WO2017164391A1 - 宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカー - Google Patents

宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカー Download PDF

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seq
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林　誠
佳子 岩崎
哲太郎 林
昌史 海老澤
洋平 笹川
美佳 芳村
愛 二階堂
健介 市田
吉崎　悟朗
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Tokyo University of Marine Science and Technology NUC
University of Tsukuba NUC
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Tokyo University of Marine Science and Technology NUC
University of Tsukuba NUC
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • the present invention relates to a surrogate parent fish technique, and in particular, to a germ cell identification marker for identifying the presence or absence of engraftment of isolated germ cells to be transplanted into a host gonad in the surrogate parent fish technique.
  • the present invention also relates to a method for producing a germ cell having the ability to engraft the host gonad using the germ cell identification marker of the present invention.
  • the parent fish in bluefin tuna, the parent fish has a large body weight of 100 kg or more, and requires a wide breeding environment due to the swimming method. Also, sturgeon takes a long time to mature sperm and eggs. Because there are some fish species that are technically difficult to artificially ripen, and those that are difficult to mate one-on-one, it is costly and difficult to grow a large number of parent fish under artificial control and collect sperm and eggs. Technically extremely difficult.
  • the present inventors transplanted germ cells derived from different species of fish (donor fish) different from the host (recipient) fish into the peritoneal cavity of the host fish individual before and after hatching, It has been found that germ cells can be induced to differentiate into germ cells, and has succeeded in inducing differentiation of isolated germ cells into germ cells in heterologous host fish (see, for example, Patent Document 1).
  • This technique also called surrogate parent fish technique or borrowed belly culture technique, is produced at low cost and easily by producing and mating sperm and eggs of fish, which are problematic for breeding of parent fish, by heterogeneous host fish that are easy to breed. It is expected to be a technology that enables seedling production.
  • primordial germ cells are used as germ cells to be transplanted. Specifically, the ridges of reproductive tissues obtained from hatched embryos of transgenic rainbow trout with GFP (Green Fluorescent Protein) introduced into the regulatory region of the vasa gene that is specifically expressed in primordial germ cells Using a suspension as a raw material, cell populations with strong fluorescence intensity are separated as primordial germ cells by flow cytometry analysis using green fluorescence as an index.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Non-Patent Document 1 discloses that germ cells are separated from a cell suspension of testis which is a gonad of donor fish.
  • a method of transplanting the isolated germ cells into the peritoneal cavity of a host fish individual using the surrogate parent fish technique is disclosed.
  • the proportion of individuals engrafted with transplanted cells in the host gonad when using isolated testicular germ cells as transplanted germ cells was lower than when using primordial germ cells.
  • Non-patent document 2 describes that when rainbow trout spermatogonia are transplanted into the peritoneal cavity of hatched fry, only a part of type A spermatogonia (A-SG) engraft in the host gonad, and a functional gamete derived from a donor. Based on the idea that type A spermatogonia with high engraftability are spermatogonial stem cells (SSC), the host focused on SideSiPopulation (SP) of spermatogonial stem cells. A method for concentrating type A spermatogonia having high engraftment ability to the gonads is disclosed.
  • SSC spermatogonial stem cells
  • SP SideSiPopulation
  • the concentration rate of spermatogonial stem cells is insufficient, and a germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad has not been obtained. Therefore, in the surrogate parent fish technique, in order to determine the engraftment ability of the isolated germ cells to be transplanted into the host gonad, there is a method of identifying other than by transplanting to the host fish individual before and after actual hatching. do not do.
  • Testicular germ2006cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional aeg of sciences of the United States of America, 103 (8), 2725-2729.
  • germ cell markers that can distinguish the presence or absence of fish engraftment into the host gonad especially germ cells that have the engraftment ability into the host gonad, which are necessary for the practical application of surrogate parent fish techniques, are introduced before transplantation.
  • germ cell markers that can be detected and separated have been reported.
  • the inventors of the present invention have recently confirmed that transplanted germ cells derived from the testes of donor fish were transplanted into the abdominal cavity of the individual host fish and engrafted in the host gonad. Germ cells that have the ability to survive (i.e., engraftment cells), and the gene expression in these cells was comprehensively analyzed. We have succeeded in developing germ cell identification markers that can detect germ cells that do not have engraftment ability. The present invention is based on these findings.
  • an object of the present invention is to provide a novel germ cell identification marker, particularly a germ cell identification marker for identifying the presence or absence of engraftment of the isolated germ cell to be transplanted into the host gonad.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a germ cell having the ability to engraft the host gonad using the germ cell identification marker of the present invention.
  • a germ cell comprising the following (I) germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad and / or (II) a germ cell identification marker not having engraftment ability to the host gonad Identification marker: (I) A germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad comprising one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): (A) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, (B) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, wherein the polynucleotide has a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad , (C) a nucleotide
  • the germ cell identification marker comprising one or more polynucleotides selected from (a) to (f) of (1) is a germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad ( The marker according to 1) or (2).
  • SSC spermatogonial stem cell
  • a primer or probe for detecting an SSC gene which can hybridize to the polynucleotide according to (4) or a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide.
  • the germ cell identification marker comprising one or more polynucleotides selected from (g) to (l) of (1) is a germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad. The marker according to (1) or (2).
  • a method for producing a germ cell capable of engraftment in a host gonad comprising separating a cell having expression or high expression from a testis or ovary of a fish.
  • germ cell identification marker of the present invention it is possible to identify the status of germ cells, in particular, the presence or absence of engraftment of the isolated germ cells to be transplanted into the host gonad before transplantation in the surrogate parent fish technique.
  • germ cells capable of engraftment in the host gonad can be efficiently produced.
  • a germ cell identification marker comprising a germ cell identification marker capable of engrafting in the host gonad and / or a germ cell identification marker not capable of engrafting in the host gonad is provided.
  • the germ cell identification marker is a germ cell identification marker that identifies the presence or absence of engraftment in the host gonad.
  • the “surrogate parent fish technique” is a method in which isolated germ cells isolated from donor fish are transplanted into the abdominal cavity of the host (recipient) fish before and after hatching, and the transplanted germ cells are germ cells in the gonad of the host fish individual. This means induction of differentiation into a lineage (gamete) (see Patent Document 1).
  • Germ cells means gametes for sexual reproduction and cells that are the basis for them. Germ cells include in the case of fish, for example, primordial germ cells, oocytes, spermatogonia, oocytes, spermatocytes, sperm cells, eggs and sperm.
  • a “germ cell capable of engrafting the host gonad” is a separated germ cell derived from a donor fish that is transplanted into the abdominal cavity of the individual host fish in the surrogate parent fish technique, and can be engrafted in the host gonad after transplantation. It means isolated germ cells, also called engraftment germ cells. Such germ cells include primordial germ cells, some type A spermatogonia and some oocytes. Among type A spermatogonia, type A spermatogonia that have the ability to engraft the host gonads are said to be less than 1%.
  • Whether or not a germ cell is a germ cell capable of engrafting into the host gonad is determined by the germ cell marker having the ability to reproduce into the host gonad of the present invention, or in the surrogate fish technique, It can be judged by the presence or absence of engraftment when transplanted to the gonad.
  • Type A spermatogonia are undifferentiated germ cells that exist with somatic cells in an undifferentiated testis (immature testis). Type spermatogonia, spermatocytes, sperm cells, cells that differentiate into sperm. Type A spermatogonia include spermatogonial stem cells (SSC) that continue to replicate spermatogonia. Further, SSC is concentrated to a fraction having a low staining property by staining with Hoechst 33342, which is a cell membrane-permeable nuclear staining reagent.
  • the type A spermatogonia as germ cells capable of engrafting the host gonads are preferably spermatogonial stem cells.
  • an “egg cell” is an undifferentiated germ cell that is present together with somatic cells in an undifferentiated ovary (immature ovary), and is a cell that differentiates into an oocyte or egg as it matures.
  • the oocyte includes an oocyte stem cell (OSC) that continues to replicate the oocyte.
  • OSC oocyte stem cell
  • the oocyte as a germ cell capable of engrafting the host gonad is preferably an oocyte stem cell.
  • the germ cell identification marker of the present invention it is possible to identify the presence or absence of the engraftment ability of the isolated germ cell to be transplanted into the host gonad in the surrogate parent fish technique. That is, according to one embodiment of the present invention, a germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad is provided. According to another embodiment, a germ cell identification marker that does not have the ability to engraft the host gonad is provided.
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): Is: (A) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, (B) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, wherein the polynucleotide has a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad , (C) a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, added, inserted or substituted in one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, and / or one of them, or A polynucleotides selected from
  • the germ cell identification marker capable of engrafting the host gonad of the present invention is a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74. It is. According to a preferred embodiment of the present invention, the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention consists of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74. It is a polynucleotide having a germ cell identification function having an engraftment ability in the host gonad substantially equivalent to the polynucleotide.
  • Examples of the polynucleotide having a germ cell identification function having an engraftment ability to the host gonad substantially equivalent to a polynucleotide consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74 are as described above. Examples include polynucleotides selected from (b) to (f).
  • the polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74 is 1 selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74
  • other nucleotide sequences may be included as long as expression of two or more nucleotide sequences is not hindered, and other nucleotide sequences can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the length of the polynucleotide sequence of (b) is preferably 500%, more preferably 400%, relative to the length of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74, More preferably 300%, more preferably 200%, more preferably 100%, more preferably 70%, more preferably 50%, more preferably 30%, still more preferably 10%, more preferably 5%, still more preferably May be 1% longer.
  • the “nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, added, inserted or substituted” refers to a well-known technical method such as site-directed mutagenesis or the like. This means that the modification has been made, for example, by substitution of one to a plurality of bases to the extent that can occur.
  • the number of base modifications is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, further preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 5. Two.
  • the addition of a base to one or both ends thereof means that the expression of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID Nos. 1 to 74 is hindered. Unless otherwise specified, other nucleotide sequences may be added to one or both ends of the nucleotide sequence, and other nucleotide sequences can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the other nucleotide sequence is preferably 500%, more preferably 400%, even more preferably 300%, relative to the length of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74 More preferably, the length is 200%, more preferably 100%, more preferably 70%, more preferably 50%, more preferably 30%, more preferably 10%, more preferably 5%, and even more preferably 1%.
  • the modification of the polynucleotide (c) is preferably performed at a site where the number of differences when comparing the cDNA sequences of puffer fish, tilapia and tuna in FIG.
  • the polynucleotide (d) is composed of a nucleotide sequence having at least 70% identity with one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74.
  • This sequence identity is preferably at least preferably 75% or higher, more preferably at least 85% or higher, more preferably 88% or higher, still more preferably 89% or higher, still more preferably 90% or higher, still more preferably 91% or higher. More preferably 92% or more, still more preferably 93% or more, further preferably 94% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, Most preferably, it is 99% or more.
  • sequence identity is determined by a known method.
  • BLAST search Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers
  • EW & “Lipman”, “DJ” (1990) “Basic” local ”alignment” search “tool.” “J. Mol. Biol. 215: 403-410.”
  • Etc Moreover, BLASTN and BLASTX based on this algorithm BLAST can also be used.
  • the “orthologous gene” is also called an orthologous gene, and is a homologous gene that shares the same function among other species with common ancestor genes.
  • a polynucleotide encoding an ortholog gene of a gene consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74 is one or more selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74
  • it has a function equivalent to that of the nucleotide sequence, it is not particularly limited, and those skilled in the art can easily identify it by a known method. For example, it can be identified by performing phylogenetic tree analysis on a homologous gene identified by BLASTP search using an amino acid sequence encoded by BLASTX or polynucleotide.
  • the “orthologous gene” is preferably at least 70%, more preferably one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 74 Is at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 88%, more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, Preferably 93% or more, more preferably 94% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more. It consists of a nucleotide sequence having
  • the polynucleotide of (f) can be selected from those that hybridize under high stringency conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in any of (a) to (f). .
  • “hybridizes under highly stringent conditions” means that the polynucleotide hybridizes to the target polynucleotide under highly stringent conditions and does not hybridize to nucleotides other than the target nucleotide.
  • “High stringency conditions” can be determined depending on the melting temperature (° C.) of the double strand of the polynucleotide and the target nucleotide, the salt concentration of the solution, and the like. It is a technique well known to those skilled in the art to select a target sequence and then set a stringent condition accordingly (for example, Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).
  • the hybridization method can be performed according to a known method. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): is there: (A) 1 selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-7, 9, 11-13, 18-28, 31-33, 35-39, 42-49, 51-60, 63-66, 70, 73 Or a polynucleotide comprising two or more nucleotide sequences, (B) selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-7, 9, 11-13, 18-28, 31-33, 35-39, 42-49, 51-60, 63-66, 70, 73 A polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences, wherein the polynucleotide has a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad, (C) 1 selected from the
  • a polynucleotide having a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad (D) 1 selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-7, 9, 11-13, 18-28, 31-33, 35-39, 42-49, 51-60, 63-66, 70, 73 Or a polynucleotide represented by a nucleotide sequence having at least 70% identity (preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% identity) with two or more nucleotide sequences, A polynucleotide having a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad, (E) 1 selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-7, 9, 11-13, 18-28, 31-33, 35-39, 42-49, 51-60, 63-66, 70, 73 Or a polynucleotide encoding an ortholog gene of a gene consist
  • the germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): Is: (A) SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 18, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 43, 44 , 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, 73.
  • a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from nucleotide sequences (B) Sequence application No.
  • nucleotide sequences 44, 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, 73 A polynucleotide having a germ cell identification function capable of engrafting in the host gonad, (C) SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 18, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 43, 44 , 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, 73 in one or more nucleotide sequences, 1 or Several (for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 4, further preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 2) A polynucleotide represented by a
  • a polynucleotide having a germ cell identification function (E) SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 18, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 43, 44 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, of a gene consisting of one or more nucleotide sequences selected from nucleotide sequences A polynucleotide encoding an ortholog gene, and (f) hybridizing under a highly stringent condition with a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide having the nucleotide sequence shown in any of (a) to (e) above A polynucleo
  • the germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): Is: (A) consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 65, 70 Polynucleotides, (B) one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 65, 70 A polynucleotide comprising a germ cell identification function having engraftment ability to the host gonad, (C) in one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38,
  • a polynucleotide having a germ cell identification function (D) one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 65, 70 and at least A polynucleotide represented by a nucleotide sequence having 70% identity (preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and even more preferably at least 95% identity), the engraftment ability in the host gonad
  • a polynucleotide having a germ cell identification function (E) consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 65, 70
  • a polynucleotide encoding a gene orthologous gene and (f) hybridizing under high stringency conditions with a polynucleotide comprising a complementary sequence of
  • the germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): Is: (A) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 25, 28, 35, 37, 44, 47, 49, 52, 65, (B) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 25, 28, 35, 37, 44, 47, 49, 52, 65, A polynucleotide having a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad, (C) one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 25, 28, 35, 37, 44, 47, 49, 52, 65,
  • a germ cell discriminating function having the ability to engraft the host gonad, comprising a nucleotide sequence inserted or substituted, and / or a nucleotide sequence to which a base is added to one or both ends thereof
  • the germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (a) to (f): Is: (A) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 25, 28 and 47; (B) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 25, 28 and 47, and having a germ cell identification function capable of engraftment in the host gonad Polynucleotides, (C) 1 or several (for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 1) nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 25, 28 and 47 (5, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 2)
  • a polynucleotide having a germ cell identification function having engraftment ability to the host gonad (E) a polynucleotide encoding an ortholog gene of a gene consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 25, 28, and 47, and (f) any one of (a) to (e) above
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention is SEQ ID NO: 1-7, 9, 11-13, 18-28, 31-33, 35- A polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from nucleotide sequences of 39, 42 to 49, 51 to 60, 63 to 66, 70, 73, more preferably SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 18, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, 73, more preferably SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 6 A 70, more preferably is SEQ ID NO: 9,11,25,28,35,37,44,47,49,52,65, particularly preferably SEQ ID NO:
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention is a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of the above SEQ ID NOs. It is a polynucleotide having a germ cell discrimination function having an engraftment ability in the host gonad that is substantially equivalent to the above.
  • a polynucleotide having a germ cell discriminating function having an engraftment ability to the host gonad substantially equivalent to a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention is also called an engraftment germ cell identification marker.
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention in the surrogate parent fish technique, the germ cell having the engraftment ability to the host gonad can be detected and separated as a transplanted cell.
  • a type A spermatogonia having the engraftment ability to the host gonad as a germ cell having the engraftment ability to the host gonad.
  • a type A spermatogonia identification marker having engraftment ability to the host gonad ie, type A having engraftment ability to the host gonad in type A spermatogonia.
  • a marker for identifying spermatogonia a spermatogonial stem cell identification marker, an oocyte identification marker capable of engraftment in the host gonad, and an oocyte stem cell identification marker.
  • the germ cell identification marker having engraftment ability to the host gonad is a type A spermatogonia discrimination marker having engraftment ability to the host gonad.
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): It consists of: (G) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 101, (H) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 101 and having a germ cell identification function having no engraftment ability in the host gonad Polynucleotides, (I) a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, added, inserted or substituted in one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 101, and / or one of them, or A polynucleo
  • the germ cell identification marker not capable of engrafting the host gonad of the present invention consists of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 101. It is a polynucleotide.
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 101.
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): Is: (G) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 84, 86, 88, 91 to 99, (H) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75-84, 86, 88, 91-99, and having engraftment ability in the host gonad
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): Is: (G) 1 selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 88, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 Or a polynucleotide comprising two or more nucleotide sequences, (H) selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 88, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): Is: (G) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 78, 81, 83, 86, 88, 98; (H) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 78, 81, 83, 86, 88, 98, and engraftment in the host gonad
  • a polynucleotide represented by a nucleotide sequence to which a base is added to one or both ends thereof, and a polynucleotide having a germ cell identification function having no engraftment ability to the host gonad (J) at least 70% identity (preferably at least 85%, more preferably at least 85%) with one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 78, 81, 83, 86, 88, 98
  • a polynucleotide represented by a nucleotide sequence having 90%, more preferably at least 95% identity), and having a germ cell identification function not capable of engraftment in the host gonad (K) a polynucleotide encoding an orthologous gene of a gene consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75, 78, 81,
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): Is: (G) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78, 81, 83, 86, 88; (H) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78, 81, 83, 86, 88, and having no engraftment ability in the host gonad
  • a polynucleotide having a germ cell identification function (I) In one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78, 81, 83, 86, 88, one or several
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability in the host gonad of the present invention is one or more polynucleotides selected from the following (g) to (l): Is: (G) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78 and 86; (H) a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78 and 86, and having a germ cell identification function having no engraftment ability in the host gonad Polynucleotides, (I) 1 or 2 or more (for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78 and 86 More preferably 1 to 4, more
  • K a polynucleotide encoding an ortholog gene of a gene consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 78 and 86, and (1) any one of (g) to (k) above
  • the germ cell identification marker capable of engraftment in the host gonad of the present invention is selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 75 to 84, 86, 88, 91 to 99 or A polynucleotide comprising two or more nucleotide sequences, more preferably SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 88, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, more preferably SEQ ID NO: 75, 78, 81, 83, 86, 88, 98, still more preferably SEQ ID NO: 78, 81, 83, 86, 88, 98, particularly preferable.
  • the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention is a polynucleotide comprising one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences of the above SEQ ID NOs. It is a polynucleotide having a germ cell discrimination function having an engraftment ability in the host gonad that is substantially equivalent to the above.
  • the germ cell identification marker having no engraftment ability to the host gonad of the present invention is also called a non-engraftment germ cell identification marker.
  • a germ cell that does not have the ability to engraft the host gonad of the present invention in the surrogate parent fish technique, a germ cell that does not have the ability to engraft the host gonad is detected and separated as a transplanted cell. Can do.
  • germ cell identification marker having no engraftment ability to the host gonad of the present invention as a negative marker, germ cells having engraftment ability to the host gonad can be isolated as transplanted cells.
  • primers and probes as germ cell identification markers are provided.
  • the primer and probe according to the present invention specifically hybridize with a polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide, and all or part of the germ cell identification gene of the present invention is obtained by a nucleic acid amplification method. Can be amplified. Accordingly, the primers and probes according to the present invention are primers and probes as germ cell gene detection markers that have engraftment ability to the host gonad or germ cell gene detection markers (negative marker) that do not have engraftment ability to the host gonad.
  • the primer and probe according to the present invention include a type A spermatogonia gene detection marker that has engraftment ability to the host gonad, a spermatogonial stem cell gene detection marker, and an oocyte gene detection marker that has engraftment ability to the host gonad.
  • a type A spermatogonia gene detection marker that has engraftment ability to the host gonad
  • a spermatogonial stem cell gene detection marker a spermatogonial stem cell gene detection marker
  • an oocyte gene detection marker that has engraftment ability to the host gonad.
  • it can be used as a marker for detecting oocyte stem cell genes.
  • the primers and probes according to the present invention mean those composed of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) and the like.
  • the primer according to the present invention only needs to be able to amplify all or part of the germ cell identification gene of the present invention by a nucleic acid amplification method.
  • a polynucleotide comprising at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20, even more preferably at least 21 base sequences of the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the present invention or a complementary sequence thereof.
  • the thing which consists of is mentioned.
  • the primer according to the present invention comprises a nucleotide sequence of 10-30, 12-30, 15-30, 20-30, or 21-30 consecutive nucleotide sequences of the polynucleotide according to the present invention or its complementary sequence. It may consist of a polynucleotide comprising.
  • the length of the primer according to the present invention can be at least 10 bases, preferably at least 15 bases, more preferably at least 20 bases, and even more preferably at least 21 bases.
  • the length of the primer according to the present invention may be 12-30 bases, 20-30 bases, or 21-30 bases.
  • the primer according to the present invention may be used as a primer set formed by combining two or more kinds of primers according to the present invention.
  • Primers and primer sets according to the present invention are obtained by PCR method (Saiki, RK, Bugawan, TL, et al. (1986) Nature, 324, 163-166), NASBA method (Comptom, J. (1991) Nature, 650, 91-92). ), TMA method (Kacian, DL, and Fultz, TJ (1995) US. Patent 5,399, 491), SDA method (Walker, GT, Little, MC, et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392- 396), PCR-SSCP method (Orita, M., Iwahara, H., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770), etc. It can be used as a primer and primer set according to the method.
  • Examples of the probe according to the present invention include those capable of hybridizing to the base sequence of the polynucleotide according to the present invention.
  • the length of the probe according to the present invention is at least 10 bases.
  • the length of the probe according to the present invention can be appropriately adjusted depending on the use of the probe, and is preferably 100 to 500 bases when used in an in situ hybridization method.
  • the probe according to the present invention can be used as a probe according to a conventional method in known methods such as Northern blotting, Southern blotting, in situ hybridization and the like.
  • Primers and probes according to the present invention can be chemically synthesized based on the base sequences disclosed herein. Primer preparation methods are well known and can be performed according to conventional methods.
  • an antibody that specifically binds to germ cells, particularly germ cells having the ability to engraft the host gonads, using the germ cell identification marker of the present invention.
  • Methods for preparing antibodies are well known and can be performed according to conventional methods.
  • such an antibody includes a germ cell identification antibody having the ability to engraft the host gonad, which binds to a part of the protein encoded by the germ cell identification marker of the present invention.
  • a peptide corresponding to a part of the protein encoded by the cell identification marker can be synthesized, and the peptide can be immunized to obtain an antiserum.
  • the peptide is preferably PKWETDSKISECEQT (SEQ ID NO: 308).
  • a germ cell identification kit comprising the germ cell identification marker of the present invention, particularly a germ cell identification kit having engraftment ability to the host gonad.
  • the method for preparing the kit is well known and can be carried out according to a conventional method.
  • the presence or absence of expression of a gene of a germ cell identification marker capable of engrafting in the host gonad using the germ cell identification marker capable of engrafting in the host gonad of the present invention comprising detecting and / or extent to isolate cells that are expressed or highly expressed from the testis or ovary of a fish. . That is, by using the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention, the presence or absence and / or the degree of expression of the gene of the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad is detected.
  • a method of enriching germ cells having the ability to engraft into the host gonad comprising isolating cells that are expressed or highly expressed from the testis or ovary of a fish.
  • the method for producing a germ cell capable of engrafting the host gonad of the present invention uses the germ cell identification marker not capable of engrafting the host gonad of the present invention.
  • a germ cell identification marker having no engraftment ability to the host gonad of the present invention as a negative marker, a germ cell having engraftment ability to the host gonad is converted into a host gonad. For example, separation and removal of cells having no engraftment ability can be mentioned.
  • separation using the germ cell identification marker having the engraftment ability to the host gonad of the present invention as a positive marker, and to the host gonad of the present invention Separation using a germ cell identification marker having no engraftment ability as a negative marker may be performed simultaneously, separately or sequentially according to the separation method. May be either.
  • germ cell separation methods using the germ cell marker of the present invention include flow cytometry analysis, density gradient centrifugation, analysis using cell properties such as motility and adhesion ability, and cell surface antigens. Examples include cell separation by analysis using antibodies.
  • the germ cells obtained by the method for producing germ cells having the engraftment ability to the host gonad of the present invention are used as isolated germ cells derived from donor fish, and the individual host fish before and after hatching.
  • the types of host fish and donor fish in the differentiation induction method of the present invention may be the same or different.
  • Examples of different types of fish include the same species of different species and different species of fish.
  • the donor fish is a rainbow trout
  • the same species of different species of recipient fish are yamame trout
  • the different species of recipient fish are brown trout and char.
  • the donor fish is bluefin tuna
  • the recipient fishes of the same genus and different species are, for example, bigeye tuna, albacore tuna, yellowfin tuna, bigeye tuna, etc.
  • examples of the recipient fish of different genera include horse mackerel and nibs.
  • the donor fish are groupers or eels, it is possible to use dissimilar fish that are easily reared.
  • immature germ cells derived from donor fish use immature germ cells of fish that are relatively expensive and labor-intensive to grow up to adult fish (for example, larger fish than recipient fish).
  • fish that are relatively low cost and low labor to grow up to adult fish for example, smaller fish than donor fish
  • the recipient fish eggs are grown by growing the recipient fish after transplantation. It is possible to induce differentiation of sperm and sperm at a relatively low cost and with low labor, for example, using a relatively small water tank.
  • a combination of bluefin tuna (donor) and chub mackerel (recipient) can be exemplified.
  • the fish is not particularly limited as long as it is a fish that specifically expresses the polynucleotide of the present invention.
  • salmonid fish for example, rainbow trout, salmon, scallop, chinook salmon
  • azirid fish for example, yellowtail
  • Puffer fishes eg, tiger puffer fish
  • mackerel fishes eg, bluefin tuna, southern bluefin tuna
  • Thai fishes eg red sea bream
  • cichlid fishes eg tilapia
  • the fish may be a saltwater fish or a freshwater fish.
  • the method of inducing differentiation of the present invention comprises forming sperm and / or eggs derived from donor fish. That is, according to one aspect of the present invention, the germ cells obtained by the method for producing germ cells having engraftment ability in the host gonads of the present invention are used as isolated germ cells derived from donor fish, and the host fish before and after hatching. Provided is a method for producing sperm or egg of a donor fish comprising transplanting into the abdominal cavity of an individual to obtain donor-derived sperm or egg.
  • the germ cells obtained by the method for producing germ cells having the engraftment ability to the host gonads of the present invention are used as isolated germ cells derived from donor fish, and the host fish before and after hatching. Transplanting into the abdominal cavity of an individual, obtaining a sperm or egg from the donor, producing a fertilized egg using the egg or sperm, and hatching it to create a new individual of the donor fish, A method for producing donor fish is provided.
  • the differentiation induction method of the present invention may be used for the preservation of fish genetic resources. Specifically, if immature germ cells of a rare or endangered species are cryopreserved and transplanted to a host of a related species that is easy to breed when needed, these hosts are rare or endangered species ( In some cases, it becomes possible to produce eggs and sperm derived from already extinct species). In addition, when various useful strains and varieties are produced by techniques such as gene transfer in the future, it is possible to maintain them without subcultivating individuals, and when necessary, individuals can be maintained by transplanting to host embryos. Can be modified.
  • Example 1 Production of germ cell identification marker
  • a germ cell capable of engraftment in the host gonad is isolated and specific to this cell.
  • the gene that was expressed in a comprehensive manner was comprehensively analyzed to obtain a germ cell identification marker. Specifically, it is as follows.
  • the obtained isolated germ cells were transplanted by a fixed number of cells into the peritoneal cavity of the host fish individual according to the method of Citation 1.
  • the host gonads in which engraftment of the transplanted GFP-positive germ cells was confirmed using a fluorescence microscope was isolated using a tweezers under a stereomicroscope.
  • the isolated gonads were dispersed by treatment with trypsin enzyme (manufactured by Worthington Biochemical Corp.), and then engrafted transplanted germ cells were isolated and collected using GFP fluorescence as an index.
  • the Quartz-seq method is one of 1-cell RNA sequencing methods. Specifically, the obtained cells were used as a cell lysate, and 10% NP-40 (manufactured by ThermocientScientific) diluted to a final concentration of 0.5% and 0.4 unit (1 unit / ⁇ l) of RNasin Plus RNase Inhibitor. (Promega Co., Ltd.) is used to melt, and cDNA complementary to the mRNA is obtained by reverse transcription reaction. Poly-A is added to the 3 ′ end of the reverse transcribed cDNA using terminal transferase. The complementary strand (second strand) is synthesized by an extension reaction from the tagging primer bound to the poly-A strand, and the cDNA derived from the target RNA is amplified by suppression PCR. Purified.
  • the obtained purified cDNA was sequenced and data processing was performed according to the scheme of FIG. Specifically, data processing was performed in the order of removal of the sequence adapter sequence and quantification of the gene expression level. The results are shown in FIGS.
  • WTA whole transcription amplification
  • / or 1 engrafted cell that is considered to affect the survival of the somatic cell was removed from the analysis target, and the gene expression difference was analyzed.
  • the total number of transcripts of rainbow trout used in the analysis was 175,285, and it was found that there were 2,904 transcripts that had a significant difference in expression between transplanted cells and engrafted cells. It was.
  • PCA principal component analysis
  • PCA is an analysis in which multivariate is subjected to dimensional compression in a low dimension, and it is understood how cells are classified by performing this analysis.
  • genes that have a large functional contribution to the classified cells can be obtained from the magnitude of factor loading.
  • a pair plot was drawn. The result of the plot is shown in FIG.
  • factor loading ranking in PCA As shown in FIG. As shown in FIG. 6, genes having a large contribution to the first main component can be seen.
  • SP Side® Population
  • SP Side® Population
  • Hoechst 33342 which is a cell membrane-permeable nuclear staining reagent
  • cells with high engraftment ability to the host gonad are concentrated.
  • these microarrays are based on the development of Hoechst blue and Hoechred by flow cytometry analysis, and the SP cell population with high engraftment ability and low engraftment ability.
  • FIG. 7 shows the result of comparison between microarray analysis using SP cells and Quartz-seq analysis.
  • 14 of the transcripts that characterize the engrafted cells obtained by the Quartz-seq analysis overlap with genes that are significantly expressed in the SP cells in the microarray analysis, and the translip that characterizes the non-engrafted cells. 8 of them overlapped with non-SP significantly expressed genes in microarray analysis.
  • Example 2 Analysis of sequence similarity with other fish species 74 transcripts characterizing engraft cells obtained as a result of the Quartz-seq analysis of Example 1 (2) above, transcript 27 characterizing non-engraft cells Blast search was performed on cDNA sequences of tilapia, puffer fish and tuna as fish species other than rainbow trout.
  • the tilapia cDNA sequence is from the Ensemble database (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/oreochromis_niloticus/), while the puffer's cDNA sequence is from the Ensemble database (ftp://ftp.ensembl.org) / pub / release-84 / fasta / tetraodon_nigroviridis /)
  • the tuna cDNA sequence is available from the Central Fisheries Research Institute database (http://nrifs.fra.affrc.go.jp/ResearchCenter/5_AG/genomes/Tuna_DNAmicroarray/index_j. html). Blast search used blastn 2.2.31.
  • sequence numbers 1 to 74 and 75 to 101 and the corresponding transcript sequence names are shown in Tables 3 and 4 below, respectively.
  • Example 3 Analysis by qRT-PCR Concentration of non-engrafted cells on the sequence of 74 transcripts (SEQ ID NOs: 1 to 74) characterizing the engrafted cells obtained as a result of the Quartz-seq analysis in Example 1 (2) above
  • SP cells type A spermatogonia
  • nonSP cells nonSP cells
  • the non-engrafting cell enriched fraction of the 27 transcript sequences SEQ ID NOs: 75 to 101
  • Real-time quantitative PCR qRT-PCR, qPCR (quantitative real-time PCR) was performed in order to confirm whether it was highly expressed in type A spermatogonia (non-SP cells).
  • QRT-PCR was performed according to the following method. First, immature rainbow trout at 10 months, 11 months, and 15 months, respectively, using a flow-sert meter, Hayashi, Makoto, et al. "Enrichment of spermatogonial stem cells using side population in teleost.” Biology of reproduction 91.1 (2014): SP cells and non-SP cells were sorted according to the method of 23. RNA was purified from the sorted cells using RNeasy mini Kit (Qiagen), and then subjected to reverse transcription to synthesize cDNA. Oligo- (dT) primer (5'-d (T) 25VN-3 ') and SuperScript III First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Fisher Scientific) were used for cDNA synthesis.
  • the gene expression level was analyzed by qRT-PCR.
  • qRT-PCR was performed using LightCycler 480 System II (Nippon Genetics Co., Ltd.) and QuantTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen).
  • SEQ ID NOs 1 to 74 corresponds to the sequence of 74 transcripts that characterize engraft cells
  • SEQ ID NOs 75 to 101 corresponds to the sequence of 74 transcripts that characterize non-engraft cells.
  • the primers are shown in Tables 5 and 6 below.
  • Vasa was used as a representative gene that is known to be uniformly expressed in all type A spermatogonia and whose expression level does not correlate with the engraftment ability of type A spermatogonia.
  • the b-actin gene was used to correct the RNA amount between samples.
  • the primers for vasa and b-actin are shown in Table 7.
  • PCR was performed at 95 ° C. for 15 minutes, and then the reaction of “95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 1 minute” was performed 45 times.
  • Data analysis is performed using Microsoft Excel (Microsoft) and the ⁇ Ct method (Livak, Kenneth J., and Thomas D. Schmittgen. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ⁇ CTmethod. methods 25.4 (2001): 402-408.)
  • Example 1 (3) SP microarray In addition, in Example 1 (3) SP microarray, only a limited number of genes plotted on the array could be analyzed, whereas qTR-PCR can analyze all candidate genes. .
  • the expression levels of SP cells and non-SP cells differed with respect to the 74 transcript sequences (SEQ ID NOs: 1 to 74) that characterize engrafted cells, and SP cells were compared to non-SP cells.
  • transcripts SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 18, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 65, 70, 73.
  • 15 transcripts corresponding to SEQ ID NOs: 9, 11, 18, 25, 28, 32, 35, 37, 38, 44, 47, 49, 52, 65, 70
  • 15 transcripts correspond to be 2 times or more, or the expression level was significantly high in SP cells although the difference in expression level was 2 times or less.
  • Eleven transcripts (corresponding to SEQ ID NOs: 9, 11, 25, 28, 35, 37, 44, 47, 49, 52, 65) were confirmed to have a difference in expression level of 2 times or more. It is. Among these, in particular, three transcripts (corresponding to SEQ ID NOs: 25, 28, and 47) are confirmed to have a difference in expression level of 2 times or more, and may be significantly highly expressed in SP cells. Admitted.
  • the expression levels of SP cells and non-SP cells differed from the 27 transcript sequences (SEQ ID NOs: 75 to 101) that characterize non-engrafting cells, and non-SP cells compared to SP cells.
  • 19 transcripts SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 88, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98
  • transcripts (corresponding to SEQ ID NOs: 75, 78, 81, 83, 86, 88, 98) were confirmed to have a difference in expression level of 2 times or more, or Although the difference was 2 times or less, it was found that the expression was significantly high in non-SP cells.
  • Five transcripts (corresponding to SEQ ID NOs: 78, 81, 83, 86, 88) were confirmed to have a difference in expression level of 2 times or more.
  • two transcripts (corresponding to SEQ ID NOs: 78 and 86) were confirmed to have a difference in expression level of 2 times or more, and were also found to be significantly highly expressed in non-SP cells. It was.
  • Example 4 Immunohistochemical qRT-PCR method of dyeing Example 3, a significant difference was observed in the expression between SP cells and non-SP cells, and was most highly expressed in SP cells compared to non-SP cells sequence
  • immunohistochemical staining was performed. First, in order to produce an antibody against a part of the protein encoded by SEQ ID NO: 28, a peptide (PKWETDSKISISCEQT (SEQ ID NO: 308)) was synthesized, and an antiserum (GP8023) was obtained by immunizing a guinea pig.
  • paraffin sections were prepared according to a conventional method.
  • the prepared paraffin section was subjected to deparaffinization, hydrophilic treatment, antigen activation with HistoVT ONE (manufactured by Nacalai Tesque), and blocking with Block Ace (manufactured by Snow Brand Megmilk), followed by primary antibody reaction.
  • the primary antibody reaction was performed at 4 ° C. for 16 hours using the above antibody (GP8023) diluted 1000 times using Can Get Signal Solution B (TOYOBO).
  • the secondary antibody reaction was performed at room temperature for 1 hour using Alexa Fluor 488 conjugated anti-guinea pig IgG diluted 200-fold with Can Get Signal Solution A (TOYOBO).
  • the antibody binding to a part of the protein encoded by SEQ ID NO: 28 showed a strong signal in some A-type restricted cells in the immature testis. That is, it was confirmed that the protein encoded by the transcript corresponding to SEQ ID NO: 28 was strongly expressed in some A-type spermatogonia in immature testis.
  • the type A spermatogonia in which this strong expression was observed are considered to be germ cells having engraftment ability to the host gonad.

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Abstract

本発明は、（Ｉ）の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーおよび／または（ＩＩ）の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを含んでなる、生殖細胞識別マーカーに関する。本発明は、魚類の宿主生殖腺への生着能の有無を識別できる生殖細胞マーカーを提供する。

Description

宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカー 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国特許出願である特願２０１６－６０９１４（出願日：２０１６年３月２４日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体を参照することによりここに組み込まれる。
発明の背景
技術分野
　本発明は、代理親魚技法に関し、特に、代理親魚技法において、移植する分離生殖細胞の宿主生殖腺への生着能の有無を識別する生殖細胞識別マーカーに関する。また本発明は、本発明の生殖細胞識別マーカーを用いた、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法に関する。
背景技術
　欧米での健康志向の高まりや中国等の経済発展により、世界の食用水産物消費量は年々増加を続け、その結果、天然水産資源量の減少が問題となっている。特に、高級魚として需要の高いウナギおよびクロマグロなどは、乱獲による天然資源量の減少が著しく、絶滅が危惧される状態にまで至っている。そのため、水産資源量の増加を目的とした種苗生産および人工種苗（稚魚）放流が検討されている。一般的に、種苗生産では、近親交配や特定疾病の発症による全滅を避けるために、親魚となる個体の遺伝的多様性が必要とされ、従って、多数の親魚を育成する必要がある。しかしながら、魚種によっては、種苗生産は難しい。例えば、クロマグロでは親魚は体重１００ｋｇ以上と大型であり、遊泳方法から広い飼育環境を必要とする。また、チョウザメでは精子や卵の成熟に長い年月を要する。人為催熟が技術的に難しい魚種や、１対１交配が難しい魚種もいることから、多数の親魚を人為的な管理下で育成し、精子や卵を採取することは、コスト的および技術的に極めて難しい。
　魚類の種苗生産技術として、本発明者らは、宿主（レシピエント）魚類とは異なる異種の魚類（ドナー魚類）由来の生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することによって、生殖細胞を生殖細胞系列へ分化誘導することができることを見いだし、異種の宿主魚類での分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導に成功している（例えば、特許文献１参照）。この技術は、代理親魚技法または借り腹養殖技法とも呼ばれ、親魚の飼育に問題の多い魚類の精子や卵を、飼育しやすい異種の宿主魚類によって生産し、交配することにより低コストで簡便な種苗生産を可能にする技術であるとして期待されている。
　特許文献１では、移植する生殖細胞として始原生殖細胞を用いている。具体的には、始原生殖細胞に対して特異的に発現するｖａｓａ遺伝子の調節領域にＧＦＰ（Green Fluorescent Protein：緑色蛍光タンパク質）遺伝子を導入した遺伝子組換えニジマスの孵化胚から得た生殖隆起組織の懸濁液を原料に、緑色蛍光を指標としたフローサイトメトリー解析により蛍光強度の強い細胞集団を始原生殖細胞として分離している。しかしながら、始原生殖細胞は、孵化前後の極めて若い胚に由来し、その数は孵化稚魚１尾当たり６０個程度と大変少ないものであるため、商業的な量産化には向かない。
　商業的な量産化を目的として、移植する分離生殖細胞の数を十分確保するために、例えば、非特許文献１には、ドナー魚類の生殖腺である精巣の細胞懸濁液から、生殖細胞を分離し、その分離生殖細胞を、代理親魚技法において、宿主魚類個体の腹腔内に移植する方法が開示されている。しかしながら、移植する分離生殖細胞として、精巣由来の分離生殖細胞を用いた場合の宿主生殖腺への移植細胞の生着した個体の割合は、始原生殖細胞を用いた場合より低かった。
　非特許文献２には、ニジマス精原細胞を孵化稚魚腹腔内に移植すると、一部のＡ型精原細胞（Ａ－ＳＧ）のみが宿主生殖腺へと生着し、ドナー由来の機能的配偶子を生産することから、高い生着能を有しているＡ型精原細胞は、精原幹細胞（ＳＳＣ）であるという考えのもと、精原幹細胞のＳｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）に着目した、宿主生殖腺への高い生着能を有しているＡ型精原細胞の濃縮方法が開示されている。しかしながら、この方法では精原幹細胞の濃縮率が不十分であり、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを得るには至っていない。よって、代理親魚技法において、移植する分離生殖細胞の宿主生殖腺への生着能の有無を判断するためには、実際に孵化前後の宿主魚類個体に移植して確認する以外、識別する方法は存在しない。
特許第４３００２８７号公報
Okutsu, T., Suzuki, K., Takeuchi, Y., Takeuchi, T., & Yoshizaki, G. (2006). Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 103(8), 2725-2729. Hayashi, M., Sato, M., Nagasaka, Y., Sadaie, S., Kobayashi, S., & Yoshizaki, G. (2014). Enrichment of spermatogonial stem cells using side population in teleost. Biology of reproduction, 91(1), 23.
　このように、魚類の宿主生殖腺への生着能の有無を識別できる生殖細胞マーカー、特に、代理親魚技法の実用化に必要な、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞を、移植前に、検出、分離できる生殖細胞マーカーは、発明者らが知る限り報告されていない。
　本発明者らは今般、ドナー魚類の精巣由来の分離生殖細胞を宿主魚類個体の腹腔内に移植し、宿主生殖腺に生着したことが確認された、生着直後の、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞（すなわち、生着細胞）を生きたまま回収し、この細胞での遺伝子発現を網羅的に解析したところ、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞と、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞とをそれぞれ検出できる、生殖細胞識別マーカーの開発に成功した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　すなわち、本発明は、新規な生殖細胞識別マーカー、特に移植する分離生殖細胞の宿主生殖腺への生着能の有無を識別する生殖細胞識別マーカーを提供することをその目的とする。また、本発明の生殖細胞識別マーカーを用いた宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法を提供することもその目的とする。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）下記（Ｉ）の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーおよび／または（ＩＩ）の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを含んでなる、生殖細胞識別マーカー：
　（Ｉ）下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカー：
　　（ａ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　　（ｂ）配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｃ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｄ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｅ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　　（ｆ）前記（ｂ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ＩＩ）下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる宿主生殖腺への生着能を有さない分化生殖細胞識別マーカー：
　　（ｇ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　　（ｈ）配列願号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｉ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｊ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　　（ｋ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
（２）生殖細胞識別マーカーが、宿主生殖腺への生着能の有無を識別する生殖細胞識別マーカーである、（１）に記載のマーカー。
（３）（１）の（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる、生殖細胞識別マーカーが宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーである、（１）または（２）に記載のマーカー。
（４）宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーが、精原幹細胞（ＳＳＣ）マーカーである、（１）～（３）のいずれかに記載のマーカー。
（５）（４）に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ＳＳＣ遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
（６）（１）の（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる、生殖細胞識別マーカーが宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーである、（１）または（２）に記載のマーカー。
（７）（１）～（４）のいずれかに記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、
　魚類の精巣または卵巣から、発現が有るもしくは発現が高い細胞を分離する
ことを含んでなる、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法。
（８）（１）、（２）または（６）に記載の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、
　魚類の精巣または卵巣から、発現があるもしくは発現が高い細胞を分離する
ことをさらに含んでなる、（７）に記載の未分化生殖細胞生産方法。
（９）魚類が、サケ科魚類である、（７）または（８）に記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法。
（１０）（１）～（４）のいずれかに記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーがコードするタンパク質の一部に結合する、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別抗体。
　本発明の生殖細胞識別マーカーを用いることにより、生殖細胞の状態、特に、代理親魚技法において、移植前に、移植する分離生殖細胞の宿主生殖腺への生着能の有無を識別することができる。また本発明の生殖細胞識別マーカーを用いることにより、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞を効率良く生産することができる。
Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析で得られたシークエンス結果のデータ処理のスキームである。 データ処理での、全サンプル（移植細胞９４細胞と生着細胞１４細胞）の全リード数の数を示す。 データ処理での、全サンプル（移植細胞９４細胞と生着細胞１４細胞）のＧＣ含有率を示す。 データ処理での、全サンプル（移植細胞９４細胞と生着細胞１４細胞）のマッピング比を示す。 ＰＣＡ解析のＰＣＡ ペアプロットの結果を示す。 ＰＣＡ解析のファクターローディングのランキングを示す。 ＳＰアレイとＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析との比較を示す。 Ｂｌａｓｔ検索の結果を示す。ａ）生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列のフグに対するＢｌａｓｔ検索の結果。ｂ）生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列のティラピアに対するＢｌａｓｔ検索の結果。ｃ）生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列のマグロに対するＢｌａｓｔ検索の結果。ｄ）非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列のフグに対するＢｌａｓｔ検索の結果。ｅ）非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列のティラピアに対するＢｌａｓｔ検索の結果。ｆ）非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列のマグロに対するＢｌａｓｔ検索の結果。 ｑＲＴ－ＰＣＲのＳＰ細胞および非ＳＰ細胞でのそれぞれのトランスクリプトの発現量の結果を示す。グラフの＊および＃は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより算出したＰ値を示し、＊は、Ｐ値＜０．０５（ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞に有意な差が認められる）、＃は、Ｐ値＞０．1（ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞に有意な差が認められない）を示す。 免疫組織化学染色の結果を示す。蛍光顕微鏡写真（左）、ＨＥ染色の写真（右）。
発明の具体的説明
　本発明によれば、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーおよび／または宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを含んでなる、生殖細胞識別マーカーが提供される。本発明の好ましい態様によれば、生殖細胞識別マーカーは、宿主生殖腺への生着能の有無を識別する生殖細胞識別マーカーである。
　「代理親魚技法」とは、ドナー魚類から分離された分離生殖細胞を、孵化前後の宿主（レシピエント）魚類個体の腹腔内へ移植し、宿主魚類個体の生殖腺において、移植した生殖細胞を生殖細胞系列（配偶子）へ分化誘導することを意味する（特許文献１参照）。
　「生殖細胞」とは、有性生殖のための配偶子またそれらのもととなる細胞を意味する。生殖細胞は、魚類の場合、例えば、始原生殖細胞、卵原細胞、精原細胞、卵母細胞、精母細胞、精細胞、卵および精子が包含される。
　「宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞」とは、代理親魚技法において、宿主魚類個体の腹腔内へ移植するドナー魚類由来の分離生殖細胞であって、移植後、宿主生殖腺へ生着できる分離生殖細胞を意味し、生着生殖細胞ともいわれる。このような生殖細胞として、始原生殖細胞と、一部のＡ型精原細胞および一部の卵原細胞とが挙げられる。Ａ型精原細胞の中でも、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞は、１％に満たないといわれている。生殖細胞が、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞であるか否かは、本発明の、宿主生殖腺への生殖能を有する生殖細胞マーカーにより判断するか、あるいは、代理親魚技法において、宿主生殖腺に移植した際の生着能の有無により判断することができる。
　「Ａ型精原細胞」とは、未分化精巣（未成熟精巣）において体細胞と共に存在する未分化生殖細胞であり、該Ａ型精原細胞は、成熟を開始した精巣または成熟精巣において、Ｂ型精原細胞、精母細胞、精細胞、精子へと分化する細胞である。Ａ型精原細胞には、精原細胞を複製し続ける精原幹細胞（ＳＳＣ）が含まれる。さらに、ＳＳＣは、細胞膜透過性の核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色することにより染色性の薄い分画に濃縮される。本発明において、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞としてのＡ型精原細胞は、好ましくは、精原幹細胞である。
　「卵原細胞」とは、未分化卵巣（未成熟卵巣）に体細胞と共に存在する未分化生殖細胞であり、成熟に従って卵母細胞、卵へと分化する細胞である。卵原細胞は、卵原細胞を複製し続ける卵原幹細胞（ＯＳＣ）が含まれる。本発明において、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞としての卵原細胞は、好ましくは、卵原幹細胞である。
　本発明の生殖細胞識別マーカーを用いることにより、代理親魚技法において、移植する分離生殖細胞の宿主生殖腺への生着能の有無を識別できる。すなわち、本発明の一つの態様によれば、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーが提供される。またもう一つの態様によれば、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーが提供される。
　本発明の一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドである。
　配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドとしては、上記（ｂ）～（ｆ）から選択されるポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドは、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列の発現を妨げない限り、他のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、他のヌクレオチド配列は当業者であれば適宜選択することができる。（ｂ）のポリヌクレオチド配列の長さは、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列の長さに対して、好ましくは５００％、より好ましくは４００％、さらに好ましくは３００％、さらに好ましくは２００％、さらに好ましくは１００％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは５０％、さらに好ましくは３０％、さらに好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、さらに好ましくは１％長いものであってもよい。
　（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、「１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の１～複数個の数の塩基の置換等により改変がなされたことを意味する。塩基の改変の個数は、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個である。（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、「その一方または両末端への塩基の付加がなされた」とは、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列の発現を妨げない限り、そのヌクレオチド配列の一方または両末端へ、他のヌクレオチド配列が付加されていてもよく、他のヌクレオチド配列は当業者であれば適宜選択することができる。他のヌクレオチド配列は、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列の長さに対して、好ましくは５００％、より好ましくは４００％、さらに好ましくは３００％、さらに好ましくは２００％、さらに好ましくは１００％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは５０％、さらに好ましくは３０％、さらに好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、さらに好ましくは１％の長さの配列であってもよい。
　（ｃ）のポリヌクレオチドの改変は、図８において、フグ、ティラピア、マグロのｃＤＮＡ配列を比較した際の相違数が大きい部位で行われるものが好ましい。
　（ｄ）のポリヌクレオチドは、配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるものでる。この配列同一性は、好ましくは少なくとも好ましくは７５％以上、より好ましくは少なくとも８５％以上、さらに好ましくは８８％以上、さらに好ましくは８９％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　上記配列同一性は、公知の手法によって決定されるものであり、かかる手法としては、例えば、実施例の例２に記載のＢＬＡＳＴ検索(Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410.)等が挙げられる。また、このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づく、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いることもできる。
　（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、「オルソログ遺伝子」とは、オーソログ遺伝子ともよばれ、祖先遺伝子が共通の他種間で同一機能を担うホモログ遺伝子である。配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と同等の機能を有する限り、特に制限されず、当業者であれば公知の手法によって容易に特定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴＸやポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を用いたＢＬＡＳＴＰ検索により特定されたホモログ遺伝子に対して、系統樹解析を行うことで特定することができる。
　好ましい態様によれば、（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて、「オルソログ遺伝子」は、好ましくは、配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％以上、より好ましくは少なくとも８５％以上、さらに好ましくは８８％以上、さらに好ましくは８９％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるものでる。
　（ｆ）のポリヌクオチドは、（ａ）～（ｆ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件でハイブリダイズするものから選択することができる。ここで、「高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、高ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。「高ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドと標的ヌクレオチドとの二本鎖の融解温度（℃）および溶液の塩濃度等に依存して決定できる。標的配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等）。
　ハイブリダイゼーション法は、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ａ）配列番号２５、２８、４７のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列願号２５、２８、４７のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｃ）配列番号２５、２８、４７のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｄ）配列番号２５、２８、４７のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｅ）配列番号２５、２８、４７のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のより好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、配列番号１～７、９、１１～１３、１８～２８、３１～３３、３５～３９、４２～４９、５１～６０、６３～６６、７０、７３のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３であり、さらに好ましくは、配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０であり、さらに好ましくは、配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５であり、特に好ましくは、配列番号２５、２８、４７である。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、上記配列番号のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドである。上記配列番号のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドの用語は、上記（ｂ）～（ｆ）のポリヌクレオチドの用語について説明された本明細書の内容において、ポリヌクレオチドの対象となる配列番号を、それぞれの配列番号に置き換えることにより理解することができる。
　本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、生着生殖細胞識別マーカーとも呼ばれる。本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いることにより、代理親魚技法において、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞を移植細胞として検出、分離することができる。また、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いることにより、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞として、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞（精原幹細胞を含む）および宿主生殖腺への生着能を有する卵原細胞（卵原幹細胞を含む）を検出、分離することができる。すなわち、本発明の一つの態様によれば、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞識別マーカー（すなわち、Ａ型精原細胞中で、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞を識別するためのマーカー）、精原幹細胞識別マーカー、宿主生殖腺への生着能を有する卵原細胞識別マーカー、卵原幹細胞識別マーカーが提供されうる。本発明の好ましい態様によれば、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞識別マーカーである。
　本発明のもう一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドである。
　配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドとしては、上記（ｇ）～（ｌ）から選択されるポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｈ）～（ｉ）のポリヌクレオチドの用語は、上記（ｂ）～（ｆ）のポリヌクレオチドの用語について説明された本明細書の内容において、ポリヌクレオチドの対象となる配列番号および機能を、配列番号７５～１０１および宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能に置き換えることにより理解することができる。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７８、８１、８３、８６、８８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７８、８１、８３、８６、８８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７８、８１、８３、８６、８８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７８、８１、８３、８６、８８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７８、８１、８３、８６、８８のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなるものである：
　（ｇ）配列番号７８、８６のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｈ）配列願号７８、８６のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｉ）配列番号７８、８６のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個（例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個）の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｊ）配列番号７８、８６のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
　（ｋ）配列番号７８、８６のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
　本発明のより好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、配列番号７５～８４、８６、８８、９１～９９のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８であり、さらに好ましくは、配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８であり、さらに好ましくは、配列番号７８、８１、８３、８６、８８であり、特に好ましくは、配列番号７８、８６である。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーは、上記配列番号のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドである。上記配列番号のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等な宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチドの用語は、上記（ｈ）～（ｉ）のポリヌクレオチドの用語について説明された本明細書の内容において、ポリヌクレオチドの対象となる配列番号を、それぞれの配列番号に置き換えることにより理解することができる。
　本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーは、非生着生殖細胞識別マーカーとも呼ばれる。本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを用いることにより、代理親魚技法において、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞を移植細胞として検出、分離することができる。本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーをネガティブマーカーとして用いることにより、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞を移植細胞として分離することができる。
　本発明の別の態様によれば、生殖細胞識別マーカーとしてのプライマーおよびプローブが提供される。
　本発明によるプライマーおよびプローブは、本発明によるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、本発明の生殖細胞識別遺伝子の全部または一部を、核酸増幅法により増幅することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブは、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞遺伝子検出マーカーまたは宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞遺伝子検出マーカー（ネガティブマーカー）としてのプライマーおよびプローブとして用いることができる。また、本発明によるプライマーおよびプローブは、宿主生殖腺への生着能を有するＡ型精原細胞遺伝子検出マーカー、精原幹細胞遺伝子検出マーカー、宿主生殖腺への生着能を有する卵原細胞遺伝子検出マーカーまたは卵原幹細胞遺伝子検出マーカーとして用いることができる。
　本発明によるプライマーおよびプローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等からなるものを意味する。
　本発明によるプライマーは、本発明の生殖細胞識別遺伝子の全部または一部を核酸増幅法により増幅することができればよい。例えば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２１個の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプライマーは、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１０～３０個、１２～３０個、１５～３０個、２０～３０個、または２１～３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものであってもよい。
　本発明によるプライマーの長さは、少なくとも１０塩基であることができ、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、さらに好ましくは少なくとも２１塩基である。本発明によるプライマーの長さは、１２～３０塩基、２０～３０塩基、または２１～３０塩基であってもよい。
　本発明によるプライマーは、二種類以上の本発明によるプライマーを組み合わせてなるプライマーセットとして使用してもよい。
　本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,et al.(1986)Nature,324,163-166) 、ＮＡＳＢＡ法（Comptom,J.(1991)Nature,650,91-92）、ＴＭＡ法（Kacian,D.L.,and Fultz,T.J.(1995)US.Patent 5,399,491）、ＳＤＡ法（Walker,G.T.,Little,M.C.,et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396）、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法（Orita,M.,Iwahara,H.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2776-2770 ）等の公知の核酸増幅法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして用いることができる。
　本発明によるプローブとしては、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列にハイブリダイズすることができるものが挙げられる。
　本発明によるプローブの長さは、少なくとも１０塩基である。本発明によるプローブの長さは、そのプローブの用途により適宜調整することができ、in situハイブリダイゼーション法に用いる場合は、好ましくは１００～５００塩基である。
　本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、in situハイブリダイゼーション等の公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
　本発明によるプライマーおよびプローブは、本明細書に開示した塩基配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製方法は周知であり、常法に従って実施できる。
　本発明の別の態様によれば、本発明の生殖細胞識別マーカーを用いた、生殖細胞、特に宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞に特異的に結合する抗体が提供される。抗体の調製方法は、周知であり、常法に従って実施できる。例えば、このような抗体として、本発明の生殖細胞識別マーカーがコードするタンパク質の一部に結合する、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別抗体が挙げられ、このような抗体は、生殖細胞識別マーカーがコードするタンパク質の一部に対応するペプチドを合成し、そのペプチドを動物に免疫して抗血清として得ることができる。該ペプチドは、好ましくは、ＰＫＷＥＴＤＳＫＩＳＣＥＱＴ（配列番号：３０８）である。
　本発明の別の態様によれば、本発明の生殖細胞識別マーカーを含んでなる、生殖細胞識別キット、特に宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別キットが提供される。キットの調製方法は、周知であり、常法に従って実施できる。
　本発明の一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、魚類の精巣または卵巣から、発現が有るもしくは発現が高い細胞を分離することを含んでなる、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法が提供される。すなわち、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、魚類の精巣または卵巣から、発現が有るもしくは発現が高い細胞を分離することを含んでなる、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞濃縮方法が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法は、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、魚類の精巣または卵巣から、発現があるもしくは発現が高い細胞を分離することをさらに含んでなる。このような方法として、例えば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーをネガティブマーカーとして用いて、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有さない細胞を分離し、除去することが挙げられる。
　本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法において、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーをポジティブマーカーとして用いた分離と、本発明の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーをネガティブマーカーとして用いた分離は、分離方法に準じて、同時におこなってもよいし、別々におこなってもよく、あるいは連続におこなってもよく、その順番はいずれであってもよい。本発明の好ましい態様によれば、ネガティブマーカーで宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞を除去した後に、ポジティブマーカーによる濃縮をする方法である。　
　本発明において、本発明の生殖細胞マーカーを用いた生殖細胞の分離方法としては、フローサイトメトリー解析や、密度勾配遠心法、運動能や接着能など細胞の性質を利用した解析、細胞表面抗原に対する抗体を利用した解析による細胞分離が挙げられる。
　本発明の一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法により得られた生殖細胞を、ドナー魚類由来の分離生殖細胞として、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法が提供される。
　本発明の分化誘導方法における宿主魚類とドナー魚類の種類は、同種であってもよいし、異種であってもよい。異種の魚類としては同属異種の魚類や異属の魚類を挙げることができ、例えば、ドナー魚類がニジマスの場合、同属異種のレシピエント魚類としてヤマメを、異属のレシピエント魚類としてブラウントラウト、イワナを具体的に例示することができ、ドナー魚類がクロマグロの場合、同属異種のレシピエント魚類として、メバチマグロ、ビンナガマグロ、キハダマグロ、メバチマグロ等を、異属のレシピエント魚類としてスマ、マサバを具体的に例示することができ、ドナー魚類がブリやカンパチの場合、異属のレシピエント魚類として、マアジやニベを例示することができる。また、ドナー魚類がハタ、ウナギの場合は、近縁の飼育が容易な異種の魚類を用いることができる。異種の魚類を用いる場合、例えばドナー魚類由来の未成熟生殖細胞として、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類（例えばレシピエント魚類より大型の魚類）の未成熟生殖細胞を用い、レシピエント魚類として、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類（例えばドナー魚類より小型の魚類）を用いると、移植後のレシピエント魚類を育成することによって、ドナー魚類の卵や精子を、例えば比較的小型の水槽を用いて、比較的低コスト、低労力で分化誘導することが可能となる。このメリットを享受するために好ましいドナー魚類とレシピエント魚類の組み合わせとしては、クロマグロ（ドナー）とマサバ（レシピエント）の組み合わせを例示することができる。
　本発明において魚類は、本発明のポリヌクレオチドを特異的に発現する魚類である限り特に限定されず、例えば、サケ科魚類（例えば、ニジマス、サケ、ヒメマス、マスノスケ）、アジ科魚類（例えば、ブリ）、フグ科魚類（例えば、トラフグ）、サバ科魚類（例えば、クロマグロ、ミナミマグロ）、タイ科魚類（例えば、マダイ）、カワスズメ科魚類（例えば、ティラピア）、ウナギ科魚類、シーラカンス科魚類などが挙げられる。本発明において魚類は、海水魚であっても、淡水魚であってもよい。
　本発明の分化誘導方法によって、ドナー魚類由来の精子及び／又は卵を形成せしめることよりなる。すなわち、本発明の一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法により得られた生殖細胞を、ドナー魚類由来の分離生殖細胞として、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、ドナー由来の精子または卵を得ることを含んでなる、ドナー魚類の精子または卵の生産方法が提供される。また、本発明の一つの態様によれば、本発明の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法により得られた生殖細胞を、ドナー魚類由来の分離生殖細胞として、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、ドナー由来の精子または卵を得て、該卵または精子を用いて受精卵を作製し、これを孵化させてドナー魚類の新規個体を作製することを含んでなる、ドナー魚類の生産方法が提供される。
　本発明の分化誘導法の利用例として、魚類の遺伝子資源の保存への利用が考えられる。具体的には、希少種、絶滅危惧種の未成熟生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容易な近縁種の宿主に移植すれば、これらの宿主は希少種、あるいは絶滅危惧種（場合によっては既に絶滅した種）に由来する卵や精子を作出することが可能となる。また、今後遺伝子導入等の技術により様々な有用系統・品種が作出された場合、個体の継代飼育を行わなくてもこれらの維持が可能であり、必要なときに宿主胚への移植により個体へ改変することが可能となる。
　本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
例１：生殖細胞識別マーカーの作製
　宿主生殖腺への生着能の有無を識別できる生殖細胞識別マーカーを作製するために、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞を単離し、この細胞で特異的に発現する遺伝子を網羅的に解析して、生殖細胞識別マーカーを得た。具体的には以下の通りである。
（１）宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞（生着細胞）の単離
　非特許文献１の方法に従って、ドナー魚類として、１５個体のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（雄）から精巣を摘出し、トリプシン酵素（Worthington Biochemical Corpotaion製）処理による分散後、Ａ型精原細胞を含む細胞集団を得た。得られた細胞集団を、代理親魚技法において、宿主魚類個体に移植する分離生殖細胞（移植細胞）として用いた。宿主魚類個体として、ニジマス仔魚（受精後２９日目）を２３０尾用いた。
　得られた分離生殖細胞を、引用文献１の方法に従って、宿主魚類個体の腹腔内へ一定細胞数ずつ移植した。移植後１４日目に、蛍光顕微鏡を用いて、移植したＧＦＰ陽性の生殖細胞の生着が確認できた宿主生殖腺を、ピンセットを用いて実体顕微鏡下で単離した。単離した生殖腺を、トリプシン酵素（Worthington Biochemical Corpotaion製）処理による分散後、ＧＦＰ蛍光を指標に、生着した移植生殖細胞を単離、回収した。
（２）Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ法による解析
　単離された生着細胞から網羅的な遺伝子発現解析を行うために、１細胞から解析できるＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ法（Sasagawa et. al., Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 2013 Apr 17;14 (4) 参照）に従って、解析を行った。具体的には、上記（１）により得られた生着細胞 １４細胞と、移植に用いた精巣から得られた細胞集団に含まれる細胞（移植細胞）９４細胞に対して、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ法による遺伝子発現の比較を行った。
　Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ法とは、１細胞ＲＮＡシークエンス法の一つである。具体的には、得られた細胞を、細胞融解液として、最終濃度０．５％に希釈した１０％ＮＰ－４０（Thermo Scientific社製）と０．４ｕｎｉｔ（１ｕｎｉｔ／μｌ）のＲＮａｓｉｎ Ｐｌｕｓ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Promega社製）とが含まれる溶液を用いて融解し、逆転写反応により該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを得て、逆転写されたｃＤＮＡの３’末端にターミナルトランスフェラーゼを用いてｐｏｌｙ－Ａを付加し、ｐｏｌｙ－Ａ鎖に結合されたタギングプライマーからの伸長反応により相補的な鎖（第２鎖）を合成し、抑制ＰＣＲにより目的のＲＮＡ由来のｃＤＮＡの増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡを精製した。
　得られた精製ｃＤＮＡについてシークエンスを行い、データ処理は図１のスキームに従って行った。具体的には、シーケンスアダプター配列の除去、遺伝子発現量の定量の順にデータ処理を行った。結果を図２～４に示す。
　図２に示されるように、生着細胞では、一部リード数にばらつきが見られた。図３に示されるようシークエンスのＧＣ含有率は、均一であった。図４に示されるように、マッピング比は均一であった。
　これらの結果に基づいて、ＷＴＡ（whole transcript amplification）および／または 細胞生存に影響が考えられる生着細胞１細胞は解析対象から除去し、遺伝子発現差を解析した。その結果、解析に用いたニジマスの全トランスクリプトは１７５，２８５個であり、移植細胞と生着細胞との間で発現に有意な差があったトランスクリプトは２，９０４個であることがわかった。
　その後、ＰＣＡ（主成分分析）を行った。ＰＣＡとは、多変量を低次元に次元圧縮を行う解析であり、この解析を行うことにより細胞がどのように分類されるかがわかる。また分類された細胞に対して、機能的に寄与が大きな遺伝子を因子負荷量（factor loading）の大小から得ることができる。具体的には、移植細胞９４細胞と生着細胞１３細胞とを、あわせて１０７細胞について、移植細胞と生着細胞の間で発現に有意な差があった２９０４遺伝子の発現情報をもとにペアプロットを描画した。プロットの結果を図５に示す。また、ＰＣＡでのファクターローディングのランキングを。図６に示す。図６に示されているように、第一主成分に寄与の大きな遺伝子がわかる。
　ＰＣＡ解析の結果、生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個と、非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個が得られた。
（３）ＳＰマイクロアレイとの比較
　非特許文献１で開示されているように、高い生着能を有しているＡ型精原細胞は、精原幹細胞であると考えられる。上記（１）で得られた生着細胞は、宿主生殖腺に生着した直後の細胞であることから、精原幹細胞（ＳＳＣ）そのものとしての遺伝子を発現していると考えられる。そこで、精原幹細胞で着目されるＳＰ細胞で有意に発現するマイクロアレイおよび非ＳＰ細胞で有意に発現するマイクロアレイ解析の結果と、上記（２）で得られたＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析の結果とを比較した。
　ＳＰ細胞で有意に発現するマイクロアレイおよび非ＳＰ細胞で有意に発現するマイクロアレイ解析の結果は、非特許文献２に開示されているものを用いた。ここで、ＳＰ（Side Population）細胞とは、細胞膜透過性の核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した際に、染色性の低い細胞集団であり、宿主生殖腺への生着能の高い細胞が濃縮されていることが知られている。これらのマイクロアレイは、具体的には、非特許文献２の濃縮方法に従って、フローサイトメトリー解析で、ヘキストブルーとヘキストレッド展開に基づいて、生着能が高いＳＰ細胞集団と、生着能が低い非ＳＰ細胞集団とを分離し、ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞間でのマイクロアレイによる遺伝子発現解析により得られたものである。ＳＰ細胞で有意に強く発現するマイクロアレイトランスクリプトは８３５０個、非ＳＰ細胞で有意に強く発現するマイクロアレイトランスクリプト７７９８個である。
　ＳＰ細胞を用いたマイクロアレイ解析と、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析とを比較した結果を図７に示す。その結果、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析で得られた、生着細胞を特徴づけるトランスクリプトのうち１４個がマイクロアレイ解析においてＳＰ細胞で有意に発現する遺伝子と重複し、非生着細胞を特徴づけるトランスリプとのうち８個がマイクロアレイ解析において非ＳＰで有意に発現する遺伝子と重複した。
例２：他魚種との配列類似性の解析
　上記例１（２）のＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析の結果得られた生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個、非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列について、ニジマス以外の魚種として、ティラピア、フグ、マグロのｃＤＮＡ配列に対してＢｌａｓｔ検索を行った。ティラピアのｃＤＮＡ配列はＥｎｓｅｍｂｌｅのデータベース（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/oreochromis_niloticus/）より、フグのｃＤＮＡ配列はＥｎｓｅｍｂｌｅのデータベース（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/tetraodon_nigroviridis/）より、マグロのｃＤＮＡ配列は中央水産研究所のデータベース（http://nrifs.fra.affrc.go.jp/ResearchCenter/5_AG/genomes/Tuna_DNAmicroarray/index_j.html）より得た。Ｂｌａｓｔ検索はｂｌａｓｔｎ２．２．３１を用いた。
　結果を図８ａ～ｆに示し、まとめを下記表１および２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１および２に示されているように、生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個中Ｂｌａｓｔ検索の結果ヒットしたものは約３０％、非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個中Ｂｌａｓｔ検索の結果ヒットしたものは２０％弱であった。ヒットした配列の同一性は７０％以上であった。
　配列番号１～７４および７５～１０１と、対応するトランスクリプトのシークエンス名を、それぞれ下記表３および４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
例３：ｑＲＴ－ＰＣＲによる解析
　上記例１（２）のＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ解析の結果得られた生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列（配列番号１～７４）について、非生着細胞濃縮分画のＡ型精原細胞（ｎｏｎＳＰ細胞（非ＳＰ細胞））に比べ、生着細胞濃縮分画のＡ型精原細胞（ＳＰ細胞）で高発現しているか否かを確かめるために、また、非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列（配列番号７５～１０１）について、生着細胞濃縮分画のＡ型精原細胞（ＳＰ細胞）に比べ、非生着細胞濃縮分画のＡ型精原細胞（非ＳＰ細胞）で高発現しているか否かを確かめるために、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ））を行った。
　ｑＲＴ－ＰＣＲは、以下の方法に従って行った。まず、１０ヶ月齢、１１ヶ月齢、１５ヶ月齢の未成熟のニジマスからそれぞれ、フローサートメーターを用いて、Hayashi, Makoto, et al. "Enrichment of spermatogonial stem cells using side population in teleost." Biology of reproduction 91.1 (2014): 23.の方法に従い、ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞を分取した。分取した細胞から、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Qiagen）をもちいてＲＮＡを精製したのち、逆転写反応の供することにより、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成には、ｏｌｉｇｏ－（ｄＴ）プライマー（５’－ｄ（Ｔ）２５ＶＮ－３’）と、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）を用いた。
　得られたｃＤＮＡを用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲ法により、遺伝子の発現量を解析した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ（日本ジェネティクス株式会社）と、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Qiagen）を用いておこなった。ｑＲＴ－ＰＣＲで使用した、生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列（配列番号１～７４）および非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列（配列番号７５～１０１）に対応するプライマーを、下記表５および６に示す。また、全てのＡ型精原細胞で均一に発現することが知られており、発現量がＡ型精原細胞の生着能を相関がない遺伝子の代表としてｖａｓａを用いた。サンプル間のＲＮＡ量の補正には、ｂ－ａｃｔｉｎ遺伝子を用いた。ｖａｓａおよびｂ－ａｃｔｉｎのプライマーを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　 ＰＣＲの条件は、９５℃で１５分間処理したのち、「９５℃で１５秒、６０℃で１分」の反応を４５回おこなった。データの解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ（Microsoft）を用いて、ΔΔＣｔ法（Livak, Kenneth J., and Thomas D. Schmittgen. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔCT method." methods 25.4 (2001): 402-408.）によりおこなった。
　 ｑＲＴ－ＰＣＲの結果に基づいて、それぞれのトランスクリプトのＳＰ細胞と非ＳＰ細胞での発現量を比較した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより、有意差検定もおこなった。このｑＲＴ－ＰＣＲでの比較は、ｂｌａｓｔでの対応付けを行う例１（３）ＳＰマイクロアレイとの比較より、高い精度で解析することができる。また、例１（３）ＳＰマイクロアレイでは、アレイ上にプロットされている限られた遺伝子しか解析できなかったのに対して、ｑＴＲ－ＰＣＲでは、全ての候補遺伝子に対して解析を行うことができる。その結果、生着細胞を特徴づけるトランスクリプト７４個の配列（配列番号１～７４）に対して、ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞との発現量に差が見られ、非ＳＰ細胞に比べてＳＰ細胞で高発現する３９個のトランスクリプト（配列番号１、３、４、６、９、１１、１２、１８、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３５、３７、３８、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６０、６３、６５、７０、７３に対応する）が得られた。これらの中でも１５個のトランスクリプト（配列番号９、１１、１８、２５、２８、３２、３５、３７、３８、４４、４７、４９、５２、６５、７０に対応する）では、発現量の差が２倍以上あることが確認されたか、あるいは、発現量の差は２倍以下ではあるがＳＰ細胞で有意に高発現することが認められた。発現量の差が２倍以上あることが確認されたのは、１１個のトランスクリプト（配列番号９、１１、２５、２８、３５、３７、４４、４７、４９、５２、６５に対応する）である。これらの中でも特に、３個のトランスクリプト（配列番号２５、２８、４７に対応する）では、発現量の差が２倍以上あることが確認され、かつ、ＳＰ細胞で有意に高発現することも認められた。
　 また、非生着細胞を特徴づけるトランスクリプト２７個の配列（配列番号７５～１０１）に対して、ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞との発現量に差が見られ、ＳＰ細胞に比べて非ＳＰ細胞で高発現する１９個のトランスクリプト（配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８に対応する）が得られた。これらの中でも７個のトランスクリプト（配列番号７５、７８、８１、８３、８６、８８、９８に対応する）では、発現量の差が２倍以上あることが確認されたか、あるいは、発現量の差は２倍以下ではあるが非ＳＰ細胞で有意に高発現することが認められた。発現量の差が２倍以上あることが確認されたのは、５個のトランスクリプト（配列番号７８、８１、８３、８６、８８に対応する）である。これらの中でも特に、２個のトランスクリプト（配列番号７８、８６に対応する）では、発現量の差が２倍以上あることが確認され、かつ、非ＳＰ細胞で有意に高発現することも認められた。
　 発現量の差が２倍以上あることが確認され、かつ、有意差も認められた、生着細胞を特徴づける、３個のトランスクリプト（配列番号２５（TCONS_00162389）、配列番号２８（TCONS_00095523）、配列番号４７（TCONS_00101612））および非生着細胞を特徴づける、２個のトランスクリプト（TCONS_00173676、TCONS_00002882）およびｖａｓａについての結果を図９に示す。
例４：免疫組織化学染色
　 例３のｑＲＴ－ＰＣＲ法により、ＳＰ細胞と非ＳＰ細胞間で発現に有意な差が認められ、かつ、非ＳＰ細胞に比べＳＰ細胞で最も高発現していた配列番号２８に対応するトランスクリプトについて、未成熟精巣において、一部のＡ型精原細胞で高発現しているか否かを確かめるために、免疫組織化学染色をおこなった。まず、配列番号２８がコードするタンパク質の一部に対する抗体を作成するために、ペプチド（ＰＫＷＥＴＤＳＫＩＳＣＥＱＴ（配列番号：３０８））を合成し、モルモットに免疫することで抗血清（ＧＰ８０２３）を得た。
　 免疫組織化学染色を行うために、１２．５ヶ月齢の未成熟ニジマスの精巣を４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（ＰＦＡ）で固定し、常法に従って、パラフィン切片を作成した。作成したパラフィン切片を、脱パラフィン、親水処理、ＨｉｓｔｏＶＴ　ＯＮＥ（ナカライテスク株式会社製）による抗原の賦活化、ブロックエース（雪印メグミルク株式会社製）によるブロッキングに供したのち、１次抗体反応をおこなった。１次抗体反応は、上記の抗体（ＧＰ８０２３）をＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ（TOYOBO）を用いて１０００倍稀釈したものを用いて、４℃で１６時間おこなった。２次抗体反応には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ＩｇＧをＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（TOYOBO）を用いて２００倍稀釈したものを用いて、室温で１時間おこなった。
　 蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて配列番号２８に対応するトランスクリプトがコードするタンパク質の発現を観察したのち、ヘマトキシリンエオシン（ＨＥ）染色に供し、明視野観察により、細胞の形態を観察した。結果を図１０に示す。
　 図１０に示されるように、配列番号２８がコードするタンパク質の一部に結合する抗体は、未成熟精巣において、一部のＡ型制限細胞で強いシグナルが認められた。すなわち、配列番号２８に対応するトランスクリプトがコードするタンパク質が、未成熟精巣において、一部のＡ型精原細胞で強く発現することが確認された。この強い発現が認められたＡ型精原細胞は、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞であると考えられる。

Claims (10)

  1. 　下記（Ｉ）の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーおよび／または（ＩＩ）の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを含んでなる、生殖細胞識別マーカー：
    　（Ｉ）下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる生殖細胞識別マーカー：
    　　（ａ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    　　（ｂ）配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｃ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｄ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｅ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
    　　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　（ＩＩ）下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカー：
    　　（ｇ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    　　（ｈ）配列願号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｉ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｊ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｋ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
    　　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
  2. 　生殖細胞識別マーカーが、宿主生殖腺への生着能の有無を識別する生殖細胞識別マーカーである、請求項１に記載のマーカー。
  3. 　下記（ａ）～（ｆ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる、生殖細胞識別マーカーが、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーである、請求項１または２に記載のマーカー：
    　　（ａ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    　　（ｂ）配列願号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｃ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｄ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｅ）配列番号１～７４のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
    　　（ｆ）前記（ａ）～（ｅ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
  4. 　宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーが、精原幹細胞（ＳＳＣ）マーカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載のマーカー。
  5. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ＳＳＣ遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
  6. 　下記（ｇ）～（ｌ）から選択される１または２以上のポリヌクレオチドからなる、生殖細胞識別マーカーが、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーである、請求項１または２に記載のマーカー：
    　　（ｇ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    　　（ｈ）配列願号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｉ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、付加、挿入または置換されたヌクレオチド配列、および／またはその一方または両末端への塩基の付加がなされたヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｊ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド、
    　　（ｋ）配列番号７５～１０１のヌクレオチド配列から選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子のオルソログ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および
    　　（ｌ）前記（ｇ）～（ｋ）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別機能を有するポリヌクレオチド。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、
    　魚類の精巣または卵巣から、発現が有るもしくは発現が高い細胞を分離する
    ことを含んでなる、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法。
  8. 　請求項１、２または６に記載の宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーを用いて、該宿主生殖腺への生着能を有さない生殖細胞識別マーカーの遺伝子の発現の有無および／または程度を検出して、
    　魚類の精巣または卵巣から、発現があるもしくは発現が高い細胞を分離する
    ことをさらに含んでなる、請求項７に記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法。
  9. 　魚類が、サケ科魚類またはサバ科魚類である、請求項７または８に記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞生産方法。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別マーカーがコードするタンパク質の一部に結合する、宿主生殖腺への生着能を有する生殖細胞識別抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118345083A (zh) * 2024-06-06 2024-07-16 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种dnd基因及鉴定引物组和在鉴定草鱼和赤眼鳟生殖细胞中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009118778A1 (ja) * 2008-03-25 2009-10-01 国立大学法人東京海洋大学 魚類未成熟生殖細胞表面特異的タンパク質を利用した、魚類未成熟生殖細胞の分離方法
WO2016042684A1 (ja) * 2014-09-16 2016-03-24 国立大学法人東京海洋大学 濃縮された生着能をもつ未分化生殖細胞を用いた生殖細胞系列への分化誘導方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009118778A1 (ja) * 2008-03-25 2009-10-01 国立大学法人東京海洋大学 魚類未成熟生殖細胞表面特異的タンパク質を利用した、魚類未成熟生殖細胞の分離方法
WO2016042684A1 (ja) * 2014-09-16 2016-03-24 国立大学法人東京海洋大学 濃縮された生着能をもつ未分化生殖細胞を用いた生殖細胞系列への分化誘導方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank [online] 21 December 2012 (2012-12-21), "TSA: Oncorhynchus mykiss mRNA, contig: YGL02. 4929. C1", XP055601988, Database accession no. FX355071.1 *
DATABASE GenBank [online] 24 August 2010 (2010-08-24), "Salmo salar clone ssal-rgb2-555-140 Thyroliberin type A precursor putative mRNA", XP055601963, Database accession no. BT048522.1 *
DATABASE Nucleotide [online] 11 September 2006 (2006-09-11), "CR373234 AGENAE Rainbow trout normalized testis library (tcbi) Oncorhynchus mykiss cDNA clone tcbi0029. e. 11 5", XP055601953, retrieved from NCBI Database accession no. CR373234.2 *
DATABASE Nucleotide [online] 20 November 2008 (2008-11-20), "EST_omyk_evn_814168 omykevn RBC Oncorhynchus mykiss cDNA Oncorhynchus mykiss cDNA clone omyk_evn_508_376 5", XP055601986, Database accession no. GE826476.1 *
DATABASE Nucleotide [online] 24 August 2010 (2010-08-24), "Salmo salar clone ssal-eve-507-163 Tubulin beta-2C chain putative mRNA", XP055601977, retrieved from NCBI Database accession no. BT056899.1 *
DATABASE Nucleotide [online] 29 December 2006 (2006-12-29), "1284580 NCCCWA 03RT Oncorhynchus mykiss cDNA clone 03RT117M12 3", XP055601982, retrieved from NCBI Database accession no. CX144839.1 *
DATABASE NUCLEOTIODE [online] 24 August 2010 (2010-08-24), "Salmo salar clone ssal-eve-547-353 Microfibrillar-associated protein 2 precursor putative mRNA", XP055601960, retrieved from NCBI Database accession no. BT056416.1 *
HAYASHI, M. ET AL.: "Enrichment of spermatogonial stem cells using side population in teleost", BIOL. REPROD., vol. 91, no. 1, 2014, pages 1 - 8, XP055562657, DOI: doi:10.1095/biolreprod.113.114140 *
SALEM, M. ET AL.: "Characterization of the rainbow trout transcriptome using Sanger and 454-pyrosequencingapproaches", BMC GENOMICS, vol. 11, 2010, pages 564, XP021072861, DOI: doi:10.1186/1471-2164-11-564 *
YAZAWA, R. ET AL.: "The Pacific Bluefin Tuna (Thunnus orientalis) dead end gene is suitable as a specific molecular marker of type A spermatogonia", MOL. REPROD. DEV., vol. 80, 2013, pages 871 - 880, XP055602008 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118345083A (zh) * 2024-06-06 2024-07-16 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种dnd基因及鉴定引物组和在鉴定草鱼和赤眼鳟生殖细胞中的应用

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