WO2017142083A1 - エクソソームの遺伝子機能を抑制することができる複合体、がんの増殖及び／又は転移抑制剤 - Google Patents

エクソソームの遺伝子機能を抑制することができる複合体、がんの増殖及び／又は転移抑制剤 Download PDF

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inhibitor
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麻子 山吉
村上　章
英司 芦原
哲生 小堀
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Definitions

  • the present invention relates to a complex capable of suppressing exosome gene function, and a cancer growth and / or metastasis inhibitor.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 In order to suppress the function of miRNA in the exosome, a technique using a modified nucleic acid (antisense nucleic acid) having a sequence complementary to miRNA is generally used (Non-Patent Documents 1 to 3). However, since miRNA present in blood is encapsulated in exosomes, it is difficult to target directly even if antisense nucleic acid is administered into blood.
  • Patent Documents 3 to 5 Many methods using exosomes as drug transport carriers are known (Non-patent Documents 3 to 5, Patent Documents 1 and 2).
  • the main object of the present invention is to provide a new technique for inhibiting the function of a gene such as miRNA contained in an exosome or the expression product thereof.
  • the present invention provides the following complex and cancer growth and / or metastasis inhibitor.
  • Item 1 A complex comprising an antibody or antibody fragment targeting an exosome surface antigen and a gene or expression product inhibitor, wherein the antibody or antibody fragment and the gene or expression product inhibitor are directly or via a linker A complex that is covalently bound or non-covalently bound.
  • Item 2. Item 2. The complex according to Item 1, wherein the exosome surface antigen is CD9, CD63, CD81 or CD147.
  • the antibody or antibody fragment is modified with a peptide containing at least one amino acid selected from the group consisting of cysteine, arginine, lysine and ornithine, and the inhibitor of the gene or its expression product is covalently bound to the peptide (SS Item 3.
  • Item 4. The complex according to Item 3, wherein the peptide further comprises glycine or alanine.
  • Item 5. The complex according to Item 3, wherein the peptide is polylysine or polyarginine.
  • Item 6. Item 6.
  • the composite according to claim 1. Item 8. Item 2. The complex according to Item 1, wherein the antibody or antibody fragment is an anti-CD63 antibody. Item 9. Item 2. The complex according to Item 1, wherein the inhibitor of the gene or its expression product is an inhibitor of miRNA or gene present in exosomes. Item 10. Item 2. The complex according to Item 1, wherein the inhibitor of the gene or its expression product is a miRNA inhibitor. Item 11. Item 2.
  • the complex according to Item 1 wherein the antibody or antibody fragment is a monoclonal antibody, a single chain antibody, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, or scFv.
  • Item 12. A cancer growth and / or metastasis inhibitor comprising the complex according to any one of items 1 to 11.
  • gene functions contained in exosomes particularly involved in cancer metastasis and proliferation can be effectively suppressed.
  • An inhibitor of a gene or an expression product thereof is an inhibitor of the function of a gene contained in an exosome, such as a low molecular weight compound, an miRNA inhibitor, a DNA inhibitor, an mRNA inhibitor, a tRNA inhibitor, an rRNA inhibitor, a piRNA Inhibitors, non-coding RNA inhibitors, aptamers, antibodies, F (ab ′) 2 fragments, single chain antibody fragments, Fv fragments, single chain Fv fragments, affibodies, nanobodies, selective antibody scaffolds (eg, dia Body).
  • a low molecular weight compound such as a low molecular weight compound, an miRNA inhibitor, a DNA inhibitor, an mRNA inhibitor, a tRNA inhibitor, an rRNA inhibitor, a piRNA Inhibitors, non-coding RNA inhibitors, aptamers, antibodies, F (ab ′) 2 fragments, single chain antibody fragments, Fv fragments, single chain Fv fragments, affibodies, nanobodies,
  • examples of inhibitors of genes or their expression products include low molecular weight compounds and anti-miRNA nucleic acids.
  • the low molecular weight compound include cisplatin, 5FU (5-fluorouracil), doxorubicin, actinomycin, mitomycin, cyclophosphamide, melferran and the like.
  • antibody or antibody fragment examples include monoclonal antibodies, single chain antibodies, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and scFv.
  • MiRNA is RNA containing about 15 to 30, especially about 18 to 25 bases contained in exosomes.
  • exosomes broadly include vesicles released from mammalian cells. Examples of mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like, with humans being particularly preferred.
  • Mammalian cells include in particular tumor cells, dendritic cells, macrophages, T cells, B cells, platelets, reticulocytes, epithelial cells, fibroblasts, etc., and particularly tumor cells.
  • the diameter of the exosome is about 30 to 200 nm, preferably about 30 to 100 nm.
  • exosome surface antigens examples include CD9, CD63, CD81, CD147, and the like.
  • Preferred exosome surface antigens targeted by antibodies or antibody fragments are CD9, CD63, more preferably CD63.
  • the complex of the present invention contains an antibody or antibody fragment targeting an exosome surface antigen and an inhibitor of a gene or its expression product as essential components.
  • antibodies or antibody fragments targeting exosome surface antigens include anti-CD9 antibodies, anti-CD63 antibodies, anti-CD81 antibodies, anti-CD147 antibodies, or fragments of these antibodies, preferably anti-CD9 antibodies and anti-CD63 antibodies. Or an antibody fragment thereof, more preferably an anti-CD63 antibody or an antibody fragment thereof.
  • An anti-miRNA nucleic acid contains a complementary sequence of miRNA present in exosomes, and miRNA functions can be suppressed by forming a complementary strand with miRNA.
  • the anti-miRNA nucleic acid may be composed only of a complementary sequence of miRNA, and an arbitrary sequence may be added to the 5 'end side or 3' end side of the complementary sequence of miRNA.
  • the number of bases of the added sequence is 50 or less, preferably 40 or less, more preferably 20 or less, even more preferably 10 or less, especially 5 or less, and the most preferred anti-miRNA nucleic acid is the target. It consists only of the complementary strand to miRNA.
  • the anti-miRNA nucleic acid is DNA, RNA, or a nucleic acid derivative, preferably RNA.
  • nucleic acid derivatives include atoms (for example, hydrogen atom, oxygen atom) or functional groups (for example, hydroxyl group, amino group) such as base portion, ribose portion, and phosphodiester bond portion of nucleic acid as other atoms (for example, hydrogen atom).
  • a sulfur atom a functional group (for example, an amino group), a group substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a group protected with a protecting group (for example, a methyl group or an acyl group), or a moiety thereof
  • a substance substituted with a non-natural component eg, peptide bond.
  • nucleic acid derivatives include, for example, peptide nucleic acids (PNA), glycol nucleic acids (GNA), threose nucleic acids (TNA), cross-linked nucleic acids (BNA), and amino acids of base amino groups that have base moieties linked by peptide bonds.
  • Examples include a nucleic acid substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a nucleic acid obtained by changing the configuration of the hydroxyl group of the ribose moiety, and a nucleic acid containing phosphorothioate in which the oxygen atom of the phosphodiester bond moiety is substituted with a sulfur atom.
  • the anti-miRNA nucleic acid may contain one complementary sequence of the target miRNA, and two or more (eg, 2 to 10, preferably 2, 3, 4, 5) complementary sequences are directly or appropriately used. A plurality of bases may be included.
  • the complementary sequence may include a plurality of one type of sequences, or may include a plurality of types of complementary sequences.
  • the anti-miRNA nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid as well as a single-stranded nucleic acid. Examples of the double-stranded nucleic acid include dsRNA and siRNA, and RNA having a hairpin structure such as shRNA is also included in the anti-miRNA nucleic acid. Double-stranded nucleic acids also include DNA-RNA hybrids.
  • the exosome gene or its expression product which is the target of function suppression, is particularly involved in cancer growth and metastasis.
  • An inhibitor of a gene or its expression product such as an miRNA inhibitor, may be covalently bound to the antibody or antibody fragment directly or via a linker, or may be bound non-covalently.
  • Non-covalent bonds include ionic bonds, coordinate bonds, and hydrophobic interactions.
  • the inhibitor of a gene having an SH group or an expression product thereof is linked to the S—S bond via the SH group of cysteine. It can be covalently bonded, or can be bonded by a coordinate bond of -S- (metal ion) -S- through a metal ion.
  • the number of cysteine residues may be one or two or more.
  • an anionic gene such as an anti-miRNA nucleic acid or an inhibitor of its expression product is non-covalently bound to the cation of the arginine residue by ionic bonding.
  • an anionic gene such as an anti-miRNA nucleic acid or an expression product thereof can be combined with a cation of the lysine residue or ornithine residue. It can be non-covalently bonded by ionic bonding, or can be covalently bonded directly or via an appropriate linker via the amino group (NH 2 ) at the terminal of the lysine residue or ornithine residue.
  • the peptide bound to the antibody or antibody fragment directly or via a linker is preferably a peptide composed of a basic amino acid selected from lysine (Lys, K), arginine (Arg, R), ornithine (Orn).
  • the peptide may contain a glycine or alanine residue for adjustment of the linker length.
  • the basic amino acid is more preferably lysine (Lys, K) or arginine (Arg, R).
  • One preferred embodiment peptide is polyarginine or polylysine.
  • the number of amino acids in the peptide is not particularly limited as long as it can bind to an anionic gene or an inhibitor of its expression product (for example, miRNA inhibitor).
  • the number of anionic genes or expression product inhibitors for example, miRNA inhibitors
  • the number of anionic genes or expression product inhibitors that can bind to the peptide is 1 or 2, preferably An inhibitor of an anionic gene or its expression product binds one to one.
  • Peptides are 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 for one antibody or antibody fragment. Alternatively, one or two can be combined.
  • a complex containing a plurality of miRNA inhibitors can be obtained by binding a plurality of peptides to an antibody. There are more than 200 miRNA types in exosomes.
  • multiple peptides can be bound to one antibody and multiple miRNA inhibitors can be bound. it can. Further, when a large number of surface antigens such as CD9, CD63, CD81, CD147 are present in the exosome, the number of antibodies may be increased.
  • an antibody or antibody fragment modified with a peptide means that the peptide is covalently bound to the antibody or antibody fragment.
  • Examples of the place where the peptide is bound include constant regions (C H 1, C H 2, C H 3) of antibodies or antibody fragments, and constant regions such as Fc regions.
  • the peptide can be bound to the antibody or antibody fragment according to a conventional method, for example, according to the following scheme 1.
  • Ab is an antibody or antibody fragment
  • NH 2 bound to Ab is an amino group of an amino acid in a region that does not greatly affect the binding of Ab (for example, a constant region such as CH1, CH2, CH3, and Fc region).
  • P 1 is cysteine, arginine, an inhibitor of the peptide or gene or its expression product comprising at least one amino acid selected from the group consisting of lysine and ornithine.
  • Antibody or antibody fragment in which antibody or antibody fragment (1) and compound (2) are reacted to form amidine compound (3), and this is reacted with compound (4) to bind a peptide or gene or an inhibitor of its expression product (5) can be obtained.
  • linker when a peptide, gene or its expression product inhibitor binds to an antibody or antibody fragment, -O-, -CO-, -CONH-, -NHCO-, -NH 2 -,-(OCH 2 CH 2 ) Bivalent linkers having an n-, maleimide group and succinimide group at the end are exemplified.
  • the antibody or antibody fragment to which the peptide is bound is mixed with an anti-miRNA nucleic acid in a solvent such as water to form a complex.
  • the complex of the present invention binds to exosomes at the antibody or antibody fragment portion when injected into a blood vessel.
  • the inhibitor of the gene or its expression product exists outside the exosome, but when the exosome is taken into the cell, it is taken into the cell together with the exosome, and the exosome is taken into the cell.
  • the inhibitor of the gene or its expression product (anti-miRNA nucleic acid in FIG. 1) is released, the function of the gene or its expression product can be suppressed.
  • the complex of the present invention becomes a cancer growth and / or metastasis inhibitor.
  • the complex of the present invention may be administered at about 1 ⁇ g to 1 g per day for an adult.
  • anti-CD63 antibody manufactured by Cosmo Bio anti-CD9 antibody and anti-CD81 antibody manufactured by abcam, and anti-TSG101 antibody manufactured by abnova were used.
  • Example 1 Intracellular uptake of fluorescently labeled antibody (Figure 2) We examined whether antibodies recognizing exosome surface antigens were taken into cells together with exosomes.
  • Hela cells cervical cancer cells were added at 9000 cells / well to a multiwell glass bottom dish (manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) and incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator.
  • Fluorescently labeled antibodies (anti-CD63 antibody, anti-CD9 antibody, anti-CD81 antibody, anti-TSG101 antibody) were added to each well, and further incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator. The supernatant was removed, the cells were washed with 1 ⁇ PBS, 100 ⁇ L of 4% paraformaldehyde was added, and the cells were fixed by incubation at room temperature for 5 minutes.
  • the cells were washed twice with 1 ⁇ PBS, Hoechst33342 in 1 ⁇ PBS was added at 200 ⁇ L (final concentration 5 ⁇ M), and incubated at room temperature for 10 minutes to stain viable cells.
  • the cells were washed twice with 1 ⁇ PBS, and confocal laser scanning was performed.
  • the results are shown in Figure 3.
  • the fluorescence of fluorescein which is the antibody labeling group, was clearly observed. Fluorescein fluorescence was also slightly observed for anti-CD9 antibody (CD9) and anti-CD81 antibody (CD81). When anti-TSG101 antibody (TSG101) was used, no fluorescence was observed.
  • anti-CD63 antibody is incorporated, but when Cal27 cells are used instead of Hela cells, anti-CD9 antibody is preferentially incorporated.
  • anti-CD63 antibody and anti-CD9 antibody are taken up into cells after binding to exosomes present in the cell culture supernatant.
  • Example 2 and Comparative Example 1 Cellular uptake of antibody / nucleic acid complex (FIG. 4) We examined whether antibodies recognizing exosome surface antigens were taken into cells together with exosomes.
  • Hela cells cervical cancer cells were added at 9000 cells / well to a multiwell glass bottom dish (manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) and incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator.
  • Anti-CD63 antibody-9r / nucleic acid complex (anti-CD63 IgG-9r + anti-miR (Cy5)) was added to each well.
  • the anti-miR (Cy5) used is 5′-Cy5-aguca auagg gugug ugaga gacuu acug-3 ′ (manufactured by Fasmac, SEQ ID NO: 1).
  • anti-CD63 IgG and anti-miR were added instead of anti-CD63 IgG-9r / nucleic acid complex.
  • Phalloidin was used for cytoskeleton staining.
  • Phalloidin is an oligopeptide that specifically binds to polymerized actin (F-actin) that constitutes the cytoskeleton.
  • the cells were washed twice with 1 ⁇ PBS, and confocal laser scanning was performed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, the anti-CD63 antibody / nucleic acid complex (anti-CD63 IgG-9r + anti-miR (Cy5)) was shown to be taken up into cells.
  • Example 3 microRNA function inhibitory effect of anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex (FIG. 6) After the anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex was taken up into cells, it was evaluated whether or not it exerts a microRNA function inhibitory effect.
  • Hela cells cervical cancer cells were added to a 96-well plate at 4500 cells / well, and incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator.
  • MicroRNA (miR-Luc) targeting luciferase mRNA was introduced into each well (Lipofectamine RNAiMAX). Incubation was performed at 37 ° C. for 18 hours in a 5% CO 2 incubator to introduce a luciferase expression plasmid (pGL4.13 & pGL4.73) (Lipofectamine 2000).
  • anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex anti-CD63 IgG-9r + anti-miR-Luc
  • anti-miR-Luc only 300 nM
  • anti-CD63 antibody alone 600 nM
  • firefly luciferin was added to perform luciferase assay.
  • the complex was anti-CD63 antibody (300 nM) / anti-miR nucleic acid (300 nM) or anti-CD63 antibody (600 nM) / anti-miR nucleic acid (300 nM). The results are shown in FIG.
  • the anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex exhibits a function-inhibiting effect on microRNA after being taken up into cells.
  • Example 4 Function-inhibiting effect of anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex on exosome-encapsulated microRNA Whether anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex exerts a function-inhibiting effect on exosome-encapsulated microRNA evaluated.
  • Cal27 oral epithelial cancer cells
  • a 96-well plate at 50,000 cells / well, and incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator.
  • the cells were cultured under hypoxia (0.1% O 2 ) or normoxia (20% O 2 ) conditions, and exosomes (10 ⁇ g / ml) were added.
  • anti-CD63 antibody / anti-miR nucleic acid complex anti-CD63 IgG-9r + anti-miR21
  • anti-CD63 antibody + anti-miR-21 no addition (control)
  • a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours, and wound healing by scratching (% Wound closure) was observed.
  • the results are shown in FIG.
  • Example 5 In vivo function inhibitory effect of anti-CD63 antibody / anti-miR21 nucleic acid complex (FIG. 9) It was evaluated whether the anti-CD63 antibody / anti-miR21 nucleic acid complex exerts a function-inhibiting effect on microRNA even in vivo.
  • the complex of the present invention is effective in suppressing tumor growth in vivo.

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Abstract

本発明は、エクソソーム表面抗原を標的とする抗体又は抗体断片と遺伝子又はその発現産物の抑制剤を含む複合体であって、前記抗体又は抗体断片と前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は直接又はリンカーを介して共有結合するか、或いは、非共有結合的に結合している、複合体を提供するものである。

Description

エクソソームの遺伝子機能を抑制することができる複合体、がんの増殖及び／又は転移抑制剤
　本発明は、エクソソーム（exosome）の遺伝子機能を抑制することができる複合体、がんの増殖及び／又は転移抑制剤に関する。
　近年、Ｔ細胞、血小板、上皮細胞、免疫細胞やがん細胞をはじめとする多様な細胞がエクソソームと呼ばれる直径40～100nmの小胞を放出することにより、遠く離れた細胞まで情報を伝達する機構が見出された。
　とりわけ、血中に分泌されたエクソソームに含まれるmiRNAなどの遺伝子の発現産物が、がん細胞の増殖能並びに転移能を支配するという新たなメカニズムが示唆されており、非常に注目を浴びている。
　エクソソーム内のmiRNAの機能を抑制するために、miRNAに相補的な配列を有する修飾核酸（アンチセンス核酸）を用いる手法が一般的である（非特許文献１～３）。しかし、血中に存在するmiRNAはエクソソームに内包されているため、血中にアンチセンス核酸を投与しても直接ターゲッティングするのは困難である。
　エクソソームを薬物輸送担体として用いる手法は多数知られている（非特許文献３～５、特許文献１～２）。
特開2010-285426 特開2014-185090
G. Hutvagner, M. J. Simard, C. C. Mello and P. D. Zamore, PLoS Biol., 2004, 2, E98. U. A. Orom, S. Kauppinen and A. H. Lund, Gene, 2006, 372, 137－141 S. Davis, B. Lollo, S, Freier and C. Esau, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 2294－2304 Lai CP, Mardini O, Ericsson M, Prabhakar S, Maguire CA, Chen JW, et al.Acs Nano. 2014; 8(1):483－94 Smyth T, Petrova K, Payton NM, Persaud I,Redzic JS, Graner MW, et al.Bioconjugate Chem. 2014; 25(10):1777－84
　本発明は、エクソソームに含まれるmiRNAなどの遺伝子又はその発現産物の機能を阻害する新たな手法を提供することを主な目的とする。
　本発明は、以下の複合体及びがんの増殖及び／又は転移抑制剤を提供するものである。
項１．　エクソソーム表面抗原を標的とする抗体又は抗体断片と遺伝子又はその発現産物の抑制剤を含む複合体であって、前記抗体又は抗体断片と前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は直接又はリンカーを介して共有結合するか、或いは、非共有結合的に結合している、複合体。
項２．　エクソソーム表面抗原がCD9、CD63、CD81又はCD147である、項１に記載の複合体。
項３．　前記抗体又は抗体断片はシステイン、アルギニン、リシン及びオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチドで修飾され、前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は前記ペプチドと共有結合（Ｓ－Ｓ結合）、配位結合又は非共有結合的に結合してなる、項１又は２に記載の複合体。
項４．　前記ペプチドは、グリシン又はアラニンをさらに含む、項３に記載の複合体。
項５．　前記ペプチドは、ポリリシン又はポリアルギニンである、項３に記載の複合体。
項６．　前記ペプチドがポリアルギニンである、項５に記載の複合体。
項７．　前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は抗miRNA核酸であり、前記抗miRNA核酸はエクソソームに含まれるmiRNAと相補鎖を形成することでmiRNAの機能を抑制する核酸である、項１～６のいずれか１項に記載の複合体。
項８．　前記抗体又は抗体断片が抗CD63抗体である、項１に記載の複合体。
項９．　前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤がエクソソーム中に存在するmiRNA又は遺伝子の抑制剤である、項１に記載の複合体。
項１０．　遺伝子又はその発現産物の抑制剤がmiRNA抑制剤である、項１に記載の複合体。
項１１．　前記抗体又は抗体断片がモノクローナル抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv又はscFvである、項１に記載の複合体。
項１２．　項１～１１のいずれか１項に記載の複合体を含む、がんの増殖及び／又は転移抑制剤。
　本発明によれば、特にがん転移と増殖に関与するエクソソームに含まれる遺伝子機能を効果的に抑制することができる。
本発明の複合体(conjugate)の作用機序の概念図 実施例１の蛍光標識抗体の製造スキームを示す模式図 実施例１の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真 実施例２の複合体の製造スキームを示す模式図 実施例２及び比較例1の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真。上段の「anti-CD63 IgG + RNA(Cy5)」が比較例1であり、下段の「anti-CD63 IgG-9r + RNA(Cy5)」が実施例１である。phalloidin は、細胞骨格を構成する重合アクチン（F-actin)と特異的に結合するオリゴペプチドで、細胞骨格の染色に用いた。 実施例３の製造スキームを示す模式図 細胞内に取り込まれたanti-CD63抗体／anti-miR複合体のmicroRNAに対する機能阻害効果 エクソソームmiR21依存性の細胞増殖抑制 in vivoにおけるanti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体のin vivoにおける効果
　遺伝子又はその発現産物の抑制剤は、エクソソーム中に含まれる遺伝子の機能の抑制剤であり、例えば低分子化合物、miRNA抑制剤、DNA抑制剤、mRNA抑制剤、tRNA抑制剤、rRNA抑制剤、piRNA抑制剤、non-coding RNA抑制剤、アプタマー、抗体、F(ab’)2断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、アフィボディ、ナノボディ、選択的抗体足場（例えば、ダイアボディなど）が挙げられる。
　本発明の１つの好ましい実施形態において、遺伝子又はその発現産物の抑制剤としては、低分子化合物、抗miRNA核酸が挙げられる。低分子化合物としては、シスプラチン、5FU（５－フルオロウラシル）、ドキソルビシン、アクチノマイシン、マイトマイシン、シクロホスファミド、メルフェラン等が挙げられる。
　抗体又は抗体断片としては、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFvが挙げられる。
　miRNA（microRNA）は、エクソソームに含まれる１５～３０個程度、特に１８～２５個程度の塩基を含むRNAである。本発明において、エクソソームとは、哺乳動物細胞から放出される小胞を広く含む。哺乳動物としては、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットなどが挙げられ、特にヒトが好ましい。哺乳動物細胞は、特に腫瘍細胞、樹状細胞、マクロファ－ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、網状赤血球、上皮細胞、線維芽細胞などが挙げられ、特に腫瘍細胞が挙げられる。エクソソームの直径は３０～２００ｎｍ程度、好ましくは３０～１００ｎｍ程度である。
　抗体又は抗体断片の標的となるエクソソーム表面抗原としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１４７等が挙げられる。抗体又は抗体断片の標的となる好ましいエクソソーム表面抗原は、ＣＤ９、ＣＤ６３であり、より好ましくはＣＤ６３である。
　本発明の複合体は、エクソソーム表面抗原を標的とする抗体又は抗体断片と遺伝子又はその発現産物の抑制剤を必須の構成要素として含む。
　エクソソーム表面抗原を標的とする抗体又は抗体断片としては、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ１４７抗体、或いはこれらの抗体の断片等が挙げられ、好ましくは抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体又はその抗体断片であり、より好ましくは抗ＣＤ６３抗体又はその抗体断片である。
　抗miRNA核酸は、エクソソームに存在するmiRNAの相補配列を含み、miRNAと相補鎖を形成することでmiRNAの機能を抑制することができる。抗miRNA核酸は、miRNAの相補配列のみから構成されていてもよく、miRNAの相補配列の5’末端側もしくは3’末端側に任意の配列が付加されていてもよい。付加される配列の塩基の数は、50個以下、好ましくは40個以下、より好ましくは20個以下、さらに好ましくは10個以下、特に5個以下であり、最も好ましい抗miRNA核酸は、標的のmiRNAに対する相補鎖のみからなる。抗miRNA核酸は、DNA、RNA、或いは、核酸誘導体であり、好ましくはRNAである。核酸誘導体としては、核酸の塩基部分、リボース部分、リン酸ジエステル結合部分等の原子（例えば、水素原子、酸素原子）もしくは官能基（例えば、水酸基、アミノ基）が他の原子（例えば、水素原子、硫黄原子）、官能基（例えば、アミノ基）、もしくは炭素数１～６のアルキル基で置換されたものまたは保護基（例えばメチル基またはアシル基）で保護されたもの、またはこれらの部分が非天然型の成分（例えば、ペプチド結合）で置換されたものをいう。このような核酸誘導体としては、例えば塩基部分をペプチド結合で連結したペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、架橋化核酸(ＢＮＡ）、塩基のアミノ基の水素原子を炭素数１～６のアルキル基で置換した核酸、リボース部分の水酸基の立体配置を変換した核酸、およびリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエートを含む核酸等が挙げられる。
　抗miRNA核酸は、標的となるmiRNAの相補配列を１個含んでいてもよく、２個以上（例えば、２～１０個、好ましくは２，３，４，５個）の相補配列を直接或いは適当な塩基を介在させて複数含んでいてもよい。また、相補配列は、１種類の配列を複数含んでいてもよく、多種類の相補配列を各々含んでいてもよい。抗miRNA核酸は、1本鎖だけでなく、２本鎖核酸であってもよい。２本鎖核酸としては、dsRNA、siRNAが挙げられ、shRNAのようなヘアピン構造を有するRNAも抗miRNA核酸に含まれる。２本鎖核酸には、DNA-RNAハイブリッドも含まれる。
　機能抑制の対象となるエクソソームの遺伝子又はその発現産物は、特にがんの増殖、転移に関与するものである。
　遺伝子又はその発現産物の抑制剤、例えばmiRNA抑制剤は、抗体又は抗体断片と直接又はリンカーを介して共有結合してもよく、非共有結合的に結合してもよい。非共有結合的な結合としては、イオン結合、配位結合、疎水性相互作用が挙げられる。例えば、抗体又は抗体断片が少なくとも１個のシステイン残基を含むペプチドで修飾されている場合、ＳＨ基を有する遺伝子又はその発現産物の抑制剤はシステインのＳＨ基を介して、Ｓ-Ｓ結合により共有結合することができ、或いは、金属イオンを介して、－Ｓ－(金属イオン)－Ｓ－の配位結合により結合することができる。システイン残基の数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。抗体又は抗体断片がアルギニン残基を含むペプチドで修飾されている場合、抗miRNA核酸のようなアニオン性の遺伝子又はその発現産物の抑制剤は、アルギニン残基のカチオンとイオン結合により非共有結合することができる。また、抗体又は抗体断片がリシン残基又はオルニチン残基を含むペプチドで修飾されている場合、抗miRNA核酸のようなアニオン性の遺伝子又はその発現産物は、リシン残基又はオルニチン残基のカチオンとイオン結合により非共有結合することができ、或いは、リシン残基又はオルニチン残基の末端のアミノ基（ＮＨ２）を介して直接又は適当なリンカーを介して共有結合することもできる。
　抗体又は抗体断片に直接又はリンカーを介して結合されるペプチドは、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）から選択される塩基性アミノ酸から構成されるペプチドが好ましい。ペプチドは、リンカー長の調整のためにグリシン又はアラニン残基を含んでいてもよい。塩基性アミノ酸は、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）がより好ましい。１つの好ましい実施形態のペプチドは、ポリアルギニン又はポリリシンである。ペプチドにおけるアミノ酸の数は、アニオン性の遺伝子又はその発現産物の抑制剤(例えばmiRNA抑制剤)を結合できる限り特に限定されないが、例えば４～５０個、好ましくは５～４０個、より好ましくは６～３０個、さらに好ましくは７～２５個、特に好ましくは８～２０個である。例えば、ペプチドが塩基性アミノ酸のみから構成される場合、ペプチドに結合できるアニオン性の遺伝子又はその発現産物の抑制剤(例えばmiRNA抑制剤)の数は１個又は２個であり、好ましくはペプチドとアニオン性の遺伝子又はその発現産物の抑制剤は、１対１で結合する。ペプチドは、１つの抗体又は抗体断片に対し１～１０個、１～８個、１～６個、１～４個。或いは１～２個結合させることができる。ペプチドを抗体に複数結合させることで、複数のmiRNA抑制剤を含む複合体を得ることができる。エクソソーム内のmiRNA の種類は200種類を超えるとされており、標的となるmiRNAが多数存在する場合には、抗体１個に複数のペプチドを結合させ、多種類のmiRNA抑制剤を結合させることができる。また、エクソソームにCD9、CD63、CD81、CD147などの表面抗原が多数存在する場合には、抗体の数を増やして対応してもよい。
　本明細書において、「ペプチドで修飾された抗体又は抗体断片」とは、ペプチドが抗体又は抗体断片に共有結合していることを意味する。ペプチドが結合される場所は、抗体又は抗体断片の定常領域（CH1、CH2、CH3）、Ｆｃ領域などの定常領域が挙げられる。抗体又は抗体断片へのペプチドの結合は、常法に従い行うことができ、例えば下記のスキーム１に従い行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Abは抗体又は抗体断片であり、Ab に結合したNH2は、Abの結合に大きく影響しない領域(例えばCH1,CH2,CH3、Fc領域などの定常領域）のアミノ酸のアミノ基である。Ｐ１は、システイン、アルギニン、リシン及びオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチド又は遺伝子又はその発現産物の抑制剤である。）
　抗体又は抗体断片(1)と化合物(2)を反応させてアミジン化合物(3)とし、これと化合物(4)を反応させてペプチド或いは遺伝子又はその発現産物の抑制剤が結合した抗体又は抗体断片(5)を得ることができる。ペプチド或いは遺伝子又はその発現産物の抑制剤が結合した抗体又は抗体断片(5)を得るための具体的な反応条件は、ACS Chem. Biol. 2011, 6, 962-970などの記載を参考にして当業者は容易に決定することができる。上記のスキーム１は単なる例示であり、ペプチド或いは遺伝子又はその発現産物の抑制剤が抗体又は抗体断片に直接もしくは適当なリンカーを介して共有結合している限り、全て本発明に含まれる。
　ペプチド、遺伝子又はその発現産物の抑制剤が抗体又は抗体断片と結合するときのリンカーとしては、―O―、－CO－、－CONH－、―NHCO―、－NH2－、―(OCH2CH2)n―、マレイミド基とスクシンイミド基を末端に有する二価のリンカー等が挙げられる。
　ペプチドが結合した抗体又は抗体断片は、抗miRNA核酸と水などの溶媒中で混合することで、複合体を形成する。
　本発明の複合体は、図１に示すように、血管内に注入されると抗体又は抗体断片部分でエクソソームと結合する。このとき、遺伝子又はその発現産物の抑制剤（図1ではanti-miR）はエクソソームの外に存在するが、エクソソームが細胞内に取り込まれると、エクソソームとともに細胞内に取り込まれ、細胞内でエクソソームが壊れて遺伝子又はその発現産物の抑制剤（図1では抗miRNA核酸）が放出されると、遺伝子又はその発現産物の機能を抑制することができる。機能が抑制される遺伝子又はその発現産物ががんの増殖、転移に関わる場合には、本発明の複合体はがんの増殖及び／又は転移抑制剤になる。がんの増殖及び／又は転移抑制のために、本発明の複合体は、成人１日当たり１μｇ～１ｇ程度を投与すればよい。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　実施例において、anti-CD63抗体はコスモバイオ製、anti-CD 9抗体とanti-CD81抗体はabcam製、anti-TSG101抗体はabnova製を使用した。
実施例１：蛍光標識抗体の細胞内取り込み(図2)
　エクソソーム表面抗原を認識する抗体が、エクソソームとともに細胞内に取り込まれるかどうかを検証した。
　マルチウェルガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社製）にHela細胞(子宮頸ガン細胞)を9000個／wellで加え、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。各ウェルに蛍光標識抗体（anti-CD63抗体、anti-CD9抗体、anti-CD81抗体、抗TSG101抗体）を加え、さらに5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。上清を除去し、1×PBSで細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒド100μLを加え、室温で5分間インキュベートして細胞を固定した。1×PBSで細胞を2回洗浄し、1×PBS 中のHoechst33342を200μL(最終濃度5μM)加え、室温で10分間インキュベートして、生細胞を染色した。1×PBSで細胞を2回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡撮影を行った。結果を図3に示す。図3に示すように、anti-CD63抗体(CD63)で処置した細胞において、抗体の標識基であるフルオレセインの蛍光がハッキリと観察された。anti-CD9抗体(CD9) 、anti-CD81抗体(CD81)に関してもフルオレセインの蛍光が僅かながら観察された。anti-TSG101抗体(TSG101)を用いた場合には、蛍光発光は観察されなかった。
　Hela細胞を用いた上記の例では、anti-CD63抗体が取り込まれているが、Hela細胞に代えてCal27細胞を用いたときには、anti-CD9抗体が優先的に取り込まれる。
　anti-CD63抗体とanti-CD9抗体は、細胞培養上清に存在するエクソソームに結合した後、細胞内に取り込まれることが示唆された。
実施例2及び比較例1：抗体／核酸複合体の細胞内取り込み(図4)
　エクソソーム表面抗原を認識する抗体が、エクソソームとともに細胞内に取り込まれるかどうかを検証した。
　マルチウェルガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社製）にHela細胞(子宮頸ガン細胞)を9000個／wellで加え、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。各ウェルにanti-CD63抗体-9r／核酸複合体(anti-CD63 IgG-9r + anti-miR(Cy5))を添加した。使用したanti-miR(Cy5)は、5’-Cy5-aguca auagg gugug ugaga gacuu acug- 3’（ファスマック社製、配列番号1）である。
　比較例1として、anti-CD63 IgG -9r／核酸複合体の代わりにanti-CD63 IgGとanti-miR(Cy5)を添加した。
　細胞骨格の染色にphalloidinを用いた。Phalloidinは細胞骨格を構成する重合アクチン（F-actin)と特異的に結合するオリゴペプチドである。
　5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。上清を除去し、1×PBSで細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒド100μLを加え、室温で5分間インキュベートして細胞を固定した。1×PBSで細胞を2回洗浄し、1×PBS 中のAlexa488標識phalloidine溶液を200μL(最終濃度100 nM)加え、室温で20分間インキュベートした。phalloidine溶液を除去し、1×PBS 中のHoechst33342を200μL(最終濃度5μM)加え、室温で10分間インキュベートして、生細胞を染色した。1×PBSで細胞を2回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡撮影を行った。結果を図5に示す。図5に示すように、抗CD63抗体／核酸複合体(anti-CD63 IgG-9r + anti-miR(Cy5))は、細胞内に取り込まれることが示された。
実施例３：anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体のmicroRNA機能阻害効果(図6)
　anti-CD63抗体/ anti-miR核酸複合体が細胞内に取り込まれた後、microRNA機能阻害効果を発揮するかどうかを評価した。
　96ウェルプレートにHela細胞(子宮頸ガン細胞)を4500個／wellで加え、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。各ウェルにルシフェラーゼmRNAを標的とするmicroRNA(miR-Luc)を導入した（Lipofectamine RNAiMAX）。5％ CO2 インキュベータで、37℃で18時間インキュベートし、ルシフェラーゼ発現プラスミド(pGL4.13＆pGL4.73)を導入した（Lipofectamine 2000）。5％ CO2 インキュベータで、37℃で6時間インキュベートし、anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体(anti-CD63 IgG-9r + anti-miR-Luc)、anti-miR－Lucのみ(300nM)、あるいは、anti-CD63抗体のみ(600nM)を添加し、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートし、ホタルルシフェリンを添加してルシフェラーゼアッセイを行った。前記複合体は、anti-CD63抗体(300nM)／anti-miR核酸(300nM)、又は、anti-CD63抗体(600nM)／anti-miR核酸(300nM)であった。結果を図7に示す。
　anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体は、細胞内に取り込まれた後、microRNAに対する機能阻害効果を発揮することが確認された。
実施例４：anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体のエクソソーム内包型microRNAに対する機能阻害効果
　anti-CD63抗体/ anti-miR核酸複合体がエクソソーム内包型microRNAに対する機能阻害効果を発揮するかどうかを評価した。
　96ウェルプレートにCal27(口腔上皮がん細胞)を50000個／wellで加え、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートした。細胞をスクラッチした後にhypoxia（0.1% O2）又はnormoxia（20% O2）条件下で培養し、エクソソーム(10μg/ml)を添加した。次いでhypoxia exosome添加系において、anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体(anti-CD63 IgG-9r + anti-miR21)、anti-CD63抗体 + anti-miR-21(リンカー無し)または無添加(コントロール)の系で、5％ CO2 インキュベータで、37℃で24時間インキュベートし、スクラッチによる創傷治癒（% Wound closure）を観察した。結果を図８に示す。
　anti-CD63抗体／anti-miR核酸複合体は、エクソソームmiR21 dependentな細胞増殖を抑制することが明らかになった。
実施例５：anti-CD63抗体／anti-miR21核酸複合体のin vivo機能阻害効果(図9)
　anti-CD63抗体/ anti-miR21核酸複合体がin vivoにおいてもmicroRNAに対する機能阻害効果を発揮するかどうかを評価した。
　Cal27(口腔上皮がん細胞)を500,000個/200μL/PBSをヌードマウス(nu/nu BALB)の臀部に移植し、14日後に腫瘍系を測定した。Cal27とともにPBSのみを投与したもの(PBS)をコントロールとし、anti-CD63抗体／anti-miR21核酸複合体(anti-CD63 IgG-9r + anti-miR21)又は、anti-CD63抗体 + anti-miR21(各々単体投与)を投与したものと比較した。結果を図9に示す。 
　本発明の複合体は、in vivoでの腫瘍増殖の抑制に有効であることが明らかになった。

Claims (12)

  1. エクソソーム表面抗原を標的とする抗体又は抗体断片と遺伝子又はその発現産物の抑制剤を含む複合体であって、前記抗体又は抗体断片と前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は直接又はリンカーを介して共有結合するか、或いは、非共有結合的に結合している、複合体。
  2. エクソソーム表面抗原がCD9、CD63、CD81又はCD147である、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記抗体又は抗体断片はシステイン、アルギニン、リシン及びオルニチンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含むペプチドで修飾され、前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は前記ペプチドと共有結合（Ｓ－Ｓ結合）、配位結合又は非共有結合的に結合してなる、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 前記ペプチドは、グリシン又はアラニンをさらに含む、請求項３に記載の複合体。
  5. 前記ペプチドは、ポリリシン又はポリアルギニンである、請求項３に記載の複合体。
  6. 前記ペプチドがポリアルギニンである、請求項５に記載の複合体。
  7. 前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤は抗miRNA核酸であり、前記抗miRNA核酸はエクソソームに含まれるmiRNAと相補鎖を形成することでmiRNAの機能を抑制する核酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載の複合体。
  8. 前記抗体又は抗体断片が抗CD63抗体である、請求項１に記載の複合体。
  9. 前記遺伝子又はその発現産物の抑制剤がエクソソーム中に存在するmiRNA又は遺伝子の抑制剤である、請求項１に記載の複合体。
  10. 遺伝子又はその発現産物の抑制剤がmiRNA抑制剤である、請求項１に記載の複合体。
  11. 前記抗体又は抗体断片がモノクローナル抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv又はscFvである、請求項１に記載の複合体。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の複合体を含む、がんの増殖及び／又は転移抑制剤。
     
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