IT201900015806A1 - Complesso chimerico e suoi usi terapeutici - Google Patents

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Daniela Taverna
Lorena Quirico
Francesca Orso
Franciscis Vittorio De
Carla Lucia Esposito
Silvia Catuogno
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Univ Degli Studi Di Torino
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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Complesso chimerico e suoi usi terapeutici”
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici delle patologie tumorali, in particolare dei tumori solidi, più particolarmente delle patologie tumorali caratterizzate da elevata attività metastatica.
Le patologie tumorali sono tipicamente caratterizzate dalla progressione attraverso stadi successivi di crescente gravità. In una fase iniziale, le cellule normali, a seguito di modifiche genetiche, iniziano a proliferare in maniera anomala in un microambiente costituito da cellule stromali incorporate in una matrice extracellulare rimodellata e infiltrata da cellule immunitarie.
Allorché alcune cellule tumorali acquisiscono la capacità di invadere i tessuti adiacenti, intravasare, muoversi attraverso il sistema vascolare, arrestarsi nei capillari, extravasare nel parenchima tissutale circostante, si assiste alla formazione di metastasi a distanza. Poiché la diffusione metastatica è responsabile di oltre il 90% dei decessi associati alle patologie tumorali, un notevole sforzo nel campo della ricerca clinica e farmacologica è volto all’individuazione di terapie appropriate che consentano di bloccare o almeno rallentare lo sviluppo metastatico.
Negli ultimi anni è stato messo in luce il coinvolgimento nella biologia dei tumori dei miRNA, piccoli RNA non codificanti che operano come regolatori post-trascrizionali negativi dei loro geni bersaglio. In particolare, è stato osservato che in una vasta maggioranza di casi la formazione e la progressione della malattia tumorale è associata ad un'espressione aberrante di determinati miRNA, e tale osservazione è supportata da una crescita continua di nuovi dati. Il primo articolo sul ruolo dei miRNA nel cancro è apparso nel 2002 e riguardava le conseguenze della delezione dei miR-15 e miR-16 nella leucemia linfatica cronica (CLL) (Calin, GA, et al., (2002) “Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia”; Proc Natl Acad Sci 99: 15524-15529). Da allora sono stati pubblicati oltre 32.500 studi. Tra la pluralità di miRNA sinora individuati, per i miRNA let-7, la famiglia del miR-29, miR-34 e miR-148b è stata dimostrata un’attività di soppressori di "tumori o metastasi", mentre per il cluster miRNA 17-92, miR-21, miR-10b e miR-214 è stato dimostrato un ruolo di promozione della crescita o della disseminazione del tumore a seconda del contesto tumorale. In particolare, studi recenti hanno dimostrato che il miR-148b controlla la progressione del cancro al seno coordinando un numero elevato di molecole bersaglio, tra le quali l'integrina ITGA5, i suoi attori a valle ROCK1 e PIK3CA/p110α (Cimino, D, et al. (2013) “miR148b is a major coordinator of breast cancer progression in a relapse-associated microRNA signature by targeting ITGA5, ROCK1, PIK3CA, NRAS, and CSF1”, FASEB J 27: 1223-1235) e la molecola di adesione cellulare ALCAM (Penna, E, et al. (2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”, Cancer Res 73: 4098-4111). Inoltre, è stato osservato che l’espressione del miR-148b viene regolata negativamente dal miR-214 prometastatico, suggerendo pertanto che il miR-148b operi in modo antagonistico nel controllo della diffusione del cancro al seno e del melanoma (Orso, F, et al. (2016) “miR-214 and miR-148b Targeting Inhibits Dissemination of Melanoma and Breast Cancer”; Cancer Res 76: 5151-5162.).
A causa del ruolo dei miRNA nella progressione del cancro, sono state sviluppate terapie oncologiche basate sul loro impiego che, però, soffrono di importanti limitazioni dovute alla necessità di efficienti sistemi di somministrazione in vivo.
Vi è pertanto un’urgente necessità di nuove strategie terapeutiche atte a contrastare in maniera mirata la progressione delle patologie tumorali, consentendo in tal modo di prevenire, rallentare e/o inibire la comparsa delle metastasi tumorali e sfavorendo al contempo l’insorgenza di possibili effetti avversi secondari.
Per soddisfare queste ed altre necessità, la presente invenzione mette a disposizione il complesso chimerico e la composizione farmaceutica come definiti nelle annesse rivendicazioni indipendenti.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione sono definiti nelle rivendicazioni dipendenti, che formano parte integrante della descrizione.
Come risulterà chiaramente dalla descrizione dettagliata che segue, la presente invenzione mette a disposizione un complesso chimerico che è definito da una combinazione di caratteristiche atte a conferire a detto complesso un’efficace attività antitumorale accompagnata da una significativa selettività di azione.
In particolare, nel contesto della presente descrizione, il termine “complesso chimerico” si riferisce ad un complesso macromolecolare che comprende due molecole di natura diversa, in particolare una molecola artificiale aptamero ed una molecola miRNA isolata che è presente in natura, capaci di esercitare azioni differenti.
Il complesso chimerico secondo l’invenzione comprende un aptamero diretto verso il recettore tirosina-chinasi AXL.
Nella presente descrizione, il termine aptamero indica una molecola oligonucleotidica di DNA o RNA a singolo filamento capace di legarsi ad una determinata molecola bersaglio, ad esempio una proteina cellulare transmembrana, con elevata affinità e selettività. Il recettore AXL, bersaglio della molecola aptamero secondo l’invenzione, è noto per essere espresso sulla superficie di una larga prevalenza di cellule tumorali diverse, dove esplica un’attività oncogenica.
L’aptamero del complesso chimerico secondo l’invenzione comprende dall’estremità 5’ all’estremità 3’:
(i) la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 1, come descritta in WO2012049108;
(ii) un elemento linker che consiste di una catena alchilica lineare non sostituita contenente da 4 a 20 atomi di carbonio; e
(iii) la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 2.
Preferibilmente, la catena alchilica lineare non sostituita dell’elemento linker contiene da 6 a 18 atomi di carbonio, più preferibilmente 12 atomi di carbonio.
La produzione di un aptamero secondo l’invenzione rientra ampiamente nelle capacità del tecnico medio del settore.
Il complesso chimerico secondo l’invenzione è inoltre caratterizzato dal comprendere un microRNA (miRNA) comprendente: un filamento “guida” che consiste della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 3 e un filamento “passeggero” che consiste dall’estremità 5’ all’estremità 3’ della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 4 e della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 5.
Nella presente descrizione, i termini “microRNA” o “miRNA” indicano corte molecole endogene di RNA non codificanti, aventi una lunghezza generalmente compresa fra 20 e 25 nucleotidi. Nell’ambito della presente descrizione, con il termine “filamento guida” si intende in particolare il filamento di miRNA che viene incorporato nel complesso citoplasmatico effettore, chiamato RISC (RNA-Induced Silencing Complex), che guida il legame specifico del miRNA alla molecola di RNA messaggero bersaglio, mediandone in tal modo l’azione di silenziamento genico. Con il termine “filamento passeggero” si intende altresì il filamento di miRNA che non si associa al complesso RISC all’interno della cellula e viene degradato.
Nel complesso chimerico secondo l’invenzione, la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 3 comprende la sequenza del miR-148b-3p presente nel database miRBase con numero di accesso MIMAT0000759, e la sequenza SEQ ID NO. 4 comprende la sequenza del miR-148b-5p presente nel database miRBase con numero di accesso MIMAT0004699.
Secondo l’invenzione, la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 2 presente all’estremità 3’ terminale dell’aptamero e la sequenza nucleotidica SEQ ID NO.
5 presente all’estremità 3’ terminale del filamento “passeggero” del miRNA sono complementari l’una all’altra. Di conseguenza, come illustrato nella Figura 1A, l’appaiamento di queste due sequenze nucleotidiche consente l’associazione tra l’aptamero e il miRNA e la formazione in tal modo del complesso chimerico dell’invenzione.
La presente invenzione è basata sui risultati ottenuti dagli inventori nelle attività di sperimentazione e ricerca descritte nella parte sperimentale che segue. In breve, studi in vitro condotti dai presenti inventori hanno rivelato che l’impiego del complesso chimerico secondo l’invenzione comporta una significativa riduzione della invasività e capacità migratoria di cellule tumorali che esprimono il recettore AXL, provocando allo stesso tempo una sensibile riduzione dell’espressione di geni bersaglio del miRNA coinvolti nella progressione tumorale (Figura 2 e 3). Inoltre, il trattamento con il complesso chimerico dell’invenzione permette di inibire la formazione e la crescita di mammosfere da tumore del seno in un modello tridimensionale in vitro (Figura 4). È importante sottolineare che gli effetti sopra menzionati sono presenti soltanto nelle cellule che esprimono AXL sulla loro superficie cellulare e non sono presenti nelle cellule che non esprimono questo recettore. Ancora di maggiore importanza, i presenti inventori hanno dimostrato in vivo una elevata azione anti-tumorale del complesso chimerico secondo l’invenzione, che risulta in grado di indurre, dopo somministrazione diretta in xenotrapianti murini, la necrosi e l’apoptosi nelle masse tumorali primarie nonché di bloccare in questi animali la disseminazione delle cellule tumorali e i processi metastatici (Figure 5 e 6).
Gli studi compiuti dagli inventori hanno inoltre evidenziato la particolare selettività dell’azione del complesso chimerico secondo l’invenzione in quanto attivo soltanto su cellule tumorali che esprimono il recettore AXL, ma non di cellule neoplastiche AXL-negative.
Alla luce di quanto sopra-descritto, il complesso chimerico secondo l’invenzione rappresenta uno strumento terapeutico innovativo nel campo oncologico, particolarmente efficace nel contrastare l’invasività tumorale e la progressione metastatica, e caratterizzato al contempo da una notevole riduzione di effetti secondari avversi grazie alla particolare selettività di azione dell’aptamero che è capace di mediare il legame specifico di detto complesso alla cellula tumorale bersaglio AXL-positiva e la sua internalizzazione.
Preferibilmente, il complesso chimerico secondo l’invenzione è resistente all’azione delle nucleasi.
Più preferibilmente, nel complesso chimerico secondo l’invenzione una o più basi pirimidiniche delle sequenze nucleotidiche SEQ. ID NO. 1, 2, 3, 4 e/o 5 sono sostituite con la corrispondente 2’-fluoropirimidina e/o una o più basi puriniche di dette sequenze nucleotidiche sono sostituite con la corrispondente 2’-O-metilpurina.
In una forma di realizzazione, in aggiunta alle sostituzioni nucleotidiche precedentemente descritte, o in alternativa, al fine di incrementare la resistenza alle nucleasi, nel complesso chimerico dell’invenzione l’estremità 3’ della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 2 e/o l’estremità 3’ della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 5 sono bloccate mediante coniugazione con una molecola di biotina.
Ulteriori modifiche delle sequenze nucleotidiche idonee a conferire resistenza alle nucleasi al complesso chimerico dell’invenzione, includono ad esempio, ma non esclusivamente, l’aggiunta di 2’ammino (2’-NH2) ribosio, monotiofosfati o tiofosfati, modifiche al legame fosfodiestere (fosforotioati e metilfosfonati), l’impiego di fosforoamidati, 2’-O-alchilribonucleotidi, sostituzione con locked nucleic acids (LNA) o peptil nucleic acids (PNA).
In un’altra forma di realizzazione, il complesso chimerico dell’invenzione comprende in aggiunta polietilenglicole (PEG) o colesterolo allo scopo di diminuire la clearance renale.
Grazie alla sua attività anti-tumorale mirata, in particolare anti-metastatica, il complesso chimerico secondo l’invenzione è idoneo all’uso nel trattamento terapeutico di patologie tumorali, preferibilmente di patologie tumorali caratterizzate da un’attività alterata del recettore tirosinachinasi AXL.
Tra le patologie tumorali si citano ad esempio, ma non esclusivamente, il melanoma, il tumore del seno e il tumore del polmone.
Nell’ambito dell’invenzione rientra inoltre una composizione farmaceutica comprendente il complesso chimerico dell’invenzione come definito in precedenza, in combinazione con almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
Secondo l’invenzione, la composizione farmaceutica è idonea ad essere impiegata nelle applicazioni mediche terapeutiche sopra indicate con riferimento al complesso chimerico.
La composizione farmaceutica della presente invenzione può essere formulata in qualsivoglia forma di dosaggio idonea, ad esempio, per la somministrazione per via sottocutanea, endovenosa, intraarteriosa, intraperitoneale, intramuscolare, intranasale o inalatoria.
In una forma di realizzazione alternativa, la composizione farmaceutica secondo l’invenzione può essere formulata in una forma di dosaggio idonea per la somministrazione locale intra-tumorale, ad esempio mediante iniezione sotto guida tomografica computerizzata.
Naturalmente la scelta dei veicoli, eccipienti e/o diluenti idonei è effettuata in dipendenza della forma di somministrazione desiderata e tale scelta rientra nelle capacità del tecnico medio del settore. Anche la scelta della dose di principio attivo e del regime di dosaggio rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore, e la loro selezione dipende da svariati fattori quali ad esempio l’età e il peso del paziente<, >il grado di progressione della malattia nonché le dimensioni della massa tumorale da trattare.
L’invenzione è ulteriormente descritta negli esempi che seguono, facendo riferimento ai disegni allegati in cui:
La Figura 1 mostra la struttura del complesso chimerico dell’invenzione e la sua differente capacità di rilasciare il miR-148b nelle cellule tumorali AXL<+ >o AXL-. (A) Rappresentazione schematica del complesso chimerico. (B) Analisi qRT-PCR dei livelli di mRNA di AXL nelle linee cellulari AXL<+>: cellule A549 di adenocarcinoma polmonare, cellule MA-2 e MC-1 di melanoma e cellule MDAMB231 e 4175-TGL di carcinoma mammario e nella linea cellulare AXL<- >SKBR3 di tumore del seno. I risultati sono mostrati come variazioni del livello di espressione (media ± SD) rispetto alle cellule A549, normalizzati rispetto ai livelli di GAPDH. (C-G) Analisi qRT-PCR dell'espressione di miR-148b nelle linee cellulari sopra-indicate non trattate (controlli = ctrl) o trattate con 400 nmol/l di aptamero (axl) o di complesso chimerico dell’invenzione (axl-148b). In alternativa, le cellule sono state trasfettate con 75 nmol/l di precursore del miR-148b (pre-148b) o con il suo controllo negativo (pre-ctrl). I risultati sono mostrati come variazioni del livello di espressione (media ± SD) rispetto ai controlli (ctrl o pre-ctrl), normalizzati rispetto ai livelli dei piccoli RNA nucleolari U6 o U44. Sono stati eseguiti due esperimenti (in triplicato) e ne viene mostrato uno rappresentativo. ns = non significativo; *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001. SD = deviazione standard.
La Figura 2 mostra che il complesso chimerico dell’invenzione è capace di inibire la motilità delle cellule tumorali. Per gli esperimenti sono stati impiegati saggi di migrazione utilizzando dei transwell per valutare la migrazione (A-C), la capacità invasiva attraverso matrigel (D) o la migrazione transendoteliale attraverso un monostrato di cellule endoteliali (HUVECs) piastrate sopra una membrana porosa (E-F) delle cellule tumorali AXL<+ >o AXL<- >(come indicate nella Figura 1) non trattate (controlli = ctrl) o trattate con 400 nmol/l di aptamero (axl) o di complessochimerico dell’invenzione (axl-148b). In alternativa, le cellule sono state trasfettate con 75 nmol/l di precursore del miR-148b (pre-148b) o con il suo controllo negativo (pre-ctrl). I risultati sono espressi come rapporto delle medie ± SEM dell'area coperta dalle cellule tumorali migrate/invasive rispetto alle cellule piastrate (A-D) o come media ± SEM dell'area (pixel) coperta dalle cellule migrate (E-F). Sono stati eseguiti almeno due esperimenti indipendenti (in triplicato) e ne vengono illustrati i risultati rappresentativi. ns = non significativo; *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001. SEM = Errore standard medio.
La Figura 3 mostra che il complesso chimerico dell’invenzione modula l'espressione di ALCAM e ITGA5 nelle cellule tumorali. (A-D) Analisi molecolare Western blot dell'espressione delle proteine ALCAM e ITGA5 nelle cellule tumorali AXL<+ >(A-C) o AXL<- >(D) (come indicate nella Figura 1) non trattate (controlli = ctrl) o trattate con 400 nmol/l di aptamero (axl) o di complesso chimerico dell’invenzione (axl-148b). In alternativa, le cellule sono state trasfettate con 75 nmol/l di precursore del miR-148b (pre-148b) o con il suo controllo negativo (pre-ctrl). Le variazioni proteiche sono state calcolate rispetto ai controlli (ctrl o pre-ctrl), normalizzate rispetto ai controlli di caricamento (α-tubulina o GAPDH) ed espresse come percentuali (%). Sono stati eseguiti almeno due esperimenti indipendenti e ne vengono illustrati i risultati rappresentativi.
La Figura 4 mostra che il complesso chimerico dell’invenzione inibisce la formazione e la crescita di mammosfere derivate da cellule tumorali AXL<+ >ma non da cellule tumorali AXL-. (A) Schema sperimentale seguito relativamente ai saggi sulle mammosfere riferiti alle linee cellulari di carcinoma mammario 4175-TGL o SKBR3. Le cellule sono state piastrate, cresciute in sospensione per 5 giorni e trattate con 200/400 nmol/l di aptamero o complesso chimerico dell’invenzione al giorno 0, 3, 5, come indicato (numeri nei quadrati). (B-C) Controlli (pLenti-empty pLenti4/V5-vuoto) o cellule 4175-TGL di tumore del seno (pLenti4/V5-148b) che sovra-esprimono il miR-148b sono state messe in coltura (giorno 0, in sospensione) ed è stata valutata la formazione e dimensione delle sfere al giorno 5. (D-G) Formazione e crescita delle sfere derivate da cellule di tumore al seno 4175-TGL o SKBR3 al giorno 5, trattate come descritto in (A). (B, D, F) Diagrammi del numero di mammosfere derivate da cellule 4175-TGL o SKBR3 in 50 μl di volume di coltura al giorno 5, indicato come media ± SEM. (C, E, G) In alto: immagini rappresentative di mammosfere derivate al giorno 5. In basso: diagrammi delle dimensioni delle sfere, indicati come media ± SEM della lunghezza della sfera (μm); le linee nere corrispondono alle misure delle dimensioni. (B-G) Sono stati eseguiti due o tre esperimenti indipendenti (in triplicato) e ne vengono illustrati i risultati rappresentativi. ns = non significativo; *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001. SEM = Errore standard medio. Barra della scala = 25 μm (C, E, G).
La Figura 5 mostra che il complesso macromolecolare dell’invenzione previene la disseminazione del tumore al seno nei topi. (A) Schema dell’esperimento: cellule 4175-TGL fluorescenti rosse (che esprimono RFP) sono state iniettate in modo ortotopico nella ghiandola mammaria di topi NOD/SCID/IL2R e il complesso chimerico dell’invenzione o il PBS sono stati somministrati nei tumori a partire dal giorno 9 dopo l'iniezione delle cellule tumorali, quando le masse erano palpabili, (3 trattamenti/settimana, 300 pmoli in 100 μl, 10 iniezioni in totale, come indicato) e le metastasi polmonari sono state valutate dopo 11 (B), 18 (C) o 32 (D) giorni dalle iniezioni di cellule tumorali. Al giorno 32 sono state valutate anche le metastasi epatiche (E) e le cellule tumorali circolanti (CTC) (F). (B-F) Diagrammi del numero totale delle metastasi fluorescenti polmonari ed epatiche o delle CTC come media ± SEM per il numero (n) indicato di topi. Sono mostrate immagini rappresentative di metastasi polmonari o epatiche fluorescenti o delle CTC. CTC = cellule tumorali circolanti. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001. SEM = Errore standard medio. Barra della scala = 800 μm (B-E) o 50 μm (F).
La Figura 6 mostra che il complesso chimerico dell’invenzione previene la disseminazione del melanoma nei topi. (A) Schema dell'esperimento: cellule MA-2 fluorescenti rosse (che esprimono RFP) sono state iniettate nel fianco di topi NOD/SCID/IL2R e il complesso macromolecolare dell’invenzione o il PBS sono stati somministrati nei tumori a partire dal giorno 12 dopo l'iniezione, quando i tumori erano palpabili, (3 trattamenti/settimana, 300 pmoli in 100 μl, 9 iniezioni in totale, come indicato) e i tumori primari o le CTC sono stati analizzati 32 giorni dopo le iniezioni di cellule tumorali. (B) Valutazione delle CTC: immagini rappresentative sono mostrate al di sopra dei diagrammi che rappresentano il numero totale di cellule RFP positive ottenute dal sangue (32 giorni dopo l'iniezione), coltivate in coltura per 7 giorni, rappresentate come medie ± SEM per il numero (n) indicato di topi. CTC = cellule tumorali circolanti. Barra della scala = 50 μm (B). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001. SEM = Errore standard medio.
La Figura 7 mostra la riduzione del numero di cellule AXL positive nei tumori primari murini dopo il trattamento con il complesso chimerico dell’invenzione. In alto: schema dell'esperimento: cellule 4175-TGL fluorescenti rosse (che esprimono RFP) sono state iniettate in modo ortotopico nella ghiandola mammaria di topi NOD/SCID/IL2R e il complesso chimerico dell’invenzione o il PBS sono stati somministrati nei tumori a partire dal giorno 9 post-iniezione, quando le masse erano palpabili, (3 trattamenti/settimana, 300 pmoli in 100 μl, 11 iniezioni in totale, come indicato) e il livello di AXL è stato determinato 32 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali. In basso: (pannello superiore) microfotografie rappresentative delle sezioni FFPE dei tumori primari sottoposte a colorazione immunoistochimica impiegando un anticorpo anti-AXL; ; (pannello inferiore) diagrammi che rappresentano la percentuale (%) di cellule positive rispetto a quelle totali, mostrate come media ± SEM per il numero indicato (n) di topi .Ssono stati valutati 10 campi/ciascun topo. IHC = immunoistochimica. FFPE: fissazione in formalina, inclusione in paraffina. Barra della scala = 25 μm. *** p <0,001. SEM = Errore standard medio.
La Figura 8 mostra la riduzione delle cellule tumorali circolanti (CTC) in vivo dopo il trattamento con il complesso macromolecolare dell’invenzione. In alto: schema dell'esperimento: cellule 4175-TGL fluorescenti rosse (che esprimono RFP) sono state iniettate in modo ortotopico nella ghiandola mammaria di topi NOD/SCID/IL2R e il complesso chimerico dell’invenzione (axl-148b), il complesso scramble (scramble-148b), l’aptamero axl (axl) o il PBS sono stati somministrati nei tumori a partire dall’ottavo giorno dopo l'iniezione, quando le masse erano palpabili, (3 trattamenti/settimana, 300 pmoli in 100 μl, 11 iniezioni in totale, come indicato) e le CTC sono state misurate 31 giorni dopo le iniezioni delle cellule tumorali. In basso: (pannello superiore) microfotografie rappresentative delle CTC; (pannello inferiore) grafico che rappresenta il numero totale delle CTC come media ± SEM per il numero indicato (n) di topi. . CTC = cellule tumorali circolanti. Ns = non significativo *p <0,05, **p <0,01. SEM = Errore standard medio. Barra della scala = 50 μm.
ESEMPI
Procedure sperimentali
Esempio 1: Colture cellulari
Le cellule MA-2 di melanoma (Xu, L, et al. (2008) “Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases”. Mol Cancer Res 6: 760-769.) sono state mantenute come descritto in Penna, E, et al. (2011) “microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C”. EMBO J 30: 1990-2007; Penna, E, et al. (2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”. Cancer Res 73: 4098-4111. Le cellule MDAMB231, SKBR3 e A549 sono state acquistate presso l’American Type Culture Collection (ATCC), mentre le cellule 4175-TGL sono state generosamente fornite da J. Massagué (Minn, AJ, et al. (2005) “Genes that mediate breast cancer metastasis to lung”. Nature 436: 518-524) e mantenute in condizioni di coltura standard. Le cellule HUVECs (cellule endoteliali umane ottenute dal cordone ombelicale) sono state gentilmente fornite da M.F. Brizzi e mantenute come descritto in Penna, E, et al. (2011) “microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C”. EMBO J 30: 1990-2007; Penna, E, et al. (2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”, Cancer Res 73: 4098-4111.
Esempio 2: Reagenti e anticorpi.
Per gli esperimenti descritti di seguito, sono stati utilizzati i seguenti precursori dei miRs: Pre-miR ™ miRNA Precursore Controllo negativo n. 1, Pre-miR ™ miRNA Precursore del hsa-miR-148b (PM10264) (Applied Biosystems). Per l’analisi dei livelli di espressione dei miRNA sono stati usati i seguenti reagenti: MicroRNA TaqMan®: Hsa-miR-148b ID 000471, U6 snRNA ID001973, U44 snRNA ID001904 (Applied Biosystems). Per l’analisi dell’espressione genica sono stati usati i seguenti reattivi: Quantitect Primer Assay: 218300Axl ID 33000 (Qiagen), Qiagen miScript-SYBR Green PCR Kit e miScript Primer Assay: hsa-let-7g ID 1 (Qiagen). Per gli esperimenti sono stati impiegati i seguenti anticorpi primari: anti-Cleaved Caspase-3 (Asp175) # 9661 (Cell Signaling Technology), anti-Ki67 ab15580 (Abcam), anti-AXL (R&D Systems), anti-ITGA5 pAb RM10 (Molecular Biotechnology Center, Università di Torino), anti -CD166 / ALCAM mAb MOG/07 (Novocastra Laboratories), anti-GAPDH pAb V-18 (da Santa Cruz Biotechnology), anti-α-tubulina mAb B5-1-2 (Sigma). Gli anticorpi secondari impiegati sono stati i seguenti: IgG di capra anti-topo coniugato con HRP, IgG di capra anti-coniglio (Santa Cruz Biotechnology), IgG di capra anti-coniglio biotinilato e di coniglio anti-capra biotinilato (Dako).
Esempio 3: Trasfezioni transienti e produzione di linee cellulari stabili
Allo scopo di ottenere l'espressione transiente dei miRNA e delle linee cellulari stabili per l’espressione dei miRNA, i presenti inventori hanno seguito le procedure descritte in Penna, E, et al. (2011) “microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C”. EMBO J 30: 1990-2007; Orso, F, et al. (2016) “miR-214 and miR-148b Targeting Inhibits Dissemination of Melanoma and Breast Cancer”. Cancer Res 76: 5151-5162.
Esempio 4: Preparazione del complesso chimerico dell’invenzione e dei controlli
La produzione di un aptamero secondo l’invenzione rientra ampiamente nelle capacità del tecnico medio del settore.
Al fine di generare il complesso chimerico dell’invenzione, un precursore del miR-148b è stato complessato con una molecola aptamero AXL. In breve, il filamento “guida” del miR-148b è stato appaiato al filamento “passeggero”. Quindi, il filamento “passeggero” del miR-148b e la molecola aptamero AXL, sono stati allungati alle loro estremità 3' con due sequenze di 17 nucleotidi complementari tra loro e appaiati attraverso le loro estremità adesive (sticky ends).
Le sequenze nucleotidiche delle molecole impiegate sono illustrate di seguito.
aptamero AXL
- 5'AUGAUCAAUCGCCUCAAUUCGACAGGAGGCUCAC 3’ (SEQ ID NO. 1);
- 5’ GUACAUUCUAGAUAGCC 3 ' (SEQ ID NO. 2);
miR-148b
filamento “guida” (3P)
- 5' AGUCAGUGCAUCACAGAACUUUGUCUUU 3' (SEQ ID NO. 3); filamento “passeggero” (5P) (dall’estremità 5’ all’estremità 3’)
- 5'AGGUGAAGUUCUGUUAUACACUCAGGCU 3’ (SEQ ID NO. 4); e
- 5’GGCUAUCUAGAAUGUAC 3 ' (SEQ ID NO. 5).
Nel corso degli studi sperimentali condotti dai presenti inventori, sono stati impiegati come controlli un aptamero scramble ed un complesso chimerico axl-let-7g.
Nell’ambito della presente descrizione, il termine “aptamero scramble” è inteso riferirsi a una molecola di aptamero comprendente una sequenza alterata di oligonucleotidi che, pur essendo in grado di ripiegarsi correttamente, non è però in grado di legare e attivare il recettore tirosinchinasi AXL.
L’aptamero scramble che è stato impiegato come controllo contiene, dall’estremità 5’ all’estremità 3’, i seguenti componenti:
- sequenza nucleotidica 5'GGCGCUAGAACCUUCUAAGCGAAUACAUUACCGC 3’ (SEQ ID NO.
6);
- elemento linker che consiste di una catena alchilica lineare non sostituita contenente 12 atomi di carbonio; e
- sequenza nucleotidica 5’GUACAUUCUAGAUAGCC 3’ (SEQ ID NO. 2).
Il complesso chimerico axl-let-7g è descritto in Esposito C.L. et al, “Multifunctional AptamermiRNA Conjugates for Targeted Cancer Therapy”, (2014) Mol Ther. 22(6): 1151–1163.
In particolare, questo complesso comprende un aptamero uguale al complesso chimerico dell’invenzione, associato al piccolo RNA let-7g, le cui sequenze nucleotidiche sono riportate di seguito.
let-7g
filamento “guida”
- 5′GGCUGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUUG3′ (SEQ ID NO. 7) filamento “passeggero” (dall’estremità 5’ all’estremità 3’)
- 5'CAAACUGUACAGGCCACUGCCUUGCC 3’ (SEQ ID NO. 8); e - 5’GGCUAUCUAGAAUGUAC 3' (SEQ ID NO. 9).
Allo scopo di incrementare la stabilità, in una forma di realizzazione del complesso macromolecolare dell’invenzione nelle sequenze nucleotidiche una o più basi pirimidiniche sono state sostituite con la corrispondente 2’-fluoropirimidina e/o una o più basi puriniche sono state sostituite con la corrispondente 2’-O-metilpurina.
Le molecole di RNA sopra descritte sono state sintetizzate presso il centro di chimica di sintesi e biopolimeri, “Beckman Research Institute”, Città della speranza, Duarte, CA.
Il filamento “guida” del miR-148b contiene due basi sporgenti (UU) all'estremità 3' per favorire il processamento mediato dall’enzima Dicer.
Per preparare il complesso chimerico dell’invenzione, il complesso contenente l’aptamero scramble o il complesso axl-let-7g è stata condotta la seguente procedura sperimentale: (i) i filamenti “passeggero” e “guida” del miR-148b o di let-7g sono stati appaiati dopo incubazione in tampone di appaiamento a 95 °C per 10 minuti, a 55 °C per 10 minuti e poi a 37 °C per 20 minuti; (ii) gli aptameri contenenti le sequenze adesive (sticky ends) o scramble sono stati ripiegati (5 minuti 85 °C, 3 minuti su ghiaccio, 10 minuti a 37 °C); (iii) uguali quantità di aptamero/scramble e filamenti “guida” e “passeggero” appaiati sono stati quindi nuovamente appaiati tra loro incubandoli insieme a 37 ° C per 30 minuti. L'efficienza di appaiamento è stata controllata come descritto in Catuogno, S, et al. (2015) “Selective delivery of therapeutic single strand antimiRs by aptamer-based conjugates”. J Control Release 210: 147-159. Per trattare le cellule con i complessi chimerici descritti precedentemente, le cellule sono state piastrate in piastre da 24 pozzetti ad una confluenza dell'80% e trattate 24 ore più tardi con gli aptameri ripiegati aggiungendoli al loro mezzo di coltura.
Esempio 5: Isolamento di proteine o RNA, Western Blot, qRT-PCR
Le procedure per ottenere gli estratti totali di proteine o di RNA, e i saggi Western Blot (WB) e qRT-PCR sono stati eseguiti come descritto in Penna, E, et al. (2011) “microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C”. EMBO J 30: 1990-2007.
Esempio 6: Saggi di proliferazione, migrazione, invasione e migrazione transendoteliale
Le analisi di proliferazione cellulare in vitro, migrazione, invasione e migrazione transendoteliale sono state eseguite come descritto in Penna, E, et al. (2011) “microRNA-214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C”. EMBO J 30: 1990-2007; Penna, E, et al. (2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”. Cancer Res 73: 4098-4111; Cerchia, L, et al. (2012) “Targeting Axl with an high-affinity inhibitory aptamer”. Mol Ther 20: 2291-2303.
Esempio 7: Saggi di formazione di mammosfere
I saggi di formazione delle mammosfere sono stati eseguiti come descritto su https://www.stemcell.com/tumorsphere-culture-humanbreast-cancer-cell-lines-lp.html, su piastre da 24 pozzetti ricoperte di poli-HEMA (poli-2-idrossietilmetacrilato) utilizzando due protocolli diversi. Secondo un primo protocollo, le singole cellule di tumore della mammella (8x10<3 >cellule/pozzetto per le cellule 4175-TGL, 1x10<4 >cellule/pozzetto per cellule SKBR3) sono state piastrate (giorno 0), mantenute in sospensione in MammoCult Medium (StemCell Technologies) e non trattate (controlli = ctrl) o trattate con 400 nmol/1 di aptamero axl o complesso chimerico dell’invenzione. I trattamenti sono stati ripetuti ai giorni 3 e 5 (200 nmol/l). Al giorno 5 sono state valutate la dimensione e il numero delle sfere utilizzando un microscopio Zeiss AxioObserver (Zeiss) e il software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Per la valutazione delle dimensioni, è stato misurato il lato lungo delle sfere (lunghezza). Per la valutazione del numero, è stato contato il numero totale di sfere presenti in 50 μl di volume per ciascun trattamento.
Secondo un protocollo alternativo, le singole cellule sono state piastrate e mantenute come descritto sopra e le mammosfere sono state dissociate al giorno 5, contate, ripiastrate alla stessa densità e trattate allo stesso modo. Le sfere sono state analizzate al giorno 12. In alcuni esperimenti, le cellule sono state marcate al giorno 5 con PKH26 (Sigma, 10-7M, 5 min) e la percentuale (%) di cellule PKH26 positive è stata analizzata al 12° giorno mediante analisi al FACS dopo la dissociazione delle mammosfere per valutare la staminalità. Il FACSCalibur è stato utilizzato per misurare le cellule PKH26 positive sul totale (100%).
Esempio 8: Istologia e immunoistochimica
Sezioni di tessuto spesse 5 μm sono state tagliate dai campioni tumorali fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) e colorate con ematossilina ed eosina (H & E) per osservazioni istologiche standard. Le colorazioni immunoistochimiche (IHC) sono state eseguite utilizzando anticorpi anti-Ki67, anti-caspasi 3 clivata o anti-axl con le tecniche di avidinabiotina-perossidasi (Anti-Mouse HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit, R & D Systems). I vetrini sono stati controcolorati con ematossilina.
Esempio 9: Stabilità del complesso chimerico dell’invenzione nel siero umano
La stabilità del complesso chimerico dell’invenzione nel siero umano è stata verificata come descritto in Catuogno, S, et al. (2015) “Selective delivery of therapeutic single strand antimiRs by aptamer-based conjugates”. J Control Release 210: 147-159.
Esempio 10: Saggi di crescita e metastasi del tumore in vivo
Tutti gli esperimenti eseguiti con animali sono stati condotti in ottemperanza dell’etica. Topi NOD/SCID/IL2R_null (NSG) sono stati iniettati con cellule tumorali come descritto in Penna, E, et al.
(2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”. Cancer Res 73: 4098-4111; Orso, F, et al. (2016) “miR-214 and miR-148b Targeting Inhibits Dissemination of Melanoma and Breast Cancer”. Cancer Res 76: 5151-5162. I tumori, una volta palpabili, sono stati trattati con PBS o con il complesso chimerico dell’invenzione (300 pmol/iniezione, tre iniezioni a settimana). I topi sono stati sacrificati ed analizzati 11, 18 o 32 giorni dopo le iniezioni di cellule MA-2 o 4175-TGL rispettivamente. Il peso e la morfologia del tumore primario e delle metastasi polmonari o epatiche sono stati valutati come descritto in Penna, E, et al. (2013) “miR-214 coordinates melanoma progression by upregulating ALCAM through TFAP2 and miR-148b downmodulation”. Cancer Res 73: 4098-4111; Orso, F, et al. (2016) “miR-214 and miR-148b Targeting Inhibits Dissemination of Melanoma and Breast Cancer”. Cancer Res 76: 5151-5162. Le dimensioni degli organi (fegato, milza, reni) (peso) e la morfologia (colorazione con ematossilina ed eosina) sono stati analizzati al punto finale.
Esempio 11: Isolamento delle cellule tumorali circolanti
Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono state isolate come descritto in Dettori, D, et al. (2018) “Therapeutic Silencing of miR-214 Inhibits Tumor Progression in Multiple Mouse Models”. Mol Ther.
26(8):2008-2018.
Esempio 12: Analisi statistica
Tutti i risultati sono presentati come media ± Deviazione standard (SD) o ± Errore standard medio (SEM), come indicato, e il test t di Student a due code è stato utilizzato per i confronti. * = p <0.05; ** = p <0.01; *** = p <0.001 sono stati considerati statisticamente significativi. ns = indica un valore p non statisticamente significativo.
Risultati
Esempio 13: Trasporto di miR-148b mediato dall’aptamero Axl utilizzando il complesso chimerico dell’invenzione.
I presenti inventori hanno verificato mediante analisi elettroforetica su gel non-denaturante l'efficienza dell’appaiamento del complesso dell’invenzione delle sequenze complementari presenti alle estremità 3’ della molecola aptamero e del filamento “passeggero” del miRNA, e anche l’appaiamento del filamento “guida” con il filamento “passeggero”.
Come dimostrato dall'analisi qRT-PCR e illustrato nella Figura 1, le cellule A549 di adenocarcinoma polmonare, le cellule MA-2 e MC-1 di melanoma e le cellule MDAMB231 e 4175-TGL di carcinoma mammario esprimono AXL (AXL+), mentre le cellule SKBR3 di tumore al seno non lo esprimono (AXL-). Pertanto, cellule AXL+ o AXL- sono state trattate con il complesso chimerico dell’invenzione e i livelli di miR-148b sono stati misurati mediante analisi qRT-PCR dopo 48 ore dal trattamento e confrontati con quelli delle cellule non trattate (controlli = ctrl) o trattate soltanto con la molecola aptamero (axl).
In alternativa, le medesime tipologie di cellule sono state trasfettate con pre-miR-148b (pre-148b) o pre-controllo (pre-ctrl).
Di nota, come mostrato nelle Figure 1C-G, dopo trattamento con il complesso chimerico dell’invenzione, un significativo incremento dell’espressione di miR-148b è stato osservato nelle cellule AXL+, ma non in quelle AXL-, rispetto ai controlli e alle cellule trattate con la molecola di aptamero soltanto, e l'incremento di espressione appariva dose e tempo-dipendente. Nessun aumento dei livelli di miR-148b è stato osservato nelle cellule tumorali AXL+ quando è stato impiegato un complesso chimerico in cui la molecola aptamero è complessata con un altro piccolo RNA, let-7g.
Di contro, è stato misurato un significativo incremento dei livelli di miR-148b in tutte le cellule trasfettate con pre-148b, ma non con prectrl, ivi incluse le cellule SKBR3 che sono AXL-. Al fine di operare un’ulteriore verifica della specificità di trasporto di miR-148b mediante AXL, i presenti inventori hanno generato un complesso chimerico “scramble” in cui una molecola di aptamero con sequenza scramble è stato complessata con miR-148b. Nel presente caso, la sequenza “scramble” corrisponde a una sequenza alterata di oligonucleotidi in grado di ripiegarsi correttamente, ma non in grado di legare e attivare il recettore tirosin-chinasi AXL. Quando cellule AXL+ sono state trattate con molecole di aptamero “scramble” o con complessi chimerici “scramble”, non è stata osservata nessuna alterazione nei livelli di miR-148b, analogamente ai campioni controllo.
I risultati precedentemente illustrati dimostrano il trasporto specifico del miR-148b nelle cellule AXL+ mediante impiego del complesso chimerico dell’invenzione.
Esempio 14: Il complesso chimerico dell’invenzione inibisce il movimento delle cellule tumorali, ma non ne influenza la capacità proliferativa.
Al fine di valutare gli effetti del complesso chimerico dell’invenzione sui tratti metastatici, cellule A549 di adenocarcinoma polmonare, cellule MDAMB231, 4175-TGL e SKBR3 di carcinoma mammario o cellule MA-2 di melanoma non sono state sottoposte a trattamento (ctrl) oppure sono state trattate con l’aptamero “scramble” o con l’aptamero axl o con il complesso chimerico dell’invenzione o, in alternativa, sono state trasfettate con precursori di miR-148b (pre-148b) o controlli (pre-ctrl).
Sulle cellule trattate sono stati eseguiti saggi di migrazione, di invasione attraverso Matrigel, di migrazione transendoteliale attraverso un monostrato di HUVEC e saggi di proliferazione.
Come illustrato nella Figura 2A-F, è stato osservato un effetto inibitorio sulla motilità cellulare per tutte le cellule AXL+, ma non per le cellule SKBR3 AXL-, trattate con l’aptamero axl soltanto o con il complesso chimerico dell’invenzione rispetto alle cellule di controllo (ctrl o “scramble”), e l’effetto inibitorio era maggiore quando veniva impiegato il complesso chimerico dell’invenzione.
Un effetto simile è stato osservato per le cellule trasfettate con pre-148b rispetto al prectrl, sia per le cellule AXL+ che per le cellule AXL-, indicando che gli effetti biologici di miR-148b dopo la somministrazione del complesso chimerico dell’invenzione sono mediati dal trasporto mediante l’aptamero axl, e quindi specifici per le cellule che esprimono AXL.
Sorprendentemente, i presenti inventori non hanno rilevato nessun effetto sulla proliferazione cellulare quando le cellule sono state trattate con il complesso chimerico dell’invenzione o con l’aptamero axl, oppure quando trasfettate con pre-148b rispetto ai controlli (ctrl o pre-ctrl), indicando che l’effetto di miR-148b si esplica principalmente sul movimento cellulare.
Dal momento che le cellule trattate con molecole “scramble” o non trattate (ctrl) davano risultati simili nei test di motilità, i presenti inventori hanno considerato i campioni ctrl come controlli negativi negli esperimenti descritti di seguito.
Esempio 15: Il complesso chimerico dell’invenzione influenza i bersagli diretti del mir-148b nelle cellule tumorali
Con lo scopo di esplorare il meccanismo molecolare alla base degli effetti del complesso chimerico dell’invenzione sui tratti metastatici, i presenti inventori hanno analizzato l'espressione di ALCAM e ITGA5, due bersagli diretti del miR-148b in grado di coordinare l’extravasazione delle cellule tumorali.
Cellule A549 di adenocarcinoma polmonare, cellule MA-2 di melanoma o cellule 4175-TGL e SKBR3 di carcinoma mammario sono state trattate con il complesso chimerico dell’invenzione o con l’aptamero axl soltanto, ed è stata determinata l'espressione delle proteine ALCAM e ITGA5 mediante analisi Western Blot, rispetto alle cellule di controllo (ctrl) o alle cellule trasfettate con precursori del miR-148b (pre-148b) o con i controlli (pre-ctrl).
Come mostrato nella Figura 3A-D, l'espressione di ALCAM e ITGA5 viene ridotta nelle cellule AXL<+>, ma non nelle cellule AXL-, trattate con il complesso chimerico dell’invenzione. Invece, tutte le tipologie di cellule hanno mostrato una riduzione dei livelli di queste due molecole di adesione quando tranfettate con pre-148b, ma non con pre-ctrl.
In sintesi, i risultati ottenuti dai presenti inventori indicano che il complesso chimerico dell’invenzione agisce sul coordinamento delle vie molecolari coinvolte nella disseminazione cellulare.
Esempio 16: Il complesso chimerico dell’invenzione influenza il numero e le dimensioni delle mammosfere Poiché le cellule staminali tumorali (CSC) sono responsabili della diffusione metastatica, i presenti inventori hanno esaminato l'influenza del complessochimerico dell’invenzione sullo sviluppo di mammosfere 3D derivate da cellule 4175-TGL e SKBR3 di carcinoma mammario. A tale scopo, sono state piastrate singole cellule al giorno 0, non trattate (controlli = ctrl), o sottoposte a trattamento ai giorni 0, 3 e 5 con il complesso chimerico dell’invenzione o soltanto con l’aptamero axl, e le mammosfere sono state analizzate al giorno 5 (Figura 4A).
Secondo un procedimento alternativo, le singole cellule sono state piastrate al giorno 0 e le mammosfere derivate sono state dissociate al giorno 5, ri-piastrate e non trattate (controlli = ctrl) o sottoposte a trattamento al giorno 5, 8 e 10 con il complesso chimerico dell’invenzione o soltanto con l’aptamero axl; le mammosfere sono state quindi analizzate al giorno 12.
In tutti gli esperimenti, mediante analisi qRT-PCR i livelli di miR-148b sono risultati aumentati nelle cellule AXL<+ >4175-TGL di carcinoma mammario, ma non in quelle AXL<- >SKBR3, in seguito al trattamento con il complesso chimerico dell’invenzione, rispetto alle cellule trattate con il controllo o con l’aptamero axl. In parallelo, sono state anche piastrate al giorno 0 cellule 4175-TGL che sovraesprimono miR-148b (pLenti4/V5-148b) e controlli vuoti (pLentiempty+pLenti4/5V-empty) e le mammosfere analizzate al giorno 5. Come mostrato nella Figura 4B-C, i presenti inventori hanno osservato che le cellule che esprimono pLenti4/V5-148b hanno generato un numero ridotto di sfere di dimensioni minori rispetto ai controlli pLentiempty+pLenti4/5V-empty. Allo stesso modo, quando sono stati determinati il numero o la dimensione delle sfere o la percentuale (%) di cellule PKH26 positive nelle mammosfere derivate da cellule 4175 al giorno 5 (Figura 4B-E) o al giorno 12, in seguito ai trattamenti descritti precedentemente, è stata osservata una forte riduzione della staminalità per le sfere trattate con il complesso chimerico dell’invenzione rispetto alle cellule trattate con il controllo o l’aptamero axl. Invece, quando il complesso chimerico dell’invenzione è stato impiegato per trattare le mammosfere derivate da cellule SKBR3 AXL-, non è stato rilevato alcun effetto sul numero o sulla dimensione delle mammosfere (Figura 4F-G). In sintesi, i dati prodotti dai presenti inventori mostrano che il complesso chimerico dell’invenzione influenza la formazione e la crescita delle mammosfere in modo dipendente da AXL, in maniera simile alle cellule che sovra-esprimono miR-148b, indicando che il complesso chimerico dell’invenzione è efficace nel bloccare la staminalità delle cellule tumorali e la successiva metastatizzazione.
Esempio 17: Il complesso chimerico dell’invenzione blocca la disseminazione delle cellule tumorali Al fine di valutare l'efficacia del complesso chimerico dell’invenzione sui tumori primari e sulla disseminazione metastatica nei topi, cellule 4175-TGL tRFP-positive di carcinoma mammario o cellule MA-2 di melanoma sono state iniettate rispettivamente in modo ortotopico nella ghiandola mammaria e nel fianco (sottocutaneo) di topi NSG immunocompromessi, e ai topi è stato somministrato il complesso chimerico dell’invenzione o il PBS (controllo), 3 volte a settimana, a partire dal momento in cui i tumori erano palpabili (giorno 9 per 4175-TGL e 12 per MA-2), come mostrato nelle Figure 5 e 6A. Il complesso chimerico dell’invenzione è stato somministrato direttamente negli xenotrapianti e non intravena. Le caratteristiche del tumore primitivo, la formazione di metastasi e le cellule tumorali circolanti (CTC) sono state analizzate al giorno 11, 18 o 32 postiniezione. Le colorazioni con ematossilina ed eosina hanno mostrato un aumento della necrosi tumorale, in particolare delle cellule tumorali AXL<+ >(Figura 7), mentre l'analisi immunoistochimica (IHC) per la caspasi-3 clivata e per Ki67 ha rivelato un aumento dell'apoptosi delle cellule neoplastiche, ma nessuna alterazione della proliferazione. Ancora di maggiore importanza, è stata osservata una significativa riduzione della formazione di metastasi polmonari nei topi trattati con il complesso chimerico dell’invenzione rispetto ai controlli al giorno 11, 18 e 32 per 4175-TGL (Figura 5B-D). In questi animali, ai giorni 31 e 32, è stata anche rilevata una marcata riduzione delle metastasi epatiche e delle CTC rispetto ai gruppi controllo trattati con l’aptamero axl o con il complesso chimerico scramble (Figura 5E e Figura 8). È inoltre interessante notare che il complesso chimerico (axl-148b) risulta maggiormente in grado di bloccare le CTC rispetto all’aptamero axl da solo (Figura 8).
In parallelo, è stata osservata una diminuzione delle CTC al giorno 32 nei topi che portano tumori primari derivati da MA-2, trattati con il complesso chimerico dell’invenzione (Figura 6B). Di particolare nota, in seguito alla somministrazione del complesso chimerico dell’invenzione, non è stata rilevata alcuna tossicità negli animali rispetto ai controlli. Infatti, non è stata rilevata nessuna alterazione di morfologia (analizzata mediante colorazione con ematossilina ed eosina) o di peso nel fegato, milza e reni, alla fine dell'esperimento come nella Figura 5A. Nel loro complesso, i risultati precedentemente illustrati dimostrano che il complesso chimerico dell’invenzione è un potente strumento terapeutico in grado di influenzare la disseminazione dal tumore primario, senza segni di tossicità, con elevato potenziale clinico.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Complesso chimerico isolato comprendente: a) un aptamero diretto verso il recettore tirosinachinasi AXL, detto aptamero comprendendo dall’estremità 5’ all’estremità 3’: (i) la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 1; (ii) un elemento linker, detto elemento linker consistendo di una catena alchilica lineare non sostituita contenente da 4 a 20 atomi di carbonio; e (iii) la sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 2; e b) un microRNA (miRNA) comprendente un filamento “guida” che consiste della sequenza nucleotidica SEQ ID NO.3 e un filamento “passeggero” che consiste dall’estremità 5’ all’estremità 3’ della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 4 e della sequenza nucleotidica SEQ ID NO. 5; in cui le sequenze nucleotidiche SEQ ID NO.2 e SEQ ID NO. 5 sono complementari l’una all’altra.
  2. 2. Complesso chimerico isolato secondo la rivendicazione 1, in cui la catena alchilica lineare non sostituita contiene 12 atomi di carbonio.
  3. 3. Complesso chimerico isolato secondo la rivendicazione 1 o 2, che è resistente alle nucleasi.
  4. 4. Complesso chimerico isolato secondo la rivendicazione 3, in cui una o più basi pirimidiniche delle sequenze nucleotidiche SEQ. ID NO. 1, 2, 3, 4 e/o 5 sono sostituite con la corrispondente 2’-fluoropirimidina.
  5. 5. Complesso chimerico isolato secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui una o più basi puriniche delle sequenze nucleotidiche SEQ. ID NO. 1, 2, 3, 4 e/o 5 sono sostituite con la corrispondente 2’-O-metilpurina.
  6. 6. Complesso chimerico isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia tumorale.
  7. 7. Complesso chimerico isolato per l’impiego secondo la rivendicazione 6, in cui la patologia tumorale è caratterizzata da un’attività alterata del recettore tirosina-chinasi AXL.
  8. 8. Complesso chimerico isolato per l’impiego secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui la patologia tumorale è scelta dal gruppo che consiste di melanoma, tumore del seno e tumore del polmone.
  9. 9. Complesso chimerico isolato per l’impiego secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 8, in cui il trattamento è una terapia che influenza l’insorgenza e/o la progressione della metastasi.
  10. 10. Composizione farmaceutica comprendente un complesso chimerico isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5 ed almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
  11. 11. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10, che è in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via intra-tumorale.
  12. 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10, che è in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via sottocutanea, intravascolare endovenosa, intravascolare intraarteriosa, intraperitoneale, intramuscolare, intranasale o inalatoria.
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