WO2017135316A1 - 変異リゾプス属菌 - Google Patents

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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/845—Rhizopus

Definitions

  • the present invention relates to a mutant genus Rhizopus and a method for producing an organic acid using the same.
  • Organic acids such as lactic acid, malic acid, succinic acid, and fumaric acid are industrially valuable substances that are used in food production and as raw materials for synthetic resins and biodegradable polymers.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose lactic acid production methods using microorganisms into which a promoter of Rhizopus, which is a filamentous fungus, has been introduced.
  • Non-Patent Document 1 reports a mutant Rhizopus genus that produces a large amount of fumaric acid and a small amount of byproduct ethanol production.
  • Patent Documents 4 and 5 in the production of fumaric acid in eukaryotes and prokaryotes under specific conditions, disruption of the pyruvate decarboxylase gene or suppression of pyruvate decarboxylase activity improves fumaric acid productivity. It reports that it contributes.
  • the genetic background of Rhizopus spp. Has not yet been fully studied, it is not easy to develop Rhizopus spp. Suitable for production of useful substances by genetic recombination technology.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,268,189 (Patent Document 2) International Publication No. 2001/73083 (Patent Document 3) International Publication No. 2001/72967 (Patent Document 4) International Publication No. 2009/155382 (Patent Document 3) Reference 5) Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-211042 (Non-Patent Document 1) Korean J Chem Eng, 2010, 27 (1): 183-186
  • the present invention provides a mutant Rhizopus sp. That has reduced activity of pyruvate decarboxylase.
  • the present invention also provides a method for producing a mutant Rhizopus, which comprises reducing the activity of pyruvate decarboxylase in Rhizopus.
  • the present invention also provides a method for improving the organic acid productivity of Rhizopus sp., which comprises reducing the activity of pyruvate decarboxylase in Rhizopus sp.
  • the present invention also provides a method for producing an organic acid, comprising culturing the mutant genus Rhizopus.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence identities are calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis with unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • “at least 80% identity” with respect to an amino acid sequence or nucleotide sequence means 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and even more preferably. 97% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more identity.
  • “at least 85% identity” with respect to an amino acid sequence or a nucleotide sequence is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably An identity of 98% or more, more preferably 99% or more.
  • “at least 95% identity” with respect to an amino acid sequence or nucleotide sequence means 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted or added is 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 An amino acid sequence in which 10 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, and still more preferably 1 or more and 3 or less amino acids are deleted, inserted, substituted or added.
  • nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, inserted, substituted or added is 1 or more and 90 or less, preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 Examples include nucleotide sequences in which one or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less nucleotides are deleted, inserted, substituted or added.
  • “addition” of amino acids or nucleotides includes addition of one or more amino acids or nucleotides to one and both ends of the sequence.
  • operable linkage between a control region and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • operable linkage between a gene and a regulatory region is well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream relating to a gene refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • the “corresponding position” or “corresponding region” on the amino acid sequence or nucleotide sequence represents the maximum homology between the target sequence and the reference sequence (for example, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11). It can be determined by aligning as given. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms and the procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed manually based on the above-described Lipman-Pearson method or the like, but the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). ) With default settings.
  • Clustal W2 or Clustal omega which is a revised version of Clustal W.
  • Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are, for example, European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and Japanese DNA data operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the website of the bank (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • the position or region of the target sequence aligned corresponding to an arbitrary region of the reference sequence by the above alignment is regarded as a “corresponding position” or “corresponding region” for the arbitrary region.
  • the “pdc gene” is a gene encoding pyruvate decarboxylase, and is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; at least 80% identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 And a polynucleotide encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; and one or more nucleotides deleted, inserted, substituted or substituted with respect to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include a gene encoding pyruvate decarboxylase 1 (PDC1) (SEQ ID NO: 2) derived from Rhizopus delmar.
  • PDC1 pyruvate decarboxylase 1
  • the “pdc gene” in the present specification is also a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a polynucleotide encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; and one or more amino acid residues are deleted, inserted, substituted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • “reduction of pyruvate decarboxylase activity” in the mutant microorganism means that the pyruvate decarboxylase activity in the mutant microorganism is 50% or less, preferably 20% or less of the activity of the strain (parent strain) before mutation, More preferably, it means a reduction to 15% or less.
  • the pyruvate decarboxylase activity of microorganisms can be measured according to the method described in the examples below.
  • the present invention relates to the provision of a mutant Rhizopus sp. Having high organic acid productivity and a method for producing an organic acid using the same.
  • the present inventors examined improvement of organic acid productivity of Rhizopus sp. As a result, the present inventors found that organic acid productivity was remarkably improved in Rhizopus spp. In which the activity of pyruvate decarboxylase was reduced, and completed the present invention.
  • the present invention provides a mutant Rhizopus genus having high organic acid productivity. According to the genus Rhizopus of the present invention, efficient microbiological production of an organic acid is realized.
  • the mutant Rhizopus spp. Of the present invention is a mutant Rhizopus spp. With reduced pyruvate decarboxylase activity.
  • filamentous fungi belonging to the genus Rhizopus for example, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrizus, Rhizopus chinissis, Rhizopus nigricans, Rhizopus, Rhizopus.
  • Rhizopus oryzae and Rhizopus delemar are preferable, and Rhizopus delemar is more preferable.
  • Reduction of pyruvate decarboxylase activity in Rhizopus sp. Can be achieved by reducing the expression level of pyruvate decarboxylase in Rhizopus sp. Cells. For example, by deleting or inactivating the pdc gene of the genus Rhizopus, inactivating mRNA transcribed from the pdc gene, or inhibiting translation of the pdc gene from mRNA to protein, pyruvin The activity of acid decarboxylase can be reduced.
  • the “pdc gene” to be deleted or inactivated according to the present invention is as defined above.
  • pyruvate decarboxylase shown in SEQ ID NO: 83 (sometimes referred to herein as a pdc3 gene) are deleted or inactivated.
  • the “pyrubin” defined herein is used.
  • the reduction in acid decarboxylase activity cannot be achieved, and the organic acid productivity improving effect according to the present invention cannot be sufficiently obtained.
  • the activity of pyruvate decarboxylase can also be reduced by reducing the activity of pyruvate decarboxylase expressed in Rhizopus sp.
  • the above modification can be artificially performed using molecular biological or genetic engineering techniques.
  • siRNA inhibition using siRNA As a method for inactivating mRNA of pdc gene in cells, target-specific mRNA inhibition using siRNA can be mentioned.
  • the basic procedure of siRNA is well known to those skilled in the art (see, for example, JP-T-2007-512808), and reagents or kits for siRNA are commercially available.
  • a person skilled in the art can prepare a desired target-specific siRNA and inhibit the target mRNA based on known literature and manuals of commercially available products.
  • Examples of the method for reducing the activity of pyruvate decarboxylase include a method using a PDC inhibitor.
  • Examples of the PDC inhibitor include omeprazole (see Biochem. Pharmacol, 44: 177-179, etc.).
  • Methods for deleting or inactivating the pdc gene in cells include removing part or all of the nucleotide sequence of the pdc gene from the genome or replacing it with other nucleotide sequences, and other methods in the pdc gene sequence. And a method of mutating the transcription or translation initiation region of the pdc gene. Preferably, part or all of the nucleotide sequence of the pdc gene is deleted. More specific examples include a method for specifically deleting or inactivating the pdc gene on the cell genome, and a random deletion or inactivating mutation in the gene in the cell, and then the pdc gene. And a method for selecting a cell having a desired mutation by performing an expression level or activity evaluation of a pyruvate decarboxylase encoded by the gene, or performing a gene analysis.
  • a DNA fragment obtained by randomly cloning the inactivated gene is introduced into the cell, and homologous recombination is performed between the gene on the genome of the cell. And a method of inducing mutations by irradiating cells with ultraviolet rays, ⁇ rays and the like.
  • Site-directed mutagenesis system Mutan-SuperExpress Km kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis kit (CloneOD-Co), a method for producing an inactivated gene includes site-directed mutagenesis.
  • Commercially available kits such as Plus-Mutageness Kit (Toyobo Co., Ltd.) can be used.
  • a cell in which the pdc gene is deleted or inactivated can be selected.
  • cells in which the pdc gene is deleted or inactivated can be selected using the expression level or activity of pyruvate decarboxylase in the cells as an index.
  • Examples of a method for specifically deleting or inactivating a gene in the genome include, but are not limited to, genome editing using an artificial DNA cleaving enzyme (artificial DNA nucleases or Programmable nuclease). It is done.
  • an artificial DNA cleaving enzyme artificial DNA nucleases or Programmable nuclease
  • the deletion or inactivation of the Rhizopus pdc gene according to the present invention is performed by genome editing of the pdc locus.
  • the “pdc locus” refers to a region on the genome including the DNA sequence of the pdc gene, its 5′-side 1000 bp region and its 3′-side 1000 bp region.
  • Genome editing specifically cleaves the DNA duplex at the target locus on the genome, induces deletion, insertion, or substitution of nucleotides in the process of repairing the cleaved DNA, or inserts a foreign polynucleotide. This is a technique for site-specific modification of the genome.
  • Such technologies include TALEN (transcribable activator-like effector nuclease), ZFN (zinc-finger nuclase, etc.), CRISPR (Clustered RegularlyInterpacedShortlandPalmedHardenReductiveCreatingHard-CentricallyReducedHealth) Nature Reviews Genetics, 2014, 15: 321-334, Nucleic Acids Research, 2011, 39: e82, Nucleic Acids Research, 2006, 34: e149, Nature communications, 2013,4: 1762). Kits for genome editing based on these technologies are commercially available, and can be purchased from Life technologies, Cellectis, Transposagen Biopharmaceuticals, and the like.
  • TALEN will be described in detail for the purpose of illustration of genome editing technology only.
  • TALEN is a protein having a transcriptional activator-like (TAL) effector derived from the DNA binding domain of the genus Xanthomonas, which is a phytopathogenic bacterium, and a DNA cleavage domain consisting of DNA nuclease Fok1.
  • the TALEN TAL effector has a structure in which about 17 repeating sequences (repeats) consisting of about 34 amino acids are linked, and each repeat recognizes one nucleotide.
  • the type of base specifically recognized by each repeat depends on the type of two consecutive amino acid residues (referred to as repeat-variable diresidues; RVD) at a specific position in each repeat.
  • RVD repeat-variable diresidues
  • TALEN that specifically recognizes the target genomic DNA sequence.
  • genome editing by TALEN a set of TALENs that specifically recognize upstream and downstream sequences in the vicinity of the genomic DNA region to be cleaved are designed and expressed in cells.
  • a gene encoding a target-specific TALEN is constructed, introduced into a cell, and the TALEN is expressed in the cell.
  • Fok1 contained therein forms a dimer on the cleavage target genomic DNA region and cleaves the DNA duplex.
  • TALEN for deletion or inactivation of Rhizopus sp.
  • Pdc gene examples include TALEN pairs consisting of the following polypeptides (L) and (R).
  • the TAL effector contained in the polypeptide (L) includes a polypeptide in which 17 repeat sequences (repeats) are linked, and includes 5′-TGCCTGCTATTAAAATCG-3 ′. The sequence shown by (SEQ ID NO: 9) is recognized.
  • the TAL effector contained in the polypeptide (R) includes a polypeptide in which 17 repeat sequences (repeats) are linked, and 5′-TTGATTTCCTTAAGACGG-3 ′. The sequence represented by (SEQ ID NO: 10) is recognized.
  • the 1st to 16th repeats from the upstream each consist of an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 Or consisting of an amino acid sequence in which 5 or less amino acid residues are deleted, inserted, substituted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the 1st to 16th repeats from the upstream are deleted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 by deleting or inserting 3 or less amino acid residues in portions other than RVD described later Consists of a substituted or added amino acid sequence.
  • the 17th repeat located in the most downstream among the repeats in the TAL effector (L) consists of an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27.
  • the 1st to 16th repeats from the upstream each consist of an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 Or an amino acid sequence in which 5 or less amino acid residues are deleted, inserted, substituted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28.
  • the 1st to 16th repeats from the upstream are deleted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 by deleting or inserting 3 or less amino acid residues in portions other than RVD described later Consists of a substituted or added amino acid sequence.
  • the 17th repeat located at the most downstream of the repeats in the TAL effector (R) consists of an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44.
  • the 17 repeats in the TAL effector (L) each have two amino acid residues (repeat) that are base recognition sites at positions corresponding to amino acids 12 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. -Variable diresidues (RVD), and the RVD of each repeat recognizes the 2nd to 18th bases of the sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • each of the 17 repeats in the TAL effector (R) has an RVD at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, and the RVD of each repeat has the sequence Recognizes the 2nd to 18th bases of the sequence represented by number 10.
  • the type of amino acid residue of RVD depends on the type of target base as shown below.
  • Target base RVD A NI C HD G / A NN T NG
  • the TAL effector (L) can recognize the sequence represented by SEQ ID NO: 9, 2 or less, preferably 1 of the 17 repeats have RVD corresponding to SEQ ID NO: 9. Not necessary. In other words, 15 or more, preferably 16 or more of the 17 repeats may have RVD corresponding to SEQ ID NO: 9. As long as the TAL effector (R) can recognize the sequence represented by SEQ ID NO: 10, 2 or less, preferably 1 of the 17 repeats do not have an RVD corresponding to SEQ ID NO: 10. Also good. In other words, 15 or more, preferably 16 or more of the 17 repeats may have RVD corresponding to SEQ ID NO: 10.
  • each of the 17 repeats of the TAL effector (L) consists of the following amino acid sequences (1) to (17) in order from the upstream: (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (5) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (6) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (7) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, or an amino acid sequence having at least 95% identity thereto; (8) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence having
  • the amino acid sequences (1) to (17) each have an RVD consisting of the following amino acid residue pairs: (1) amino acid residue NN (guanine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 11; (2) amino acid residue HD (cytosine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 12; (3) amino acid residue HD (cytosine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 13; (4) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 14; (5) amino acid residue NN (guanine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 15; (6) amino acid residue HD (cytosine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 16; (7) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ
  • the TAL effector (L) can recognize the sequence represented by 5′-TGCCCTGCTTTAAAAACG-3 ′ (SEQ ID NO: 9), 15 or more of the repeats (1) to (17), preferably 16 What is necessary is just to have the said RVD at least.
  • each of the 17 repeats of the TAL effector (R) consists of the following amino acid sequences (1 ′) to (17 ′) in order from upstream: (1 ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, or an amino acid sequence having at least 95% identity thereto; (2 ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (3 ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (4 ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (5 ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32, or an amino acid sequence having at least 95% identity with this; (6 ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, or an amino acid sequence having at least 95% identity thereto; (7 ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence having at least 95% identity
  • the amino acid sequences (1 ′) to (17 ′) each have an RVD consisting of the following amino acid residue pairs: (1 ′) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 28; (2 ′) amino acid residue NN (guanine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 29; (3 ′) amino acid residue NI (adenine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 30; (4 ′) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 31; (5 ′) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 32; (6 ′) amino acid residue NG (thymine recognition site) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of SEQ ID NO: 33; (7 ′) amino acid residue pairs
  • the TAL effector can recognize the sequence represented by 5′-TTGATTTCCTTAAGACGG-3 ′ (SEQ ID NO: 10), preferably 15 or more of the repeats (1 ′) to (17 ′) above, 16 or more may have the RVD.
  • the Fok1-like DNA nuclease contained in the polypeptides (L) and (R) refers to a nuclease that dimerizes and functions as a DNA endonuclease.
  • the Fok1-like DNA nuclease is encoded by a polynucleotide consisting of a sequence represented by nucleotides 2416 to 3006 of SEQ ID NO: 3, or a sequence consisting of at least 95% of the same and dimerized to form a DNA endonuclease. It is a nuclease that functions as a nuclease.
  • polypeptides (L) and (R) include the following: Polypeptide (L): A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; or the TAL comprising the amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and targeting the sequence represented by SEQ ID NO: 9 A polypeptide having an effector (L) and a DNA cleavage domain comprising the Fok1-like DNA nuclease, Polypeptide (R): A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or the TAL comprising the amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and targeting the sequence represented by SEQ ID NO: 10 A polypeptide having an effector (R) and a DNA cleavage domain comprising the Fok1-like DNA nuclease.
  • polypeptides (L) and (R) include polypeptides encoded by the following polynucleotides (l) and (r), respectively: Polynucleotide (l): A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3; or the TAL comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and targeting the sequence represented by SEQ ID NO: 9 A polynucleotide encoding a polypeptide having an effector (L) and a DNA cleavage domain comprising the Fok1-like DNA nuclease, Polynucleotide (r): A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; or the TAL comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and targeting the sequence represented by SEQ
  • the polypeptide (L) is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide (R) is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 or a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5.
  • TALEN consisting of the polypeptides (L) and (R) specifically binds to the sense strand and the antisense strand of DNA (SEQ ID NO: 81) containing the pdc locus on the Rhizopus genome, respectively.
  • SEQ ID NO: 81 DNA sequence containing the pdc locus on the Rhizopus genome, respectively.
  • the DNA at the locus is cleaved, and the pdc gene is deleted or inactivated.
  • the above-mentioned polypeptides (L) and (R) or a polynucleotide encoding them is introduced into the Rhizopus sp. Parent strain, so that the pdc gene of the Rhizopus sp. Activated to produce the mutant Rhizopus spp.
  • the polynucleotide encoding the polypeptides (L) and (R) include the above-described polynucleotides (l) and (r), respectively.
  • an exogenous exonuclease together with an artificial DNA cleaving enzyme such as TALEN in the cell
  • an artificial DNA cleaving enzyme such as TALEN
  • the destruction of the target DNA of the artificial DNA cleaving enzyme is promoted (Scientific Reports, 2013, 3: 1253, DOI: 10.1038 / srep01253). Nat Methods, 2012, 9: 973-975). Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, in addition to the TALEN peptide or a polynucleotide encoding the same, an exonuclease or a polynucleotide encoding the same is further introduced into the Rhizopus sp. Parent strain.
  • the exonuclease is not particularly limited as long as it is an exonuclease derived from a filamentous fungus, but preferably includes an exonuclease derived from Rhizopus spp., More preferably one belonging to exonuclease 1 or exonuclease 2, and more preferably Rhizopus. exonuclease derived from oryzae or Rhizopus delmar.
  • exonuclease examples include Rhizopus oryzae-derived exonuclease (SEQ ID NO: 8) encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 82.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • Polypeptide comprising the polynucleotide-encoded exonuclease activity consisting of the nucleotide sequence having 95%
  • TALEN or exonuclease peptide or a polynucleotide encoding it may be introduced into the cell.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding each TALEN or exonuclease is introduced into the cell, and the TALEN or exonuclease is expressed in the cell.
  • Each TALEN and exonuclease polynucleotide may be contained in the same vector, but may be contained in separate vectors.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is stably retained in the cell into which it is introduced and can be propagated.
  • Examples of expression vectors suitable for Rhizopus sp include pUC18 / 19, pUC118 / 119, pBR322, pMW218 / 219, pPTR1 / 2 (TaKaRa), pRI909 / 910 (TaKaRa), pDJB2 (DJ Ballance et al.
  • the polynucleotide encoding TALEN or exonuclease is preferably operably linked to a promoter working in Rhizopus sp.
  • promoters working in Rhizopus sp include an ldhA promoter (US Pat. No. 6,268,189), a pgk1 promoter (International Publication No. 2001/73083), a pgk2 promoter (International Publication No. 2001/72967), a pdcA promoter and an amyA promoter. (Archives of Microbiology, 2006, 186: 41-50), tef and 18S rRNA promoters (US Patent Application Publication No. 2010/112651), and adh1 promoter (Japanese Patent Application No. 2015-155759), but are not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding TALEN or exonuclease or an expression vector containing the same can be obtained by a general transformation method, for example, electroporation method, transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, particle gun method, agro It can be introduced into cells using a bacterial method or the like.
  • Cells in which the target gene has been deleted or inactivated by the introduction of TALEN can be selected based on the confirmation of the genomic sequence of the cells or the expression level or activity of pyruvate decarboxylase, as in the case of random mutation. .
  • the mutant genus Rhizopus of the present invention with reduced pyruvate decarboxylase activity can be produced.
  • the mutant Rhizopus spp. Of the present invention has improved organic acid productivity as compared to the strain (parent strain) before the mutation. Therefore, when the mutant Rhizopus bacterium of the present invention is cultured, an organic acid can be produced efficiently. Therefore, the present invention provides a method for producing an organic acid, comprising culturing the mutant Rhizopus spp. Of the present invention.
  • the organic acid is preferably lactic acid, fumaric acid, succinic acid, malic acid and ⁇ -ketoglutaric acid, more preferably fumaric acid, succinic acid and malic acid.
  • the production of the organic acid using the mutant genus Rhizopus of the present invention is carried out by aerobically cultivating the mutant genus Rhizopus of the present invention according to a general method of culturing Rhizopus, and then recovering the organic acid from the culture This can be done.
  • an organic acid can be produced by aerobically culturing the mutant Rhizopus spp.
  • the culture period may be a period in which the target organic acid is sufficiently produced.
  • the target organic acid is lactic acid
  • lactic acid is produced by culturing at the above-mentioned temperature for 1 to 168 hours, preferably 2 to 72 hours, more preferably 4 to 24 hours.
  • fumaric acid is produced by culturing at the above-mentioned temperature for 1 to 168 hours, preferably 2 to 72 hours, more preferably 4 to 36 hours.
  • succinic acid, malic acid, and ⁇ -ketoglutaric acid is succinic acid, malic acid, and ⁇ -ketoglutaric acid.
  • the medium for culturing the mutant Rhizopus sp. Of the present invention is not particularly limited as long as Rhizopus sp. Grows healthy and can produce the target organic acid.
  • the medium include monosaccharides such as glucose and xylose; oligosaccharides such as sucrose, lactose and maltose; solid medium or liquid medium using a polysaccharide such as starch as a substrate, or commercially available PDB medium (potato dextrose medium; Becton Dickinson & Company, etc.), PDA medium (Becton Dickinson & Company, etc.), LB medium (Luria-Bertani medium; trade name “Daigo”, etc.), NB medium (Nutient Broth; Becton) -Dickinson & Company, etc.), SB medium (Sabouraud medium; manufactured by OXOID, etc.) and the like can be used.
  • the medium contains biological components such as glycerin and citric acid; nitrogen sources such as ammonium salts, nitrates, nitrites, urea, amino acids, natural nitrogen sources such as soybean peptides; sodium, potassium, magnesium, zinc, iron, Various salts such as phosphoric acid can be added as appropriate.
  • biological components such as glycerin and citric acid; nitrogen sources such as ammonium salts, nitrates, nitrites, urea, amino acids, natural nitrogen sources such as soybean peptides; sodium, potassium, magnesium, zinc, iron,
  • Various salts such as phosphoric acid can be added as appropriate.
  • an organic acid can be obtained by collecting the culture supernatant from the medium. If necessary, the organic acid in the culture solution is organically treated by a gradient method, membrane separation, centrifugation, electrodialysis, use of an ion exchange resin, distillation, salting out, crystallization, or a combination thereof. After recovery as an acid salt, the organic acid may be isolated or purified from the recovered organic acid salt.
  • a spore suspension of the mutated Rhizopus spp. Of the present invention is prepared (step A), which is cultured in a culture solution to germinate spores to prepare a mycelium (step B1), and preferably further the mycelium.
  • An organic acid can be efficiently produced by growing the body (step B2) and then culturing the prepared mycelium to produce an organic acid (step C).
  • the spores of the genus Rhizopus of the present invention can be obtained, for example, by using an inorganic agar medium (composition example: 2% glucose, 0.1% ammonium sulfate, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.025% magnesium sulfate / 7 hydrate).
  • an inorganic agar medium composition example: 2% glucose, 0.1% ammonium sulfate, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.025% magnesium sulfate / 7 hydrate.
  • a spore suspension can be prepared by forming a spore by stationary culture at -30 ° C for 7 to 10 days and suspending it in physiological saline or the like.
  • the mycelium may or may not be contained in the spore suspension.
  • Step B1 Preparation of mycelium>
  • the spore suspension obtained in step A is inoculated into a culture solution and cultured, and the spores are germinated to obtain mycelium.
  • the number of spores of the filamentous fungus inoculated into the culture solution is 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 8 spore / mL-culture solution, preferably 1 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 4 spore / mL-culture solution, More preferred is 5 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 4 spores / mL-culture solution, and further preferred is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 spores / mL-culture solution.
  • the culture solution may include monosaccharides such as glucose and xylose, oligosaccharides such as sucrose, lactose, and maltose, or polysaccharides such as starch as a carbon source; glycerin, citric acid Biological components such as ammonium sources, ammonium salts, nitrates, nitrites, urea, etc., amino acids, natural nitrogen sources such as soybean peptides, etc .; other inorganic substances such as sodium, potassium, magnesium, zinc, iron, phosphoric acid, etc.
  • the preferred concentration of monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide and glycerin is 0.1-30% (w / v)
  • the preferred concentration of citric acid is 0.01-10% (w / v)
  • the preferred concentration of nitrogen source is 0 .01 to 1% (w / v)
  • the preferred concentration of the inorganic substance is 0.0001 to 0.5% (w / v).
  • the mutant Rhizopus spp. Of the present invention is cultured using the culture solution.
  • the culture may be performed according to a normal procedure.
  • a filamentous fungal spore is inoculated into a culture vessel containing a culture solution, and preferably 24 to 24.degree. C. under a culture temperature control of 25 to 42.5.degree. C. while stirring at 80 to 250 rpm, more preferably 100 to 170 rpm. Incubate for ⁇ 120 hours, more preferably 48-72 hours.
  • the amount of the culture solution used for the culture may be appropriately adjusted according to the culture vessel.
  • it may be about 50 to 100 mL for a 200 mL baffled flask and about 100 to 300 mL for a 500 mL baffled flask. That's fine.
  • filamentous fungal spores germinate and grow into mycelium.
  • Step B2 Growth of mycelium> From the viewpoint of improving organic acid production ability, it is preferable to perform a step (step B2) of further culturing and growing the mycelium obtained in step B1.
  • the growth culture medium used in step B2 is not particularly limited, and may be any inorganic culture liquid containing glucose that is normally used.
  • 7.5-30% glucose, 0.05-2% ammonium sulfate, 0 0.03 to 0.6% potassium dihydrogen phosphate, 0.01 to 0.1% magnesium sulfate heptahydrate, 0.005 to 0.1% zinc sulfate heptahydrate, and 3.75 to Examples thereof include a culture solution containing 20% calcium carbonate (both concentrations are% (w / v)), preferably 10% glucose, 0.1% ammonium sulfate, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0 A culture solution containing 0.025% magnesium sulfate.7 hydrate, 0.009% zinc sulfate.7 hydrate, and 5.0% calcium carbonate (the concentration is% (w / v)). .
  • the amount of the culture solution may be appropriately adjusted according to the culture vessel.
  • the culture vessel in the case of a 500 mL Erlenmeyer flask, it may be 50 to 300 mL, preferably 100 to 200 mL.
  • the bacterial cells cultured in Step B1 are inoculated into this culture solution so that the wet weight becomes 1 to 20 g-bacteria / 100 mL-medium, preferably 3 to 10 g-bacteria / 100 mL-medium, and 100 to 300 rpm, Culturing is preferably performed at 170 to 230 rpm and under a culture temperature control of 25 to 42.5 ° C. for 12 to 120 hours, preferably 16 to 72 hours.
  • the mycelium of the filamentous fungus obtained in the above procedure (B1 or B2) can be cultured to cause the fungus to produce an organic acid, and then the produced organic acid can be recovered.
  • the culture solution for organic acid production used in the step (C) includes a carbon source such as glucose, a nitrogen source such as ammonium salt, various metal salts, and the like, and may be any culture solution that can produce an organic acid.
  • Examples of the culture solution used in the step (C) include 7.5 to 30% glucose, 0.05 to 2% ammonium sulfate, 0.03 to 0.6% potassium dihydrogen phosphate, 0.01 to 0.1% magnesium sulfate 7-hydrate, 0.005 to 0.1% zinc sulfate 7-hydrate, and 3.75 to 20% calcium carbonate (all concentrations are% (w / v)) And the like, and preferably 10 to 12.5% glucose, 0.1% ammonium sulfate, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.025% magnesium sulfate heptahydrate, Examples include a culture solution containing 009% zinc sulfate heptahydrate and 5.0% calcium carbonate (both concentrations are% (w / v)).
  • the amount of the culture solution used in step (C) may be appropriately adjusted according to the culture vessel. For example, in the case of a 200 mL Erlenmeyer flask, about 20 to 80 mL, and in the case of a 500 mL Erlenmeyer flask, about 50 to 200 mL. If it is.
  • the cells obtained in the step B1 or B2 are added in a weight of 5 g to 90 g-cells / 100 mL-culture solution, preferably 5 g-50 g-cells / 100 mL-culture solution.
  • the mutant Rhizopus spp. Described in [1], wherein the pdc gene is deleted or inactivated.
  • the pdc gene is: A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, inserted, substituted or added to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having at least 95% identity thereto, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, or at least 95% thereof
  • the mutant Rhizopus genus according to [2] or [3], wherein a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having identity is introduced.
  • the mutated Rhizopus spp. According to [4], into which an exonuclease or a polynucleotide encoding the same is further introduced.
  • the exonuclease is Preferably, it is an exonuclease derived from the genus Rhizopus, More preferably, it is an exonuclease derived from Rhizopus oryzae or Rhizopus delmar. [5] The mutant Rhizopus sp.
  • the polynucleotide encoding the exonuclease comprises A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encoding a polypeptide having exonuclease activity; A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 82; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 82 and encoding a polypeptide having exonuclease activity; A polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence
  • the activity of pyruvate decarboxylase is preferably reduced to 50% or less, more preferably 20% or less, and even more preferably 15% or less, compared to that before mutation, [1] to [7]
  • the mutant genus Rhizopus according to any one of the above.
  • Rhizopus sp. Rhizopus oryzae or Rhizopus delmar is preferred, More preferably Rhizopus delmar, [1] The mutant Rhizopus genus according to any one of [1] to [8].
  • a method for producing a mutant Rhizopus which comprises reducing the activity of pyruvate decarboxylase in Rhizopus.
  • a method for improving the organic acid productivity of Rhizopus comprising reducing the activity of pyruvate decarboxylase in Rhizopus.
  • the pdc gene is: A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, inserted, substituted or added to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having pyruvate decarboxylase activity; A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having
  • the genome editing Preferably, the TALEN peptide or a polynucleotide encoding the same is introduced into the Rhizopus sp. More preferably, a polynucleotide encoding a TALEN peptide is introduced into the Rhizopus sp. [16] The method described in the above.
  • the TALEN peptide preferably comprises the following polypeptides (L) and (R): Polypeptide (L): Has a TAL effector with 17 repeats linked;
  • the 1st to 16th repeats from the upstream are each an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • the 17th repeat from the upstream of the 17 repeats consists of an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27;
  • the TAL effector recognizes the sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the 17 repeats in the TAL effector of the polypeptide (L) are each a repeat-variable diresidues (RVD) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • the RVD of each repeat recognizes the 2nd to 18th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the 17 repeats in the TAL effector of the polypeptide (R) are each a repeat-variable diresidues (RVD) at a position corresponding to amino acids 12 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28.
  • RVD repeat-variable diresidues
  • polypeptide (L) is preferably the following polypeptide: A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; It has an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and has a TAL effector targeting the sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a DNA cleavage domain consisting of a Fok1-like DNA nuclease A polypeptide; A polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3; or a polynucleotide encoded by a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: A polypeptide having a TAL effector targeting the sequence represented by 9 and a DNA cleavage domain comprising a Fok1
  • polypeptide (R) is preferably the following polypeptide: A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6; It has an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and has a TAL effector targeting the sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a DNA cleavage domain consisting of a Fok1-like DNA nuclease A polypeptide; A polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; or a polynucleotide encoded by a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: A polypeptide having a TAL effector targeting the sequence represented by 10 and a DNA cleavage domain comprising a Fok1
  • polynucleotide encoding TALEN is preferably the following i) and ii): i) A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity thereto, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or at least 95% identity thereto A polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence, and ii) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity thereto, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or at least 95% identity thereto Polynucleotide encoding polypeptide comprising amino acid sequence
  • the exonuclease is Preferably, it is an exonuclease derived from the genus Rhizopus, More preferably, it is an exonuclease derived from Rhizopus oryzae or Rhizopus delmar. [28] The method described.
  • the polynucleotide encoding the exonuclease is: A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encoding a polypeptide having exonuclease activity; A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 82; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 82 and encoding a polypeptide having exonuclease activity; A polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; or a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid
  • Rhizopus sp. Rhizopus oryzae or Rhizopus delmar is preferred, More preferably Rhizopus delmar, [11] The method according to any one of [30].
  • the reduction of pyruvate decarboxylase activity in the genus Rhizopus is preferably 50% or less, more preferably 20% or less, and even more preferably 15% or less. [11] to [31] The method of any one of these.
  • a method for producing an organic acid comprising culturing the mutant Rhizopus bacterium according to any one of [1] to [10].
  • the organic acid is Preferably fumaric acid, lactic acid, succinic acid, malic acid or ⁇ -ketoglutaric acid, More preferably fumaric acid, succinic acid or malic acid, [33] or [34] The method for producing an organic acid according to [34].
  • the organic acid is Preferably fumaric acid, lactic acid, succinic acid, malic acid or ⁇ -ketoglutaric acid, More preferably fumaric acid, succinic acid or malic acid, [36] The use according to [36].
  • PCR primers used in this example are shown in Table 1 and Table 2.
  • Example 1 Production of pdc gene-deficient mutant Rhizopus genus (1) Production of tryptophan auxotrophic strain Rhizopus delmar JCM (Japan Collection of Microorganisms / RIKEN) 5557 strain (hereinafter referred to as 5557 strain) auxotrophic strain was used as the parent strain for the pdc gene (SEQ ID NO: 1) deletion. The tryptophan auxotrophic strain was selected and obtained from among the mutant-introduced strains obtained by ion beam irradiation of 5557 strains. Ion beam irradiation was performed at the ion irradiation facility (TIARA) of the Japan Atomic Energy Agency / Takasaki Quantum Application Laboratory.
  • TIARA ion irradiation facility
  • Rhizopus delmar 02T6 strain having a 1 base deletion mutation in the trpC gene region and showing tryptophan auxotrophy was obtained. This strain was used as the parent strain of the mutant Rhizopus in the following examples.
  • the promoter fragment and terminator fragment of adh1 were used as primers oJK202 (SEQ ID NO: 49) and oJK204 (SEQ ID NO: 50), and oJK205 (SEQ ID NO: 51) and oJK216 (SEQ ID NO: 52), respectively.
  • a plasmid vector was prepared by removing the trpC gene region from pUC18-trpC-Pad-Tadh. That is, the DNA fragment was amplified by PCR using the primers trpC-lost-F (SEQ ID NO: 55) and trpC-lost-R (SEQ ID NO: 56) using the pUC18-trpC-Pad-Tadh constructed above as a template. . This fragment was ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to prepare plasmid pUC18-Padh-Tadh.
  • LeftTALEN-pdc encodes TALEN targeting the sequence of 5′-TGCCTGCTATTTAAAATCG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) in the sense strand of the pdc gene
  • RightTALEN-pdc is 5′-TTGATTTCCTTAAGACGG- in the antisense strand It encodes a TALEN that targets the 3 '(SEQ ID NO: 10) sequence.
  • the polynucleotide encoding the above LEFTTALEN-pdc was prepared by the method described in (2) above.
  • a vector that expresses TALEN under the control of an adh1 promoter and an adh1 terminator was prepared by inserting into the expression vector pUC18-trpC-Pad-Tadh for delmar. That is, the vector fragment was amplified by PCR using pUC18-trpC-Padh-Tadh as a template and primers adhpro-R (SEQ ID NO: 57) and adhter-F (SEQ ID NO: 58).
  • the LeftTALEN-pdc fragment was amplified by PCR using the primers TALPRON-pdc as a template and primers adhpro-TALEN-F (SEQ ID NO: 59) and TALEN-adhter-R (SEQ ID NO: 60). In the two fragments, there is an overlapping region of 15 bases. These two fragments were ligated using In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to obtain a plasmid padh-LeftTALEN-pdc containing LeftTALEN-pdc.
  • the polynucleotide encoding the above RightTALEN-pdc was prepared by the method described in (2) above.
  • the vector was inserted into an expression vector pUC18-Pad-Tadh for delmar, and a vector expressing TALEN (but not including the trpC sequence) under the control of the adh1 promoter and adh1 terminator was prepared. That is, the vector fragment was amplified by PCR using pUC18-Pad-Tadh as a template and primers adhpro-R (SEQ ID NO: 57) and adhter-F (SEQ ID NO: 58).
  • RightTALEN-pdc fragment was amplified by PCR using RightTALEN-pdc as a template and primers adhpro-TALEN-F (SEQ ID NO: 59) and TALEN-adhter-R (SEQ ID NO: 60), and ligated with the vector fragment.
  • adhpro-TALEN-F SEQ ID NO: 59
  • TALEN-adhter-R SEQ ID NO: 60
  • plasmid ptrpC-knock-in for knock-in the trpC gene region was prepared by removing the pdc gene ORF from the pdc gene locus. That is, the pUC18 vector fragment amplified with primers pUC18-Pae1-F3 (SEQ ID NO: 69) and pUC18-Hind3-R3 (SEQ ID NO: 70) using pUC18 as a template, and the primer PDC1-upstr-F using the genome of JCM5557 strain as a template.
  • the purified product was further treated with Lambda Exonuclease (NEW ENGLAND BioLabs) and then purified in the same manner as above to obtain single-stranded DNA. Lambda exonuclease treatment was performed at 37 ° C. overnight.
  • the gene was introduced into the spores of the 02T6 strain obtained in (1) above using GDS-80 (Neppagene) using the above DNA-gold particle solution.
  • the spore after gene transfer is an inorganic agar medium (20 g / L glucose, 1 g / L ammonium sulfate, 0.6 g / L potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g / L magnesium sulfate heptahydrate, 0.09 g / L (Zinc sulfate heptahydrate, 15 g / L agar), and statically cultured at 30 ° C. for about one week.
  • Colony PCR was performed using the genomic template solution, primers pdc1-up2 (SEQ ID NO: 79) and trpC (d) -1 (SEQ ID NO: 80), and KOD FX Neo (TOYOBO).
  • pdc1-up2 SEQ ID NO: 79
  • trpC trpC
  • d trpC
  • TOYOBO KOD FX Neo
  • Example 2 Evaluation of pyruvate decarboxylase activity in mutant Rhizopus genus 02T6 strain and 02T6 ⁇ pdc strain obtained in Example 1 were cultured, and pyruvate decarboxylase (PDC) activity was measured.
  • PDC pyruvate decarboxylase
  • Inorganic culture solution 100mL (composition: 10% glucose, 0.1% ammonium sulfate, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.025% magnesium sulfate heptahydrate) 0.009% zinc sulfate heptahydrate, 5.0% calcium carbonate, 0.002% tryptophan, both in concentration (% (w / v)) are inoculated with 6.0 to 8.0 g, 27 Stirring culture was performed at 220 rpm at 40 ° C. for about 40 hours.
  • the culture is filtered using a sterilized stainless steel screen filter holder (MILLIPORE), the cells are collected on the filter, and the cells are collected on the filter holder with about 50 mL of physiological saline. Washed twice. The physiological saline used for washing was removed by suction filtration.
  • MILLIPORE sterilized stainless steel screen filter holder
  • the frozen 3 mL disruption tube was subjected to a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.), and the cells were disrupted at 1700 rpm for 10 seconds. Then, after suspending in 50 mM Tri-HCl (pH 7.5) solution added with cComplete ULTRA Tables, Mini, EDTA-free, and EASY pack (Roche), it was centrifuged at 14500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was disrupted. Liquid. The protein concentration of the cell disruption solution was measured using Quick Start Bradford Protein Assay (BIO-RAD).
  • the PDC activity of the cell disruption solution is determined by reacting the reaction product of pyruvic acid and the cell disruption solution with alcohol dehydrogenase (hereinafter referred to as ADH) and measuring the amount of NAD + produced based on the change in absorbance. did. That is, 10 L of an appropriately diluted microbial cell disruption solution was added to 180 ⁇ L of a reaction solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 175 ⁇ M NADH, 2 mM MgCl 2 , 1 mM thiamine diphosphate, 1 U ADH (Sigma)] The mixture was allowed to stand at 35 ° C. for 5 minutes.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • Example 3 Evaluation of organic acid productivity in mutant Rhizopus genus 02T6 strain and 02T6 ⁇ pdc strain were cultured in the same procedure as in Example 2 (1). However, the culture period was 2 days. The culture supernatant was sampled at 0, 4, 8, 10, 24, and 32 hours after the start of the culture, and glucose, fumaric acid, malic acid, succinic acid in the supernatant were sampled according to the procedure described in Reference Example 1 described later. The acid and ethanol were quantified, and then the selectivity of each substance was determined.
  • Table 4 shows the selectivity of each substance after 24 hours of culture in which complete consumption of glucose was confirmed.
  • the 02T6 ⁇ pdc strain had a reduced ethanol selectivity of 95.5% and an increased selectivity of fumaric acid, malic acid and succinic acid to 117%, 112% and 108%, respectively, compared to the parental strain 02T6. As a result, it became clear that the productivity of organic acids was improved.
  • citC promoter region fragment was amplified by PCR using the primers trpCter-cicCpro-F (SEQ ID NO: 89) and chipCpro-adhter-R (SEQ ID NO: 90) as templates.
  • the above two fragments were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to produce plasmid pUC18-trpC-PcipC-Tadh.
  • a plasmid vector was prepared by removing the trpC gene region from the pUC18-trpC-PcipC-Tadh constructed above. That is, a DNA fragment was amplified by PCR using the primers trpC-lost-F2 (SEQ ID NO: 91) and trpC-lost-R2 (SEQ ID NO: 92) using the pUC18-trpC-PcipC-Tadh as a template. This fragment was ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to prepare plasmid pUC18-PcipC-Tadh.
  • Kits that target the pdc3 gene include LeftTALEN-pdc3 (SEQ ID NO: 84) and RightTALEN-pdc3 (SEQ ID NO: 85), each of which is 5′-CCGGAATCGACAGAGTTT- in the sense strand of the pdc3 gene. It encodes a TALEN that targets the 3 '(SEQ ID NO: 86) and 5'-CGTAACTTACCATATTGTA-3' (SEQ ID NO: 87) sequences in the antisense strand.
  • a polynucleotide encoding LeftTALEN for the pdc3 gene was prepared in the above-mentioned (1).
  • a vector that expresses TALEN under the control of the cipC promoter and adh1 terminator was prepared by inserting into the expression vector pUC18-PcipC-Tadh for delmar. That is, the vector fragment was amplified by PCR using pUC18-PcipC-Tadh as a template and primers cpCpro-R (SEQ ID NO: 93) and adhter-F (SEQ ID NO: 58).
  • the LeftTALEN-pdc3 fragment was amplified by PCR using the primers cpCpro-LifeTALEN-F (SEQ ID NO: 94) and LifeTALEN-adter-R (SEQ ID NO: 95) using the template. In the two fragments, there is an overlapping region of 15 bases. These two fragments were ligated with an In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to obtain a plasmid pcipC-LeftTALEN-pdc3 containing LeftTALEN-pdc3.
  • the polynucleotide encoding RightTALEN for the pdc3 gene was prepared in the above-mentioned (1).
  • a vector that expresses TALEN under the control of the cipC promoter and adh1 terminator was prepared by inserting into the expression vector pUC18-PcipC-Tadh for delmar. That is, the vector fragment was amplified by PCR using pUC18-PcipC-Tadh as a template and primers cpCpro-R (SEQ ID NO: 93) and adhter-F (SEQ ID NO: 58).
  • RightTALEN-pdc3 was amplified by PCR using RightTALEN-pdc3 as a template and primers cipCpro-LifeTALEN-F (SEQ ID NO: 94) and LifeTALEN-adhter-R (SEQ ID NO: 95). In the two fragments, there is an overlapping region of 15 bases. These two fragments were ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to obtain a plasmid pcipC-RightTALEN-pdc3 containing RightTALEN-pdc3.
  • the pdc3 gene terminator fragment amplified with -R (SEQ ID NO: 101) was ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to prepare plasmid pknock-in (pdc3).
  • the trpC gene region fragments amplified with the primers trpCpro-R (SEQ ID NO: 73) and trpCter-F (SEQ ID NO: 74) were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) and the plasmid ptrpC-knock-in ( pdc3) was prepared.
  • a DNA-gold particle solution containing single-stranded DNA is prepared, and this is used for gene transfer to the spore of 02T6 strain.
  • the obtained spores were cultured.
  • the single-stranded DNA the single-stranded DNA prepared in (5) above was used.
  • the TALEN expression vector pcipC-LeftTALEN-pdc3 and pcipC-RightTALEN-pdc3 prepared in (2) above were used.
  • pcipC-exo1 prepared in (4) above was used as the exonuclease expression vector.
  • the concentration ratio of pcipC-LeftTALEN-pdc3, pcipC-RightTALEN-pdc3, pcipC-exo1, and single-stranded DNA in the DNA solution was approximately 1: 1: 1: 2.
  • Reference Example 1 Determination of glucose, fumaric acid, malic acid, succinic acid and ethanol in the culture ⁇ Analysis conditions> Glucose, glucose, fumaric acid, malic acid, succinic acid, and ethanol in the culture supernatant were quantified using an HPLC apparatus LaChrom Elite (manufactured by Hitachi High-Technologies).
  • a guard column ICSep ION-300 Guard Column Cartridge (4.0 mm ID ⁇ 20 mm, manufactured by Transgenomic) was connected to a polymer column for organic acid analysis ICSep ICE-ION-300 (7.8 mm I.D.).
  • RI detector refractive index detector
  • UV detector detection wavelength 210 nm
  • a culture supernatant sample to be subjected to HPLC analysis is diluted three-fold with a 0.86 M sodium sulfate solution in advance and then appropriately diluted with 37 mM sulfuric acid, and then AcroPrep 96-well Filter Plates (0.2 ⁇ m GHP membrane, manufactured by Pall). Was used to remove insolubles.
  • the selectivity of a substance is the actual value obtained from the culture relative to the maximum equivalent of the substance that can be theoretically obtained from the culture (calculated from the glucose consumption of the culture). Refers to the ratio of equivalents of substances. That is, the selectivity is obtained by the following formula.

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Abstract

有機酸生産性の高いリゾプス属菌の提供。ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌。

Description

変異リゾプス属菌
　本発明は、変異リゾプス属菌、及びそれを用いた有機酸の製造方法に関する。
　乳酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸などの有機酸は、食品製造に使用されたり、合成樹脂や生分解性ポリマーの原料として用いられるなど、工業的な価値が高い物質である。
　近年、微生物や酵素を用いた生物学的な有用物質生産が行われている。しかしながら、微生物による物質の工業生産においては、生産性の向上が重要な課題の一つである。生産性向上のため、従来、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学及びバイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な微生物学的な物質生産方法の開発が注目されている。
　例えば、特許文献１～３には、糸状菌であるリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）のプロモーターを導入した微生物を用いた乳酸生産法が開示されている。また、非特許文献１には、フマル酸生産量が多く、副産物であるエタノール産生の少ない変異リゾプス属菌が報告されている。また特許文献４及び５は、特定の条件における真核生物や原核生物でのフマル酸生産において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の破壊またはピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の抑制が、フマル酸生産性の向上に寄与することを報告している。しかし、リゾプス属菌の遺伝学的背景は未だ十分に研究されていないことから、現状では、有用物質生産に適したリゾプス属菌を遺伝子組換え技術によって開発することは容易ではない。
　（特許文献１）米国特許第６２６８１８９号明細書
　（特許文献２）国際公開第２００１／７３０８３号
　（特許文献３）国際公開第２００１／７２９６７号
　（特許文献４）国際公開第２００９／１５５３８２号
　（特許文献５）特開２００５－２１１０４２号
　（非特許文献１）Korean J Chem Eng, 2010, 27(1):183-186
　本発明は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌を提供する。
　また本発明は、リゾプス属菌においてピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法を提供する。
　また本発明は、リゾプス属菌においてピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減することを含む、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法を提供する。
　また本発明は、上記変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下、なお好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上９０個以下、好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは１個以上１５個以下、なお好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は複数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　また本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、別途限定がない限り、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の位置又は領域は、当該任意の領域に「相当する位置」又は「相当する領域」とみなされる。
　本明細書において、「ｐｄｃ遺伝子」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子であり、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される遺伝子をいう。配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとしては、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ１（ＰＤＣ１）（配列番号２）をコードする遺伝子が挙げられる。
　したがって、本明細書における「ｐｄｃ遺伝子」はまた、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される遺伝子をいう。
　本明細書において、変異微生物における「ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低減」とは、変異微生物におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が、変異前の株（親株）の活性の５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下に低減していることをいう。微生物のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、後述の実施例に記載された方法に従って測定することができる。
　本発明は、有機酸生産性の高い変異リゾプス属菌、及びそれを用いた有機酸の製造方法の提供に関する。
　本発明者らは、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上について検討した。その結果、本発明者らは、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が低減したリゾプス属菌において、有機酸生産性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、有機酸生産性が高い変異リゾプス属菌を提供する。本発明の変異リゾプス属菌によれば、効率のよい有機酸の微生物学的生産が実現する。
　本発明の変異リゾプス属菌は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低減した変異リゾプス属菌である。
　本発明の変異リゾプス属菌の親株としては、リゾプス属に属する糸状菌、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒなどが挙げられる。このうち、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒが好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒがより好ましい。当該親株を、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低減するように改変することにより、本発明の変異リゾプス属菌を作製することができる。
　リゾプス属菌におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低減は、該リゾプス属菌の細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの発現量を低下させることによって実現することができる。例えば、該リゾプス属菌のｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化させること、ｐｄｃ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化すること、又はｐｄｃ遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害することによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減させることができる。なお、本発明により欠失又は不活性化されるべき「ｐｄｃ遺伝子」は、上記で定義したとおりである。他の遺伝子、例えば配列番号８３で示されるピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（本明細書においてｐｄｃ３遺伝子、という場合もある）を欠失又は不活性化しても、本明細書で定義する「ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低減」を達成できず、本発明による有機酸生産性向上効果を充分に得ることはできない。あるいは、リゾプス属菌中で発現したピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低下させることによっても、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減させることができる。上記の改変は、分子生物学的又は遺伝子工学的手法を用いて、人工的に行うことができる。
　細胞中のｐｄｃ遺伝子のｍＲＮＡを不活性化させる方法としては、ｓｉＲＮＡを用いた標的特異的なｍＲＮＡ阻害が挙げられる。ｓｉＲＮＡの基本的な手順は当業者によく知られており（例えば、特表２００７－５１２８０８号公報参照）、またｓｉＲＮＡのための試薬又はキットが市販されている。当業者は、公知の文献や市販の製品のマニュアルに基づいて、所望の標的特異的なｓｉＲＮＡを調製し、標的ｍＲＮＡを阻害することができる。
　ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低下させる方法としては、ＰＤＣ阻害剤を用いる方法が挙げられる。ＰＤＣ阻害剤としては、オメプラゾールなどが挙げられる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４４：１７７－１７９等を参照）。
　細胞中のｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、ｐｄｃ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換える方法、ｐｄｃ遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入する方法、ｐｄｃ遺伝子の転写又は翻訳開始領域に変異を与える方法、などが挙げられる。好適には、ｐｄｃ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させる。より具体的な例としては、細胞のゲノム上のｐｄｃ遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び細胞中の遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、ｐｄｃ遺伝子にコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの発現量や活性評価、又は遺伝子解析を行って、所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。
　細胞中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。不活性化した遺伝子を作製する方法としては、部位特異的変異導入があり、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒTM　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販のキットを利用することができる。上記の方法で得られたランダムな変異を有する細胞のゲノム配列を確認することにより、ｐｄｃ遺伝子が欠失又は不活性化された細胞を選択することができる。あるいは、細胞のピルビン酸デカルボキシラーゼの発現量又は活性を指標に、ｐｄｃ遺伝子が欠失又は不活性化された細胞を選択することができる。
　ゲノム中の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法の例としては、これに限定されるものではないが、人工ＤＮＡ切断酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ＤＮＡ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集が挙げられる。
　好ましい実施形態において、本発明によるリゾプス属菌ｐｄｃ遺伝子の欠失又は不活性化は、ｐｄｃ遺伝子座のゲノム編集によって行われる。本明細書において、「ｐｄｃ遺伝子座」とは、ｐｄｃ遺伝子のＤＮＡ配列と、その５’側１０００ｂｐ領域及びその３’側１０００ｂｐ領域とを含むゲノム上の領域をいう。
　ゲノム編集は、ゲノム上の標的遺伝子座のＤＮＡ２重鎖を特異的に切断し、切断したＤＮＡの修復の過程でヌクレオチドの欠失や挿入、置換を誘導したり、外来ポリヌクレオチドを挿入するなどして、ゲノムを部位特異的に改変する技術である。このような技術は、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔ）－Ｃａｓ９システム、Ｈｏｍｉｎｇ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ｃｏｍｐａｃｔ　ｄｅｓｉｇｎｅｒ　ＴＡＬＥＮなどとして知られている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，１５：３２１－３３４、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３９：ｅ８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：ｅ１４９、Ｎａｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１３，４：１７６２）。これらの技術に基づくゲノム編集のためのキットは市販されており、例えばＬｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから購入することができる。
　ゲノム編集技術の例示のみを目的として、ＴＡＬＥＮについて詳述する。ＴＡＬＥＮは、植物病原性細菌であるキサントモナス属のＤＮＡ結合ドメインに由来する転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターと、ＤＮＡヌクレアーゼＦｏｋ１からなるＤＮＡ切断ドメインとを有するタンパク質である。ＴＡＬＥＮのＴＡＬエフェクターは、約３４アミノ酸からなる繰り返し配列（リピート）を約１７個連結した構造を取り、各リピートが１ヌクレオチドを認識する。各リピートが特異的に認識する塩基の種類は、各リピート中の特定位置にある連続する２個のアミノ酸残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ；ＲＶＤと称される）の種類に依存する。４種の塩基ＡＴＧＣに対応するＲＶＤのアミノ酸残基ペアの種類は公知である。したがって当業者は、標的ゲノムＤＮＡ配列を特異的に認識するＴＡＬＥＮを構築することができる。ＴＡＬＥＮによるゲノム編集では、切断したいゲノムＤＮＡ領域の近傍の上流及び下流の配列をそれぞれ特異的に認識する１組のＴＡＬＥＮを設計し、細胞内で発現させる。一般的には、標的特異的なＴＡＬＥＮをコードする遺伝子を構築し、細胞に導入して、細胞内で該ＴＡＬＥＮを発現させる。発現した各ＴＡＬＥＮが対応するゲノムＤＮＡに結合すると、それぞれに含まれるＦｏｋ１が切断標的ゲノムＤＮＡ領域上で２量体を形成し、ＤＮＡ２重鎖を切断する。
　リゾプス属菌ｐｄｃ遺伝子の欠失又は不活性化のためのＴＡＬＥＮの例としては、下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなるＴＡＬＥＮのペアが挙げられる。
　ポリペプチド（Ｌ）：ｐｄｃ遺伝子のセンス鎖中の５’－ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号９）で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するＴＡＬＥＮポリペプチド。好ましくは、該ポリペプチド（Ｌ）に含まれるＴＡＬエフェクター（以下、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）とも称する）は、１７個の繰り返し配列（リピート）が連結したポリペプチドを含み、５’－ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号９）で示される配列を認識する。
　ポリペプチド（Ｒ）：ｐｄｃ遺伝子のアンチセンス鎖中の５’－ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するＴＡＬＥＮポリペプチド。好ましくは、該ポリペプチド（Ｒ）に含まれるＴＡＬエフェクター（以下、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）とも称する）は、１７個の繰り返し配列（リピート）が連結したポリペプチドを含み、５’－ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）で示される配列を認識する。
　上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中の１７個のリピートのうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。好ましくは、該上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して、後述するＲＶＤ以外の部分で、３個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中のリピートのうち最下流に位置する１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
　上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中の１７個のリピートのうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。好ましくは、該上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して、後述するＲＶＤ以外の部分で、３個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中のリピートのうち最下流に位置する１７個目のリピートは、配列番号４４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
　好ましくは、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１２～１３番アミノ酸に相当する位置に、塩基認識部位である２つのアミノ酸残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ；ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号９で示される配列の２～１８番塩基を認識する。また好ましくは、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号２８で示されるアミノ酸配列の１２～１３番アミノ酸に相当する位置にＲＶＤを有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号１０で示される配列の２～１８番塩基を認識する。ＲＶＤのアミノ酸残基の種類は、下記に示すとおり、標的とする塩基の種類に依存する。
　　標的塩基　　　　 ＲＶＤ
　　　Ａ　　　　　　　ＮＩ
　　　Ｃ　　　　　　　ＨＤ
　　　Ｇ／Ａ　　　　　ＮＮ
　　　Ｔ　　　　　　　ＮＧ
　ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）が配列番号９で示される配列を認識できる限り、上記１７個のリピートのうちの２個以下、好ましくは１個は、配列番号９に対応するＲＶＤを有していなくともよい。言い換えれば、上記１７個のリピートのうち１５個以上、好ましくは１６個以上が配列番号９に対応するＲＶＤを有していればよい。また上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）が配列番号１０で示される配列を認識できる限り、上記１７個のリピートのうちの２個以下、好ましくは１個は、配列番号１０に対応するＲＶＤを有していなくともよい。言い換えれば、上記１７個のリピートのうち１５個以上、好ましくは１６個以上が配列番号１０に対応するＲＶＤを有していればよい。
　さらに好ましい実施形態において、ＴＡＬエフェクター（Ｌ）の１７個のリピートの各々は、上流から順に、以下の（１）～（１７）のアミノ酸配列からなる：
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８）配列番号１８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９）配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１）配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３）配列番号２３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１５）配列番号２５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１６）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１７）配列番号２７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
　なお好ましくは、上記（１）～（１７）のアミノ酸配列は、各々、以下のアミノ酸残基ペアからなるＲＶＤを有する：
（１）配列番号１１の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（２）配列番号１２の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（３）配列番号１３の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（４）配列番号１４の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（５）配列番号１５の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（６）配列番号１６の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（７）配列番号１７の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（８）配列番号１８の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（９）配列番号１９の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１０）配列番号２０の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１１）配列番号２１の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１２）配列番号２２の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１３）配列番号２３の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１４）配列番号２４の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１５）配列番号２５の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１６）配列番号２６の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１７）配列番号２７の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）。
ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）が５’－ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号９）で示される配列を認識できる限り、上記（１）～（１７）のリピートのうちの１５個以上、好ましくは１６個以上が上記ＲＶＤを有していればよい。
　別のさらに好ましい実施形態において、ＴＡＬエフェクター（Ｒ）の１７個のリピートの各々は、上流から順に、以下（１'）～（１７'）のアミノ酸配列からなる：
（１'）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（２'）配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（３'）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（４'）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（５'）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（６'）配列番号３３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（７'）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（８'）配列番号３５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（９'）配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１０'）配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１１'）配列番号３８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１２'）配列番号３９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１３'）配列番号４０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１４'）配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１５'）配列番号４２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１６'）配列番号４３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（１７'）配列番号４４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列。
　なお好ましくは、上記（１'）～（１７'）のアミノ酸配列は、各々、以下のアミノ酸残基ペアからなるＲＶＤを有する：
（１'）配列番号２８の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（２'）配列番号２９の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（３'）配列番号３０の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（４'）配列番号３１の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（５'）配列番号３２の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（６'）配列番号３３の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（７'）配列番号３４の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（８'）配列番号３５の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（９'）配列番号３６の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１０'）配列番号３７の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ（チミン認識部位）；
（１１'）配列番号３８の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１２'）配列番号３９の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１３'）配列番号４０の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（１４'）配列番号４１の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ（アデニン認識部位）；
（１５'）配列番号４２の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ（シトシン認識部位）；
（１６'）配列番号４３の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）；
（１７'）配列番号４４の１２～１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ（グアニン認識部位）。
ただし、上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）が５’－ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）で示される配列を認識できる限り、上記（１'）～（１７'）のリピートのうちの１５個以上、好ましくは１６個以上が上記ＲＶＤを有していればよい。
　上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）に含まれるＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼとは、２量体化してＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼをいう。好ましくは、該Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼとは、配列番号３の２４１６～３００６番ヌクレオチドで示される配列、又はこれと少なくとも９５％同一な配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ２量体化してＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼである。
　上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）の好ましい例としては、下記が挙げられる：
ポリペプチド（Ｌ）：
　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
　配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド、
ポリペプチド（Ｒ）：
　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
　配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
　上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）の別の好ましい例としては、それぞれ、下記ポリヌクレオチド（ｌ）及び（ｒ）にコードされるポリペプチドが挙げられる：
ポリヌクレオチド（ｌ）：
　配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
　配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｌ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチド（ｒ）：
　配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
　配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とする上記ＴＡＬエフェクター（Ｒ）と、上記Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　好ましい実施形態において、上記ポリペプチド（Ｌ）は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドである。また好ましい実施形態において、上記ポリペプチド（Ｒ）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドである。
　上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなるＴＡＬＥＮは、リゾプス属菌ゲノム上のｐｄｃ遺伝子座を含むＤＮＡ（配列番号８１）のセンス鎖とアンチセンス鎖とにそれぞれ特異的に結合して、ｐｄｃ遺伝子座のＤＮＡを切断し、ｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化する。
　したがって、好ましい実施形態においては、リゾプス属菌親株に、上記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを導入することによって、該リゾプス属菌のｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化して、本発明の変異リゾプス属菌を作製する。該ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、それぞれ、上述したポリヌクレオチド（ｌ）及び（ｒ）が挙げられる。
　細胞内でＴＡＬＥＮなどの人工ＤＮＡ切断酵素とともに外来エキソヌクレアーゼを発現させることにより、人工ＤＮＡ切断酵素の標的ＤＮＡの破壊が促進される（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，３：１２５３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１２５３、Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９：９７３－９７５）。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、リゾプス属菌親株に、上記ＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドに加えて、さらにエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入する。エキソヌクレアーゼとしては、糸状菌に由来するエキソヌクレアーゼであれば特に限定されないが、好ましくはリゾプス属菌由来エキソヌクレアーゼ、より好ましくはエキソヌクレアーゼ１又はエキソヌクレアーゼ２に属するものが挙げられ、さらに好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼが挙げられる。
　さらに好ましいエキソヌクレアーゼの例としては、配列番号７又は配列番号８２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来エキソヌクレアーゼ（配列番号８）が挙げられる。したがって、本発明で使用されるエキソヌクレアーゼのさらに好ましい例としては、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされたエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；配列番号８２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；及び、配列番号８２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされたエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
　細胞内でのＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼの発現には、ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼのペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入すればよい。好ましくは、各ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞内に導入し、該細胞内でＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼを発現させる。各ＴＡＬＥＮ及びエキソヌクレアーゼのポリヌクレオチドは、同じベクターに含まれていてもよいが、別々のベクターに含まれていてもよい。発現ベクターは、それを導入する細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであれば特に限定されない。リゾプス属菌に適した発現ベクターとしては、例えばｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＰＴＲ１／２（ＴａＫａＲａ）、ｐＲＩ９０９／９１０（ＴａＫａＲａ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ　Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
　細胞内でのＴＡＬＥＮの効率的な発現のために、上記ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、リゾプス属菌で働くプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。リゾプス属菌で働くプロモーターの例としては、ｌｄｈＡプロモーター（米国特許第６２６８１８９号）、ｐｇｋ１プロモーター（国際公開第２００１／７３０８３号）、ｐｇｋ２プロモーター（国際公開第２００１／７２９６７号）、ｐｄｃＡプロモーター及びａｍｙＡプロモーター（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１８６：４１－５０）、ｔｅｆ及び１８ＳｒＲＮＡプロモーター（米国特許出願公開第２０１０／１１２６５１号）、ならびにａｄｈ１プロモーター（特願２０１５－１５５７５９）が挙げられるが、これらに限定されない。
　上記ＴＡＬＥＮ又はエキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含む発現ベクターは、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などを用いて細胞に導入することができる。
　ＴＡＬＥＮの導入により標的遺伝子が欠失又は不活性化した細胞は、ランダム変異の場合と同様に、細胞のゲノム配列の確認、又はピルビン酸デカルボキシラーゼの発現量若しくは活性に基づいて選択することができる。
　以上の手順により、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低減された本発明の変異リゾプス属菌を作製することができる。本発明の変異リゾプス属菌は、その変異前の株（親株）と比べて有機酸の生産性が向上している。したがって、本発明の変異リゾプス属菌を培養すれば、有機酸を効率よく生産することができる。したがって、本発明は、本発明の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法を提供する。有機酸としては、好ましくは乳酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸及びα－ケトグルタル酸が挙げられ、より好ましくはフマル酸、コハク酸及びリンゴ酸が挙げられる。
　本発明の変異リゾプス属菌を用いた有機酸の製造は、本発明の変異リゾプス属菌を、一般的なリゾプス属菌の培養方法に従って好気的に培養し、次いで培養物から有機酸を回収することにより行うことができる。例えば、本発明の変異リゾプス属菌を、適切な培地で１０℃～５０℃、好ましくは２５℃～３５℃にて、数日間好気的に培養することで、有機酸を生産することができる。培養日数は目的の有機酸が充分に産生される期間であればよい。例えば、目的の有機酸が乳酸であれば、前述の温度にて、１～１６８時間、好ましくは２～７２時間、より好ましくは４～２４時間培養することにより、乳酸が生産される。あるいは目的の有機酸がフマル酸であれば、前述の温度にて、１～１６８時間、好ましくは２～７２時間、より好ましくは４～３６時間培養することにより、フマル酸が生産される。コハク酸、リンゴ酸、及びα－ケトグルタル酸の場合も同様である。
　本発明の変異リゾプス属菌を培養するための培地は、リゾプス属菌が健全に生育し、且つ目的の有機酸を生産することが可能な培地である限り特に限定されない。例えば、培地としては、グルコース、キシロースなどの単糖；シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖；デンプン等の多糖などを基質とした固体培地若しくは液体培地、又は市販のＰＤＢ培地（ポテトデキストロース培地；ベクトン・ディッキンソン　アンド　カンパニー製等）、ＰＤＡ培地（ベクトン・ディッキンソン　アンド　カンパニー製等）、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地；日本製薬社製（商標名「ダイゴ」）等）、ＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ；ベクトン・ディッキンソン　アンド　カンパニー製等）、ＳＢ培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地；ＯＸＯＩＤ社製等）などを使用することができる。さらに培地には、グリセリン、クエン酸などの生体成分；アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素等、アミノ酸等、大豆ペプチドなどの天然窒素源等の窒素源；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、などを適宜添加することができる。
　培養後、培地から培養上清を回収することにより、有機酸を得ることができる。必要に応じて、傾斜法、膜分離、遠心分離、電気透析法、イオン交換樹脂の利用、蒸留、塩析、晶析等の方法、又はこれらの組み合わせにより、当該培養液中の有機酸を有機酸塩として回収した後、回収された有機酸塩から有機酸を単離又は精製してもよい。
　一実施形態において、より効率的に有機酸を生産するには、以下に示すような工程で生産を行ってもよい。すなわち、本発明の変異リゾプス属菌の胞子懸濁液を調製し（工程Ａ）、それを培養液で培養して胞子を発芽させ菌糸体を調製し（工程Ｂ１）、好適にはさらに当該菌糸体を増殖させ（工程Ｂ２）、次いで調製した菌糸体を培養して有機酸を生産させること（工程Ｃ）により、効率よく有機酸を製造することができる。
＜工程Ａ：胞子懸濁液の調製＞
　本発明の変異リゾプス属菌の胞子を、例えば、無機寒天培地（組成例：２％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、１．５％寒天、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））、ＰＤＡ培地、等の培地に接種し、１０～４０℃、好ましくは２７～３０℃にて、７～１０日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれてもよいし、含まれなくてもよい。
＜工程Ｂ１：菌糸体の調製＞
　工程Ａで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、１×１０2～１×１０8個－胞子／ｍＬ－培養液、好ましくは１×１０2～５×１０4個－胞子／ｍＬ－培養液、より好ましくは５×１０2～１×１０4個－胞子／ｍＬ－培養液、さらに好ましくは１×１０3～１×１０4個－胞子／ｍＬ－培養液である。
　本工程で使用する胞子発芽用の培養液には、市販の培地、例えば、ＰＤＢ培地、ＬＢ培地、ＮＢ培地、ＳＢ培地などが利用できる。また、当該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素等、アミノ酸等、大豆ペプチドなどの天然窒素源等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１～３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１～１０％（ｗ／ｖ）、窒素源の好ましい濃度は０．０１～１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１～０．５％（ｗ／ｖ）である。
　工程Ｂ１においては、上記培養液を用いて、本発明の変異リゾプス属菌を培養する。培養は、通常の手順にて行なえばよい。例えば、培養液を含む培養容器に、糸状菌胞子を接種し、好ましくは８０～２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００～１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５～４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４～１２０時間、より好ましくは４８～７２時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０～１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００～３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、糸状菌胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
＜工程Ｂ２：菌糸体の増殖＞
　有機酸生産能向上の観点から、工程Ｂ１で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（工程Ｂ２）を行うことが好ましい。工程Ｂ２で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５～３０％グルコース、０．０５～２％硫酸アンモニウム、０．０３～０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１～０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５～０．１％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５～２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０～３００ｍＬ、好ましくは１００～２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程Ｂ１で培養した菌体を、湿重量として１～２０ｇ－菌体／１００ｍＬ－培地、好ましくは３～１０ｇ－菌体／１００ｍＬ－培地となるよう接種し、１００～３００ｒｐｍ、好ましくは１７０～２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５～４２．５℃の培養温度制御下で、１２～１２０時間、好ましくは１６～７２時間培養する。
＜工程Ｃ：有機酸生産＞
　上記の手順（Ｂ１又はＢ２）で得られた糸状菌の菌糸体を培養して当該菌に有機酸を生産させ、その後生産された有機酸を回収することができる。工程（Ｃ）で使用される有機酸生産用培養液は、グルコース等の炭素源、アンモニウム塩等の窒素源及び各種金属塩等を含み、有機酸を生産できる培養液であればよい。当該工程（Ｃ）に使用される培養液としては、例えば、７．５～３０％グルコース、０．０５～２％硫酸アンモニウム、０．０３～０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１～０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５～０．１％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５～２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０～１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。
　工程（Ｃ）で使用する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０～８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０～２００ｍＬ程度であればよい。この培養液に、工程Ｂ１又はＢ２で得られた菌体を、湿重量として５ｇ～９０ｇ－菌体／１００ｍＬ－培養液、好ましくは５ｇ～５０ｇ－菌体／１００ｍＬ－培養液の量となるように接種し、１００～３００ｒｐｍ、好ましくは１７０～２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５～４５℃の培養温度制御下で、２時間～７２時間、好ましくは４時間～３６時間好気的に培養する。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が低減されている変異リゾプス属菌。
〔２〕好ましくは、ｐｄｃ遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔１〕記載の変異リゾプス属菌。
〔３〕好ましくは、前記ｐｄｃ遺伝子が、以下：
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
　配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、〔２〕記載の変異リゾプス属菌。
〔４〕好ましくは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが導入されている、〔２〕又は〔３〕記載の変異リゾプス属菌。
〔５〕好ましくは、エキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドがさらに導入されている、〔４〕記載の変異リゾプス属菌。
〔６〕前記エキソヌクレアーゼが、
　好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
　より好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼである、
〔５〕記載の変異リゾプス属菌。
〔７〕好ましくは、前記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
　配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
　配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、〔５〕記載の変異リゾプス属菌。
〔８〕ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が、変異前と比べて、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下に低減されている、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
〔９〕前記リゾプス属菌が、
　好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒであり、
　より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒである、
〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
〔１０〕有機酸生産性が向上している、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
〔１１〕リゾプス属菌においてピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減することを含む、変異リゾプス属菌の製造方法。
〔１２〕リゾプス属菌においてピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を低減することを含む、リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法。
〔１３〕好ましくは、リゾプス属菌におけるｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記ｐｄｃ遺伝子が、以下：
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
　配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１つである、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記ｐｄｃ遺伝子の欠失又は不活性化が、人工ＤＮＡ切断酵素を用いたｐｄｃ遺伝子座のゲノム編集によって行われる、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕前記ゲノム編集が、好ましくはＴＡＬＥＮ、Ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９システム、又はＺＦＮによって行われ、より好ましくはＴＡＬＥＮによって行われる、〔１５〕記載の方法。
〔１７〕前記ゲノム編集が、
　好ましくは、前記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することであり、
　より好ましくは、前記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することである、
〔１６〕記載の方法。
〔１８〕好ましくは、前記ＴＡＬＥＮペプチドが下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなる、〔１７〕記載の方法：
ポリペプチド（Ｌ）：
　１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
　該１７個のリピートうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
　該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
　該ＴＡＬエフェクターは、配列番号９で示される配列を認識する、
ポリペプチド（Ｒ）：
　１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し；
　該１７個のリピートうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列に対して５個以下のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり；
　該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号４４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり；
　該ＴＡＬエフェクターは、配列番号１０で示される配列を認識する。
〔１９〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｌ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号１１で示されるアミノ酸配列の１２～１３番アミノ酸に相当する位置にｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号９で示される配列の２～１８番塩基を認識する、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｒ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、それぞれ、配列番号２８で示されるアミノ酸配列の１２～１３番アミノ酸に相当する位置にｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＲＶＤ）を有し、各リピートのＲＶＤは、配列番号１０で示される配列の２～１８番塩基を認識する、〔１８〕記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｌ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、上流から順に、以下の（１）～（１７）のアミノ酸配列からなる、〔１８〕記載の方法。
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（２）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（５）配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（６）配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（７）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（８）配列番号１８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（９）配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１０）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１１）配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１２）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１３）配列番号２３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１４）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１５）配列番号２５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１６）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１７）配列番号２７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
〔２２〕前記（１）～（１７）の配列のうちの好ましくは１５個以上、より好ましくは１６個以上が、以下のアミノ酸残基を有する、〔２１〕記載の方法。
（１）について：配列番号１１の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（２）について：配列番号１２の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（３）について：配列番号１３の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（４）について：配列番号１４の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（５）について：配列番号１５の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（６）について：配列番号１６の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（７）について：配列番号１７の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（８）について：配列番号１８の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（９）について：配列番号１９の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１０）について：配列番号２０の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１１）について：配列番号２１の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１２）について：配列番号２２の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１３）について：配列番号２３の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１４）について：配列番号２４の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１５）について：配列番号２５の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１６）について：配列番号２６の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１７）について：配列番号２７の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
〔２３〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｒ）のＴＡＬエフェクター中の１７個のリピートは、上流から順に、以下の（１'）～（１７'）のアミノ酸配列からなる、〔１８〕記載の方法。
（１'）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（２'）配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（３'）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（４'）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（５'）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（６'）配列番号３３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（７'）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（８'）配列番号３５で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（９'）配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１０'）配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１１'）配列番号３８で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１２'）配列番号３９で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１３'）配列番号４０で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１４'）配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１５'）配列番号４２で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１６'）配列番号４３で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（１７'）配列番号４４で示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
〔２４〕前記（１'）～（１７'）の配列のうちの好ましくは１５個以上、より好ましくは１６個以上が、以下のアミノ酸残基を有する、〔２３〕記載の方法。
（１'）について：配列番号２８の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（２'）について：配列番号２９の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（３'）について：配列番号３０の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（４'）について：配列番号３１の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（５'）について：配列番号３２の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（６'）について：配列番号３３の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（７'）について：配列番号３４の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（８'）について：配列番号３５の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（９'）について：配列番号３６の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１０'）について：配列番号３７の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＧ
（１１'）について：配列番号３８の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１２'）について：配列番号３９の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１３'）について：配列番号４０の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（１４'）について：配列番号４１の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＩ
（１５'）について：配列番号４２の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＨＤ
（１６'）について：配列番号４３の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
（１７'）について：配列番号４４の１２－１３番アミノ酸に相当する位置におけるアミノ酸残基ＮＮ
〔２５〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｌ）が以下のポリペプチドである、〔１８〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法：
　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
　配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
　配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
　配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
〔２６〕好ましくは、前記ポリペプチド（Ｒ）が以下のポリペプチドである、〔１８〕～〔２５〕のいずれか１項記載の方法：
　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
　配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
　配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
　配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターと、Ｆｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
〔２７〕好ましくは、前記ＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが以下のi）及びii）である、〔１７〕記載の方法。
i） 配列番号３で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
　  配列番号４で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
及び
ii）配列番号５で示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
　  配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
〔２８〕好ましくは、前記リゾプス属菌にエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、〔１７〕～〔２７〕のいずれか１項記載の方法。
〔２９〕前記エキソヌクレアーゼが、
　好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
　より好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼである、
〔２８〕記載の方法。
〔３０〕好ましくは、前記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
　配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
　配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、〔２８〕記載の方法。
〔３１〕前記リゾプス属菌が、
　好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒであり、
　より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒである、
〔１１〕～〔３０〕のいずれか１項記載の方法。
〔３２〕前記リゾプス属菌におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の低減が、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下への低減である、〔１１〕～〔３１〕のいずれか１項記載の方法。
〔３３〕〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法。
〔３４〕好ましくは、培養後の培養物から有機酸を回収することをさらに含む、〔３３〕記載の有機酸の製造方法。
〔３５〕前記有機酸が、
　好ましくはフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα－ケトグルタル酸であり、
　より好ましくはフマル酸、コハク酸又はリンゴ酸である、
〔３３〕又は〔３４〕記載の有機酸の製造方法。
〔３６〕有機酸の製造のための、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌の使用。
〔３７〕前記有機酸が、
　好ましくはフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα－ケトグルタル酸であり、
　より好ましくはフマル酸、コハク酸又はリンゴ酸である、
〔３６〕記載の使用。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　本実施例で用いたＰＣＲプライマーを表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１　ｐｄｃ遺伝子欠損変異リゾプス属菌の作製
（１）トリプトファン栄養要求性株の作製
　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）由来のトリプトファン栄養要求性株を、ｐｄｃ遺伝子（配列番号１）欠失のための親株として用いた。トリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて12Ｃ5＋を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００～１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、ｔｒｐＣ遺伝子領域に１塩基欠損変異を有し、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　０２Ｔ６株を取得した。この株を、以降の実施例で変異リゾプス属菌の親株として用いた。
（２）プラスミドベクター作製
　５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号４５）及びｏＪＫ１６３（配列番号４６）を用いたＰＣＲにてｔｒｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号４７）及びｏＪＫ１６５（配列番号４８）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８－ｔｒｐＣを作製した。
　次いで、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ａｄｈ１のプロモーター断片とターミネーター断片を、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号４９）及びｏＪＫ２０４（配列番号５０）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号５１）及びｏＪＫ２１６（配列番号５２）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、上記で構築したプラスミドｐＵＣ１８－ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号５３）及びｏＪＫ２１１（配列番号５４）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを作製した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にａｄｈ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。
　さらに、ｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈから、ｔｒｐＣ遺伝子領域を除いたプラスミドベクターを作製した。すなわち、上記で構築したｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｔｒｐＣ－ｌｏｓｔ－Ｆ（配列番号５５）及びｔｒｐＣ－ｌｏｓｔ－Ｒ（配列番号５６）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。本断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐＵＣ１８－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを作製した。
（３）ｐｄｃ遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
　Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に依頼し、Ｃｕｓｔｏｍ　ＸＴＮ　ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を作製した。これは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ１（ＰＤＣ１）をコードする遺伝子（ｐｄｃ遺伝子；配列番号１）を標的とするＴＡＬＥＮのためのキットであり、２つのポリヌクレオチドＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ（配列番号３）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ（配列番号５）を含み、ｐｄｃ遺伝子を含む領域（配列番号８１）に結合する。ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃは、ｐｄｃ遺伝子のセンス鎖中の５’－ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号９）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードし、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃは、アンチセンス鎖中の５’－ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。
　上記ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃをコードするポリヌクレオチドを、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ－Ｒ（配列番号５７）及びａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ－ＴＡＬＥＮ－Ｆ（配列番号５９）及びＴＡＬＥＮ－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号６０）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを含むプラスミドｐａｄｈ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを得た。
　上記ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃをコードするポリヌクレオチドを、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現する（但しｔｒｐＣ配列を含まない）ベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ－Ｒ（配列番号５７）及びａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ－ＴＡＬＥＮ－Ｆ（配列番号５９）及びＴＡＬＥＮ－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号６０）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ断片を増幅し、ベクター断片と連結して、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを含むプラスミドｐａｄｈ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃを得た。
（４）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
　プラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ）を鋳型に、プライマーｐＰＴＲ１－ｓａｌ１－Ｆ（配列番号６１）及びｐＰＴＲ１－ｓａｌ１－Ｒ（配列番号６２）を用いたＰＣＲにてｐＵＣ１８ベクター断片を増幅した。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＮＲＢＣ５３８４株（以下、５３８４株と表記）の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーｓａｌ１－ｌｄｈｐｒｏ－Ｆ３（配列番号６３）及びｌｄｈｐｒｏ－Ｒ（配列番号６４）を用いてｌｄｈプロモーター断片を、プライマーｌｄｈｐｒｏ－ｅｘｏ１－Ｆ２（配列番号６５）及びｅｘｏ１－ｐｄｃｔｅｒ－Ｒ２（配列番号６６）を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片（配列番号８２）を、及びプライマーｐｄｃＴｅｒ－Ｆ（配列番号６７）及びｐｄｃＴｅｒ－ｓａｌ１－Ｒ（配列番号６８）を用いてｐｄｃターミネーター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記４断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｌｄｈ－ｅｘｏ１を作製した。
（５）ｔｒｐＣ　ｋｎｏｃｋ－ｉｎ用プラスミドの作製
　ｐｄｃ遺伝子ローカスにてｐｄｃ遺伝子ＯＲＦを除き、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ－ｉｎするためのプラスミドｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８－Ｐａｅ１－Ｆ３（配列番号６９）及びｐＵＣ１８－Ｈｉｎｄ３－Ｒ３（配列番号７０）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１－ｕｐｓｔｒ－Ｆ（配列番号７１）及びＰＤＣ１－ｕｐｓｔｒ－Ｒ（配列番号７２）にて増幅したｐｄｃ遺伝子のプロモーター部位断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ－Ｒ（配列番号７３）及びｔｒｐＣｔｅｒ－Ｆ（配列番号７４）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｆ（配列番号７５）及びＰＤＣ１－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｒ（配列番号７６）にて増幅したｐｄｃ遺伝子のターミネーター部位断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎを構築した。
（６）一本鎖ＤＮＡの調製
　プラスミドｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎを鋳型にプライマーＰＤＣ１－ｕｐｓｔｒ－Ｆ２（配列番号７７）及びＰＤＣ１－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｒ－Ｐ（配列番号７８、プライマーの５’末端がリン酸化されている）を用いてＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、鋳型をＤｐｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）処理にて分解した後、生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理にて精製した。精製物を、さらにＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖ＤＮＡを得た。Ｌａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、３７℃、オーバーナイトで行った。
（７）パーティクルガンによる遺伝子導入
　上記（３）で作製したプラスミドｐａｄｈ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ及びｐａｄｈ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃは制限酵素ＳｃａＩで、及び上記（４）で作製したプラスミドｐｌｄｈ－ｅｘｏ１は制限酵素Ｐｓｔ１で処理した。ｐａｄｈ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ、ｐａｄｈ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ、ｐｌｄｈ－ｅｘｏ１及び上記（６）で作製した一本鎖ＤＮＡの濃度比が、２：４：２：１になるよう混合してＤＮＡ溶液（約１～３μｇ／μＬ）を調製した。該ＤＮＡ溶液１０μＬを金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、ＩＮＢＩＯ　ＧＯＬＤ社、粒子径１μｍ）１００μＬに加え混合した。さらに０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。２．５ＭのＣａＣｌ2を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。
　上記（１）で取得した０２Ｔ６株の胞子に対し、上記のＤＮＡ－金粒子溶液を用い、ＧＤＳ－８０（ネッパジーン）にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）上で、３０℃にて１週間ほど静置培養した。
（８）ｐｄｃ遺伝子欠損株の選択
　上記（７）で培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ３に調製した無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）を用いて菌株を単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ１－ｕｐ２（配列番号７９）とｔｒｐＣ（ｄ）－１（配列番号８０）、及びＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ遺伝子ローカスにｔｒｐＣ遺伝子断片のｋｎｏｃｋ－ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、ｐｄｃ遺伝子欠失株０２Ｔ６Δｐｄｃ株として取得した。
実施例２　変異リゾプス属菌におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の評価
　実施例１で取得した０２Ｔ６株及び０２Ｔ６Δｐｄｃ株を培養し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を測定した。
（１）菌体の培養
　５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコ（旭硝子製）に、２００ｍＬのシード培地（組成：ＳＤ／－Ｔｒｐ　Ｂｒｏｔｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、添付のプロトコールに従い調製）、０．００２％トリプトファン、０．５％ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ－Ｌ１０、花王製）、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を供し、０２Ｔ６株又は０２Ｔ６Δｐｄｃ株の胞子懸濁液を１×１０3個－胞子／ｍＬ－培地となるように接種し、２７℃にて約７２時間、１７０ｒｐｍで撹拌培養した。次いで、上記の培養物を、滅菌処理した網目２５０μｍの金網を用いて濾過し、菌体をフィルター上に回収した。回収した菌体を５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、０．００２％トリプトファン、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に６．０～８．０ｇを接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて撹拌培養した。上記培養物を、滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて培養物を濾過し、フィルター上に菌体を回収し、このフィルターホルダー上で約５０ｍＬの生理食塩水にて菌体を２回洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。得られた菌体６ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液４０ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、０．００２％トリプトファン、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し３５℃、１７０ｒｐｍにて８時間、振盪培養を行った。
（２）ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性の評価
　上記（１）で得られた培養物から、滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて菌体を濾過し、フィルター上に菌体を回収した。さらに、このフィルターホルダー上で約５０ｍＬの生理食塩水にて菌体を２回洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。菌体０．３ｇを３ｍＬ破砕チューブ（安井器械社製）に回収し、３ｍＬ用メタルコーン（安井器械社製）を入れ、蓋を閉めた後、液体窒素で凍結した。凍結した３ｍＬ破砕チューブをマルチビーズショッカー（安井器械社製）に供し、１７００ｒｐｍで１０秒間菌体を破砕した。その後、ｃＯｍｐｌｅｔｅ　ＵＬＴＲＡ　Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ，ＥＡＳＹ　ｐａｃｋ（ロシュ社）を添加した５０ｍＭ　Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて懸濁後、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を菌体破砕液とした。菌体破砕液のタンパク質濃度は、Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて測定した。
　菌体破砕液のＰＤＣ活性は、ピルビン酸と菌体破砕液との反応生成物にアルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨ）を反応させ、生成するＮＡＤ＋の量を吸光度変化に基づいて測定することで定量した。すなわち、１８０μＬの反応液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１７５μＭ　ＮＡＤＨ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、１ｍＭ　チアミン２リン酸、１Ｕ　ＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）］に、適宜希釈した菌体破砕液を１０Ｌ添加し、３５℃で５分静置した。その後、上記反応液に２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム溶液を１０μＬ添加し、３５℃で反応を開始した。吸光度変化は、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００　ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）で測定した。１Ｕは、３５℃で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ+を生成する酵素量と定義した。
　結果を表３に示す。親株である０２Ｔ６株と比較して、０２Ｔ６Δｐｄｃ株では、ＰＤＣ活性が約１３％に減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例３　変異リゾプス属菌における有機酸生産性評価
　実施例２（１）と同様の手順で０２Ｔ６株及び０２Ｔ６Δｐｄｃ株を培養した。但し、培養期間は２日間とした。培養開始０、４、８、１０、２４及び３２時間後に、培養液上清のサンプリングを行い、後述の参考例１に記載の手順にて該上清中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールを定量し、次いで各物質の選択率を求めた。
　グルコースの完全消費が確認された培養２４時間後時点での各物質の選択率を表４に示す。０２Ｔ６Δｐｄｃ株は、親株である０２Ｔ６株と比較して、エタノール選択率が９５．５％に減少し、フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸の選択率がそれぞれ１１７％、１１２％及び１０８％に向上したことにより、有機酸の生産性が向上したことが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
比較例１　ｐｄｃ３遺伝子破壊株のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の評価
（１）プラスミドベクターの作製
　実施例１（２）で構築したｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈのａｄｈ１プロモーターをｃｉｐＣプロモーターに変更したプラスミドベクターを作製した。すなわち、該ｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－Ｐａｄｈ－Ｔａｄｈを鋳型にプライマーａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）及びｔｒｐＣｔｅｒ－Ｒ（配列番号８８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅し、また５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｔｒｐＣｔｅｒ－ｃｉｃＣｐｒｏ－Ｆ（配列番号８９）及びｃｉｐＣｐｒｏ－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号９０）を用いたＰＣＲにてｃｉｐＣプロモーター領域断片を増幅した。以上の２断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを作製した。
　続いて、上記で構築したｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－ＰｃｉｐＣ－ＴａｄｈからｔｒｐＣ遺伝子領域を除いたプラスミドベクターを作製した。すなわち、該ｐＵＣ１８－ｔｒｐＣ－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｔｒｐＣ－ｌｏｓｔ－Ｆ２（配列番号９１）及びｔｒｐＣ－ｌｏｓｔ－Ｒ２（配列番号９２）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。本断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを作製した。
（２）ｐｄｃ３遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
　ｐｄｃ３遺伝子座を標的として、ＴＡＬＥＮを作製した。ＴＡＬＥＮの作製は、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼し、ＧｅｎｅＡｒｔ　ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ　ＴＡＬｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を得た。このキットは、標的遺伝子に対するＬｅｆｔ－ＴＡＬＥＮ及びＲｉｇｈｔ－ＴＡＬＥＮの２つのポリヌクレオチドを含む。ｐｄｃ３遺伝子（配列番号８３）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３（配列番号８４）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３（配列番号８５）を含み、これらはそれぞれ、ｐｄｃ３遺伝子のセンス鎖中の５’－ＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴ－３’（配列番号８６）及びアンチセンス鎖中の５’－ＣＧＴＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＡＴＴＧＴＡ－３’（配列番号８７）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。
　ｐｄｃ３遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（１）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈに挿入し、ｃｉｐＣプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－Ｒ（配列番号９３）及びａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ－Ｆ（配列番号９４）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号９５）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３の断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を含むプラスミドｐｃｉｐＣ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を得た。
　同様に、ｐｄｃ３遺伝子用のＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（１）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈに挿入し、ｃｉｐＣプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－Ｒ（配列番号９３）及びａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ－Ｆ（配列番号９４）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号９５）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３の断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を含むプラスミドｐｃｉｐＣ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を得た。
（３）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
　実施例１（４）で作製したプラスミドｐｌｄｈ－ｅｘｏ１を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－ｅｘｏ１－Ｆ（配列番号９６）及びｅｘｏ１－ａｄｈｔｅｒ－Ｒ（配列番号９７）を用いたＰＣＲにてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、上記（１）で作製したプラスミドｐＵＣ１８－ＰｃｉｐＣ－Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ－Ｒ（配列番号９３）及びａｄｈｔｅｒ－Ｆ（配列番号５８）を用いたＰＣＲにてベクター断片を、それぞれ増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｃｉｐＣ－ｅｘｏ１を得た。
（４）ｐｄｃ３遺伝子座を標的とするｔｒｐＣ　ｋｎｏｃｋ－ｉｎ用プラスミドの作製
　ｐｄｃ３遺伝子ローカスにてｐｄｃ３遺伝子ＯＲＦを除き、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ－ｉｎするための、プラスミドｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８－Ｐａｅ１－Ｆ３（配列番号６９）及びｐＵＣ１８－Ｈｉｎｄ３－Ｒ３（配列番号７０）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｐｄｃ３－ｕｐｓｔｒ－Ｆ（配列番号９８）及びｐｄｃ３－ｕｐｓｔｒ－Ｒ２（配列番号９９）にて増幅したｐｄｃ３遺伝子プロモーター断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｐｄｃ３－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｆ２（配列番号１００）及びｐｄｃ３－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｒ（配列番号１０１）にて増幅したｐｄｃ３遺伝子ターミネーター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。
　続いて、ｐｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ｐｄｃ３）を鋳型にプライマーｐｄｃ３－ｕｐｓｔｒ－Ｒ（配列番号１０２）及びｐｄｃ３－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｆ（配列番号１０３）にて増幅したＤＮＡ断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ－Ｒ（配列番号７３）及びｔｒｐＣｔｅｒ－Ｆ（配列番号７４）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。
（５）一本鎖ＤＮＡの調製
　ＰＣＲの鋳型としてｐｔｒｐＣ－ｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ｐｄｃ３）を、プライマーとしてｐｄｃ３－ｕｐｓｔｒ－Ｆ２（配列番号１０４）及びｐｄｃ３－ｄｏｗｎｓｔｒ－Ｒ２－Ｐ（配列番号１０５、５’側はリン酸化されている）を用いた以外は、上記実施例１（６）と同様の手順で一本鎖ＤＮＡを得た。
（６）パーティクルガンによる遺伝子導入
　上記実施例１（７）と同様の手順で、一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ－金粒子溶液を調製し、これを用いて０２Ｔ６株の胞子に対して遺伝子導入し、得られた胞子を培養した。一本鎖ＤＮＡには、上記（５）で作製した一本鎖ＤＮＡを用いた。ＴＡＬＥＮ発現ベクターには、上記（２）で作製したｐｃｉｐＣ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３及びｐｃｉｐＣ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３を用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターには上記（４）で作製したｐｃｉｐＣ－ｅｘｏ１を用いた。ＤＮＡ溶液におけるｐｃｉｐＣ－ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３、ｐｃｉｐＣ－ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ－ｐｄｃ３、ｐｃｉｐＣ－ｅｘｏ１、及び一本鎖ＤＮＡの濃度比は、およそ１：１：１：２とした。
（７）ｐｄｃ３遺伝子欠損株の選択
　上記（６）で培養した菌体から胞子を回収し、上記実施例１（８）と同様の手順で、菌株の単離及びゲノムテンプレート溶液の調製を行った。次いでこれを鋳型としたコロニーＰＣＲによりｐｄｃ３遺伝子ローカスにｔｒｐＣ遺伝子領域断片がｋｎｏｃｋ－ｉｎされたｐｄｃ３遺伝子欠損株を選択した。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ３－ｕｐ（配列番号１０６）とｔｒｐＣ（ｄ）－１（配列番号８０）、及びＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ３遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子領域断片のｋｎｏｃｋ－ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、ｐｄｃ３遺伝子欠損株０２Ｔ６Δｐｄｃ３株として取得した。
（８）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の評価
　上記実施例２（１）と同様の方法で０２Ｔ６株、０２Ｔ６Δｐｄｃ株及び０２Ｔ６Δｐｄｃ３株菌体を培養し、実施例２（２）と同様の方法でピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の評価を行った。
　結果を表５に示す。親株である０２Ｔ６株と比較して、ＰＤＣ活性は、０２Ｔ６Δｐｄｃ株では約２０％に減少していたが、０２Ｔ６Δｐｄｃ３株では約８９％残存していた。ＰＤＣの活性低下は、有機酸生産の副産物であるエタノールの生成の抑制に寄与することから、０２Ｔ６Δｐｄｃ３株の有機酸生産性が０２Ｔ６Δｐｄｃ株に劣ること、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の中でも、ｐｄｃ遺伝子の欠損が有機酸生産性向上に有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
参考例１　培養物中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールの定量
＜分析条件＞
　培養上清中のグルコース、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸及びエタノールの定量は、ＨＰＬＣ装置ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて行なった。分析カラムには、ガードカラムＩＣＳｅｐ　ＩＯＮ－３００　Ｇｕａｒｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｃａｒｔｒｉｄｅ（４．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×２０ｍｍ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を接続した有機酸分析用ポリマーカラムＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製）を用い、溶離液０．０１Ｎ硫酸、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃の条件にて溶出した。グルコース及びエタノールの検出には示唆屈折率検出器（ＲＩ検出器）を、フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いた。ＨＰＬＣ分析に供する培養上清試料は、予め０．８６Ｍ硫酸ナトリウム溶液で３倍希釈し、その後３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＡｃｒｏＰｒｅｐ　９６－ｗｅｌｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｔｅｓ（０．２μｍ　ＧＨＰ膜、ポール社製）を用いて不溶物を除去した。
＜選択率の算出＞
　物質の選択率とは、培養物のグルコース消費量から計算される該培養物から理論上得ることが可能な該物質の最大当量（理論最大量）に対する、該培養物から実際に得られた該物質の当量の比率をいう。すなわち、選択率は以下の式で求められる。
　　選択率　＝　生成物当量／理論最大量
　　（ここで、理論最大量＝グルコース消費当量 ×〔補正係数〕）
　測定対象物質の理論最大量及び補正係数は以下のとおりである：
　　　　　　　 〔理論最大量〕　　　　　　　　　　　 〔補正係数〕
　　エタノール：グルコース１ｍｏｌから最大２ｍｏｌ　　１／２
　　フマル酸　：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ　　２／３
　　リンゴ酸　：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ　　２／３
　　コハク酸　：グルコース２ｍｏｌから最大３ｍｏｌ　　２／３ 

Claims (19)

  1. 　変異リゾプス属菌であって、ｐｄｃ遺伝子が欠失又は不活性化されており、
    　該ｐｄｃ遺伝子が、以下：
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    からなる群より選択される少なくとも１つである、
    変異リゾプス属菌。
  2. 　ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が、変異前と比べて５０％以下に低減されている、請求項１記載の変異リゾプス属菌。
  3. 　前記リゾプス属菌が、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒである、請求項１又は２記載の変異リゾプス属菌。
  4. 　有機酸生産性が向上している、請求項１～３のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌。
  5. 　前記有機酸が、フマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα－ケトグルタル酸である、請求項４記載の変異リゾプス属菌。
  6. 　変異リゾプス属菌の製造方法であって、
    　リゾプス属菌におけるｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化することを含み、
    　該ｐｄｃ遺伝子が、以下：
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    からなる群より選択される少なくとも１つである、
    方法。
  7. 　リゾプス属菌の有機酸生産性の向上方法であって、
    　リゾプス属菌におけるｐｄｃ遺伝子を欠失又は不活性化することを含み、
    　該ｐｄｃ遺伝子が、以下：
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    からなる群より選択される少なくとも１つである、
    方法。
  8. 　前記ｐｄｃ遺伝子の欠失又は不活性化が、人工ＤＮＡ切断酵素を用いたｐｄｃ遺伝子座のゲノム編集によって行われる、請求項４又は５記載の方法。
  9. 　前記ゲノム編集が、ＴＡＬＥＮ、Ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９システム、又はＺＦＮによって行われる、請求項８記載の方法。
  10. 　前記ゲノム編集が、前記リゾプス属菌にＴＡＬＥＮペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することである、請求項８記載の方法。
  11. 　前記ＴＡＬＥＮペプチドが下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなる、請求項１０記載の方法：
    ポリペプチド（Ｌ）
    　１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し、
    　該１７個のリピートうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
    　該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
    　該ＴＡＬエフェクターは、配列番号９で示される配列を認識する、
    ポリペプチド（Ｒ）
    　１７個のリピートが連結したＴＡＬエフェクターを有し、
    　該１７個のリピートうちの上流から１～１６個目までのリピートは、各々、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
    　該１７個のリピートうちの上流から１７個目のリピートは、配列番号４４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
    　該ＴＡＬエフェクターは、配列番号１０で示される配列を認識する。
  12. 　前記ＴＡＬＥＮペプチドが下記ポリペプチド（Ｌ）及び（Ｒ）からなる、請求項１０記載の方法：
    ポリペプチド（Ｌ）
    　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    　配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターとＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
    　配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
    　配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号９で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターとＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド、
    ポリペプチド（Ｒ）
    　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    　配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターとＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド；
    　配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；又は
    　配列番号５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、且つ配列番号１０で示される配列を標的とするＴＡＬエフェクターとＦｏｋ１様ＤＮＡヌクレアーゼからなるＤＮＡ切断ドメインとを有するポリペプチド。
  13. 　前記リゾプス属菌にエキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　前記エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、
    　配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    　配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
    　配列番号８２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
    　配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    である、請求項１３記載の方法。
  15. 　前記リゾプス属菌が、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒである、請求項６～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 　請求項１～５のいずれか１項記載の変異リゾプス属菌を培養することを含む、有機酸の製造方法。
  17. 　培養後の培養物から有機酸を回収することをさらに含む、請求項１６記載の有機酸の製造方法。
  18. 　前記有機酸が、フマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα－ケトグルタル酸である、請求項１６又は１７記載の有機酸の製造方法。
  19. 　前記培養が好気培養である、請求項１６～１８のいずれか１項記載の有機酸の製造方法。 
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