WO2017130613A1 - 観察装置 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus.
  • Methods for measuring the state of cells and bacteria in a liquid mainly include a light scattering method for analyzing light scattering and an image imaging method for imaging with a microscope or the like.
  • the light scattering method can easily measure the size and number of relatively high concentration particles.
  • the light scattering method is a method for measuring the scattering intensity of light incident on a sample liquid in which cells and bacteria are suspended. The scattering intensity has a correlation with the volume and number of cells / bacteria, and is generally used as a method for examining drug activity.
  • the liquid containing bacteria is irradiated with light, the incident light is scattered by the bacteria, and the attenuation of the transmitted light amount is measured. Thereby, the growth state of bacteria is measured. Further, in recent years, image imaging methods that measure not only the volume and number of cells but also the shape of cells by microscopic observation have been actively used. Examination of drug activity against cells is considered indispensable to elucidate the mechanism of canceration and the nature of hepatocytes, which are regarded as important as a tool for realizing regenerative medicine.
  • a method for observing the state of cells by image imaging optical microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like are known.
  • the most common and simple method is an optical microscope.
  • the cells are transparent and it may be difficult to recognize the shape of the cells.
  • As a method for observing cells with an optical microscope there is a method of observing transparent cells by an observation method that captures a change in refractive index called a phase difference observation method.
  • a fluorescence microscope can recognize cells with higher sensitivity than a normal optical microscope by staining cells with a fluorescent substance. Since the fluorescence microscope needs to stain cells with a fluorescent substance, there are cases where the cells to be observed cannot be observed as they are.
  • molecules or proteins introduced as fluorescent substances may affect the activity of biomolecules. In examining drug activity, it is necessary to observe the intact state of the cells.
  • sensitivity testing devices that test the effects of antibacterial agents on bacteria, that is, the growth of bacteria is suppressed by antibacterial agents in the test of drug activity against bacteria.
  • the number of bacteria is counted using a light scattering method.
  • an image imaging method as a method for counting the number of bacteria. Observe the growth process of one bacterium by microscopic observation.
  • Some bacteria have chemotaxis (for example, Escherichia coli), and it is also possible to capture the change in chemotaxis caused by an antibacterial agent by an image imaging method.
  • a moving image is generally acquired. For example, an apparatus for detecting an effect on drug motility with respect to pulsating cardiomyocytes has been proposed (see Patent Document 1).
  • Cells and bacteria may move out of the focal plane and may be present in front of or behind the objective lens. It is also possible to evaluate the motility of cells / bacteria by determining the presence in front or behind.
  • the present invention provides a technique for recognizing the presence of cells / bacteria out of the focal plane even when the shape cannot be recognized due to defocusing, and for quantitative evaluation.
  • an observation apparatus of the present application includes an optical system used for measuring fine particles present in a sample liquid in a sample container, A driving mechanism for driving at least one of the sample container and a part of the optical system in order to three-dimensionally search the bottom surface of the sample container; A control unit for controlling the optical system or the drive mechanism; An image processing unit that divides the image of the fine particles in the sample container at the first time and the second time into a focused region and an unfocused region, and acquires information about the fine particles; A display unit that displays information about the fine particles as information representing a temporal change between the first time and the second time; It has.
  • the present invention in an observation image of cells / bacteria, from an image obtained by a single imaging, even an image that is not in focus is analyzed as information, and the positional relationship of the cells / bacteria in the optical axis direction is detected. It becomes possible to evaluate the motility of cells and bacteria.
  • FIG. 3A It is the schematic diagram which showed the whole system of the observation apparatus. It is a figure explaining the various process parts of a computer. It is the flowchart which showed the test
  • FIG. 6A It is the image after the external shape extraction of FIG. 6A according to the second embodiment. It is the image after the external shape extraction by the process different from FIG. 6B of FIG. 6A concerning 2nd Example. It is the image after the external shape extraction by the process different from FIG. 6B and FIG. 6C of FIG. 6A concerning 2nd Example. It is an example of the screen displayed on the display of the computer which concerns on 2nd Example. It is another example of the screen displayed on the display of the computer which concerns on 2nd Example.
  • the present application includes a plurality of means for solving the above-described problems.
  • an optical system such as an objective lens for measuring cells / bacteria existing on the bottom surface of the sample container and a digital image thereof are included. It consists of an image sensor that converts it into a signal, and a personal computer that receives and analyzes the digital signal of the image.
  • the image processing device is configured to extract the boundary line of the image focused on the cells and bacteria present on the bottom of the sample container.
  • An observation apparatus including a display unit for displaying information analyzed on a detection area and a background area on a monitor or the like is provided.
  • an XYZ rectangular coordinate system is set.
  • a predetermined direction in the horizontal plane is defined as the X direction
  • a direction orthogonal to the X direction in the horizontal plane is defined as the Y direction
  • a direction orthogonal to each of the X direction and the Y direction is defined as the Z direction.
  • FIG. 1 is a schematic view of a bacteria observation apparatus of this example.
  • the bacteria observation apparatus includes an illumination 101, a sample container 102, a pedestal 103, an XY stage 104, an objective lens 105, an objective lens actuator 106, an image sensor 107, and a computer 108 as main components.
  • the illumination 101 is preferably Koehler illumination that is optically designed to illuminate the bottom surface of the sample container 102 uniformly.
  • the sample container 102 has a storage unit that can hold at least one sample liquid.
  • the pedestal 103 can hold the sample container 102 and has a structure in which light enters from the top surface and light exits from the bottom surface.
  • the XY stage 104 can move the base 103 on which the sample container 102 is placed in the X direction and the Y direction.
  • the XY stage 104 includes a heater (not shown) that controls the temperature of the sample container 102.
  • the sample container 102 may be surrounded by a transparent glass heater.
  • the entire optical system may be surrounded by a heat insulating material, and the temperature inside may be adjusted with a heater.
  • the objective lens actuator 106 is an actuator that moves the objective lens 105 in the Z direction, and can scan the focal position of the objective lens 105 in the depth direction of the sample container 102.
  • the image sensor 107 is installed at a position where an image at the focal position of the objective lens 105 is formed.
  • An imaging lens may be installed between the image sensor 107 and the objective lens 105.
  • the image sensor 107 has a structure in which an image formed on the image sensor is converted into a digital signal and transferred to the computer 108.
  • the computer 108 includes at least a processor such as a CPU (Central Processing Unit), a storage unit such as a memory, and a storage device such as a hard disk. Further, the computer 108 includes an input device (such as a mouse and a keyboard) that receives input from the user, and a display device (such as a display) that displays measurement results.
  • a processor such as a CPU (Central Processing Unit)
  • a storage unit such as a memory
  • a storage device such as a hard disk.
  • the computer 108 includes an input device (such as a mouse and a keyboard) that receives input from the user, and a display device (such as a display) that displays measurement results.
  • a display device such as a display
  • the bottom surface of the sample container 102 is desirably thin and smooth.
  • the sample container 102 may be a microtiter plate having a large number of sample holders.
  • the sample container 102 is fixed to the base 103.
  • Light having a uniform intensity is irradiated from the illumination 101 to the bottom surface of the sample container 102.
  • an imaging system optical system such as a bright field, a dark field, and a phase difference is desirable.
  • the bacteria image existing near the bottom surface of the illuminated sample container 102 is collected by the objective lens 105.
  • the bacteria image collected by the objective lens 105 is formed on the image sensor 107.
  • the objective lens actuator 106 is moved to adjust the Z height position of the objective lens 105.
  • an autofocus function that takes a process of monitoring the contrast of an image captured by the image sensor 107 may be used.
  • the image captured by the image sensor 107 is transmitted to the computer 108 as digital data.
  • the transmitted image is stored in a storage device of the computer 108.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining various processing units of the computer 108.
  • the computer 108 controls an optical system such as the illumination 101, a driving mechanism (the objective lens actuator 106 and the XY stage 104), and a heater, and acquires information about bacteria at a plurality of different times.
  • the computer 108 obtains information representing temporal changes in information about bacteria from the acquired information.
  • the computer 108 includes a data acquisition unit 201, a data analysis unit 202, a data display processing unit 203, and a control unit 204.
  • the data acquisition unit 201 is a module that acquires an image formed on the image sensor 107.
  • the data acquisition unit 201 reproduces a two-dimensional image of digital data transmitted from the image sensor 107.
  • the data analysis unit 202 is a module that uses the image generated by the data acquisition unit 201 as input information and outputs the analysis result of the measurement data. For example, the data analysis unit 202 analyzes image information for a plurality of different times, and at least one quantitative value of the number of bacteria, the shape of the bacteria, the size of the bacteria, the amount of suspended bacteria, and the proportion of bacteria in the focal plane May be calculated. As an example, the data analysis unit 202 may calculate the number of bacteria by counting the number of portions of the image information that have a predetermined luminance value or more. The shape of the bacteria, the size of the bacteria, and the proportion of the bacteria in the focal plane may also be obtained from the size of the portion of the image information that is equal to or greater than a predetermined luminance value.
  • the data analysis unit 202 may obtain information on the motility of the bacteria from the information on the floating bacteria. Further, the data analysis unit 202 may obtain information on temporal changes in bacterial motility from information representing the relationship between airborne bacteria information and time. For example, when the number of bacteria at a position away from the bottom surface of the sample container decreases, it can be determined that the drug has affected the chemotactic bacteria, and the response of the drug to the bacteria can be detected.
  • the data analysis unit 202 may include statistical software that can inspect changes in the state of bacteria from temporal changes in information about bacteria.
  • the data display processing unit 203 is a module that displays the analysis result from the data analysis unit 202 on the display of the computer 108.
  • the data display processing unit 203 displays information on bacteria on a plurality of focal planes on a display in a format in which temporal changes can be compared.
  • the data display processing unit 203 may display the analysis result of the temporal change in the information about the bacteria on the display. For example, the data display processing unit 203 may display a determination result regarding the motility of bacteria and information regarding the response of the drug to the bacteria on the display.
  • the control unit 204 is a module that controls each component of the bacteria observation apparatus.
  • the control unit 204 can manage each component of the bacteria observation apparatus and manage the start of measurement and the end of measurement.
  • the control unit 204 can control the driving of the objective lens actuator 106 and the driving of the XY stage 104 when acquiring measurement data.
  • processing unit described above may be realized as a function of a program executed on the computer 108.
  • the processing unit may be realized by storing a program code corresponding to each process in a memory and executing a program code by a processor.
  • a part of the processing unit may be configured by hardware such as a dedicated circuit board.
  • FIG. 3A is a flowchart showing a method for testing a bacterial specimen.
  • a specimen which is a bacterium separated and cultured from blood or the like is obtained (301). Since the amount of bacteria is usually small, pre-culture is performed (302).
  • a mixed solution (sample solution) of a drug for examining the response to bacteria and a culture solution is prepared (303).
  • sample solution mixed with drug 304.
  • a control which is a sample solution containing only the culture solution containing no drug is also prepared.
  • Dispense the sample solution containing bacteria into the sample container (305).
  • the sample container is set in the observation apparatus of this embodiment (306).
  • Measurement with an observation apparatus is started (307). Thereafter, measurement data is acquired while performing temperature control and measurement (308). The acquired measurement data is analyzed by the computer 108. After the analysis process, the test result of how the drug has affected the bacteria is output on the computer 108 (309).
  • FIG. 3B is a flowchart showing the contents of step 308 in FIG. 3A.
  • the data acquisition unit 201 acquires measurement data measured by the image sensor 107 (311).
  • the control unit 204 may drive the objective lens actuator 106 to perform autofocus having a function of aligning the focal position of the objective lens 105 with the bottom surface of the sample container 102.
  • the data analysis unit 202 analyzes the two-dimensional plane data acquired by the data acquisition unit 201 (312). As an example, the data analysis unit 202 may convert two-dimensional plane data into image information. As another example, the data analysis unit 202 analyzes the image information and obtains at least one quantitative value of the number of bacteria, the shape of the bacteria, the size of the bacteria, the amount of airborne bacteria, and the proportion of bacteria in the focal plane. It may be calculated. Further, the data analysis unit 202 may measure the motility of bacteria from the calculated quantitative value. Further, the data analysis unit 202 may inspect the change in the state of the bacteria from the temporal change in the information about the bacteria.
  • the data analysis unit 202 outputs the analysis result (313).
  • the data display processing unit 203 may display the analysis result from the data analysis unit 202 on the display of the computer 108.
  • the data analysis unit 202 analyzes the two-dimensional plane data or the image for a plurality of different times after the drug is put into the sample solution.
  • the data analysis unit 202 can obtain information on the response of the drug to the bacteria from information representing temporal changes in information on the bacteria. For example, the data analysis unit 202 outputs the analysis result of the measurement data after 1 hour (first time) after putting the medicine and the analysis result of the measurement data after 5 hours (second time).
  • the data display processing unit 203 displays the analysis result of the measurement data at the first time and the analysis result of the measurement data at the second time on the display of the computer 108. can do.
  • the data acquisition unit 201 acquires two-dimensional plane data at a plurality of focal planes before and after the drug is added to the sample solution, and the data analysis unit 202 acquires information on the bacteria before and after the drug is added. You may obtain
  • FIG. 4A is an example of the acquired image.
  • the bacteria image is not defocused, and the bacteria are positioned at the bottom surface of the sample container 102. If it is far away from it, the bacteria image will be defocused.
  • FIG. 4B is a processed image divided into a bacterial region and a background region by performing the outer shape extraction of FIG. 4A and binarizing the image. The contour extraction is performed based on the contrast of the image. For example, a Sobel filter is generally used for contour extraction.
  • FIG. 4C is the image of FIG. 4A fractionated as the background region in FIG. 4B.
  • the area fractionated as the background area includes information on bacteria away from the bottom surface position of the sample container 102.
  • a defocused bacterial image is included in the background area, the luminance variation in the background area increases and the standard deviation (S.D.) increases.
  • the defocused bacterial image is not included in the background area, only the signal noise is present, the luminance variation in the background area is reduced, and the luminance standard deviation (S.D.) is reduced.
  • the standard deviation of the luminance of the background area is correlated with the amount of floating bacteria away from the bottom surface of the sample container 102.
  • FIG. 5 is an example of a screen displayed on the computer display by the data display processing unit 203.
  • an experimental condition display unit 501 for displaying experimental conditions indicating the state of a solution containing bacteria
  • a measurement condition display unit 502 for indicating an incident light quantity and an image measurement interval, which are conditions for acquiring an image
  • a first A first area 503 displaying a bacterial image of time (for example, 1 hour after the suspension of bacteria) and a second area displaying a bacterial image of the second time (for example, 5 hours after the suspension of bacteria) 504.
  • a bacteria number display unit 505 indicating the number of bacteria on the bottom surface of the sample container 102 in the image and a standard deviation of the luminance of the background region indicating the amount of floating bacteria are included. It has a floating bacteria amount display section 506 on which (SD) is displayed.
  • an amount correlated with the amount of bacteria floating in the culture solution is displayed.
  • information on the number of bacteria at different times is displayed side by side in a format that allows comparison of changes in the number of bacteria over time. Therefore, the response of the drug to the bacteria over time can be observed.
  • information on bacteria at two different times (the number of bacteria and the amount of suspended bacteria) is displayed, but information on bacteria at three or more different times is displayed on the screen in a format that can be compared. May be.
  • the bacterial observation apparatus of the above embodiment focuses on the bottom surface of the sample container 102 and the optical system that measures fine particles (bacteria, cells, etc.) present on the focal plane of the objective lens 105 in the sample liquid in the sample container 102.
  • a drive mechanism objective lens actuator 105 and XY stage 1004.
  • the measurement result (observation image) obtained by the image sensor 107 is converted into digital data and transferred to the computer 108.
  • the computer 108 converts the digital data into image information and displays the image information on a display.
  • the computer 108 displays the measurement results at a plurality of different times on the display.
  • the computer 108 has a process of dividing the image into two parts, that is, a bacterial region and a background region by performing image processing on the image information. From the area of bacteria, quantitative values such as the number, size, and shape of bacteria are calculated. From the background area, the amount of airborne bacteria is calculated. The computer 108 may measure the proliferation power and motility of the bacteria from the quantitative value, and inspect the state change of the microparticles from the time change of the motility.
  • the shape of the fine particles (cells or bacteria) near the bottom surface of the sample container can be accurately measured, and the spatial distribution information that the defocused image is floating in the sample liquid. Can be measured. It is possible to obtain information on the mobility of fine particles from a single still image without acquiring a plurality of images and shooting a moving image. Moreover, after making a chemical
  • medical agent for example, antibacterial agent
  • the degree of bacterial chemotaxis can be examined by measuring the extent of bacterial distribution in the liquid.
  • the data analysis unit 202 obtains information related to the response of the drug to bacteria from the information before and after the drug is put.
  • FIG. 6A is an example of the acquired image.
  • the focal position of the objective lens 105 is aligned with the bottom surface of the sample container 102 and the bacteria are close to the bottom surface of the sample container 102, the bacteria image is not defocused, and the bacteria are positioned at the bottom surface of the sample container 102. If it is far away from it, the bacteria image will be defocused.
  • FIG. 6B is a processed image that is divided into a bacterial region and a background region by extracting the outer shape of FIG. 6A and binarizing the image.
  • the contour extraction is performed based on the contrast of the image.
  • a Sobel filter is generally used for contour extraction.
  • FIG. 6C is a post-processing image obtained by extracting the outer shape of the image of FIG. 6A divided as the background area of FIG. 6B with a binarization parameter different from the image processing performed in FIG. 6B.
  • a sharpening process may be performed in addition to changing the binarization parameter.
  • 6D is a post-processing image obtained by performing outline extraction of the image of FIG. 6A that is fractionated as the background region of FIG. 6B and the background region of FIG.
  • a sharpening process may be performed in addition to changing the binarization parameter.
  • the binarization parameters were changed in three stages, and the outline of bacteria was extracted for each defocus amount. Since the defocus amount is correlated with the distance from the bottom surface of the sample container 102, the amount of bacteria at the distance from the bottom surface of the sample container 102 can be calculated. When calculating the amount of bacteria with the distance from the bottom surface with higher resolution, it is possible to change the binarization parameter in three steps performed in this embodiment by changing the binarization parameter in more steps. . In addition, since the defocused image does not reflect an accurate shape, it is desirable to correct the outer shape of the bacteria for each defocus amount.
  • FIG. 7 is an example of a screen displayed on the computer display by the data display processing unit 203.
  • an experimental condition display unit 701 for displaying an experimental condition indicating the state of a solution containing bacteria
  • a measurement condition display unit 702 for indicating an incident light amount and an image measurement interval, which are conditions for acquiring an image
  • a first A first area 703 that displays a bacterial image of time (1 hour after the suspension of bacteria)
  • a second area 704 that displays a bacterial image of the second time (5 hours after the suspension of bacteria)
  • a bacteria number display unit 705 indicating the number of bacteria on the bottom surface of the sample container 102 in the image
  • a floating bacteria amount display unit 706 displaying the number of floating bacteria.
  • a bacterial number distribution diagram 707 that displays the bacterial number distribution at a distance from the bottom surface of the sample container 102 of floating bacteria.
  • an amount correlated with the amount of bacteria floating in the culture solution is displayed.
  • information on the number of bacteria at different times is displayed side by side in a format that allows comparison of changes in the number of bacteria over time. Therefore, the response of the drug to the bacteria over time can be observed.
  • FIG. 8 shows information representing the relationship between the spatial distribution information of bacteria and time.
  • FIG. 8 is a graph plotting a temporal change in the distribution of the number of bacteria with respect to the height from the bottom surface of the sample container.
  • the vertical axis is the number of bacteria
  • the horizontal axis is the height from the bottom (position in the Z direction)
  • the depth axis is the incubation time (for example, the elapsed time since the sample solution was prepared, etc. ).
  • the data analysis unit 202 may output information as shown in FIG. If the bottom surface of the sample container is 0 ⁇ m, the number of bacteria at the position of 0 ⁇ m increases with time.
  • the number of bacteria at 200 ⁇ m from the bottom of the sample container decreases with time.
  • the bacteria tend to grow or be constant at each height from the bottom surface, here 200 ⁇ m.
  • the decrease in the number of bacteria at a location 200 ⁇ m from the bottom of the sample container means that the bacteria in the sample liquid that were originally moving lose their chemotaxis under the influence of the drug (for example, an antibacterial agent), and the activity of the bacteria itself decreases. It shows that.
  • the effect of the antibacterial agent can be examined by analyzing the time-dependent change of the distribution of the number of bacteria in the sample solution in the height direction depending on the culture time. Therefore, the data analysis unit 202 may output the determination result of the response of the drug to the bacteria from the information representing the relationship between the spatial distribution information of the bacteria and the time.
  • the bacterial observation apparatus of the above embodiment focuses on the bottom surface of the sample container 102 and the optical system that measures fine particles (bacteria, cells, etc.) present on the focal plane of the objective lens 105 in the sample liquid in the sample container 102.
  • a drive mechanism objective lens actuator 105 and XY stage 1004.
  • the measurement result (observation image) obtained by the image sensor 107 is converted into digital data and transferred to the computer 108.
  • the computer 108 converts the digital data into image information and displays the image information on a display.
  • the computer 108 displays the measurement results at a plurality of different times on the display.
  • the computer 108 has a process of dividing the image into two parts, that is, a bacterial region and a background region by performing image processing on the image information. From the area of bacteria, quantitative values such as the number, size, and shape of bacteria are calculated. From the background area, the amount of airborne bacteria is calculated. The computer 108 may measure the proliferation power and motility of the bacteria from the quantitative value, and inspect the state change of the microparticles from the time change of the motility. Alternatively, the change in specific gravity or surface state of the fine particles may be evaluated from the natural sedimentation of the fine particles.
  • the shape of the fine particles (cells or bacteria) near the bottom surface of the sample container can be accurately measured, and the spatial distribution information that the defocused image is floating in the sample liquid. Can be measured. It is possible to obtain information on the mobility of fine particles from a single still image without acquiring a plurality of images and shooting a moving image. Moreover, after making a chemical
  • medical agent for example, antibacterial agent
  • the degree of bacterial chemotaxis can be examined by measuring the extent of bacterial distribution in the liquid.

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Abstract

細胞・細菌の観察像において、一度の撮像によって得られる画像から、焦点があっていない像においても、情報として解析し、細胞・細菌の光軸方向の位置関係を検出し、細胞・細菌の運動性を評価する。　サンプル容器内のサンプル液中に存在する微粒子の測定に用いる光学系と、　前記サンプル容器の底面を3次元的に探索するためにサンプル容器及び前記光学系の一部の少なくともいずれか一方を駆動させる駆動機構と、光学系または前記駆動機構を制御する制御部と、第１の時間及び第２の時間におけるサンプル容器内の微粒子の画像を焦点が合った領域と焦点が合っていない領域に分け、微粒子に関する情報を取得する画像処理部と、微粒子に関する情報を、第１の時間及び第２の時間の間の時間的な変化を表す情報として表示する表示部と、を備える。

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関する。
　近年、微生物や細胞・細菌などの薬剤活性を測定することが医薬品分野の研究や臨床の現場で盛んに行われている。液体中の細胞・細菌の状態を測定する方法には、主に光の散乱を解析する光散乱法と、顕微鏡などで撮像する画像イメージング法がある。光散乱法は、比較的高濃度の粒子の大きさや個数を簡便に測定できる。光散乱法は、細胞・細菌が懸濁されているサンプル液に入射する光の散乱強度を測定する方法である。その散乱強度は細胞・細菌の体積や個数に相関があり、薬剤活性を検査する手法として、一般に用いられている。例えば、細菌が含まれている液体に光を照射し、細菌によってその入射光が散乱され、透過した光量の減衰を測定する。これにより、細菌の増殖状態を計測する。また、顕微鏡観察で細胞の体積や個数だけではなく、細胞の形状まで測定する画像イメージング法が近年盛んに用いられている。細胞に対する薬剤活性の検査は、癌化メカニズムや、再生医療実現ツールとして重要視されている肝細胞の性質などを解明するために必要不可欠と考えられている。
　細胞の状態を画像イメージングにより観察する方法として、光学顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察などが知られている。最も一般的で簡便な方法は光学顕微鏡である。しかし、細胞は透明であり、細胞の形状を認識することが困難な場合がある。細胞を光学顕微鏡観察する方法に位相差観察法という屈折率の変化を捉える観察法で透明な細胞を観察する方法がある。蛍光顕微鏡は細胞を蛍光物質で染色することで、通常の光学顕微鏡よりも高感度に細胞を認識できる。蛍光顕微鏡は細胞を蛍光物質で染色する必要があるため、観察対象である細胞のありのままを観察できない場合がある。また、蛍光物質として導入した分子やタンパク質が生体分子の活動に影響を与えるおそれもある。薬剤活性を検査する上では、細胞のありのままの状態を観察する必要がある。
　細菌に対する薬剤活性の検査において、抗菌剤の細菌への効果、つまり抗菌剤により細菌の増殖が抑制されることを検査する装置（感受性検査装置）が存在する。、感受性検査装置では、光散乱法を用いて、細菌の数を計数する。前述しているように、光散乱法のほかに、細菌の数を計数する方法として、画像イメージング法がある。顕微鏡観察によって1つの細菌の増殖過程を観察する。細菌の中には走性を有するもの（例えば、大腸菌）があり、画像イメージング法によって、抗菌剤による走性の変化を捉えることも可能となる。走性つまり運動性を検査するには、一般に動画像を取得する。例えば、脈動する心筋細胞について、薬剤の運動性への効果を検出する装置が提案されている（特許文献１参照）。
　細胞・細菌が運動して焦点面から外れ、対物レンズに対して手前または奥に存在する場合がある。この手前または奥に存在することを判定することでも、細胞・細菌の運動性を評価することが可能である。細胞が焦点面、例えば、サンプル容器の底面に接着しているか、またはその底面から離れているかを判定する装置がある。画像内に細胞があるかを認識し、認識された個々の細胞がサンプル容器底面に接着しているかを判定する（特許文献２参照）。
特表２０１２－１９４１６８号公報 特開２００９－８９６２８号公報
　動画像取得では、焦点面は固定されているため、細胞が焦点面から外れる方向に運動した場合、その細胞の運動を把握することは出来なかった。焦点面から外れ、細胞の像がデフォーカスし、細胞として認識されないものに関しては、無視されていた。したがって、細胞として輪郭が明瞭な領域のみが解析に使用され、細胞として輪郭が不明瞭な領域は背景領域として平滑化され、情報は取り除かれていた。また、複数枚の画像を撮像し、動画像を生成するため、１つのサンプルの運動性を評価するために撮像時間、処理時間について長時間を要した。
　個々の細胞をサンプル容器底面に接着しているかを判定する方法では、細胞が焦点面から外れる方向に運動したことを把握することは可能である。しかし、焦点面から外れ、細胞の像がデフォーカスし、細胞として認識されないものに関しては、無視されていた。したがって、細胞として輪郭が明瞭な領域のみが解析に使用され、細胞として輪郭が不明瞭な領域の情報は使用されていなかった。
　そこで、本発明は、焦点面から外れた細胞・細菌に関して、デフォーカスにより、形状を認識できない場合においても、細胞・細菌が存在することを認識し、定量評価できる技術を提供する。
　上記課題を解決するために、本願の観察装置は、サンプル容器内のサンプル液中に存在する微粒子の測定に用いる光学系と、
　前記サンプル容器の底面を3次元的に探索するために前記サンプル容器及び前記光学系の一部の少なくともいずれか一方を駆動させる駆動機構と、
　前記光学系または前記駆動機構を制御する制御部と、
　第１の時間及び第２の時間における前記サンプル容器内の微粒子の画像を焦点が合った領域と焦点が合っていない領域に分け、前記微粒子に関する情報を取得する画像処理部と、
　前記微粒子に関する情報を、前記第１の時間及び第２の時間の間の時間的な変化を表す情報として表示する表示部と、
を備えている。
　本発明によれば、細胞・細菌の観察像において、一度の撮像によって得られる画像から、焦点があっていない像においても、情報として解析し、細胞・細菌の光軸方向の位置関係を検出し、細胞・細菌の運動性を評価することが可能となる。
観察装置のシステム全体を示した模式図である。 コンピュータの各種処理部を説明する図である。 細菌検体の検査方法を示したフローチャートである。 図３Ａの測定データ出力のステップの内容を示したフローチャートである。 第１実施例に係るサンプル容器の底面に最も近い撮像画像である。 第１実施例に係る図４Ａの外形抽出後の画像である。 第１実施例に係る図４Ａの背景領域の画像である。 第１実施例に係るコンピュータのディスプレイに表示される画面の一例である。 第２実施例に係るサンプル容器の底面に最も近い撮像画像である。 第２実施例に係る図６Ａの外形抽出後の画像である。 第２実施例に係る図６Ａの図６Ｂと異なる処理による外形抽出後の画像である。 第２実施例に係る図６Ａの図６Ｂや図６Ｃと異なる処理による外形抽出後の画像である。 第２実施例に係るコンピュータのディスプレイに表示される画面の一例である。 第２実施例に係るコンピュータのディスプレイに表示される画面の別の例である。
　本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、構成としては、サンプル容器底面に存在する細胞・細菌を測定する対物レンズなどの光学系と、その像をデジタル信号に変換する撮像素子、画像のデジタル信号を受け取り解析するパーソナルコンピュータからなり、画像処理装置の構成としては、サンプル容器底面に存在する細胞・細菌に焦点のあった像の境界線を抽出する外形抽出機能、その境界線で分けられる検出領域と背景領域の分割機能、検出領域の細胞・細菌の情報を検出する検出領域解析部、背景領域のデフォーカスした細菌・細胞を検出する背景領域解析部、検出領域、背景領域の解析した情報をモニタなどに表示する表示部を備えた観察装置を提供する。
　以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
　以下の実施例は、薬剤が含まれた液体中に存在する細胞・細菌の薬剤活性を検査する手法または装置に関する。
各実施例について、以下の項目について説明する。
１．観察装置の測定方法の概略
２．検査方法と結果出力
　以下の説明においては、XYZ直交座標系を設定する。水平面内の所定方向をX方向、水平面内においてX方向と直交する方向をY方向、X方向及びY方向のそれぞれに直交する方向（すなわち鉛直方向）をZ方向とする。
１観察装置の測定方法の概略
　図１に本実施例の細菌観察装置の概略図を示す。細菌観察装置は、主要な構成要素として、照明101と、サンプル容器102と、台座103と、XYステージ104と、対物レンズ105と、対物レンズアクチュエータ106と、撮像素子107と、コンピュータ108を備える。
　照明101はサンプル容器102の底面を均一に照明するように光学設計されているケーラー照明が望ましい。サンプル容器102は少なくとも１つ以上のサンプル液を保持できる格納部を有するものとする。台座103は、サンプル容器102を保持することができ、上面からから光が入射し、底面から光が抜ける構造を有する。XYステージ104は、サンプル容器102を載せた台座103をX方向及びY方向に移動できる。XYステージ104にはサンプル容器102を温調するヒーター（不図示）を備える。例えば、透明ガラスヒータにより、サンプル容器102を囲ってもよい。また、光学系全体を断熱材で囲い、内部をヒーターで温調しても良い。対物レンズアクチュエータ106は、対物レンズ105をZ方向に移動させるアクチュエータであり、対物レンズ105の焦点位置をサンプル容器102の深さ方向に走査することができる。撮像素子107は対物レンズ105の焦点位置にある像を結像させる位置に設置される。撮像素子107と対物レンズ105の間に結像レンズを設置しても良い。撮像素子107は撮像素子上に結像された像をデジタル信号に変換し、コンピュータ108に転送される構造を備える。
　コンピュータ108は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などのプロセッサと、メモリなどの記憶部と、ハードディスクなどの記憶装置を少なくとも備える。また、コンピュータ108は、ユーザからの入力を受け付ける入力装置（マウス、キーボードなど）と、測定結果を表示する表示装置（ディスプレイなど）とを備える。
　測定する細菌と抗菌剤を懸濁したサンプル液が入ったサンプル容器102を準備する。サンプル容器102の底面は薄く、平滑であることが望ましい。また、サンプル容器102はサンプル保持部を多数持つマイクロタイタープレートを用いても良い。サンプル容器102を台座103に固定する。照明101からサンプル容器102の底面に均一な強度の光が照射される。光学系としては、明視野、暗視野、位相差などの結像系光学系が望ましい。照明されたサンプル容器102の底面付近に存在する細菌像を対物レンズ105によって、集光する。対物レンズ105によって集光された細菌像は撮像素子107に結像される。このとき、対物レンズ105の焦点位置がサンプル容器102の底面に合致していない場合、対物レンズアクチュエータ106を動かし、対物レンズ105のZ高さ位置を調節する。対物レンズ105のZ高さ位置の調節には撮像素子107によって撮像された画像のコントラストを監視する過程をとるようなオートフォーカス機能を用いても良い。
　撮像素子107で撮像された画像は、デジタルデータとして、コンピュータ108に送信される。送信された画像は、コンピュータ108の記憶装置に保存される。
　図２は、コンピュータ108の各種処理部を説明する図である。コンピュータ108は、照明101などの光学系及び駆動機構（対物レンズアクチュエータ106とXYステージ104）、ヒーターを制御し、複数の異なる時間に関して、細菌に関する情報を取得する。また、コンピュータ108は、取得した情報から、細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報を求める。この機能を実現するため、コンピュータ108は、データ取得部201と、データ解析部202と、データ表示処理部203と、制御部204とを備える。
　データ取得部201は、撮像素子107に結像された画像を取得するモジュールである。データ取得部201は、例えば、撮像素子107から送信されるデジタルデータを2次元画像再生する。
　また、データ解析部202は、データ取得部201で生成された画像を入力情報とし、測定データの解析結果を出力するモジュールである。例えば、データ解析部202は、複数の異なる時間に関して、画像情報を解析し、細菌の数、細菌の形状、細菌の大きさ、浮遊細菌量、焦点面における細菌が占める割合の少なくとも１つの定量値を算出してもよい。一例として、データ解析部202は、画像情報の所定の輝度値以上の部分の数を計数し、細菌の数を求めてもよい。細菌の形状、細菌の大きさ、及び、焦点面における細菌が占める割合についても、画像情報の所定の輝度値以上の部分のサイズから求めてもよい。
　また、データ解析部202は、浮遊細菌の情報から、細菌の運動性に関する情報を求めてもよい。また、データ解析部202は、浮遊細菌の情報と時間との関係を表す情報から、細菌の運動性の時間的変化に関する情報を求めてもよい。例えば、サンプル容器の底面から離れた位置での細菌の数が減少した場合、走性を有する細菌に薬剤が影響したと判断でき、薬剤の細菌への応答を検出することができる。
　上記のように、データ解析部202は、細菌に関する情報の時間的な変化から、細菌の状態変化を検査できる統計ソフトウェアを備えてもよい。
　データ表示処理部203は、データ解析部202からの解析結果をコンピュータ108のディスプレイに表示するモジュールである。例えば、データ表示処理部203は、複数の焦点面での細菌に関する情報を、時間的な変化が比較できる形式でディスプレイ上に表示する。
　また、データ表示処理部203は、細菌に関する情報の時間的な変化の解析結果をディスプレイ上に表示してもよい。例えば、データ表示処理部203は、細菌の運動性に関する判定結果、及び薬剤の細菌への応答に関する情報をディスプレイ上に表示してもよい。
　制御部204は、細菌観察装置の各構成要素を制御するモジュールである。例えば、制御部204は、細菌観察装置の各構成要素を制御して、測定の開始及び測定の終了を管理することができる。また、制御部204は、測定データを取得する際に、対物レンズアクチュエータ106の駆動及びXYステージ104の駆動を制御することができる。
　なお、上記で説明した処理部は、コンピュータ108上で実行されるプログラムの機能として実現されてもよい。上記の処理部は、各処理に対応するプログラムコードがメモリに格納され、プロセッサが各プログラムコードを実行することによって実現されてもよい。なお、上記の処理部の一部が、専用の回路基板などのハードウェアによって構成されてもよい。
　２検査方法と結果出力
　図３Ａは、細菌検体の検査方法を示したフローチャートである。まず、血液などから分離培養された細菌である検体を入手する（301）。通常細菌量が少ないため、前培養を行う（302）。次に、細菌への応答を検査する薬剤と培養液との混合液（サンプル溶液）を準備する（303）。細菌を薬剤が混ざったサンプル溶液に懸濁する（304）。このとき、細菌への薬剤応答は最短でも数時間を要するため、薬剤が入っていない培養液のみのサンプル溶液であるコントロールも用意しておく。細菌入りのサンプル溶液をサンプル容器に分注する（305）。次に、サンプル容器を本実施例の観察装置にセットする（306）。観察装置での測定を開始する（307）。その後、温度コントロール及び計測を行いながら、測定データを取得する（308）。取得した測定データは、コンピュータ108によって解析処理が行われる。解析処理後に薬剤が細菌にどのような影響を与えたかの検査結果をコンピュータ108上に出力する（309）。
　図３Ｂは、図３Ａのステップ308の内容を示したフローチャートである。データ取得部201は、撮像素子107で測定された測定データを取得する（311）。このとき、制御部204は、対物レンズアクチュエータ106を駆動させ、対物レンズ105の焦点位置をサンプル容器102の底面に合わせる機能を持つオートフォーカスを行っても良い。
　データ解析部202は、データ取得部201で取得された2次元平面データを解析する（312）。一例として、データ解析部202は、2次元平面データを画像情報に変換してもよい。別の例として、データ解析部202は、画像情報を解析し、細菌の数、細菌の形状、細菌の大きさ、浮遊細菌の量及び焦点面での細菌が占める割合の少なくとも１つの定量値を算出してもよい。また、データ解析部202は、算出された定量値から、細菌の運動性を測定してもよい。また、データ解析部202は、細菌に関する情報の時間的な変化から細菌の状態変化を検査してもよい。
　データ解析部202は、解析結果を出力する（313）。なお、この時点で、データ表示処理部203が、データ解析部202からの解析結果をコンピュータ108のディスプレイに表示してもよい。
　次に、測定を終了するかを判定する（314）。終了しない場合は、測定間隔だけ待機し（315）、ステップ311に戻る。したがって、本実施例では、データ解析部202は、サンプル液に薬剤を入れた後の複数の異なる時間について、2次元平面データまたは画像を解析する。データ解析部202は、細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報から、前記薬剤の前記細菌への応答に関する情報を求めることができる。例えば、データ解析部202は、薬剤の入れた後の１時間後（第１の時間）の測定データの解析結果と、５時間後（第２の時間）の測定データの解析結果を出力する。その後に実施される図３Ａのステップ309では、データ表示処理部203が、第１の時間での測定データの解析結果と、第２の時間での測定データの解析結果をコンピュータ108のディスプレイに表示することができる。
　なお、データ取得部201が、サンプル液に薬剤を入れる前及び後についての複数の焦点面での2次元平面データを取得し、データ解析部202が、薬剤を入れる前及び後についての細菌に関する情報の時間的な変化を表す情報を求めてもよい。この場合、データ解析部202が、薬剤を入れる前及び後についての情報から、薬剤の細菌への応答に関する情報を求める。
　図４Ａは、取得した画像の一例である。対物レンズ105の焦点位置がサンプル容器102の底面に合っている状態であり、細菌がサンプル容器102の底面に近い場合には細菌像はデフォーカスすることが無く、細菌がサンプル容器102の底面位置から遠い場合には細菌像はデフォーカスする。図４Ｂは、図４Ａの外形抽出を行い、画像を2値化することによって、細菌の領域と背景領域に分けた処理後画像である。外形抽出は像のコントラストにより行われる。例えば、外形抽出にはSobelフィルターが一般に用いられている。図４Ｃは、図４Ｂでの背景領域として分画された図４Ａの画像である。この背景領域として分画された領域には、サンプル容器102の底面位置から離れた細菌の情報が含まれている。背景領域にデフォーカスした細菌像が含まれている場合には、背景領域の輝度のばらつきは大きくなり、標準偏差(S.D.)が大きくなる。背景領域にデフォーカスした細菌像が含まれていない場合には、信号ノイズのみとなり、背景領域の輝度のばらつきは小さくなり、輝度の標準偏差(S.D.)は小さくなる。背景領域の輝度の標準偏差はサンプル容器102の底面から離れた浮遊細菌の量に相関がある。
　図５は、データ表示処理部203によってコンピュータのディスプレイに表示される画面の例である。画面には細菌が入っている溶液の状態を示す実験条件を表示する実験条件表示部501、画像を取得するための条件である入射光量や画像測定間隔を示す測定条件表示部502、第１の時間（例えば細菌の懸濁から１時間後）の細菌像を表示する第１の領域503と、第２の時間（例えば細菌の懸濁から5時間後）の細菌像を表示する第２の領域504を有する。第１の領域503、第２の領域504のそれぞれの領域には画像中のサンプル容器102底面の細菌の数を示す細菌数表示部505と、浮遊細菌の量を示す背景領域の輝度の標準偏差(S.D.)が表示される浮遊細菌量表示部506を有する。
　本実施例の画面には、サンプル容器102の底面付近に存在する細菌数のほかに培養液中に浮遊する細菌の量に相関がある量が表示される。また、異なる時間での細菌数の情報が、細菌数の時間変化を比較できる形式で並んで表示される。したがって、時間経過による薬剤の細菌への応答を観察することができる。
　なお、図５の例では、２つの異なる時間での細菌に関する情報（細菌数及び浮遊細菌量）を表示したが、３つ以上の異なる時間での細菌に関する情報を比較できる形式で画面に表示してもよい。
　以上の実施例の細菌観察装置は、サンプル容器102内のサンプル液中の対物レンズ105の焦点面に存在する微粒子（細菌、細胞など）を測定する光学系と、サンプル容器102底面に焦点を合わせる駆動機構（対物レンズアクチュエータ105とXYステージ104）とを備える。撮像素子107による測定結果（観察像）をデジタルデータに変換し、コンピュータ108に転送する。コンピュータ108は、デジタルデータを画像情報に変換し、その画像情報をディスプレイに表示する。ここで、コンピュータ108は、異なる複数の時間での測定結果をディスプレイに表示する。また、コンピュータ108は、画像情報を画像処理することにより、画像を細菌の領域と背景の領域の２つの分ける処理を有する。細菌の領域からは、細菌の個数、大きさ、形状などの定量値を算出する。背景の領域からは、浮遊細菌の量を算出する。コンピュータ108は、その定量値から細菌の増殖力や運動性を測定し、その運動性の時間変化から微粒子の状態変化を検査してもよい。
　以上の実施例によれば、微粒子（細胞又は細菌など）のサンプル容器底面付近のでは形状を正確に測定することができ、デフォーカスした像からはサンプル液中に浮遊しているという空間分布情報を測定することができる。複数枚の画像を取得し、動画撮影をすることなく、1枚の静止画像で微粒子の運動性の情報を得ることができる。また、薬剤（例えば、抗菌剤）を作用させた後、この細菌数分布の時間変化から、細菌の抗菌剤への効果を検査することができる。
　また、細菌の空間的な分布から、細菌が走性を有するか、さらに、どの程度走性を有するかを測定することができる。また、液体中への細菌の分布の広がりの程度を測定することによって、細菌の走性の程度を検査することができる。
１観察装置の測定方法の概略
　第１実施例と同様である。
　２検査方法と結果出力
　図３Ａ及び図３Ｂを用いて上述した通り、データ解析部202が、薬剤を入れる前及び後についての情報から、薬剤の細菌への応答に関する情報を求める。
　図６Ａは、取得した画像の一例である。対物レンズ105の焦点位置がサンプル容器102の底面に合っている状態であり、細菌がサンプル容器102の底面に近い場合には細菌像はデフォーカスすることが無く、細菌がサンプル容器102の底面位置から遠い場合には細菌像はデフォーカスする。
　図６Ｂは、図６Ａの外形抽出を行い、画像を2値化することによって、細菌の領域と背景領域に分けた処理後画像である。外形抽出は像のコントラストにより行われる。例えば、外形抽出にはSobelフィルターが一般に用いられている。図６Ｃは、図６Ｂの背景領域として分画された図６Ａの画像を図６Ｂで行った画像処理とは異なる2値化パラメータで外形抽出を行った処理後画像である。2値化パラメータを変更する以外に先鋭化処理を行っても良い。図６Ｄは、図６Ｂの背景領域かつ図６Ｃの背景領域として分画された図６Ａの画像を図６Ｃで行った画像処理とは異なる2値化パラメータで外形抽出を行った処理後画像である。2値化パラメータを変更する以外に先鋭化処理を行っても良い。本実施例では3段階に2値化パラメータを変更し、デフォーカス量毎に細菌の外形抽出を行った。デフォーカス量はサンプル容器102の底面からの距離に相関があるため、サンプル容器102の底面からの距離での細菌量を算出することが可能となる。より高分解能に底面からの距離で細菌量を算出する場合には、本実施例で行った3段階の2値化パラメータの変更をより多段階の2値化パラメータ変更を行うことで可能となる。また、デフォーカスした像は正確な形状を反映していないので、デフォーカス量毎に細菌の外形を補正することを行うことが望ましい。
　図７は、データ表示処理部203によってコンピュータのディスプレイに表示される画面の例である。画面には細菌が入っている溶液の状態を示す実験条件を表示する実験条件表示部701、画像を取得するための条件である入射光量や画像測定間隔を示す測定条件表示部702、第１の時間（細菌の懸濁から１時間後）の細菌像を表示する第１の領域703と、第２の時間（細菌の懸濁から5時間後）の細菌像を表示する第２の領域704を有する。第１の領域703、第２の領域704のそれぞれの領域には画像中のサンプル容器102底面の細菌の数を示す細菌数表示部705と、浮遊細菌の数を表示する浮遊細菌量表示部706、浮遊細菌のサンプル容器102底面からの距離での細菌数分布を表示する細菌数分布図707を有する。
　本実施例の画面には、サンプル容器102の底面付近に存在する細菌数のほかに培養液中に浮遊する細菌の量に相関がある量が表示される。また、異なる時間での細菌数の情報が、細菌数の時間変化を比較できる形式で並んで表示される。したがって、時間経過による薬剤の細菌への応答を観察することができる。
　なお、図７の例では、２つの異なる時間での細菌に関する情報（細菌数及び浮遊細菌量）を表示したが、３つ以上の異なる時間での細菌に関する情報を比較できる形式で画面に表示してもよい。
　図８は、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報である。詳細には、図８は、サンプル容器の底面からの高さに対する細菌数の分布の時間的な変化をプロットしたグラフである。図８のグラフでは、縦軸を細菌数とし、横軸を、底面からの高さ（Z方向位置）とし、奥行きの軸を、培養時間（例えば、サンプル液を準備してからの経過時間など）とする。一例として、データ解析部202は、図８のような情報を出力してもよい。サンプル容器の底面を0μmとすると、0μmの位置での細菌数は、時間が経つにつれて増加している。一方、サンプル容器の底面から200μmの場所の細菌数は、時間が経つにつれて減少している。走性を持つ場合、細菌は底面からの各高さ、ここでは200μmの高さで増殖または、一定という傾向がある。サンプル容器底面から200μmの場所で細菌数が減少したことは、元々運動していたサンプル液中の細菌が、薬剤（例えば、抗菌剤）の影響で走性を失って、細菌自体の活動が低下したことを示している。このように、サンプル液中の細菌数の高さ方向の分布の培養時間による経時変化を解析することによって、抗菌剤の効果を検査することができる。したがって、データ解析部202は、細菌の空間的分布の情報と時間との関係を表す情報から、薬剤の細菌への応答の判定結果を出力してもよい。
　以上の実施例の細菌観察装置は、サンプル容器102内のサンプル液中の対物レンズ105の焦点面に存在する微粒子（細菌、細胞など）を測定する光学系と、サンプル容器102底面に焦点を合わせる駆動機構（対物レンズアクチュエータ105とXYステージ104）とを備える。撮像素子107による測定結果（観察像）をデジタルデータに変換し、コンピュータ108に転送する。コンピュータ108は、デジタルデータを画像情報に変換し、その画像情報をディスプレイに表示する。ここで、コンピュータ108は、異なる複数の時間での測定結果をディスプレイに表示する。また、コンピュータ108は、画像情報を画像処理することにより、画像を細菌の領域と背景の領域の２つの分ける処理を有する。細菌の領域からは、細菌の個数、大きさ、形状などの定量値を算出する。背景の領域からは、浮遊細菌の量を算出する。コンピュータ108は、その定量値から細菌の増殖力や運動性を測定し、その運動性の時間変化から微粒子の状態変化を検査してもよい。または、微粒子の自然沈降から、微粒子の比重や表面状態の変化を評価してもよい。
　以上の実施例によれば、微粒子（細胞又は細菌など）のサンプル容器底面付近のでは形状を正確に測定することができ、デフォーカスした像からはサンプル液中に浮遊しているという空間分布情報を測定することができる。複数枚の画像を取得し、動画撮影をすることなく、1枚の静止画像で微粒子の運動性の情報を得ることができる。また、薬剤（例えば、抗菌剤）を作用させた後、この細菌数分布の時間変化から、細菌の抗菌剤への効果を検査することができる。
　また、細菌の空間的な分布から、細菌が走性を有するか、さらに、どの程度走性を有するかを測定することができる。また、液体中への細菌の分布の広がりの程度を測定することによって、細菌の走性の程度を検査することができる。
101　　…照明
102　　…サンプル容器
103　　…台座
104　　…XYステージ
105　　…対物レンズ
106　　…対物レンズアクチュエータ
107　　…撮像素子
108　　…コンピュータ
201　　…データ取得部
202　　…データ解析部
203　　…データ表示処理部
204　　…制御部
501　　…実験条件表示部
502　　…測定条件表示部
503　　…画像表示部１
504　　…画像表示部２
505　　…細菌数表示部
506　　…風有細菌量表示部
701　　…実験条件表示部
702　　…測定条件表示部
703　　…画像表示部１
704　　…画像表示部２
705　　…細菌数表示部
706　　…風有細菌量表示部
707　　…細菌数分布表示部

Claims (11)

  1. 　サンプル容器内のサンプル液中に存在する微粒子の測定に用いる光学系と、
    　前記サンプル容器の底面を3次元的に探索するために前記サンプル容器及び前記光学系の一部の少なくともいずれか一方を駆動させる駆動機構と、
    　前記光学系または前記駆動機構を制御する制御部と、
    　第１の時間及び第２の時間における前記サンプル容器内の微粒子の画像を焦点が合った領域と焦点が合っていない領域に分け、前記微粒子に関する情報を取得する画像処理部と、
    　前記微粒子に関する情報を、前記第１の時間及び第２の時間の間の時間的な変化を表す情報として表示する表示部と、
    を備えることを特徴とする観察装置。
  2. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記画像処理部は、コントラストにより外形抽出を行うことで焦点が合った領域と焦点が合っていない領域に分けることを特徴とする観察装置。
  3. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記時間的な変化を表す情報は、前記サンプル液中に浮遊する微粒子量の情報と、時間との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  4. 　請求項３に記載の観察装置において、
    　前記サンプル液中に浮遊する微粒子量の情報は、焦点があっていない領域の輝度のばらつきを指標とし、算出することを特徴とする観察装置。
  5. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記焦点が合っていない領域は、さらにデフォーカス量によって、複数の領域に分画し、
    　分画された領域毎に画像処理を行い、分画された領域毎に前記微粒子の量を算出し、前記微粒子のサンプル液中の空間分布を求めることを特徴とする観察装置。
  6. 　請求項５に記載の観察装置において、
    　デフォーカス量によって分画された領域毎にデフォーカス補正を行い、前期微粒子のサンプル液中の空間分布を求めることを特徴とする観察装置。
  7. 　請求項５に記載の観察装置において、
    　前記表示装置は、前記第１の時間での前記微粒子の空間的分布の情報と、前記第２の時間での前記微粒子の空間的分布の情報とを表示することを特徴とする観察装置。
  8. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記微粒子に関する情報は、前記微粒子の数、前記微粒子の大きさ、前記微粒子の形状、及び、前記焦点面における前記微粒子が占める割合の少なくとも１つであることを特徴とする観察装置。
  9. 　請求項１に記載の観察装置において、
    　前記微粒子は細菌であり、サンプル液を温調する機構を備え、前記時間的な変化を表す情報は、前記細菌のサンプル液中に浮遊する量の情報と、時間との関係を表す情報であることを特徴とする観察装置。
  10. 　請求項９に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記時間的な変化を表す情報から、前記細菌の運動性に関する情報を求めることを特徴とする観察装置。
  11. 　請求項９に記載の観察装置において、
    　前記制御装置は、前記サンプル液に薬剤を入れる前後についての前記時間的な変化を表す情報から、前記薬剤の前記細菌への応答に関する情報を求めることを特徴とする観察装置。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019198293A (ja) * 2018-05-18 2019-11-21 株式会社ニコン 細菌の薬剤感受性の判定方法及び細菌の薬剤感受性の判定装置

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022012314A (ja) * 2020-07-01 2022-01-17 ネッパジーン株式会社 細胞回収装置
US11906435B2 (en) 2020-09-11 2024-02-20 Atonarp Inc. System including auto-alignment

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007527540A (ja) * 2004-03-05 2007-09-27 ザ・リサーチ・ファンデーション・オブ・ステート・ユニバーシティ・オブ・ニューヨーク 細胞の体積変化を測定するための方法及び装置
WO2009107321A1 (ja) * 2008-02-28 2009-09-03 株式会社ニコン 顕微鏡装置および細胞培養装置
JP2010011814A (ja) * 2008-07-04 2010-01-21 Japan Science & Technology Agency 培養細胞観察用チャンバー及びその使用
JP2011525009A (ja) * 2008-05-30 2011-09-08 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション １以上のデフォーカス画像又は低コントラスト対雑音比画像を検出し除去するシステム及び方法
JP2014209085A (ja) * 2013-03-22 2014-11-06 オリンパス株式会社 位相分布計測方法、及び、位相分布計測装置

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932872A (en) * 1994-07-01 1999-08-03 Jeffrey H. Price Autofocus system for scanning microscopy having a volume image formation
US7518652B2 (en) * 2000-05-03 2009-04-14 Aperio Technologies, Inc. Method and apparatus for pre-focus in a linear array based slide scanner
JP2005514617A (ja) * 2001-07-02 2005-05-19 ザ、ボード、オブ、トラスティーズ、オブ、ザ、リーランド、スタンフォード、ジュニア、ユニバーシティ 細胞の表現型決定および操作のためのマイクロアレイ
DK2184346T3 (en) * 2001-09-06 2017-06-26 Rapid Micro Biosystems Inc Rapid detection of replicating cells
US20040241832A1 (en) * 2003-06-02 2004-12-02 Olympus Corporation Cell culture detection apparatus, cell culture observation apparatus, and cell culture observation method
US8848199B2 (en) * 2007-07-10 2014-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Tomographic phase microscopy
JP2009089628A (ja) 2007-10-05 2009-04-30 Nikon Corp 識別装置および識別方法
JP6078943B2 (ja) 2011-02-28 2017-02-15 ソニー株式会社 画像処理装置および方法、並びに、プログラム
US9904842B2 (en) 2012-12-19 2018-02-27 Koninklijke Philips N.V. System and method for classification of particles in a fluid sample
EP2990849B1 (en) * 2013-04-26 2020-09-02 Hamamatsu Photonics K.K. Image acquisition device and method and system for creating focus map for specimen
CN105579828B (zh) * 2013-05-28 2020-02-14 克莫麦特公司 图像式细胞仪
WO2015157246A2 (en) * 2014-04-07 2015-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Use of microparticle additives to simultaneously enable artifact-free image registration, auto-focusing, and chromatic aberration correction in microscopy
FR3028616A1 (fr) * 2014-11-13 2016-05-20 Commissariat Energie Atomique Procede d'analyse comprenant la determination d'une position d'une particule biologique.
FR3031180A1 (fr) * 2014-12-30 2016-07-01 Commissariat Energie Atomique Methode et dispositf de controle de la position d'une particule transparente par pile d'images holographiques
JP6559555B2 (ja) * 2015-12-02 2019-08-14 株式会社日立エルジーデータストレージ 光計測方法および装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007527540A (ja) * 2004-03-05 2007-09-27 ザ・リサーチ・ファンデーション・オブ・ステート・ユニバーシティ・オブ・ニューヨーク 細胞の体積変化を測定するための方法及び装置
WO2009107321A1 (ja) * 2008-02-28 2009-09-03 株式会社ニコン 顕微鏡装置および細胞培養装置
JP2011525009A (ja) * 2008-05-30 2011-09-08 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション １以上のデフォーカス画像又は低コントラスト対雑音比画像を検出し除去するシステム及び方法
JP2010011814A (ja) * 2008-07-04 2010-01-21 Japan Science & Technology Agency 培養細胞観察用チャンバー及びその使用
JP2014209085A (ja) * 2013-03-22 2014-11-06 オリンパス株式会社 位相分布計測方法、及び、位相分布計測装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019198293A (ja) * 2018-05-18 2019-11-21 株式会社ニコン 細菌の薬剤感受性の判定方法及び細菌の薬剤感受性の判定装置
JP7230342B2 (ja) 2018-05-18 2023-03-01 株式会社ニコン 細菌の薬剤感受性の判定方法及び細菌の薬剤感受性の判定装置

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