WO2017114752A1 - Verfahren zur herstellung von sekundärmetaboliten - Google Patents

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WO2017114752A1
WO2017114752A1 PCT/EP2016/082400 EP2016082400W WO2017114752A1 WO 2017114752 A1 WO2017114752 A1 WO 2017114752A1 EP 2016082400 W EP2016082400 W EP 2016082400W WO 2017114752 A1 WO2017114752 A1 WO 2017114752A1
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seq
fungal cell
polypeptide
amino acid
fusarium
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PCT/EP2016/082400
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Astrid Mach-Aigner
Robert Mach
Christian DERNTL
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Technische Universität Wien
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to methods for producing at least one secondary metabolite.
  • Mushrooms produce a large amount of chemical compounds. These compounds are very different in terms of structure and effects, but share a basic egg ⁇ genschaft. They are all synthesized in the secondary metabolism of fungi. The secondary metabolism complements the primary metabolism, which includes all biological processes necessary for the growth of the fungi. Mushrooms secondary metabolism employ for various purposes, such recordable communication, competition, toxicity, Pathoge ⁇ nity and Mykoparasitismus. Some products of the secondary meta ⁇ bolismus be used to combat infectious diseases (as antibiotics) and cancer (as immunosuppressants). In addition, they provide a rich source of new therapeutics and provide opportunities for pharmaceutical research.
  • the present invention therefore relates to a process for the preparation of at least one secondary metabolite in a gene ⁇ schematically modified fungal cell, which comprises culturing a ge ⁇ genetically modified fungal cell, which is able to produce at least one secondary metabolite, said unmodified fungal cell a gene coding for a polypeptide tid comprises the at least two motifs selected from the Grup ⁇ pe consisting of the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO. 3), KX 3 SKGX 4 X 5 LX 6 KATEYI (SEQ ID NO. 4), RX7LQAF (SEQ ID NO. 5 () LFDPRGFC SEQ ID NO.
  • Va ⁇ variants thereof include having an identity of at least 60%, for the regulation of secondary metabolism and thus responsible for the production of secondary metabolites and mitver ⁇ are responsible. Is the activity or the expression level of said polypeptide is reduced within the fungal cell, increases the amount of fungal cell formed by the secondary metabolites ⁇ Israel.
  • a genetically modified fungal cell which has a reduced expression rate of the aforementioned polypeptide compared to the unmodified fungal cell.
  • the Po ⁇ lypeptid also have one or more mutations, whereby its biological function in the fungus cell changes in such a way that the production of at least one secondary metabolite in the fungal cell is increased.
  • Increasing the amount produced of secondary metabolites is preferably at least 10%, in ⁇ preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably Minim ⁇ least 50%, even more preferably at least 60%, even more before ⁇ Trains t least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 100%, more preferably at least 150%, even more preferably at least 200%, compared to unmodified fungal cells.
  • the unmodified fungal cell comprises at least two, preferably before ⁇ at least three, in particular four, motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences
  • AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID NO. 4), RX7LQAF (SEQ ID NO. 5), LFDPRGFC (SEQ ID NO. 6) and Va ⁇ variants thereof with an identity of at least 60%, ⁇ V or I, X 2 D or V, X 3 V or I, X 4 T or A, X 5 V or I, X 6 ei ⁇ ne arbitrary amino acid and X 7 is R or K.
  • X 8 is F or Y, Xg D or E, ⁇ F or Y and Xu R or K
  • X 9 IDXi 0 SXii SEQ ID NO: 7
  • AHNDX1ERKYRTNLKX2KI SEQ ID NO: 3
  • KX3SKGX4X5LX6KATEYI SEQ ID NO: 4
  • RX7LQAF SEQ ID NO: 5
  • LFDPRGFC SEQ ID no. 6
  • the present ⁇ invention comprising at least one polypeptide, at least one, preferably at least two, even more preferably at least three, more motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences GSX 8 X 9 IDXi 0 sxii (SEQ ID NO. 7 ) PGLGX 12 GX 13 Y (SEQ ID NO. 8), REGLYSTPLSWEX 14 PQPGX 15 RMD (SEQ ID NO. 9)
  • the to be regulated in fiction, modern method ⁇ polypeptide may comprise the addition to prior designs ⁇ said other motives.
  • the motifs are separated in the polypeptide by peptides which are preferably between 15 and 300, more preferably 16-280, even more preferably comprise from 18 to 260, Amino Text ⁇ acid residues. Between the motif with the amino acid sequence GSXsXglDXioSXn (SEQ ID NO. 7) and the motif with the Aminoklarese acid sequence AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO.
  • 3) may be a peptide having 200 to 300, preferably 220 to 280, more preferably 230 to 260, even more preferred are acid residues 238 to 252 Amino Text ⁇ .
  • KX3SKGX4X5LX6KATEYI SEQ ID NO.
  • the motif with the amino acid sequence RRLQAF may be a peptide having 15 to 20, preferably 17 to 19, even more be ⁇ vorzugt with 18, are amino acid residues.
  • Between the motif with the amino acid sequence RRLQAF and the design with the Amino Text ⁇ resequenz LFDPRGFC (SEQ ID NO. 6) may be a peptide having from 15 to 25, preferably preferred are 17 to 23, even more with 19 to 21 amino acid residues.
  • polypeptide of the cell used according to the invention may also comprise motifs or variants of motifs which comprise at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% identical to the amino acid sequences AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID NO: 3),
  • ⁇ Liche number can be made of secondary metabolites.
  • ⁇ is with the inventive method preferably at least one, preferably at least two, even more preferably Minim ⁇ least three, even more preferably at least four, even more before Trains t ⁇ least five, even more preferably, Se kundärmetabolite made at least ten.
  • Genetically modified fungal cell as used herein, be ⁇ takes place on fungal cells have been genetically or genetically modified so that the gene thereof coding for the invention shown SSE and claimed polypeptide having the at least two motifs as compared to an unmodified fungal cell tribal having a different nucleic acid sequence.
  • a genetically modified fungal cell is mutated to obtain in the genome out ⁇ from an unmodified fungal cell the gene.
  • an "unmodified fungal cell” or a “non-modify ⁇ te fungal cell”, as used herein, is the starting point for the production of a modified fungal cell of the invention.
  • the unmodified fungal cell comprises at least one gene kodie ⁇ rend of the invention and claimed polypeptide, and has a specific production rate of secondary metabolites.
  • An unmodified fungal cell can be a fungal cell that occurs naturally in nature.
  • an unmodified fungal cell can also be a fungal cell which has already been genetically or genetically engineered at any point in the genome or comprises extrachromosomal nucleic acid molecules which naturally do not occur in the fungal cell.
  • the mutations in the genome of the fungal cell can kodie ⁇ rend affect polypeptide of the invention the gene. This fungal cell is used as the starting cell for further modifications as described herein and thus also constitutes an "unmodified fungal cell”.
  • polypeptide comprising at least two motifs selected from the group consisting of the amino acid sequences
  • Trichoderma reesei the amino acid sequence SEQ ID No. 1 has ⁇ from Trichoderma reesei as Xppl (xylanase promoter-binding protein 1, xylanase promoter-binding protein 1) be ⁇ known (see Derntl C. et al., Biotechnol Biofuels 8 (2015 ): 112).
  • Xppl is responsible for the regulation of Expres ⁇ sion of xylanases in fungal cells, not per ⁇ but liten for the regulation of biosynthetic pathways of Sekundärmetabo-. Since Xppl has been described as a very specific regulator of xylanase expression - cellulases are not regulated by Xppl - it is surprising that down-regulation of Xppl leads to increased production of secondary metabolites. Therefore, the polypeptide having the at least two motifs may also be referred to as "Xppl".
  • Fungal cells may on the one hand are used, the expression of the herein described Po ⁇ lypeptids reduced (for example by modification or replacement of the respective promoter by deletion of the gene encoding the polypeptide, or parts thereof).
  • the Polypep ⁇ tid comprising the motifs described above, is a transcription factor. That is, the polypeptide has the Transkrip ⁇ tion controls notebook genes of the secondary and possibly the Primärme ⁇ tabolismus.
  • the at least one mutation of the polypeptide in the genetically modified fungal cell ⁇ table is preferably a deletion, substitution or insertion of at least one amino acid residue.
  • the Polypep ⁇ tid comprises at least one mutation in at least one motif out ⁇ selected from the group consisting of amino acid sequences
  • AHNDX1ERKYRTNLKX2KI SEQ ID NO. 3
  • KX3SKGX4X5LX6KATEYI SEQ ID NO. 4
  • RX7LQAF SEQ ID NO. 5
  • LFDPRGFC SEQ ID NO. 6
  • the Polypep ⁇ tid comprises at least one mutation in at least one motif out ⁇ selected from the group consisting of amino acid sequences GSX 8 X 9 IDXioSXn (SEQ ID NO: 7), PGLGXi 2 GXi 3 Y (SEQ ID NO: 8), REGLYSTPLSWEX 14 PQPGX 15 RMD (SEQ ID NO: 9), GRAPQLSQQQXi 6 QQQQQ (SEQ ID NO: 10 ) PPPEVPPXi 7 EGLYSTPLXi 8 WE (SEQ ID NO: 11),
  • the reduction of the expression of the polypeptide in the genetically modified fungal cell ⁇ table is preferably achieved by Modifika ⁇ tion of the gene or parts thereof.
  • the promoter of the gene or the Polypep ⁇ tid coding region of the gene is mutated.
  • the mutation at Promo ⁇ ter may include a deletion, insertion or substitution of at least one nucleotide.
  • the naturally occurring in the gene pro ⁇ moter can also be replaced by another promoter.
  • This promoter can be from the same or from a fungal cell of the organism ⁇ , preferably also a fungal cell, stam ⁇ men.
  • the amount of polypeptide at least 10%, preferably at least 20%, even more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably Minim ⁇ least 50%, even more preferably at least 60% , even more before ⁇
  • the amount of transcribed RNA can be ⁇ consistent with known methods for determining RNA coding for the polypeptide.
  • the expression of the polypeptide can be reduced or prevented, for example, if preferably at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, even more preferably at least 40%, even more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%. , even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably Minim ⁇ least 95%, especially 100% of the coding region for the substituting Po ⁇ lypeptid deleted or.
  • the promoter region or parts thereof may be modified by, for example, deletion or substitution.
  • modifications in the promoter region of the Transkripti ⁇ onsrate can be reduced or the transcription can be suppressed completely.
  • Trains t least 60%, even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, in particular 100%, of the promoter are deleted or substituted.
  • the gene encoding the polypeptide Xppl in Trichoderma reesei comprises the following nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2):
  • the ahead ⁇ fungal cell is selected from the group consisting of Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens ⁇ derma, atroviride Trichoderma, Tolypocladium ophio- glossoides, Ophiocordyceps unilateralis, Hirsuteila minnesoten- sis, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Neonectria ditissima, Nectria haematococca, Villosiclava virens, Colletotrichum sublineola, fioriniae Colletotrichum, Colletotrichum graminicola, Claviceps purpurea, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Fusarium avenaceum, Col ⁇ letotrichum gloeospor
  • the design TKAKPGEKMAQLES STSQQPLD I (SEQ ID NO. 13) is preferably defined in anisopliae before ⁇ polypeptides herein kind of fungus Metarhizium ⁇ cells album, Metarhizium robertsii, Metarhizium, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, guizhouense Metarhizium and Metarhizium acridum present.
  • Fig. 1 shows the course of yellowing (absorption at 370 nm) in culture supernatants of the wild-type strain (black squares, solid lines), the Xppl deletion strain (black Rau ⁇ th, dashed lines) and the Xppl overexpression strain (white squares, dotted lines ) on carboxymethylcellulose (CMC) (A), lactose (B) and D-glucose (C).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • B lactose
  • C D-glucose
  • Fig. 2 shows the quality of the samples analyzed by RNASeq.
  • A The wild-type strain ( ⁇ tmus53) and the Xppl deletion strain ( ⁇ ) were cultured in triplicates on CMC and the mycelium harvested after 48 hours and weighed.
  • B The individual samples were clustered by the RNA-Seq analysis according to the precisely measured ⁇ NEN amounts of the individual transcripts.
  • Fig. 6 shows all of the genes responsible for polyketide synthases (PKS) encoding, including the detailed results from the RNASeq- analysis (average number of the transcripts per sample, the difference between wild-type and deletion strain Xppl as Loga ⁇ algorithm to the base 2, p-value after Benjamini & Hochberg). Fat ge ⁇ printed PKS genes coding counted in the evaluation of RNASeq- analysis expressed as different.
  • PKS polyketide synthases
  • Fig. 7 shows the expression rates of the PKS-encoding genes 73621 (A), 73618 (B), 65116 (C), 65172 (D), 60118 (E), and 81964 (F) as they grow on CMC of the Xppl deletion strain (Rau ⁇ th) and the wild-type strain (squares).
  • the two strains were cultured in triplicates and the relative transcript levels were determined by means of qPCR, the reference value used being in each case the value of the wild-type strain after 36 h.
  • the error bars indicate the standard deviation.
  • Fig. 8 shows the basic parameters of the culture in modified Medi ⁇ order (no citrate) with D-glucose.
  • the wild-type strain black quad ⁇ rate
  • the Xppl deletion strain black diamonds
  • the Xppl- overexpression strain white squares
  • the course of the biomass A
  • the yellowing of the supernatant B
  • the expression rates of the PKS-encoding genes 73621 C
  • 65172 D
  • the values are from three biological replicates, error bars indicate the Stan ⁇ deviation.
  • the relative transcript levels were determined by means of qPCR, the reference value used being in each case the value of the wild-type strain after 48 h.
  • Fig. 10 shows a pedigree of the orthologist of Xppl.
  • the T. reesei strains QM6aEtmus53 (Steiger M et al., Appl Environ Microbiol. 77 (2011): 114), the Xppl deletion strain
  • the qPCRs were performed on a Mastercycler ep realplex 2.2 Sys ⁇ tem (Eppendorf, Germany) in triplicate.
  • the 25 ⁇ 1 PCR approaches included 12.5 i ⁇ 2 iQ SYBR Green Mix (Bio-Rad Laboratories, USA), 100 nM forward and reverse primers and 2.5 ⁇ , 1: 100 diluted cDNA.
  • the PCR and the calculations of the rela ⁇ tive transcript rates based on the reference genes actl and sarl were as in Steiger MG et al. (J Biotechnol 145 (2010): 30-37).
  • the following primers were used:
  • Example 2 Xppl influences the expression of genes of primary and secondary metabolism
  • Protein ID 65172 appears to be expressed earlier in the Xppl deletion strain ( Figure 7D).
  • the metho ⁇ de provides no clear Re ⁇ sultate (Fig. 7E and 7F) for the proteins ID 60118 and 81,964th
  • Example 5 Absence of Xppl Promotes the Secretion of Low Molecular Substances
  • the Xppl- deletion strain, the Xppl overexpression strain and the wild-type ⁇ strain were each cultured in parallel on U-12C and U-13C-labeled D-glucose. All low-molecular substances from the over ⁇ supernatants were then, as in Bueschl C et al. (metabolomics

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten in einer genetisch modifizierten Pilzzelle, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Kultivieren einer genetisch modifizierten Pilzzelle umfasst, die in der Lage ist, den mindestens einen Sekundärmetaboliten zu produzieren, wobei die unmodifizierte Pilzzelle mindestens ein Gen kodierend für mindestens ein Polypeptid umfasst, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD-PRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, wobei X1 V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, X6 eine beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist, und die Expression dieses Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich mit der unmodifizierten Pilzzelle reduziert ist und/oder das Polypeptid in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle mindestens eine Mutation umfasst, wodurch die Bildung des mindestens einen Sekundärmetaboliten in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle erhöht ist.

Description

Verfahren zur Herstellung von Sekundärmetaboliten
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten.
Pilze stellen eine große Menge an chemischen Verbindungen her. Diese Verbindungen sind höchst unterschiedlich in puncto Struktur und Wirkungen, teilen sich aber eine grundlegende Ei¬ genschaft. Sie werden alle im sekundären Stoffwechsel der Pilze synthetisiert. Der sekundäre Stoffwechsel ergänzt den primären Stoffwechsel, welcher alle biologischen Prozesse umfasst, die für das Wachstum der Pilze notwendig sind. Pilze bedienen sich des sekundären Metabolismus zu unterschiedlichen Zwecken, wie zum Bespiel Kommunikation, Konkurrenzkampf, Toxizität, Pathoge¬ nität und Mykoparasitismus . Einige Produkte des sekundären Meta¬ bolismus werden zur Bekämpfung von infektiösen Krankheiten (als Antibiotika) und Krebs (als Immunsupressiva) eingesetzt. Zudem stellen sie eine ergiebige Quelle für neue Therapeutika dar und bieten Ansatzmöglichkeiten für die pharmazeutische Forschung. Zahlreiche Verbindungen wurden in den letzten Jahrzehnten iden¬ tifiziert und werden in der biotechnologischen und pharmazeuti¬ schen Industrie genutzt. Zahlreiche weitere Verbindungen können potentiell entdeckt werden. Ein Hindernis dabei ist die Tatsa¬ che, dass der Großteil der Gene des sekundären Metabolismus un¬ ter Laborbedingungen nicht aktiv ist. Eine Strategie, dem zu be¬ gegnen, ist der Einsatz von pleiotropischen Regulatoren des se¬ kundären Metabolismus. Ein gut untersuchtes Beispiel dafür ist der Regulator LaeA (siehe zum Bespiel WO 2011/161063). Er findet sich in einigen Pilzen wieder. Wird LaeA dort deletiert, kommt es zu einer Herabregulierung des sekundären Stoffwechsels (siehe WO 2011/161063) .
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren bereitzustellen, um die Produktion von Sekundärmetabo¬ liten in Pilzen zu regulieren, insbesondere zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboliten in einer gene¬ tisch modifizierten Pilzzelle, welches das Kultivieren einer ge¬ netisch modifizierten Pilzzelle umfasst, die in der Lage ist, den mindestens einen Sekundärmetaboliten zu produzieren, wobei die unmodifizierte Pilzzelle ein Gen kodierend für ein Polypep- tid umfasst, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Grup¬ pe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Iden¬ tität von mindestens 60% umfasst, wobei Χχ V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, XQ eine beliebige Aminosäu¬ re und X7 R oder K ist, und die Expression dieses Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich mit der unmo- difizierten Pilzzelle reduziert ist und/oder das Polypeptid in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifi- zierten Pilzzelle mindestens eine Mutation umfasst, wodurch die Bildung des mindestens einen Sekundärmetaboliten in der gene¬ tisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle erhöht ist.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass in Pilzzellen Polypeptide, welche mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Va¬ rianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfassen, für die Regulierung des Sekundärmetabolismus und somit für die Herstellung von Sekundärmetaboliten verantwortlich bzw. mitver¬ antwortlich sind. Wird die Aktivität bzw. die Expressionsrate dieses Polypeptids innerhalb der Pilzzelle reduziert, erhöht sich die Menge an durch die Pilzzelle gebildeten Sekundärmetabo¬ liten. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine genetisch modifizierte Pilzzelle eingesetzt, die im Vergleich zur unmodi- fizierten Pilzzelle eine reduzierte Expressionsrate des zuvor genannten Polypeptids aufweist. Alternativ dazu kann das Po¬ lypeptid auch eine oder mehrere Mutationen aufweisen, wodurch sich dessen biologische Funktion in der Pilzzelle derart ändert, dass die Produktion mindestens eines Sekundärmetaboliten in der Pilzzelle erhöht wird. Vorzugsweise beträgt die Erhöhung der hergestellten Menge an Sekundärmetaboliten mindestens 10%, vor¬ zugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevor¬ zugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 100%, noch mehr bevorzugt mindestens 150%, noch mehr bevorzugt mindestens 200%, verglichen mit unmodifizierten Pilzzellen.
Die unmodifizierte Pilzzelle umfasst mindestens zwei, vor¬ zugsweise mindestens drei, insbesondere vier, Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Va¬ rianten davon mit einer Identität von mindestens 60%, wobei Χχ V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder I, X6 ei¬ ne beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist. Umfasst das erfin¬ dungsgemäße Polypeptid alle vier Motive, sind diese im Polypep¬ tid vorzugsweise in der Reihenfolge AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) angeordnet. Auch bei Vorhanden¬ sein von weniger als vier dieser Motive können diese in dieser Reihenfolge im Polypeptid vorkommen. Umfasst das Peptid zusätz¬ lich das Motiv GSX8X9IDXioSXn (SEQ ID Nr. 7), wobei X8 F oder Y, Xg D oder E, Χχο F oder Y und Xu R oder K ist, kann das Polypep¬ tid die Motive in der Reihenfolge GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) um¬ fassen .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er¬ findung umfasst das mindestens eine Polypeptid mindestens ein, vorzugsweise mindestens zwei, noch mehr bevorzugt mindestens drei, weitere Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9),
GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEK- MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%, wobei X8 F oder Y, X9 D oder E, X10 F oder Y, Xn R oder K, X12 S oder T, X 3 V, I oder L, Χχ4 R oder K, X 5 I oder L, Xig eine be¬ liebige Aminosäure, Χχ7 R oder K, Χ 8 S oder T, X 9 A oder P, X2o L oder M und X2i eine beliebige Aminosäure ist. Das im erfindungs¬ gemäßen Verfahren zu regulierende Polypeptid kann neben den zu¬ vor genannten Motiven weitere Motive umfassen. Die Motive sind im Polypeptid durch Peptide getrennt, welche vorzugsweise zwischen 15 und 300, noch mehr bevorzugt zwischen 16 und 280, noch mehr bevorzugt zwischen 18 und 260, Aminosäu¬ rereste umfassen. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz GSXsXglDXioSXn (SEQ ID Nr. 7) und dem Motiv mit der Aminosäurese¬ quenz AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3) kann sich ein Peptid mit 200 bis 300, vorzugsweise mit 220 bis 280, noch mehr bevorzugt mit 230 bis 260, noch mehr bevorzugt mit 238 bis 252, Aminosäu¬ reresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3) und dem Motiv mit der Amino¬ säuresequenz KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4) kann sich ein Peptid mit 20 bis 40, vorzugsweise mit 22 bis 35, noch mehr be¬ vorzugt mit 25 bis 31, Aminosäureresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4) und dem Motiv mit der Aminosäuresequenz RRLQAF kann sich ein Peptid mit 15 bis 20, vorzugsweise mit 17 bis 19, noch mehr be¬ vorzugt mit 18, Aminosäureresten befinden. Zwischen dem Motiv mit der Aminosäuresequenz RRLQAF und dem Motiv mit der Aminosäu¬ resequenz LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) kann sich ein Peptid mit 15 bis 25, vorzugsweise mit 17 bis 23, noch mehr bevorzugt mit 19 bis 21, Aminosäureresten befinden.
Umfasst eine Pilzzelle ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit den vier bzw. fünf Motiven, können diese die folgenden allgemei¬ nen Sequenzen umfassen:
AHNDX1ERKYRTNLKX2KIX22KX3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX7LQAFX24LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 15) und
GSX8X9lDXioSXiiX25AHNDXiERKYRTNLKX2KIX22 X3SKGX4X5LX6KATEYIX23RX 7LQAFX24LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 16) wobei X22 ein Peptid mit 20 bis 40, vorzugsweise mit 22 bis 35, noch mehr bevorzugt mit 25 bis 31, Aminosäureresten, X23 ein Pep¬ tid mit 15 bis 20, vorzugsweise mit 17 bis 19, noch mehr bevor¬ zugt mit 18, Aminosäureresten, X24 ein Peptid mit 15 bis 25, vor¬ zugsweise mit 17 bis 23, noch mehr bevorzugt mit 19 bis 21, Ami¬ nosäureresten und X25 ein Peptid mit 200 bis 300, vorzugsweise mit 220 bis 280, noch mehr bevorzugt mit 230 bis 260, noch mehr bevorzugt mit 238 bis 252, Aminosäureresten ist. Am N-Terminus kann sich ein Peptid mit bis zu 150 Aminosäureresten befinden. Das Polypeptid der erfindungsgemäß verwendeten Zelle kann auch Motive bzw. Varianten von Motiven umfassen, die mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, ident mit den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3),
KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD- PRGFC (SEQ ID Nr. 6), GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9),
GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEK- MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13) und ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) sind.
„Identität" bezeichnet den Grad der Übereinstimmung zwischen zwei oder mehr Nuklein- bzw. Aminosäuresequenzen, der durch den Vergleich der Sequenzen bestimmt werden kann. Der Prozentsatz der „Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Be¬ reiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten (d.h. % Identität ist die Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positio¬ nen x 100) . Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Identität ist das BLAST X Programm des National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (siehe u.a. Altschul S et al . J Mol Biol 215 (1990) : 403-410) . Dabei wird bevorzugter Weise der BLOSUM62 Algorithmus mit den Parametern „Gap" „Existence" : 11 und „Extension" : 1 verwendet.
Je nach Pilzzelle bzw. je nach Anzahl der Biossynthesewege für Sekundärmetaboliten in der Pilzzelle, kann eine unterschied¬ liche Anzahl von Sekundärmetaboliten hergestellt werden. Vor¬ zugsweise wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens ein, vorzugsweise mindestens zwei, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens drei, noch mehr bevorzugt mindestens vier, noch mehr bevor¬ zugt mindestens fünf, noch mehr bevorzugt mindestens zehn, Se- kundärmetabolite hergestellt.
„Genetisch modifizierte Pilzzelle", wie hier verwendet, be¬ zieht sich auf Pilzzellen, die genetisch bzw. gentechnisch so verändert wurden, dass das Gen kodierend für das erfindungsgemä¬ ße und beanspruchte Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven im Vergleich zu einer unmodifizierten Pilzzelle desselben Stam- mes eine andere Nukleinsäuresequenz aufweist. Um eine genetisch modifizierte Pilzzelle zu erhalten wird das Gen im Genom ausge¬ hend von einer unmodifizierten Pilzzelle mutiert.
Eine „unmodifizierte Pilzzelle" bzw. eine „nicht modifizier¬ te Pilzzelle", wie hier verwendet, bildet den Ausgangspunkt für die Herstellung einer erfindungsgemäßen modifizierten Pilzzelle. Die unmodifizierte Pilzzelle umfasst mindestens ein Gen kodie¬ rend für das erfindungsgemäße und beanspruchte Polypeptid und weist eine bestimmte Herstellungsrate an Sekundärmetaboliten auf. Eine unmodifizierte Pilzzelle kann eine Pilzzelle sein, die in der Natur natürlicherweise vorkommt. Eine unmodifizierte Pilzzelle kann jedoch auch eine Pilzzelle sein, welche bereits genetisch bzw. gentechnisch an einer beliebigen Stelle des Ge¬ noms verändert wurde bzw. extrachromosomale Nukleinsäuremoleküle umfasst, die natürlicherweise nicht in der Pilzzelle vorkommen. Die Mutationen im Genom der Pilzzelle können auch das Gen kodie¬ rend das erfindungsgemäße Polypeptid betreffen. Diese Pilzzelle wird als Ausgangszelle für weitere Modifikationen, wie hierin beschrieben, verwendet und stellt somit ebenfalls eine „unmodi- fizierte Pilzzelle" dar.
Der Begriff „Sekundärmetabolit" umfasst nicht nur ein End¬ produkt eines Sekundärstoffwechselweges sondern auch Zwischen¬ produkte .
Das Merkmal, dass die Expression eines Polypeptids in einer genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zu einer unmodi- fizierten Pilzzelle reduziert ist, bedeutet, dass eine Pilzzelle bei einer genetischen Modifikation eine geringere Menge des er¬ findungsgemäßen Polypeptids mit den hierin erwähnten Motiven synthetisiert als eine Pilzzelle derselben Art, die unmodifi- ziert bzw. nicht modifiziert ist. Die Reduktion der Expressions¬ rate bzw. der produzierten Polypeptidmenge beträgt mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 98%, insbesondere 100%. Die Expressionsrate dieses Polypeptids kann beispielsweise mit¬ tels einer mRNA Bestimmung (z.B. mittels PCR (Polymeraseketten- reaktion) ) oder einer Polypeptidbestimmung unter Zuhilfenahme von Polypeptid-spezifischen Antikörpern (z.B. ELISA (Enzyme Lin- ked Immunosorbent Assay) bestimmt werden. Selbstverständlich kann die Expressionsrate auch indirekt bestimmt werden, indem die Menge einer oder mehrere von der Pilzzelle produzierte Se¬ kundarmetaboliten bestimmt wird. Erhöht sich die Menge an in der modifizierten Pilzzelle hergestellten Sekundarmetaboliten im Vergleich zu unmodifizierten Pilzzellen, ist die Einführung ei¬ ner Mutation in das Gen kodierend für das Polypeptids erfolg¬ reich.
Der hier verwendete Einbuchstabencode für Aminosäurereste bei Aminosäuresequenzen entspricht dem üblicherweise verwende¬ ten :
Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparaginsäure Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gin Q
Glutaminsäure Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode
Valin Val V
Das Polypeptid, welches mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Vari¬ anten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, und in Trichoderma reesei die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 auf¬ weist, ist aus Trichoderma reesei als Xppl (Xylanase promoter- binding protein 1; Xylanase Promoter-bindendes Protein 1) be¬ kannt (siehe Derntl C et al . Biotechnol Biofuels 8 (2015) : 112) . Bisher war nur bekannt, dass Xppl für die Regulation der Expres¬ sion von Xylanasen in Pilzzellen verantwortlich ist, nicht je¬ doch für die Regulation von Biosynthesewegen von Sekundärmetabo- liten. Da Xppl als sehr spezifischer Regulator der Expression von Xylanasen beschrieben wurde - Zellulasen werden durch Xppl nicht reguliert - ist es überraschend, dass Herabregulierung von Xppl zu einer erhöhten Produktion von Sekundärmetaboliten führt. Daher kann das Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven auch als „Xppl" bezeichnet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können einerseits Pilzzellen eingesetzt werden, deren Expression des hierin beschriebenen Po¬ lypeptids reduziert ist (z.B. durch Modifikation oder Austausch des entsprechenden Promoters, durch Deletion des Gens, welches für das Polypeptid kodiert, bzw. Teilen davon) . Andererseits ist es auch möglich, die Aktivität des Polypeptids zu reduzieren, in dem dieses z.B. durch Mutationen modifiziert wird. Das Polypep¬ tid, welches die oben beschriebenen Motive umfasst, ist ein Transkriptionsfaktor. D.h. das Polypeptid steuert die Transkrip¬ tion verschiedenster Gene des Sekundär- und evtl. des Primärme¬ tabolismus. Durch gezielte Mutationen ist es beispielsweise mög¬ lich, die Aktivität des Polypeptids so zu verändern, dass sich die Biosynthese der Sekundärmetaboliten im Vergleich zu Pilzzel¬ len, welche ein unverändertes Polypeptid exprimieren, erhöht. Durch die Bestimmung der Mengen an in den Pilzzellen hergestell¬ ten Sekundärmetaboliten ist es möglich zu testen, ob eine Muta¬ tion des Polypeptids zu dem gewünschten Effekt führt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er¬ findung weist das Polypeptid einen Bereich auf, der mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, ident mit den Aminosäureres¬ ten 118 bis 157 und/oder 394 bis 494 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist.
SEQ ID Nr. 1 stammt von Trichoderma reesei und weist folgen¬ de Aminosäuresequenz auf:
MAQALDISSSSGPGPLVALPERTLGPPASAITPPSTVQRSAWTSSPRAPAMDMFNFTTAASASA VASYAPAGGSNSNSNSNSGGNSGGLGDMNFSQMPQYSGRNPLQSMLSQTKEGPDAKRIKVESPH SALDS IDSWLQFDEDADKFGSFEIDFSKQYNTANQPRASTNMTPGLGSGLYANPTAPFREEDFL DDSAFDHSLSEDDEMFDNININDQLSKLGTLPSTEAQSSRSLFSTPSMGWEKPQQGVQPSAVMG DEIPRRMTSDSWDP IPQGTNYTLTPDERRRLLEIAMGPGRLASYVNPSRFNMGFGSTMQPS I SQ EFGGFGAPKQGLSHMGMYQRNNSADTSASPLSQSRELKHKQPKVETPPKTVPTKRPSTLSETSS IGKEKVKSADRMAHNDVERKYRTNLKDKITELRNAVPALQQVAEGEPDAAQGIAKVSKGTVLTK ATEYIHQLEQRNKDIMTEHKQLMRRLQAFEALLNNSMRVDIMPSHSMTLFDPRGFC
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorlie¬ genden Erfindung ist das Polypeptid mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, ident mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1.
Die mindestens eine Mutation des Polypeptids in der gene¬ tisch modifizierten Pilzzelle ist vorzugsweise eine Deletion, Substitution oder Insertion mindestens eines Aminosäurerests. Verfahren zur Herstellung mutierter Polypeptide durch Einführen von Mutationen in der korrespondierenden Nukleinsäuresequenz sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypep¬ tid mindestens eine Mutation in mindestens einem Motiv ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Vari¬ anten davon mit einer Identität von mindestens 60%.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypep¬ tid mindestens eine Mutation in mindestens einem Motiv ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSX8X9IDXioSXn (SEQ ID Nr. 7), PGLGXi2GXi3Y (SEQ ID Nr. 8), REGLY- STPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11),
PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLES I STSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60%.
Das Polypeptid, welches durch die genetisch modifizierte Pilzzelle hergestellt werden kann, weist im Vergleich zum Po¬ lypeptid der unmodifizierten Pilzzelle vorzugsweise eine oder mehrere Mutationen in einem oder mehreren der oben genannten Mo¬ tive auf. Dabei können einzelne Aminosäuren substituiert oder das gesamte Motiv oder Teile davon (umfassend mindestens eine, zwei, fünf oder zehn Aminosäurereste) deletiert sein. Diese Mu¬ tationen sollen zu einer Erhöhung der Bildung von Sekundärmeta- boliten oder entsprechenden Vorläufermolekülen davon in der mo¬ difizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle führen .
Die Reduktion der Expression des Polypeptids in der gene¬ tisch modifizierten Pilzzelle wird vorzugsweise durch Modifika¬ tion des Gens oder Teilen davon erzielt.
Vorzugsweise ist der Promoter des Gens oder der das Polypep¬ tid kodierende Bereich des Gens mutiert. Die Mutation am Promo¬ ter kann eine Deletion, Insertion oder Substitution mindestens eines Nukleotids umfassen. Der natürlich im Gen vorkommende Pro¬ moter kann auch durch einen anderen Promoter ersetzt werden.
Dieser Promoter kann aus derselben Pilzzelle oder von einem an¬ deren Organismus, vorzugsweise ebenfalls einer Pilzzelle, stam¬ men .
Durch Modifikationen in der Nukleinsäuresequenz des Gens, welches für das Polypeptid mit den mindestens zwei Motiven wie hierin definiert kodiert, ist es möglich, dessen Transkriptions¬ rate zu reduzieren, wodurch auch weniger Polypeptid aus der ent¬ sprechenden RNA translatiert wird. Vorzugsweise wird mit geeig¬ neter Modifikation die Menge an Polypeptid um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevor¬ zugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100% im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzel¬ le reduziert. Die Menge an transkribierter RNA kodierend für das Polypeptid kann mit bekannten Verfahren zur RNA Bestimmung be¬ stimmt werden.
Die Expression des Polypeptids kann beispielsweise dadurch reduziert oder unterbunden werden, wenn vorzugsweise mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens 95%, insbesondere 100% der kodierenden Region für das Po¬ lypeptid deletiert oder substituiert werden.
Um die Expression des Polypeptids in der genetisch modifi¬ zierten Pilzzelle zu reduzieren bzw. zur Gänze zu unterbinden, kann beispielsweise die Promotorregion oder Teile davon durch beispielsweise Deletion oder Substitution modifiziert werden. Durch Modifikationen in der Promotorregion kann die Transkripti¬ onsrate reduziert bzw. die Transkription zur Gänze unterbunden werden. Dabei kann mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, noch mehr bevorzugt mindestens 30%, noch mehr bevorzugt mindes¬ tens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, noch mehr bevor¬ zugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugt mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100% des Promotors deletiert oder substituiert werden. Vorzugsweise wer¬ den stromaufwärts vom Startcodon mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, noch mehr bevorzugt mindestens 50, noch mehr be¬ vorzugt mindestens 100, noch mehr bevorzugt mindestens 200, Nuk¬ leotide deletiert oder substituiert, wobei die Modifikation des Promotors unmittelbar ab dem Startcodon der für das Polypeptid kodierenden Region erfolgen kann.
Das Gen kodierend das Polypeptid Xppl in Trichoderma reesei umfasst die folgende Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) :
CAGATGGTGAAGACGGGCAGAAAGGGGAGCGAAAGCTGAAAAATACTTAAGCAGCAGCTGTTCC CCGTACGTTCGTGGAGATGGCAAGAGCAGCCGGCCGCGGGGAGTCTGGAGCAGGAGCCGCAGCT
GCGTAGCTGCCGGTTGCTGCTGCCCATCTGCCCAGGTTCGTTTGCGCCGGATCCGTCCAAATAT
CTCCTGATAAATGCGGCCACTTTTCCCTCATGCTCGTCCTTTTTTATTCCCCGAAGCGCAGCAA ACGAGCAGCAAGAGCAAAGAGCAGAGCAGAAAGTCGCCTCATCTCGGGCGCCGCCTTGCCTAAC GGGGTAGCAATAAGCCCATCGACACCGACGGCGGGCGGCGGGCTGGCCAATCAGCGGCGCGCGG TGCTGTTCCTTTGGCCCTTGGAGCCTTGGGGAATCATACGATGTCTGAGCAGCCAATTCTTGCA TTCTTCCCACATGCATGGCATCCCATGGCGCAGGGTCCCCCCCCCTTCTCCCCTCTCCGCTCTC TTCTCCTCTCTTCTTGGCTGAGGTGCTCTGCTCCCTCTGCTCGGCCAGCTAAGACAACCAGCGC TGTGGCCCGGCAAGACAGCCACTCTTGTCATTCGCCAGGGGGGTTGGAGGAGGGCGCCACGGCT CCGCGGAAAGTCAGGCCATTTTCATCAACAGCCGCAGACACTGGCCCAGAGAACTATCCTTATC CTGGACGCGCGCACGTCGAAAATTTTCATTTTTGCTCGCCCAGGCGCGCCTGCAATTCGCCATG CGGGCTGCTCGATACCCACGCAGACGGCAAATGACAGGCCATTCTGGCTCACAGACGCCGCCGT CCCGGCTCTCGCCGAGGTGGAAAAGGGTCATCTGGGTTCGTTGCGCTGAGCTCTAGCTAGGCCA GAAGACACAGCCGAGACATGCCTATTCGACGTGCCTACGGGGCGGAGGCAGAGGGCAGAGGACA GGAGGGCAGGAGGACATCCCAACAAAGGCTCCCCATGCCGGAAACGCAAAGAGAAGCATCGGAG AGCTGCGAAGCACCCGCCGAAACAGCCACTACCTTACCCAGCAAGAGCAGCAGCTCTCTTGAAT GGCCTGACTGGCGACACCGCGGGTCCCTAGCGCCGGGGCCTTGCCTGGATGGCACCGGTCCCTG GAGCGGGATCCTCGTCGCTGGTGCTCGACGGGCTGTGGTGCTGCTGTGCGTCTTGCGCTGCCGG CTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGATCTGAGCTGCTTGCAGCGCCGTTCCCTCAGGCTTCGGAA TCGCAGCCGTCGCGGCGTTGCCCGAACAGCCACCCGGAGCTTGGCCTGCCTCTGCGAGGTGCTA ATGCTGAAACTGGTCGACCCTGTATATTACCCGTGATGCTCTGGCACCGCAGCTCCAGACCCAG ACCCGGGTCTAGGTTCCCAATATCGATCCTGTAGCATTGATATCGAACGGTACTTGCTGGGTAC TACCTCCCACTCTTGCTGCTCGGTACCCTGCCCTGTCTCACCTGTGCATGCACAGAAGCACCAT CACTATCCATTGACTTCCAATTTTGCATCTGCATCCGTCGGCCTATCTTGCCGGCATCTACTTC TACTTCTACTTCTACGTCTCCGCCTGCACTCGCATTGACCTCTTTTTGCATCTACATCTGCGGC AGAGCTGTGCGCTATCTACCTTACCTCGTCTTGAACCCCCCTGATCCGAGCATCGTATCCCTCC ATAACCACCTCGGCTCGCTACCTCACCTCCTTCGTGATAGGTATTCAATCGTGGTGTCTCTTGC TCATCTGCATCTGGAATTCTTCCCTTTCTCCTCTTGACATCTTCTACCTATTATCGCGCTCTTC CTCCTCCGTCTGCAACCCCCCAGACGCCGCCGAACCCGATCTGTGGCTGCCATTAGCCTTTCGG CGCGCATTCCTCTACGCCACCCGGTTTGGGTCCCCCTTCACCCCCAGCACATATTCCGACAACC CTGTGTCTGCAGCCGCATGGCACAAGCCCTCGACATTTCCTCGTCGTCAGGACCCGGACCCCTC GTCGCCCTGCCCGAGCGAACTCTCGGCCCCCCAGCCTCGGCCATCACGCCTCCCTCGACCGTCC AGCGCTCGGCCTGGACGTCGTCGCCTCGCGCGCCCGCCATGGACATGTTCAACTTCACAACCGC TGCCTCGGCATCCGCAGTCGCCTCGTATGCCCCCGCCGGCGGCAGCAATAGCAATAGCAATAGC AATAGCGGCGGCAACAGCGGCGGCCTGGGCGACATGAACTTCTCTCAGATGCCGCAGTACTCTG GCCGCAATCCCCTGCAGTCGATGCTCTCCCAGACCAAGGAGGGCCCCGATGCCAAGCGGATAAA GGTCGAGTCGCCGCACTCGGCGCTGGATTCGATCGATTCATGGCTTCAGTTTGACGAGGATGCC GACAAGTTTGGCAGCTTCGAGATTGACTTTTCCAAACAGTACAACACGGCCAACCAGCCAAGGr GAGCTGCGCTCCTGAACCGCCAATCTGGTGTTTCCCGCTCTCTAACACATTGCGACATTAAGAG CTTCCACAAACATGACGCCGGGACTGGGCAGCGGTCTCTACGCCAATCCCACCGCCCCCTTCAG AGAAGAAGACTTTCTCGACGACAGCGCCTTTGACCACTCTCTGTCCGAAGACGACGAGATGTTC GACAACATCAACATCAATGACCAGCTGTCCAAGCTTGGCACGCTGCCCTCGACCGAAGCTCAGT CATCCAGGAGTCTCTTCTCCACGCCGTCGATGGGCTGGGAGAAGCCTCAGCAAGGCGTCCAGCC
CAGCGCCGTCATGGGCGACGAGATCCCGAGGCGCATGACTAGCGATTCCTGGGACCCGATTCCG
CAGGGCACCAATTACACCCTCACGCCGGACGAGCGCCGCCGACTGCTCGAAATCGCCATGGGCC
CCGGCAGATTGGCGTCCTACGTCAACCCCAGCCGGTTCAACATGGGCTTCGGATCTACGATGCA
GCCCAGCATAAGCCAGGAGTTTGGCTTCGGCTTCGGCGCTCCGAAACAGGGGCTGAGCCATATG
GGCATGTACCAGAGGAACAACTCGGCCGACACGAGCGCATCCCCCCTCTCGCAGAGTCGGGAAT
TGAAACACAAGCAGCCCAAGGTCGAGACGCCGCCGAAGACGGTGCCCACAAAGCGGCCCAGCAC
GCTTTCGGAGACGAGCAGCATCGGCAAAGAAAAGGTCAAGTCCGCCGACCGCATGGCGCACAAC
GACGTTGAGCGCAAGTATCGAACCAATCTCAAGGACAAGATTACCGAGCTGCGAAATGCGGTGC
CGGCGCTGCAGCAGGTGGCTGAAGGGGAGCCGGACGCTGCGCAGGGCATTGCCAAAGTGAGCAA
GGTGAGTTGGAAAACAGCATGCCCCATCTTGTCAGTGACTCGTGAAGACGGCATCACTGACTCT
GATCCTArAGGGCACCGTATTGACAAAAGCGACTGAATACATTCATCAGCTCGAGCAACGCAAC
AAGGATATCATGACGGAGCATAAGCAGCTTATGCGACGACTGCAAGCCTTCGAAGCACTTCTCA
ACAACTCGATGAGAGTCGACATCATGCCCAGCCATAGCATGACGCTCTTCGACCCGAGAGGATT
CTGTTGA, wobei der Promoterbereich unterstrichen, die Exons fett und die Introns kursiv und unterstrichen zwischen den Exons gedruckt sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorlie¬ genden Erfindung ist die Pilzzelle eine Pilzzelle der Klasse der Sordariomycetes , insbesondere der Familie Hypocreaceae, Clavici- pitaceae, Glomerellaceae oder Nectriaceae.
Die Pilzzelle ist vorzugsweise eine Pilzzelle der Gattung Trichoderma , Claviceps, Colletotrichum oder Fusarium.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vor¬ liegenden Erfindung ist die Pilzzelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Tricho¬ derma virens, Trichoderma atroviride, Tolypocladium ophio- glossoides, Ophiocordyceps unilateralis, Hirsuteila minnesoten- sis, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Neonectria ditissima, Nectria haematococca, Villosiclava virens, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum graminicola, Claviceps purpurea, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Fusarium avenaceum, Col¬ letotrichum gloeosporioides, Fusarium langsethiae, Fusarium pseudograminearum, Fusarium graminearum, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporum, Verticillium longisporum, Fusarium verticil- lioides, Colletotrichum orbiculare, Thielaviopsis punctulata, Madurella mycetomatis, Verticillium dahlia, Phaeoacremonium mi- nimum, Thielavia terrestris, Magnaporthe oryzae, Neurospora tet- rasperma, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Metar- hizium acridum, Magnaporthiopsis poae, Sordaria macrospora, Po- dospora anserine, Metarhizium guizhouense, Chaetomium globosum, Metarhizium brunneum, Gaeumannomyces graminis, Sporothrix schenckii, Sporothrix brasiliensis, Ophiostoma piceae, Colle¬ totrichum higginsianum, Metarhizium album und Diaporthe ampeli- na, vorzugsweise Trichoderma reesei, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea und Fusarium graminearum, besonders bevorzugt Trichoderma reesei.
Sämtliche dieser Pilzarten verfügen in ihrer unmodifizierten Form über ein Gen kodierend für mindestens ein Polypeptid, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3),
KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD- PRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% und gegebenenfalls ein weiteres Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
GSX8X9IDX10SX11 (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REG- LYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11),
PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLES I STSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst. Alle oben genannten unmodifizierten Pilzarten sind in der Lage ein Po¬ lypeptid mit den Motiven AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5) und LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) zu exprimieren. Die Motive GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLS- WEX14PQPGXi5RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11),
PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLES I STSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% kommen in Polypep¬ tiden verschiedener Pilzfamilien, Pilzgattungen bzw. Pilzarten vor .
Die Motive GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7) und PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8) sind vorzugsweise in Polypeptiden der hierin de¬ finierten Art der Pilzzellen Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Claviceps purpurea, Metarhizium album, Villosiclava virens, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizi¬ um brunneum, Metarhizium guizhouense, Metarhizium acridum, Toly- pocladium ophioglossoides, Hirsuteila minnesotensis, Ophiocordy- ceps unilateralis, Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys Chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium verticillioides, Fusarium fuji- kuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria hae- matococca, Neonectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Ver- ticillium dahlia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbi- culare, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsi- anum, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum sublineola und Colletotrichum fioriniae vorhanden.
Das Motiv REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9) ist vor¬ zugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilz¬ zellen Ophiostoma piceae, Sporothrix brasiliensis, Sporothrix schenckii, Gaeumannomyces graminis, Magnaporthiopsis poae, Mag- naporthe oryzae, Diaporthe ampelina, Phaeoacremonium minimum, Madurella mycetomatis, Podospora anserine, Thielavia terrestris, Myceliophthora thermophila und Chaetomium globosum vorhanden.
Das Motiv GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10) ist vorzugs¬ weise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilzzellen Sordaria macrospora, Neurospora crassa und Neurospora tetrasper- ma vorhanden.
Das Motiv PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11) ist vor¬ zugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilz¬ zellen Stachybotrys chlorohalonata, Stachybotrys chartarum, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium verticillioides, Fusarium fujikuroi, Fusa¬ rium oxysporum, Fusarium favenaceum, Nectaria haematococca, Ne¬ onectria ditissima, Thielaviopsis punctulata, Verticillium dah¬ lia, Verticillium logisporum, Colletotrichum orbiculare, Colle¬ totrichum gloeosporioides, Colletotrichum higginsianum, Colle¬ totrichum graminicola, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum fioriniae, Sordaria macrospora, Neurospora crassa und Neurospora tetrasperma vorhanden.
Das Motiv P S TEX19Q S SRS LY S TP SX20 GWE (SEQ ID Nr. 12) ist vor¬ zugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilz¬ zellen der Gattung Trichoderma, vorzugsweise Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens und Trichoderma atro- viride, vorhanden.
Das Motiv TKAKPGEKMAQLES I STSQQPLD (SEQ ID Nr. 13) ist vor¬ zugsweise in Polypeptiden der hierin definierten Art der Pilz¬ zellen Metarhizium album, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Metarhizium brunneum, Metarhizium guizhouense und Metarhizium acridum vorhanden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung geeigneter modifizierter Pilzzellen wie hierin beschrieben ver¬ schiedene Sekundärmetabolite hergestellt werden. Der mindestens eine Sekundärmetabolit ist daher vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyketiden, Alkaloiden, Terpenen, Melani¬ nen, Pteridinen, Phenylpropanoiden, Flavonoiden, und nichtriboso- malen Peptiden, wobei besonders bevorzugt Polyketide hergestellt werden .
Pilzzellen sind bekannt dafür, dass diese in der Lage sind, Sekundärmetaboliten herzustellen. Dabei produzieren die Pilzzel¬ len je nach Zelle unterschiedlichste Substanzen. Durch das Vor¬ sehen der erfindungsgemäßen Modifikationen ist es möglich, dass die Menge der von den Pilzzellen hergestellten Sekundärmetaboli¬ ten erhöht werden kann. Es ist auch möglich, Pilzzellen so zu modifizieren, dass diese in der Lage sind, Sekundärmetabolite zu produzieren, die diese Zellen natürlicherweise nicht produzieren könnten. Dazu können zusätzliche Nukleinsäuremoleküle in die Pilzzelle eingebracht werden, die Polypeptide und Proteine ko¬ dieren, die diese neuen bzw. alternativen Biosynthesewege kata¬ lysieren. Daher ist es besonders bevorzugt, dass die genetisch modifizierte Pilzzelle mindestens ein Nukleinsäuremolekül kodie¬ rend für mindestens ein heterologes Protein umfasst. In Watanabe CM et al. (Chem Biol 3 (2013) : 463-469) , Abrar M, et al . (Crit Rev Food Sei Nutr 53 (2013) : 862-874) , Ortel I et al . (J Biol Chem 284 (2009) : 6650-6660) , Ozcengiz G et al . (Biotech Adv
31 (2013) .287-311) , Ward TJ et al . (PNAS 99 (2002) : 9278-9283) , Ei- senman HC et al . (Appl Microbiol Biotech 93 (2012) : 931-940) und Nesic K et al . (Rev Envir Contamin Toxicol 228 (2014 ) : 101-120 ) werden Sekundärmetabolite und deren Stoffwechselwege geoffen¬ bart, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gesteuert werden können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur Sekun- därmetabolite hergestellt, sondern es kann auch zur Identifika¬ tion neuer Sekundärmetabolite und Biosynthesewegen verwendet werden. Dabei können mit den erfindungsgemäß modifizierten Pilz¬ zellen hergestellten Sekundärmetabolite isoliert und deren
Struktur bestimmt werden (z.B. mittels MS/MS oder NMR) . Die von den erfindungsgemäß modifizierten Pilzzellen hergestellten Se¬ kundärmetabolite werden mit jenen Sekundärmetaboliten vergli¬ chen, die eine entsprechende unmodifizierte Pilzzelle produ¬ ziert. Dadurch lässt sich feststellen, welcher Sekundärmetabo- litsyntheseweg in der Pilzzelle durch Reduktion der Expression bzw. Aktivität des Polypeptids mit den mindestens zwei Motiven ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Va¬ rianten davon hochreguliert wird. Die daran beteiligten Enzyme und sonstigen Proteine können mittels RNA Analysen zunächst in¬ direkt bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispielen eingehender erläutert, ohne jedoch auf diese be¬ schränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt den Verlauf der Gelbfärbung (Absorption bei 370 nm) in Kulturüberständen des Wildtypstammes (schwarze Quadrate, durchgehende Linien) , des Xppl-Deletionsstammes (schwarze Rau¬ ten, gestrichelte Linien) und des Xppl-Überexpressionsstammes (weiße Quadrate, gepunktete Linien) auf Carboxymethylcellulose (CMC) (A) , Laktose (B) und D-Glukose (C) . Die Daten stammen aus drei unabhängigen biologischen Replikaten. Die Fehlerbalken ge¬ ben die Standardabweichung an.
Fig. 2 zeigt die Qualität der Proben, die mittels RNASeq analysiert wurden. (A) Der Wildtypstamm (Ätmus53) und der Xppl- Deletionsstamm (Δχρρΐ) wurden in Triplikaten auf CMC kultiviert und das Myzel nach 48 h geerntet und gewogen. (B) Die einzelnen Proben wurden nach der RNASeq Analyse entsprechend den gemesse¬ nen Mengen der individuellen Transkripte geclustert .
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Anteile der unterschiedlich exprimierten Gene (UEG) und aller annotierten Gene pro KOG (Eu- Karyotic Orthologous Groups) beziehungsweise pro KOG-Klasse aus der jeweiligen Gesamtsumme. Das Verhältnis der prozentuellen An- teile wird als Logarithmus zur Basis 2 angegeben. KOG bezie¬ hungsweise KOG-Klassen mit einem Wert über 0,2 sind (als wahr¬ scheinlich regulierte Gengruppen) fett gedruckt.
Fig. 4 zeigt sämtliche UEG aus der KOG „Kohlehydrattransport und -metabolismus" inklusive der Detailergebnisse aus der RNA- Seq-Analyse (durchschnittliche Anzahl an der Transkripte pro Probe, Unterschied zwischen Wildtyp- und Xppl-Delet ionsstamm als Logarithmus zur Basis 2, p-Wert nach Benjamini & Hochberg) .
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Biolog-Analyse. Der Xppl- Deletionsstamm und der Wildtypstamm wurden in Triplikaten auf 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen kultivieren und das Wachstum durch Messung der Absorption bei 750 nm gemessen. (A) zeigt die durchschnittlichen Werte des Wildtypstammes (schwarze Balken) und des Xppl-Deletionsstammes (schraffierte Balken) auf einer repräsentativen Auswahl an Kohlenstoffquellen (in Bezug auf den Kohlenstoffquellentyp als auch auf die Wachstumsrate) nach 72 h. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. In (B) und (C) wurden die durchschnittlichen Werte auf allen Kohlenstoffquellen nach 72 h bzw. 96 h des Xppl-Deletionsstammes gegen den Wildtyp¬ stamm aufgetragen und eine Trendlinie eingefügt.
Fig. 6 zeigt sämtliche Gene, die für Polyketidsynthasen (PKS) kodieren inklusive der Detailergebnissen aus der RNASeq- Analyse (durchschnittliche Anzahl an der Transkripte pro Probe, Unterschied zwischen Wildtyp- und Xppl-Deletionsstamm als Loga¬ rithmus zur Basis 2, p-Wert nach Benjamini & Hochberg) . Fett ge¬ druckte PKS-kodierende Gene wurden in der Auswertung der RNASeq- Analyse als unterschiedlich exprimiert gewertet.
Fig. 7 zeigt die Expressionsraten der PKS-kodierenden Gene 73621 (A) , 73618 (B) , 65116 (C) , 65172 (D) , 60118 (E) und 81964 (F) im Wachstumsverlauf auf CMC des Xppl-Deletionsstammes (Rau¬ ten) und des Wildtypstammes (Quadrate) . Die beiden Stämme wurden in Triplikaten kultiviert und die relativen Transkriptmengen mittels qPCR bestimmt, als Referenzwert dient dabei jeweils der Wert des Wildtypstammes nach 36 h. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.
Fig. 8 zeigt die Eckdaten der Anzucht in modifiziertem Medi¬ um (kein Citrat) mit D-Glukose. Der Wildtypstamm (schwarze Quad¬ rate) , der Xppl-Deletionsstamm (schwarze Rauten) und der Xppl- Überexpressionsstamm (weiße Quadrate) wurden in „24-well-plates" kultiviert. Der Verlauf der Biomasse (A) , der Gelbfärbung des Überstands (B) und die Expressionsraten der PKS-kodierenden Gene 73621 (C) und 65172 (D) sind angegeben. Die Werte stammen aus drei biologischen Replikaten, die Fehlerbalken geben die Stan¬ dardabweichung an. Die relativen Transkriptmengen wurden mittels qPCR bestimmt, als Referenzwert dient dabei jeweils der Wert des Wildtypstammes nach 48 h.
Fig. 9 zeigt die Anzahl der niedermolekularen Substanzen, die von T. reesei gebildet wurden, in den Kulturüberständen nach 72 h bzw. 96 h in modifiziertem Medium (kein Citrat) mit D- Glukose im Wildtypstamm (Ätmus53) , dem Xppl-Deletion-Stamm
(Δχρρΐ) und dem Xppl-Überexpressionsstamm (OExppl).
Fig. 10 zeigt einen Stammbaum der Orthologe von Xppl .
BEISPIELE :
Material und Methoden
Pilzstämme und Kultivierungsbedigungen
Die T. reesei Stämme QM6aÄtmus53 (Steiger M et al . , Appl En- viron Microbiol. 77 (2011) : 114) , der Xppl-Deletionsstamm
QM6aÄtmus53Äxppl (QM6aÄxppl) (Derntl C et al . , Biotechnol Bio- fuels 8(2015): 112) und der Xppl-Überexpressionsstamm
(QM6aOExppl) (Derntl C et al . , Biotechnol Biofuels 8(2015) :112) wurden auf Malzextrakt (MEX) Agar-Platten bei 30 °C kultiviert. Hygromycin B wurde nach Bedarf in einer finalen Konzentration von 113 U/ml zugesetzt.
Für die Wachstumsvergleiche wurde T. reesei auf Platten mit Mandels-Andreotti Medium (MAM) mit 1% Glycerol bei 30 °C vorkul¬ tiviert. Vergleichbar große Stücke des überwachsenen Agars wur¬ den als Inokulum auf MAM Platten mit 1% D-Glukose gesetzt und bei 30°C inkubiert. Fotos wurden von der Unterseite der Platten aufgenommen .
Für die Kultivierung in Carboxymethylcellulose (CMC) wurde T. reesei in 60 mL MAM mit 1% CMC (Carl Roth GmbH, Deutschland) in 1-L-Erlenmeyer Kolben ohne Schütteln bei 30 °C inkubiert. Für die Kultivierung in D-Glukose und Laktose wurde T. reesei in 60 mL MAM mit 1% D-Glukose beziehungsweise Laktose in 250-ml- Erlenmeyer Kolben bei 30°C bei 180 rpm geschüttelt. Myzelium und Kulturüberstände wurden durch Filtration über Miracloth (EMD Millipore, Deutschland) getrennt. Die Myzelien wurden in flüssi¬ gem Stickstoff gelagert. Für Kultivierungen in kleinem Maßstab wurde T. reesei in 1,5 ml modifiziertem MAM mit 1% U-12C- oder U-13C-markierter D- Glukose in 24-well-plates ohne Schütteln bei 30°C inkubiert. Das MAM wurde insofern modifiziert, als dass es anstatt eines Phos- phat-Citrat-Puffers durch einen Natrium-Phosphat-Puffer gepuf¬ fert wurde. Der Kulturüberstand wurde mit 30% (v/v) Azetonitil gestoppt .
Transkriptanalyse mittels RNAseq
RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen) iso¬ liert und die Qualität der Proben auf einem Agilent 2100 Bioana- lyzer überprüft. Die RNA Bibliothek wurde mittels eines TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit und Poly (A) Anreicherung (Illumi- na, Switzerland) erzeugt und mit einem Illumina Library Quanti- fication Kit (KAPA Biosystems) quantifiziert. Die gemischten Bibliotheken wurden auf einem NextSeq500 Instrument (Illumina) ausgelesen mit Sequenzlängen von 75 nt . Für die bioinformatische Auswertung wurden die Sequenzierergebnisse mittels TopHat und Bowtie 2 Software mit dem Referenzgenom von T. reesei abgegli¬ chen (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) und schließlich mit HTSeq quantifiziert. Die ausgezählten Transkrip¬ te wurden statistisch mit Hilfe des DESeq2 Software Paketes aus¬ gewertet. Beide getesteten Stämme wurden für diese Analyse in drei biologischen Replikaten angezüchtet.
Biolog Microarray Technik
Das globale Kohlenstoffassimilationprofil wurde mittels Bio¬ log FF MicroPlate (Biolog, Inc., USA) untersucht. Dabei wurde das Protokoll, das in Druzhinina IS et al . (Appl . Environ.
Microbiol. 72 (2006) : 2126-2133) beschrieben ist, mit folgenden Ausnahmen verwendet: Das Inokulum wurde auf MEX-Platten ange¬ züchtet und die Assayplatten bei 30°C inkubiert. Das Pilzwachs¬ tum wurde nach 18, 24, 30, 36, 42, 48, 66, 72, und 90 Stunden in biologischen Triplikaten gemessen.
Transkriptanalyse mittels quantitativer PCR (qPCR)
0.01 - 0.03 g Myzel wurden mittels eines FastPrep FP120 BIO101 ThermoSavant Aufschlußgeräts (Qbiogene, USA) in 1 mL peqGOLD TriFast DNA/RNA/protein purification System Reagens (PEQLAB Biotechnologie, Deutschland) homogenisiert. Die RNA wur¬ de entsprechend den Anweisungen des Herstellers isoliert und schließlich die Konzentration auf einem NanoDrop 1000 System (Thermo Scientific) gemessen. Synthese der cDNA von der mRNA wurde mittels dem RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) durchgeführt.
Die qPCRs wurden auf einem Mastercycler ep realplex 2.2 Sys¬ tem (Eppendorf, Deutschland) in Triplikaten durchgeführt. Die 25-μ1 PCR-Ansätze beinhalteten 12,5 i 2 χ iQ SYBR Green Mix (Bio- Rad Laboratories, USA), 100 nM forward und reverse Primer und 2,5 μΐ, 1:100 verdünnte cDNA. Die PCR und die Berechnungen der rela¬ tiven Transkriptraten bezogen auf die Referenzgene actl und sarl wurden wie in Steiger MG et al . (J Biotechnol 145 (2010) : 30-37) beschrieben durchgeführt. Folgende Primer wurden benutzt:
Figure imgf000022_0001
Metabolitmessungen
Gleiche Volumen aller gestoppten, U-13C-markierten Überstän¬ de wurden gemischt. Die gestoppten, U-12C-markierten Überstände wurden individuell 1:1 mit dem U-13C-Pool gemischt. Diese Proben wurden, wie in Kluger B et al . Anal Bioanal Chem 405(2013) :5031- 5036 beschrieben, auf einem UHPLC System (Accela, Thermo Fisher Scientific, USA) aufgetrennt und mittels einem nachgeschaltetem LTQ Orbitrap XL System (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Io¬ nisierung (positiv) erfolgte an einer Elektrospray Übergangs¬ stelle. Eine reversed-phase XBridge C18 analytische Säule
(150x2.1 mm i.d., 3,5 pm particle size) (Waters, USA), nachge¬ schalten einer C18 4x3 mm Sicherungskartusche (Phenomenex, USA) , wurde mit Methanol (im folgenden A) und Wasser (im folgenden B) , jeweils mit 0,1% Ameisensäure, als Laufmittel betrieben. Die Durchflussrate wurde auf 250 pL/min eingestellt. Das Chromato¬ graphieprogramm umfaßte folgende Schritte: 2 Minuten konstant 10% B, Gradient auf 100% B in 30 Minuten, 5 Minuten 100% B. Die Säule wurde danach für 8 Minuten mit 10% B re-equilibriert . Das Orbitrap Massenspektrometer wurde in vollem Scanmdodus (m/z 100 - 1000) betrieben. Auswertung der MS-Daten erfolgte wie in Bue- schl et al . (Metabolomics 10 (2014) : 754-69) beschrieben.
Beispiel 1: Deletion von Xppl führt zu einer frühzeitigen und erhöhten Sekretion eines gelben Pigments
Der industriell eingesetzte Zellulase-produzierende Pilz Γ. reesei sekretiert während des Wachstums ein typisches, gelbes Pigment. Für eine frühere Publikation wurde ein Xppl- Deletionsstamm und der Wildtypstamm auf CMC kultiviert (Derntl C et al . , Biotechnol Biofuels 8 (2015) : 112) . Dabei zeigte sich, dass die Kulturen des Xppl-Deletionsstammes früher und intensi¬ ver gelb wurden als die des Vergleichsstammes. In einer Wieder¬ holung des Experiments wurden die beiden Stämme gemeinsam mit einem Xppl-Überexpressionsstamm auf CMC, Laktose und D-Glukose kultiviert. Die Abwesenheit von Xppl führte auf allen drei Koh¬ lenstoffquellen zu einer früheren und intensiveren Gelbfärbung des Überstandes (Fig. 1A-C) . Dazu passend, führte die Überex¬ pression von Xppl zu einem späteren Auftreten der Gelbfärbung und einer weniger intensiven Färbung auf Laktose und D- Glukose(Fig. 1B und IC).
Beispiel 2: Xppl beeinflusst die Expression von Genen des primären und des sekundären Stoffwechsels
Um die Einflüsse von Xppl auf das Transkriptom von T. reesei zu untersuchen, wurde eine RNAseq Analyse durchgeführt. Dafür wurden der Xppl-Deletionsstamm und der Wildtypstamm auf CMC 48 Stunden lang kultiviert. Die Stämme zeigten gleiches Wachstum auf dieser Kohlenstoffquelle (Fig. 2A) . Die einzelnen Proben wurden vergleichbar gut prozessiert (jeweils 50.209.455 bis 57.345.532 individuelle Sequenzen ohne signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen) . Die erhaltenen Sequenzen wurden entspre¬ chend dem Referenzgenom von T. reesei (http://genome.jgi- psf.org/Trire2/Trire2.home.html) einzelnen Transkripten zugeord¬ net (Zuordnungsquoten von 93.1% bis 93.7%) . In Summe wurden 9129 verschiedene Transkripte identifiziert. Die sechs Proben wurden entsprechend der gemessenen Anzahl der einzelnen Transkripte geclustert . Dies spiegelt die beiden Stämme wider (Fig. 2B) . Für eine genauere Analyse wurden die einzelnen Transkripte in Bezug auf unterschiedliche Menge in den beiden Stämmen verglichen und statistisch ausgewertet. Die zugehörigen Gene wurden als unter¬ schiedlich exprimiert betrachtet, wenn der berechnete p-Wert (nach Benjamini & Hochberg) unter 0,05 lag. Mittels dieser Aus¬ wertung wurden 995 unterschiedlich exprimierte Gene (UEG) gefun¬ den. Vergleichbar viele Gene wurden jeweils geringer beziehungs¬ weise stärker im Xppl-Deletionsstamm exprimiert (genau genommen wurden 490 Gene hoch und 505 Gene herab reguliert) .
Als nächstes wurden die UEG entsprechend ihrer zugewiesenen KOG klassifiziert. Da nicht alle Genen einer KOG zugeordnet wer¬ den konnten, ist diese Liste kürzer (nur 669 Einträge) als die UEG-Liste (995 Einträge). Um abzuschätzen, welche biologischen Funktionen von Xppl abhängig sind, wurde verglichen, welche KOGs in der RNASeq mit einem höheren Anteil vertreten sind, als sta¬ tistisch zu erwarten wäre. Der relative Anteil der UEG einer be¬ stimmten KOG an allen zugeordneten UEG wurde mit dem relativen Anteil aller Gene einer KOG an allen zugeordneten Genen vergli¬ chen. Diese Analyse zeigt, dass mehr Gene aus der KOG „Stoff¬ wechsel" im Xppl-Deletionsstamm reguliert werden als statistisch zu erwarten wäre (Fig. 3) . Genauer gesagt, sind sechs der neun KOG-Klassen betroffen - inklusiver der Klasse "Biosynthese, Transport und Abbau von Sekundärmetaboliten" (Fig. 3). Die wei¬ teren fünf Klassen können als Primärstoffwechsel zusammengefasst werden. Besonders Gene der Klasse „Kohlehydrattransport und - metabolismus" zeigen ein auffälliges Bild: Fast alle Gene dieser Klasse, die hochreguliert werden, sind Transporter, während die restlichen Gene (kodierend für z.B. Hydrolasen und Enzyme aus der Glykolyse) herabreguliert werden (Fig. 4). Dieses Ergebnis lässt auf eine Abschwächung des Primärstoffwechsels im Xppl- Deletionsstamm schließen. Beispiel 3: Xppl unterstützt das Pilzwachstum
Die Ergebnisse der RNASeq Analyse lassen darauf schließen, dass Xppl den Primärstoffwechsel reguliert. Um dies weiter zu untersuchen wurde das Kohlenstoffassimilationsverhalten des Xppl-Deletionsstammes und des Wildtypstammes in einem „Biolog Assay" verglichen. Dabei wird das Wachstum auf 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen gemessen. Für die Auswertung wurden nur Koh¬ lenstoffquellen, auf denen beiden Stämme besser gewachsen waren als auf Wasser (Kontrolle), berücksichtigt. Auf allen diesen Kohlenstoffquellen wuchs der Wildtypstamm besser als der Xppl- Deletionsstamm (Fig. 5A) . Ein Wilcoxon-Test auf Datenpaare
(Durchschnittswerte für beiden Stämmen) zeigte einen signifikan¬ ten Unterschied (p < 0,001) zwischen den beiden Stämmen für die zwei getesteten Zeitpunkte (48 und 72 Stunden) . Daher wurden die einzelnen Datenpaare in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen (Fig. 5B und 5C) . Der statistisch signifikante Wachstumsunter¬ schied der beiden Stämme deutet darauf hin, dass die geringere Wachstumsrate des Xppl-Deletionsstammes eine inhärente Eigen¬ schaft ist. Dies zeigt, dass Xppl das Wachstum in T. reesei un¬ terstützt, was wiederum darauf hindeutet, dass Xppl den Primär¬ stoffwechsel aktiviert.
Beispiel 4: Xppl reguliert die Genexpression von Polyketid- synthasen
In Fig. 6 werden die Resultate aus der RNASeq Analyse für alle PKS aufgelistet. Um den regulatorischen Einfluss von Xppl auf die Expression der korrespondierenden Gene konkreter zu un¬ tersuchen, wurden die relativen Transkriptmengen jener PKS, die laut RNASeq am stärksten reguliert werden (-1 > Änderung Log2 > +1) , mittels qPCR im Zeitverlauf bestimmt. Interessanterweise sind die am stärksten regulierten Gene kodierend für PKS (Pro¬ tein ID 73621 und 73618, Fig. 7A und 7B) nicht in der Liste der UEG vertreten, da in der Auswertung der RNASeq keine p-Werte be¬ stimmt werden konnten (Fig. 6) . Für Protein ID 65116 konnte kein Unterschied zwischen den beiden Stämmen mit dieser Methode be¬ stimmt werden (Fig. 7C) . Protein ID 65172 scheint im Xppl- Deletionsstamm früher exprimiert zu werden (Fig. 7D) . Die Metho¬ de liefert für die Proteine ID 60118 und 81964 keine klaren Re¬ sultate (Fig. 7E und 7F) . Beispiel 5: Abwesenheit von Xppl fördert die Sekretion von niedermolekularen Substanzen
Um den Einfluss von Xppl auf die globale Sekretion von nie- dermolekukaren Substanzen zu untersuchen, wurden der Xppl- Deletionsstamm, der Xppl-Überexpressionsstamm und der Wildtyp¬ stamm jeweils parallel auf U-12C- und U-13C-markierter D-Glukose kultiviert. Sämtliche niedermolekularen Substanzen aus den Über¬ stände wurden dann, wie in Bueschl C et al . (Metabolomics
10 (2014) : 754-69) beschrieben, gemessen. Diese Methode beruht da¬ rauf, dass die markierte D-Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zur Verfügung steht. Für diesen Versuch musste das Medium dem¬ entsprechend modifiziert werden. In einem Vorversuch wurden die drei Stämme in dem modifizierten Medium kultiviert und dann das Wachstum, der Verlauf der Gelbfärbung und die Expressionsraten der Gene kodierend für die PKS 73621 und 65172 gemessen. Wie in den bisherigen Versuchen wuchs der Xppl-Deletionsstamm schlech¬ ter (Fig. 8A) und sekretierte mehr von dem gelben Pigment (Fig. 8B) als der Wildtypstamm. Der Überexpressionsstamm zeigte das erwartete gegenteilige Verhalten (Fig. 8A und 8B) . Auch die Ex¬ pressionsrate des Gens kodierend für die PKS 73621 entspricht den bisherigen Versuchen und Erwartungen (Fig. 8D) . Für das Gen kodierend für die PKS 65172 konnte unter diesen Bedingungen eine erhöhte Expression im Xppl-Deletionsstamm festgestellt werden (Fig. 8D) . Für den eigentlichen Versuch wurden die niedermoleku¬ laren Substanzen in den Kulturüberständen nach 72 und 96 Stunden mittels Flüssigkeitschromatographie aufgetrennt und in einem Massenspektrometer gemessen wie in Bueschl C et al . (Metabo¬ lomics 10 (2014) : 754-69) beschrieben. Dabei wurden im Xppl- Deletionsstamm zu beiden Zeitpunkten erheblich mehr Einzelsub¬ stanzen als in den beiden anderen Stämmen gefunden (nämlich 31 nach 72 h und 91 nach 120 h, Fig. 9) . Im Überexpressionsstamm wurden dazu passend erheblich weniger Substanzen als in den bei¬ den anderen Stämmen gefunden (nämlich 43 nach 72 h und 127 nach 120 h, Fig. 9) .
Beispiel 6: In einer Reihe von Ascomyceten finden sich Or¬ tholöge von Xppl
Um Orthologe von Xppl zu identifizieren wurden eine BLAST Analyse durchgeführt. Die dabei gefundenen Proteine wurden in ein Cladogramm eingetragen (Fig. 10) . Orthologe finden sich u.a. auch in dem biokontrollaktiven Pilz Trichoderma atroviride, dem Pflanzen-pathogen Fusarium graminearum, und dem pharmazeutisch interessantem Ergotpilz Claviceps purpurea mit E-Werten von 0.0, 2e-70 und 8e-71 beziehungsweise Sequenzähnlichkeiten von 86%, 60% und 55%. Ein „Multiple Alignment" ergibt zwei hoch konser¬ vierte Bereiche: einen C-terminal um die DNA-Bindungsdomäne (A394 - C505) und einen zweiten im Mittelteil (K120 - G337), oh¬ ne Funktionsvorhersage.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Herstellung mindestens eines Sekundärmetaboli- ten in einer genetisch modifizierten Pilzzelle, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass das Verfahren das Kultivieren einer genetisch mo¬ difizierten Pilzzelle umfasst, die in der Lage ist, den mindes¬ tens einen Sekundärmetaboliten zu produzieren, wobei die unmodi- fizierte Pilzzelle mindestens ein Gen kodierend für mindestens ein Polypeptid umfasst, das mindestens zwei Motive ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3), KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFDPRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Vari¬ anten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, wo¬ bei Xi V oder I, X2 D oder V, X3 V oder I, X4 T oder A, X5 V oder
1. X6 eine beliebige Aminosäure und X7 R oder K ist, und die Ex¬ pression dieses Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilz¬ zelle im Vergleich mit der unmodifizierten Pilzzelle reduziert ist und/oder das Polypeptid in der genetisch modifizierten Pilz¬ zelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle mindestens eine Mutation umfasst, wodurch die Bildung des mindestens einen Se¬ kundärmetaboliten in der genetisch modifizierten Pilzzelle im Vergleich zur unmodifizierten Pilzzelle erhöht ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Polypeptid mindestens ein weiteres Motiv ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen
GSX8X9IDXioSXn (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLY- STPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9), GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11),
PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEKMAQLES I STSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst, wobei X8 F oder Y, X9 D oder E, X10 F oder Y, Xn R oder K, X12 S oder T, X13 V, I oder L, X 4 R oder K, X 5 I oder L, Xig eine beliebige Amino¬ säure, Χχ7 R oder K, Xig S oder T, X 9 A oder P, X2o L oder M und X21 eine beliebige Aminosäure ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid einen Bereich aufweist, der mindestens 60% ident, vorzugsweise mindestens 70% ident, noch mehr bevorzugt mindestens 80% ident, mit den Aminosäureresten 118 bis 157 und/oder 394 bis 494 der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass das Polypeptid mindestens 60% ident, vorzugsweise mindestens 70% ident, noch mehr bevorzugt mindestens 80% ident, mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die mindestens eine Mutation eine Deletion, Sub¬ stitution oder Insertion mindestens eines Aminosäurerests ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass das Polypeptid mindestens eine Mutation in min¬ destens einem Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen AHNDX1ERKYRTNLKX2KI (SEQ ID Nr. 3),
KX3SKGX4X5LX6KATEYI (SEQ ID Nr. 4), RX7LQAF (SEQ ID Nr. 5), LFD- PRGFC (SEQ ID Nr. 6) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass das Polypeptid mindestens eine Mutation in min¬ destens einem Motiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen GSX8X9IDXi0SXii (SEQ ID Nr. 7), PGLGX12GX13Y (SEQ ID Nr. 8), REGLYSTPLSWEX14PQPGX15RMD (SEQ ID Nr. 9),
GRAPQLSQQQXi6QQQQQQ (SEQ ID Nr. 10), PPPEVPPXi7EGLYSTPLXi8WE (SEQ ID Nr. 11), PSTEX19QSSRSLYSTPSX20GWE (SEQ ID Nr. 12), TKAKPGEK- MAQLESISTSQQPLD (SEQ ID Nr. 13), ALENSAQGX21DKFQPG (SEQ ID Nr. 14) und Varianten davon mit einer Identität von mindestens 60% umfasst .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Reduktion der Expression des Polypeptids in der genetisch modifizierten Pilzzelle durch Modifikation des Gens oder Teilen davon erzielt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Promoter des Gens oder der das Polypeptid kodierende Bereich des Gens mutiert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mutation des Promoters eine Deletion, Insertion oder Substituti¬ on mindestens eines Nukleotids ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Pilzzelle eine Pilzzelle der Klasse der
Sordariomycetes , insbesondere der Familie Hypocreaceae, Clavici- pitaceae, Glomerellaceae oder Nectriaceae ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Pilzzelle eine Pilzzelle der Gattung Tricho- derma, Claviceps, Colletotrichum oder Fusarium ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die Pilzzelle ausgewählt ist aus der Gruppe be¬ stehend aus Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Tricho- derma virens, Trichoderma atroviride, Tolypocladium ophio- glossoides, Ophiocordyceps unilateralis, Hirsuteila minnesoten- sis, Metarhizium robertsii, Metarhizium anisopliae, Metarhizium majus, Neonectria ditissima, Nectria haematococca, Villosiclava virens, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum graminicola, Claviceps purpurea, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Fusarium avenaceum, Col¬ letotrichum gloeosporioides, Fusarium langsethiae, Fusarium pseudograminearum, Fusarium graminearum, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporum, Verticillium longisporum, Fusarium verticil- lioides, Colletotrichum orbiculare, Thielaviopsis punctulata, Madurella mycetomatis, Verticillium dahlia, Phaeoacremonium mi- nimum, Thielavia terrestris, Magnaporthe oryzae, Neurospora tet- rasperma, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Metar¬ hizium acridum, Magnaporthiopsis poae, Sordaria macrospora, Po- dospora anserine, Metarhizium guizhouense, Chaetomium globosum, Metarhizium brunneum, Gaeumannomyces graminis, Sporothrix schenckii, Sporothrix brasiliensis, Ophiostoma piceae, Colle- totrichum higginsianum, Metarhizium album und Diaporthe ampeli- na .
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass der mindestens eine Sekundärmetabolit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyketiden, Alkaloiden, Terpe- nen, Melaninen, Pteridinen, Phenylpropanoiden, Flavonoiden, und nichtribosomalen Peptiden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die genetisch modifizierte Pilzzelle mindestens ein Nukleinsäuremolekül kodierend für mindestens ein heterologes Protein umfasst.
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