CN113406253A - 一种苯丙烷代谢途径代谢物的液质联用分析方法及应用 - Google Patents
一种苯丙烷代谢途径代谢物的液质联用分析方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生化代谢分析领域，具体而言就是依据苯丙（烯）酸类、香豆素类和黄酮类（统称为苯丙烷类）代谢物在体内合成过程中具有前后对应关系，因此其含量变化有相关性，通过定量检测这些代谢物含量变化，分析苯丙烷类化合物在有机体内的代谢趋势。本发明使用液相色谱‑电喷雾电离‑质谱联用技术建立了103个苯丙烷类（包括62个同分异构体）代谢物定性鉴定和定量分析方法，并在银杏、大豆等有机体中进行了分析应用。本发明的目的是通过建立灵敏度高、定性准确、操作简单的检测方法，分析苯丙烷类代谢途径的变化趋势，为研究生物代谢过程提供新思路新方法。
Description
技术领域
本发明涉及生化代谢分析领域，具体而言就是利用苯丙素类与黄酮类代谢物因生物合成关系造成的结构相似性,通过定量检测有相同取代基结构的苯丙(烯)酸类、香豆素类与黄酮类代谢物含量变化确定苯丙烷类代谢途径的变化趋势，为研究生物代谢过程提供新思路新方法。
背景技术
苯丙素类(phenylpropanoids)是一类含有一个或几个C6-C3为基本单位的化合物，包括苯丙烯类、苯丙醇类、苯丙(烯)酸及其缩酯类、香豆素类、木脂素类、黄酮类、木质素等。这类化合物在植物生长调节及抗御病害侵袭等生命过程中发挥重要作用。香豆素(coumarin)最早从豆科植物香豆中分离得到，并具有芳香气味，故名香豆素。它由苯丙素类在生物体内衍生而来，从结构上看，它的母核是顺式邻羟基桂皮酸内酯化形成的。香豆素以游离或糖苷形式广泛分布于植物界，它们在植物体内起着植物激素的作用或作为植物收到外来侵害时的应激素。从广义上讲，黄酮类(flavonoids)化合物属于苯丙素类，因为其C6-C3-C6骨架来源于苯丙素类的C6-C3骨架。它是植物中分布最广的一类次生代谢物，除了形成花色外，对调节其生长发育和抵御异物入侵也有重要作用。C6-C3-C6骨架是黄酮类的基本母核，根据C3部分的成环、氧化和取代方式的差异，可以分为二氢黄酮类(flavanones)、黄酮类(flavones)、二氢黄酮醇(flavanonols)、黄酮醇(flavonols)、异黄酮(isoflavones)、黄烷醇(flavanols)、花色素(anthocyans)以及双黄酮(biflavones)等，骨架上的甲基、羟基或甲氧基取代进一步丰富了黄酮物质的结构多样性。苯丙烷类代谢代谢途径存在于所有陆地生物中，因此研究其代谢过程具有重要的理论及应用价值。
目前已知苯丙烷类代谢物的生物合成过程来源于桂皮酸途径(cinnamic acidpathway)：由莽草酸形成的苯丙氨酸和酪氨酸，经脱氨、氧化等反应生成桂皮酸，再由桂皮酸经氧化、甲基化、还原等反应转化生成具有C6-C3骨架的苯丙素类和C6-C3-C6骨架的黄酮类(图1)。因此黄酮类与苯丙烯酸、香豆素等苯丙素类在生物合成上具有密切关系，同位素示踪实验已经证明黄酮类分子中的A环中的C6结构由三个乙酰-CoA分子头尾相接合成，B环和C环的C6-C3结构则来自桂皮酸途径形成的苯丙烯酸类。基于以上实验事实，具有相同羟基、甲氧基等取代基的苯丙烷类代谢物很可能来源于同一条合成途径，因此含量变化具有相关性。
本发明利用上述理论基础，特异检测具有相同取代基的不同类代谢物，通过比较含量差异监测特定条件下的苯丙烷类代谢途径代谢趋势，为代谢分析提供依据。由于苯丙烷类化合物结构相似，同分异构体多，造成目前常用的检测方法定性可靠度低，检测灵敏度较弱。本发明使用液相色谱-电喷雾电离-质谱联用技术进行代谢物的定性定量检测：利用特异子母离子配对及其它们的保留时间做参数对代谢物特别是结构性质相近的同分异构体进行准确定性鉴定，提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点；同时根据特异子离子的丰度对代谢物进行定量检测，极大提高了检测灵敏度，另外本方法无需同位素示踪来分析同一代谢途径的代谢趋势，操作简单，适用性广泛。
发明内容
本发明旨在通过检测苯丙烷代谢途径中具有合成关系的代谢物含量变化，建立研究苯丙烷类代谢趋势的方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
(1)所述的苯丙烷代谢途径中具有合成关系的代谢物，其特征在于：包括18个苯丙烯酸类、苯丙酸类；85个香豆素类、二氢黄酮类、黄酮类、异黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮醇类、黄烷醇类、双黄酮类等共103个，其中包括62个同分异构体，其结构特点以苯环上的羟基或甲氧基取代基做纵向分类标准，以骨架连接特点形成的化合物种类做横向分类标准，建立苯丙烷类代谢物结构周期表(图2)。
(2)所述的苯丙烷代谢途径中代谢物定性定量检测，其特征在于：使用液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆质谱联用技术，仪器配置为：超高效液相色谱作为分离系统；电喷雾电离系统作为离子源；三重四级杆质谱仪作为检测器。
(3)所述的85个香豆素类、二氢黄酮类、黄酮类、异黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮醇类、黄烷醇类、双黄酮类等代谢物的定性定量检测，其特征在于：(-)使用液相色谱分离系统的具体参数如下：①色谱柱型号是
BEH C18 2.5μm 3.0×150mm XP；②流动相为含有0.01％甲酸的甲醇(A)和含有0.01％甲酸的水溶液(B)；③梯度洗脱程序为10％A(0min),30％A(5min),30％A(8min)，50％A(18min)，50％A(25min)，70％A(29min)，100％A(33min)，10％A(34min)，10％A(37min)停止；流速为0.4ml/min；④进样量1-5μl；⑤柱温40℃。(二)使用电喷雾电离系统的具体参数如下：①氮气温度(Gas Temp)350℃；②气体流速(Gas Flow)10L/min；③喷雾气压(Nebulizer)40psi；④毛细管电压(Capillary)+4000V。(三)使用三重四极杆质谱检测系统的多反应检测模式(Multiple reaction Model,MRM)对每一个代谢物设立检测参数如下：①保留时间(Retention Time)；②母离子(PrecursorIon)，③子离子(Production Ion)，④驱离电压(Fragmentor)，⑤碰撞电压(CollisionEnergy)，⑥检测极性(Polarity)，⑦驻留时间(Dwell)。具体参数值见表1，图3。
(4)所述的85个香豆素类、二氢黄酮类、黄酮类、异黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮醇类、黄烷醇类、双黄酮类等代谢物的定性定量检测，其特征在于：(一)使用液相色谱分离系统的具体参数如下：①色谱柱型号是
BEH C18 2.5μm 3.0×150mm XP；②流动相为乙腈(A)和含有0.01％甲酸的水溶液(B)；③梯度洗脱程序为10％A(0min),30％A(5min),30％A(8min)，50％A(18min)，50％A(25min)，70％A(29min)，100％A(30min)，10％A(32min)，10％A(35.5min)停止；流速为0.4ml/min；④进样量1-5μl；⑤柱温40℃。(二)使用电喷雾电离系统的具体参数如下：①氮气温度(Gas Temp)350℃；②气体流速(Gas Flow)10L/min；③喷雾气压(Nebulizer)45psi；④毛细管电压(Capillary)+4000V。(三)使用三重四极杆质谱检测系统的多反应检测模式(Multiple reaction Model，MRM)对每一个代谢物设立检测参数如下：①保留时间(Retention Time)；②母离子(Precursor Ion)，③子离子(Production Ion)，④驱离电压(Fragmentor)，⑤碰撞电压(Collision Energy)，⑥检测极性(Polarity)，⑦驻留时间(Dwell)具体参数值见表2，图4。
(5)所述的18个苯丙烯酸类、苯丙酸类等代谢物的定性定量检测，其特征在于：(一)使用液相色谱分离系统的具体参数如下：①色谱柱型号是
BEH C18 2.5μm3.0×150mm XP；②流动相为甲醇(A)和含有5mM甲酸铵和0.05％甲酸的水溶液(B)；③梯度洗脱程序为5％A(0min),5％A(1min),30％A(5min)，30％A(6min)，100％A(9min)，100％A(12min)，5％A(12.5min)，5％A(15.5min)停止；流速为0.4ml/min；④进样量1-5μl；⑤柱温40℃。(二)使用电喷雾电离系统的具体参数如下：氮气温度(Gas Temp)350℃；气体流速(Gas Flow)10L/min；喷雾气压(Nebulizer)40psi；毛细管电压(Capillary)-4000V。(三)使用三重四极杆质谱检测系统的多反应检测模式(Multiple reaction Model,MRM)对每一个代谢物设立检测参数如下：①保留时间(Retention Time)；②母离子(Precursor Ion)，③子离子(Production Ion)，④驱离电压(Fragmentor)，⑤碰撞电压(Collision Energy)，⑥检测极性(Polarity)，⑦驻留时间(Dwell)具体参数值见表3，图5。
本发明具有的优点：
具有相同羟基、甲氧基等取代基的苯丙烷类代谢物很可能来源于同一条合成途径，因此含量变化有相关性。本发明利用上述理论基础，特异检测具有相同取代基的不同类代谢物，通过比较含量差异监测特定条件下的苯丙烷类代谢途径代谢趋势，为代谢分析提供依据。由于苯丙烷类化合物结构相似，同分异构体多，造成目前常用的检测方法定性可靠度低，检测灵敏度较弱。本发明使用液相色谱-电喷雾电离-质谱联用技术进行代谢物的定性定量检测：利用特异子母离子配对及其它们的保留时间做参数对代谢物特别是结构性质相近的同分异构体进行准确定性鉴定，提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点；同时根据特异子离子的丰度对代谢物进行定量检测，极大提高了检测灵敏度，另外无需同位素示踪，操作简单，适用性广泛。
附图(表)说明
图1桂皮酸途径中苯丙素类及黄酮类代谢物的生物合成过程示意图
图2待分析的苯丙烷类化合物结构周期图
图3技术方案(3)中85个代谢物在甲醇(0.01％甲酸)/水(0.01％甲酸)做流动相以MRM正离子模式检测条件下的质谱图。其中A代表58个同分异构体质谱图，B代表27个非同分异构体质谱图。
图4技术方案(4)中85个代谢物在乙腈/水(0.01％甲酸)做流动相以MRM正离子模式检测条件下的质谱图。其中A代表58个同分异构体质谱图，B代表27个非同分异构体质谱图。
图5技术方案(5)中18个代谢物在甲醇/水(5mM甲酸铵，0.05％甲酸)做流动相以MRM负离子模式检测条件下的质谱图。
图6银杏叶片中的苯丙烷代谢途径在一年中的含量变化趋势热图。
图7大豆叶片受到盐和旱胁迫时苯丙烷类代谢途径的变化趋势热图。
表1技术方案(3)中85个代谢物的多反应检测模式分析参数值。
表2技术方案(4)中85个代谢物的多反应检测模式分析参数值。
表3技术方案(5)中18个代谢物的多反应检测模式分析参数值。
具体实施方式
下面结合附图(表)和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明以权力要求书2中所述的代谢物为目标进行分析，但是鉴于天然产物研究不断更新，新的符合权力要求书中所述特征的化合物被不断发掘出来，本发明保留继续增加符合要求的新代谢物以提高分析精准度的权利。本发明实例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1一种苯丙烷类代谢物的液质联用分析方法的建立：
1、根据苯丙烷类代谢途径的合成顺序，确定需要分析的具有前后对应关系的代谢物类别：为了确定需要分析的代谢物种类，以合成过程中苯环上的羟基或甲氧基取代集团做纵向分类标准，以骨架连接特点形成的化合物种类做横向分类标准，建立苯丙烷类代谢物结构周期表(图2)，共找到103种代谢物用于分析。
2、根据代谢物的结构特点，使用液质分析方法的多反应检测模式确定它们的分析参数：
本发明使用安捷伦1290 Infinity做液相分离系统，安捷伦6430A做质谱检测仪，
BEH C18 2.5μm 3.0×150mm XP做色谱分离柱，用标准品对每个化合物的分析参数进行确定，具体参数值见表1，2，3。103个代谢物中85个采用正离子检测模式分析(表1，2分别采用不同的流动相和洗脱程序，详见技术方案3，4)，18个采用负离子检测模式(表3，详见技术方案5)。
实施例2银杏叶片中的苯丙烷代谢途径在一年中的含量变化趋势分析：
1、制备分析样品
(1)取不同月份待测银杏叶片(-80℃保存)200mg，液氮条件下充分研磨；(2)加入1ml 80％甲醇利用超声波辅助萃取15min，温度45℃；(3)12000g离心5min，取上清提取液；(4)向沉淀再加入1ml 80％甲醇重复上述操作两次；(5)合并三次提取液，将提取液利用氮吹仪或者真空离心仪将提取液浓缩挥发至无明显液体；(6)加入80％甲醇定容至1ml，利用0.22μm有机滤膜过滤除杂。
2、样品上机分析，获取分析数据
样品分两次分析过程：正离子模式分析85个代谢物；负离子模式分析18个代谢物。(1)首先获得85个代谢物在样品中含量数据：①按技术方案(3)配好相应流动相并设置好检测参数；②配置不同浓度的标准品同样品一起分析；(2)其次获得18个代谢物在样品中的含量数据：①按技术方案(5)配好流动相并设置好检测参数；②配置不同浓度的标准品同样品一起分析。
3、样品数据分析
对标准品及样品的数据文件使用MassHunter Workstation软件分析：根据标准品的保留时间与子离子种类对样品质谱峰进行定性；根据标准品的定量离子丰度对样品检测到的代谢物进行定量；制作代谢物含量按时间顺序变化热图；按图2中的结构把不同代谢物变化热图汇聚在一起；根据横向和纵向趋势观察银杏叶片中苯丙烷类代谢途径在一年内的变化规律(图6)。
实施例3大豆叶片受到非生物胁迫时苯丙烷类代谢途径的变化趋势分析：
1、制备分析样品
(1)取经过盐处理和干旱处理的待测大豆叶片(-80℃保存)200mg，液氮条件下充分研磨；(2)加入1ml 80％甲醇利用超声波辅助萃取15min，温度45℃；(3)12000g离心5min，取上清提取液；(4)向沉淀再加入1ml 80％甲醇重复上述操作两次；(5)合并三次提取液，将提取液利用氮吹仪或者真空离心仪将提取液浓缩挥发至无明显液体；(6)加入80％甲醇定容至1ml，利用0.22μm有机滤膜过滤除杂。
2、样品上机分析，获取分析数据
样品分两次分析过程：正离子模式分析85个代谢物；负离子模式分析18个代谢物。(1)首先获得85个代谢物在样品中含量数据：①按技术方案(3)配好相应流动相并设置好检测参数；②配置不同浓度的标准品同样品一起分析；(2)其次获得18个代谢物在样品中的含量数据：①按技术方案(5)配好流动相并设置好检测参数；②配置不同浓度的标准品同样品一起分析。
3、样品数据分析
对标准品及样品的数据文件使用MassHunter Workstation软件分析：根据标准品的保留时间与子离子种类对样品质谱峰进行定性；根据标准品的定量离子丰度对样品检测到的代谢物进行定量；制作代谢物含量按不同处理变化热图；按图2中的结构把不同代谢物变化热图汇聚在一起；根据横向和纵向趋势观察大豆叶片中苯丙烷类代谢途径在经过盐胁迫和干旱胁迫后的变化规律(图7)。
表1.技术方案(3)中85个代谢物的正离子多反应检测模式分析参数值
表2.技术方案(4)中85个代谢物的正离子多反应检测模式分析参数值
表3.技术方案(5)中18个代谢物的负离子多反应检测模式分析参数值
Claims (6)
1.一种苯丙烷类代谢物的液质联用分析方法。
2.按权利要求1所述苯丙烷类化合物的分析，其特征在于：所述的代谢物包括苯丙（烯）酸类、香豆素类、黄酮类、异黄酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮醇类、黄烷醇类、双黄酮类共103个。
3.按权利要求1所述的液质联用分析方法，其特征在于：使用液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆质谱联用技术，以母离子与子离子种类及它们的保留时间作为定性依据，以特定子离子的丰度作为定量依据。
4.一种按权利要求1所述的苯丙烷类代谢物分析的应用，其特征在于：分析苯丙烷类代谢物在拥有苯丙烷代谢途径有机体内的变化趋势。
5.一种按权利要求4所述的苯丙烷类代谢物分析应用举例，其特征在于：分析银杏叶片中的苯丙烷代谢途径在一年中的含量变化趋势。
6.一种按权利要求4所述的苯丙烷类代谢物分析应用举例，其特征在于：分析大豆叶片受到盐和旱胁迫时苯丙烷类代谢途径的变化趋势。
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