WO2017038993A1 - トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 - Google Patents

トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2017038993A1
WO2017038993A1 PCT/JP2016/075875 JP2016075875W WO2017038993A1 WO 2017038993 A1 WO2017038993 A1 WO 2017038993A1 JP 2016075875 W JP2016075875 W JP 2016075875W WO 2017038993 A1 WO2017038993 A1 WO 2017038993A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
strain
tag
genetically modified
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2016/075875
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
原山　重明
曜子 井出
阿部　淳
笠井　由紀
憲秀 藏野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denso Corp
Chuo University
Original Assignee
Denso Corp
Chuo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denso Corp, Chuo University filed Critical Denso Corp
Priority to AU2016317623A priority Critical patent/AU2016317623B2/en
Priority to US15/756,233 priority patent/US10370687B2/en
Publication of WO2017038993A1 publication Critical patent/WO2017038993A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)

Definitions

  • TAG triacylglycerol
  • ⁇ microalgae '' unicellular photosynthetic organisms
  • ⁇ lipids '' compounds such as TAG that liberates fatty acids by hydrolysis
  • ⁇ lipids '' compounds such as TAG that liberates fatty acids by hydrolysis
  • microalgae accumulate a part of the assimilation products generated by photosynthesis as starch or TAG.
  • the accumulated amount of starch and TAG varies depending on the type of microalgae, and also varies depending on the culture conditions in the same organism.
  • the rate at which photosynthetic assimilation products are converted to starch and TAG differs from the rate at which the storage material once synthesized is degraded, depending on the species and culture conditions, and this is the difference in the accumulated amount of starch and TAG. It seems to appear.
  • TAG raw materials are glycerol-3-phosphate and fatty acid.
  • Glycerol-3-phosphate is synthesized by glycerol kinase using glycerol and ATP as substrates.
  • fatty acids are biosynthesized in the chloroplast.
  • the first reaction of fatty acid biosynthesis is catalyzed by acyl-CoA carboxylase to produce malonyl-CoA from acetyl-CoA.
  • Malonyl CoA reacts with acyl carrier protein (ACP) to form malonyl ACP.
  • ACP acyl carrier protein
  • Palmitic acid binds to CoA to form palmityl CoA, which moves from the chloroplast to the endoplasmic reticulum. Palmityl CoA is also produced by CoA ester of oleic acid (oleyl CoA: C18: 1), which is a monounsaturated fatty acid, by the action of long-chain fatty acid elongation enzymes (very long fatty acid elongase) and desaturase (fatty acid desaturase). It is done. Palmitic acid and oleic acid are the highest content fatty acids in many organisms.
  • TAG biosynthesis is performed on the endoplasmic reticulum membrane.
  • an acyl group of acyl CoA is added to the sn-1 position of glycerol-3-phosphate by glycerol-3-phosphate acyltransferase to produce lysophosphatidic acid To do.
  • the acyl group of acyl CoA is added to the sn-2 position of lysophosphatidic acid by lysophosphatidic acid acyltransferase to produce phosphatidic acid.
  • DGAT diacylglycerol acyltransferase
  • TAG productivity the amount of TAG produced per unit time and light-receiving area of microalgae
  • Patent Document 2 encodes DGAT, phospholipid: diacylglycerol acyltransferase or phosphatidic acid phosphatase in Nannochloropsis belonging to Heteromonyphyta and Eustigmataceae. To increase the TGA content. However, in the said patent document, the detail of the effect of these gene transfer is not shown by the Example.
  • Chlamydomonas reinhardtii which belongs to the green plant subfamily and green algae plant gate (Chlorophyta: hereinafter referred to as “green algae”), has a plurality of DGAT2 genes (homologous genes). No increase in lipid content was observed even with high expression. On the other hand, when one of Chlamydomonas DGAT2 homologous genes was expressed in yeast, the yeast transformant showed higher TAG productivity than the wild-type yeast (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 5 A gene encoding glycerol-3-phosphate acyltransferase, the first enzyme in the Kennedy pathway for TGA synthesis, was isolated from Lobosphaera incisa, a green alga, and introduced and expressed in Chlamydomonas. Productivity has increased significantly (Non-patent Document 5).
  • glycerol kinase which synthesizes glycerol-3-phosphate, which is a substrate of the above-mentioned glycerol-3-phosphate acyltransferase, is highly expressed in the diatom Fisturira (solaris) JPCC DA0580 strain to produce TAG Slightly increased but increased (Non-patent Document 6).
  • the acyl ACP thioesterase gene is used to promote the synthesis of rather short fatty acids (C10, C12 and C14) rather than fatty acids with a typical carbon chain length (C16 and C18).
  • Lipids containing fatty acids such as C10 and C12 accumulate in the seeds of the camphoraceae plant Umbellularia ⁇ ⁇ californica, which is due to acyl ACP thioesterase that hydrolyzes the acyl ACP with C12 carbon chain of this plant. Has been revealed.
  • the cDNA of U When the cDNA of U.
  • Non-patent Document 8 californica acyl ACP thioesterase gene, which has a substrate specificity of hydrolyzing a slightly shorter fatty acid, was introduced into Escherichia coli and expressed highly, free fatty acids of C12 and C14 were synthesized and extracellular.
  • Patent Document 6 Pseudococcomyxa sp. KJ strain (hereinafter referred to as ⁇ KJ strain '') belonging to the class of green and trebouxiophyceae is a unicellular green algae with very high TAG productivity isolated from hot spring water. (Patent Document 6) and can be cultured in an open culture system shown in Patent Document 7.
  • the KJ strain is a strain suitable for large-scale cultivation outdoors, and can be said to be one of the most promising strains as a raw material for the commercial production of lipids.
  • it has been desired to further improve the TAG productivity and reduce the TAG production cost.
  • the present invention has an object to provide a TAG production method using eukaryotic microalgae genetically modified strains produced by genetic manipulation of eukaryotic microalgae including the KJ strain with improved TAG productivity. To do.
  • the present invention includes the following.
  • the eukaryotic microalgae genetically modified strain which is a protein having an amino acid sequence having at least 50% sequence identity with and having alpha glycosidase activity.
  • a TAG production method comprising a step of culturing the eukaryotic microalgae genetically modified strain of any one of (1) to (8).
  • the present invention makes it possible to produce a eukaryotic microalgae genetically modified strain with improved TAG productivity.
  • culturing the eukaryotic microalgae genetically modified strain according to the present invention it is possible to significantly reduce the production cost of lipids used for biofuels and the like.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structures of pAGL1, pFAT1, pDGAT2d and pble-PeEGFP-T1A plasmids.
  • the KJoxDGAT2d-5822 strain with the KJDGAT2d cDNA expression cassette introduced into the KJ strain and the KJ strain, the KJoxFAT1-325 strain with the KJFAT1 cDNA expression cassette introduced into the KJ strain, and the KJoxFD-2264 strain with the KJDGAT2d cDNA expression cassette introduced into the KJoxFAT1-325 strain It is a graph which shows the average value of TAG content rate (% DW) per cell dry weight, and a standard error (n
  • 3).
  • a FAT1 gene and / or a DGAT2 gene is further introduced into a wild-type eukaryotic algal strain or a mutant derived from the wild strain (hereinafter referred to as a strain to be transfected).
  • a strain to be transfected a wild-type eukaryotic algal strain or a mutant derived from the wild strain.
  • TAG productivity of eukaryotic microalgae One of the most important issues to reduce the production cost of biofuels using TAG derived from eukaryotic microalgae is the significant improvement of TAG productivity of eukaryotic microalgae.
  • the present inventors have found that the TAG productivity of this green algae can be greatly improved by highly expressing the gene encoding the AGL1 protein, FAT1 protein and / or DGAT2 protein derived from the KJ strain in the KJ strain. It came to complete.
  • the FAT1 gene and / or the DGAT2 gene are highly expressed.
  • the TAG productivity of eukaryotic microalgae and cultivating the TAG productivity-enhanced strain, the production cost of TAG used for biofuel and the like can be greatly reduced.
  • examples of the eukaryotic microalgae include eukaryotic microalgae belonging to green algae, diatoms (diatom or Bacillariophyceae), true eye-point algae (Eustigmatophyceae), and the like.
  • green algae examples include green algae belonging to the Treboxia algae network.
  • examples of green algae belonging to the treboxya algae network include, for example, the genus Trebouxia, Chlorella, Botryococcus, Choricystis, Coccomyxa, and Pseudococy.
  • Green algae belonging to Specific strains belonging to the treboxya algae include the KJ strain. KJ Co., Ltd. was established on June 4, 2013 (NITE-IPOD), the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE-IPOD), 2-5 Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan. No. -8 ⁇ 120) was deposited under the accession number FERM P-22254 and transferred to the international deposit under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-22254.
  • examples of diatoms include eukaryotic microalgae belonging to the genus Fistulifera, Feodactilam, Thalassiosira, Cyclotella, Cylindrothica, Skeletonema, etc. be able to.
  • examples of the true eye point algae include the genus Nannochloropsis.
  • the eukaryotic microalgae-modified strain according to the present invention can be obtained by highly expressing the gene according to the present invention using the above-described eukaryotic microalgae as a parent strain.
  • examples of the AGL1 gene include an AGL1 gene derived from the KJ strain (gene base sequence: SEQ ID NO: 1, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 2, amino acid sequence: SEQ ID NO: 3) or a homologue thereof.
  • the AGL1 gene includes at least 50%, preferably at least 50%, preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (that is, a highly conserved amino acid sequence corresponding to the 215th to 783rd amino acid sequence in SEQ ID NO: 3).
  • a protein having an amino acid sequence with at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, 100% sequence identity and having alpha-glycosidase activity A gene coding for.
  • the AGL1 gene includes at least 50%, preferably at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the alpha glycosidase activity means an enzyme activity that hydrolyzes starch from the non-reducing end and cuts out D-glucose.
  • the FAT1 gene examples include the FAT1 gene derived from the KJ strain (gene base sequence: SEQ ID NO: 5, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 6, amino acid sequence: SEQ ID NO: 7) or a homologue thereof.
  • the FAT1 gene includes an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (that is, a highly conserved amino acid sequence corresponding to the 78th to 283rd amino acid sequence in SEQ ID NO: 7) and at least 50%, preferably Have an amino acid sequence with at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, 100% sequence identity and have acyl ACP thioesterase activity
  • Examples include genes encoding proteins.
  • the FAT1 gene includes at least 50%, preferably at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • Examples thereof include a gene encoding a protein having an amino acid sequence having 100% sequence identity and having acyl ACP thioesterase activity.
  • the acyl ACP thioesterase activity means an enzyme activity that hydrolyzes the thioester bond of acyl-ACP.
  • Examples of the DGAT2 gene include a DGAT2d gene derived from the KJ strain (gene base sequence: SEQ ID NO: 9, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 10, amino acid sequence: SEQ ID NO: 11) or a homologue thereof.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 that is, a highly conserved amino acid sequence corresponding to the 123rd to 322rd amino acid sequence in SEQ ID NO: 11
  • at least 50% preferably Having an amino acid sequence with at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, 100% sequence identity and having diacylglycerol acyltransferase activity
  • the DGAT2 gene is at least 50%, preferably at least 65%, particularly preferably at least 80%, most preferably at least 85%, at least 90%, at least 95% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • Examples thereof include a gene encoding a protein having an amino acid sequence having 100% sequence identity and having diacylglycerol acyltransferase activity.
  • the diacylglycerol acyltransferase activity means an enzyme activity in which an acyl group derived from acyl CoA is added to diacylglycerol and TAG is synthesized.
  • the gene according to the present invention may be derived, for example, from a strain belonging to the green algae described above, preferably a strain belonging to the Treboxya algae, and particularly preferably a strain belonging to the genus Kokomixa or Pseudococcus.
  • AGL1 gene, FAT1 gene and DGAT2 gene are highly expressed.
  • the most common method is to test a construct that is operably linked to a gene to be highly expressed (e.g., upstream of the gene) with a promoter that ensures high gene expression (constitutively highly expressed promoter). It is a method of constructing in a tube and introducing it into a host. Depending on the purpose, promoters of different strength and properties (constitutive or inducible) can be used.
  • the mRNA precursor After transcription, the mRNA precursor undergoes post-transcriptional modifications such as capping, splicing, and poly (A) addition, and then moves from the nucleus to the cytoplasm. Attempts to increase the efficiency of this post-transcriptional modification and highly express the gene have not been made as much as the use of promoters.
  • post-transcriptional modifications such as capping, splicing, and poly (A) addition
  • the efficiency of translation initiation is influenced by the sequence upstream of the initiation codon (5'-UTR) (Kim et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42, 485). It is possible to improve.
  • techniques for achieving high expression by optimizing the codon usage of mRNA are widely used. That is, a codon-optimized gene can be produced in vitro and introduced into a host to increase the amount of protein to be translated.
  • the gene according to the present invention of KJ strain is induced by nitrogen deficiency or salt stress. This induction is considered to be controlled by a transcription factor that positively or negatively regulates the expression of the gene.
  • a transcription factor that positively or negatively regulates the expression of the gene.
  • high expression of the gene according to the present invention using this mechanism can be achieved.
  • the target gene when a gene to be highly expressed is positively controlled by a transcription factor, the target gene can also be highly expressed by highly expressing the transcription factor.
  • a gene to be highly expressed is negatively controlled by a transcription factor, conversely, high expression of the target gene can be achieved by losing the expression or activity of the negative transcription factor. .
  • high expression of the target gene can also be achieved by manipulating a signal transduction system for activating or inactivating the transcription factor.
  • the gene according to the present invention was cloned downstream of a strong promoter (for example, the promoter of the EF1 ⁇ gene derived from the KJ strain (SEQ ID NO: 13)) and It is a method for producing a eukaryotic microalgae genetically modified strain according to the present invention by introducing it into a eukaryotic microalgae such as a strain.
  • a strong promoter for example, the promoter of the EF1 ⁇ gene derived from the KJ strain (SEQ ID NO: 13)
  • the KJoxAFD-41417 strain in which all three genes according to the present invention derived from the KJ strain shown in Examples are highly expressed in the KJ strain is Heisei.
  • NITE-IPOD National Institute of Technology and Evaluation (NITE-IPOD) (Room 2-5-8, Kazusa Kamashi, Kisarazu 292-0818, Japan) Has been deposited under the accession number FERM P-22294 and has been transferred to the international deposit under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-22294.
  • the present invention is a method for producing TAG by mass-culturing the eukaryotic microalgae genetically modified strain according to the present invention described above.
  • the mass culture method the culture method described in Patent Document 7 that has already been established can be used. Specifically, it is a method of culturing microalgae using a medium having urea as a nitrogen source and a pH of 4 or less. According to this culturing method, by using urea as the nitrogen source, fluctuations in pH due to consumption of nitrogen content are minimized. In addition, even when CO 2 is introduced into a culture solution having a pH of 4 or less, bicarbonate ions are hardly generated, so that the pH of the culture solution is hardly changed. Thus, since the pH of the culture solution can be stably maintained at 4 or less, the growth of other microalgae and protists can be suppressed.
  • a lipid containing TAG can be obtained from the culture by, for example, hexane extraction.
  • the AGL1 gene is an AGL1 gene derived from the KJ strain (gene base sequence: SEQ ID NO: 1, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 2, amino acid sequence: SEQ ID NO: 3), and the FAT1 gene is KJ Strain-derived FAT1 gene (gene base sequence: SEQ ID NO: 5, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 6, amino acid sequence: SEQ ID NO: 7), and DGAT2 gene is a DGAT2d gene (gene base sequence: SEQ ID NO: 9, mRNA base sequence: SEQ ID NO: 10, amino acid sequence: SEQ ID NO: 11).
  • Example 1 Analysis of genes involved in TAG productivity by RNA-seq
  • TAG production is promoted by adding about 100 mM NaCl to the medium under nitrogen deficient conditions or in addition to it. Can do.
  • KJ strain and the closely related Pseudochoricystis ellipsoidea Obi strain (hereinafter referred to as “Obi strain”: Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909)
  • Obi strain Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909
  • the black bar graph indicates the results when no NaCl is added
  • the white bar graph indicates the results when 100 mM NaCl is added.
  • the oil content was measured using NMR under the following conditions. The cells were harvested by centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes or longer, freeze-dried, about 40 mg was weighed, and the oil content per unit cell dry weight was measured with a model MQC oil content measuring device manufactured by Oxford Instrumets. The calibration curve was prepared using Japanese Pharmacopoeia olive oil as a standard substance.
  • amino acid sequences of enzymes involved in lipid metabolism and starch metabolism were obtained using a plant metabolic pathway database (http://www.plantcyc.org/). Using these amino acid sequences as queries, a Tblastn search is performed on the genome sequence of KJ and Obi strains or the mRNA sequence obtained by transcriptome analysis (RNA-seq) to determine lipid metabolism and starch in KJ and Obi strains. The amino acid sequence of the enzyme involved in metabolism and its gene were identified. In addition, the expression level and expression change of these genes were analyzed using RNA-seq results.
  • DGAT2d one of the synonymous genes of acyl ACP thioesterase (FAT1) gene that works in the final step of fatty acid synthesis and diacylglycerol acyltransferase (DGAT) that works in the final step of Kennedy pathway for TAG synthesis Expression was also strongly induced by NaCl addition.
  • FIG. 2 shows the expression of AGL1, FAT1, and DGAT2d genes of the KJ strain when NaCl was added at 0 and 100 mM.
  • the vertical axis of the graph is FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads).
  • the expression of FAT1 gene, DGAT2d gene, and AGL1 gene increased as the culture time passed without adding NaCl, but the expression level further increased when NaCl was added. The increase in gene expression in the absence of NaCl is probably caused by a decrease in the nitrogen concentration in the medium.
  • MA5 is composed of 18 mM NaNO 3 , 0.4 mM MgSO 4 , 60 ⁇ M CaCl 2 , 0.26 mM KH 2 PO 4 , 0.26 mM K 2 HPO 4 , 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 0.4% (v / v ) Fe solution, 0.1% (v / v) Trace elements.
  • the composition of the stock solution used for the preparation of this medium was as follows: Fe solution was 3 g / L, citric acid, 4.9 g / L ammonium iron citrate, 0.5 g / L, EDTA, and trace elements were 70 mg / L H 3 BO 3 , 150 mg / L MnSO 4 ⁇ 5H 2 O, 300 mg / L ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 300 mg / L CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 70 mg / L CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 3 mg / L Na 2 MoO 4 .
  • NaNO 3 was not added, but NaCl was added so that the concentration of Na + was the same.
  • Each of these genes encodes an enzyme that acts in the final stages of fatty acid synthesis, TAG synthesis, and starch degradation, so by expressing these genes at high levels, strains with higher TAG productivity could be obtained. We thought that it might be obtained and decided to produce a high expression strain.
  • Example 2 Preparation of AGL1 gene, FAT1 gene, DGAT2d gene cDNA high expression strain KJ strain in order to highly express cDNA of AGL1 gene, FAT1 gene, DGAT2d gene singly or simultaneously in KJ strain
  • PAGL1, pFAT1, and pDGAT2d plasmids were prepared by inserting the cDNAs of the AGL1 gene, FAT1 gene, and DGAT2d gene between the promoter and terminator of KJEF1A (FIG. 4).
  • KJEF1A pro and KJEF1A ter are sequences containing the promoter and terminator of the EF1A gene (KJEF1A) of the KJ strain, respectively.
  • KJRBCS indicates the RuBisCO small subunit gene of the KJ strain, and the first intron sequence (SEQ ID NO: 15) is inserted between the promoter and cDNA.
  • the middle part of each plasmid shows the cDNA sequence of each gene.
  • FLAG-Tag is a DNA fragment encoding a peptide sequence of N-terminal-DYKDDDDK-C-terminal.
  • ObiTub pro and ObiAct ter are sequences containing the Tubulin gene promoter and Actin gene terminator of the Obi strain, respectively (Imamura et al., 2012, J Gen Appl Microbiol, 58, 1).
  • ble is a resistance gene for bleomycin and zeomycin [trade name Zeocin TM ] (Stevens et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251, 23-30.).
  • Linker is a DNA fragment encoding a peptide sequence of N-terminal-GGSGGR-C-terminal.
  • PeEGFP is a sequence in which the codon usage frequency of EGFP (enhanced GFP: highly sensitive GFP) is optimized for expression in an Obi strain.
  • plasmids were co-introduced into the KJ strain together with the pG418-T1A plasmid (Kasai et al., 2015, Biotechnol Biofuels, 8, 94) that confers G418 resistance using particle bombardment, and G418 resistant colonies were selected.
  • Example 3 Evaluation of TAG productivity of KJAGL1 cDNA high-expressing strain
  • the expression of KJAGL1 cDNA in six transformants obtained by introducing the pAGL1 plasmid was analyzed by real time PCR.
  • TAG productivity on the 13th day of culture was about 1.3 times that of the wild strain (FIG. 5).
  • the remaining strains the TAG content was slightly increased and the starch content was slightly decreased, but the TAG productivity was almost the same as that of the wild strain.
  • the TAG productivity is the TAG production amount (%) of the transformant when the TAG production amount (g / L) of the wild strain (KJ) is 100%.
  • each strain was simultaneously cultured in 1/2 DENSO medium and sampled on the 7th day (7d) and 13th day (13d).
  • the DENSO medium has almost the same composition as the A6 medium, but the concentrations of (NH 4 ) 2 SO 4 and (NH 2 ) 2 CO are 863 ⁇ M and 2.38 mM, respectively.
  • 1/2 DENSO medium is obtained by diluting DENSO medium twice with distilled water.
  • TAG productivity was evaluated for 18 transformants obtained by introducing the pFAT1 plasmid.
  • TAG productivity was about 1.2 on the 7th day of culture. It increased to 1.3 times and increased to about 1.1 to 1.2 times on the 14th day (Fig. 6).
  • a decrease in starch was observed at the same time as an increase in TAG, so it was considered that an increase in TAG due to introduction of the pFAT1 plasmid was accompanied by a decrease in starch (FIG. 6).
  • each strain was simultaneously cultured in 1/2 DENSO medium and sampled on day 7 (7d) and day 14 (14d).
  • Example 6 Preparation of a strain in which multiple cDNAs are simultaneously highly expressed Among the pFAT1 plasmid transformants, the pDGAT2d plasmid and pble-PeEGFP were transformed into the KJoxFAT1-325 strain (Fig. 6) that had the highest TAG productivity on the 7th day. -T1A plasmid was co-introduced to select 228 Zeo resistant colonies. When the insertion of the KJDGAT2d cDNA expression cassette was analyzed by PCR, it was confirmed that the full length of the KJDGAT2d cDNA expression cassette was inserted in 13 strains (5.7%).
  • transformants (AGL1 & FAT1, AGL1 &) that combine three gene cDNAs in four ways DGAT2d, FAT1 and DGAT2d, AGL1 and FAT1 and DGAT2d).
  • the pFAT1 plasmid was co-introduced into the KJ strain together with the pble-PeEGFP-T1A plasmid into the KJoxAGL1-6060 strain, which had the highest TAG productivity among the pAGL1 plasmid transformants, and 237 Zeocin (Zeo) resistant colonies were selected.
  • Example 7 Evaluation of TAG productivity of a strain in which a plurality of cDNAs are highly expressed
  • the construction procedure of the transformant is shown below:
  • the name of the strain constructed by introducing the cDNA expression cassette shown in parentheses into the KJ strain is shown.
  • a KJDGAT2d325 cDNA expression cassette was again introduced into the KJoxFAT1-325 strain to produce the KJoxFD-2643 strain.
  • the name of the strain prepared by introducing only the KJFAT1 cDNA expression cassette or only the KJDGAT2d cDNA expression cassette into the KJoxAGL1-6060 strain is not shown.
  • the KJFAT1 cDNA expression cassette and the KJDGAT2d cDNA expression cassette were simultaneously introduced into the KJoxAGL1-6060 strain to prepare the KJoxAFD-41417 strain.
  • the KJoxFAT1-325 and KJoxDGAT2d-5822 strains had a higher TAG content than the wild strain, whereas the KJoxFD-2643 strain had a higher TAG content than those strains (FIG. 8). That is, high expression of FAT1 and DGAT2d additively increased the TAG content of the KJ strain.
  • Each strain was simultaneously cultured in 1/2 DENSO medium and sampled on days 4, 8, 11, 14, and 18 of the culture.
  • the TAG productivity of the KJoxAGL1-6060 strain which is a KJAGL1 cDNA expression cassette introduced strain, was about 30% higher than that of the wild strain (FIG. 5). 17 strains and 18 strains in which only the KJFAT1 cDNA expression cassette or only the KJDGAT2d cDNA expression cassette was introduced into the KJoxAGL1-6060 strain were isolated, and the TAG productivity of these strains was examined. Among these expression cassette-introduced strains, no TAG productivity significantly higher than that of the parent strain KJoxAGL1-6060 was found.
  • the KJoxAFD-41417 strain in which the KJFAT1 cDNA expression cassette and the KJDGAT2d cDNA expression cassette were simultaneously introduced into the KJoxAGL1-6060 strain, had a much higher productivity than the parent strain, as described below.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、光合成によって生産された同化産物がより多くトリグリセリド(=トリアシルグリセロール:TAG)合成に向かうように遺伝子操作された真核微細藻類を提供することを目的とし、具体的には、AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、又は当該遺伝子に加えてFAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくはDGAT2タンパク質をコードする遺伝子をさらに高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してTAG生産性が向上している、前記真核微細藻類遺伝子改変株に関する。

Description

トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用
　本発明は、光合成によって生産された同化産物がより多くトリグリセリド(=トリアシルグリセロール(triacylglycerol): 以下、「TAG」と呼ぶ)合成に向かうように遺伝子操作された真核微細藻類及びその利用に関する。
　単細胞性の光合成生物(以下、「微細藻類」と呼ぶ)が生産する脂肪酸、あるいは加水分解により脂肪酸を遊離するTAG等の化合物(以下、これらを総称して「脂質」と呼ぶ)を原料として、バイオディーゼル燃料をはじめとする工業・食品製品を生産する研究が、世界的に行われている。しかしながら現状では、脂質生産コストが高く、商業ベースでのバイオディーゼル燃料等の生産は困難である(非特許文献１）。そのため、バイオディーゼル燃料等の生産コスト削減のための更なる技術開発が続けられており、その1つに、微細藻類のTAG生産性の改良研究がある。
　微細藻類の多くは、光合成によって生じる同化産物の一部をデンプンあるいはTAGとして蓄積する。デンプン及びTAGの蓄積量は微細藻類の種類によって異なり、また、同じ生物でも培養条件によって異なっている。光合成同化産物がデンプン及びTAGに変換される速度と、一旦合成された貯蔵物質が分解される速度とは、生物種及び培養条件によって異なっており、それがデンプン及びTAGの蓄積量の差異となって現れると考えられる。
　TAGの原料は、グリセロール-3-リン酸と脂肪酸である。グリセロール-3-リン酸は、グリセロールとATPとを基質として、グリセロール・キナーゼ(glycerol kinase)によって合成される。一方、脂肪酸は、葉緑体内で生合成される。
　脂肪酸生合成の最初の反応は、アシルCoAカルボキシラーゼ(acyl-CoA carboxylase)によって触媒され、アセチルCoAからマロニルCoAが作られる。マロニルCoAはアシルキャリアー・タンパク質(acyl carrier protein: ACP)と反応し、マロニルACPが作られる。マロニルACPは、アシル基がACPに結合したアシルACP(C = 2：アセチルACP、C = 4：ブチリルACP、等)と反応し、アシルACPの炭素鎖を2つ延長する。この延長反応を繰り返してアシル基の炭素鎖の長さが(最も一般的には)16になると、アシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase)によってパルミチン酸(C16:0)とACPとに加水分解される。パルミチン酸はCoAと結合しパルミチルCoAとなって、葉緑体から小胞体に移動する。パルミチルCoAはさらに長鎖脂肪酸伸長酵素(very long chain fatty acid elongase)及びデサチュレース(fatty acid desaturase)の働きで、一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸のCoAエステル(オレイルCoA：C18:1)が作られる。パルミチン酸とオレイン酸は、多くの生物で、最も含量が高い脂肪酸である。
　TAGの生合成は小胞体膜上で行われる。先ず、グリセロール-3-リン酸アシル転移酵素(glycerol-3-phosphate acyltransferase)によって、グリセロール-3-リン酸のsn-1の位置にアシルCoAのアシル基が付加され、リゾフォスファチジン酸が生成する。次に、リゾフォスファチジン酸アシル転移酵素(acylglycerophosphate acyltransferase)によって、リゾフォスファチジン酸のsn-2の位置にアシルCoAのアシル基が付加されてホスファチジン酸が生成する。ホスファチジン酸はホスファチジン酸フォスファターゼ(phosphatidate phosphatase)によって脱リン酸化され、ジアシルグリセロールに変換された後、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(diacylglycerol acyltransferase: DGAT)によってTAGが合成される。DGATは、進化的起源が異なる2つのファミリーに分類され、それぞれ、DGAT1及びDGAT2と呼ばれている。グリセロール-3-リン酸とアシルCoAからTAGが合成されるこの経路は、TGA合成のためのケネディー経路と称される。
　このケネディー経路以外でもTAGは合成され、その一例がリン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase)による以下の反応である：
　リン脂質＋1,2-ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋TAG
　遺伝子組換え技術を用いて、このTAG合成に関わる酵素活性を上昇させることにより、微細藻類の単位時間当たり及び単位受光面積当たりのTAG生産量(以降、「TAG生産性」と呼ぶ)を改良し、バイオディーゼル生産コストの削減に貢献しようという研究が既に幾つか行われている。
　上記のケネディー経路の最後の酵素であるDGATをコードする遺伝子を高発現させることによってTAG生産性が上昇するという報告は数多く出されている。例えば、シアノバクテリア（Cyanobacteria）に属するシネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）PCC 7942株にグラム陰性細菌アシネトバクター(Acinetobacler)由来のDGAT遺伝子を導入することにより、シネココッカスが約2倍のTAGを蓄積するようになった(特許文献１）。
　特許文献２は、不等毛植物門(Heterokontophyta）・真正眼点藻綱(Eustigmataceae)に属するナンノクロロプシス(Nannochloropsis)に、DGAT、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素あるいはフォスファチジン酸フォスファターゼをコードする遺伝子を導入しTGA含量を上昇させることを開示する。しかしながら、当該特許文献では、これらの遺伝子導入の効果の詳細が実施例には示されていない。
　プレクストリン相同(Pleckstrin-homology)ドメインを持つ様々な生物由来のDGAT1遺伝子をナンノクロロプシスに導入したところ、形質転換体の脂質含量は野生株よりも増加した(特許文献３)。
　ナンノクロロプシスにマウス由来のDGATを導入したところ、TAG含量が増加した(特許文献４)。
　緑色植物亜界・緑藻植物門(Chlorophyta：以下、「緑藻」と呼ぶ)に属するクラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)には、上記DGAT2の遺伝子が複数存在するが(相同遺伝子)、これら相同遺伝子をクラミドモナス中で高発現させても、脂質含量の増加は認められなかった。一方、クラミドモナスのDGAT2相同遺伝子の1つを酵母で発現させると、酵母の形質転換体は、野生株酵母よりも高いTAG生産性を示した(非特許文献２）。
　不等毛植物門・珪藻綱(Bacillariophyceae)のフェオダクチラム(Phaeodactylum tricornutum)のDGAT2をクローン化し、同じ株内で高発現させると、この株のTAG生産性が上昇した（非特許文献３及び４）。
　TGA合成のためのケネディー経路の最初の酵素であるグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素をコードする遺伝子を、緑藻であるロボスフェラ(Lobosphaera incisa)より分離し、クラミドモナスに導入・発現させたところ、TAG生産性は顕著に上昇した（非特許文献５）。
　また、上記のグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素の基質であるグリセロール-3-リン酸を合成するグリセロール・キナーゼを、珪藻フィツリフェラ(Fistulifera solaris)JPCC DA0580株内で高発現させることにより、TAG生産性がわずかであるが増加した(非特許文献６）。
　一方、大腸菌において、脂肪酸合成の初発酵素であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(Acetyl-CoA carboxylase)遺伝子とアシルACPチオエステラーゼ遺伝子とを高発現させると、遊離脂肪酸含量が増加することが報告されている(非特許文献７）。
　しかし、多くの研究において、アシルACPチオエステラーゼ遺伝子は、一般的な長さの炭素鎖を持つ脂肪酸(C16とC18)ではなく、やや短い脂肪酸(C10、C12とC14)の合成を促進するために使用されている。クスノキ科の植物であるUmbellularia californicaの種子には、C10やC12等の脂肪酸を含む脂質が蓄積され、それは、この植物の持つC12の炭素鎖を持つアシルACPを加水分解するアシルACPチオエステラーゼによることが明らかになっている。この、やや短い脂肪酸を加水分解するという基質特異性を持つU. californicaのアシルACPチオエステラーゼ遺伝子のcDNAを大腸菌に導入し、高発現させたところ、C12及びC14の遊離脂肪酸が合成され、細胞外に排出された(非特許文献８）。
　緑藻クラミドモナスに、アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(DGAT2)をコードする遺伝子を導入することにより、C12脂肪酸の割合を増加させる研究が開示されている(特許文献５）。しかし、この組換え体における乾燥重量当たりのTAGの蓄積は最大で2％程度、遊離脂肪酸を含めても7％以下であった。
　ところで、緑藻・トレボキシア藻(Trebouxiophyceae)綱に属するシュードココミクサ(Pseudococcomyxa)sp. KJ株(以下、「KJ株」と呼ぶ)は、温泉水より分離されたTAG生産性が非常に高い単細胞性緑藻であり(特許文献６）、特許文献７に示された開放系培養システムで培養できる。
US 8,394,614 B2 US 8,722,359 B2 US 8,835,149 B2 US 2014/0106417 A1 特開2014-14334号公報 特開2015-015918号公報 特開2014-117202号公報
Quinn JC, Davis R.（2015）The potentials and challenges of algae based biofuels: a review of the techno-economic, life cycle, and resource assessment modeling. Bioresour Technol. 184: 444-452. Hung C-H, Ho M-Y, Kanehara K,Nakamura Y. (2013) Functional study of diacylglycerol acyltransferase type 2 family in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett. 587: 2364-2370. Niu Y-F, Zhang M-H, Li D-W, Yang W-D, Liu J-S, Bai W-B,Li H-Y. (2013) Improvement of neutral lipid and polyunsaturated fatty acid biosynthesis by overexpressing a type 2 diacylglycerol acyltransferase in marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Mar. Drugs 11: 4558-4569. Xue J, Niu YF, Huang T, Yang WD, Liu JS, Li HY. (2015) Genetic improvement of the microalga Phaeodactylum tricornutum for boosting neutral lipid accumulation. Metab Eng. 27: 1-9. Iskandarov U, Sitnik S, Shtaida N, Didi-Cohen S.　Leu S,　Khozin-Goldberg I,　Cohen Z,　Boussiba S. (2015) Cloning and characterization of a GPAT-like gene from the microalga Lobosphaera incisa (Trebouxiophyceae): overexpression in Chlamydomonas reinhardtii enhances TAG production. J Appl Phycol DOI 10.1007/s10811-015-0634-1. Muto M, Tanaka M, Liang Y, Yoshino T, Matsumoto M, Tanaka T. (2015) Enhancement of glycerol metabolism in the oleaginous marine diatom Fistulifera solaris JPCC DA0580 to improve triacylglycerol productivity. Biotechnol Biofuels.8(1):4. doi: 10.1186/s13068-014-0184-9. Davis MS, Solbiati J, Cronan JE Jr. (2000) Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 275:28593-28598. Voelker TA, Davies HM. Alteration of the specificity and regulation of fatty acid synthesis of Escherichia coli by expression of a plant medium-chain acylacyl Carrier protein thioesterase. J Bacteriol 1994;176:7320-737.
　上述のように、KJ株は屋外での大量培養に適した株であり、脂質の商業生産の原料として最も有望な株の1つであると言える。しかしながら、そのTAG生産性を更に改良し、TAG生産コストを削減することが望まれていた。
　そこで、本発明は、TAG生産性が改良された、KJ株を含む真核微細藻類を遺伝子操作によって作製し、当該真核微細藻類遺伝子改変株を利用したTAG生産方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、KJ株において、3つの遺伝子、すなわち、(i)デンプンの分解に関与しているアルファ・グリコシダーゼ(alpha-glucosidase: AGL1)をコードする遺伝子、(ii)葉緑体内でアシルACPとして合成される脂肪酸を加水分解し、小胞体上でのTAG合成経路に脂肪酸を供給するアシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase: FAT1)をコードする遺伝子、及び(iii)TAG合成経路の最終段階の酵素であるDGAT2をコードする相同遺伝子の1つ（DGAT2d）、の発現が、TAG合成時に最も強く誘導されることを明らかにした。更に、これらの3つの遺伝子を適当なプロモーターの下流にクローン化し、KJ株に導入したところ、形質転換体のTAG生産性が有意に改良され、本発明を完成するに至った。これらの3つの遺伝子は微細藻類の光合成同化産物の代謝に広く関わる酵素であり、KJ株で得られたこの結果は、他の多くの真核微細藻類でも同様に再現できると考えられる。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してTAG生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（２）さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、（１）記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（３）前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、（１）又は（２）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（４）トレボキシア藻網に属する、（１）～（３）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（５）コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、（４）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（６）前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、（１）～（５）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（７）前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、（６）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（８）前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、（７）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（９）（１）～（８）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-173161号の開示内容を包含する。
　本発明により、TAG生産性が向上した真核微細藻類遺伝子改変株を作出することが可能となる。また、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を培養することにより、バイオ燃料等に供する脂質の生産コストを大幅に削減することが可能となる。
100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を示すグラフである。 KJ株のAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子の発現に対するNaClの影響を示すグラフである。 KJ株のAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子の発現に対する窒素欠乏条件の影響を示すグラフである。 pAGL1、pFAT1、pDGAT2d及びpble-PeEGFP-T1Aプラスミドの構造を示す模式図である。 KJ株とpAGL1プラスミド形質転換体3株(KJoxAGL1-6013, 6060, 6133)の、細胞乾燥重量(DW)当たりのTAG含有率(％DW)、細胞乾燥重量(DW)当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。 KJ株とpFAT1プラスミド形質転換体6株(KJoxFAT1-313, 325, 428, 520, 585, 643)の、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。 図６－１の続きである。 図６－２の続きである。 KJ株とpDGAT2dプラスミド形質転換体4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)の培養7日目(7d)、14日目(14d)の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW）、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。 図７－１の続きである。 図７－２の続きである。 KJ株とKJ株にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入したKJoxDGAT2d-5822株、KJ株にKJFAT1 cDNA発現カセットを導入したKJoxFAT1-325株、KJoxFAT1-325株にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入したKJoxFD-2643株の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW)の平均値と標準誤差(n = 3)を示すグラフである。 KJ株、KJoxFD-2643株（KJFAT1 cDNA及びKJDGAT2d高発現株）、KJoxAGL1-6060株(KJAGL1 cDNA高発現株)、及びKJoxAFD-41417株(KJAGL1 cDNA、KJFAT1 cDNA及びKJDGAT2d高発現株)の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)、1日当たりのTAG生産性(g/L/d)の平均値と標準誤差(n = 3)を示すグラフである。 図９－１の続きである。 図９－２の続きである。
　本発明は、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子を、真核微細藻類野生株又は当該野生株に由来する変異株に導入(以下、遺伝子導入される株を「親株」と呼ぶ)した結果、TAG生産性が親株よりも有意に(例えば15％以上、好ましくは30％以上、特に好ましくは45％以上)向上した真核微細藻類遺伝子改変株に関する。
　真核微細藻類由来のTAGを原料としたバイオ燃料等の生産コストを削減するための最重要課題の一つは、真核微細藻類のTAG生産性の大幅向上である。本発明者等は、KJ株由来のAGL1タンパク質、FAT1タンパク質及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子をKJ株で高発現させることにより、この緑藻のTAG生産性を大幅に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　上記知見から、遺伝子操作によって、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子(以下、これらの遺伝子を合わせて「本発明に係る遺伝子」と呼ぶ場合がある)を高発現させることによって真核微細藻類のTAG生産性を向上させること、及び、TAG生産性向上株を培養することにより、バイオ燃料等に供するTAGの生産コストを大幅に削減することが可能となる。
　本発明において、真核微細藻類としては、緑藻、珪藻(diatom又はBacillariophyceae)、真正眼点藻綱(Eustigmatophyceae)等に属する真核微細藻類を挙げることができる。
　緑藻としては、例えばトレボキシア藻網に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻網に属する緑藻としては、例えば、トレボキシア(Trebouxia)属、クロレラ(Chlorella)属、ボトリオコッカス(Botryococcus)属、コリシスチス(Choricystis)属、コッコミクサ(Coccomyxa)属、シュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻綱に属する具体的な菌株としては、KJ株が挙げられる。KJ株は、平成25年(2013年)6月4日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22254として寄託され、さらに受託番号FERM BP-22254としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
　トレボキシア藻網に属する緑藻以外の緑藻としては、例えばテトラセルミス(Tetraselmis)属、アンキストロデスムス(Ankistrodesmus)属、ドラニエラ(Dunalliella)属、ネオクロリス(Neochloris)属、クラミドモナス属、イカダモ(=セネデスムス：Scenedesmus)属等に属する緑藻が挙げられる。
　更に珪藻としては、フィストゥリフェラ(Fistulifera)属、フェオダクチラム属、タラシオシラ(Thalassiosira)属、シクロテラ(Cyclotella)属、シリンドロティカ(Cylindrotheca)属、スケレトネマ(Skeletonema)属等に属する真核微細藻類を挙げることができる。さらに、真正眼点藻綱としては、ナンノクロロプシス属が挙げられる。
　本発明においては、上述の真核微細藻類を親株として、本発明に係る遺伝子を高発現させることで、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を得ることができる。
　本発明において、AGL1遺伝子としては、例えばKJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)又はその相同体が挙げられる。具体的には、AGL1遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号３における215番目～783番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、AGL1遺伝子としては、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アルファ・グリコシダーゼ活性とは、デンプンを非還元末端から加水分解し、D-グルコースを切り出す酵素活性を意味する。
　FAT1遺伝子としては、例えばKJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)又はその相同体が挙げられる。具体的には、FAT1遺伝子としては、配列番号８に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号７における78番目～283番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、FAT1遺伝子としては、配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アシルACPチオエステラーゼ活性とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する酵素活性を意味する。
　DGAT2遺伝子としては、例えばKJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)又はその相同体が挙げられる。具体的には、DGAT2遺伝子としては、配列番号１２に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号１１における123番目～322番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、DGAT2遺伝子としては、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、ジアシルグリセロールアシル転移酵素活性とは、アシルCoAに由来するアシル基がジアシルグリセロールに付加し、TAGが合成される酵素活性を意味する。
　本発明に係る遺伝子は、例えば、上記で説明した緑藻に属する株、好ましくはトレボキシア藻網に属する株、特に好ましくはコッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来するものであってよい。
　また、本発明においては、好ましくは、AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2遺伝子のうち2つ又は3つ全てを高発現させる。
　本発明に係る遺伝子によりコードされるタンパク質を真核微細藻類細胞内で高発現させるための多くの方法が存在する。最も一般的な方法は、高発現させたい遺伝子に機能的に連結させた(例えば、当該遺伝子の上流に)遺伝子高発現を担保するプロモーター(構成的に高発現するプロモーター)を配したコンストラクトを試験管内で構築し、これを宿主に導入する方法である。目的によっては、強度と特性(構成的又は誘導性)の異なるプロモーターを使用することができる。
　転写後、mRNA前駆体はキャッピング、スプライシング、ポリ(A)付加等の転写後修飾を受けた後、核より細胞質に移行する。この転写後修飾の効率を上げて遺伝子を高発現させる試みは、プロモーターの利用ほどには行われていない。
　一方、mRNAの翻訳効率の改良については、複数の技術が存在する。翻訳開始の効率は開始コドンより上流の配列(5'-UTR)に影響される(Kim et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42, 485)ので、5'-UTR配列の最適化で翻訳効率を改良することが可能である。また、mRNAのコドン使用頻度を最適化することによって高発現を達成する手法は広く使われている。すなわち、コドン最適化した遺伝子を試験管内で作製し、これを宿主に導入することによって翻訳されるタンパク質の量を増加させることができる。
　以下に述べるように、KJ株の本発明に係る遺伝子は、窒素欠乏又は塩ストレス等によって誘導される。当該遺伝子の発現を正又は負に制御する転写因子によって、この誘導が制御されていると考えられる。この転写因子を同定しその活性化の機構を明らかにすることで、その機構を利用した本発明に係る遺伝子の高発現を達成することができる。一般に、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって正に制御されている場合、この転写因子を高発現させることで、目的遺伝子も高発現させることができる。一方、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって負に制御されている場合は、逆に、この負の転写因子の発現又は活性を失くすことで、目的遺伝子の高発現を達成させることができる。あるいは、この転写因子を活性化又は不活性化するためのシグナル伝達系を操作することによっても、目的遺伝子の高発現を達成できる。
　近年、遺伝子の発現が周辺の染色体構造によって正及び負に制御されることが次第に明らかになってきた。このことから、高発現させたい遺伝子周辺の染色体構造を、例えばインスレーターを導入することによって変化させ、遺伝子の高発現を達成することができる。
　具体的な例として、下記の実施例に示すように、本発明に係る遺伝子を強力なプロモーター(例えば、KJ株由来のEF1α遺伝子のプロモーター(配列番号１３))の下流にクローン化し、それをKJ株等の真核微細藻類に導入することによって本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を作製する方法である。
　なお、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株の例として、実施例に示す、KJ株に由来する本発明に係る遺伝子3つ全てをKJ株において高発現させたKJoxAFD-41417株が、平成27年(2015年)8月27日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22294として寄託され、さらに受託番号FERM BP-22294としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
　さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を大量培養し、TAGを生産する方法である。大量培養法としては、既に確立されている特許文献７に記載の培養法等を用いることができる。具体的には、尿素を窒素源とし、pHが4以下である培地を用いて、微細藻類を培養する方法である。この培養方法によれば、窒素源を尿素とすることで、窒素分消費によるpHの変動は最小限となる。また、pH4以下の培養液中にCO2を導入しても重炭酸イオンがほとんど生じないので、培養液のpHが変動しにくい特徴もある。このように培養液のpHを安定的に4以下に保つことが出来るので、他の微細藻類や原生生物の増殖を抑制することができる。
　培養後、例えば培養物からヘキサン抽出等によって、TAGを含む脂質を得ることができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、以下の実施例において、AGL1遺伝子は、KJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)であり、FAT1遺伝子は、KJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)であり、且つDGAT2遺伝子は、KJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)である。
〔実施例１〕TAG生産性に関与する遺伝子のRNA-seqによる解析
　多くの微細藻類では、窒素欠乏条件で、あるいはそれに加えNaClを100 mM程度培地に添加することによって、TAG生産を促進することができる。KJ株及びKJ株に近縁のシュードコリシスティス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株（以下、「Obi株」と呼ぶ：Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909)においても、窒素欠乏条件下での培養、及びNaCl添加後の培養の双方において、TAG含有量の増加が見られ、一方でデンプンの蓄積量は減少した。100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を図１に示す。
　具体的には、KJ株を、A6培地［2.5 mM (NH2)2CO, 378 μM (NH4)2SO4, 405 μM MgSO4, 265 μM KH2PO4, 264 μM K2HPO4, 61.2 μM CaCl2, 1.20 μM CuSO4, 1.13 μM H3BO3, 1.04 μM ZnSO4, 0.622 μM MnSO4, 0.294 μM CoCl2, 12.4 nM Na2MoO4, 0.4% (v/v) Fe solution (3 g/L citric acid, 4.9 g/L ammonium ferric citrate, 0.5 g/L EDTA-2Na)］を滅菌水で2倍に希釈した培地（1/2 A6培地）を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、72時間後のサンプルの、細胞乾燥重量(g/L)と、細胞乾燥重量当たりのTAG重量およびデンプン重量(％DW)とを測定した。図１において、黒塗りの棒グラフは、NaCl添加無し、白塗りの棒グラフは100 mM NaCl添加での結果である。油分含量測定はNMRを用いて以下の条件で行った。細胞を8,000 rpm、5分以上の遠心分離で収穫し、凍結乾燥させた後、40 mg程度を量りとり、Oxford Instrumets社製モデルMQC油分測定装置で単位細胞乾燥重量当たりの油分含量を測定した。検量線は、日本薬局方のオリーブ油を標準物質として作成した。
　図１に示すように、NaCl添加によって増殖はわずかに促進された。一方、TAG含量は有意に増加し、デンプン含量は有意に減少した。
　また、植物の代謝経路データベース(http://www.plantcyc.org/)を利用して、脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列を得た。これらのアミノ酸配列をqueryとして、KJ株やObi株のゲノム配列あるいはトランスクリプトーム解析(RNA-seq)で得られたmRNA配列に対してtblastn検索を行い、KJ株及びObi株の脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列とその遺伝子とを同定した。また、それらの遺伝子の発現量と発現変化をRNA-seq結果を用いて解析した。
　その結果、NaCl添加によって、デンプンの分解に関わるアルファ・グルコシダーゼ(AGL1)遺伝子が、KJ株、Obi株とで共通して強く発現誘導されることが分かった。また、脂肪酸合成の最終段階で働くアシルACPチオエステラーゼ(FAT1)遺伝子と、TAG合成のためのケネディー経路の最終段階で働くジアシルグリセロール・アシル転移酵素(DGAT)の同義遺伝子の一つであるDGAT2dの発現も、NaCl添加によって強く誘導されていた。
　図２に、NaClを0及び100 mM添加した時の、KJ株のAGL1、FAT1、DGAT2d遺伝子発現を示す。具体的には、KJ株を、図１と同様に1/2 A6培地を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、48時間後のサンプルのRNA-seqによる発現量を解析した。図２において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)である。FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子、AGL1遺伝子の発現は、NaCl添加無しでも、培養時間が経過するにしたがって増加したが、NaClを添加した場合は、さらにその発現量が増加した。NaCl添加無しの条件での遺伝子発現増加は、おそらく培地内の窒素分濃度の減少によって起こっていると考えられる。
　また、窒素欠乏条件下でも、これらの遺伝子は、同様に誘導されていた(図３)。具体的には、KJ株を窒素十分培地(MA5)で培養後、窒素欠乏培地(MA5-N)に移し、12、24、72、144時間後にサンプリングを行ってRNA-seqにより遺伝子発現量を調べた。図３において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)の平均値(N=2)である。MA5の組成は、18 mM NaNO3, 0.4 mM MgSO4, 60 μM CaCl2, 0.26 mM KH2PO4, 0.26 mM K2HPO4, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 0.4％ (v/v) Fe solution, 0.1％ (v/v) Trace elementsである。この培地作製に用いたストック溶液の組成は、Fe solutionが、3 g /L, citric acid, 4.9 g/L ammonium iron citrate, 0.5 g /L, EDTAであり、trace elementsが、70 mg/L H3BO3, 150 mg/L MnSO4・5H2O, 300 mg/L ZnSO4・7H2O, 300 mg/L CuSO4・5H2O, 70 mg/L CoCl2・6H2O, 3 mg/L Na2MoO4である。MA5-NではNaNO3を加えず、NaClをNa+の濃度が同じになるように加えたものを使用した。
　これらの遺伝子は、それぞれ、脂肪酸の合成、TAGの合成、デンプンの分解の最終段階で働く酵素をコードしているため、これらの遺伝子を高発現させることによって、TAG生産性がより向上した株が得られるのではないかと考え、高発現株を作製することとした。
〔実施例２〕AGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNA高発現株の作製
　KJ株内でAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNAを単独で、あるいは複数を同時に高発現させるために、KJ株の翻訳伸長因子のαサブユニットであるEF1αをコードする遺伝子(以降、「KJEF1A」と呼ぶ)のプロモーター(配列番号１３)とターミネーター(配列番号１４)とを利用した。AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2d遺伝子それぞれのcDNAを、KJEF1Aのプロモーターとターミネーターとの間に挿入したpAGL1、pFAT1及びpDGAT2dプラスミドを作製した(図４)。
　図４において、KJEF1A pro及びKJEF1A terは、それぞれ、KJ株のEF1A遺伝子(KJEF1A)のプロモーター及びターミネーターを含む配列である。KJRBCSは、KJ株のRuBisCO小サブユニット遺伝子を示し、その最初のイントロン配列(配列番号１５)がプロモーターとcDNAとの間に挿入されている。各プラスミドの中央部分は、各遺伝子のcDNA配列を示している。FLAG-Tagは、N末端-DYKDDDDK-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。ObiTub pro及びObiAct terは、それぞれ、Obi株のTubulin遺伝子プロモーター及びActin遺伝子ターミネーターを含む配列である(Imamura et al., 2012, J Gen Appl Microbiol, 58, 1)。bleは、ブレオマイシンやゼオマイシン[商品名ゼオシン(ZeocinTM)]耐性遺伝子である(Stevens et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251, 23-30.)。Linkerは、N末端-GGSGGR-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。PeEGFPは、EGFP(enhanced GFP ：高感度GFP)のコドン使用頻度をObi株での発現のために最適化した配列である。
　これらのプラスミドを、パーティクルボンバードメントを用い、G418耐性を付与するpG418-T1Aプラスミド(Kasai et al., 2015, Biotechnol Biofuels, 8, 94)と共にKJ株に共導入し、G418耐性コロニーを選抜した。
　pAGL1プラスミドを導入した実験では、G418耐性コロニー106個の内6株(5.7％)で、図４に示すpAGL1プラスミドのKJEF1Aプロモーター5'末端とターミネーター3'末端との間(以降、これを「KJAGL1 cDNA発現カセット」と呼ぶ）の全長が挿入されていた。pFAT1プラスミドを導入した実験では、365個のG418耐性コロニーの内18株（5.0％）でKJFAT1 cDNA発現カセット全長が挿入されていた。pDGAT2dプラスミドを導入した実験では164個のG418耐性コロニーの内、6株(3.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
〔実施例３〕KJAGL1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
　pAGL1プラスミドを導入して得られた6株の形質転換体におけるKJAGL1 cDNAの発現を、Real time PCRで解析した。最もKJAGL1 cDNAの発現が高かったKJoxAGL1-6060株(oxはoverexpression line：高発現株を示す)では、培養13日目のTAG生産性が野生株の約1.3倍であった(図５）。残りの株については、TAG含量が若干上昇し、デンプン含量が若干減少したが、TAG生産性は野生株とほぼ同等であった。
　ここで、TAG生産性とは、野生株(KJ)のTAG生産量(g/L)を100％としたときの形質転換体のTAG生産量(％)である。また、本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と13日目(13d)にサンプリングを行った。図５において、棒グラフとエラーバーは独立な3回の実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3)を示す。なお、DENSO培地はA6培地とほぼ同じ組成であるが、(NH4)2SO4及び(NH2)2COの濃度がそれぞれ863 μMと2.38 mMである。1/2 DENSO培地は、DENSO培地を蒸留水で2倍に薄めたものである。
〔実施例４〕KJFAT1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
　pFAT1プラスミドを導入して得られた形質転換体18株についてTAGの生産性を評価した。18株中12株でTAG含有率が増加し、そのうち細胞乾燥重量の減少があまり見られなかった(すなわち、増殖が悪くならなかった)6株では、培養7日目にTAG生産性が約1.2～1.3倍に、14日目で約1.1～1.2倍に増加していた(図６）。このとき、TAGの増加と同時にデンプンの減少が見られたため、pFAT1プラスミドの導入によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図６）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と14日目(14d)にサンプリングを行った。
〔実施例５〕KJDGAT2d cDNA高発現株のTAG生産性の評価
　pDGAT2dプラスミドの導入で得られた形質転換体6株のうち4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)において、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率に有意な増加が見られ(P < 0.01, Student's t-test)、培養7日目で野生株の約1.2倍、14日目で約1.1倍に増加した(図７）。このとき、TAGの増加が見られた4株においてデンプン含有率が減少していた(P < 0.05, Student's t-test)ことから、KJDGAT2d cDNAの高発現によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図７）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目と14日目にサンプリングを行った。図７において、棒グラフとエラーバーは独立な実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3-6)を示す。
〔実施例６〕複数cDNAを同時に高発現させた株の作製
　pFAT1プラスミド形質転換体のうち、7日目におけるTAG生産性が最も高かったKJoxFAT1-325株(図６)にpDGAT2dプラスミドとpble-PeEGFP-T1Aプラスミドとを共導入し、Zeo耐性コロニーを228個選抜した。そして、KJDGAT2d cDNA発現カセットの挿入をPCRで解析したところ、13株(5.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
　複数のcDNAを同一細胞内で同時に高発現させた場合に、TAG生産性がどの程度向上するかを解析するため、3遺伝子のcDNAを4通りに組み合わせた形質転換体（AGL1 & FAT1, AGL1 & DGAT2d, FAT1 & DGAT2d, AGL1 & FAT1 & DGAT2d)を作製した。pAGL1プラスミド形質転換体のうち最もTAG生産性が高かったKJoxAGL1-6060株にpFAT1プラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共にKJ株に共導入し、ゼオシン(Zeo)耐性コロニーを237個選抜した。この内の17株(7.2％)でKJFAT1 cDNA発現カセットの全長が挿入されていることを確認した。同様にKJoxAGL1-6060株にpDGAT2dプラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共に導入し、Zeo耐性コロニーを130個選抜し、この内18株（13.8%）でDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
　3つの遺伝子のcDNAを一つの細胞内で高発現させるため、KJoxAGL1-6060株にpFAT1、pDGAT2d及びpble-PeEGFP-T1Aの3つのプラスミドを同時導入し、Zeo耐性コロニーを685個選抜した。この内17株(2.5％)で、KJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットの両方が挿入されていた。
〔実施例７〕複数のcDNAが高発現した株のTAG生産性評価
　実施例６に示すように、KJoxFAT1-325株(図６)にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入した株、すなわち、KJFAT1 cDNAとKJDGAT2d cDNAとを高発現させた13株のうち、最もTAG生産性が高かったKJoxFD-2643株について詳しく解析を行った。また、下記に、形質転換体の構築手順を示す：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　当該構築手順では、KJ株に、カッコ内に示したcDNAの発現カセットを導入し構築した株名を示す。KJoxFAT1-325株には、再度、KJDGAT2d cDNA発現カセットを導入し、KJoxFD-2643株を作製した。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入して作製した株の名前は示していない。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットを同時に導入し、KJoxAFD-41417株を作製した。
　KJ株、KJoxFAT1-325株、KJoxDGAT2d-5822及びKJoxFD-2643株を、それぞれ1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW)を測定した。KJoxFAT1-325株とKJoxDGAT2d-5822株は野生株よりTAG含有率が増加していたが、KJoxFD-2643株はそれらの株よりさらにTAG含有率が増加していた(図８)。すなわち、FAT1とDGAT2dの高発現は、KJ株のTAG含有率を加算的に増加させた。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
　また、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性は、野生株よりも約30％高かった(図５）。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入した株を、それぞれ17株と18株分離し、これらの株のTAG生産性を調べた。これらの発現カセット導入株の中に、親株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性よりも有意に高いTAG生産性を示すものは見出されなかった。
　一方、KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットとKJDGAT2d cDNA発現カセットとを同時に導入したKJoxAFD-41417株は、以下に述べるように、その生産性は親株よりもはるかに高かった。
　KJ株、前述のKJoxFD-2643株(KJFAT1 cDNA発現カセット+KJDGAT2d発現カセット導入株)、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株(KJoxAGL1-6060)、及びKJoxAFD-41417株を1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの培養液当たりのTAG生産量(g/L)を測定した。KJoxFD-2643株では培養18日目のTAG生産量(g/L)が野生株の約1.2倍、KJoxAGL1-6060株では約1.5倍に増加していた。一方、KJoxAFD-41417株では、TAG生産量(g/L)が培養18日目で野生株の約1.7倍に増加していた(図９）。また、野生株及びKJoxFD-2643株では培養8日目から14日目でTAG生産性(g/L/d)が最大になったのに対して、KJoxAGL1-6060株、及びKJoxAGL1-6060株を親株にしたKJoxAFD-41417株では培養18日目までTAG生産性が増加していた(図９)。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
　以上の結果より、KJDGAT2d cDNAの高発現とKJFAT1 cDNAの高発現とは、TAG生産性において加算性が認められること、また、KJAGL1 cDNAの高発現と上記2つのcDNAの高発現とを組み合わせることにより、TAG生産性が野生株の約1.7倍に増加した株を作ることが出来ることが示された。
FERM BP-22254
FERM BP-22294
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してトリアシルグリセロール(TAG)生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
  2. 　さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、請求項１記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
  3. 　前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、請求項１又は２記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  4. 　トレボキシア藻網に属する、請求項１～３のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  5. 　コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、請求項４記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  6. 　前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、請求項１～５のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  7. 　前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、請求項６記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  8. 　前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、請求項７記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
PCT/JP2016/075875 2015-09-02 2016-09-02 トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 Ceased WO2017038993A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2016317623A AU2016317623B2 (en) 2015-09-02 2016-09-02 Genetically modified strain of eukaryotic microalga having improved triglyceride productivity, and use thereof
US15/756,233 US10370687B2 (en) 2015-09-02 2016-09-02 Genetically modified strain of eukaryotic microalga having improved triglyceride productivity, and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015173161A JP6613731B2 (ja) 2015-09-02 2015-09-02 トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用
JP2015-173161 2015-09-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017038993A1 true WO2017038993A1 (ja) 2017-03-09

Family

ID=58188969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/075875 Ceased WO2017038993A1 (ja) 2015-09-02 2016-09-02 トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10370687B2 (ja)
JP (1) JP6613731B2 (ja)
AU (1) AU2016317623B2 (ja)
WO (1) WO2017038993A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108062602A (zh) * 2017-12-28 2018-05-22 江苏大学 一种预测温室茄果类作物同化产物产量的方法
CN121450613A (zh) * 2026-01-06 2026-02-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 来源于南极磷虾二酰甘油酰基转移酶及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7692558B2 (ja) * 2021-03-23 2025-06-16 学校法人 中央大学 油脂生産性が増加した真核微細藻類変異体及びその利用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075881A1 (ja) * 2013-11-19 2015-05-28 株式会社デンソー 緑藻の脂質蓄積変異体およびその利用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8394621B2 (en) 2008-10-23 2013-03-12 Matrix Genetrics, LLC Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides
US8722359B2 (en) 2011-01-21 2014-05-13 Aurora Algae, Inc. Genes for enhanced lipid metabolism for accumulation of lipids
JP6006553B2 (ja) 2012-07-10 2016-10-12 花王株式会社 組換えクラミドモナス属及びそれを用いたラウリン酸高含有油脂の製造方法
US9328336B2 (en) 2012-10-16 2016-05-03 Exxonmobil Research And Engineering Company DGAT genes and methods of use for triglyceride production in recombinant microorganisms
BR112015012811A2 (pt) 2012-12-06 2017-11-14 Exxonmobil Res & Eng Co genes dgat compreendendo domínios de homologia de plecstrina e uso em micro-organismos recombinantes
JP6235210B2 (ja) 2012-12-14 2017-11-22 株式会社デンソー 微細藻類の培養方法
JP6088375B2 (ja) 2013-07-10 2017-03-01 株式会社デンソー 新規微細藻類

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075881A1 (ja) * 2013-11-19 2015-05-28 株式会社デンソー 緑藻の脂質蓄積変異体およびその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProtKB 13 June 2012 (2012-06-13), XP055373228, Database accession no. IOYMX4 *
DATABASE UniProtKB 13 June 2012 (2012-06-13), XP055373234, Database accession no. I0ZAZ8 *
DATABASE UniProtKB 13 June 2012 (2012-06-13), XP055373236, Database accession no. I0YMB8 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108062602A (zh) * 2017-12-28 2018-05-22 江苏大学 一种预测温室茄果类作物同化产物产量的方法
CN121450613A (zh) * 2026-01-06 2026-02-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 来源于南极磷虾二酰甘油酰基转移酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20180245112A1 (en) 2018-08-30
AU2016317623B2 (en) 2019-06-13
JP6613731B2 (ja) 2019-12-04
US10370687B2 (en) 2019-08-06
AU2016317623A1 (en) 2018-03-29
JP2017046643A (ja) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wei et al. A type-I diacylglycerol acyltransferase modulates triacylglycerol biosynthesis and fatty acid composition in the oleaginous microalga, Nannochloropsis oceanica
CN104126006B (zh) 包括原藻脂质通路基因的基因工程化的微生物株系
Li et al. A type 2 diacylglycerol acyltransferase accelerates the triacylglycerol biosynthesis in heterokont oleaginous microalga Nannochloropsis oceanica
Gong et al. Characterization of a novel thioesterase (PtTE) from Phaeodactylum tricornutum
Cui et al. Tung tree (Vernicia fordii, Hemsl.) genome and transcriptome sequencing reveals co-ordinate up-regulation of fatty acid β-oxidation and triacylglycerol biosynthesis pathways during eleostearic acid accumulation in seeds
US9359623B2 (en) Methods and compositions for the production of fatty acids in photosynthetic prokaryotic microorganisms
JP6310544B2 (ja) β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
Shi et al. Δ6 fatty acid elongase is involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis via the ω6 pathway in the marine alga Nannochloropsis oceanica
US20140256927A1 (en) Increasing the lipid content in microalgae by genetically manipulating a triacylglycerol (tag) lipase
JP6613731B2 (ja) トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用
CN114615881B (zh) 产生甘油三酯的非人类生物体
Sitnik et al. DGAT1 from the arachidonic-acid-producing microalga Lobosphaera incisa shows late gene expression under nitrogen starvation and substrate promiscuity in a heterologous system
Zheng et al. Identification and function analysis of a type 2 diacylglycerol acyltransferase (DGAT2) from the endosperm of coconut (Cocos nucifera L.)
RU2534560C2 (ru) Новые гены атф:цитратлиазы
WO2014045793A1 (ja) チオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法
JP2019068755A (ja) 脂質の製造方法
Zhang et al. Transcriptome-based analysis of euglena gracilis lipid metabolic pathways under light stress
AU2016228545A1 (en) Microorganisms for fatty acid production using elongase and desaturase enzymes
Han et al. Enhancing the lipid content of Nannochloropsis oceanica by introducing two type 2 diacylglycerol acyltransferase genes from Phaeodactylum tricornutum
Tsai Production of preferable high-oleic acid yeast
McCoy Identification of oleaginous Mortierella species and development of metabolic engineering strategies
KAMISAKA PREPARATION YEAST BY GENETIC OF OLEAGINOUS MODIFICATION AND ITS POTENTIAL APPLICATIONS
US20140289908A1 (en) Gene combinations for producing punicic acid in transgenic plants
CN102869768A (zh) 生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程
JP2016054703A (ja) ラウリン酸の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16842022

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15756233

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016317623

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20160902

Kind code of ref document: A

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16842022

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1