WO2017033654A1

WO2017033654A1 - 光学顕微鏡および電子顕微鏡

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Publication number: WO2017033654A1
Application number: PCT/JP2016/071945
Authority: WO
Inventors: 匡柴原; 明正大坂; 周平山本; 剛大浦; 航佐藤
Original assignee: 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2017-03-02
Also published as: JP2017040835A

Abstract

本発明は、試料を長時間観察する際に、熱変形の影響を低減する機構を備えた顕微鏡システムの提供を目的とする。上記目的を達成するために、対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた光学顕微鏡において、対物レンズを筐体に保持する対物レンズホルダをさらに備え、対物レンズの最上部は、対物レンズと接しており、かつ、対物レンズホルダは、対物レンズの少なくとも一部を覆っており、筐体に対して、対物レンズの最上部の位置より下方で固定される、光学顕微鏡を提案する。

Description

光学顕微鏡および電子顕微鏡

　本発明は、試料を長時間観察する際に、熱変形の影響を低減する機構を備えた顕微鏡に係り。特に、数十ｎｍのドリフトを低減する技術に関する。

　本技術分野の背景技術として、ラマンナノポアＤＮＡシーケンスに関するＷＯ２０１２－０４３０２８Ａ１号公報（特許文献１）がある。この公報には、「ナノポアの内径は約１０ｎｍであった。」と記載されており、ラマンナノポアＤＮＡシーケンサの光学顕微鏡システムには、一般的な光学顕微鏡より高精度化が要求されている。

　ラマンナノポアＤＮＡシーケンサは、内径約１０ｎｍ以下のナノポアに生体ポリマーを進入させ、ナノポア近傍にある金などの金属デバイスにレーザを照射し、プラズモン共鳴を意図的に発生させた励起光によって、ナノポアを通過する生体ポリマーの増幅されたラマン散乱光を検出する光学顕微鏡システムである。そして、ナノポアを観察、検出するために、対物レンズから照射されるレーザの照射位置に、金属デバイス上の所望の場所を位置付けることが可能な試料移動ステージが設けられている。また試料移動ステージは、ＸＹ（水平）方向のみでなく、Ｚ（鉛直、フォーカス）方向やＸＹＺ軸まわりの回転運動などを行う場合もある。

　この移動ステージによって、対物レンズから照射されるレーザと金属デバイスの位置関係を高精度にアライメントし、位置決めを行う。ラマンナノポアＤＮＡシーケンサの光学顕微鏡システムには、生体ポリマーがナノポアを通過する間、レーザと金属デバイスの（空間３軸の）位置関係を長時間高精度に保持し続けることが必須である。

　また温度の変化よって、アライメントされたレーザと金属デバイスの位置関係が崩れ、測定点の位置がずれたり、フォーカスから外れたりする熱ドリフト現象が発生し、これをより小さくするように光学顕微鏡システムを構成することが求められる。

　特許文献２には、フォーカス調整するラックとステージの間に、熱膨張係数の異なる材料のロッドを組み合わせ、対物レンズの光軸方向の熱膨張を補償し、全体の温度変化が焦点外れとならない構造が開示されている。

　更に、特許文献３には、対物レンズの先端部に、標本側の光軸方向のステージの基準面に当接し、対物レンズの光軸方向の位置決めを行う位置決め部材を設けたので、熱膨張に起因する対物レンズの光軸方向の焦点ずれを容易、確実に低減することができることが開示されている。

国際公開ＷＯ２０１２－０４３０２８Ａ１号公報特開平０９－１２００３０号公報特開２００３－０２９１６２号公報

　上述のように、ラマンナノポアＤＮＡシーケンサの光学顕微鏡システムには、ドリフトの抑制が求められるが、特許文献２に開示された技術によれば、熱膨張補正用のロッドが、上下動作機構に比べ長く、片持ちの形状になっているため、外部振動の影響を受けやすく、さらに、熱膨張による長さの変化は各材質がもっている固有の線膨張係数に比例することがわかっているが、熱膨張補正用のロッドに異種材料を使用することで、バイメタル効果が起こり、線膨張係数の計算どおりにはならず、Ｚ軸（フォーカス）だけでなく、ＸＹ軸にドリフトするという問題があった。

　また、特許文献３に開示された技術によれば、フォーカス方向の相対位置関係を一定に保つことが可能であるが、フォーカス方向に可動するレンズ保持部材が対物レンズ内に必須な構成で、可動するためのガタあり、ＸＹ軸に高精度に維持するような構成にはなっていない。さらに、ステージの基準面がバイメタル効果で、たわむことを考慮した構成にもなっていない。

　上記課題を解決するために、本発明の光学顕微鏡は、対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた光学顕微鏡において、
　対物レンズを筐体に保持する対物レンズホルダをさらに備え、
　対物レンズの最上部は、対物レンズと接しており、かつ、
　対物レンズホルダは、対物レンズの少なくとも一部を覆っており、筐体に対して、対物レンズの最上部の位置より下方で固定される。

　また、本発明の電子顕微鏡は、対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた光学顕微鏡において、
　対物レンズを筐体に保持する対物レンズホルダをさらに備え、
　対物レンズの最上部は、対物レンズと接しており、かつ、
　対物レンズホルダは、対物レンズの少なくとも一部を覆っており、筐体に対して、対物レンズの最上部の位置より下方で固定される。

　上記構成によれば、顕微鏡の焦点合わせを行った後、熱変動が起こったとしても、数ナノメートルオーダーのドリフトもせず、長時間計測を実現することが可能となる。

本発明の対物レンズホルダの第１の実施形態を示す断面図である。図１の対物レンズホルダを備えた顕微鏡を示す正面図である。顕微鏡筐体の材質と同じ対物レンズを備えた顕微鏡を示す正面図である。本発明の第２の実施形態を備えた顕微鏡を示す正面図である。本発明のサンプルホルダを示す斜視図である。本発明のサンプルホルダ形状の第４の実施形態を示す断面図である。本発明のサンプルホルダ形状の第５の実施形態を示す断面図である。

　本発明の一実施例を示す、光学顕微鏡について説明する。なお、本発明は光学顕微鏡に限らず、電子顕微鏡にも応用することができる。

　図１は、本発明の対物レンズホルダの第１の実施形態を示しており、図２は図１の対物レンズホルダが配置された正立型の顕微鏡を示している。図２の顕微鏡では、顕微鏡筐体１１に、図示しない上下、水平駆動ステージとサンプル支持部材を含む、移動機構１２が取り付けられ、移動機構１２の上面には、サンプル１３が載置されている。移動機構１２は、上下左右前後に、手動または電動で上下左右前後に操作され、焦点合わせを行う。

　対物レンズ１４は、対物レンズホルダ２１に螺合され、顕微鏡筐体１１に取り付けられる。対物レンズ１４を通してサンプル１３に照明（図示せず）もしくは、レーザ（図示せず）が照射され、また、その上方に図示しない結像レンズが光学系１５に配置される。

　結像レンズによる像は、光学系１５を介してカメラ１６により観察することができる。また、図示しない接眼レンズにより肉眼観察する場合も考えられる。

　図１は、図２の顕微鏡筐体１１に装着される対物レンズ１４と対物レンズホルダ２１の詳細を示すもので、対物レンズ１４の円筒状の対物レンズ筺体３１の後端部には、雄ネジ部が形成されている。対物レンズ筺体３１内には、円筒状の複数のレンズ３２が支持されている。対物レンズホルダ２１は雌ネジがあり、対物レンズ胴付面３３が接するまで螺合される。対物レンズ１４が装着された対物レンズホルダ２１を、顕微鏡筐体１１上の対物レンズホルダ取付面３４に、図示しないネジで、対物レンズ１４に対して軸対称に固定される。

　次に、図１、図２に示される距離について説明する。対物レンズ１４の先端とサンプル１３の間の空間は、ワーキング・ディスタンスと呼ばれ、Ｗ．Ｄで表している。Ｗ．Ｄは焦点が合う距離であり、各対物レンズに固有の値である。基準面１７から対物レンズ胴付面までの距離をａとし、対物レンズのレンズ長さｂとし、基準面１７からサンプル１３までの距離をｃとする。対物レンズホルダ２１は、円環状をしており、対物レンズ１４を少なくとも一部を覆っており、対物レンズ胴付面３２と対物レンズホルダ取付面との差を距離ｄとする。

　Ｗ．Ｄには、数式１のような関係式がある。ａとｂは、設計によって固定値となるので、移動機構１２によって、ｃの値を可変にして、焦点が合うことになる。

　対物レンズホルダ２１は図１、２に示す通り、下方を向いた対物レンズ１４を覆う部分と、当該部分と連続して設けられたつば部を備えており、つば部の上部が顕微鏡筐体１１に固定されている。

　ここで、熱膨張あるいは熱収縮によるＷ．Ｄのドリフト量について述べる。まず、図３に示すような、対物レンズホルダ２１がなく、顕微鏡筐体１１、移動機構１２、サンプル１３、対物レンズ１４が、すべて同じ材質で構成されているとする。ここでは、使用する材質をＳＵＳとし、線膨張係数は、１０．２×１０^-6とする。

　Ｗ．Ｄのドリフト量（Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ）は、対物レンズ側の膨張量と移動機構側の膨張量の差となり、数式２に示す。以下、線膨張計算は、基準面１７からのドリフト量を計算する。

　式変形の結果から、Ｗ．Ｄのドリフト量は、Ｗ．Ｄの線膨張量となる。ここで、本実施形態での対物レンズ１４は６０倍を考えており、Ｗ．Ｄ＝０．２８ｍｍとすると、＋１℃の温度変化に対して、２．８５６ｎｍとなり、非常に小さく、一般的な対物レンズ１４の焦点深度に対しても、ラマンナノポアＤＮＡシーケンサのラマン散乱光の増幅範囲に対しても、ほとんどドリフトの影響はないことになる。

　次に、対物レンズ１４が一般的材料である黄銅になった場合、α１をＳＵＳの線膨張係数、α２を黄銅の線膨張係数（２０．５×１０^-6）とすると、

　数式３に示された、Ｗ．Ｄのドリフト量は、Ｗ．Ｄの線膨張量と、対物レンズ１４のレンズ長さｂと、顕微鏡筐体１１の線膨張係数との対物レンズ１４の線膨張係数の差を掛け合わせたものとなる。具体的に、（α１－α２）×ｂ×ΔＴは、＋１℃の温度変化に対して、－４６３．５ｎｍとなる。

　油浸系および水浸系の対物レンズ１７のおよその焦点深度は、６０倍、１００倍ともに３００ｎｍ～４００ｎｍである。したがって、一般的な光学顕微鏡の対物レンズ１４の焦点深度に対しても、ラマンナノポアＤＮＡシーケンサのラマン散乱光の増幅範囲に対しても、線膨張係数の異なる対物レンズ１４が装着される構成では、ドリフトの影響を受けることになる。

　このドリフトの影響を低減するため、図１に示す本発明の対物レンズホルダ２１を装着した場合を考える。顕微鏡筐体１１を距離ｄだけ上方に伸ばし、対物レンズホルダ取付面３４を製作し、対物レンズ１４が装着された対物レンズホルダ２１が接触しないように、顕微鏡筐体１１にザクリ穴を製作された形状となっている。

　顕微鏡筐体１１、移動機構１２、サンプル１３が、線膨張係数α１の材質で構成され、対物レンズ１４、対物レンズホルダ２１が線膨張係数α２の材質で構成されているとする。ここでは、α１をＳＵＳ線膨張係数、α２を黄銅の線膨張係数とする。対物レンズホルダ２１付きのＷ．Ｄのドリフト量（Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ）を数式４に示す。

　数式４から、（ｂ－ｄ）が０に近づくほど、Ｗ．Ｄのドリフト量は小さくなる。線膨張係数の異なる対物レンズ１４が装着される構成でも、本発明の対物レンズホルダ２１を取り付けることにより、ドリフトの影響を容易、かつ、確実に低減することができる。

　図４は、本発明の対物レンズホルダ２１を装着し、対物レンズホルダ２１によって低減されたドリフトを、さらに低減する第２の実施形態を示すもので、この実施形態では、サンプルを保持するサンプルホルダ４１が追加されている。

　図５には、サンプルホルダ４１の詳細を示すもので、サンプルホルダは、２枚の板状の部材５１と、これら板状の部材５１に挟まれた柱状の部材５２から構成され、板状の部材５１の線膨張係数は、顕微鏡筐体１１の線膨張係数と同じであり、かつ、柱上の部材５２の線膨張係数は筐体の線膨張係数より小さいことを特徴としている。

　実施例１の形態は、数式４から、（ｂ－ｄ）が０に近づくほど、Ｗ．Ｄのドリフト量は低減できるが、完全にドリフト０にするためには、対物レンズ１４のレンズ長さ４５ｍｍ（＝ｂ）に対して、対物レンズ胴付面３２と対物レンズホルダ取付面との差を距離ｄを約４４．７２ｍｍにしなくてはならない。しかし、対物レンズホルダ２１は、対物レンズ１４に円環状に覆っており、対物レンズホルダ２１の固定部分の厚みが対物レンズ１４の先端よりもサンプル１３に近づく構成になる。円環状の対物レンズホルダ２１を、移動機構１２より大きくするなど回避策はあるが、これは現実的ではない。本実施例は更なるドリフト低減のため方法である。

　顕微鏡筐体１１、移動機構１２、サンプル１３が、線膨張係数α１の材質で構成され、対物レンズ１４、対物レンズホルダ２１が線膨張係数α２の材質で構成され、サンプルホルダ４１の柱状の部材５２が線膨張係数α３の材料で構成されているとする。α１＜α２で、α３はα１、α２に比べ、線膨張係数の小さい材料であるとして計算する。対物レンズホルダ２１とサンプルホルダ４１付きのＷ．Ｄのドリフト量（Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ＿４）を数式５に示す。

　数式５から、（α１－α２）×（ｂ－ｄ）×ΔＴで残ったドリフト量を、（α１－α２）×ｅ×ΔＴで補償することで、Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ＿４をゼロにできる。

　本発明の対物レンズレンズホルダ２１の第３の実施形態について述べる。この実施形態では、対物レンズレンズホルダ２１の材質が、対物レンズ１４の材質と異なるように構成されている。顕微鏡筐体１１、移動機構１２、サンプル１３が、線膨張係数α１の材質で構成され、対物レンズ１４が線膨張係数α２の材質で構成され、対物レンズホルダ２１が線膨張係数α４の材料で構成されているとする。α１＜α２で、α３はα２に比べ、線膨張係数の大きい材料であるとして計算する。実施例３の形態を図２の形態に適用した場合のＷ．Ｄのドリフト量（Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ＿５）を数式６に示す。

　数式６から、対物レンズ１４のドリフト量を（α１－α２）×ｂ×ΔＴを、（α１－α４）×ｄ×ΔＴで、適切なα４とｄの値を決めることで、移動機構のドリフト量をキャンセルし、Ｗ．Ｄ＿Ｄｒｉｆｔ＿５をゼロにできる。

　また実施例３の対物レンズホルダ２１を使用することで、これまでは、移動機構は図示しないステージ筐体、ステージガイド、その他構成はすべてα１の材質に統一していたが、一般的には、ステージ筐体にはアルミが使用され、ステージガイドには鉄系の材料が使用され、異なる材質を水平方向に固定するため、バイメタル効果が引き起こされる。その際のこれまで行ってきた線膨張係数計算では、予想が難しいが、この場合には、実施例３と同じ構造で、適切なα４とｄの値で解決することができる。

　以下、線膨張係数α４と距離ｄの決定方法について、細かい計算を省き、線膨張係数の大小から説明する。バイメタル効果による個別に温度による変化の方向と量を測定することにより知ることができるため、移動機構１２のドリフト量が対物レンズ側のドリフト量より小さく、温度上昇によりサンプル１３が対物レンズ１４の先端から離れる場合には、数式７から、α４≦α２かつ、ｄを、すなわち、対物レンズホルダ２１の線膨張係数および長さが決められる。

　図６は、本発明の第４の実施形態を示すもので、この実施形態では、対物レンズ１４のドリフトをキャンセルするように、柱状の顕微鏡筐体の一部６１の材質を対物レンズ１４の材質と柱状の顕微鏡筐体の一部６１の長さをレンズ長さと同じに構成されている。柱状の顕微鏡筐体の一部６１を対物レンズ１４の材質、長さを同じにすることで、ドリフトがキャンセルされる。

　これは、上述と同様の計算を行い、違う材質、違う長さにしてもドリフトが低減される。

　図７は、本発明の第５の実施形態を示すもので、この実施形態では、本発明のサンプルホルダが、倒立型顕微鏡に適用される。なお、この実施形態では、サンプルホルダ４１の形状でドリフトキャンセルを行う例だが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、対物レンズホルダ２１の形態でドリフト補償するようにしても良い。そして、上述した第１、第３の実施形態では、対物レンズホルダ２１を円環状に形成した例について説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、例えば、対物レンズ１４の軸対称に形成しても良い。

１１　　顕微鏡筐体
１２　　移動機構
１３　　サンプル
１４　　対物レンズ
１５　　光学系
１６　　カメラ
１７　　基準面
２１　　対物レンズホルダ
３１　　対物レンズ筐体
３２　　レンズ複合体
３３　　対物レンズ胴付面
３４　　対物レンズホルダ取付面
４１　　サンプルホルダ
５１　　板状の部材
５２　　柱状の部材
６１　　柱状の顕微鏡筐体の一部

Claims

　対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた光学顕微鏡において、
　対物レンズを筐体に保持する対物レンズホルダをさらに備え、
　対物レンズの最上部は、対物レンズと接しており、かつ、
　対物レンズホルダは、対物レンズの少なくとも一部を覆っており、筐体に対して、対物レンズの最上部の位置より下方で固定される、光学顕微鏡。
　請求項１において、
　対物レンズおよび対物レンズホルダは、線膨張係数が等しいことを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項２において、
　サンプル、位置調整機構、筐体は、互いに線膨張係数が等しく、対物レンズおよび対物レンズホルダの線膨張係数とは異なることを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１において、
　対物レンズと対物レンズホルダは、ネジ部により螺合されていることを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１において、
　筐体の内側は、対物レンズが取り付けられる位置に、凹部が設けられていることを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１において、
　対物レンズホルダは、対物レンズの熱膨張または熱収縮による対物レンズとサンプルとの距離の変化を低減するために設けられていることを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１において、
　対物レンズホルダは、下方を向いた対物レンズを上方から覆う部分と、当該部分と連続して設けられたつば部を備えており、当該つば部の上部が筐体に固定されていることを特徴とする、光学顕微鏡。
　対物レンズと、サンプルを保持するサンプルホルダと、サンプルホルダの位置を調整する機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた光学顕微鏡において、
　サンプルホルダは、少なくとも２枚の板状の第１部材と、これらの第１部材に挟まれた柱状の第２部材から構成され、
　第１部材の線膨張係数は、筐体の線膨張係数と略同じであり、かつ、第２部材の線膨張係数より大きいことを特徴とする、光学顕微鏡。
　対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、を備えた光学顕微鏡において、
　対物レンズおよび位置調整機構とを囲う筐体を備え、当該筐体の側面の一部が対物レンズと同じ線膨張係数を備え、かつ、筐体のその他の部分は線膨張係数が対物レンズよりも小さく、
　筐体における線膨張係数が筐体の側面と同じ部分により、対物レンズの熱膨張または熱収縮による対物レンズとサンプルとの距離の変化を低減することを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１から９のいずれかにおいて、
　前記サンプルを画像として撮像する撮像部を備えることを特徴とする、光学顕微鏡。
　請求項１から９のいずれかにおいて、
　前記サンプルのラマン散乱光を画像として撮像するための撮像部と、前記画像を解析して前記サンプルの塩基配列情報を検出する解析部とを備えることを特徴とする光学顕微鏡。
　対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた電子顕微鏡において、
　対物レンズを筐体に保持する対物レンズホルダをさらに備え、
　対物レンズの最上部は、対物レンズと接しており、かつ、
　対物レンズホルダは、対物レンズの少なくとも一部を覆っており、筐体に対して、対物レンズの最上部の位置より下方で固定される、電子顕微鏡。
　対物レンズと、サンプルを保持するサンプルホルダと、サンプルホルダの位置を調整する機構と、線膨張係数が対物レンズよりも小さい筐体とを備えた電子顕微鏡において、
　サンプルホルダは、少なくとも２枚の板状の第１部材と、これらの第１部材に挟まれた柱状の第２部材から構成され、
　第１部材の線膨張係数は、筐体の線膨張係数と略同じであり、かつ、第２部材の線膨張係数より大きいことを特徴とする、電子顕微鏡。
　対物レンズと、サンプルの位置を調整する位置調整機構と、を備えた電子顕微鏡において、
　対物レンズおよび位置調整機構とを囲う筐体を備え、当該筐体の側面の一部が対物レンズと同じ線膨張係数を備え、かつ、筐体のその他の部分は線膨張係数が対物レンズよりも小さく、
　筐体における線膨張係数が筐体の側面と同じ部分により、対物レンズの熱膨張または熱収縮による対物レンズとサンプルとの距離の変化を低減することを特徴とする、電子顕微鏡。