WO2017026173A1 - セレノネインの製造方法 - Google Patents

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WO2017026173A1
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selenonein
selenium
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惠一 市川
靖智 篠原
精一 原
恵子 黒澤
由美子 山下
倫明 山下
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キッコーマン株式会社
国立研究開発法人水産研究・教育機構
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing selenonein, and more particularly to a method for producing selenonein using a microorganism having an ability to produce selenonein.
  • Selenium is an element belonging to Group 16 in the periodic table, that is, an oxygen group element (chalcogen element), and is an essential trace element for humans. Selenium forms part of enzymes and proteins in vivo and plays an important role in antioxidant reactions. Since it is abundant in algae, seafood, meat, egg yolk, etc., selenium can be ingested through foods containing these.
  • glutathione peroxidase containing selenocysteine and selenomethionine as constituent amino acids is known in animal species. Many selenoproteins have been reported in algae and plant species.
  • Insufficiency of selenium can lead to cell damage due to peroxide, resulting in cardiomyopathy (Katsuyama disease), Kashin-Beck disease (local disease osteoarticular osteochondrosis), coronary artery diseases such as angina and myocardial infarction, It can lead to the onset of diseases such as cardiovascular diseases.
  • cardiomyopathy Keryama disease
  • Kashin-Beck disease local disease osteoarticular osteochondrosis
  • coronary artery diseases such as angina and myocardial infarction
  • diseases such as cardiovascular diseases.
  • selenium deficiency induces muscle pain; dry skin, hepatic necrosis, lung cancer, colon cancer, prostate cancer, rectal cancer, breast cancer, leukemia, and other cancers. is there.
  • selenium has a poisonous toxicity.
  • toxicity is increased by taking the form of selenium oxanion. Therefore, it is known that excessive intake of selenium induces nail deformation and hair loss, gastrointestinal disorders, neurological disorders, myocardial infarction, acute dyspnea, renal failure and the like. Therefore, the selenium dietary intake standard is set by the Ministry of Health, Labor and Welfare. ) ⁇ g / day, the upper limit is 460 (350) ⁇ g / day (see Non-Patent Document 1, the entire description of which is incorporated herein by reference).
  • inorganic selenium inorganic selenium compound
  • organic selenium organic selenium compound
  • selenomethionine is used for the prevention and treatment of diseases related to selenium deficiency.
  • selenium yeast containing selenomethionine at a high concentration is used as one kind of organic selenium compound by culturing yeast in a medium containing inorganic selenium compound.
  • selenonein As one of other organic selenium compounds, and it is known that selenonein has a biological antioxidant action and a cell growth promoting action (see Patent Document 1, the entire description of which is disclosed herein) ).
  • Selenonein is a selenium analog in which the SH group of ergothioneine is substituted with a SeH group, and its antioxidant capacity is 1,000 times that of ergothioneine (see Non-Patent Document 3, the entire description of which is incorporated herein by reference) Reach).
  • Patent Document 1 The method described in Patent Document 1 is a method for extracting selenonein from fish organs and blood, and since the selenonein content contained in these is very small, a large amount of fish is required to obtain a large amount of selenonein. There is a problem that it becomes necessary.
  • Non-Patent Document 2 has Egt1 as an enzyme that catalyzes the reaction of producing helsinyl selenocysteine from histidine and selenocysteine, and has been transformed to overexpress the gene SPBC1604.01 encoding the enzyme. It is described that selenonein was synthesized in vivo using converted Schizosaccharomyces pombe. However, there is a problem that the amount of selenonein obtained using the transformed Schizosaccharomyces pombe described in Non-Patent Document 2 is very small.
  • the problem to be solved by the present invention is that selenonein can be produced in a higher yield than the transformed Schizosaccharomyces pombe described in Non-Patent Document 2, so that selenonein can be produced on an industrial scale. It is an object of the present invention to provide a method for producing selenonein that makes it possible.
  • the present inventors have encoded an enzyme that catalyzes a reaction for producing selenonein from histidine and selenium compounds in Aspergillus sojae , a kind of fungus. Succeeded in identifying the gene AsEgtA.
  • the present inventors create a DNA construct for overexpressing the AsEgtA protein, introduce it into Aspergillus soya and transform it to produce a transformed Aspergillus soya that overexpresses the AsEgtA protein. Succeeded.
  • the gene AoEgtA of Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae ) having high homology with the gene AsEgtA was identified and succeeded in producing a transformed Aspergillus oryzae that overexpresses the AoEgtA protein.
  • the obtained transformant can produce not only organic selenium compounds such as selenocystine but also selenonein from inorganic selenium compounds such as selenite, and the amount thereof is described in Non-Patent Document 2.
  • the amount was significantly higher than that of the described transformed Schizosaccharomyces pombe.
  • the present inventors apparently have a higher resistance to selenium compounds compared to the wild type strain even when selenium compounds at concentrations that are toxic are added. It was found to show.
  • the transformant can be cultured according to a conventional method, and the growth rate and the like were not significantly different from the wild type. From these facts, it was found that selenonein can be mass-produced by using the transformant. The present invention has been completed based on such successful examples and knowledge.
  • the histidine and selenium compounds act on a transformant in which a gene encoding the enzyme of the following (1) is inserted and overexpressed the inserted gene.
  • a method for producing selenonein comprises the step of obtaining selenonein.
  • it is at least one selenium compound selected from the group consisting of organic selenium compounds, inorganic selenium compounds and salts thereof.
  • the organic selenium compound and a salt thereof are at least selected from the group consisting of selenocysteine, selenocystine, selenomethionine, Se- (methyl) seleno-L-cysteine, selenopeptides, selenoproteins and salts thereof, and selenium yeast.
  • the inorganic selenium compound and the salt thereof are selected from the group consisting of selenic acid, selenous acid, selenium chloride, selenium, selenium sulfide, dimethyl selenium, selenophosphoric acid, selenium dioxide and salts thereof. At least one selenium compound.
  • the transformant is a transformant into which a gene encoding the enzyme of the following (2) is further inserted and overexpresses the inserted gene.
  • pyridoxal 5′-phosphate as a coenzyme, the following formula [I] [I] Enzymes that catalyze the reaction to produce selenonein from helsinylselenocysteine
  • the host organism is a microorganism in which the transformant expresses at least one enzyme selected from the group consisting of selenate reductase, selenocysteine lyase and serine dehydratase.
  • the transformants are microorganisms belonging to the genus Aspergillus, microorganisms belonging to the genus Escherichia, microorganisms belonging to the genus Trichoderuma, microorganisms belonging to the genus Fusarium, microorganisms belonging to the genus Penicillium p, And at least one microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Neuspora as a host organism.
  • the Aspergillus (Aspergillus) microorganism of the genus Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus tamari (Aspergillus tamarii), Aspergillus awamori (Aspergillus awamori ), Aspergillus usamii , Aspergillus kawachii, and Aspergillus saitoi, an Aspergillus saitoi microorganism that belongs to the genus Aspergillus saitoi .
  • the transformant uses Escherichia coli as a host organism.
  • the transformant is a transformant in which expression of the gene encoding the enzyme of (1) is enhanced so that the amount of selenonein is increased as compared with the host organism.
  • the transformant is cultured at 30 ° C. for 5 days using a selenocystine-containing medium suitable for the growth of the host organism, wherein the gene encoding the enzyme of (1) is expressed.
  • the amount of selenonein is 10 ⁇ g / g wet cell mass, more preferably 20 ⁇ g / g wet cell mass, more preferably 40 ⁇ g / g wet cell mass, and even more preferably 100 ⁇ g / g wet cell mass. The transformant thus enhanced.
  • the gene encoding the enzyme of (1) is selected from the group consisting of a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing
  • the enzyme of (1) above is selected from the group consisting of an enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and an enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • the gene encoding the enzyme of (2) is selected from the group consisting of a gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing
  • the enzyme of (2) is an enzyme selected from the group consisting of an enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing and an enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing.
  • the production amount of selenonein is very small compared to the production method using the transformant, but organic matter such as selenocystine is used using filamentous fungi such as Aspergillus microorganisms. It has been found that selenonein can be produced from selenium compounds and inorganic selenium compounds such as selenious acid. That is, according to another embodiment of the present invention, histidine and a selenium compound are allowed to act on filamentous fungi such as Aspergillus oryzae having a gene encoding the enzyme of (1) above on genomic DNA, A method for producing selenonein is provided, including a step of obtaining selenonein.
  • a high yield of selenonein can be produced under conditions for culturing a normal host organism.
  • it can be expected to produce selenonein on an industrial scale.
  • FIG. 1 shows a control strain and a selenonein extract prepared from a culture obtained by culturing a transformed Aspergillus sojae (“(AsEgtA + AsEgtC) transformant”) in a selenocystine-added DPY liquid medium.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of LC-MS analysis in which detection of a peak corresponding to selenonein was attempted.
  • FIG. 2 shows a control strain and a selenonein extract prepared from a culture obtained by culturing a transformed Aspergillus sojae (“(AsEgtA + AsEgtC) transformant”) in a DPY liquid medium supplemented with selenocystine.
  • FIG. 1 shows a control strain and a selenonein extract prepared from a culture obtained by culturing a transformed Aspergillus sojae (“(AsEgtA + AsEgtC) transformant”) in a
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of LC-MS analysis in which detection of a peak corresponding to ergothioneine was attempted.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the MS spectrum of the peak near the retention time of 31 minutes in the LC-MS analysis result of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing the calculated value of selenonein ion distribution estimated from the natural abundance ratio in FIG.
  • FIG. 5 shows the transformation of Aspergillus soya as described in Examples into a DPY liquid medium (“DPY”), a DPY liquid medium supplemented with selenocystine (“DPY + selenocystine”), or a DPY liquid medium supplemented with selenious acid (“DPY + selenium subelen FIG.
  • DPY DPY liquid medium
  • DPY + selenocystine a DPY liquid medium supplemented with selenious acid
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of LC-MS analysis in which a peak corresponding to selenonein was tried to be detected in a selenonein extract prepared from a culture obtained by culturing using “acid”).
  • FIG. 6 shows a selenonein extract prepared from a culture obtained by culturing a control strain and transformed Aspergillus oryzae (“AoEgtA transformant”) described in Examples in a DPY liquid medium containing selenocystine.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of LC-MS analysis in which detection of a peak corresponding to is attempted.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of evaluating the toxicity to selenocystine for the control strain (“NBRC4239 strain”) and transformed Aspergillus sojae (“(AsEgtA + AsEgtC) transformant”) described in the Examples.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of evaluating the toxicity to selenite for the control strain (“NBRC4239 strain”) and transformed Aspergillus sojae (“(AsEgtA + AsEgtC) transformant”) described in the Examples.
  • FIG. 9 is a photograph of SDS-PAGE using total proteins extracted from the transformants and control strains described in the Examples.
  • Lane 1 is a control strain
  • Lane 2 is an AsEgtA transformant
  • Lane 3 is an AsEgtB transformant
  • Lane 4 is an AsEgtC transformant
  • Lane 5 is an (AsEgtA + AsEgtB) transformant
  • Lane 6 is an (AsEgtA + AsEgtC) transformant. Each of the origins is shown.
  • a histidine and selenium compound is inserted with a gene encoding an enzyme of the following (1) (hereinafter referred to as enzyme (1)), and the inserted gene is excessive It includes at least a step of obtaining selenonein by acting on the transformant to be expressed.
  • enzyme (1) an enzyme of the following (1)
  • the selenium compound includes salts, complexes, cross-linked products and derivatives of the selenium compound in addition to the selenium compound itself.
  • the transformant used in one embodiment of the production method can finally produce selenonein from the histidine and selenium compounds by overexpressing the gene encoding the enzyme (1) inserted as a foreign gene. .
  • the transformant used in one embodiment of the production method further has a gene encoding the enzyme (2) below (hereinafter referred to as enzyme (2)) inserted therein, and the inserted gene. It is preferable that the transformant overexpresses.
  • enzyme (2) An enzyme that catalyzes a reaction of producing selenonein from hercinylselenocysteine represented by the above formula [I], using pyridoxal 5′-phosphate as a coenzyme
  • the transformant used in one embodiment of the production method efficiently converts selenonein from a selenonein precursor such as helsinylselenocysteine by overexpressing a gene encoding the enzyme (2) inserted as a foreign gene. It is thought that it can be generated. However, when the host organism sufficiently expresses the enzyme (2), the gene encoding the enzyme (2) may not be inserted. There may be one or more genes encoding the overexpressed enzyme (2).
  • the transformant used in one embodiment of the production method is large and overexpresses the gene encoding enzyme (1) and does not overexpress the gene encoding enzyme (2); and enzyme (1 ) Is overexpressed and the gene encoding enzyme (2) is overexpressed.
  • Enzymatic properties of enzymes (1) and (2) Enzymatic properties of enzymes (1) and (2)
  • Enzyme (1) as shown in the formula [II], depending on the S- adenosylmethionine (SAM), histidine, catalyzes a reaction -NH 2 groups are converted to Herushinin which is trimethylated Has an activity (hereinafter referred to as a first activity).
  • the enzyme (1) has an activity (hereinafter referred to as a second activity) that can catalyze a reaction for producing hercinylselenocysteine from hercinin and selenocysteine in the presence of iron (II).
  • enzyme (1) has the first and second activities, and as a result, can generate selenonein from histidine and selenocysteine in the presence of S-adenosylmethionine and iron (II).
  • Enzyme (2) has an activity (hereinafter referred to as a third activity) capable of catalyzing a reaction for producing selenonein from hercinyl cyselenostein using pyridoxal 5'-phosphate (PLP) as a coenzyme.
  • a third activity capable of catalyzing a reaction for producing selenonein from hercinyl cyselenostein using pyridoxal 5'-phosphate (PLP) as a coenzyme.
  • the transformant used in one embodiment of the production method comprises expressing histidine and seleno under the conditions that each enzyme is activated by expressing the gene encoding enzyme (1) or enzymes (1) and (2).
  • Selenonein can finally be produced from organic selenium compounds such as cysteine.
  • the transformant can produce selenonein not only from organic selenium compounds but also from inorganic selenium compounds such as selenious acid.
  • the enzyme (1) and the enzyme (2) can also be used in an ergothioneine biosynthesis system.
  • One embodiment of a biosynthetic system of ergothioneine assumed for fungi is represented by the following formula [III]: [III] (In the formula, SAM represents S-adenosylmethionine, and PLP represents pyridoxal 5′-phosphate.) become that way.
  • Enzyme (1) corresponds to egtA in formula [III]
  • enzyme (2) corresponds to egtB and / or egtC in formula [III].
  • Enzyme (1) has the above-mentioned enzymatic properties, ie, an activity that catalyzes the reaction of producing helsinyl selenocysteine from histidine and selenocysteine in the presence of S-adenosylmethionine and iron (II).
  • the enzyme (1) since the enzyme (1) has the first and second activities, the enzyme (1) includes a conserved region (domain) that is well conserved in the enzyme having the first activity and / or the second activity. It is preferable.
  • Examples of the conserved region of the enzyme having the first activity include a conserved region of SAM-dependent methyltransferase, and specifically, a SAM-dependent methyltransferase domain including domain DUF2260.
  • Examples of the conserved region of the enzyme having the second activity include a conserved region of sulfatase, and specifically, a formylglycine-producing enzyme (FGE) -sulfatase domain. Since the enzymes have the first and second activities, the domains do not have to be integrally linked. For example, a non-conserved region may be included in the domains.
  • the enzyme (1) preferably contains a DinB_2 domain between the conserved region of SAM-dependent methyltransferase and the conserved region of sulfatase, and contains a DinB_2 domain containing HX 3 HXE that is an iron-binding motif. It is more preferable.
  • one embodiment of the enzyme (1) has a structure including a conserved region of SAM-dependent methyltransferase, a DinB_2 domain, and a conserved region of sulfatase.
  • Another embodiment of the enzyme (1) includes the domain DUF2260. It has a structure including a SAM-dependent methyltransferase domain containing, a DinB_2 domain containing HX 3 HXE, and a FGE-sulfatase domain.
  • sequence identity with the amino acid sequence of NCU04343 described in Non-Patent Document 2 is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 45% or more, still more preferably Those having an amino acid sequence of 60% or more, particularly preferably 70% or more.
  • sequence identity means identity (identity) between sequences when two sequences are aligned, and does not mean similarity between sequences (Similarity). Absent.
  • a preferred embodiment of the enzyme (1) include an accession number (the value in parentheses indicates the sequence identity as a result of Blastp using the AsEgtA protein amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 as a query) as XP_001727309.
  • a protein whose accession number is XP — 001727309.1 is a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • the protein whose accession number is XP_001397117.2 (73%) is derived from Aspergillus niger but has the expression and the first and second activities in Aspergillus soya.
  • the amino acid sequence of the AsEgtA protein has an amino acid sequence of 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, is a methyltransferase, or is a methyltransferase.
  • a protein having a methyltransferase, putative amino acid sequence or a theoretical protein amino acid sequence regarded as a methyltransferase can be used as the enzyme (1).
  • Enzyme (2) also has the enzymological properties described above, that is, has an activity of catalyzing the reaction of producing selenonein from helinylselenocysteine using pyridoxal 5'-phosphate (PLP) as a coenzyme If it is, it will not be specifically limited by a structural property, a biochemical property, an origin organism, etc. However, since the enzyme (2) has the third activity, the enzyme (2) preferably contains a conserved region (domain) that is well conserved in the enzyme having the third activity.
  • Examples of the conserved region of the enzyme having the third activity include a PLP-linked cysteine desulfurase domain.
  • the enzyme (2) is described in the document of Bello et al. (Bello MH et al., Fungal Genet Biol. 2012 Feb; 49 (2): 160-72, the entire description of which is incorporated herein by reference).
  • PLP binding that has a structure containing a PLP-binding cysteine desulfurase domain having a sequence identity of about 75% with NCU04636 and NCU11365 described in Non-Patent Document 2 is about 44%
  • the enzyme (2) may be either one of these two types or both.
  • amino acid sequence of enzymes (1) and (2) As long as the enzymes (1) and (2) have the enzymatic properties described above, preferably the enzymatic properties and structural properties described above, the amino acid sequence is not particularly limited. For example, there is an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 as an embodiment of the enzyme (1) having the enzymatic properties and structural properties described above, and one of the enzymes (2) having the enzymatic properties and structural properties described above. As an embodiment, there are amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • These enzymes having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 are all derived from Aspergillus sojae and are named AsEgtA, AsEgtB and AsEgtC proteins by the present inventors, respectively.
  • the base sequences of the genes encoding these enzymes are the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 is derived from Aspergillus oryzae and is named AoEgtA protein by the present inventors.
  • the base sequence of the gene encoding the enzyme is the base sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • AsEgtA, AsEgtB and AsEgtC proteins are encoded by genes encoding these enzymes present on the chromosomal DNA of Aspergillus soja.
  • the AoEgtA protein is encoded by a gene encoding the enzyme present on the chromosomal DNA of Aspergillus oryzae.
  • wild type gene When a gene existing on the chromosomal DNA of such an organism and a protein or enzyme encoded by the gene are referred to as “wild type gene”, “wild type protein” or “wild type enzyme”, respectively, in this specification There is.
  • amino acid sequences of the enzymes (1) and (2) have the enzymatic properties of the enzymes (1) and (2), respectively, one to several amino acids in the amino acid sequence of the wild-type enzyme It may consist of an amino acid sequence having a deletion, substitution, addition or the like.
  • the range of “1 to several” in the “deletion, substitution and addition of one to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20, preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 About 1, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
  • amino acid deletion means deletion or disappearance of an amino acid residue in the sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence is replaced with another amino acid residue.
  • Additional of amino acid means that a new amino acid residue is added to the sequence.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of the basic amino acid having a positive charge include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of acidic amino acids having a negative charge include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequences having a deletion, substitution, addition, etc. of one to several amino acids in the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme include amino acid sequences having a certain sequence identity with the amino acid sequence possessed by the wild type enzyme. For example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% with the amino acid sequence of the wild-type enzyme As mentioned above, amino acid sequences having sequence identity of 97% or more, 98% or 99% or more, more preferably 99.5% or more can be mentioned.
  • the gene encoding enzymes (1) and (2) encodes the amino acid sequence of enzymes (1) and (2) having the enzymatic properties described above, preferably the enzymatic properties and structural properties described above. There is no particular limitation as long as it has a base sequence. Enzymes (1) and (2) are produced by overexpressing genes encoding enzymes (1) and (2) in the transformant. As used herein, “gene expression” means that an enzyme encoded by a gene is produced in such a manner as to have an original catalytic activity through transcription or translation. In addition, “overexpression of a gene” in the present specification means that a protein (enzyme) encoded by the gene is produced by inserting the gene in excess of the amount originally expressed by the host organism. means.
  • the gene encoding the enzymes (1) and (2) may be a gene capable of generating the enzymes (1) and (2) via splicing after transcription of the gene when introduced into the host organism.
  • the gene may be either a gene that can produce enzymes (1) and (2) without passing through splicing after transcription of the gene.
  • the gene encoding the enzymes (1) and (2) may not be completely identical to the gene originally possessed by the derived organism (ie, the wild type gene), and encodes an enzyme having at least the above-mentioned enzymatic properties. As long as it is a gene, it may be a DNA having a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method using a DNA having a base sequence of a wild-type gene as a probe. It means the base sequence of DNA obtained by using.
  • stringent conditions in the present specification is a condition in which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal.
  • the hybridization system used, the type of probe, and the sequence It depends on the length.
  • Such conditions can be determined by changing the hybridization temperature, washing temperature and salt concentration. For example, when a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the hybridization and washing temperature and, if necessary, lowering the washing salt concentration. If no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, raising the washing salt concentration.
  • hybridization is 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v), a nucleic acid hybridization blocking reagent (Boehringer Mannheim), 0 1% (w / v) N-lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS is used overnight (about 8 to 16 hours). Washing is performed using 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, twice for 15 minutes. Do.
  • the temperature for performing hybridization and washing is 65 ° C or higher, preferably 68 ° C or higher.
  • the DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions for example, using a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter on which the DNA fragment is immobilized, After performing hybridization at 40 to 75 ° C. in the presence of DNA obtained by hybridization under the above stringent conditions or 0.5 to 2.0 M NaCl, preferably 0.7 to 1. After hybridization at 65 ° C. in the presence of 0 M NaCl, 0.1 to 1 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) at 65 ° C. Examples thereof include DNA that can be identified by washing the filter.
  • Probe preparation and hybridization methods are described in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd-Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereinafter these documents are referred to as reference technical documents, all of which are incorporated herein by reference). It can be carried out according to the method described. In addition to the conditions such as the salt concentration and temperature of the buffer, those skilled in the art will consider other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. Conditions for obtaining a DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary base sequence can be appropriately set.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain sequence identity with a base sequence of a DNA having a base sequence of a wild-type gene used as a probe. 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more , 98% or 99% or more, more preferably 99.5% or more of DNA having sequence identity.
  • the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild type gene under stringent conditions is, for example, 1 to several, preferably 1 to 50, more preferably, in the base sequence of the wild type gene. Has 1 to 30, more preferably 1 to 20, even more preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 base deletions, substitutions, additions, etc. Contains the base sequence.
  • base deletion means that there is a deletion or disappearance in the base in the sequence
  • base replacement means that the base in the sequence is replaced with another base
  • “Addition of a base” means that a new base is added to be inserted.
  • the enzyme encoded by the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is 1 to several in the amino acid sequence of the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene. Although it is likely to be an enzyme having an amino acid sequence having deletion, substitution, addition, etc. of individual amino acids, it has the same enzyme activity as the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene.
  • the method for determining the sequence identity of the base sequence or amino acid sequence is not particularly limited. For example, using a generally known method, the amino acid sequence of the enzyme encoded by the wild type gene or the wild type gene and the target base sequence And a program for aligning amino acid sequences and calculating the coincidence ratio between the two sequences.
  • a person skilled in the art can search, for example, a sequence showing high sequence identity from a database using a program described above. These can be used, for example, on the website of the US National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • Each of the above methods can be generally used for searching a sequence showing sequence identity from a database.
  • Genetyx network version version 12.0. 1 Genetics
  • This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985).
  • CDS or ORF a region encoding a protein
  • the gene encoding the enzymes (1) and (2) is derived from, for example, a species having selenonein-producing ability or ergothioneine-producing ability, or a species having the expression of the enzymes (1) and (2).
  • Examples of the organism derived from the genes encoding the enzymes (1) and (2) include microorganisms. Among microorganisms, filamentous fungi are preferable because there are many bacterial species known to have ergothioneine-producing ability.
  • filamentous fungi Aspergillus (Aspergillus) filamentous fungi and the like, more specifically Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus Tamari (Aspergillus tamarii), Aspergillus awamori (Aspergillus awamori), Aspergillus Usami (Aspergillus usamii), Aspergillus kawachii (Aspergillus kawachii), Aspergillus saitoi (Aspergillus saitoi) and the like.
  • the organism from which the genes encoding enzymes (1) and (2) are derived is not particularly limited, but enzymes (1) and (2) expressed in the transformant are inactivated by the growth conditions of the host organism. There is a probability of not showing or showing each activity. Therefore, the organism from which the genes encoding enzymes (1) and (2) are derived is a microorganism whose growth conditions approximate that of the host organism to be transformed by inserting the genes encoding enzymes (1) and (2). Preferably there is.
  • the gene encoding the enzymes (1) and (2) can be inserted into various appropriate known vectors. Furthermore, this vector can be introduced into an appropriate known host organism to produce a transformant into which a recombinant vector (recombinant DNA) containing the genes encoding enzymes (1) and (2) has been introduced. Methods for obtaining genes encoding enzymes (1) and (2), gene sequences encoding enzymes (1) and (2), methods for obtaining amino acid sequence information of enzymes (1) and (2), various vectors A production method, a production method of a transformant, and the like can be appropriately selected by those skilled in the art. Moreover, in this specification, a transformation and a transformant include a transduction and a transductant, respectively. An example of the cloning of the genes encoding the enzymes (1) and (2) will be described later without limitation.
  • a generally used gene cloning method can be appropriately used.
  • chromosomal DNA and mRNA can be extracted from microorganisms and various cells capable of producing the enzymes (1) and (2) by conventional methods, for example, methods described in reference technical literature.
  • CDNA can be synthesized using the extracted mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • the gene encoding the enzymes (1) and (2) can be obtained by cloning using a chromosomal DNA or cDNA derived from a microorganism having the gene as a template.
  • the organisms from which the genes encoding enzymes (1) and (2) are derived are as described above, and specific examples include Aspergillus soya NBRC4239 strain and Aspergillus oryzae RIB40 strain.
  • Aspergillus soya NBRC 4239 strain culturing Aspergillus soya NBRC 4239 strain, removing moisture from the obtained bacterial cells, and by physically grinding using a mortar or the like while cooling in liquid nitrogen, to make a fine powdered bacterial cell piece, A chromosomal DNA fraction is extracted from the cell fragments by a conventional method.
  • a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) can be used for the chromosomal DNA extraction operation.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the primer is not particularly limited as long as a DNA fragment containing the gene can be amplified. Examples thereof include primers represented by SEQ ID NOs: 17 to 22 designed with reference to the genome sequence of Aspergillus soja. When these primers are used, the entire length of the target gene is amplified, so that RACE can be omitted.
  • DNA containing the target gene fragment can be amplified by appropriate PCR such as 5'RACE method or 3'RACE method, and these can be ligated to obtain DNA containing the full length target gene.
  • the method for obtaining the genes encoding the enzymes (1) and (2) is not particularly limited.
  • the enzymes (1) and (2) can be obtained using a chemical synthesis method without using a genetic engineering technique. It is possible to construct a gene to encode.
  • Confirmation of the base sequence in the amplification product amplified by PCR or the chemically synthesized gene can be performed, for example, as follows. First, a DNA whose sequence is to be confirmed is inserted into an appropriate vector according to a normal method to produce a recombinant DNA.
  • kits such as TA Cloning Kit (Invitrogen); pUC119 (Takara Bio), pUC18 (Takara Bio), pBR322 (Takara Bio), pBluescript SK + (Stratagene), pYES2
  • plasmid vector DNA such as / CT (Invitrogen); commercially available bacteriophage vector DNA such as ⁇ EMBL3 (Stratagene) can be used.
  • the recombinant DNA is used to transform a host organism, for example, E. coli ( Escherichia coli ), preferably E. coli JM109 (Takara Bio) or E. coli DH5 ⁇ (Takara Bio).
  • the recombinant DNA contained in the obtained transformant is purified using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the base sequence of each gene inserted into the recombinant DNA is determined by the dideoxy method (Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983).
  • the sequence analysis apparatus used for determining the base sequence is not particularly limited, and examples thereof include Li-COR MODEL 4200L Sequencer (Aloka), 370 DNA Sequence System (PerkinElmer), and CEQ2000XL DNA Analysis System (Beckman). Can be mentioned.
  • the translated protein that is, the amino acid sequences of the enzymes (1) and (2) can be known.
  • a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding the enzymes (1) and (2) comprises a PCR amplification product containing any of the genes encoding the enzymes (1) and (2) and various vectors. It can be constructed by linking in a form that allows expression of genes encoding enzymes (1) and (2). For example, it can be constructed by excising a DNA fragment containing either of the genes encoding enzymes (1) and (2) with an appropriate restriction enzyme and ligating the DNA fragment with a plasmid cut with an appropriate restriction enzyme. it can.
  • a DNA fragment containing the gene to which a sequence homologous to the plasmid is added at both ends and a plasmid-derived DNA fragment amplified by inverse PCR are combined with a commercially available group such as In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). It can be obtained by ligation using a replacement vector preparation kit.
  • the production method of the transformant used in one embodiment of the production method is not particularly limited.
  • the host is used in such a manner that the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) is expressed according to a conventional method.
  • the method of inserting into living organisms is mentioned. Specifically, a DNA construct is prepared by inserting any of the genes encoding enzymes (1) and (2) between an expression-inducing promoter and a terminator, and then containing a gene encoding enzyme (1).
  • a gene encoding enzyme (1) by transforming a host organism with both a DNA construct containing a gene encoding gene or enzyme (1) and a DNA construct containing a gene encoding enzyme (2) A transformant overexpressing both the genes encoding (1) and (2) is obtained.
  • a DNA fragment comprising an expression-inducible promoter-enzyme (1) or (2) -encoding gene-terminator and a recombinant vector containing the DNA fragment prepared for transforming a host organism are DNA.
  • the method for inserting the enzyme (1) or the gene encoding the enzymes (1) and (2) into the host organism in a manner in which the gene is expressed is not particularly limited. Examples include a method of direct insertion; a method of introduction into a host organism by ligation on a plasmid vector.
  • a DNA construct in the method using homologous recombination, can be ligated and inserted into the genome of the host organism between sequences homologous to the upstream region and downstream region of the recombination site on the chromosome.
  • the high expression promoter is not particularly limited, and examples thereof include a promoter region of the TEF1 gene (tef1), which is a translation elongation factor, a promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy), an alkaline protease gene (alp) promoter region, and the like.
  • a DNA construct in a method using a vector, can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of a host microorganism by a conventional method, and the corresponding host organism can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing enzyme (1) or enzymes (1) and (2) in the host organism.
  • a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing enzyme (1) or enzymes (1) and (2) in the host organism.
  • pUC19 and filamentous fungi Systems pSTA14 (Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989) and filamentous fungi systems.
  • the DNA construct is preferably used after being introduced into the chromosome of the host organism.
  • the DNA construct is used in an autonomously replicating vector (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)). By incorporating it, it can be used in a form not introduced into the chromosome.
  • the DNA construct may include a marker gene to allow selection of transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include genes that complement the auxotrophy of the host organism such as pyrG, niaD, and adeA; and drug resistance genes for drugs such as pyrithiamine and hygromycin B oligomycin.
  • DNA constructs also include promoters, terminators and other regulatory sequences (eg, enhancers, polyadenylation) that allow overexpression of the gene encoding enzyme (1) or enzymes (1) and (2) in the host organism. Preferably including a sequence).
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter and a constitutive promoter, such as a tef1 promoter, an alp promoter, and an amy promoter.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, and a tef1 terminator.
  • the expression control sequence of the gene encoding the enzyme (1) or (2) is such that the DNA fragment containing the gene encoding the enzyme (1) or (2) to be inserted has an expression control function. It is not always necessary to include sequences. Further, when transformation is performed by the co-transformation method, the DNA construct may not have a marker gene.
  • the DNA construct can be tagged for purification.
  • a linker sequence is appropriately connected upstream or downstream of the gene encoding the enzyme (1) or (2), and a base sequence encoding histidine is connected by 6 codons or more, thereby enabling purification using a nickel column. can do.
  • a tef1 gene promoter for example, a tef1 gene promoter, a gene encoding the enzyme (1) or (2), an alp gene terminator and a pyrG marker gene are linked to the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19. It is the made DNA construct.
  • a method for transformation into filamentous fungi a method known to those skilled in the art can be appropriately selected.
  • a protoplast PEG method using polyethylene glycol and calcium chloride for example, Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-2222055, etc.
  • a medium for regenerating the transformant an appropriate medium is used according to the host organism to be used and the transformation marker gene.
  • the regeneration of the transformant is, for example, Czapek-Dox minimal medium containing 0.5% agar and 1.2 M sorbitol. (Difco).
  • the enzyme (1) or enzymes (1) and (2) that the host organism originally has on the chromosome using homologous recombination may be replaced with a high expression promoter such as tef1.
  • a transformation marker gene such as pyrG in addition to the high expression promoter.
  • the upstream region of the gene encoding enzyme (1) or (2) —transformation marker gene—high expression A transformation cassette comprising all or part of the gene encoding the promoter-enzyme (1) or (2) can be used.
  • the upstream region of the gene encoding the enzyme (1) or (2) and the whole or part of the gene encoding the enzyme (1) or (2) are used for homologous recombination.
  • a gene including a region in the middle from the start codon can be used as the whole or part of the gene encoding the enzyme (1) or (2).
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or more.
  • confirmation that the transformant used in one embodiment of the production method has been prepared is obtained by extracting chromosomal DNA from the transformant, performing PCR using this as a template, and performing amplification when transformation occurs. This may be done by confirming that a possible PCR product is generated.
  • PCR is performed with a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transformation marker gene, and it is confirmed that a product of the expected length is generated.
  • PCR is performed using a combination of a forward primer located upstream from the upstream homologous region used and a reverse primer located downstream from the used homologous region. It is preferable to confirm that a product of the expected length is produced when recombination occurs.
  • a DNA construct containing a gene encoding the enzyme (1) or a DNA construct containing a gene encoding the enzyme (1) and a DNA construct containing the gene encoding the enzyme (2) are transformed with the enzyme ( 1) or microorganisms capable of producing enzymes (1) and (2) are not particularly limited, and examples thereof include microorganisms capable of metabolizing selenium from the viewpoint of the toxicity of selenium compounds, such as selenate reductase (EC1).
  • selenocysteine lyase EC 4.4.1.16
  • serine dehydratase EC 4.3.1.17
  • a microorganism that expresses two or more of these enzymes Aspergillus (Aspergillus) microorganisms of the genus, Escherichia (Escheric ia) microorganism, Trichoderma (Trichoderma) microorganism belonging to the genus Fusarium (Fusarium) microorganism belonging to the genus Penicillium (Penicillium) microorganism belonging to the genus, Rhizopus (Rhizopus) microorganisms, filamentous fungi, such as Neurospora crassa (Neuspora) microorganisms, photosynthetic microorganisms and probiotic More preferred are microorganisms.
  • Acinetobacter microorganisms Acinetobacter ), Aeromonas microorganisms ( Aeromonas ), Arthrobacter microorganisms ( Arthrobacter ), Bacillus microorganisms ( Bacillus ), Candida microorganisms ( Candida ), Cephalosporium microorganisms a microorganism belonging to the genus (Citrobacter), microorganism of the genus Corynebacterium (Corynebacterium), Flavobacterium microorganisms belonging to the genus (Flavobacterium), Fusarium microorganism belonging to the genus (Fusarium), Micrococcus microorganism belonging to the genus (Micrococcus), Neurospora microorganism belonging to the genus (Neurospora), Penicillium microorganism belonging to the genus ( Penicillium ), Pseudomonas microorganisms ( Pseudomonas ), Salmonella
  • Tauera selenatis Tauera selenatis
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae
  • Bacillus selenatalsenates Bacillus selenates
  • these microorganisms can be used as host organisms. Moreover, not only these but what strengthened or heterologously expressed the selenium metabolism gene can be used as a host organism. Furthermore, there is a probability that it can be a gene derived from the gene encoding enzyme (1) or the gene encoding enzyme (2).
  • filamentous fungus capable of producing ergothioneine and a filamentous fungus having a gene encoding the enzymes (1) and (2) on the genomic DNA are more preferable.
  • filamentous fungi include Donald et al. (Donald B. Melville et al, J. Biol. Chem. 1956, 223: 9-17, the entire description of which is incorporated herein by reference) and Dorothy. And the like (Dorothy S. Genghof, J. Bacteriology, Aug. 1970, p.
  • Aspergillus Neurospora, Penicillium, Fusarium (Fusarium) genus Trichoderma (Trichoderma) genus include filamentous bacteria belonging to such Mucor (Mucor) genus.
  • Neosartorya Neosartorya
  • Bissokuramisu Bossochlamys
  • Talaromyces Talaromyces
  • Talaromyces Talaromyces
  • Ajeromisesu Ajellomyces
  • para cock Sidi Oy death Paracoccidioides
  • Anshinokarupusu Uncinocarpus
  • cock Sidi Oy death Coccidioides
  • Arufuroderuma Arthroderma
  • Trichophyton Trichophyton
  • Ekusofira Exophiala
  • Kapuronia Capronia
  • Kuradofiaro Fora Cadophialophora
  • macro Mina Macrophomina
  • Aspergillus soya Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, listed above as genes derived from the genes encoding enzymes (1) and (2), It is preferably an Aspergillus microorganism such as Aspergillus tamari, Aspergillus awamori, Aspergillus usami, Aspergillus kawachi, Aspergillus cytoii.
  • Examples of the gene encoding the enzyme (1) derived from the Aspergillus soja NBRC4239 strain include the gene AsEgtA described in Examples described later.
  • the gene AsEgtB and AsEgtC which are described in the Example mentioned later are mentioned, for example.
  • the base sequences of the genes AsEgtA, AsEgtB, and AsEgtC are shown as SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing, respectively.
  • the amino acid sequences of AsEgtA, AsEgtB, and AsEgtC proteins are shown as SEQ ID NOs: 4 to 6 in the sequence listing, respectively.
  • Examples of the gene encoding the enzyme (1) derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain include the gene AoEgtA described in Examples described later.
  • the base sequence of the gene AoEgtA is shown as SEQ ID NO: 23 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the AoEgtA protein is shown as SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • a method for obtaining genes encoding enzymes (1) and (2) from microorganisms other than Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae is not particularly limited.
  • the base sequences of genes AsEgtA, AsEgtB, AsEgtC, and AsoEgtA (SEQ ID NO: 1 to 3 and 23) and BLAST homology search of genomic DNA of microorganisms other than Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae based on the amino acid sequences of AsEgtA, AsEgtB, AsEgtC and AoEgtA proteins (SEQ ID NOs: 4 to 6 and 24), It can be obtained by specifying a gene having a base sequence having high sequence identity with the base sequences of the genes AsEgtA, AsEgtB, AsEgtC and AoEgtA.
  • a protein having an amino acid sequence having a high sequence identity with the AsEgtA, AsEgtB, AsEgtC and AoEgtA proteins is identified, and the gene encoding the protein is identified Can be obtained. That the obtained gene corresponds to the gene encoding the enzymes (1) and (2) is to confirm that selenonein is produced by transforming the derived organism as a host organism with the obtained gene, Alternatively, it can be confirmed that the production amount of selenonein is enhanced as compared with the host organism.
  • the gene encoding the enzyme (1) obtained from Aspergillus soja or the enzymes (1) and (2) can be introduced into Aspergillus oryzae or Aspergillus niger as a host organism for transformation.
  • the organism and the host organism of the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) are preferably the same.
  • the Aspergillus soya-derived enzyme (1) or the gene encoding the enzymes (1) and (2) may be transformed into the same Aspergillus soja.
  • Genes encoding the enzymes (1) and (2) are codons for expression in the host organism based on the amino acid sequences of the genes encoding the enzymes (1) and (2) derived from Aspergillus sojae, It may be a gene with optimized secondary structure, GC content and the like. Specific examples of such genes include EcEgtA (SEQ ID NO: 27) and EcEgtC (SEQ ID NO: 28) synthesized for E. coli expression.
  • One embodiment of the transformant used in one embodiment of the production method is a transformed Aspergillus soja transformed by inserting the gene AsEgtA into Aspergillus soya and overexpressing the AsEgtA protein.
  • Another embodiment of the transformant is a transformed Aspergillus oryzae transformed by inserting the gene AoEgtA into Aspergillus oryzae and overexpressing the AoEgtA protein.
  • Such transformed Aspergillus sojae and transformed Aspergillus oryzae overproduce AsEgtA and AoEgtA protein, so that they are not produced in the host organism, or even if they are produced, they will produce more selenonein than is detectable. Can do.
  • transformed Aspergillus soya and transformed Aspergillus oryzae are not limited to organic selenium compounds such as selenocysteine and selenocystine, but also selenonein from inorganic selenium compounds such as selenite. Can be produced. Therefore, one embodiment of the transformant is a transformation wherein the expression of the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) is enhanced so that the amount of selenonein is increased as compared to the host organism. It is preferable that it is a body.
  • the expression of the gene encoding the enzymes (1) and (2) is greater than that of the transformant in which the expression of the gene encoding the enzyme (1) is enhanced. More preferably, the transformant is enhanced so as to increase the amount.
  • transformed Aspergillus soya transformed to overexpress AsEgtA protein is 30 ° C. using a DPY medium suitable for the growth of the host organism Aspergillus soya, By culturing for 4 to 5 days, 15.8 ⁇ g of selenonein was obtained when 1% of selenious acid was used per 1 g of wet cell mass, and 207.9 ⁇ g of selenonein when selencystine was used.
  • the transformant is a selenium compound-containing medium in which the expression of the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) is suitable for the growth of the host organism.
  • Characters enhanced so that the amount of selenonein when cultured at 30 ° C. for 5 days per gram of wet cell mass is, for example, 5 ⁇ g or more, preferably 10 ⁇ g or more, more preferably 20 ⁇ g or more, and even more preferably 40 ⁇ g or more. It is a conversion body.
  • Another embodiment of the transformant uses a selenite-containing medium in which the expression of the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) is suitable for the growth of the host organism. When cultivated at 30 ° C.
  • the amount of selenonein per gram of wet cell mass was enhanced to be, for example, 5 ⁇ g or more, preferably 6 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more, more preferably 15 ⁇ g or more.
  • It is a transformant.
  • the expression of the gene encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2) is performed using a selenocystine-containing medium suitable for the growth of the host organism. When cultivated at 30 ° C.
  • the amount of selenonein per gram of wet cell mass is, for example, 10 ⁇ g or more, preferably 20 ⁇ g or more, more preferably 40 ⁇ g or more, more preferably 100 ⁇ g or more, still more preferably 200 ⁇ g or more. It is a transformant that has been enhanced.
  • the transformant used in one embodiment of the production method is originally possessed by the host organism at the same time as the enzymes (1) and (2) produced by the genes encoding the inserted enzyme (1) and enzyme (2).
  • the genes encoding the enzymes (1) and (2) may produce wild-type enzymes (1) and (2) having the same or different structural properties as the enzymes (1) and (2). is there.
  • the transformant used in one embodiment of the production method can produce selenonein even if the gene encoding the enzyme (2) is not introduced.
  • the transformant used in one embodiment of the production method is a transformed archaebacteria or transformation into which genes encoding enzymes (1) and (2) are inserted and overexpressing the inserted genes
  • Examples include true bacteria.
  • transformed eubacteria include E. coli transformed with EcEgtA or a plasmid vector containing EcEgtA and EcEgtC.
  • histidine and selenium compound are transformed with the gene (encoding the enzyme (1) or the enzymes (1) and (2)) inserted therein and overexpressing the inserted gene.
  • a method for producing selenonein comprising at least a step of obtaining selenonein by acting on a body.
  • the method of allowing histidine and selenium compounds to act on the transformant is not particularly limited as long as it is a method in which histidine and selenium compound and the transformant are brought into contact with each other, and selenonein can be produced by the enzyme of the transformant.
  • a method for producing selenonein by culturing a transformant under a culture condition suitable for growth of the transformant using a medium containing histidine and a selenium compound and suitable for growth of the transformant. can be mentioned.
  • the culture method is not particularly limited, and examples thereof include a solid culture method and a liquid culture method performed under aerated or non-aerated conditions.
  • the amount of selenium compound added is not particularly limited as long as the growth inhibition of the transformant is not observed.
  • the amount of selenium compound is sufficiently small relative to the bacterial cell concentration at the beginning of the culture, preferably 1 mM. Or less, more preferably 0.1 mM or less, and even more preferably 0.05 mM or less. If it is desired to obtain a large amount of selenonein, it is preferable to increase the selenium compound as the culture progresses or as the bacterial cell concentration increases.
  • a selenium compound may be additionally added to the culture solution at a concentration of 0.001 to 10 mM, preferably 0.005 to 5 mM, after 1 to 24 hours, preferably 3 to 22 hours from the start of culture. It is done.
  • any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains a normal medium for culturing a host organism, that is, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and other nutrients in an appropriate ratio.
  • a host organism is a microorganism belonging to the genus Aspergillus, a DPY medium or the like as described in Examples described later can be used, but is not particularly limited.
  • the medium component preferably contains iron (II) necessary for the activation of the enzyme (1). Iron (II) can be added to the medium as a compound, but may be added as a mineral-containing material.
  • the selenium compound is not particularly limited as long as it contains selenium as a constituent element, for example, organic selenium compounds and inorganic selenium compounds and salts thereof.
  • organic selenium compounds and salts thereof include selenocysteine, selenocystine, Selenomethionine, Se- (methyl) seleno-L-cysteine, selenopeptides, selenoproteins and salts thereof, and selenium yeast are preferred.
  • Inorganic selenium compounds and salts thereof include selenate, selenite, selenium chloride, selenium, Selenides, selenium sulfide, dimethyl selenium, selenophosphoric acid, selenium dioxide and their salts are preferred.
  • the selenium compound may be an organic substance containing an organic selenium compound, an inorganic selenium compound, and salts thereof.
  • Examples of the organic substance include bonito (processed product, dried bonito), mustard (powder, mustard with grains, kneaded mustard), pig (kidney, liver, raw), sea bream (beans, raw), sea bream (raw, raw) , Suketo Udara (Tarako, Raw), Black Tuna (Red, Raw), Magarei (Raw), Skipjack (Autumn, Raw), Snow crab (Raw), Sunflower seeds (Fry, Seasoned), Maji Foods that are known to contain a large amount of selenium such as (baked), red rice (raw), granule-flavored seasonings, kihada (raw), binnaga (raw), oysters (boiled) Can be, but is not limited to. Selenium compounds can be used alone or in combination of two or more thereof.
  • selenocysteine and selenocystine are more preferable.
  • the method for obtaining selenocysteine and selenocystine is not particularly limited.
  • selenocysteine can be produced with reference to JP-A-2001-61489.
  • the transformant used in one embodiment of the production method may be the above-described transformant.
  • an organic selenium compound such as selenocysteine or selenocystine
  • the enzymes (1) and (2) When an inorganic selenium compound such as selenite is used as the selenium compound, an enzyme (1) can be used.
  • a transformant in which a gene to be encoded is inserted and the inserted gene is overexpressed can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the culture conditions for the transformant may be those normally known by those skilled in the art.
  • the initial pH of the medium is adjusted to 5 to 10
  • the culture temperature Can be set as appropriate, such as 20 to 40 ° C., culture time of several hours to several days, preferably 1 to 7 days, more preferably 2 to 4 days.
  • the culture means is not particularly limited, and aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture, and the like can be adopted, but culture is preferably performed under conditions that provide sufficient dissolved oxygen.
  • a culture medium and culture conditions for culturing Aspergillus microorganisms shaking culture at 30 ° C. and 160 rpm for 3 to 5 days using DPY medium described in Examples described later can be mentioned.
  • the method for extracting selenonein from the culture after completion of the culture is not particularly limited.
  • the cells recovered from the culture by filtration, centrifugation, or the like may be used as they are, or the cells recovered after drying and further crushed cells may be used.
  • the method for drying the cells is not particularly limited, and examples thereof include freeze drying, sun drying, hot air drying, vacuum drying, aeration drying, and reduced pressure drying.
  • the extraction solvent is not particularly limited as long as selenonein can be dissolved.
  • organic solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, and acetone; hydrous organic solvents obtained by mixing these organic solvents and water; water, hot water, and heat Water etc. are mentioned.
  • the extraction solvent temperature can be set from room temperature to 100 ° C.
  • a suspension obtained by adding the cells to water is prepared.
  • a method of destroying bacterial cells using a disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, a dynomill, or a mortar
  • a cell cell wall using a cell wall lytic enzyme such as yatalase Method of dissolving
  • the cells may be subjected to cell disruption treatment such as a method of dissolving cells using a surfactant such as SDS or Triton X-100.
  • a surfactant such as SDS or Triton X-100.
  • the obtained extract is centrifuged, filtered, ultrafiltered, gel filtered, separated by solubility difference, solvent extraction, chromatography (adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography).
  • Selenonein can be purified by subjecting it to a purification treatment such as reverse phase chromatography, crystallization, activated carbon treatment, membrane treatment and the like.
  • a high yield of selenonein is obtained.
  • FIG. S6 and FIG. In 3B and the like the production amount of ergothioneine is described as a culture result using a selenium-free medium, and the peak ratio of ergothioneine and selenonein is described as a culture result using a selenium-containing medium.
  • the production amount of selenonein can be estimated to be about 0.047 ⁇ g / ml.
  • Another embodiment of the production method is a production method using not a transformant but a microorganism having a gene encoding the enzyme (1) or the enzyme (1) and the enzyme (2) on the genomic DNA.
  • another embodiment of the production method is a filamentous form such as Aspergillus oryzae that has a gene encoding histidine and selenium compound on enzyme (1) or enzyme (1) and enzyme (2) on genomic DNA.
  • a method for producing selenonein, comprising a step of obtaining selenonein by acting on a bacterium.
  • the product selenonein may cause growth inhibition or production inhibition on the microorganism used. Therefore, by adding an oxidizing agent such as copper ion to the medium, the produced selenonein may be dimerized (formation of Se-Se bond), thereby preventing microbial growth inhibition or production inhibition. . Therefore, in one embodiment of the production method, it is preferable that an oxidizing agent such as copper ion is present when the histidine and selenium compounds are allowed to act on microorganisms.
  • Selenonein obtained using the production method and transformant according to one embodiment of the present invention is a functional biological material having various physiological activities and is a heat-resistant and water-soluble material.
  • Functional food and drink Utilizing general food and drink, functional food and drink, functional indication food and drink, food and drink for specified health use, nutrition function food and drink, health function food and drink, special use food and drink, nutrition supplement food and drink, health supplement food and drink, supplement It can be used as a raw material for manufacturing beauty products, cosmetics, cosmetics, pharmaceuticals, quasi drugs, animal feeds, and the like.
  • selenonein is known to have antioxidant activity, and the activity is said to reach 1,000 times that of ergothioneine, which is a thioanalogue.
  • selenonein is useful as a substance that exhibits biological antioxidant effects such as, for example, hydroxyl radical scavenging action and heme iron autooxidation inhibiting action.
  • Specific products containing selenonein include nutritional supplements in place of selenite and selenomethionine, preventive or therapeutic agents for lifestyle-related diseases such as cancer and ischemic heart disease, and methylmercury detoxifiers. However, it is not limited to these.
  • Example 1 Preparation of DNA construct inserted with gene AsEgtA, AsEgtB or AsEgtC]
  • Search for target genes NCU04343 and NCU11365 are known as enzymes involved in biosynthesis of ergothioneine in Neurospora crassa (see Non-Patent Documents 3 and 4).
  • Non-patent document 3 suggests that NCU04636 may be involved in the biosynthesis of ergothioneine.
  • the gene shown in SEQ ID NO: 1 was found as a sequence region having relatively high gene sequence identity with NCU04343.
  • This gene was named AsEgtA gene (SEQ ID NO: 1) in the sense of an egtA gene derived from Aspergillus soja.
  • AsEgtB gene SEQ ID NO: 2
  • AsEgtC gene SEQ ID NO: 3
  • sequence identity comparison at the amino acid level is performed by genetic information processing software Genetyx network version version 12.0.1 (Genetics), AsEgtA protein (SEQ ID NO: 4), AsEgtB protein (SEQ ID NO: 5) and AsEgtC protein (The sequence identities of SEQ ID NO: 6) with NCU04343, NCU04636 and NCU11365 were 46%, 75% and 44%, respectively.
  • sequence identity between the AsEgtC protein and SPBC6600.12c which is an ortholog of Schizosaccharomyces pombe of NCU11365, was 27%.
  • the egtA gene, the egtB gene and the egtC gene of other Aspergillus microorganisms can be searched based on the base sequences and amino acid sequences of AsEgtA, AsEgtB and AsEgtC.
  • the bacterial cells were collected from the obtained culture broth by filtration, and the water was removed by sandwiching between paper towels, and the bacterial cells were pulverized while being cooled with liquid nitrogen using a mortar and pestle previously cooled with liquid nitrogen. Chromosomal DNA was extracted from the obtained pulverized cells using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
  • Plasmid pUC19 was added to the translation elongation factor gene tef1 promoter sequence Ptef (upstream of tef1 gene 748 bp, SEQ ID NO: 7), alkaline protease gene alp terminator sequence Talp (downstream of the alp gene) 800 bp, SEQ ID NO: 8), and a plasmid for construction in which a transformation marker gene pyrG (1838 bp including upstream 407 bp, coding region 896 bp and downstream 535 bp, SEQ ID NO: 9) that complements uridine requirement was prepared as follows did.
  • Ptef, Talp and pyrG are chromosomal DNA of Aspergillus soya NBRC4239 strain obtained above as template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) as a PCR enzyme, attached to this enzyme as a reaction reagent, apparatus PCR was performed according to the protocol attached to the enzyme using Mastercycler gradient (Eppendorf).
  • the primers and PCR conditions used to amplify Ptef, Talp and pyrG are shown in Tables 1 to 3 below. Of the sequences in the table, the lower case sequence indicates an additional sequence for linking the amplified fragments of Ptef, Talp and pyrG in this order and further linking with pUC19.
  • the amplified DNA fragments were separated in a 1% (w / v) agarose gel and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • pUC19 As pUC19, pUC19 linearized Vector attached to In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) was used. Using the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19, the amplified Pef, Talp and pyrG are linked using the In-Fusion HD Cloning Kit described above according to the protocol attached to the kit, and used for construction. A plasmid was obtained.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture solution after the culture was centrifuged to recover the cells. About the obtained microbial cell, plasmid DNA was extracted according to the protocol attached to the kit using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics).
  • the primers and PCR conditions used to amplify AsEgtA, AsEgtB and AsEgtC are shown in Tables 5-7 below. Of the sequences in the table, the lower case sequence indicates an additional sequence for linking to the construct plasmid (between Ptef and Talp).
  • the amplified DNA fragments were separated in a 1% (w / v) agarose gel and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • a gene-inserted DNA construct was obtained. From the 5 ′ end to the 3 ′ end, the DNA construct thus obtained was composed of a pUC19-derived DNA fragment, a Ptef DNA fragment, an AsEgtA, AsEgtB or AsEgtC DNA fragment, a Talp DNA fragment, and a pyrG DNA. The fragment and the DNA fragment derived from pUC19 are linked. That is, three types of DNA constructs were obtained in which the sequence of Ptef-AsEgtA, AsEgtB, or AsEgtC-Talp-pyrG was sequentially linked to the MUC of pUC19.
  • E. coli JM109 (Nippon Gene) was transformed according to the manufacturer's instructions to obtain transformed E. coli.
  • the obtained transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. The culture solution after the culture was centrifuged to recover the cells. About the obtained microbial cells, plasmid DNA (DNA construct) was extracted using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) according to the protocol attached to the kit.
  • Example 2 Production of transformed Aspergillus soya (1)
  • Aspergillus soya NBRC4239 strain-derived pyrG-disrupted strain Each DNA construct was ethanol-precipitated, dissolved in TE, and a DNA solution prepared to a desired concentration was prepared by the following procedure. Aspergillus soya NBRC4239 strain-derived pyrG-disrupted strain It was used for transformation of (upstream 48 bp of the pyrG gene, coding region 896 bp, downstream 240 bp deletion strain).
  • transformation was performed by the protoplast PEG method, and then Czapek-Dox minimal medium (Difco) containing 0.5% (w / v) agar and 1.2 M sorbitol. Incorporated pH 6) and incubated at 30 ° C. for 5 days or longer to obtain transformed Aspergillus soya as having colony-forming ability.
  • the resulting transformed Aspergillus sojae is selected as a strain into which the target gene has been introduced by introducing pyrG, a gene that complements uridine requirement, so that it can grow in a uridine-free medium. did it.
  • Example 3 Preparation of DNA construct inserted with gene AoEgtA]
  • a protein having high sequence identity was searched using AsEgtA amino acid sequence of Aspergillus soja as a query.
  • DOGAN http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AO
  • AO090012000265 was found as a protein having relatively high sequence identity with the AsEgtA amino acid sequence.
  • AO090012000265 is an S.A. It is described in Table 2 of Non-Patent Document 5 as being similar to pombe Egt1.
  • AO090012000265 was found to have 97% sequence identity with AsEgtA.
  • the gene encoding AO090012000265 was named AoEgtA gene (SEQ ID NO: 23) in the sense of an aspergillus oryzae-derived egtA gene.
  • the amino acid sequence of the AoEgtA protein is set forth in SEQ ID NO: 24.
  • Target gene insertion construct The same method as in Example 1- (4) above, except that the target gene is AoEgtA and the chromosomal DNA of Aspergillus oryzae RIB40 strain obtained above was used as the template DNA. It carried out in.
  • the primers and PCR conditions used for amplifying AoEgtA are shown in Table 8 below.
  • Example 4 Preparation of transformed Aspergillus oryzae
  • the same procedure as in Examples 2- (1) and (2) above was performed, except that the pyrG disrupted strain derived from the Aspergillus oryzae RIB40 strain described in JP2013-0334416A was transformed.
  • DPY liquid medium (0.1% (w / v) histidine, 1 mM selenocystine, 1% (w / v) polypeptone, 2% (w / v) dextrin, 0.5%) in 200 ml Erlenmeyer flask (W / v) yeast extract, 0.5% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.05% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 0.00017% FeSO 4 ; pH unadjusted) 40 ml Were inoculated with conidia of each strain, and cultured with shaking at 160 rpm at 30 ° C. for 5 days.
  • the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem).
  • the collected cells were washed with 40 ml of distilled water, and the cells were sandwiched between paper towels to extrude moisture to obtain wet cells.
  • a bacterial suspension was obtained by adding 8 ml of water and stirring. The obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 100 ° C. for 15 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • the obtained selenonein extract was analyzed by LC-MS under the following conditions.
  • [LC-MS conditions] LC equipment; Agilent 1100 series (Agilent) Mass spectrometer; QSTAR Elite (AB scex) Column; COSMOSIL HILIC (4.6 ⁇ 250 mm) Eluent: acetonitrile + 0.1% formic acid: water + 0.1% formic acid 75: 25 (v / v) Flow rate: 250 ⁇ l / ml Detection; ESI positive Injection; 10 ⁇ l Temperature; room temperature
  • Fig. 5 shows LC / MS analysis results of m / z 278 corresponding to protonated ions of selenonein for selenonein extract obtained using Aspergillus soja NBRC4239 strain and transformed Aspergillus soya transformed with genes AsEgtA and AsEgtC. It is shown in 1. A very small peak in Aspergillus soja NBRC4239 strain was clearly detected in transformed Aspergillus soya transformed with genes AsEgtA and AsEgtC.
  • the LC-MS analysis result of m / z 230 corresponding to the protonated ion of ergothioneine is shown in FIG.
  • Aspergillus soya NBRC4239 strain was used, a peak corresponding to ergothioneine was slightly detected, and when using transformed Aspergillus soya transformed with the genes AsEgtA and AsEgtC, a peak corresponding to ergothioneine was clearly detected. .
  • FIG. 3 shows an enlarged view of the MS spectrum of the peak detected at m / z 278 and near the retention time of 31 minutes detected in FIG. Furthermore, the calculated value of selenonein ion distribution estimated from the natural abundance ratio is shown in FIG. Since the actually measured values of the ion distributions almost coincided with each other, the peak is a peak indicating that it is selenonein, and it was shown that transformed Aspergillus sojae transformed with the genes AsEgtA and AsEgtC produces selenonein.
  • DPY liquid medium 40 ml in a 200 ml Erlenmeyer flask DPY liquid medium (1 mM selenious acid, 0.1% (w / v) histidine, 1% (w / v) polypeptone, 2% (w / V) dextrin, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.05% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 0.00017 % FeSO 4; pH unadjusted) 40 ml; with or selenocystine added DPY liquid medium 40 ml, the gene AsEgtA and AsEgtC inoculated with conidia of transformants Aspergillus sojae transformed, 5 days at 30 ° C., at 160rpm Shaking culture was performed.
  • the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem). After the collected cells were washed with 40 ml of distilled water, the cells were sandwiched between paper towels to extrude moisture, and wet cell masses 2.28 g (DPY liquid medium with selenocystine) and 1.89 g (with selenite added) DPY liquid medium) was obtained.
  • a bacterial suspension was obtained by adding 8 ml of water and stirring. The obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 100 ° C. for 15 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • the obtained selenonein extract was analyzed for the presence of selenonein by LC-MS under the above conditions. Also, quantification of selenonein and total selenium was determined by Yamashita et al. (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 24, pp. 18134-18138, June 11, 2010, “EXPERMENTAL PROCEDURES”, “Selenim” All the descriptions in the literature were analyzed by LC-ICP-MS under the conditions described in (incorporated herein by reference).
  • FIG. 5 shows the LC-MS analysis result of m / z 278 corresponding to selenonein.
  • Selenonein was not detected in the DPY liquid medium itself, but selenonein was detected by the addition of selenocystine or selenious acid. Therefore, it was confirmed that if transformed Aspergillus soya was used, selenonein could be produced by adding a selenium compound to the medium.
  • the amount of selenonein produced per wet cell mass is 128.93 ⁇ g / g-wet cell mass when using a selenocystine-added liquid medium, and 43.89 ⁇ g / g when using a selenite-added medium. g-wet cell mass. From these results, it was possible to obtain a large amount of selenonein by using transformed Aspergillus soya and by using selenocystine or selenious acid.
  • the DAN fluorescence method is a 4,5-benzopiacerecene produced by a complex formation reaction with Se (IV) after wet thermal decomposition with a mixed solution of nitric acid and perchloric acid, followed by reaction with 2,3-diaminonaphthalene (DAN).
  • DAN 2,3-diaminonaphthalene
  • Example 8 Selenonein production using transformed Aspergillus sojae (2)] Aspergillus soya NBRC4239 strain; transformed Aspergillus soya transformed with the gene AsEgtA; transformed Aspergillus soya transformed with the genes AsEgtA and AsEgtB; The same operation as in Example 7 was carried out except that inoculation was performed and the culture was performed with shaking at 160 rpm for 4 days at 30 ° C. The results are summarized in Table 9 and Table 10.
  • the transformed Aspergillus soya transformed with the gene AsEgtA is more than the transformed Aspergillus soya transformed with the genes AsEgtA and AsEgtB and the transformed Aspergillus soya transformed with the genes AsEgtA and AsEgtC.
  • the result that the amount of selenocysteine and the total amount of selenium were increased was obtained.
  • the conidia of each strain were inoculated into 40 ml of DPY liquid medium containing selenocystine in a 200 ml Erlenmeyer flask, and cultured at 30 ° C. for 4 days with shaking at 160 rpm. Subsequently, the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem). After the collected cells were washed with 40 ml of distilled water, the cells were sandwiched between paper towels to extrude moisture to obtain 1.84 g of wet cell mass. A bacterial suspension was obtained by adding 8 ml of water and stirring. The obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 100 ° C. for 15 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • the obtained selenonein extract was analyzed for the presence of selenonein by LC-MS under the above conditions.
  • Selenonein was quantified by LC-ICP-MS under the conditions described in Yamashita et al.
  • FIG. 6 shows the LC-MS analysis result of m / z 278 corresponding to selenonein.
  • selenonein was detected in the control strain as a slightly larger peak than Aspergillus soja NBRC4239 strain.
  • the transformant transformed with the gene AoEgtA a peak of selenonein with a retention time of around 31.5 minutes was clearly detected. From these results, it was confirmed that selenonein can be produced in large quantities by using transformed Aspergillus oryzae.
  • the selenonein content (selenium equivalent) in the selenonein extract was analyzed as described above, the selenonein content when transformed Aspergillus oryzae was used was 32.3 ⁇ g-Se / g-extract. In addition, the amount of selenonein produced per wet cell mass was 316.58 ⁇ g / g-wet cell mass. When the total selenium content in the selenonein extract was measured by the DAN fluorescence method, it was 39.1 ⁇ g-Se / g-extract.
  • Example 10 Selenium compound toxicity 0 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, or 1.0 mM selenocystine or selenious acid was added to the DPY liquid medium. Each of these was inoculated with conidia of Aspergillus soja NBRC4239 strain as a control or transformed Aspergillus soya transformed with the genes AsEgtA and AsEgtC, and cultured with shaking at 160 rpm for 4 days at 30 ° C. Subsequently, the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem). After the collected cells were washed with 40 ml of distilled water, the cells were sandwiched between paper towels to extrude moisture and the wet cell weight was measured.
  • FIG. 7 and FIG. 8 show the relative amount of the wet cell weight of the transformant relative to the control for each concentration of the selenium compound. As shown in FIGS. 7 and 8, the transformant was shown to be resistant to any selenium compound.
  • Example 11 Confirmation of transformed Aspergillus soja] Aspergillus soya NBRC4239 as a control; transformed Aspergillus soya transformed with any one gene of genes AsEgtA, AsEgtB and AsEgtC; and genes AsEgtA and AsEgtB or AsEgtC and 10 ml of DPY liquid medium in a test tube After inoculation with each conidia of transformed Aspergillus soya transformed by, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days, the cells were collected.
  • the AsEgtA protein had an assumed molecular weight of 95.7 kDa from the amino acid sequence, but was found as two bands around 90 kDa by SDS-PAGE.
  • the AsEgtB protein had an assumed molecular weight of 56.4 kDa from the amino acid sequence, but was seen as a band of less than 50 kDa by SDS-PAGE.
  • the AsEgtC protein had an assumed molecular weight of 51.2 kDa from the amino acid sequence, but was seen as a 50 kDa band by SDS-PAGE.
  • the control strain hardly expressed AsEgtA protein, AsEgtB protein and AsEgtC protein, and the (AsEgtA + AsEgtB) transformant and the (AsEgtA + AsEgtC) transformant expressed AsEgtA protein and AsEgtB protein or AsEgtC protein. It was. Moreover, AsEgtA transformant, AsEgtB transformant and AsEgtC transformant expressed the corresponding AsEgtA protein, AsEgtB protein and AsEgtC protein, respectively.
  • Example 12 Preparation of transformed Escherichia coli
  • the gene sequence is optimized for E. coli expression from the viewpoint of codons, secondary structure, GC content, etc., and an EcoRV sequence (GATATC) is added upstream of the gene.
  • GATATC EcoRV sequence
  • SpeI sequence ACTAGT
  • EcEgtA SEQ ID NO: 27
  • EcEgtC SEQ ID NO: 28
  • PUTE120K ' was constructed as an expression vector. That is, pUTE100K ′ described in JP-A-6-292584 was digested with NheI and HpaI to remove the lac promoter. Subsequently, the Tac promoter region of pKK223-3 (GE) was amplified and purified by PCR with an NheI site added to the 3 'end and an EcoRV site added to the 5' end. Next, after digestion with NheI, pUTE100K 'was inserted into the site where the original lac promoter was present to prepare pUTE120K'.
  • GE the Tac promoter region of pKK223-3
  • pUTE120K ' was treated with restriction enzymes using EcoRV and SpeI, and then EcEgtA or EcEgtC was ligated to produce plasmids pUTE120K'-EcEgtA and pUTE120K'-EcEgtC into which EcEgtA or EcEgtC had been inserted.
  • E. coli transformed with the above construct plasmid was cultured, and plasmids pUTE120K'-EcEgtA and pUTE120K'-EcEgtC were purified.
  • pUTE120K'-EcEgtC was subjected to restriction enzyme treatment with BamHI and SpeI, and a fragment containing the gene EcEgtC was excised and purified.
  • pUTE120K'-EcEgtA was treated with restriction enzymes with BamHI and NheI, and a fragment containing the gene EcEgtC was inserted to prepare plasmid pUTE120K'-EcEgtA-EcEgtC.
  • E. coli strain JM109 was transformed to obtain transformed E. coli.
  • the transformed Escherichia coli was treated with TY medium (1% (w / v) bacto tryptone, 0.5% containing 1 mM selenocystine or 1 mM selenite and 0.1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • TY medium 1% (w / v) Bacto tryptone, 0.5% containing 1 mM selenocystine or 1 mM selenite and 0.1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • XP_001397117.2 (SEQ ID NO: 30) was found as a homologous protein of Aspergillus niger CBS 513.88 strain among the proteins having high sequence identity with the amino acid sequence of AsEgtA protein. XP_001397117.2 was found to have 73% sequence identity with the AsEgtA protein.
  • a gene encoding XP — 001397117.2 was identified from genomic DNA of Aspergillus niger and named gene AnEgtA (SEQ ID NO: 29) in the sense of an egtA gene derived from Aspergillus niger.
  • Target gene insertion construct The same procedure as in Example 1- (4) above, except that the target gene is the AnEgtA gene and the chromosomal DNA of Aspergillus niger IAM2533 obtained above was used as the template DNA. The method was carried out. The primers and PCR conditions used for amplifying the AnEgtA gene are shown in Table 11 below.
  • genomic information is disclosed. It matched the sequence of the predicted gene (ANI_1_792134) of niger CBS 513.88 strain (corresponding amino acid sequence XP_001397117.2 above).
  • Example 14 Production of transformed Aspergillus soya (2)
  • the procedure was the same as in Example 2- (1) and (2) except that a DNA construct into which the gene AnEgtA was inserted was used.
  • Example 15 Selenonein production using transformed Aspergillus sojae (3) It was carried out in the same manner as in Example 7 except that inoculated with Aspergillus soja NBRC4239 strain as a control and conidia of transformed Aspergillus soja transformed with the gene AnEgtA. The obtained ergothioneine extract and the culture supernatant obtained from the culture after the main culture (filtered using a 0.45 ⁇ m filter) were analyzed by LC-ICP-MS under the conditions described in Yamashita et al. Selenonein was quantified. Table 12 shows the results of comparison of the amount of selenonein produced by the control strain and transformed Aspergillus sojae.
  • the transformed Aspergillus sojae transformed with the gene AsEgtA has any substrate than the non-transformed control strain.
  • the production amount of selenonein in the extract and the culture broth was large. From these results, it was found that selenonein can be efficiently produced even in transformed Aspergillus soya transformed with a heterologous gene AnEgtA having a different origin.
  • Example 16 Selenonein production using transformed Escherichia coli
  • E. coli introduced with the expression vector pUTE120K ′ as a control; transformed Escherichia coli transformed with the gene EcEgtA or EcEgtC; and the respective selenoyneins of transformed E. coli transformed with the gene EcEgtA and the gene EcEgtC.
  • Productivity was compared as follows.
  • Each strain shown in Table 13 was inoculated into 2.5 ml of TY medium in a 19 ml test tube, and seed culture was performed at 37 ° C. for 16 hours under shaking at 180 rpm. 20 ⁇ l of the seed culture solution is inoculated into 2.5 ml of TY medium containing ampicillin and 0.5 mM IPTG in a 19 ml test tube, and this is shaken at 180 rpm for 20.5 hours at 25 ° C. Culture was performed.
  • the TY medium used for the main culture includes 0.1 mM selenocystine-containing (TY ++), 0.01 mM selenocystine-containing (TY +), and 0.01 mM 6 hours after the start of the culture. Three lines of selenocystine added (TY + ⁇ ) were prepared.
  • 20 ⁇ l of the seed culture solution is inoculated into 0.6 ml of TY medium containing ampicillin and 0.5 mM IPTG in a 19 ml test tube, and shaken at 25 ° C. for 25 hours at 180 rpm.
  • the main culture was performed under the conditions.
  • 10 ⁇ l of 2.5 mM selenocystine was added 20.5 hours after the start of the culture, and further cultured for 4.5 hours (TY ++++).
  • the cells were collected as a precipitate by centrifugation (12,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) from the cultured product.
  • 0.2 ml of water was added to the microbial cells obtained from 1 ml of the culture solution for TY ++, TY + and TY ++, and to the microbial cells obtained from the 0.6 ml culture solution for TY ++ to obtain a bacterial suspension.
  • the obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 98 ° C. for 10 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • the amount of selenonein increased.
  • the amount of selenonein decreased as a result of growth inhibition. From this, it was found that the amount of selenocystine added is preferably a sufficiently small amount relative to the cell concentration at the beginning of the culture, and preferably increased during the course of the culture or as the cell concentration increases. .
  • Example 17 Selenonein production using transformed Aspergillus sojae in selenium yeast medium
  • selenium yeast liquid medium 40 ml (1.5% (w / v) selenium yeast, 2% (w / v) dextrin, 0.5% (w / v) KH2PO4, 0.05% (W / v) MgSO4 ⁇ 7H2O (pH unadjusted) was inoculated with conidia of transformed Aspergillus sojae transformed with the gene AsEgtA, and cultured with shaking at 160 rpm for 5 days at 30 ° C.
  • the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem).
  • the collected bacterial cells were washed with 40 ml of distilled water, and 8 ml of water was added and stirred to obtain a bacterial suspension.
  • the obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 100 ° C. for 15 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • Example 18 Selenonein Production Using Transformed Aspergillus soya with Bonito Tuna Extract (Bacterio-N-KN) as Medium]
  • bonito tuna extract liquid medium 40 ml (2.0% (w / v) Bacterio-N-KN (Maruha Nichiro), 2% (w / v) dextrin, 0.5% (w / v) v) KH 2 PO 4 , 0.05% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O; pH unadjusted) is inoculated with conidia of transformed Aspergillus sojae transformed with the gene AsEgtA at 30 ° C. Shaking culture was performed at 160 rpm for 5 days.
  • the cells were collected from the culture after culturing on Miracloth (Calbiochem).
  • the collected cells were washed with 40 ml of distilled water, and then 4 ml of water was added and stirred to obtain a cell suspension.
  • the obtained bacterial suspension was subjected to heat treatment at 100 ° C. for 15 minutes. After the treatment, the extracellular fluid recovered as a supernatant by centrifugation was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a selenonein extract.
  • the production method and transformant according to one embodiment of the present invention can be used to produce a large amount of selenonein having antioxidant activity, which is said to reach 1,000 times that of ergothioneine. Therefore, this invention can be utilized in order to manufacture the raw material for manufacturing antioxidant products, such as cosmetics and a supplement provided with the antioxidant function, on an industrial scale.

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Abstract

本発明の目的は、従来技術に比べてセレノネインを高収量で生産することができることから、工業的規模でのセレノネインの製造を可能にする、セレノネインの製造方法を提供することにある。 上記目的は、ヒスチジン及びセレン化合物を、下記（１）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含む、セレノネインの製造方法より解決される。 （１）Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する酵素

Description

セレノネインの製造方法 関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月７日出願の日本特願２０１５－１５７４４３号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに開示として援用される。
本発明は、セレノネインの製造方法に関し、特にセレノネイン生産能を有する微生物を用いたセレノネインの製造方法に関する。
セレン（Ｓｅ）は周期表における第１６族に属する元素、すなわち、酸素族元素（カルコゲン元素）の１種であり、ヒトにとって必須の微量元素である。セレンは、生体内では、酵素やタンパク質の一部を構成し、抗酸化反応において重要な役割を担っている。藻類、魚介類、肉類、卵黄などに豊富に含まれていることから、これらを含む食品を通じてセレンを摂取することができる。
セレンを含有する酵素としては、例えば、動物種においては、構成アミノ酸としてセレノシステインやセレノメチオニンを含むグルタチオンペルオキシターゼなどが知られている。また、藻類や植物種においてもセレノプロテインの存在が多数報告されている。
セレンが不足すると、過酸化物による細胞障害が生じ、結果として心筋症（克山病）、カシン・ベック症（地方病性変形性骨軟骨関節症）、狭心症や心筋梗塞などの冠動脈疾患、心臓血管系疾患などの疾患の発症に繋がり得る。この他にも、セレン欠乏によって、筋肉痛；皮膚の乾燥、肝壊死、肺がん、大腸がん、前立腺がん、直腸がん、乳がん、白血病などの発癌のリスクの上昇が誘起されるという報告がある。
一方で、セレンは、毒物としての有害性を持ち合わせている。例えば、セレンオキサニオンの形態をとることにより、毒性が高まる。そこで、セレンを過剰摂取することにより、爪の変形や脱毛、胃腸障害、神経障害、心筋梗塞、急性の呼吸困難、腎不全などが誘起されることが知られている。そこで、厚生労働省によりセレンの食事摂取基準が定められており、例えば、３０～４９歳の男性（女性）であれば、推定平均必要量は２５（２０）μｇ／日、推奨量は３０（２５）μｇ／日、上限量は４６０（３５０）μｇ／日である（非特許文献１を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。
現在、セレン欠乏に関わる疾病の予防や治療には、亜セレン酸などの無機態セレン（無機セレン化合物）やセレノメチオニンなどの有機態セレン（有機セレン化合物）を含有するサプリメントが利用されている。また、無機セレン化合物を含む培地中で酵母を培養することによって、セレノメチオニンを高濃度に含むセレン酵母が有機セレン化合物の１種として利用されている。
その他の有機セレン化合物の１種としてセレノネインがあり、セレノネインは生体抗酸化作用及び細胞増殖促進作用などを有することが知られている（特許文献１を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。セレノネインは、エルゴチオネインのＳＨ基がＳｅＨ基に置換したセレンアナログであるところ、その抗酸化能はエルゴチオネインの１，０００倍（非特許文献３を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）に達する。
セレノネインの製造方法としては、動物の臓器や血液から抽出する方法（下記特許文献１を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）に加えて、エルゴチオネイン生合成系に関与する遺伝子を導入した分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を利用する方法が知られている（非特許文献２を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。
特許第５６６９０５６号公報
厚生労働省、「日本人の食事摂取基準（２０１５年版）策定検討会」報告書、平成２６年３月２８日（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０５－Ｓｈｉｎｇｉｋａｉ－１０９０１０００－Ｋｅｎｋｏｕｋｙｏｋｕ－Ｓｏｕｍｕｋａ／０００００４２６３８．ｐｄｆ） ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　２０１４　Ｍａｙ　１４；９（５）：ｅ９７７７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．－２０１０　１８１３４－８
特許文献１に記載の方法は、魚類の臓器や血液からセレノネインを抽出する方法であるところ、これらに含まれるセレノネイン含有量は非常に少ないことから、大量のセレノネインを得るためには大量の魚類が必要になるという問題がある。
一方、非特許文献２には、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する酵素としてＥｇｔ１があり、該酵素をコードする遺伝子ＳＰＢＣ１６０４．０１を過剰発現するように形質転換した形質転換シゾサッカロミセス・ポンベを用いてセレノネインをｉｎ　ｖｉｖｏ合成したことが記載されている。しかし、非特許文献２に記載の形質転換シゾサッカロミセス・ポンベを用いて得られたセレノネインの量は非常に少ないという問題がある。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、非特許文献２に記載の形質転換シゾサッカロミセス・ポンベに比べて、セレノネインを高収量で生産することができることから、工業的規模でのセレノネインの製造を可能にする、セレノネインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、菌類の一種であるアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）において、ヒスチジン及びセレン化合物からセレノネインを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子ＡｓＥｇｔＡを特定することに成功した。
次に、本発明者らは、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、アスペルギルス・ソーヤに導入して形質転換することによって、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製することに成功した。また、同様にして、遺伝子ＡｓＥｇｔＡと相同性の高いアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の遺伝子ＡｏＥｇｔＡを特定して、ＡｏＥｇｔＡタンパク質を過剰発現する形質転換アスペルギルス・オリゼを作製することに成功した。
驚くべきことに、得られた形質転換体は、セレノシスチンなどの有機セレン化合物だけではなく、亜セレン酸などの無機セレン化合物からセレノネインを生産することができ、しかもその量は非特許文献２に記載の形質転換シゾサッカロミセス・ポンベに比べて著しく多い量であった。
本発明者らは、さらに驚くべきことに、有毒性が認められる濃度のセレン化合物を添加した場合であっても、上記形質転換体は野生株と比較して明らかにセレン化合物に対して高い耐性を示すことを見出した。また、上記形質転換体は、常法に従って培養することができ、その増殖速度などについても野生株と格別相違がないものであった。これらのことより、上記形質転換体を用いればセレノネインを大量生産し得ることがわかった。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明の一実施態様によれば、ヒスチジン及びセレン化合物を、下記（１）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含む、セレノネインの製造方法が提供される。
（１）Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインから下記式〔Ｉ〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する酵素
好ましくは、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である。
好ましくは、前記有機セレン化合物及びその塩がセレノシステイン、セレノシスチン、セレノメチオニン、Ｓｅ－（メチル）セレノ－Ｌ－システイン、セレノペプチド、セレノプロテイン及びそれらの塩並びにセレン酵母からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物であり、かつ、前記無機セレン化合物及びその塩がセレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、セレン、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸、二酸化セレン及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である。
好ましくは、前記形質転換体が、さらに下記（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である。
（２）ピリドキサール　５’－リン酸を補酵素として、下記式〔Ｉ〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する酵素
好ましくは、前記形質転換体が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物を宿主生物とする。
好ましくは、前記形質転換体が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物を宿主生物とする。
好ましくは、前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である。
好ましくは、前記形質転換体が、大腸菌を宿主生物とする。
好ましくは、前記形質転換体は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が、宿主生物に比してセレノネインの量が増えるように増強された形質転換体である。
好ましくは、前記形質転換体は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が、該形質転換体を、宿主生物の生育に適したセレノシスチン含有培地を用いて３０℃、５日間で培養した場合のセレノネインの量が湿菌体質量１ｇあたり１０μｇ、より好ましくは湿菌体質量１ｇあたり２０μｇ、さらに好ましくは湿菌体質量１ｇあたり４０μｇ、なおさらに好ましくは湿菌体質量１ｇあたり１００μｇになるように増強された形質転換体である。
好ましくは、前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である。
好ましくは、前記（２）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（２）の酵素が配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である。
また、本発明の一実施態様として、上記形質転換体を用いた製造方法と比較するとセレノネインの生産量としては微量ではあるが、アスペルギルス属微生物といった麹菌などの糸状菌を用いてセレノシスチンなどの有機セレン化合物や、亜セレン酸などの無機セレン化合からセレノネインを生産することができることを見出している。すなわち、本発明の別の一実施態様によれば、ヒスチジン及びセレン化合物を、前記（１）の酵素をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有するアスペルギルス属微生物といった麹菌などの糸状菌に作用させて、セレノネインを得る工程を含む、セレノネインの製造方法が提供される。
本発明の一実施態様である製造方法や形質転換体によれば、通常の宿主生物を培養する条件により、高収量のセレノネインを製造することができる。その結果、本発明の一実施態様である製造方法や形質転換体によれば、工業的規模でセレノネインを製造することが期待できる。
図１は、実施例に記載のコントロール株及び形質転換アスペルギルス・ソーヤ（「（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体」）をセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地で培養して得られた培養物から作製したセレノネイン抽出液について、セレノネインに相当するピークの検出を試みたＬＣ－ＭＳ分析結果を示した図である。 図２は、実施例に記載のコントロール株及び形質転換アスペルギルス・ソーヤ（「（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体」）をセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地で培養して得られた培養物から作製したセレノネイン抽出液について、エルゴチオネインに相当するピークの検出を試みたＬＣ－ＭＳ分析結果を示した図である。 図３は、図１のＬＣ－ＭＳ分析結果のうち、リテンションタイム３１分付近のピークのＭＳスペクトルの拡大図である。 図４は、図３について、天然存在比から推定されるセレノネインのイオン分布の計算値を示した図である。 図５は、実施例に記載の形質転換アスペルギルス・ソーヤをＤＰＹ液体培地（「ＤＰＹ」）、セレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地（「ＤＰＹ＋セレノシスチン」）又は亜セレン酸添加ＤＰＹ液体培地（「ＤＰＹ＋亜セレン酸」）を用いて培養して得られた培養物から作製したセレノネイン抽出液について、セレノネインに相当するピークの検出を試みたＬＣ－ＭＳ分析結果を示した図である。 図６は、実施例に記載のコントロール株及び形質転換アスペルギルス・オリゼ（「ＡｏＥｇｔＡ形質転換体」）をセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地で培養して得られた培養物から作製したセレノネイン抽出液について、セレノネインに相当するピークの検出を試みたＬＣ－ＭＳ分析結果を示した図である。 図７は、実施例に記載のコントロール株（「ＮＢＲＣ４２３９株」）及び形質転換アスペルギルス・ソーヤ（「（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体」）について、セレノシスチンに対する毒性を評価した結果を示した図である。 図８は、実施例に記載のコントロール株（「ＮＢＲＣ４２３９株」）及び形質転換アスペルギルス・ソーヤ（「（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体」）について、亜セレン酸に対する毒性を評価した結果を示した図である。 図９は、実施例に記載の形質転換体及びコントロール株から抽出した総タンパク質を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真図である。レーン１はコントロール株、レーン２はＡｓＥｇｔＡ形質転換体、レーン３はＡｓＥｇｔＢ形質転換体、レーン４はＡｓＥｇｔＣ形質転換体、レーン５は（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換体、レーン６は（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体の由来のものをそれぞれ示す。
以下、本発明の一実施態様である製造方法及び形質転換体の詳細について説明する。
（製造方法の概要）
製造方法の一実施態様は、ヒスチジン及びセレン化合物を、下記（１）の酵素（以下、酵素（１）とよぶ。）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含む。本明細書において、セレン化合物は、セレン化合物そのものに加えて、セレン化合物の塩、錯体、架橋物及び誘導体を包含する。
（１）Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインから下記式〔Ｉ〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する酵素
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、外来遺伝子として挿入された酵素（１）をコードする遺伝子を過剰発現することにより、ヒスチジン及びセレン化合物から最終的にセレノネインを生成することができる。過剰発現する酵素（１）をコードする遺伝子は１種又は２種以上であり得る。
本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測に拘泥されるわけではないが、菌類の想定されるセレノネインの生合成系の一態様として、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を模式的に表わすと下記式〔ＩＩ〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 〔ＩＩ〕
（式中、ＳＡＭはＳ－アデノシルメチオニンを表わす。）
のようになる。酵素（１）は式〔ＩＩ〕中のｅｇｔＡに相当するものである。
製造方法の一実施態様で使用される形質転換体は、さらに下記（２）の酵素（以下、酵素（２）とよぶ。）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体であることが好ましい。
（２）ピリドキサール　５’－リン酸を補酵素として、前記式〔Ｉ〕に示されるヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する酵素
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、外来遺伝子として挿入された酵素（２）をコードする遺伝子を過剰発現することにより、ヘルシニルセレノシステインなどのセレノネイン前駆体からセレノネインを効率的に生成することができると考えられる。ただし、宿主生物が酵素（２）を十分に発現している場合は、酵素（２）をコードする遺伝子を挿入しなくともよい。過剰発現する酵素（２）をコードする遺伝子は１種又は２種以上であり得る。
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、大きく、酵素（１）をコードする遺伝子を過剰発現し、かつ、酵素（２）をコードする遺伝子を過剰発現しないもの；及び、酵素（１）をコードする遺伝子を過剰発現し、かつ、酵素（２）をコードする遺伝子を過剰発現するものの２つの態様に分けられる。
（酵素（１）及び（２）の酵素学的性質）
酵素（１）は、上記式〔ＩＩ〕に示されているとおり、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に依存して、ヒスチジンを、－ＮＨ２基がトリメチル化されたヘルシニンへ転換する反応を触媒し得る活性（以下、第１の活性とよぶ。）を有する。さらに、酵素（１）は、鉄（ＩＩ）の存在下で、ヘルシニン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒し得る活性（以下、第２の活性とよぶ。）を有する。したがって、酵素（１）は、第１及び第２の活性を有することにより、結果として、Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインからセレノネインを生成することができる。
酵素（２）は、ピリドキサール　５’－リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、ヘルシニルシセレノステインからセレノネインを生成する反応を触媒し得る活性（以下、第３の活性とよぶ。）を有する。
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を発現することによって、それぞれの酵素が活性化する条件において、ヒスチジン及びセレノシステインなどの有機セレン化合物から最終的にセレノネインを生産することができる。しかも、驚くべきことに、該形質転換体は、有機セレン化合物に限らず、亜セレン酸などの無機セレン化合物からもセレノネインを生産することができる。
なお、酵素（１）及び酵素（２）はエルゴチオネインの生合成系でも使用され得る。菌類の想定されるエルゴチオネインの生合成系の一態様は下記式〔ＩＩＩ〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 〔ＩＩＩ〕
（式中、ＳＡＭはＳ－アデノシルメチオニンを表わし、ＰＬＰはピリドキサール　５’－リン酸を表わす。）
のようになる。酵素（１）は式〔ＩＩＩ〕中のｅｇｔＡに相当するものであり、酵素（２）は式〔ＩＩＩ〕中のｅｇｔＢ及び／又はｅｇｔＣに相当するものである。
（酵素（１）及び（２）の構造的性質）
酵素（１）は、上記した酵素学的性質を有するもの、すなわち、Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインからヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する活性を有するものであれば、アミノ酸配列、全体的及び部分的な立体構造、分子量などの構造的性質；最適ｐＨ、最適温度、失活条件などの生化学的性質；由来生物などによって特に限定されない。ただし、酵素（１）は、第１及び第２の活性を有するものであるために、第１の活性及び／又は第２の活性を有する酵素によく保存されている保存領域（ドメイン）を含むものであることが好ましい。
第１の活性を有する酵素の保存領域としては、例えば、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域が挙げられ、具体的には、ドメインＤＵＦ２２６０を含むＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼドメインが挙げられる。また、第２の活性を有する酵素の保存領域としては、例えば、スルファターゼの保存領域が挙げられ、具体的には、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）－スルファターゼドメインが挙げられる。第１及び第２の活性を有する酵素であるために、上記ドメインは一体的に連結されているものでなくともよく、例えば、ドメイン内に非保存領域が含まれていてもよい。また、酵素（１）は、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域とスルファターゼの保存領域との間に、ＤｉｎＢ＿２ドメインを含むものであることが好ましく、鉄結合モチーフであるＨＸ３ＨＸＥを含むＤｉｎＢ＿２ドメインを含むものであることがより好ましい。
例えば、酵素（１）の一態様は、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域、ＤｉｎＢ＿２ドメイン及びスルファターゼの保存領域を含む構造を有するものであり、酵素（１）の別の一態様は、ドメインＤＵＦ２２６０を含むＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼドメイン、ＨＸ３ＨＸＥを含むＤｉｎＢ＿２ドメイン及びＦＧＥ－スルファターゼドメインを含む構造を有するものである。
酵素（１）の好ましい態様は、非特許文献２に記載のＮＣＵ０４３４３のアミノ酸配列との配列同一性が好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、なおさらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有するものである。なお、本明細書において「配列同一性」とは、２つの配列をアラインメントした場合の配列間の同一性（一致性；Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、配列間の類似性（Ｓｉｍｉｒａｌｉｔｙ）を意味するものではない。酵素（１）の好ましい態様の具体例は、アクセッション番号（カッコ内の数値は配列番号４に記載のＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列をクエリーにしたＢｌａｓｔｐの結果としての配列同一性を示す）がそれぞれＸＰ＿００１７２７３０９．１（９７％）、ＸＰ＿００２３７５５５６．１（９７％）、ＸＰ＿００１２１１６１４．１（７４％）、ＧＡＡ９０４７９．１（７５％）、ＸＰ＿００１２６１０２７．１（７２％）、ＸＰ＿００１２７５８４３．１（７２％）、ＥＤＰ５５０６９．１（７２％）、ＸＰ＿７５５９００．１（７２％）、ＥＨＡ２４８１１．１（７４％）、ＸＰ＿００１３９７１１７．２（７３％）、ＥＹＥ９６６５５．１（７２％）、ＣＡＫ４２５４１．１（７１％）、ＸＰ＿６８０８８９．１（６９％）、ＥＰＳ３２７２３．１（６６％）、ＧＡＤ９１７６２．１（６３％）、ＥＫＶ０６０１８．１（６３％）、ＸＰ＿００２４８７１５９．１（６１％）、ＸＰ＿００２１４５３８７．１（６１％）、ＣＤＭ３１０９７．１（６２％）、ＸＰ＿００２６２３０４５．１（５７％）、ＥＱＬ３６０９６．１（５７％）、ＥＥＱ９１０１２．１（５７％）、ＸＰ＿００２７９４３１６．１（５７％）、ＸＰ＿００２５４０８３９．１（５７％）、ＸＰ＿００１２４６５０５．１（５７％）、ＸＰ＿００３０６６６８１．１（５６％）、ＥＦＷ１８３２９．１（５６％）、ＥＥＨ０６８２０．１（５６％）、ＸＰ＿００３１７２８０３．１（５５％）、ＥＧＥ８２２３０．１（５６％）、ＥＧＤ９５４２６．１（５４％）、ＥＺＦ３０３９１．１（５４％）、ＥＨＹ５３１４９．１（５３％）、ＸＰ＿００２８４４１４０．１（５４％）、ＸＰ＿００３２３７５５５．１（５４％）、ＥＸＪ７８７６５．１（５２％）、ＸＰ＿００１５４３９８０．１（５３％）、ＥＸＪ８４１６７．１（５３％）、ＥＸＪ７６８０４．１（５１％）、ＥＴＩ２１４２５．１（５２％）、ＥＸＪ５５８６８．１（５２％）、ＥＫＧ１３３７７．１（５１％）、ＸＰ＿００３８３６９８８．１（５１％）、ＥＯＮ６０８３１．１（５０％）、ＥＧＥ０８４４６．１（５２％）、ＥＭＤ８６１６３．１（５１％）、ＥＵＮ２１８１４．１（５１％）、ＥＭＤ６９８９５．１（５０％）、ＥＭＥ４０６６９．１（５２％）、ＥＵＣ４５４２７．１（５１％）、ＥＥＨ１８３６５．１（５２％）、ＸＰ＿００１９３９５３７．１（５１％）、ＥＵＣ２８３２７．１（５０％）、ＸＰ＿００３２９６６４５．１（５０％）、ＥＥＲ３８４８６．１（５４％）、ＸＰ＿００７５８７６３２．１（５０％）、ＥＯＡ８７１１０．１（５０％）、ＥＥＨ４７３０３．１（５４％）、ＥＭＣ９１７７２．１（５１％）、ＥＪＴ７９０６３．１（５０％）、ＸＰ＿００７２８９８７８．１（５１％）、ＥＭＦ０９３０８．１（５０％）、ＸＰ＿００７２７４１８８．１（４９％）、ＸＰ＿００３８４９５４０．１（５１％）、ＥＮＨ８３４０９．１（５０％）、ＥＱＢ４７７５４．１（４８％）、ＸＰ＿００６６９３５１０．１（５１％）、ＥＴＮ４１９１６．１（５０％）、ＸＰ＿００３７１１９３３．１（４９％）、ＥＷＧ４６２９９．１（５０％）、ＥＧＵ８７４１２．１（４９％）、ＥＳＺ９５３６５．１（４８％）、ＥＧＣ４７６３１．１（５２％）、ＥＸＭ３１３８１．１（４９％）、ＥＸＬ８３３７３．１（４９％）、ＸＰ＿３８５８２３．１（５０％）、ＥＭＴ７００５４．１（５０％）、ＥＸＫ９５３１３．１（４９％）、ＣＣＴ７１８６０．１（５０％）、ＥＸＭ０４８６７．１（４９％）、ＥＸＡ３８５３１．１（４９％）、ＥＷＺ３４５７７．１（４９％）、ＥＷＹ８７１０２．１（４９％）、ＥＮＨ７０５８５．１（４９％）、ＥＹＢ２９６６１．１（５０％）、ＥＸＫ３７２１９．１（４９％）、ＥＷＺ９５３２３．１（４９％）、ＥＧＹ２０６１３．１（４９％）、ＥＭＥ７８６７１．１（５０％）、ＥＫＪ７３６２３．１（５０％）、ＥＦＱ３０７０１．１（４８％）、ＥＰＥ０９９７７．１（４８％）、ＥＸＶ０６６２４．１（４９％）、ＥＲＳ９９８５２．１（４９％）、ＥＧＯ５９４６２．１（４９％）、ＸＰ＿００３３４８７８０．１（４８％）、ＥＦＹ９９９２７．１（４９％）、ＸＰ＿００７５９４９１５．１（４７％）、ＸＰ＿００３６６０７５２．１（４９％）、ＥＡＡ２７０８８．３（４９％）、ＥＲＦ６８２７９．１（４９％）、ＥＦＸ０４４２９．１（５０％）、ＥＴＲ９８６７６．１（４９％）、ＥＦＹ８４３４０．１（４８％）、ＸＰ＿００６９６８６２０．１（４８％）、ＸＰ＿００３０４８８８４．１（４９％）、ＥＨＫ２０８３２．１（４９％）、ＥＰＥ２４４１３．１（４９％）、ＥＪＰ６２９６２．１（４９％）、ＥＴＳ８３７４０．１（４８％）、ＥＨＫ４５９８９．１（４９％）、ＥＬＱ６４９０４．１（４７％）、ＸＰ＿００６６７２５５５．１（４８％）、ＥＬＱ４０００７．１（４６％）、ＥＸＬ８３３７５．１（５０％）、ＥＸＫ９５３１５．１（５０％）、ＣＣＥ３３５９１．１（４８％）、ＥＸＭ０４８６９．１（５１％）、ＥＸＡ３８５３３．１（５０％）、ＥＷＺ９５３２５．１（５０％）、ＥＸＫ３７２２１．１（５０％）、ＥＷＺ３４５７９．１（５０％）、ＥＷＹ８７１０４．１（５０％）、ＣＣＸ３１７５４．１（４７％）、ＸＰ＿９５６３２４．２（４６％）及びＸＰ＿９５６３２４．２（４６％）であるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。上記のうち、例えば、アクセッション番号がＸＰ＿００１７２７３０９．１（９７％）であるタンパク質は配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、アクセッション番号がＸＰ＿００１３９７１１７．２（７３％）であるタンパク質は、アスペルギルス・ニガー由来のものでありながら、アスペルギルス・ソーヤにおいて発現並びに上記第１及び第２の活性を有することを確認している。これらのことより、ＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有する、メチルトランスフェラーゼである、又はメチルトランスフェラーゼと推定される（ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｐｕｔａｔｉｖｅ）アミノ酸配列やメチルトランスフェラーゼとみなされる理論的タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列を有するタンパク質は酵素（１）として利用し得る。
酵素（２）もまた、上記した酵素学的性質を有するもの、すなわち、ピリドキサール　５’－リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、ヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する活性を有するものであれば、構造的性質、生化学的性質及び由来生物などによって特に限定されない。ただし、酵素（２）は、第３の活性を有するものであるために、第３の活性を有する酵素によく保存されている保存領域（ドメイン）を含むものであることが好ましい。
第３の活性を有する酵素の保存領域としては、例えば、ＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼドメインが挙げられる。酵素（２）としては、ベロらの文献（Ｂｅｌｌｏ　ＭＨ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｕｎｇａｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｂｉｏｌ．２０１２　Ｆｅｂ；４９（２）：１６０－７２、該文献の全記載はここに開示として援用される）に記載のＮＣＵ０４６３６との配列同一性が７５％程度であるＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼドメインを含む構造を有するものと非特許文献２に記載のＮＣＵ１１３６５との配列同一性が４４％程度であるＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼドメインを含む構造を有するものという少なくとも構造的に２種類のものであり得る。酵素（２）は、これら２種類のうちいずれか１種のものであってもよく、両方であってもよい。
（酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列）
酵素（１）及び（２）は、上記した酵素学的性質、好ましくは上記した酵素学的性質及び構造的性質を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。例えば、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）の一態様として配列番号４に示すアミノ酸配列があり、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（２）の一態様として配列番号５及び６に示すアミノ酸配列がある。これら配列番号４～６に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１～３に示す塩基配列である。
同様に、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）の一態様として配列番号２４に示すアミノ酸配列がある。この配列番号２４に示すアミノ酸配列を有する酵素は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）に由来するものであり、本発明者らによりＡｏＥｇｔＡタンパク質と名付けられる。また、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２３に示す塩基配列である。
ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質は、アスペルギルス・ソーヤの染色体ＤＮＡ上に存在するこれらの酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。また、ＡｏＥｇｔＡタンパク質は、アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ上に存在する該酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質」や「野生型酵素」と本明細書ではよぶ場合がある。
酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列は、それぞれ上記した酵素（１）及び（２）の酵素学的性質を有するものであれば、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えらた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、上記した酵素学的性質、好ましくは上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）及び（２）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものであれば特に限定されない。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が形質転換体内で過剰発現することにより酵素（１）及び（２）が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の触媒活性を有する態様で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質（酵素）が生産されることを意味する。
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由して酵素（１）及び（２）を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに酵素（１）及び（２）を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも上記した酵素学的性質を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）　核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社）、０．１％（ｗ／ｖ）　Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ　、０．１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ。これらの文献の全記載はここに開示として援用される）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ酵素活性を有するものである。
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、例えば、セレノネイン生産能又はエルゴチオネイン生産能がある生物種や酵素（１）及び（２）の発現が見られる生物種などに由来する。酵素（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物が挙げられる。微生物の中でも糸状菌はエルゴチオネイン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。糸状菌の具体例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌が挙げられ、より具体的にはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）などが挙げられる。
上記アスペルギルス属糸状菌の具体例として挙げたアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用による安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。
上記のとおり、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素（１）及び（２）は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、又はそれぞれの活性を示す蓋然性がある。そこで、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
（遺伝子工学的手法による酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のクローニング）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の取得方法や、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子配列、酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの作製方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素（１）及び（２）の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
例えば、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する微生物由来の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株やアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株を挙げることができる。例えば、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。その例としては、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計した配列番号１７～２２で表されるプライマーなどが挙げられる。なお、これらのプライマーを用いると、目的遺伝子全長が増幅されるので、ＲＡＣＥを省略できる。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
また、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を構築することが可能である。
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ　４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ　ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列を知り得る。
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることがができる。
（形質転換体の作製方法）
製造方法の一実施態様に用いられる形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法が挙げられる。具体的には、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトのみ又は酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト及び酵素（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトの両方で宿主生物を形質転換することにより、酵素（１）をコードする遺伝子のみ又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の両方を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主生物内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主微生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主生物中で酵素（１）又は酵素（１）及び（２）を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
また、例えば、製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流領域及び酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
形質転換体が作製されたことの確認は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）の酵素活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるセレノネインが検出されること、又は検出されたセレノネインの量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物におけるセレノネインの量よりも多いことを確認することにより行うことができる。
また、製造方法の一実施態様に用いられる形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。 
（宿主生物）
宿主生物としては、酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト又は酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト及び酵素（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）を生産することができる微生物であれば特に限定されないが、例えば、セレン化合物の有毒性の観点からセレンを代謝できる微生物が挙げられ、セレン酸レダクターゼ（ＥＣ１．９７．１．９）、セレノシステインリアーゼ（ＥＣ４．４．１．１６）若しくはセリンデヒドラターゼ（ＥＣ４．３．１．１７）又はこれらの２種以上の酵素を発現する微生物であることが好ましく、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｓｐｏｒａ）属微生物などの糸状菌、光合成微生物及びプロバイオティック微生物などがより好ましい。
例えば、アシネトバクター属微生物（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属微生物（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルスロバクター属微生物（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンジダ属微生物（Ｃａｎｄｉｄａ）、セファロスポリウム属微生物（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、シトロバクター属微生物（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属微生物（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属微生物（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フサリウム属微生物（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属微生物（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ニューロスポラ属微生物（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属微生物（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属微生物（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スコプラリオプシス属微生物（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、セレノモナス属微生物（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）などの微生物には、セレン化合物を酸化又は還元する能力があることが知られている（Ｄ．Ｔ．ＭＡＩＥＲＳ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＯＣｔ．１９８８，ｐ．２５９１－２５９３を参照）。特に、タウエラ・セレナティス（Ｔｈａｕｅｒａ　ｓｅｌｅｎａｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）及びバチルス・セレナタルセナティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｅｌｅｎａｔａｒｓｅｎａｔｉｓ）からは、セレン酸還元酵素又は該酵素をコードする遺伝子が見出されている（阪口利文、「セレンオキサニオン還元酵素とその遺伝子」、バイオミディア、２０１２年　第３号、ｐ．１３３を参照）。また、アルカリジェネス・ヴィスコラクティス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｖｉｓｃｏｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・シュードディフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・アルカノリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃａ）、ビレビバクテリウム・ロイシノファガム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｕｃｉｎｏｐｈａｇｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、アーウィニア・カロトヴォラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アルカリジェネス・ブッケリ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｂｏｏｋｅｒｉ）、アスペルギルス・フィキューム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アブシディア・コリビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｅｘｐａｎｓｕｍ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ベッキー（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｂｅｃｋｉｉ）、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）にもまたセレノシステインリアーゼ活性を有すること、又は該活性を有する可能性があることが知られている（ＰＡＴＲＩＣＫ　ＣＨＯＣＡＴ　ｅｔ　ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｏｃｔ．１９８３，ｐ．４５５－４５７を参照）。そこで、これらの微生物を宿主生物として使用することができる。また、これらに限らず、セレン代謝遺伝子を強化又は異種発現させたものを宿主生物とすることができる。さらに酵素（１）をコードする遺伝子又は酵素（２）をコードする遺伝子の由来生物とすることができる蓋然性がある。
これらの中でも、エルゴチオネインの生産が認められる糸状菌や酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌がさらに好ましい。糸状菌の具体例としては、ドナルドらの文献（Ｄｏｎａｌｄ　Ｂ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５６，２２３：９－１７、該文献の全記載はここに開示として援用される）やドロシーらの文献（Ｄｏｒｏｔｈｙ　Ｓ．Ｇｅｎｇｈｏｆ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．１９７０，ｐ．４７５－４７８、該文献の全記載はここに開示として援用される）に記載の糸状菌が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属などに属する糸状菌が挙げられる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌としては、例えば、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属などに属する糸状菌などが挙げられる。
糸状菌の中でも、安全性や培養の容易性を加味すれば、上記に酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物として挙げた、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・サイトイなどのアスペルギルス属微生物であることが好ましい。
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の具体例）
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（１）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｓＥｇｔＡが挙げられる。また、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（２）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣが挙げられる。遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１～３として示す。また、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号４～６として示す。
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来の酵素（１）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｏＥｇｔＡが挙げられる。遺伝子ＡｏＥｇｔＡの塩基配列を配列表の配列番号２３として示す。また、ＡｏＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２４として示す。
アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ以外の微生物から酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ、ＡｓＥｇｔＣ及びＡｏＥｇｔＡの塩基配列（配列番号１～３及び２３）並びにＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ、ＡｓＥｇｔＣ及びＡｏＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４～６及び２４）に基づいて、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ以外の微生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ、ＡｓＥｇｔＣ及びＡｏＥｇｔＡの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ以外の微生物の総タンパク質を基に、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ、ＡｓＥｇｔＣ及びＡｏＥｇｔＡタンパク質と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。得られた遺伝子が酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子に相当することは、得られた遺伝子により由来生物を宿主生物として形質転換し、セレノネインが生産されていることを確認すること、又は宿主生物に比してセレノネインの生産量が増強されていることで確認できる。
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーは生育条件が近似していることから、これらそれぞれが有する遺伝子を挿入することにより、相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、アスペルギルス・ソーヤから得られた酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ニガーに導入して形質転換することができる。酵素（１）又は酵素（１）及び（２）が確実に所望の酵素活性を有することを鑑みれば、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物と宿主生物とが同一であることが好ましい。例えば、アスペルギルス・ソーヤ由来の酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を、同じアスペルギルス・ソーヤに形質転換することが挙げられる。
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、アスペルギルス・ソーヤなどに由来する酵素（１）や酵素（２）をコードする遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、宿主生物に発現させるためにコドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の具体例としては、大腸菌発現用に合成されたＥｃＥｇｔＡ（配列番号２７）及びＥｃＥｇｔＣ（配列番号２８）が挙げられる。
（形質転換体の一実施態様）
製造方法の一実施態様で使用する形質転換体の一実施態様は、遺伝子ＡｓＥｇｔＡをアスペルギルス・ソーヤに挿入して、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤである。上記形質転換体の別の一実施態様は、遺伝子ＡｏＥｇｔＡをアスペルギルス・オリゼに挿入して、ＡｏＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼである。このような形質転換アスペルギルス・ソーヤ及び形質転換アスペルギルス・オリゼは、ＡｓＥｇｔＡやＡｏＥｇｔＡタンパク質を過剰発現することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしても微量であるセレノネインを検出可能以上に生産することができる。さらに、後述する実施例に記載があるとおり、形質転換アスペルギルス・ソーヤ及び形質転換アスペルギルス・オリゼは、セレノシステインやセレノシスチンといった有機セレン化合物に限らず、亜セレン酸などの無機セレン化合物からもセレノネインを生産することができる。そこで、形質転換体の一実施態様は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、宿主生物に比してセレノネインの量が増えるように増強された形質転換体であることが好ましい。また、形質転換体の一実施態様は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、酵素（１）をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体に比してセレノネインの量が増えるように増強された形質転換体であることがより好ましい。
また、後述する実施例に記載があるとおり、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、宿主生物であるアスペルギルス・ソーヤの生育に適したＤＰＹ培地を用いて３０℃、４～５日間で培養することにより、湿菌体質量１ｇあたり亜セレン酸を用いた場合に１５．８μｇ及びセレノシスチンを用いた場合に２０７．９μｇのセレノネインが得られている。そこで、形質転換体の一実施態様は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、形質転換体を宿主生物の生育に適したセレン化合物含有培地を用いて３０℃、５日間で培養した場合のセレノネインの量が湿菌体質量１ｇあたり、例えば、５μｇ以上、好ましくは１０μｇ以上、より好ましくは２０μｇ以上、さらに好ましくは４０μｇ以上になるように増強された形質転換体である。形質転換体の別の一実施態様は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、形質転換体を宿主生物の生育に適した亜セレン酸含有培地を用いて３０℃、５日間で培養した場合のセレノネインの量が湿菌体質量１ｇあたり、例えば、５μｇ以上、好ましくは６μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上、より好ましくは１５μｇ以上になるように増強された形質転換体である。形質転換体の別の一実施態様は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、形質転換体を宿主生物の生育に適したセレノシスチン含有培地を用いて３０℃、５日間で培養した場合のセレノネインの量が湿菌体質量１ｇあたり、例えば、１０μｇ以上、好ましくは２０μｇ以上、より好ましくは４０μｇ以上、さらに好ましくは１００μｇ以上、なおさらに好ましくは２００μｇ以上になるように増強された形質転換体である。
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、挿入された酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子によって生産される酵素（１）及び（２）と同時に、宿主生物が本来保有している酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子により上記酵素（１）及び（２）と構造的性質が同種又は別種の野生型の酵素（１）及び（２）を生産する場合がある。結果として、製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、たとえ酵素（２）をコードする遺伝子を導入したものではなくとも、セレノネインを生産することができる。
製造方法の一実施態様で用いられる形質転換体は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換古細菌又は形質転換真性細菌が挙げられる。形質転換真性細菌の非限定的な例としては、ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＡ及びＥｃＥｇｔＣを含有するプラスミドベクターによって形質転換された形質転換大腸菌が挙げられる。
（製造方法）
製造方法の一実施態様は、ヒスチジン及びセレン化合物を、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を少なくとも含む、セレノネインの製造方法である。
ヒスチジン及びセレン化合物を形質転換体に作用させる方法は、ヒスチジン及びセレン化合物と形質転換体とが接触して、形質転換体が有する酵素によってセレノネインが生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒスチジン及びセレン化合物を含有し、かつ、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、セレノネインを製造する方法が挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法が挙げられる。セレン化合物の添加量は、形質転換体の生育阻害が認められない程度の量であれば特に限定されないが、例えば、培養当初には菌体濃度に対して十分に小さい量であり、好ましくは１ｍＭ以下であり、より好ましくは０．１ｍＭ以下であり、さらに好ましくは０．０５ｍＭ以下である。大量のセレノネインを得たければ、セレン化合物を、培養経過時に、又は菌体濃度が高まるにつれて増やすことが好ましい。例えば、セレン化合物を、培養開始から１～２４時間、好ましくは３～２２時間経過時に、０．００１～１０ｍＭ、好ましくは０．００５～５ｍＭの濃度で追加的に培養液に添加することが挙げられる。
培地は、宿主生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物がアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＤＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。ただし、培地成分には、酵素（１）の活性化に必要な鉄（ＩＩ）が含まれることが好ましい。鉄（ＩＩ）は化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。
セレン化合物はセレンを構成元素として含むものであれば特に限定されないが、例えば、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩であり、このうち有機セレン化合物及びその塩としてはセレノシステイン、セレノシスチン、セレノメチオニン、Ｓｅ－（メチル）セレノ－Ｌ－システイン、セレノペプチド、セレノプロテイン及びそれらの塩並びにセレン酵母などが好ましく、無機セレン化合物及びその塩としてはセレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸、二酸化セレン及びそれらの塩などが好ましい。また、セレン化合物は、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩を含む有機物であってもよい。該有機物としては、例えば、かつお（加工品、かつお節）、からし（粉、粒入りマスタード、練りマスタード）、ぶた（腎臓、肝臓、生）、うし（マメ、生）、あんこう（きも、生）、すけとうだら（タラコ、生）、くろまぐろ（赤身、生）、まがれい（生）、かつお（秋獲り、生）、ずわいがに（生）、ひまわりの種（フライ、味付け）、まあじ（焼き）、あまだい（生）、顆粒風味調味料、きはだ（生）、びんなが（生）、カキ（水煮）などのセレンを多く含むことが知られている食品などを挙げることができるが、これらに限定されない。セレン化合物はこれらのうちの１種又は２種以上を組みわせて用いることができる。
セレン化合物としては、セレノシステイン及びセレノシスチンがより好ましい。セレノシステイン及びセレノシスチンの入手方法は特に限定されないが、例えば、セレノシステインは特開２００１－６１４８９号公報を参照して製造できる。
製造方法の一実施態様で用いる形質転換体は、上記した形質転換体であればよく、例えば、セレノシステインやセレノシスチンなどの有機セレン化合物をセレン化合物として用いる場合は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体とすることができ、亜セレン酸などの無機セレン化合物をセレン化合物として用いる場合は酵素（１）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体とすることができるが、これに限定されない。
形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＤＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。
培養終了後に培養物からセレノネインを抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
抽出溶媒はセレノネインが溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながらセレノネインを抽出する。抽出溶媒温度は室温から１００℃に設定することができる。
セレノネインの抽出方法の一実施態様としては、例えば、培養物から回収した菌体を水で洗浄した後に、菌体を水に加えた懸濁液を調製し、次いで得られた懸濁液を１００℃、１５分間などの加温処理に供した後に、遠心分離することにより上清を回収し、次いで回収した上清をろ過して不溶物を取り除く方法が挙げられる。また、該加熱処理した懸濁液を、遠心分離に供することなく、ろ過してもよい。
また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することによりセレノネインを精製することができる。
セレノネインの定性的又は定量的分析は、ＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
製造方法の一実施態様によれば、高収量のセレノネインが得られる。例えば、非特許文献２のＦｉｇ．Ｓ６及びＦｉｇ．３Ｂなどでは、セレン非含有培地を用いた培養結果としてエルゴチオネインの生産量が記載されており、かつ、セレン含有培地を用いた培養結果としてエルゴチオネイン及びセレノネインのピーク比が記載されているところ、これらの結果から総合して考えれば、セレノネインの生産量は約０．０４７μｇ／ｍｌと推定できる。これに対して、製造方法の一実施態様では、後述する実施例に記載されているように、分析値である６．４６μｇ－Ｓｅ／ｍｌ（セレンのみの量）からセレノネイン生産量を計算すると、１４．５６μｇ／ｍｌとなる。したがって、製造方法の一実施態様によれば、非特許文献２に記載の製造方法に比して、１００倍以上の量で、セレノネインを製造することができるという格別に有利な点がある。
製造方法の一実施態様では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
製造方法の別の一実施態様は、形質転換体ではなく、酵素（１）又は酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する微生物を用いる製造方法である。例えば、製造方法の別の一実施態様は、ヒスチジン及びセレン化合物を、酵素（１）又は酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有するアスペルギルス属微生物といった麹菌などの糸状菌に作用させて、セレノネインを得る工程を含む、セレノネインの製造方法である。
製造方法の一実施態様において、生産物であるセレノネインが使用する微生物に対して増殖阻害又は生産阻害を引き起こし得る。そこで、培地中に銅イオンなどの酸化剤を添加することにより、生産したセレノネインを二量体化（Ｓｅ－Ｓｅ結合の形成）して、微生物の増殖阻害又は生産阻害を回避できる可能性がある。したがって、製造方法の一実施態様において、ヒスチジン及びセレン化合物を微生物に作用させる際に、銅イオンなどの酸化剤が存在していることが好ましい。
（セレノネインの用途）
本発明の一実施態様である製造方法や形質転換体を利用して得られたセレノネインは、種々の生理活性を有する機能性生体物質であることや熱に強く水溶性の物質であるという特徴を活かして、一般飲食品、機能性飲食品、機能性表示飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
特に、セレノネインは抗酸化活性を有することが知られており、その活性はチオアナログであるエルゴチオネインの１，０００倍に達するといわれている。そこで、セレノネインは、例えば、ヒドロキシルラジカルの捕捉作用、ヘム鉄の自動酸化抑制作用などの生体抗酸化作用を示す物質として有用である。また、セレノネインを含有する具体的な製品としては、亜セレン酸やセレノメチオニンなどに代わる栄養補助剤、癌や虚血性心疾患などの生活習慣病の予防剤又は治療剤、メチル水銀の解毒剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象遺伝子の探索
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）においてエルゴチオネインの生合成に関与する酵素としてＮＣＵ０４３４３及びＮＣＵ１１３６５が知られている（非特許文献３及び４を参照）。また、非特許文献３では、ＮＣＵ０４６３６がエルゴチオネインの生合成に関与する可能性が示唆されている。そこで、ニューロスポラ・クラッサの上記３つの酵素をコードする遺伝子をクエリーとして、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列を基に、ＮＣＵ０４３４３、ＮＣＵ０４６３６及びＮＣＵ１１３６５のそれぞれをコードする遺伝子と比較的配列同一性の高い領域を検索した。検索にはＢＬＡＳＴプログラム（ｔｂｌａｓｔｎ）及びアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　ＤＮＡ　ｄａｔａｂａｓｅｓ、　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　６５　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；　ＤＦ０９３５５７－ＤＦ０９３５８５、ＤＮＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　１８，１６５-１７６，２０１１）を用いた。
その結果、ＮＣＵ０４３４３と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号１に示す遺伝子が見出された。この遺伝子をアスペルギルス・ソーヤ由来のｅｇｔＡ遺伝子という意味でＡｓＥｇｔＡ遺伝子（配列番号１）と名付けた。ＮＣＵ０４６３６と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号２に示す遺伝子が見出され、この遺伝子をＡｓＥｇｔＢ遺伝子（配列番号２）と名付けた。ＮＣＵ１１３６５と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号３に示す遺伝子が見出され、この遺伝子をＡｓＥｇｔＣ遺伝子（配列番号３）と名付けた。
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社）によりアミノ酸レベルでの配列同一性の比較を行うと、ＡｓＥｇｔＡタンパク質（配列番号４）、ＡｓＥｇｔＢタンパク質（配列番号５）及びＡｓＥｇｔＣタンパク質（配列番号６）とＮＣＵ０４３４３、ＮＣＵ０４６３６及びＮＣＵ１１３６５との配列同一性は、それぞれ４６％、７５％及び４４％であった。また、ＡｓＥｇｔＣタンパク質とＮＣＵ１１３６５のシゾサッカロミセス・ポンベのオルソログであるＳＰＢＣ６６０．１２ｃとの配列同一性は２７％であった。以上の結果から、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列やアミノ酸配列に基づけば、他のアスペルギルス属微生物のｅｇｔＡ遺伝子、ｅｇｔＢ遺伝子及びｅｇｔＣ遺伝子が探索できることが示唆された。
（２）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出
１５０ｍｌ容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸；ｐＨ６．０）を蒸留水で３０ｍｌ調製し、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
プラスミドｐＵＣ１９に、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号７）、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号８）、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１８３８ｂｐ、配列番号９）を連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧは、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表１～３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧの各増幅断片をこの順に連結し、さらにｐＵＣ１９と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
ｐＵＣ１９は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅにて、増幅したＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを、上記したＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。
得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆ及びＴａｌｐの間に、対象遺伝子であるＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表４に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＡｓＥｇｔＡ（配列番号１）、ＡｓＥｇｔＢ（配列番号２）及びＡｓＥｇｔＣ（配列番号３）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣを増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表５～７に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（Ｐｔｅｆ及びＴａｌｐの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣが挿入された対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、５’末端側から３’末端側にかけて、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣのＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｔｅｆ－ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧの配列が順に連結された３種のＤＮＡコンストラクトが得られた。
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクト）を抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
［例２．形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製（１）］
（１）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株
各ＤＮＡコンストラクトをエタノール沈殿した後に、ＴＥに溶解して、所望の濃度に調製したＤＮＡ溶液を、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。
（２）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。
［例３．遺伝子ＡｏＥｇｔＡを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象タンパク質の探索
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０株の総タンパク質を基に、アスペルギルス・ソーヤのＡｓＥｇｔＡアミノ酸配列をクエリーとして配列同一性の高いタンパク質を検索した。検索にはＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ｖｉｅｗ／ＡＯ）を用いた。
その結果、ＡｓＥｇｔＡアミノ酸配列と比較的配列同一性が高かったタンパク質として、ＡＯ０９００１２０００２６５が見出された。なお、ＡＯ０９００１２０００２６５は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＥｇｔ１と類似するものとして、非特許文献５のＴａｂｌｅ　２に記載されているものである。ＡＯ０９００１２０００２６５は、ＡｓＥｇｔＡと９７％の配列同一性が認められた。ＡＯ０９００１２０００２６５をコードする遺伝子をアスペルギルス・オリゼ由来のｅｇｔＡ遺伝子という意味でＡｏＥｇｔＡ遺伝子（配列番号２３）と名付けた。ＡｏＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２４に記載するものである。
（２）アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡの抽出
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の分生子を用いた以外は、上記例１－（２）と同様の方法で実施した。
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
上記例１－（３）で作製したベクター断片を用いた。
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
対象遺伝子がＡｏＥｇｔＡであること及び鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを用いた以外は、上記例１－（４）と同様の方法で実施した。なお、ＡｏＥｇｔＡを増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
なお、上記例１－（４）と同様にして、抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＡｏＥｇｔＡが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
［例４．形質転換アスペルギルス・オリゼの作製］
特開２０１３－０３４４１６号公報に記載のアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来ｐｙｒＧ破壊株について形質転換した以外は、上記例２－（１）及び（２）と同様の方法で実施した。
［例５．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産］
コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株並びに遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤのそれぞれのセレノネイン生産能を以下のとおりに比較した。
２００ｍｌ容三角フラスコ中のセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地（０．１％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、１ｍＭ　セレノシスチン、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００１７％ＦｅＳＯ４；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で５日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液について、下記の条件のＬＣ-ＭＳにより分析を行った。
［ＬＣ－ＭＳ条件］
ＬＣ装置；Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（アジレント社）
質量分析装置；ＱＳＴＡＲ Ｅｌｉｔｅ　(ＡＢ　ｓｃｉｅｘ社)
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ　ＨＩＬＩＣ（４．６×２５０ｍｍ）
溶離液；アセトニトリル＋０．１％ギ酸：水＋０．１％ギ酸 = ７５：２５（ｖ／ｖ）
流速；２５０ μｌ／ｍｌ
検出；ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；１０ μｌ
温度；室温
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株及び遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて得られたセレノネイン抽出液について、セレノネインのプロトン付加イオンに相当する、ｍ／ｚ２７８のＬＣ－ＭＳ分析結果を図１に示す。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株では非常に小さかったピークが、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤでは明確に検出された。
なお、エルゴチオネインのプロトン付加イオンに相当するｍ／ｚ２３０のＬＣ－ＭＳ分析結果を図２に示す。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を用いた場合はエルゴチオネインに相当するピークがわずかに検出され、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いた場合はエルゴチオネインに相当するピークが明確に検出された。
［例６．セレノネイン生産の確認］
図１で検出された、ｍ／ｚ２７８に検出された、リテンションタイム３１分付近のピークのＭＳスペクトルの拡大図を図３に示す。さらに、天然存在比から推定されるセレノネインのイオン分布の計算値を図４に示す。イオン分布の実測値が概ね一致することから、上記ピークがセレノネインであることを示すピークであり、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤはセレノネインを生産することが示された。
［例７．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産（１）］
２００ｍｌ容三角フラスコ中にて、ＤＰＹ液体培地　４０ｍｌ；亜セレン酸添加ＤＰＹ液体培地（１ｍＭ　亜セレン酸、０．１％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００１７％ＦｅＳＯ４；ｐＨ未調整）４０ｍｌ；又はセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地　４０ｍｌを用いて、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種し、３０℃で５日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体質量　２．２８ｇ（セレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地）及び１．８９ｇ（亜セレン酸添加ＤＰＹ液体培地）を得た。８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液について、セレノネインの存在を上記条件のＬＣ－ＭＳにより分析した。また、セレノネイン及び総セレンの定量は、ヤマシタらの文献（ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＶＯＬ．２８５，ＮＯ．２４，ｐｐ．１８１３４－１８１３８，Ｊｕｎｅ　１１，２０１０、「ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」、“Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”、該文献の全記載はここに開示として援用される）に記載の条件にて、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳにより分析した。
セレノネインに相当する、ｍ／ｚ２７８のＬＣ－ＭＳ分析結果を図５に示す。ＤＰＹ液体培地そのものではセレノネインは検出されず、セレノシスチン添加又は亜セレン酸添加によりセレノネインが検出された。したがって、形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いれば、セレン化合物を培地に添加することにより、セレノネインを生産できることが確認された。
セレノネイン抽出液中のセレノネイン含量（セレン当量）を上記のようにして分析したところ、セレノシスチン添加液体培地を用いた場合は１６．３μｇ－Ｓｅ／ｇ－抽出液であり、亜セレン酸添加液体培地を用いた場合は４．６μｇ－Ｓｅ／ｇ－抽出液であった。なお、ＤＡＮ蛍光法によりセレノネイン抽出液中の総セレン含量を測定したところ、セレノシスチン添加液体培地を用いた場合は２０．８μｇ／ｇ－抽出液であり、亜セレン酸添加培地を用いた場合は８．１μｇ／ｇ－抽出液であった。また、湿菌体質量あたりのセレノネイン生産量は、セレノシスチン添加液体培地を用いた場合は１２８．９３μｇ／ｇ－湿菌体質量であり、亜セレン酸添加培地を用いた場合は４３．８９μｇ／ｇ－湿菌体質量であった。これらの結果より、形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いることにより、セレノシスチン又は亜セレン酸を用いることにより、大量のセレノネインが得ることができた。なお、ＤＡＮ蛍光法は、硝酸・過塩素酸混液による湿式加熱分解後、２，３－ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）と反応させ、Ｓｅ（ＩＶ）との錯体形成反応により生じる４，５－ベンゾピアセレノール（Ｓｅ－ＤＡＮ）の蛍光を利用する方法であり、ワトキンソンの文献（Ｊ． Ｈ． Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３８（１），９２－９７ （１９６６）、該文献の全記載はここに開示として援用される）を参照して実施した。
［例８．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産（２）］
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株；遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ；遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＢにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ；並びに遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種したこと、及び３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養したこと以外は、上記例７と同様の操作を実施した。結果をまとめたものを表９及び表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
上記結果より、形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いることにより、セレノシスチン又は亜セレン酸を用いることにより、大量のセレノネインが得ることができた。また、驚くべきことに、遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＢにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ並びに遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤよりも、セレノシステイン量及び総セレン量が多くなるという結果が得られた。
［例９．形質転換アスペルギルス・オリゼを用いたセレノネイン生産］
コントロールであるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株及び遺伝子ＡｏＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼのそれぞれのセレノネイン生産能を以下のとおりに比較した。
２００ｍｌ容三角フラスコ中のセレノシスチン添加ＤＰＹ液体培地　４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体質量　１．８４ｇを得た。８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液について、セレノネインの存在を上記条件のＬＣ-ＭＳにより分析した。また、セレノネインの定量は、ヤマシタらの文献に記載の条件にて、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳにより分析した。
セレノネインに相当する、ｍ／ｚ２７８のＬＣ－ＭＳ分析結果を図６に示す。アスペルギルス・オリゼにおいて、コントロール株では、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株よりも若干大きなピークとしてセレノネインが検出された。一方、遺伝子ＡｏＥｇｔＡにより形質転換した形質転換体はリテンションタイムが３１．５分付近のセレノネインのピークが明確に検出された。これらの結果より、形質転換アスペルギルス・オリゼを用いることにより、セレノネインを大量に生産できることが確認された。
セレノネイン抽出液中のセレノネイン含量（セレン当量）を上記のようにして分析したところ、形質転換アスペルギルス・オリゼを用いた場合のセレノネイン含量は３２．３μｇ－Ｓｅ／ｇ－抽出液であった。また、湿菌体質量あたりのセレノネイン生産量は、３１６．５８μｇ／ｇ－湿菌体質量であった。なお、ＤＡＮ蛍光法によりセレノネイン抽出液中の総セレン含量を測定したところ、３９．１μｇ－Ｓｅ／ｇ－抽出液であった。
［例１０．セレン化合物毒性］
ＤＰＹ液体培地に０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ若しくは１．０ｍＭのセレノシスチン又は亜セレン酸を添加した。これらのそれぞれに、コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株又は遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体重量を測定した。
セレン化合物の各濃度について、コントロールに対する形質転換体の湿菌体重量の相対量を図示したものを図７及び図８に示す。図７及び図８が示すように、形質転換体は、いずれのセレン化合物に対して耐性を示すことが示された。
［例１１．形質転換アスペルギルス・ソーヤの確認］
試験管中のＤＰＹ液体培地１０ｍｌに、コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株；遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣのいずれか１種の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ；並びに遺伝子ＡｓＥｇｔＡとＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣとにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの各分生子を接種し、３０℃で３日間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を、ビーズ式細胞破砕装置（ＭＳ－１００Ｒ；トミー精工社）を用いて冷却条件で破砕した破砕菌体末を、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液に懸濁することによりＳＤＳ懸濁液を得た。得られたＳＤＳ懸濁液にサンプルバッファー（Ｌａｎｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ，ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（５×）；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１／４容量添加して攪拌し、次いで９８℃、３分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により回収した上清について、菌体０．２ｍｇ相当をアプライすることにより、アクリルアミドゲル電気泳動に供して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。結果を図９に示す。
図９に示されているとおり、ＡｓＥｇｔＡタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が９５．７ｋＤａであるところ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは９０ｋＤａ付近に２本のバンドとして見られた。同様に、ＡｓＥｇｔＢタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が５６．４ｋＤａであるところ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは５０ｋＤａ弱のバンドとして見られた。また、ＡｓＥｇｔＣタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が５１．２ｋＤａであるところ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは５０ｋＤａのバンドとして見られた。
図９から、コントロール株はＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＥｇｔＢタンパク質及びＡｓＥｇｔＣタンパク質をほとんど発現しておらず、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換体及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換体はＡｓＥｇｔＡタンパク質とＡｓＥｇｔＢタンパク質又はＡｓＥｇｔＣタンパク質とを発現していた。また、ＡｓＥｇｔＡ形質転換体、ＡｓＥｇｔＢ形質転換体及びＡｓＥｇｔＣ形質転換体は、それぞれ対応するＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＥｇｔＢタンパク質及びＡｓＥｇｔＣタンパク質を発現していた。
［例１２．形質転換大腸菌の作製］
ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣのそれぞれのアミノ酸配列をもとに、コドン、二次構造、ＧＣ含量などの観点から大腸菌発現用に遺伝子配列を最適化したものに、遺伝子の上流にＥｃｏＲＶ配列（ＧＡＴＡＴＣ）を付加し、かつ、下流にＳｐｅＩ配列（ＡＣＴＡＧＴ）を付加することにより、ＥｃＥｇｔＡ（配列番号２７）及びＥｃＥｇｔＣ（配列番号２８）を得た。
発現用ベクターとしてｐＵＴＥ１２０Ｋ’を構築した。すなわち、特開平６－２９２５８４号公報に記載のｐＵＴＥ１００Ｋ’をＮｈｅＩ及びＨｐａＩで消化し、ｌａｃプロモーターを除去した。次いで、ｐＫＫ２２３－３（ＧＥ社）のＴａｃプロモーター領域を３’末端にＮｈｅＩサイト及び５’末端にＥｃｏＲＶサイトを付加してＰＣＲで増幅及び精製した。次いで、ＮｈｅＩ消化した後、ｐＵＴＥ１００Ｋ’の本来ｌａｃプロモーターがあった部位に挿入して、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’を作製した。
ｐＵＴＥ１２０Ｋ’をＥｃｏＲＶ及びＳｐｅＩを用いて制限酵素処理し、次いでＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣをライゲーションして、ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣが挿入されたプラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＡ及びｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＣを作製した。
上記コンストラクト用プラスミドにて形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＡ及びｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＣを精製した。次いで、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＣをＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで制限酵素処理をし、遺伝子ＥｃＥｇｔＣを含む断片を切り出し、精製した。また、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＡをＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩで制限酵素処理し、上記遺伝子ＥｃＥｇｔＣを含む断片を挿入して、プラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’－ＥｃＥｇｔＡ－ＥｃＥｇｔＣを作製した。該プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、形質転換大腸菌を得た。
形質転換大腸菌を、１ｍＭ　セレノシスチン又は１ｍＭ　亜セレン酸及び０．１ｍＭ　イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＴＹ培地（１％（ｗ／ｖ）バクト・トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）バクト・イースト・エクストラクト、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて、２５℃で１６時間培養することにより、培養液全体及び回収した菌体の熱水抽出液中にセレノネインが検出される。
［例１３．遺伝子ＡｎＥｇｔＡを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象タンパク質の探索
データベースＮｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｎｒ）を基に、アスペルギルス・ソーヤのＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列をクエリーとして配列同一性の高いタンパク質を検索した。検索にはＢｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を用いた。
その結果、ＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性が高かったタンパク質のうち、アスペルギルス・ニガーであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＣＢＳ　５１３．８８株の相同タンパク質としてＸＰ＿００１３９７１１７．２（配列番号３０）が見出された。ＸＰ＿００１３９７１１７．２は、ＡｓＥｇｔＡタンパク質と７３％の配列同一性が認められた。ＸＰ＿００１３９７１１７．２をコードする遺伝子をアスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡから特定し、アスペルギルス・ニガー由来のｅｇｔＡ遺伝子という意味で、遺伝子ＡｎＥｇｔＡ（配列番号２９）と名付けた。
（２）アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の染色体ＤＮＡの抽出
アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の分生子を用いた以外は、上記例１－（２）と同様の方法で実施した。
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
上記例１－（３）で作製したベクター断片を用いた。
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
対象遺伝子がＡｎＥｇｔＡ遺伝子であること及び鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の染色体ＤＮＡを用いた以外は、上記例１－（４）と同様の方法で実施した。なお、ＡｎＥｇｔＡ遺伝子を増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
なお、上記例１－（４）と同様にして、抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子ＡｎＥｇｔＡが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。
クローニングした遺伝子ＡｎＥｇｔＡの配列を確認したところ、ゲノム情報が公開されているＡ．　ｎｉｇｅｒ　ＣＢＳ　５１３．８８株の予測遺伝子（ＡＮＩ＿１＿７９２１３４）の配列と一致した（対応するアミノ酸配列は上記ＸＰ＿００１３９７１１７．２）。
［例１４．形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製（２）］
遺伝子ＡｎＥｇｔＡを挿入したＤＮＡコンストラクトを用いた以外は、上記例２－（１）及び（２）と同様の方法で実施した。
［例１５．形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産（３）］
コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株及び遺伝子ＡｎＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種した以外は上記例７と同様の方法により実施した。得られたエルゴチオネイン抽出液及び本培養後の培養物から得た培養上清（０．４５μｍフィルターを用いたろ過処理済み）について、ヤマシタらの文献に記載の条件にて、ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳによりセレノネインを定量した。コントロール株及び形質転換アスペルギルス・ソーヤによるセレノネイン生産量を比較した結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
表１２に示されているとおり、遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤと同様に、遺伝子ＡｎＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、形質転換していないコントロール株よりも、いずれの基質を用いた場合にも、抽出液中及び培養液中のセレノネインの生産量が多かった。これらの結果より、由来生物種が異なる異種遺伝子ＡｎＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤにおいてもセレノネインを効率的に生産できることがわかった。
［例１６．形質転換大腸菌を用いたセレノネイン生産］
下記表１３に示すとおり、コントロールである発現用ベクターｐＵＴＥ１２０Ｋ’を導入した大腸菌；遺伝子ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣにより形質転換した形質転換大腸菌；及び遺伝子ＥｃＥｇｔＡと遺伝子ＥｃＥｇｔＣとにより形質転換した形質転換大腸菌のそれぞれのセレノネイン生産能を以下のとおりに比較した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
１９ｍｌ容試験管中のＴＹ培地　２．５ｍｌに、表１３に示す各菌株を接種し、３７℃で１６時間、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、種培養を行った。種培養した培養液　２０μｌを、１９ｍｌ容試験管中のアンピシリン及び０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを含有するＴＹ培地　２．５ｍｌに接種し、２５℃で２０．５時間、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、本培養を行った。なお、本培養に用いたＴＹ培地には、０．１ｍＭ　セレノシスチンを含有するもの（ＴＹ＋＋）、０．０１ｍＭ　セレノシスチンを含有するもの（ＴＹ＋）及び培養開始６時間後に０．０１ｍＭになるようにセレノシスチンを添加したもの（ＴＹ＋○）の３系統を用意した。
さらに、これらとは別に、種培養した培養液２０μｌを、１９ｍｌ容試験管中のアンピシリン及び０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを含有するＴＹ培地　０．６ｍｌに接種し、２５℃で２５時間、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、本培養を行った。この際、０．０１ｍＭになるようにセレノシスチンを添加した後に、培養開始から２０．５時間後に２．５ｍＭのセレノシスチンを１０μｌ添加し、さらに４．５時間培養した（ＴＹ＋＋＋）。
培養後の培養物から遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）をすることにより菌体を沈殿物として回収した。ＴＹ＋＋＋、ＴＹ＋及びＴＹ＋○について１ｍｌの培養液から得られる菌体及びＴＹ＋＋＋について０．６ｍｌの培養液から得られる菌体に、０．２ｍｌの水を添加し、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、９８℃、１０分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液及び本培養後の培養物から得た培養上清（０．４５μｍフィルターを用いたろ過処理済み）について、下記の条件のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりセレノネインを定量した。セレノネインを定量した結果を表１４に示す。
ＬＣ装置；ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）
質量分析装置；Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＡＰＩ　(Ｗａｔｅｒｓ社)
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ　２．５ＨＩＬＩＣ（３．０×１００ｍｍ）
溶離液；アセトニトリル＋０．１％ギ酸：水＋０．１％ギ酸 = ８０：２０（ｖ／ｖ）
流速；５００ μｌ／ｍｌ
検出；ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；２ μｌ
温度；４０℃
定量法；セレノネイン標品（アスペルギルス・オリゼ生産）を用いた検量線法
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
表１４に示されているとおり、いずれの培養系統においても、コントロール株及びＥｃＥｇｔＣ形質転換株では、培養上清及びセレノネイン抽出液にかかわらずセレノネイン量が認められなかった。このことから、コントロール株及びＥｃＥｇｔＣ形質転換株は、セレノネインの生産能がないこと、又はセレノネインの生産能は非常に微小であることがわかった。
一方で、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株及び（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株では、セレノネインの生産能が確認できた。また、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株によるセレノネイン量は、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株によるセレノネイン量よりも多く、それらの差異は培養上清において顕著であった。また、培地中へのセレノシスチンの添加の影響を比較したところ、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株及び（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株のいずれにおいても、培養開始から十分な時間が経った後に培地中へセレノシスチンを添加することにより、セレノネイン量は増加した。なお、ＴＹ＋＋系統については、セレノシスチンが培養当初から高濃度に存在していたことから、生育阻害を起こすなどして、結果的にセレノネイン量が小さくなった。このことから、セレノシスチンの添加量は、培養当初には菌体濃度に対して十分に小さい量であることが好ましく、培養経過時に、又は菌体濃度が高まるにつれて増やすことが好ましいことがわかった。
以上の結果より、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株はセレノネインの生産量が多いものの、ＥＣＥｇｔＣ形質転換株のセレノネインの生産量は検出できなかったことから、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株は、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株に対して、相加的というよりもむしろ相乗的にセレノネインの生産能が増強されたものであることがわかった。
［例１７．セレン酵母を培地とした形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産］
２００ｍｌ容三角フラスコ中にて、セレン酵母液体培地　４０ｍｌ（１．５％（ｗ／ｖ）セレン酵母、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ｐＨ未調整）に、遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種し、３０℃で５日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。
次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、８ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液及び生産株未接種の培地について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりセレノネインを定量した。セレノネインを定量した結果を表１５に示す。形質転換アスペルギルス・ソーヤは、セレン酵母中のセレンを利用して、セレノネインを生産できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
［例１８．カツオマグロエキス（Ｂａｃｔｅｒｉｏ－Ｎ－ＫＮ）を培地とした形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いたセレノネイン生産］
２００ｍｌ容三角フラスコ中にて、カツオマグロエキス液体培地　４０ｍｌ（２．０％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｅｒｉｏ－Ｎ－ＫＮ（マルハニチロ社）、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ｐＨ未調整）に、遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種し、３０℃で５日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。
次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、４ｍｌの水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、セレノネイン抽出液を得た。
得られたセレノネイン抽出液及び生産株未接種の培地について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりセレノネインを定量した。セレノネインを定量した結果を表１６に示す。形質転換アスペルギルス・ソーヤは、カツオマグロエキス中のセレンを利用して、セレノネインを生産できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
本発明の一実施態様である製造方法や形質転換体は、エルゴチオネインの１，０００倍に達するといわれている抗酸化活性を有するセレノネインを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、抗酸化機能が付与された化粧品やサプリメントなどの抗酸化製品を製造するための原料を工業的規模で製造するために利用可能である。

Claims (11)

  1. ヒスチジン及びセレン化合物を、下記（１）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体に作用させて、セレノネインを得る工程を含む、セレノネインの製造方法。
    （１）Ｓ－アデノシルメチオニン及び鉄（ＩＩ）の存在下で、ヒスチジン及びセレノシステインから下記式〔Ｉ〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔Ｉ〕
    に示されるヘルシニルセレノシステインを生成する反応を触媒する酵素
  2. 前記セレン化合物が、有機セレン化合物及び無機セレン化合物並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記セレン化合物がセレノシステイン、セレノシスチン、セレノメチオニン、Ｓｅ－（メチル）セレノ－Ｌ－システイン、セレノペプチド、セレノプロテイン及びそれらの塩並びにセレン酵母からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物であり、及び／又は、前記セレン化合物がセレン酸、亜セレン酸、塩化セレン、セレン、セレン化物、硫化セレン、ジメチルセレン、セレノリン酸、二酸化セレン及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のセレン化合物である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 前記形質転換体が、さらに下記（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換体である、請求項１に記載の製造方法。
    （２）ピリドキサール　５’－リン酸を補酵素として、下記式〔Ｉ〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔Ｉ〕
    に示されるヘルシニルセレノシステインからセレノネインを生成する反応を触媒する酵素
  5. 前記形質転換体が、セレン酸レダクターゼ、セレノシステインリアーゼ及びセリンデヒドラターゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を発現する微生物を宿主生物とする、請求項１に記載の製造方法。
  6. 前記形質転換体が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、及びアカパンカビ（Ｎｅｕｓｐｏｒａ）属微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生物を宿主生物とする、請求項１に記載の製造方法。
  7. 前記形質転換体が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物を宿主生物とする、請求項１に記載の製造方法。
  8. 前記形質転換体は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が、宿主生物に比してセレノネインの量が増えるように増強された形質転換体である、請求項１に記載の製造方法。
  9. 前記形質転換体は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が、該形質転換体を、宿主生物の生育に適したセレノシスチン含有培地を用いて３０℃、５日間で培養した場合のセレノネインの量が湿菌体質量１ｇあたり１０μｇ以上になるように増強された形質転換体である、請求項１に記載の製造方法。
  10. 前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の製造方法。
  11. 前記（２）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（２）の酵素が配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の製造方法。
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