WO2017010853A1 - 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법 - Google Patents

코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법 Download PDF

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이윤식
경산
정철환
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    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
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    • C01B33/18—Preparation of finely divided silica neither in sol nor in gel form; After-treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Definitions

  • the technology disclosed herein relates to a method of preparing magnetic nanoparticles having a core-shell structure, and more particularly, to a method of preparing core-shell structured magnetic nanoparticles suitable for application to biomaterials and cell separation technologies, bioassays, and the like. It is about.
  • Magnetic nanoparticles are attracting attention in the field of biotechnology, in particular the separation of biomolecules.
  • superparamagnetic iron oxide nanoparticles Fe 3 O 4 NP
  • Fe 3 O 4 NP is promising materials because they are not aggregated by residual magnetization at room temperature.
  • Fe 3 O 4 NP is non-toxic and the synthesis method is well known.
  • bare Fe 3 O 4 NP itself is difficult to be used for biomolecular separation due to some problems.
  • single Fe 3 O 4 NPs show very slow accumulation and low separation yield by magnets.
  • Fe 3 O 4 NP composed of a metal atom is very vulnerable to the oxidizing material, the magnetic and dispersing properties of the NP may be reduced.
  • many factors such as high surface area to nanoparticle volume and van der Waals attraction, can induce aggregation in common nanosystems.
  • introducing a functional group to the central nanoparticles surface modification (a) introducing a functional group to the central nanoparticles surface modification; (b) treating the catechol functional group-containing compound to the central nanoparticle to introduce a catechol functional group into the central nanoparticle; (c) forming a layer of superparamagnetic nanoparticles around the central nanoparticle by introducing superparamagnetic nanoparticles on the surface of the central nanoparticle; And (d) forming a silica shell to surround the layer of superparamagnetic nanoparticles.
  • the central nanoparticles may be silica nanoparticles.
  • the catechol functional group-containing compound may include a separate functional group for binding at one end thereof to the catechol functional group and at the other end thereof to the functional group introduced into the central nanoparticle.
  • the catechol functional group-containing compound may be a compound represented by the following formula (1).
  • L is a single bond or a divalent organic group
  • X is a functional group selected from an amine group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an epoxy group, an azide group, and an alkyne group.
  • the divalent organic group may be alkylene, alkenylene or alkynylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • the method comprises the steps of (d), after the step (e) surface modification of the silica shell; And (f) repeating the steps of (b) to (d) to form a multilayer structure.
  • the method may further comprise the step (d), after the step (g) introducing a metal nanoparticle coated with a Raman labeling compound to the silica shell.
  • the metal nanoparticle of step (g) may be gold nanoparticles or silver nanoparticles.
  • the linker is introduced into the central nanoparticles; A plurality of superparamagnetic nanoparticles coated to surround one of the central nanoparticles by the linker; And a silica shell formed to surround the superparamagnetic nanoparticles.
  • the linker may be a catechol functional group containing compound.
  • the magnetic nanoparticles of the core-shell structure includes a plurality of superparamagnetic nanoparticles forming an additional layer to surround the silica shell; And an additional silica shell surrounding the superparamagnetic nanoparticles of the additional layer.
  • the magnetic nanoparticles of the core-shell structure includes metal nanoparticles introduced to surround the silica shell; And it may have enhanced Raman activity by including a Raman labeling compound coated on the metal nanoparticles.
  • FIG. 1 is a process flowchart showing one embodiment of a method of manufacturing magnetic nanoparticles having a core-shell structure.
  • SL MNP single layer magnetic nanoparticles
  • DL MNP double layer magnetic nanoparticles
  • M Ag NS magnetic nanoparticles
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the process of measuring the SERS signal after aggregation of the nanoparticles.
  • TEM 5 is a transmission electron microscope (TEM) image of the magnetic nanoparticles synthesized in the above embodiment.
  • FIG. 7 is a TEM photograph of magnetic nanoparticles with silver nanoparticle shells.
  • 10 is a graph showing the SERS signal measured from nanoparticles before aggregation.
  • 11 is a graph comparing SERS signals before and after aggregation.
  • a method for producing magnetic nanoparticles having a core-shell structure is provided.
  • 1 is a process flowchart showing one embodiment of a method of manufacturing magnetic nanoparticles having a core-shell structure.
  • surface modification is performed by introducing a functional group into the central nanoparticle in step S1.
  • the central nanoparticle may be an oxide nanoparticle or a polymer nanoparticle.
  • the size of the central nanoparticles may be 50 to 1,000 nm, preferably 100 to 1,000 nm, more preferably 100 to 500 nm, the superparamagnetic nanoparticles having a small surface area when the size of the central nanoparticles are less than the above range.
  • the oxide nanoparticles may be silica, titania, chromia, yttria, and the like, and silica particles are preferable in view of double biocompatibility and synthesis process.
  • the silica nanoparticles may be prepared by a known synthesis method such as the Stover method using TEOS.
  • the polymer nanoparticles may also be prepared by known synthetic methods such as emulsion method, and various polymers such as styrene-based polymer or acrylic polymer may be used without limitation.
  • the functional group may be a carboxyl group, an amine group, a hydroxyl group, a thiol group, an epoxy group, an acryl group, a methacryl group, an alkyne group, an azide group, or the like.
  • carboxyl group modified silica nanoparticles SiO 2 -COOH NP
  • APTS APTS and succinic anhydride.
  • the catechol functional group-containing compound which serves as a linker for easily introducing the superparamagnetic nanoparticles later, may be bound to the central nanoparticle.
  • the catechol functional group-containing compound is treated in the central nanoparticle to introduce the catechol functional group into the central nanoparticle.
  • the catechol functional group-containing compound serves to facilitate bonding between the central nanoparticle and the superparamagnetic nanoparticles.
  • one end of the catechol functional group-containing compound preferably contains a catechol functional group and the other end includes a separate functional group for bonding with the functional group introduced to the central nanoparticle.
  • the separate functional group may be selected from amine group, carboxyl group, hydroxy group, thiol group, alkyne group, azide group and the like.
  • the catechol functional group-containing compound may be represented by the following Chemical Formula 1.
  • L is a single bond or a divalent organic group
  • X is a functional group selected from an amine group, a carboxyl group, a hydroxy group, a thiol group, an alkyn group, or an azide group.
  • the divalent organic group may be alkylene, alkenylene, alkynylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • the divalent organic group may comprise one or more double bonds in the chain.
  • the divalent organic group may be substituted with one or more substituents.
  • the substituent may be an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyl group, a nitro group, a cyano group, an amino group, or the like.
  • catechol functional group-containing compound is caffeic acid ( ) Or dopamine ( May be).
  • a catechol functional group may be introduced into the central nanoparticle through an amide bond by reacting caffeic acid with an amine-modified central nanoparticle or by reacting dopamine hydrochloride with a carboxyl-modified central nanoparticle.
  • Catechol functionalities may help to later combine superparamagnetic nanoparticles with the central nanoparticles.
  • the superparamagnetic nanoparticle can be easily fixed to the central nanoparticle by the strong affinity between the two hydroxyl groups and the surface iron atoms present in the catechol. More specifically, the iron atoms located on the surface of the iron oxide nanoparticles have an empty coordination site. When two hydroxy groups in the catechol form coordination bonds, they form a stable octahedral structure. Maintainability promotes bond formation.
  • step S3 superparamagnetic nanoparticles are introduced to the surface of the central nanoparticle to form a layer of superparamagnetic nanoparticles around the central nanoparticle.
  • the superparamagnetic nanoparticles may be, for example, a material of Fe 3 O 4 , iron-platinum alloy, cobalt, nickel, niobium, and the like, and is preferably Fe 3 O 4 in terms of biocompatibility.
  • the size of the superparamagnetic nanoparticles may be 1 to 50nm, preferably 3 to 40nm, more preferably 4 to 30nm, even more preferably 5 to 20nm, the size of the superparamagnetic nanoparticles are less than the above range
  • the coating on the central nanoparticles is not easy, and there is a fear that the superparamagnetism is lost above the above range.
  • the number of the superparamagnetic nanoparticles fixed per one central nanoparticle may be 200 to 20,000.
  • a stabilizer such as polyvinylpyrrolidone (PVP) for the smooth introduction of the superparamagnetic nanoparticles, it is possible to impart amphipathic to the particles to facilitate later silica coating.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • step S4 a silica shell is formed to surround the layer of superparamagnetic nanoparticles.
  • the surface of the silica shell is modified in the same manner as in the above-described step S2, and thereafter, by repeating the steps of forming the layer of superparamagnetic nanoparticles and forming the silica shell as in steps S3 to S4, two or more layers are formed.
  • Silica nanospheres of a core / multishell structure of a multilayer structure can be prepared. As the number of layers of the shell increases, the surface area of the particles increases, so that the number of superparamagnetic nanoparticles that can be loaded into one particle can be greatly increased.
  • silica nanospheres of the core / multi-shell structure thus obtained are further strengthened in magnetism and can be easily used for biological material separation in biological applications.
  • the metal nanoparticles coated with the Raman labeling compound may be introduced into the silica shell after step S4. If desired, the entire particle can be coated with a silica shell again.
  • the particles thus obtained can be used as surface enhanced Raman scattering (SERS) nanoparticles.
  • Korean Patent Publication No. 10-2007-0060545, Korean Patent Publication No. 10-2008-0078969 and the like can be referred to.
  • the metal nanoparticles may be gold nanoparticles or silver nanoparticles. There is a contact point called hot spot or nanojunction between the metal nanoparticles, where the enhanced Raman scattering phenomenon may occur more strongly.
  • the metal nanoparticles are prepared by treating the silica shell of the core-shell magnetic nanoparticles prepared above with a thiol compound such as merctosilane, and then reducing the gold or silver precursor to reduce the cores on the core-shell magnetic nanoparticles. It can be introduced into the shell magnetic nanoparticles.
  • the Raman labeling compound is not particularly limited as long as it has a simple structure and shows a Raman spectrum in a distinct fingerprint region, and there is a thiol group, an amine group, a cyanide group, an isocyanide group, an isothiocyanide group, and a disulfide at a terminal thereof.
  • Chemicals with groups or azide groups have a strong affinity with metal nanoparticles and can be used in the present invention. Some examples include 2-methylbenzenethiol, 4-methylbenzenethiol, 3,4-dimethylbenzenethiol, thiophenol, 4-mertotoluene, 4-fluorobenzenethiol, and the like.
  • FIG. 2 illustrates a process of manufacturing single layer magnetic nanoparticles (SL MNP) and double layer magnetic nanoparticles (DL MNP) according to an embodiment of the present invention.
  • DL MNP is prepared by repeating the method described above for catechol-modified SL MNP.
  • the DL MNP has a core-shell structure, and is disposed in the shell portion of the silica core in a double layer structure in which a plurality of Fe 3 O 4 NPs are stacked.
  • Silica nanoparticles can be used as the core template for ease of handling and reproducibility.
  • the bilayer to which Fe 3 O 4 NP is fixed may be designed to increase the load level of MNP on silica nanoparticles.
  • the surface of the DL MNP is finally covered with a layer of silica shell that is highly biocompatible and easily functionalizable.
  • FIG. 3 illustrates a process of manufacturing magnetic nanoparticles (M Ag NS) generating SERS signals according to an embodiment of the present invention.
  • Ag nanostructures having SERS characteristics may be synthesized by reducing Ag ions on the surface of a single layer magnetic-silica nanoparticle.
  • a thiol group such as Mercaptopropyltrimethoxysilane was introduced to introduce a thiol group on the surface of silica, and then hundreds of Ag nanoparticles were reduced on the surface of the silica nanoparticles to grow a layer made of Ag nanoparticles. Ag-covered structure is formed.
  • SERS signals can be obtained by treating the nanostructures with 4-FBT (4-Fluorobenzenethiol), one of the SERS markers.
  • 4-FBT 4-Fluorobenzenethiol
  • the nanostructures can be gathered in one place using magnetism to obtain even stronger SERS signals, including the effect of increasing particle concentration. Aggregation of nanostructures using an external magnetic field causes resonance between the surface plasmons of the nanoparticles as the distance between the nanoparticles increases. This is called a hot spot where the SERS signal can be greatly amplified, and a very strong SERS signal can be obtained by placing the SERS marker here.
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the process of measuring the SERS signal after aggregation of the nanoparticles.
  • the magnetic nanoparticles of the core-shell structure of the present invention may have a multilayer shell structure in which hundreds to thousands (for example, about 1200) of superparamagnetic nanoparticles are attached to the surface of the central nanoparticles.
  • the nanostructure may have strong magnetic properties. Since superparamagnetic nanoparticles, such as iron oxide nanoparticles, are fixed as shells to central nanoparticles, such as silica, there is no agglomeration between iron oxide nanoparticles, resulting in hundreds to thousands of iron oxide nanoparticles without losing their inherent superparamagnetism. Because of its high density mounting on nanostructures, the magnetic properties per particle are hundreds of times stronger than conventional single iron oxide nanoparticles.
  • the core-shell magnetic nanoparticles of the present invention may have a very strong SERS signal due to the presence of the magnetic nanoparticles.
  • Iron oxide nanoparticles (18 nm) were purchased from Ocean Nanotech.
  • Polyvinylpyrrolidone (PVP, molecular weight 10,000), Tetraethylorthosilicate (TEOS), 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTS), succinic anhydride and dopamine hydrochloride were purchased from Sigma Aldrich.
  • Diethyl ether, Dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), ethanol, isopropanol (IPA) and ammonia water were purchased from large purified gold.
  • Diisopropylethylamine (DIEA) was purchased from Alfa Aesar.
  • Ethanol anhydrous was purchased from Carlo Erba.
  • 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) and Hydroxybenzotriazole (HOBt) were purchased from BidTech.
  • TEOS 1.6 mL
  • ammonium hydroxide 4 mL
  • EtOH 40 mL
  • the reaction mixture is stirred overnight at 25 ° C., centrifuged at 7,000 rpm for 15 minutes, and the resulting silica Nanoparticles (200 nm) were washed repeatedly with EtOH.
  • Silica nanoparticles (2 mg mL- 1 , 20 mL in EtOH) were treated with APTS (100 ⁇ L) and ammonia water (100 ⁇ L) for 18 hours to introduce amine groups on the surface.
  • silica nanoparticles were washed several times with EtOH and redispersed in DMF.
  • Silica nanoparticles with introduced amine groups (2 mg mL- 1 , 20 mL in DMF) were reacted with succinic anhydride (40 mg) and DIEA (40 ⁇ L).
  • the reaction mixture was stirred for 3 hours and washed several times with DMF by centrifugation.
  • Silica nanoparticles terminated with carboxyl groups (2 mg mL- 1 , 20 mL in DMF) were reacted with dopamine hydrochloride (56 mg) and the same equivalent of HOBt, HBTU, and DIEA for 3 hours.
  • Dopamine loaded silica nanoparticles were washed several times with DMF by centrifugation (15 minutes at 7,000 rpm) and redispersed in DMF.
  • 5 is a transmission electron microscopic (TEM) image of the magnetic nanoparticles synthesized in the above embodiment.
  • 5 a) shows silica nanoparticles fixed with Fe 3 O 4 NPs, b) SL MNP, c) SL MNP fixed with Fe 3 O 4 NPs, and d) DL MNP.
  • Fe 3 O 4 NPs were well fixed to the surface of the dense dopamine introduced silica nanoparticles ( ⁇ 400 Fe 3 O 4 NPs / silica core NP).
  • the catechol-iron complex between Fe 3 O 4 NPs and silica nanoparticles into which dopamine was introduced was maintained even after 1 hour sonication.
  • oleate-stabilized Fe 3 O 4 NPs and Fe 3 O 4 NPs immobilized on dopamine-incorporated silica nanoparticles were analyzed using high-resolution transmission electron microscopy (HR-TEM).
  • the distance between two adjacent planes of oleate-stabilized Fe 3 O 4 was determined to be 4.9 Angstrom, which corresponds to a typical parameter of the (111) plane of Fe 3 O 4 of inverse spinel structure.
  • Fe 3 O 4 NPs immobilized on dopamine-incorporated silica nanoparticles have a lattice constant of 2.8 Angstrom, which matches well with the (220) plane of Fe 3 O 4 .
  • TEOS was added to the silica nanoparticles into which Fe 3 O 4 NPs were introduced to form a silica shell.
  • MNPs of the SL were encapsulated in a simple dispersion manner with a silica shell having a thickness of 30 nm or less. Since the amphipathic properties can increase the affinity of the Fe 3 O 4 NPs with silica, some of the PVP remaining on the NP surface is well coated with silica.
  • the size of the SL MNPs was 300 nm or less, and the size of the majority of the immobilized Fe 3 O 4 NPs remained even after silica coating.
  • DL MNP was prepared by repeating the above method.
  • the size of DL MNPs was increased to ⁇ 400 nm, as shown in d) of FIG. 5.
  • the prepared NPs were uniform in size, and no aggregation of MNPs was detected.
  • the total number of Fe 3 O 4 NPs was about ⁇ 1,200, which was successfully filled in a single nanostructure due to the high affinity between the catechol molecule and iron oxide and the double layer structure.
  • Magnetic-silica nanostructure synthesis generates SERS signals
  • SL MNP monolayer magnetic-silica nanostructure
  • MPTS 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane
  • ammonia 2.5 uL
  • 0.2 ml of polyvinylpyrrolidone (Mw 40,000), 0.8 mg of silver nitrate, and 3 uL of octylamine were added to 2 ml of the nanoparticle solution, followed by reaction for 1 hour. After washing 5 times by centrifugation for 15 minutes at 9000 rpm and dispersed in ethanol at a concentration of 0.5 mg mL -1 .
  • FIG. 6 is a hysteresis loop showing the degree of magnetization due to an external magnetic field of a magnetic nanoparticle having a silver nanoparticle shell. Referring to FIG. 6, it can be seen that magnetic nanoparticles having silver nanoparticle shells have superparamagnetism.
  • FIG. 7 is a TEM photograph of magnetic nanoparticles with silver nanoparticle shells. Referring to Figure 7, it can be seen that the size of the magnetic nanoparticles having a silver nanoparticle shell is about 400nm.
  • SL MNPs and DL MNPs Magnetic properties of SL MNPs and DL MNPs were investigated. Each of the three types of nanoparticles (single layer magnetic nanoparticle (SL MNP), bilayer magnetic nanoparticle (DL MNP), and silica coated Fe 3 O 4 nanoparticles) was dispersed in EtOH. The nanoparticles were attracted to a magnet (SuperMag Multitube Separator, Ocean Nanotech with a magnetic force of 1.2T) and 10 ⁇ L of solution was obtained after 0, 1, 2, 3, 5, 10 and 30 minutes. The concentration of initial and obtained nanoparticles was analyzed using Nanosight LM10. The aggregation rate was obtained by subtracting the measured concentration of MNP from the initial concentration.
  • SL MNP single layer magnetic nanoparticle
  • DL MNP bilayer magnetic nanoparticle
  • silica coated Fe 3 O 4 nanoparticles silica coated Fe 3 O 4 nanoparticles
  • 8 shows the magnetic properties of the synthesized magnetic nanoparticles.
  • 8 a) is the integration information for DL MNP (red), SL MNP (blue), and silica coated Fe 3 O 4 NP (black), and b) is the hysteresis loop of the DL MNPs.
  • DL MNPs were collected more efficiently than silica coated Fe 3 O 4 NPs or SL MNPs.
  • SL MNPs showed better cohesion than silica coated Fe 3 O 4 NPs, none of these nanoparticles showed a full integration rate and resulted in saturated plateaus.
  • Silica surface charges of the prepared MNPs may cause repulsion between charges resulting in incomplete integration of nanoparticles.
  • all DL MNPs quantitatively integrated for 30 minutes show a large number of Fe 3 O 4 NPs to overcome the repulsive action of silica surface charge.
  • field-dependent magnetism of DL MNPs at 300 K exhibits superparamagnetic characteristics and saturation magnetization of 5.0 emu / g. Although the magnetization value per weight of 18 nm MNPs was less than 60.0 emu / g, each unit DL MNPs had a 500 times stronger magnetism than bare 18 nm MNPs.
  • SL MNPs were stored in three buffers of pH 4, 7, and 10 for 7 days as follows.
  • SL MNPs 0.25 mg were added to each of three buffers; pH 4.0 potassium hydrogen phthalate buffer (50 mM, 1 mL), pH 7.0 potassium hydrogen phosphate buffer (50 mM, 1 mL), pH 10 sodium borate buffer (50 mM, 1 mL). After 7 days of storage at 25 ° C., three samples were collected for analysis.
  • SL MNPs were added to the cell culture medium (10% FBS, 10 U mL -1 of penicillin, 10 ⁇ g mL -1 of streptomycin), and 7 days at 4 ° C. Stored.
  • SL MNPs retained their original structure as well as dispersing properties, and Fe 3 O 4 NPs were not leached under acidic (pH 4) and neutral (pH 7) conditions.
  • Fe 3 O 4 NP leaching was not found under the basic buffer condition (pH 10)
  • the silica layer thickness of the SL MNPs decreased. Since most of the silica-based materials have been used stably at pH 6-8, the MNPs of the present invention are suitable for general biological applications.
  • streptavidin was isolated by the following method.
  • Biotin-bound DL MNP and bare DL MNP were aged together with FITC-streptavidin in microtubes. Biotin was easily bound to nanoparticles into which amine groups were introduced by amide coupling. The magnet was placed close to one side of both sample tubes for 30 minutes. The magnetic nanoparticles captured by the magnet were then separated and then resuspended in fresh PBS buffer. Resuspension samples were analyzed by confocal-optical microscope.
  • 9 shows the results of separating FITC-streptavidin using biotin-bound DL MNP and DL MNP in its bare state.
  • 9 a) and b) are fluorescence and optical microscopy images of biotin-bound DL MNP after aging with FITC-streptavidin and magnet-induced separation, respectively.
  • 9 c) and d) are fluorescence and optical microscope images of DL MNP in bare state after maturing with FITC-streptavidin and magnet-induced separation, respectively.
  • the nanoparticle solution was dropped on the slide glass by 20 uL, and a magnet was placed under the slide glass to aggregate the nanoparticles into one point. SERS signals were measured from nanoparticles aggregated at one point after 30 minutes.
  • FIG. 10 is a graph showing the SERS signal measured from the nanoparticles before aggregation
  • Figure 11 is a graph comparing the SERS signal before and after aggregation
  • Figure 12 shows the SERS signal at the time of nanoparticle aggregation according to the 4-FBT treatment concentration. 10 to 12, it can be seen that the core-shell silica magnetic nanoparticles into which silver nanoparticles are introduced may generate SERS signals and may generate stronger SERS signals by agglomerating nanoparticles through an external magnetic field. Can be.

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Abstract

(a) 중심 나노입자에 관능기를 도입하여 표면개질하는 단계; (b) 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기 함유 화합물을 처리하여 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기를 도입하는 단계; (c) 상기 중심 나노입자의 표면에 초상자성 나노입자들을 도입함으로써 상기 중심 나노입자의 주위에 상기 초상자성 나노입자들의 층을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 초상자성 나노입자들의 층을 둘러싸도록 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법이 제공된다.

Description

코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법
본 명세서에 개시된 기술은 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이오 물질 및 세포 분리 기술, 바이오어세이 등에 응용하기 적합한 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
자성 나노입자(MNP)는 생명공학, 특히 생체 분자의 분리 분야에서 주목받고 있다. 다양한 MNP 중에서 초상자성 산화철 나노입자(Fe3O4 NP) 상온에서 잔여 자화에 의해 응집되지 않기 때문에 전도유망한 소재이다. 또한 Fe3O4 NP 비독성이며 합성 방법이 잘 알려져 있다. 그러나 맨 상태의 Fe3O4 NP 자체는 몇 가지 문제점 때문에 생체 분자 분리에 사용되기에는 어렵다. 첫째, 단일 Fe3O4 NP는 매우 느린 집적(accumulation)과 자석에 의한 낮은 분리 수율을 나타낸다. 둘째, 금속 원자로 구성된 Fe3O4 NP는 산화 물질에 매우 취약하여, NP의 자성 및 분산 특성이 저하될 수 있다. 또한 나노입자의 체적 대비 높은 표면적과 반데르발스 인력과 같은 여러 가지 요인이 일반적인 나노 시스템에서의 응집을 유도 할 수 있다.
기존의 생체 물질 분리를 위한 자성 구조체는 일반적으로 단일 자성나노입자를 이용함으로써 자성을 부여하지만, 이 경우 자성이 매우 약하고 분리를 위한 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 한편 자성이 강한 나노구조체도 개발되었지만 수백 나노미터 이상으로 큰 크기를 가지는 자성나노입자를 사용할 경우 입자가 초상자성을 잃어버리고 매우 쉽게 응집되어 그 기능을 잃어버릴 가능성이 크다.
그 밖에도 다양한 형태의 자성 나노구조체가 존재하지만 입자들이 응집된 형태로 존재하여 분리의 효율이 떨어지거나 재현성 부족, 크기의 불균일성 등의 문제가 있어 신규한 자성 나노구조체의 개발이 요구된다.
[선행문헌]
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2. Di Corato R, Bigall NC, Ragusa A, Dorfs D, Genovese A, Marotta R, et al. (2011) Multifunctional Nanobeads Based on Quantum Dots and Magnetic Nanoparticles: Synthesis and Cancer Cell Targeting and Sorting. Acs Nano 5: 1109-1121.
3. Hui C, Shen CM, Tian JF, Bao LH, Ding H, Li C, et al. (2011) Core-shell Fe3O4@SiO2 nanoparticles synthesized with well-dispersed hydrophilic Fe3O4 seeds. Nanoscale 3: 701-705.
본 발명의 일 측면에 의하면, (a) 중심 나노입자에 관능기를 도입하여 표면개질하는 단계; (b) 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기 함유 화합물을 처리하여 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기를 도입하는 단계; (c) 상기 중심 나노입자의 표면에 초상자성 나노입자들을 도입함으로써 상기 중심 나노입자 주위에 상기 초상자성 나노입자들의 층을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 초상자성 나노입자들의 층을 둘러싸도록 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 중심 나노입자는 실리카 나노입자일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 일 말단은 카테콜 관능기를 함유하고 타 말단은 상기 중심 나노입자에 도입된 관능기와 결합하기 위한 별도의 관능기를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016007807-appb-I000001
상기 식에서, L은 단일 결합 또는 2가의 유기기이고, X는 아민기, 카복실기, 하이드록실기, 티올기, 에폭시기, 아지드기, 알킨기 중에서 선택되는 관능기이다. 상기 2가의 유기기는 탄소수 1~6의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제조방법은 상기 (d) 단계 이후, (e) 상기 실리카 쉘을 상기 표면 개질하는 단계; 및 (f) 상기 (b)~(d) 단계의 방식을 반복하여 다층 구조를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제조방법은 상기 (d) 단계 이후, (g) 상기 실리카 쉘에 라만 표지화합물이 코팅된 금속 나노입자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (g) 단계의 금속 나노입자가 금 나노입자 또는 은 나노입자일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 링커가 도입된 중심 나노입자; 상기 링커에 의해 하나의 상기 중심 나노입자를 둘러싸도록 코팅된 복수의 초상자성 나노입자들; 및 상기 초상자성 나노입자들을 둘러싸도록 형성된 실리카 쉘을 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 링커가 카테콜 관능기 함유 화합물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 코어-쉘 구조의 자성 나노입자는 상기 실리카 쉘을 둘러싸도록 추가 층을 형성하는 복수의 초상자성 나노입자들; 및 상기 추가 층의 초상자성 나노입자들을 둘러싸는 추가 실리카 쉘을 더 포함함으로써 멀티 쉘을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 코어-쉘 구조의 자성 나노입자는 상기 실리카 쉘을 둘러싸도록 도입된 금속 나노입자들; 및 상기 금속 나노입자에 코팅된 라만 표지화합물을 포함함으로써 증강된 라만활성을 가질 수 있다.
도 1은 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법의 일 구현예를 나타낸 공정순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 단일층 자성 나노입자(SL MNP)와 이중층 자성 나노입자(DL MNP)의 제조 과정을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 SERS 신호를 발생시키는 자성 나노입자(M Ag NS)의 제조 과정을 나타낸다.
도 4는 나노입자의 응집 후 SERS 신호를 측정하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 5는 위 실시예에서 합성한 자성 나노입자의 투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM) 이미지이다.
도 6은 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자의 초상자성을 확인하기 위한 이력곡선이다.
도 7은 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자의 TEM 사진이다.
도 8은 합성된 자성 나노입자의 자기적 특성을 나타낸다.
도 9는 비오틴 결합된 DL MNP와 맨 상태의 DL MNP를 사용하여 FITC-streptavidin을 분리한 결과이다.
도 10은 응집 전 나노입자로부터 측정한 SERS 신호를 나타낸 그래프이다.
도 11은 응집 전후의 SERS 신호를 비교한 그래프이다.
도 12는 4-FBT 처리 농도에 따른 나노입자 응집시의 SERS 신호를 나타낸다.
이하 본 발명의 다양한 구현예들에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법이 제공된다. 도 1은 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법의 일 구현예를 나타낸 공정순서도이다. 도 1을 참조하면, 단계 S1에서 중심 나노입자에 관능기를 도입하여 표면개질한다. 상기 중심 나노입자는 산화물 나노입자 또는 고분자 나노입자일 수 있다. 상기 중심 나노입자의 크기는 50 내지 1,000nm, 바람직하게는 100 내지 1,000 nm, 더욱 바람직하게는 100 내지 500nm일 수 있으며, 상기 중심 나노입자의 크기가 상기 범위 미만에서는 표면적이 작아 많은 초상자성 나노입자들의 도입이 어려울 수 있고, 상기 범위 초과에서는 무게 당 표면적이 작아져 중심 나노입자의 자성이 약화될 수 있다. 상기 산화물 나노입자는 실리카, 티타니아, 크로미아, 이트리아 등일 수 있으며, 이중 생체적합성 및 합성공정 면에서 실리카 입자가 바람직하다. 예를 들어 상기 실리카 나노입자는 TEOS를 이용하여 스토버 법 등 공지된 합성법으로 제조될 수 있다. 또한 상기 고분자 나노입자 역시 에멀젼 법 등 공지된 합성법으로 제조될 수 있으며, 스티렌계 고분자 또는 아크릴계 고분자 등 다양한 고분자가 비제한적으로 사용될 수 있다.
상기 관능기는 카복실기, 아민기, 하이드시기, 티올기, 에폭시기, 아크릴기, 메타크릴기, 알킨기, 또는 아지드기 등일 수 있다. 예를 들어 카복실기로 개질된 실리카 나노입자(SiO2-COOH NP)는 APTS 및 숙신산 무수물을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 관능기의 도입에 의해 추후 초상자성 나노입자들을 용이하게 도입하기 위한 링커 역할을 하는 카테콜 관능기 함유 화합물을 상기 중심 나노입자에 결합시킬 수 있다.
단계 S2에서 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기 함유 화합물을 처리하여 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기를 도입한다. 상술한 바와 같이 상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 상기 중심 나노입자와 초상자성 나노입자들 사이에 결합을 용이하게 하는 역할을 한다. 이를 위해 상기 카테콜 관능기 함유 화합물의 일 말단은 카테콜 관능기를 함유하고 타 말단은 상기 중심 나노입자에 도입된 관능기와 결합하기 위한 별도의 관능기를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 별도의 관능기는 아민기, 카복실기, 히드록시기, 티올기, 알킨기, 또는 아지드기 등에서 선택될 수 있다.
예를 들어 상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016007807-appb-I000002
상기 식에서, L은 단일 결합 또는 2가의 유기기이고, X는 아민기, 카복실기, 히드록시기, 티올기, 알킨기, 또는 아지드기 중에서 선택되는 관능기이다. 상기 2가의 유기기는 탄소수 1~6의 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌일 수 있다. 상기 2가의 유기기는 사슬 내에 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수도 있다. 상기 2가의 유기기는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 상기 치환기는 탄소수 1~3의 알킬기, 탄소수 1~3의 알콕시기, 하이드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기 등이 될 수 있다.
상기 카테콜 관능기 함유 화합물의 바람직한 예는 카페익산(
Figure PCTKR2016007807-appb-I000003
) 또는 도파민(
Figure PCTKR2016007807-appb-I000004
)일 수 있다. 예를 들어 아민 개질된 중심 나노입자에 카페익산을 반응시키거나, 카복실기로 개질된 중심 나노입자에 도파민 염산염을 반응시켜 아마이드 결합을 통해 카테콜 관능기를 상기 중심 나노입자에 도입할 수 있다. 카테콜 관능기는 추후 초상자성 나노입자를 상기 중심 나노입자와 결합하는 데에 도움을 줄 수 있다.
카테콜 관능기가 상기 중심 나노입자에 도입되면, 카테콜에 존재하는 두 개의 히드록시기와 표면 철 원자 사이의 강한 친화력에 의하여 상기 초상자성 나노입자가 상기 중심 나노입자에 용이하게 고정될 수 있다. 좀더 자세하게는 산화철 나노입자의 표면 부분에 위치한 철 원자의 경우 배위결합을 할 수 있는 부위가 비어있는데, 카테콜에 존재하는 두 개의 히드록시기가 이 부위에 배위결합을 형성할 경우 안정한 정팔면체 구조의 결합을 유지할 수 있게되어 결합 형성이 촉진된다.
단계 S3에서 상기 중심 나노입자의 표면에 초상자성 나노입자들을 도입함으로써 상기 중심 나노입자 주위에 초상자성 나노입자들의 층을 형성한다. 상기 초상자성 나노입자는 예를 들어 Fe3O4, 철-백금 합금, 코발트, 니켈, 니오븀 등의 재질일 수 있으며, 바람직하게는 생체 적합성 면에서 Fe3O4이다.
상기 초상자성 나노입자의 크기는 1 내지 50nm, 바람직하게는 3 내지 40nm, 더욱 바람직하게는 4 내지 30nm, 더더욱 바람직하게는 5 내지 20nm일 수 있으며, 상기 초상자성 나노입자의 크기가 상기 범위 미만에서는 중심 나노입자에 코팅이 용이하지 않고, 상기 범위 초과에서는 초상자성을 잃을 염려가 있다.
상기 중심 나노입자 하나 당 고정되는 상기 초상자성 나노입자들의 개수는 200 내지 20,000개일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 초상자성 나노입자의 원활한 도입을 위해 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 안정화제로 코팅함으로써, 입자에 양친매성을 부여하여 추후 실리카 코팅이 용이하게 할 수 있다.
단계 S4에서 상기 초상자성 나노입자들의 층을 둘러싸도록 실리카 쉘을 형성한다.
일 구현예에서, 이후 상술한 단계 S2와 같은 식으로 상기 실리카 쉘을 표면 개질한 후에 단계 S3~S4와 같이 초상자성 나노입자들의 층을 형성하고 실리카 쉘을 형성하는 단계들을 반복함으로써, 2층 이상의 다층 구조의 코어/멀티 쉘 구조의 실리카 나노구체를 제조할 수 있다. 쉘의 층수가 증가할수록 입자의 표면적이 커지므로 하나의 입자에 적재할 수 있는 초상자성 나노입자들의 개수가 대폭 증가될 수 있다.
이렇게 얻은 코어/멀티 쉘 구조의 실리카 나노구체는 자성이 더욱 강화되어 생물학적 응용분야에서 생체 물질 분리시 용이하게 사용될 수 있다.
한편 다른 구현예에서, 상기 단계 S4 이후 상기 실리카 쉘에 라만 표지화합물이 코팅된 금속 나노입자를 도입할 수 있다. 필요에 따라 다시 실리카 쉘로 전체 입자를 코팅할 수 있다. 이렇게 얻어진 입자는 표면 증강 라만 산란(SERS) 나노입자로 사용될 수 있다.
표면 증강 라만 산란(SERS) 분석용도의 라만 표지화합물이 코팅된 금속 나노입자의 제조방법과 관련하여, 한국공개특허 10-2007-0060545, 한국공개특허 10-2008-0078969 등을 참고할 수 있다.
상기 금속 나노입자는 금 나노입자 또는 은 나노입자일 수 있다. 상기 금속 나노입자 간에 핫스팟 또는 나노정션이라는 접점이 존재하며, 여기서 증강된 라만 산란 현상이 더욱 강하게 발생할 수 있다. 상기 금속 나노입자는 앞서 제조한 코어-쉘 자성 나노입자의 실리카 쉘을 머켑토실란과 같은 티올 화합물로 처리한 후 금 전구체나 은 전구체를 환원시켜 코어-쉘 자성 나노입자 상에 환원시키는 방식으로 상기 코어-쉘 자성 나노입자에 도입할 수 있다.
이어서, 라만 표지화합물로 상기 코어-쉘 자성 나노입자를 처리한다. 상기 라만 표지화합물은 간단한 구조를 가지면서 뚜렷한 지문 영역에서 라만 스펙트럼을 보여주는 물질이라면 특별히 제한되지 않으며, 말단에 티올기, 아민기, 시아나이드기, 이소시아나이드기, 이소티오시아나이드기, 다이설파이드기 또는 아자이드기가 있는 화학물질은 금속 나노입자와 강한 친화력이 있어 본 발명에 사용될 수 있다. 몇 가지 예를 들면, 2-메틸벤젠티올, 4-메틸벤젠티올, 3,4-디메틸벤젠티올, 티오페놀, 4-머켑토톨루엔, 4-플루오로벤젠티올 등이 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 단일층 자성 나노입자(SL MNP)와 이중층 자성 나노입자(DL MNP)의 제조 과정을 나타낸다.
도 2를 참조하면, Fe3O4 나노입자는 카테콜로 수식된 실리카 나노입자에 고정되고, 이어 실리카-쉘 캡슐화에 의해 SL MNP가 제조된다. DL MNP는 카테콜-수식 SL MNP에 전술한 방법을 반복함으로써 제조된다.
도 2를 참조하면, DL MNP는 코어-쉘 구조를 가지는데, 다수의 Fe3O4 NP가 적층된 이중층 구조로 실리카 코어의 쉘 부분에 배치되어 있다. 실리카 나노입자는 취급의 용이성 및 재현성을 위해 코어 주형으로 사용될 수 있다. 강한 자기 특성을 얻기 위해, Fe3O4 NP가 고정된 이중층은 실리카 나노입자 상에 MNP의 부하 수준을 높이는 구조로 설계될 수 있다. 그리고 DL MNP의 표면은 최종적으로 생체 적합성이 뛰어나고 손 쉽게 기능화가 가능한 실리카 쉘 층으로 덮여진다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 SERS 신호를 발생시키는 자성 나노입자(M Ag NS)의 제조 과정을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 단일층 자성-실리카 나노입자의 표면에 Ag 이온을 환원시켜 SERS 특성을 가지는 Ag 나노구조체를 합성할 수 있다. 단일층 자성-실리카 나노입자를 합성한 후 Mercaptopropyltrimethoxysilane과 같은 티올 화합물을 처리하여 실리카 표면에 티올기를 도입한 후 수백개의 Ag 나노입자를 실리카 나노입자의 표면에서 환원시키면 Ag 나노입자로 되어있는 층이 성장하면서 Ag 껍질이 뒤덮인 구조를 이루게 된다.
이 나노구조체에 SERS 표지자들 중 하나인 4-FBT(4-Fluorobenzenethiol)를 처리할 경우 SERS 신호를 얻을 수 있다. 또한 이 나노구조체가 자성을 가지고 있다는 특성을 이용하여 자성을 이용하여 나노구조체를 한 곳으로 집합시키면, 입자 농도 증가효과를 포함한 훨씬 더 강한 SERS 신호를 얻을 수 있다. 외부자기장을 이용하여 나노구조체를 응집시키면 나노입자들 간의 거리가 가까워지면서 나노입자의 표면 플라스몬 간의 공명 현상이 생긴다. 이로인해 SERS 신호가 크게 증폭될 수 있는 위치를 hot spot이라 부르며, 여기에 SERS 표지자가 위치하게 되면 매우 강한 SERS 신호를 얻을 수 있다.
도 4는 나노입자의 응집 후 SERS 신호를 측정하는 과정을 나타낸 개략도이다.
상술한 바에 따르면, 본 발명의 코어-쉘 구조의 자성 나노입자는 중심 나노입자의 표면에 수백~수천 개(예를 들어 약 1200개)의 초상자성 나노입자를 붙인 형태로서 다층 쉘 구조를 가질 수 있으며, 이로인해 나노구조체가 강한 자성을 가질 수 있다. 산화철 나노입자와 같은 초상자성 나노입자가 실리카 등의 중심 나노입자에 쉘로서 고정되어 있으므로 산화철 나노입자 간의 응집 현상이 일어나지 않아서, 입자 고유의 초상자성을 잃지 않으면서 수백 ~ 수천 개의 산화철 나노입자가 하나의 나노 구조체에 고밀도로 탑재되었기 때문에 기존의 단일 산화철 나노입자와 비교하여 입자당 자성이 수백 배 이상 강하다. 또한 친수성이면서 화학반응성이 매우 낮고, 다양하게 표면개질을 할 수 있는 실리카가 나노 구조체의 표면을 덮고 있기 때문에 바이오 물질 및 세포 분리 기술에 응용하기 매우 적합하다. 또한 SERS 신호를 증강시키는 금속 입자 및 표지화합물을 도입할 경우 자성 나노입자의 존재로 인해 본 발명의 코어-쉘 자성 나노입자는 매우 강한 SERS 신호를 가질 수 있다.
이하 본 발명을 다양한 실시예를 통해 보다 상세히 설명하고자 하나 본 발명의 기술적 사상이 이하의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 합성
시약의 준비
산화철 나노입자(18nm)는 Ocean Nanotech에서 구입하였다. Polyvinylpyrrolidone (PVP, 분자량 10,000), Tetraethylorthosilicate (TEOS), 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTS), 숙신산 무수물, 도파민 염산염은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 디에틸에테르, Dimethylformamide (DMF), 디클로로메탄 (DCM), 에탄올, 이소프로판올 (IPA), 암모니아수는 대정화금에서 구입하였다. Diisopropylethylamine (DIEA)는 Alfa Aesar에서 구입하였다. 무수에탄올은 Carlo Erba에서 구입하였다. 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)와 Hydroxybenzotriazole (HOBt)는 비드테크에서 구입하였다.
도파민 결합된 실리카 나노입자 의 합성
TEOS (1.6 mL) 및 수산화암모늄 (4 ㎖)을 무수 EtOH (40 ㎖)에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 밤새 교반하고, 15 분 동안 7,000 rpm에서 원심 분리하고, 생성된 실리카 나노입자(200 nm)를 EtOH로 반복해서 세척하였다. 실리카 나노입자 (2 mg mL-1, 20 mL in EtOH)에 APTS (100 μL) 및 암모니아수 (100 μL)를 18시간 동안 처리하여 표면에 아민 그룹을 도입하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 7,000 rpm에서 원심 분리하고, 생성된 실리카 나노입자는 EtOH로 여러 번 세척하고, DMF에 재분산시켰다. 아민기가 도입된실리카 나노입자(2 mg mL-1, 20 mL in DMF)를 숙신산무수물(succinic anhydride, 40 mg) 및 DIEA(40 μL)과 함께 반응시켰다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하고, 원심 분리에 의해 DMF로 수회 세척하였다. 카복실기로 종결된 실리카 나노입자(2 mg mL-1, 20 mL in DMF)를 도파민 염산염(dopamine hydrochloride, 56 mg) 및 동일한 당량의 HOBt, HBTU, 및 DIEA와 3시간 동안 반응시켰다. 도파민이 탑재된 실리카 나노입자는 원심 분리에 의해 DMF로 수회 세척하고 (7,000 rpm으로 15 분간) DMF에 재분산시켰다.
Fe 3 O 4 나노입자의 PVP에 의한 안정화
올레이트 안정화된(Oleate-stabilized) Fe3O4 나노입자(25 mg mL-1 in 100 μL chloroform)를 DMF/DCM 용매에 붓고(1:1 v/v, 5 mL), PVP (60 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 18 시간 동안 100℃로 가열하고 실온으로 냉각하고, 디에틸에테르 용액 10 ㎖에 부었다. 상기 용액을 5 분 동안 4,500 rpm에서 원심 분리하고, 얻어진 침전물을 EtOH에 재분산시켜서 올레이트 리간드를 PVP로 교환하여 Fe3O4 나노입자를 안정화시켰다.
단일층 자성 나노입자 및 이중층 자성 나노입자의 합성
도파민이 도입된 실리카 나노입자(0.2 mg mL-1, DMF, 5 mL in DMF)를 PVP 로 안정화된 Fe3O4 나노입자 용액(0.14 mg mL-1, 5 mL in EtOH)에 붓고, 1 시간 동안 초음파 분산 처리하였다. 반응 혼합물을 10 분 동안 7,000 rpm에서 원심 분리하고, 3 회 세척하고 이소프로판올(IPA)에 분산시켰다. TEOS (50 μL) 및 암모니아수(125 μL)를 Fe3O4 나노입자 고정된 실리카 나노입자 수용액 (0.2 mg mL-1, 5 ㎖ in IPA)에 첨가하고 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 원심분리하고 수회 세정 후 EtOH에 분산시켰다. 동일한 과정을 반복함으로써 단일층 자성 나노입자로부터 이중층 자성 나노입자를 합성하였다.
도 5는 위 실시예에서 합성한 자성 나노입자의 투과전자현미경(Transmission electron microscopic, TEM) 이미지이다. 도 5의 a)는 Fe3O4 NP들이 고정된 실리카 나노입자, b)는 SL MNP, c)는 Fe3O4 NP들이 고정된 SL MNP, 및 d)는 DL MNP의 이미지를 나타낸다.
도 5의 a)에 도시된 바와 같이 Fe3O4 NP들은 조밀하게 도파민이 도입된 실리카 나노입자의 표면에 잘 고정되었다 (~400 Fe3O4 NPs/silica core NP). Fe3O4 NP들과 도파민이 도입된 실리카 나노입자의 사이에 카테콜-철 복합체는 1시간 초음파처리 후에도 그 구조를 유지하였다. Fe3O4 NP들이 리간드 교환 후에도 안정된 격자 구조를 이루고 있는지 확인하기 위해, oleate-stabilized Fe3O4 NP들과 dopamine 이 도입된 실리카 나노입자에 고정된 Fe3O4 NP들을 각각 고분해능 투과 전자 현미경 (HR-TEM)을 사용하여 분석하였다. Oleate-stabilized Fe3O4들의 인접한 두 평면 사이의 거리는 4.9 Angstrom으로 측정되었고, 이는 역 스피넬 구조의 Fe3O4의 (111) 면의 전형적인 파라미터에 대응한다. Dopamine 이 도입된 실리카 나노입자에 고정된 Fe3O4 NP들은 2.8 Angstrom의 격자정수를 갖고 이것은 Fe3O4의 (220) 면과 잘 매치된다. 이러한 결과는 Fe3O4 NP가 리간드 교환 후에도 그 구조를 유지하고 있음을 증명한다.
실리카 쉘을 형성하기 위해 Fe3O4 NP들이 도입된 실리카 나노입자에 TEOS가 첨가되었다. 도 5의 b)에 도시 된 바와 같이 SL의 MNP들은 30 nm 이하의 두께로 실리카 쉘이 있는 상태에서 단순 분산 방식으로 캡슐화 되었다. 양친매성 특성이 Fe3O4 NP들과 실리카의 친화도를 증가시킬 수 있기 때문에, NP 표면에 남아있는 PVP 일부가 실리카 코팅이 잘 되도록 한다. SL MNP들의 크기는 300 nm 이하이고, 실리카 코팅 후에도 고정화된 대다수의 Fe3O4 NP들의 크기도 동일한 상태로 남았다. DL MNP는 상기 방법을 반복하여 제조하였다. 도 5의 c)에 도시 된 바와 같이, 결과적으로는 Fe3O4 NP 약 800개 정도가 NP에 상에 추가적으로 적재되었다. 이는 도파민 결합된 실리카 나노입자보다 표면적이 두 배가 커진 결과로 SL MNP들에 비해 Fe3O4 NP의 양이 두 배 정도 적재되었다.
추가적으로 Fe3O4 NP 층과 실리카 쉘(~30 nm)을 도입한 결과, 도 5의 d)에 나타낸 바와 같이 DL MNP들의 크기가 ~400 nm로 증가되었다. 제조된 NP들은 크기가 균일하였고, MNP들의 응집은 검출되지 않았다. 또한 Fe3O4 NP 총 갯수는 약 ~1,200 개로 카테콜 분자와 산화철과의 높은 친화도와 이중 층 구조로 인해 성공적으로 단일 나노 구조물 내에 채워졌다.
SERS 신호를 발생시키는 자성-실리카 나노구조체 합성
단일층 자성-실리카 나노구조체(SL MNP) 1 mg을 무수에탄올 1 ml에 분산시킨 후 물 10 uL, 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS) 10 uL, 암모니아수 2.5 uL를 투입하고 18시간 동안 반응시켰다. 이후 7000rpm으로 10분간 원심분리하여 5회 세척하고 0.25 mg mL-1의 농도로 에틸렌글리콜에 분산시켰다.
위의 나노입자 용액 2ml에 폴리비닐피롤리돈(Mw 40,000) 0.2 mg, 질산은 0.8 mg, 옥틸아민 3 uL를 투입한 후 1시간동안 반응시켰다. 이후 9000rpm으로 15분간 원심분리하여 5회 세척하고 0.5 mg mL-1의 농도로 에탄올에 분산시켰다.
도 6은 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자의 외부 자기장으로 인한 자화 정도를 나타내는 히스테리시스 곡선(Hysteresis loop)이다. 도 6을 참조하면, 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자는 초상자성을 가진다는 것을 알 수 있다.
도 7은 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자의 TEM 사진이다. 도 7을 참조하면, 은 나노입자 쉘을 갖는 자성 나노입자의 크기는 400nm 정도 된다는 것을 알 수 있다.
2. 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 특성평가
외부 자기장 하에서의 나노입자 집적율 분석
SL MNP들과 DL MNP들의 자기 특성을 조사 하였다. 세 가지 유형의 나노입자들 (단일층 자성 나노입자(SL MNP), 이중층 자성 나노입자(DL MNP), 및 실리카 코팅된 Fe3O4 나노입자) 각각을 EtOH에 분산시켰다. 상기 나노입자들을 자석(1.2T의 자력을 갖는 SuperMag Multitube Separator, Ocean Nanotech)으로 끌어당기고, 0, 1, 2, 3, 5, 10 및 30 분이 지난 후에 10 μL씩의 용액을 수득하였다. 초기 및 수득한 나노입자들의 농도를 Nanosight LM10를 사용하여 분석하였다. 집적 속도는 초기 농도에서 MNP의 측정된 농도를 감산함으로써 얻었다.
도 8은 합성된 자성 나노입자의 자기적 특성을 나타낸다. 도 8의 a)는 DL MNP (빨강), SL MNP (파랑), 및 실리카 코팅된 Fe3O4 NP (검정)에 대한 집적 정보이고, b)는 DL MNP들의 히스테리시스 곡선(Hysteresis loop)이다.
도 8의 a)에 도시된 바와 같이, DL MNP들은 실리카 코팅된 Fe3O4 NP 또는 SL MNP들 보다 더 효율적으로 수집되었다. SL MNP들이 실리카 코팅된 Fe3O4 NP보다 더 좋은 응집성을 보였지만, 이들 나노입자들 모두 완전한 집적율을 보여주지 못하고 포화된 정체기(plateau)를 만들었다. 제조된 MNP들의 실리카 표면 전하는 전하들 사이의 반발을 일으켜서 나노입자들의 불완전한 집적을 가져올 수 있다. 그러나 30분 동안 정량 집적된 모든 DL MNP들은 실리카 표면 전하의 반발 작용을 극복하도록 많은 수의 Fe3O4 NP들을 포함한다는 것을 나타낸다.
도 8의 b)를 참조하면, 300 K에서 DL MNP들의 장-의존 자성(field-dependent magnetism)은 초상자성 특성을 나타내며, 5.0 emu/g의 포화 자화를 나타내었다. 18 nm MNP들의 중량 당 자화 값이 60.0 emu/g 미만일지라도, 각 단위 DL MNP들은 맨 상태의 18 nm MNP들 보다 500배 강한 자성을 가졌다.
제조된 자성입자의 안정성 시험
준비된 MNP들의 안정성을 확인하기 위해, 아래와 같은 방식으로 7일 동안 SL MNP들을 pH 4, 7, 10인 세 종류의 완충액에 저장하였다.
0.25 mg의 SL MNP 들을 세 종류의 완충액에 각각 첨가하였다; pH 4.0 potassium hydrogen phthalate buffer (50 mM, 1 mL), pH 7.0 potassium hydrogen phosphate buffer (50 mM, 1 mL), pH 10 sodium borate buffer (50 mM, 1 mL). 25℃에서 7일 동안 저장 한 후, 3 개의 시료를 분석을 위해 수집하였다.
세포 배양 배지에서의 안정성 분석을 위해, 0.25 mg의 SL MNP들을 세포 배양 배지에 첨가하였다(10% FBS, 10 U mL-1 of penicillin, 10 μg mL-1 of streptomycin), 그리고 4℃에서 7 일간 저장하였다.
SL MNP들은 원래의 구조뿐만 아니라 분산 특성을 그대로 유지하였고, 산성(pH 4) 및 중성(pH 7) 조건에서 Fe3O4 NP는 침출되지 않았다. 한편, 기본 버퍼 조건(pH 10) 하에서는 Fe3O4 NP 침출이 발견되지 않았음에도 불구하고, SL MNP들의 실리카 층 두께가 저하되었다. 실리카계 재료의 대부분은 pH 6~8에서 안정적으로 사용되어왔기 때문에, 본 발명의 MNP들은 일반적인 생체 적용에 적합하다.
생체 분자 분리 시험
자석으로 단백질을 분리하기 위해 코어-쉘 구조의 자성 나노입자가 사용될 수 있다는 것을 입증하기 위해 아래의 방법으로 스트렙타비딘(streptavidin)을 분리하였다.
비오틴 결합된 DL MNP와 맨 상태의 DL MNP를 마이크로 튜브에서 FITC-streptavidin과 함께 숙성시켰다. 비오틴은 아마이드 커플링에 의해 아민기가 도입된 나노입자에 쉽게 결합되었다. 자석을 30분 동안 두 샘플 튜브의 한 면에 가까이 배치하였다. 이후, 자석에 의해 포획된 자성 나노입자들을 분리한 후, 신선한 PBS 완충액에서 재현탁하였다. 재현탁 샘플은 공초점-광학 현미경(confocal-optical microscope)으로 분석하였다.
도 9는 비오틴 결합된 DL MNP와 맨 상태의 DL MNP를 사용하여 FITC-streptavidin을 분리한 결과이다. 도 9의 a) 및 b)는 각각 FITC-streptavidin으로 숙성하고 자석-유도 분리한 이후의 비오틴 결합된 DL MNP의 형광 및 광학현미경 이미지이다. 도 9의 c) 및 d)는 각각 각각 FITC-streptavidin으로 숙성하고 자석-유도 분리한 이후의 맨 상태의 DL MNP의 형광 및 광학현미경 이미지이다.
광학 현미경 하에서 관찰된 비오틴이 결합된 모든 DL MNP들은 FITC-streptavidin으로부터 유래된 초록 형광을 비추었으며, 이는 비오틴 결합된 DL MNP들을 사용하여 스트렙타비딘이 깨끗이 분리되었음을 의미한다.
한편 도 9의 c) 및 d)에 도시된 바와 같이, 맨 상태의 DL MNP에서는 FITC-streptavidin의 녹색 형광이 발견되지 않았다. 또한 CCK-8 분석 결과에 기초하여 봤을 때, 본 발명의 MNP는 세포 배양 배지에서 7일간 그들의 유체역학적 크기를 유지하고, 현저한 세포상해활성을 보이지 않았다. 이러한 결과는 생체 분자 분리에 대한 DL MNP의 뛰어난 성능을 명확하게 나타낸다.
SERS 신호를 발생시키는 자성-실리카 나노구조체로부터 SERS 신호 측정
상술한 방법으로 제조된 은 나노입자가 도입된 코어-쉘 실리카 자성 나노입자가 0.5 mg mL-1로 에탄올에 분산되어있는 용액에 4-Fluorobenzenethiol (4-FBT) 2 ul를 투입하고 1시간 반응시켰다. 이 경우 용액 내의 4-FBT의 농도는 10mM이 된다. 7000rpm으로 10분간 원심분리하여 3회 세척하고 0.5 mg mL-1로 물에 분산시킨 후 SERS 신호를 측정하였다.
위의 나노입자 용액을 슬라이드글라스 위에 20 uL 떨어뜨린 후 슬라이드 글라스 아래에는 자석을 위치시켜 나노입자를 한 점으로 응집시켰다. 30분 후 한 점에 응집한 나노입자로부터 SERS 신호를 측정하였다.
도 10은 응집 전 나노입자로부터 측정한 SERS 신호를 나타낸 그래프이고, 도 11은 응집 전후의 SERS 신호를 비교한 그래프이다. 또한 도 12는 4-FBT 처리 농도에 따른 나노입자 응집시의 SERS 신호를 나타낸다. 도 10 내지 12를 참조하면, 은 나노입자가 도입된 코어-쉘 실리카 자성 나노입자는 SERS 신호를 발생시킬 수 있으며, 외부 자기장을 통해 나노입자를 응집시킴으로써 더욱 강한 SERS 신호를 발생 시킬 수 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 중심 나노입자에 관능기를 도입하여 표면개질하는 단계;
    (b) 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기 함유 화합물을 처리하여 상기 중심 나노입자에 카테콜 관능기를 도입하는 단계;
    (c) 상기 중심 나노입자의 표면에 초상자성 나노입자들을 도입함으로써 상기 중심 나노입자 주위에 상기 초상자성 나노입자들의 층을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 초상자성 나노입자들의 층을 둘러싸도록 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 중심 나노입자는 실리카 나노입자인 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 일 말단은 카테콜 관능기를 함유하고 타 말단은 상기 중심 나노입자에 도입된 관능기와 결합하기 위한 별도의 관능기를 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 카테콜 관능기 함유 화합물은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물인 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016007807-appb-I000005
    (상기 식에서, L은 단일 결합 또는 2가의 유기기이고, X는 아민기, 카복실기, 히드록시기, 티올기, 아지드기, 또는 알킨기 중에서 선택되는 관능기이다. 상기 2가의 유기기는 탄소수 1~6의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌일 수 있다.)
  5. 제1 항에 있어서,
    (e) 상기 실리카 쉘을 상기 표면 개질하는 단계; 및
    (f) 상기 (b)~(d) 단계의 방식을 반복하여 다층 구조를 형성하는 단계를 더 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자의 제조방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    (g) 상기 실리카 쉘에 라만 표지화합물이 코팅된 금속 나노입자를 도입하는 단계를 더 포함하는 코어-쉘 구조의 자성나노입자의 제조방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 (g) 단계의 금속 나노입자가 금 나노입자 또는 은 나노입자인 코어-쉘 구조의 자성나노입자의 제조방법.
  8. 링커가 도입된 중심 나노입자;
    상기 링커에 의해 하나의 상기 중심 나노입자를 둘러싸도록 코팅된 복수의 초상자성 나노입자들; 및
    상기 초상자성 나노입자들을 둘러싸도록 형성된 실리카 쉘을 포함하는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 링커가 카테콜 관능기 함유 화합물인 것인 코어-쉘 구조의 자성 나노입자.
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘을 둘러싸도록 추가 층을 형성하는 복수의 초상자성 나노입자들; 및
    상기 추가 층의 초상자성 나노입자들을 둘러싸는 추가 실리카 쉘을 더 포함함으로써 멀티 쉘을 갖는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘을 둘러싸도록 도입된 금속 나노입자들; 및
    상기 금속 나노입자에 코팅된 라만 표지화합물을 포함함으로써 증강된 라만활성을 갖는 코어-쉘 구조의 자성 나노입자.
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