WO2016207343A1 - Peroxidase-fusionsprotein - Google Patents

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WO2016207343A1
WO2016207343A1 PCT/EP2016/064656 EP2016064656W WO2016207343A1 WO 2016207343 A1 WO2016207343 A1 WO 2016207343A1 EP 2016064656 W EP2016064656 W EP 2016064656W WO 2016207343 A1 WO2016207343 A1 WO 2016207343A1
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WO
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fusion protein
peroxidase
antibody
domain
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/064656
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English (en)
French (fr)
Inventor
Florian Wolfgang KRAINER
Original Assignee
Technische Universität Graz
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Definitions

  • the present invention relates to fusion proteins comprising peroxidases and antibody-binding peptides or polypeptides.
  • peroxidases such as horseradish peroxidase are produced predominantly by isolation from their natural environment (e.g., plants). The recombinant production of
  • peroxidases are technically possible, the yield of such processes is rather low in comparison with the production of other recombinant proteins such as antibodies or serum albumin.
  • peroxidases are used industrially in analytical and biochemical processes (e.g.
  • Peroxidases such as horseradish peroxidase
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • Southern Blot Southern Blot.
  • antibodies or antibody fragments e.g., protein G and protein A.
  • HRP-GBP protein A which consists of horseradish peroxidase (HRP), protein A and a gold-binding protein (GBP) in the order of HRP-GBP protein A.
  • HRP horseradish peroxidase
  • GBP gold-binding protein
  • a fusion protein which consists of glutathione-S-transferase, protein A and
  • US 2003/073149 relates to peroxidases which may be fused to protein A or G.
  • Object of the present invention is constructs and
  • the present invention relates to fusion proteins comprising a first domain, the at least one peroxidase or
  • peroxidases or catalytically active fragments thereof can be expressed particularly well when these are fused to an antibody-binding peptide or polypeptide.
  • Fusion proteins in which the C-terminus of the peroxidase or of a catalytically active fragment thereof is bound to the N-terminus of the antibody-binding peptide or polypeptide are at least retained and may even be increased. If, however, the N-terminus of the first
  • the catalytic activity of the first domain is compared to
  • Antibody-binding peptides and polypeptides are known in the art (e.g., protein G).
  • the peptides and polypeptides used in the invention may also be fragments of polypeptides and proteins which are themselves capable of binding to antibodies. The ability of polypeptides or
  • Peptides can bind to antibodies by conventional means
  • Binding assays are determined.
  • fusion protein is understood as meaning a protein or polypeptide which has at least two polypeptides, peptides or domains, wherein the individual protein or polypeptide
  • Polypeptide chains are covalently linked together via peptide bonds.
  • the first domain is covalently linked to the second domain via a peptide bond.
  • "fused" means having at least two protein or polypeptide chains via a peptide bond
  • Fusion proteins are well known in the art.
  • domain refers to a defined region of a protein or polypeptide which can be characterized by a particular property
  • Another domain of the invention is characterized in that it is capable of binding to an antibody or a fragment thereof.
  • the first domain of the invention may comprise one or more peroxidases or one or more catalytically active fragments thereof. The more than one, preferably more than two, three or five peroxidases are fused together and form the first domain.
  • the second domain may comprise at least one, at least two, at least three, preferably at least five, antibody-binding peptides or polypeptides which are also fused together. The together
  • Peptides or polypeptides are independently amino acids or amino acids.
  • catalytically active fragment or its homologous term "enzymatically active fragment” is understood as meaning a fragment of a catalytically or enzymatically active protein or polypeptide which contains at least 40%, preferably at least 50%, even more preferably at least 60%. even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably
  • the catalytic or enzymatic activity of the peroxidases used according to the invention can be determined by methods known to the person skilled in the art. Particularly preferred for the determination of the peroxidase activity is a process in which, with reduction of a co-substrate, such.
  • a fluorometric or colorimetric substrate such as.
  • ABTS 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • TMB 3, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidine
  • Polypeptide and “peptide” as used herein are molecules comprising peptide bonds linked amino acids having a chain length of 2 to 300 amino acid residues, wherein “polypeptides” comprise at least 50 amino acid residues.
  • the peroxidase is selected from the group consisting of horseradish peroxidase, peroxidases from thale cress
  • Soybeans e.g., soybean peroxidase
  • tobacco peroxidases e.g., tobacco peroxidases
  • peroxidase "), peroxidases from barley (eg barley peroxidase 1," barley peroxidase 1 ") and peroxidases from peanuts (eg cationic peanut peroxidase 1," cationic peanut peroxidase 1 ").
  • the fusion protein according to the invention preferably comprises horseradish peroxidase or at least one catalytic fragment thereof. Particularly preferably comprises or consists of
  • SEQ ID NO: 2 QLTPTFYDTSCPNVS IVRDI I INELRSDPRITAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFLTE KDALGNANSARGFPTVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGP SWRVPLGRRDSLQ AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDAFAKVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPLNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSFADGTQKFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM
  • SEQ ID NO: 16 RLTTNFYSKSCPRFFDIVRDTISNKQITTPTTAAATIRLFFHDCFPNGCDASILISSTAFNTAE RDSS INLSLPGDGFDVIVRAKTAIELACPNTVSCSDI ITVATRDLLVTVGGPYYDVYLGRRDSR ISKSSLLTDLLPLPSSPISKTIRQFESKGFTIQEMVALSGAHSIGFSHCKEFVNRVAGNNTGYN PRFAQALKQACSNYPKDPTLSVFNDIMTPNRFDNMYYQNIPKGLGLLESDHGLYSDPRTRPFVD LYARDQDLFFKDFARAMQKLSLFGVKTGRRGEIRRRCDAIN
  • SEQ ID NO: 21 KKPRRDVP IVKGLSWNFYQRACPKVEKI IKKELKKVFKRDIGLAAAILRIHFHDCFVQGCEASV LLAGSASGPGEQSS IPNLTLRQQAFVVINNLRALVQKQCGQVVSCSDILALAARDS IVLSGGPD YAVPLGRRDSLAFATPETTLANLPPPFANASQLI SDFNDRNLNITDLVALSGGHTIGIAHCPSF TDRLYPNQDPTMNKSFANSLKRTCPTANSSNTQVNDIRSPDVFDNKYYVDLMNRQGLFTSDQDL FVDKRTRGIVESFAIDQNLFFDHFTVAMIKMGQMSVLTGTQGEIRSNCSARNTASFI SVLEEGI VEEALSMI
  • RRPRVGFYGNRCRKVES IVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMYFHDCFVNGCDGS ILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPS ID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAI IER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN
  • RRPRVGFYGNRCRKVES IVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMHFHDCFVNGCDGS ILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPS ID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAI IER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN
  • the peroxidase according to the invention comprises or consists of one of the following amino acid sequences:
  • SEQ ID NO: 31 (Arabidopsis thaliana peroxidase 34):
  • SEQ ID NO: 32 "soybean peroxidase"
  • SEQ ID NO: 33 lignin-forming anionic tobacco peroxidase
  • SEQ ID NO: 36 (“Cationic peanut peroxidase 1"):
  • the second domain comprises at least one peptide which binds to an Fc region of the antibody or
  • Polypeptide preferably selected from the group consisting of protein G, protein A, protein A / G and variants thereof.
  • the at least one preferably the at least two, more preferably the at least three, even more preferably the at least four antibody binding peptides or
  • Polypeptides preferably bind to an Fc region of a
  • Antibody Selected are such peptides or polypeptides from the group consisting of protein G, protein A, protein A / G or variants thereof.
  • Protein G preferably has the following amino acid sequence:
  • Protein A preferably has the following amino acid sequence:
  • the at least one antibody-binding peptide or polypeptide can bind to the variable region of the light chain of antibodies.
  • the second domain of the fusion protein according to the invention therefore comprises protein L, protein M or a variant thereof.
  • Protein L preferably has the following amino acid sequence:
  • Variants of the antibody-binding peptides or polypeptides according to the invention are preferably fragments of the same, which are capable of binding to an antibody.
  • the bond strength of these variants or fragments can be up to 80%,
  • This bond strength can be determined by conventional binding assays.
  • the variants of the antibody-binding peptides or polypeptides according to the invention can be distinguished from the peptides and polypeptides from which these variants are derived. also differ in the amino acid sequence.
  • these variants have at least 70%, preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, more preferably
  • Nucleic acid molecules means that the sequences of the molecules share some degree of sequence similarity, the sequences being partially identical. According to the invention, the identity of two or more amino acid or
  • Nucleic acid molecules can be determined with known algorithms. Most preferably, the algorithm of Needleman and Wunsch (J Mol Biol 48 (1970): 443) is used. That's why
  • the second domain of the fusion protein according to the invention comprises a
  • Antibody or an antibody fragment preferably comprises those regions of an antibody capable of binding to an epitope.
  • a linker can be arranged between the first domain and the second domain of the fusion protein according to the invention, more preferably between the first and second domain of the fusion protein according to the invention, no linker
  • the linker comprises 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, amino acid residues.
  • at the N-terminus and / or C-terminus of the fusion protein is a tag, preferably an affinity tag
  • this has a tag at the N-terminus and / or C-terminus.
  • a "day" is one
  • a compound in particular a peptide, which, by virtue of its primary, secondary or tertiary structure, has a binding site for another molecular unit which allows a specific binding of this other molecular unit.
  • the tag is selected from the group consisting of His tag, HA tag, Flag tag, StrepTagII and MBP tag.
  • the fusion protein according to the invention comprises or consists of one of the following amino acid sequences:
  • nucleic acid molecule encoding a secretion signal peptide a Nukleinklanz.
  • the nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid sequence coding for a secretion signal peptide.
  • Nucleic acid sequence encoding the secretion signal peptide is linked "in frame" with the nucleic acid molecule according to the invention.
  • the secretion signal peptide is selected from the group consisting of the secretion signal peptides of the
  • PreScMfa2-proScMfa2 the pre-peptide of Pichia pastoris acid phosphatase 1
  • prePpPhol acid phosphatase 1
  • Trichoderma reesei cellobiohydrolase 2 the pre-peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase 2
  • PreTrCbh2 the pre-peptide of Homo sapiens serum albumin
  • Prepropeptides of Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 2 are meant to be a deletion of amino acids N52-I65 (NATASGLLFINTTI; SEQ ID NO: 71). The corresponding complete
  • Prepropeptide of Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 1 MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLL FINTTIAS IAAKEEGVSLEKREAEA (SEQ ID NO: 39)
  • the nucleic acid sequence encodes a secretion signal peptide which is one of the following
  • Amino acid sequences comprising:
  • SEQ ID NO: 39 (Saccharomyces cerevisiae alpha mating factor):
  • SEQ ID NO: 40 deletion mutant of Saccharomyces cerevisiae alpha-mating factor; "da"
  • SEQ ID NO: 42 (combination signal peptide consisting of P.
  • SEQ ID NO: 44 (combination signal peptide consisting of
  • Trichoderma reesei “cellobiohydrolase 2" and the propeptide of a deletion mutant of the alpha-mating factor "preTrCbh2-proDa"
  • SEQ ID NO: 45 Prepeptide of Homo sapiens serum albumin
  • SEQ ID NO: 46 (combination signal peptide consisting of Homo sapiens serum albumin and the propeptide of a deletion mutant of the alpha-mating factor; "preHsAlb-proDa”):
  • SEQ ID NO: 47 (Prepeptide of Armoracia rusticana
  • SEQ ID NO: 48 (combination signal peptide consisting of Armoracia rusticana horseradish peroxidase CIA and the propeptide of a deletion mutant of alpha-mating factor; "preArCla-proDa”):
  • SEQ ID NO: 49 (Prepeptide of Kluyveromyces lactis Killer Toxin; "preKIKtx"):
  • MNIFYIFLFLLSFVQGL SEQ ID NO: 50 prepropeptide consisting of Kluyveromyces lactis killer toxin; "preKIKtx-proKIKtx":
  • SEQ ID NO: 51 (combination signal peptide consisting of
  • SEQ ID NO: 52 prepropeptide of Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 2; "preScMfa2-proScMfa2"
  • SEQ ID NO: 53 deletion mutant of Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 2; "preScMfa2-proDa2"
  • the nucleic acid molecule according to the invention comprises or consists of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56 and SEQ ID No. 57.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid molecule according to the
  • the nucleic acid molecule of the invention may be part of a vector.
  • vector as used herein includes any intermediate vehicle for a nucleic acid which, for example, comprises
  • nucleic acid to be introduced into prokaryotic and / or eukaryotic host cells and optionally integrated into a genome.
  • vectors are preferably used in the Cell replicated and / or expressed.
  • Vectors include plasmids, phagemids or viral genomes.
  • One vector is thus a nucleic acid molecule that is capable of another
  • Nucleic acid molecule such as the invention
  • Nucleic acid molecules coding for a fusion protein to which it is bound to transport are provided.
  • the nucleic acid molecule is operatively linked to a promoter or comprises a promoter capable of directing the fusion protein encoded by the nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule encoded fusion protein this is operatively linked to a promoter.
  • “Operably linked” as used herein means a functional linkage between the promoter sequence and the nucleic acid molecule to be expressed such that the promoter sequence is capable of transcribing the nucleic acid molecule
  • promoter refers to a promoter
  • Nucleic acid molecule forms with the promoter and optionally other elements (such as terminator sequences)
  • Expression cassette which may also be part of a vector.
  • Any promoter can be used according to the invention, provided it allows the expression of the
  • inventive fusion protein in a suitable
  • the promoter can be inducible or constitutive.
  • AUG1, AOD, ENO1, GPM1, HSP82, ICL1, ILV5, GPD1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PH05, AOX1, A0X2, DAS, host cells, such as yeast cells, can be used to control expression of a gene.
  • FLD1, GAL10 / CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa or NMT promoters or combinations or variants of the abovementioned promoters are used (see, eg Vogl T and members A, New Biotechnology 30 (2013): 385-404, in particular Table 1 of Vogl T and members A).
  • an AOXl promoter or variants thereof are used.
  • WO 2006/089329 and include mutations (e.g.
  • the vector of the invention may be considered more stable
  • Expression vector are inserted in an artificial chromosome or by integration into the chromosome in a host cell. Integration into the chromosome can be achieved by using a vector that turns out to be a whole element or with parts thereof recombined with the chromosome of the yeast. Suitable vectors may contain nucleotide sequences that are homologous with nucleotide sequences of the host cell chromosome.
  • a vector according to the invention can be a selectable
  • the selectable markers are often genes that allow antibiotic resistance of the host cell or genes that are capable of complementing those host cells that have well-characterized metabolic deficiencies, such as e.g. B. defective mutants in histidine.
  • the preferred selectable markers include URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4, or genes encoding antibiotic resistance.
  • the vector may also have a replication origin that is capable
  • a further aspect of the present invention relates to a cell or a host cell comprising a nucleic acid molecule or a vector according to the present invention.
  • nucleic acid molecules or vectors according to the invention are preferably introduced into cells in order to multiply these molecules for cloning purposes, for example, or to enable the expression of the fusion protein according to the invention in host cells.
  • host cell according to the invention relates to each
  • host cell which is transformable or transfectable with an exogenous nucleic acid, preferably DNA or RNA.
  • the term "host cell” includes prokaryotic (e.g., E.
  • eukaryotic cells e.g., animal cells
  • the cell is a fungal cell, preferably one
  • Yeast cell particular preference being given to using methylotrophic yeasts and very particularly preferably P. pastoris and Hansenula polymorpha.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of producing a fusion protein according to the present invention comprising culturing a cell as defined above.
  • the fusion protein according to the invention can be prepared by methods described in the prior art. Particularly preferred is the preparation of the invention Fusion protein in methylotrophic yeasts, such as P. pastoris and Hansenula polymorpha.
  • Yet another aspect of the present invention relates to the use of a fusion protein according to the present invention in an immunoassay, preferably in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • an immunoassay preferably in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the fusion proteins according to the invention are, on the one hand, able to bind to antibodies or fragments thereof and, on the other hand, have peroxidase activity, they are particularly suitable for immunoassays.
  • the analytes to be determined are usually labeled with antibodies or fragments thereof.
  • the fusion proteins according to the invention can bind to these antibodies or to their fragments.
  • a substrate is applied, which is reacted by the first domain of the fusion protein of the invention. The conversion of the substrate is a measure of how much fusion protein and thus analyte is present.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for detecting the presence of a target molecule in a sample comprising the steps of:
  • Fusion protein excellent for detecting the presence of a target molecule in a sample (eg in a process such as in Engvall E et al. Immunochemistry 8 (1971): 871-875
  • Carrier be removed, more antibodies or
  • Bind target molecule After this step or after an optional washing step, the fusion protein according to the invention is brought into contact with the solid support. Since the fusion protein is able to bind to antibodies, the
  • the antibody bound to the target molecule is "labeled" with the fusion protein according to the invention
  • a substrate for peroxidases is applied.
  • This usually colorless substrate is converted from the first domain of the fusion protein into a colored substrate.
  • the reaction of the substrate indicates the presence of the target molecule in the original sample, the
  • At least one substrate selected from the group consisting of N- (4-aminobutyl) -N-ethylisoluminol, 3-amino-9-ethylcarbazole, 4-aminophthalhydrazide, 5-aminosalicylic acid, 2,2'-azino-bis is particularly well suited (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 4-chloro-1-naphthol, 4-chloro-7-nitrobenzofurazane, 3,3'-diaminobenzidine, tetrahydrochloride, 3,3'-diaminobenzidine (DAB), o-dianisidine, iodonitrotetrazolium chloride.
  • One aspect of the present invention relates to a kit comprising a fusion protein according to the invention and a target molecule binding antibody or a fragment thereof.
  • Figure 1 shows recombinant SpG-HRP fusion constructs with and without hexahistidine tag (6x H) or pentaglycine linker (5x G); N-terminal fusions of SpG (dotted) to HRP (filled in); C-terminal fusions of SpG (dotted) to HRP (filled in)
  • A SpG-HRP
  • B 6xH-SpG-HRP
  • C SpG-5xG-HRP
  • D 6xH-SpG-5xG-HRP
  • E HRP -SpG
  • F 6xH-HRP-SpG).
  • Fig. 2 shows the production and purification of a
  • Fig. 3 shows the detection of antigens by recombinant HRP-SpG fusion protein in direct ELISA.
  • IgGs from human serum (diamonds) or from rabbit serum (squared) were used as antigens in concentrations of 20 - 0.01953125 pg / mL.
  • HRP-SpG was used at a concentration of 0.1 pg / mL.
  • Error bars are standard deviations from triplicate measurements.
  • Light gray bars are measured enzyme activities of unmodified wild-type HRP produced as positive controls.
  • Black bars to the right are measured enzyme activities of the indicated fusion protein constructs produced by various transformants.
  • P. pastoris strains based on the strain CBS 7435 (NRRL Y-11430 identical with and ATCC 76273) with Mut s phenotype.
  • PpFWK3 Krainer FW, et al., Sei. Rep.
  • the nucleic acid molecule encoding the SpG polypeptide consisting of three IgG-binding domains was optimized codon and as so-called "gBlock" as synthetic
  • SpGsCterm_rv atatGCGGCCGCATTACTCGGTGACGGTGAAGGTCTTA 69
  • Microliter scale cultivations were performed in deep well plates. Strains were analyzed in 250 pL BMD1%
  • Bioreactor cultivations were performed in 1.2 L-Biostat® B bioreactors (Sartorius). NH 4 OH was used both as a nitrogen source and as a pH regulator to obtain a pH of 6. A dC> 2 minimum level of 30% was determined by cascade control. A 50 mL preculture was cultured for two days at 28 ° C, 90 rpm and 80% humidity and for inoculation of a batch culture in 450 mL autoclaved BSM medium with 2.18 mL PTM1 solution and 2.18 mL 200 mg / LD (+) - Biotin solution used. After consumption of glycerin
  • a glycerol fedbatch culture was started (addition of 34.5 g glycerol over 7 h). After addition of 30 ⁇ M hemin, 60.4 g of methanol were added over 136.6 h added to induce PAOXl-regulated expression. The cells were centrifuged off at 17700 ⁇ g for 40 min and the supernatant was filtered through 0.2 ⁇ l cellulose acetate filter (Sartorius).
  • Direct ELISA was performed with human IgGs or with rabbit IgGs as antigens. Clear MICROLON® high-binding microplates (Greiner Bio-One) were supplemented with 100 pL IgGs
  • Binding of the IgGs by HRP-SpG fusion protein was achieved by adding 100 pL 0.1 pg / mL HRP-SpG (diluted in blocking buffer) and incubating at 25 ° C for 1 h, followed by six washes. After 15 min incubation with 100 pL detection solution (0.5 mM TMB, 2.9 mM H 2 O 2 in 50 mM
  • Recombinant fusion proteins between HRP and SpG have a constant 1: 1 stoichiometry and are therefore more homogeneous and more reproducible as conjugates of both polypeptides.
  • Six fusion protein constructs of HRP and SpG were generated and screened in microliter scale cultivations for HRP activity (see Figure 4).
  • three N-terminal fusion constructs SpG-HRP, 6xH-SpG-HRP, SpG-5xG-HRP
  • the transformation of constructs in which SpG was fused to the C-terminus of HRP surprisingly resulted in P.
  • the corresponding strain was cultured in a 1.2 L bioreactor. After a total of 160 h of culture (136 h thereof under methanol induction), the volumetric and specific HRP activities were determined. The final
  • volumetric activity was 183 U / mL, the specific
  • Glycospecies of the same protein can either be combined to maximize the yield of functional HRP SpG, or the first smaller peak can
  • HRP activity is produced by P. pastoris in significantly lower yields of less than 10 mg / L (Morawski B, et al., Biotechnol., Bioeng., 76: 99-107 (2001)).
  • Direct ELISAS with IgGs from two mammalian species also confirmed the applicability of the produced

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase oder mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid oder Polypeptid umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne fusioniert ist.

Description

PEROXIDASE-FUSIONSPROTEIN
Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine umfassend Peroxidasen und Antikörper bindende Peptide oder Polypeptide.
Großtechnisch werden Peroxidasen wie Meerrettichperoxidase vorwiegend durch Isolierung aus ihrer natürlichen Umgebung (z.B. Pflanzen) hergestellt. Die rekombinante Herstellung von
Peroxidasen ist technisch zwar möglich, jedoch ist die Ausbeute derartiger Verfahren - im Vergleich zur Herstellung anderer rekombinanter Proteine wie Antikörper oder Serumalbumin - eher gering. Da Peroxidasen jedoch in analytischen und biochemischen Verfahren technisch eingesetzt werden (z.B. bei der
Polymerisation von Phenolen und aromatischen Aminen, bei der Papierherstellung) , ist es wünschenswert Peroxidasen in
ausreichender Menge mit effizienten und kostengünstigen
Verfahren herzustellen. Peroxidasen wie Meerrettichperoxidase werden auch bei bestimmten molekularbiologischen Verfahren zur Detektion von Proteinen und Nukleinsäuren (z.B. „Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) , Western Blot, Southern Blot) verwendet. In derartigen Verfahren werden Peroxidasen häufig an Molekülen konjugiert, die ihrerseits in der Lage sind an
Antikörper oder Antikörperfragmenten zu binden (z.B. Protein G und Protein A) .
In der US 2006/246426 wird u.a. ein Fusionsprotein
beschrieben, welches aus Meerrettichperoxidase (HRP), Protein A und ein an Gold bindendes Protein (GBP) in der Reihenfolge HRP- GBP-Protein A besteht.
In der WO 93/19091 wird ein Fusionsprotein geoffenbart, welches aus Glutathion-S-Transferase, Protein A und
Meerrettichperoxidase besteht.
Die US 2003/073149 betrifft Peroxidasen, die an Protein A oder G fusioniert sein können.
Kranier FW et al . (Appl Microbiol Biotechnol 99 (2015) : 1611- 1625) beschäftigen sich in ihrem Übersichtsartikel mit der rekombinanten Herstellung von Meerrettichperoxidase .
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verfahren und Mittel zur Überexpression von enzymatisch aktiven Peroxidasen bereitzustellen, die es ermöglichen Peroxidasen in einer höheren Ausbeute zu exprimieren als vergleichbare im Stand der Technik üblicherweise eingesetzte Expressionssysteme. Eine weitere
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Konstrukte und
Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, die Peroxidase- Aktivität aufweisen und in der Lage sind an einen Antikörper oder Fragment davon zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase oder
mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid oder Polypeptid umfasst, wobei der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne
fusioniert ist.
Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass Peroxidasen oder katalytisch aktive Fragmente davon besonders gut exprimiert werden können, wenn diese an ein Antikörper bindendes Peptid oder Polypeptid fusioniert ist. Die enzymatische Aktivität von Peroxidasen oder katalytisch aktiven Fragmenten davon in
Fusionsproteinen, in denen der C-Terminus der Peroxidase bzw. eines katalytisch aktiven Fragments davon an den N-Terminus des Antikörper bindenden Peptids oder Polypeptids gebunden ist, bleibt dabei zumindest erhalten und kann gegebenenfalls sogar gesteigert werden. Wird hingegen der N-Terminus der ersten
Domäne an den C-Terminus der zweiten Domäne fusioniert, wird die katalytische Aktivität der ersten Domäne im Vergleich zum
erfindungsgemäßen Fusionsprotein signifikant reduziert oder gänzlich unterdrückt.
Antikörper bindende Peptide und Polypeptide sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Protein G) . Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide und Polypeptide können auch Fragmente von Polypeptiden und Proteinen sein, die selbst in der Lage sind, an Antikörper zu binden. Die Fähigkeit von Polypeptiden bzw.
Peptiden Antikörper zu binden, kann durch herkömmliche
Bindungsassays bestimmt werden.
Unter dem Begriff „Fusionsprotein" wird ein Protein bzw. Polypeptid verstanden, das wenigstens zwei Polypeptide, Peptide bzw. Domänen aufweist, wobei die einzelnen Protein- bzw.
Polypeptidketten kovalent über Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Erfindungsgemäß ist die erste Domäne mit der zweiten Domäne über eine Peptidbindung kovalent verbunden. „Fusioniert", wie hier verwendet, bedeutet, dass mindestens zwei Protein- bzw. Polypeptidketten über eine Peptidbindung
miteinander verbunden sind. Verfahren zur Herstellung von
Fusionsproteinen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Der Begriff „Domäne", wie hier verwendet, bezeichnet eine definierte Region eines Proteins oder Polypeptids, welches durch eine bestimmte Eigenschaft charakterisiert werden kann. Eine erfindungsgemäße Domäne weist vorzugsweise bestimmte
biochemische Eigenschaften oder Funktionalitäten, wie die katalytische Aktivität einer Peroxidase, auf. Eine weitere erfindungsgemäße Domäne zeichnet sich dadurch aus, dass diese in der Lage ist an einen Antikörper oder einem Fragment davon zu binden .
Die erfindungsgemäße erste Domäne kann ein oder mehrere Peroxidasen oder ein oder mehrere katalytisch aktive Fragmente davon umfassen. Die mehr als eine, vorzugsweise mehr als zwei, drei oder fünf Peroxidasen sind aneinander fusioniert und bilden die erste Domäne. Die zweite Domäne kann mindestens ein, mindestens zwei, mindestens drei, vorzugsweise mindestens fünf, Antikörper bindende Peptide oder Polypeptide, welche ebenfalls aneinander fusioniert sind, umfassen. Die aneinander
fusionierten Peroxidasen bzw. katalytisch aktiven Fragmente davon und die aneinander fusionierten Antikörper bindenden
Peptide oder Polypeptide weisen unabhängig voneinander
enzymatische bzw. Antikörper bindende Eigenschaften auf.
Unter dem Begriff „katalytisch aktives Fragment" bzw. unter dessen homologen Begriff „enzymatisch aktives Fragment" wird ein Fragment eines katalytisch bzw. enzymatisch aktiven Proteins bzw. Polypeptids verstanden, welches zumindest 40%, vorzugsweise mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugte mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt
mindestens 95%, der Aktivität des Proteins bzw. Polypeptids aufweist, von dem das Fragment abgeleitet ist. Die katalytische bzw. enzymatische Aktivität der erfindungsgemäß eingesetzten Peroxidasen kann mit für den Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden. Für die Bestimmung der Peroxidaseaktivität besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem unter Reduktion eines Co-Substrats , wie z. B. Wasserstoffperoxid, die Oxidation eines fluorometrischen oder kolorimetrischen Substrats, wie z. B. ABTS (2, 2 ' -Azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) ) oder TMB (3, 3 ' , 5, 5 ' -Tetramethylbenzidin) quantifiziert wird
(siehe z.B. Morawski, B. et al . Protein Eng. 13 (2000) : 377-84, Josephy, P. D. et al . J. Biol. Chem. 257 (1982) : 3669-75) .
„Polypeptid" und „Peptid", wie hier verwendet, sind Moleküle umfassend durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren mit einer Kettenlänge von 2 bis 300 Aminosäureresten, wobei „Polypeptide" mindestens 50 Aminosäurereste umfassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Peroxidase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Meerrettichperoxidase, Peroxidasen aus Acker-Schmalwand
(z.B. Arabidopsis thaliana peroxidase 34), Peroxidasen aus
Sojabohnen (z.B. So jabohnen-Peroxidase) , Peroxidasen aus Tabak
(z.B. Lignin-formende anionische Tabak-Peroxidase; „lignin- forming anionic tobacco peroxidase") , Peroxidasen aus Tomaten
(z.B. Suberinisierungs-assoziierte anionische Tomaten- Peroxidase; „suberization-associated anionic tomato
peroxidase"), Peroxidasen aus Gerste (z. B. Gersten-Peroxidase 1; „barley peroxidase 1") und Peroxidasen aus Erdnüssen (z. B. kationische Erdnuss Peroxidase 1; „cationic peanut peroxidase 1") .
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein umfasst vorzugsweise Meerrettichperoxidase oder mindestens ein katalytisches Fragment davon. Besonders bevorzugt umfasst oder besteht die
Meerrettichperoxidase aus einer der folgenden
Aminosäuresequenzen :
SEQ ID Nr. 1:
QLTPTFYDNSCPNVS IVRDTIVNELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDAS ILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGP SWRVPLGRRDSLQ AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSLLHDMVEVVDFV SSM
SEQ ID Nr. 2: QLTPTFYDTSCPNVS IVRDI I INELRSDPRITAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFLTE KDALGNANSARGFPTVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGP SWRVPLGRRDSLQ AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDAFAKVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPLNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSFADGTQKFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM
SEQ ID Nr. 3:
QLTPTFYDNSCPNVS IVRDI I INELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGP SWRVPLGRRDSRQ AFLDLANANLPAPSFTLPELKAAFANVGLNRPSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM
SEQ ID Nr. 4:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDI I INELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGP SWRVPLGRRDSRQ AFLDLANTNLPAPSFTLPQLKAAFANVGLNRPSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM
SEQ ID Nr. 5:
QLSPSFYDKTCPQVFDIATNTIKTALRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNARSARGFDVIDTMKAAVEKACPKTVSCADLLAIAAQKSVVLAGGP SWKVPSGRRDSLR GFMDLANDNLPGPSSTLQVLKDKFRNVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCQF IMDRLYNFSNSGK PDPTLDKSYLSTLRKQCPRNGNLSVLVDFDLRTPTIFDNKYYVNLKENKGLIQSDQELFSSPDA SDTIPLVRAYADGQGKFFDAFVEAMIRMGNLSPSTGKQGEIRLNCRVVNSKPKIMDVVDTNDFA SSI
SEQ ID Nr. 6:
QLRPDFYFRTCPSVFNI IGDI IVDELRTDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASILLDNSTSFRTE KDAAPNANSARGFGVIDRMKTSLERACPRTVSCADVLTIASQI SVLLSGGPWWPVPLGRRDSVE AFFDLANTALPSPFFTLAQLKKAFADVGLNRPSDLVALSGGHTFGRAQCQFVTPRLYNFNGTNR PDPTLDPTYLVQLRALCPQNGNGTVLVNFDVVTPNTFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSSNTFAFFGAFVDAMIRMGNLRPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSSI
SEQ ID Nr. 7:
QLSPDIYAKSCPNLLQIVRDQVKIALKAEIRMAASLIRLHFHDCFVNGCDASVLLDGTNSEKLA IPNVNSVRGFEVIDTIKAAVENACPGVVSCADILTLAARDSVYLSGGPQWRVALGRKDGLVANQ SSANNLPSPFEPLDAI IAKFAAVGLNVTDVVALSGAHTFGQAKCDLFSNRLFNFTGAGTPDSTL ETTLLSDLQTVCP IGGNGNKTAPLDRNSTDAFDNNYFKNLLEGKGLLSSDQILFSSDLAVNTTK RLVEAYSRSQYLFFRDFTCSMIRMGSLVNGASGEVRTNCRVIN
SEQ ID Nr. 8:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQAFQSDTRIGASLIRLHFHDCFVNGCDASILLDDSGS IQSE KNAGPNANSARGFNVVDNIKTALENTCPGVVSCSDILALASEASVSLTGGP SWTVLLGRRDSLT ANLAGANSAIPSPFEGLSNITSKFSAVGLNTNDLVALSGAHTFGRARCGVFNNRLFNFSGTGNP DPTLNSTLLSSLQQLCPQNGSASTITNLDLSTPDAFDNNYFANLQSNNGLLQSDQELFSTTGSA TIAVVTSFASNQTLFFQAFAQSMINMGNI SPLTGSNGEIRLDCKKVNGS
SEQ ID Nr. 9:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQAFQSDTRIGASLIRLHFHDCFVNGCDASILLDDSGS IQSE KNAGPNANSARGFNVVDNIKTALENTCPGVVSCSDILALASEASVSLTGGP SWTVLLGRRDSLT ANLAGANSAIPSPFEGLSNITSKFSAVGLNTNDLVALSGAHTFGRARCGVFNNRLFNFSGTGNP DPTLNSTLLSSLQQLCPQNGSASTITNLDLSTPDAFDNNYFANLQSNNGLLQSDQELFSTTGSA TITVVTSFASNQTLFFQAFAQSMINMGNI SPLTGSNGEIRLDCKKVNGS
SEQ ID Nr. 10:
QLRPDFYSRTCPSVFNI IKNVIVDELQTDPRIAAS ILRLHFHDCFVRGCDASILLDTSKSFRTE KDAAPNVNSARGFNVIDRMKTALERACPRTVSCADILTIASQI SVLLSGGP SWAVPLGRRDSVE AFFDLANTALPSPFFTLAQLKKAFADVGLNRPSDLVALSGGHTFGRARCLFVTARLYNFNGTNR PDPTLNPSYLADLRRLCPRNGNGTVLVNFDVMTPNTFDNQFYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSSNTLSFFGAFADAMIRMGNLRPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSSM
SEQ ID Nr. 11:
QLTPTFYDSTCPSVFS IVRDTIVNELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAAPNANSARGFPVIDTMKAAVERACPRTVSCADLLTIAAQQSVNLAGGP SWRVPLGRRDSVQ AFFDLANTNLPAPFFTLPQLKASFSNVGLDRPEDLVALSGGHTFGKNQCQF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRVQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEHKGLIQTDQELFSSPNA ADTIPLVRSYADGTQKFFNAFMEAMNRMGNITPLTGTQGQIRQNCRVINSNSLLHDIVEIVDFV SSM
SEQ ID Nr. 12:
KLRPDFYLKTCPSVFQI IGNVIVDELQSDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASVLLDNSTSFQSE KDAAPNANSARGFDVVDRMKAALEKACPGTVSCADVLAI SAQI SVLLSGGPWWPVLLGRRDGVE AFFDLANTALPNPFAPLTELKEKFADVGLKRASDLVALSGAHTFGRAQCLLVTPRLYNFSGTNK PDPTLNPSYLVELRRLCPQNGNGTVLLNFDLVTPNAFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSKNTFAFFGAFVDAI IRMG IQPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIKGMENDGGVVSS I
SEQ ID Nr. 13:
KLRPDFYLKTCPSVFQI IGNVIVDELQSDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASVLLDNSTSFQSE KDAAPNANSARGFDVVDRMKAALEKACPGTVSCADVLAI SAQI SVLLSGGPWWPVLLGRRDGVE AFFDLANTALPNPFAPLTELKEKFADVGLKRASDLVALSGAHTFGRAQCLLVTPRLYNFSGTNK PDPTLNPSYLVELRRLCPQNGNGTVLLNFDLVTPNAFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSKNTFAFFGAFVDAI IRMGNIQPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSS I
SEQ ID Nr. 14:
QLTPNFYSTSCPNLLSTVQSAVKSAVNSEARMGAS IVRLFFHDCFVNGCDGSILLDDTSSFTGE QNANPNRNSARGFNVIDNIKAAVEKACPGVVSCADILAIAARDSVVVLGGPNWTVKVGRRDART ASQAAANSNIPAPTSSLSQLI SSFSAVGLSTRDMVALSGAHTIGQSRCTSFRTRIYNETNINAA FATTRQRTCPRTSGSGDGNLAPLDVTTAASFDNNYFKNLMTQRGLLHSDQELFNGGSTDS IVRG YSNNPSSFSSDFAAAMIKMGDISPLTGSSGEIRKVCGRTN
SEQ ID Nr. 15:
QLQMNFYAKSCPNAEKI I SDHIQKHIPSGPSLAAPLIRMHFHDCFVRGCDGSVLINSTSGNAEK DSAPNLTLRGFGFVERIKTLLEAECPKTVSCADI IALTARDAVVATGGPSWKVPTGRRDGRI SN TTEALNNIPPPTSNFTTLQRLFANQGLNLKDLVLLSGAHTIGVSHCSSMNTRLYNFSTTVKQDP SLDSEYAANLKANKCKSLNDNTTILEMDPGSSKTFDLSYYRLVLKRRGLFQSDSALTTNSATLK MINDLVNGPEKKFLKAFAKSMEKMGRVKVKTGSAGVIRTRCSVAGS
SEQ ID Nr. 16: RLTTNFYSKSCPRFFDIVRDTISNKQITTPTTAAATIRLFFHDCFPNGCDASILISSTAFNTAE RDSS INLSLPGDGFDVIVRAKTAIELACPNTVSCSDI ITVATRDLLVTVGGPYYDVYLGRRDSR ISKSSLLTDLLPLPSSPISKTIRQFESKGFTIQEMVALSGAHSIGFSHCKEFVNRVAGNNTGYN PRFAQALKQACSNYPKDPTLSVFNDIMTPNRFDNMYYQNIPKGLGLLESDHGLYSDPRTRPFVD LYARDQDLFFKDFARAMQKLSLFGVKTGRRGEIRRRCDAIN
SEQ ID Nr. 17:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQALQSDPRIGASLIRLHFHDCFVNGCDGSLLLDDTGS IQSE K APA ANSARGFNVVDDIKTALENACPGIVSCSDILALASEASVSLAGGP SWTVLVGRRDGLT ANLSGANSSLPSPFEGLNNITSKFLAVGLNTTDVVVLSGAHTFGRGQCVTFNNRLFNFNGTGSP DPTLNSTLLSSLQQICPQNGSGSAITNLDLTTPDAFDSNYYTNLQSNNGLLQSDQELFSNTGSP TIAIVILCK
SEQ ID Nr. 18:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQALQSDPRIGASLIRLHFHDCFVNGCDGSLLLDDTGS IQSE KNAPANANSARGFNVVDDIKTALENACPGIVSCSDILALASEASVSLAGGP SWTVLVGRRDGLT ANLSGANSSLPSPFEGLNNITSKFLAVGLNTTDVVVLSGAHTFGRGQCVTFNNRLFNFNGTGSP DPTLNSTLLSSLQQICPQNGSGSAITNLDLTTPDAFDSNYYTNLQSNNGLLQSDQELFSNTGSP TIAIVILLQVTKPCFLRLLLSL
SEQ ID Nr. 19:
QAI S I S ITIRIGFYLTTCPTAEI IVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVQGCDGSVLI SG SNTERTAVPNLSLRGFEVIENAKTQLEAACPGVVSCADILALAARDTVVLTRGIGWQVPTGRRD GRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSALGLNTRDLVVLAGGHTLGTAGCGVFRDRLFNNTDPN VDQPFLTQLQTKCPRNGDGSVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPATRP IV QQLMSSSGNFNAEFARSMVKMSNIGVVTGTNGEIRKVCSAIN
SEQ ID Nr. 20:
LSMTYYMMSCPMAEQIVKNSVNNALQADPTLAAGLIRMLFHDCFIEGCDAS ILLDSTKDNTAEK DSPANLSLRGYEI IDDAKEKVENMCPGVVSCADIVAMAARDAVFWAGGPYYDIPKGRFDGKRSK IEDTRNLPSPFLNASQLIQTFGNRGFSPQDVVALSGAHTLGVARCSSFKARLTTPDSSLDSTFA NTLTRTCNAGDNAEQPFDATRNDFDNAYFNALQRKSGVLFSDQTLFNTPRTRNLVNGYALNQAK FFFDFQQAMRKMSNLDVKLGSQGEIRQNCRTIN
SEQ ID Nr. 21: KKPRRDVP IVKGLSWNFYQRACPKVEKI IKKELKKVFKRDIGLAAAILRIHFHDCFVQGCEASV LLAGSASGPGEQSS IPNLTLRQQAFVVINNLRALVQKQCGQVVSCSDILALAARDS IVLSGGPD YAVPLGRRDSLAFATPETTLANLPPPFANASQLI SDFNDRNLNITDLVALSGGHTIGIAHCPSF TDRLYPNQDPTMNKSFANSLKRTCPTANSSNTQVNDIRSPDVFDNKYYVDLMNRQGLFTSDQDL FVDKRTRGIVESFAIDQNLFFDHFTVAMIKMGQMSVLTGTQGEIRSNCSARNTASFI SVLEEGI VEEALSMI
SEQ ID Nr. 22:
KKPRRDVP IVKGLSWNFYQRACPKVEKI IKKELKKVFKRDIGLAAAILRIHFHDCFVQGCEASV LLAGSASGPGEQSS IPNLTLRQQAFVVINNLRALVQKQCGQVVSCSDILALAARDS IVLSGGPD YAVPLGRRDSLAFATPETTLANLPPPFANASQLI SDFNDRNLNITDLVALSGGHTIGIAHCPSF TDRLYPNQDPTMNKSFANSLKRTCPTANSSNTQVNDIRSPDVFDNKYYVDLMNRQGLFTSDQDL FVDKRTRGIVESFAIDQNLFFDHFTVAMIKMGQMSVLTGTQGEIRSNCSARNTASFI SVLVEGI VEEALSMI
SEQ ID Nr. 23:
QAAARRPGP I SGTRIGFYLTTCPTAEI IVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVLGCDGSV LI SGSNTERTAVPNLNLRGFEVIDNAKTQLEATCPGVVSCADILALAARDTVVLTRGLGWQVPT GRRDGRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSAVGLNTRDLVVLAGGHTIGTAGCGVFRDRLFNN TDPNVNQLFLTQLQTQCPQNGDGAVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPAT RPIVQQLMSPRGNFNAEFARSMVRMSNIGVVTGANGEIRRVCSAVN
SEQ ID Nr. 24:
QAAARRPGP I SGTRIGFYLTTCPTAEIIVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVLGCDGSV LI SGSNTERTAVPNLNLRGFEVIDNAKTQLEATCPGVVSCADILALAARDTVVLTRGLGWQVPT GRRDGRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSAVGLNTRDLVVLAGGHTIGTAGCGVFRDRLFNN TDPNVNQLFLTQLQTQCPQNGDGSVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPAT RPIVQQLMSPRGNFNAEFARSMVRMSNIGVVTGANGEIRRVCSAVN
SEQ ID Nr. 25:
RLTTNFYSKSCPRFFDIVRDTISNKQITTPTTAAATIRLFFHDCFPNGCDASILISSTAFNTAE RDSS INLSLPGDGFDVIVRAKTAIELACPNTVSCSDI ITVATRDLLVTVGGPYYDVYLGRRDSR ISKSSLLTDLLPLPSSPISKTIRQFESKGFTIQEMVALSGAHSIGFSHCKEFVNRVAGNNTGYN PRFAQALKQACSNYPKDPTLSVFNDIMTPNRFDNMYYQNIPKGLGLLESDHGLYSDPRTRPFVD LYARDQDLFFKDFARAMQKLSLFGVKTGRRGEIRRRCDAIN
SEQ ID Nr. 26:
DDESNYGGQGKLFPGFYSSSCPKAEEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLL LDSSGS IVTEKNSNPNSRSARGFEVVDEIKAALENECPNTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWM VPLGRRDSTSASLSGSNNNIPAPNNTFNTILSRFNSQGLDLTNVVALSGSHTIGFSRCTSFRQR LYNQSGNGSPDTTLEQSYAANLRHRCPRSGGDQNLSELDINSAGRFDNSYFKNLIENMGLLNSD QVLFSSNDESRELVKKYAEDQEEFFEQFAESMVKMG I SPLTGSSGQIRKNCRKINS
SEQ ID Nr. 27:
RRPRVGFYGNRCRKVES IVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMYFHDCFVNGCDGS ILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPS ID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAI IER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN
SEQ ID Nr. 28:
RRPRVGFYGNRCRKVES IVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMHFHDCFVNGCDGS ILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPS ID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAI IER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN
SEQ ID Nr. 29:
DKSYGGKLFPGFYAHSCPQAGEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLLLDSS GRIVSEKGSNPNSRSARGFDVVDQIKAELEKQCPGTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWVVSLG RRDSRSASLSGSNNNIPAPNNTFQTILSKFNRQGLDVTDLVALSGSHTIGFSRCTSFRQRLYNQ SGNGRPDMTLEQSFAANLRQRCPRSGGDQILSVLDI I SAAKFDNSYFKNLIENKGLLNSDQVLF NSNEKSRELVKKYAEDQGEFFEQFAESMIKMGNI SPLTGSSGEIRKNCRKINS
SEQ ID Nr. 30:
DKSYGGKLFPGFYAHSCPQAGEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLLLDSS GKIVSEKGSNPNSRSARGFDVVDQIKAELEKQCPGTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWVVSLG RRDSRSASLSGSNNNIPAPNNTFQTILSKFNRQGLDVTDLVALSGSHTIGFSRCTSFRQRLYNQ SGNGRPDMTLEQSFAANLRQRCPRSGGDQILSVLDI I SAAKFDNSYFKNLIENKGLLNSDQVLF SSNEKSRELVKKYAEDQGEFFEQFAESMIKMG I SPLTGSSGEIRKNCRKI S
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst oder besteht die erfindungsgemäße Peroxidase aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
SEQ ID Nr. 31 (Arabidopsis thaliana Peroxidase 34) :
QLTPTFYDRSCPNVT IVRETIVNELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVERACPRTVSCADMLTIAAQQSVTLAGGP SWRVPLGRRDSLQ AFLELANANLPAPFFTLPQLKASFRNVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCQF ILDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNRSALVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKERKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRAYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPTTGTQGQIRLNCRVVNSNSLLHDVVDIVDFV SSM
SEQ ID Nr. 32 („Soybean peroxidase"):
QLTPTFYRETCPNLFP IVFGVIFDASFTDPRIGASLMRLHFHDCFVQGCDGSVLLNNTDTIESE QDALPNINS IRGLDVVNDIKTAVENSCPDTVSCADILAIAAEIASVLGGGPGWPVPLGRRDSLT ANRTLANQNLPAPFFNLTQLKASFAVQGLNTLDLVTLSGGHTFGRARCSTF INRLYNFSNTGNP DPTLNTTYLEVLRARCPQNATGDNLTNLDLSTPDQFDNRYYSNLLQLNGLLQSDQELFSTPGAD TIP IVNSFSSNQNTFFSNFRVSMIKMGNIGVLTGDEGEIRLQCNFVNGDSFGLASVASKDAKQK LVAQSK
SEQ ID Nr. 33 („Lignin-forming anionic tobacco peroxidase"):
QLSATFYDTTCPNVTS IVRGVMDQRQRTDARAGAKI IRLHFHDCFVNGCDGSILLDTDGTQTEK DAPANVGAGGFDIVDDIKTALENVCPGVVSCADILALASEIGVVLAKGPSWQVLFGRKDSLTAN RSGANSDIPSPFETLAVMIPQFTNKGMDLTDLVALSGAHTFGRARCGTFEQRLFNFNGSGNPDL TVDATFLQTLQGICPQGGNNGNTFTNLDI STPNDFDNDYFTNLQSNQGLLQTDQELFSTSGSAT IAIVNRYAGSQTQFFDDFVSSMIKLGNI SPLTGTNGQIRTDCKRVN
SEQ ID Nr. 34 („Suberization-associated anionic tomato
peroxidase") :
GVAIYRNTYEAI IMNNGSLLQNASPHFDSLESGVAS ILTLNNKKRNSDMYLRQQLTPEACVFSA VRGVVDSAIDAETRMGASLIRLHFHDCFVDGCDGGILLDDINGTFTGEQNSPPNANSARGYEVI AQAKQSVIDTCP I SVSCADILAIAARDSVAKLGGQTYNVALGRSDARTANFTGALTQLPAPFD NLTVQIQKFNDKNFTLREMVALAGAHTVGFARCSTVCTSGNVNPAAQLQCNCSATLTDSDLQQL DTTPTMFDKVYYDNLNNNQGIMFSDQVLTGDATTAGFVTDYSNDVSVFLGDFAAAMIKMGDLPP SAGAQLEIRDVCSRVNPTSVASM
SEQ ID Nr. 35 („Barley peroxidase 1") :
QLSPTFYDTSCPRALATIKSGVMAAVTSDPRMGASLLRLHFHDCFVQGCDASVLLSGMEQNAIP NAGSLRGFGVIDS IKTQIEAICKQTVSCADILTVAARDSVVALGGPSWTVPLGRRDS IDANENE ANTDLPGFNSSRAELEAAFLKKGGLNTVDMVALSGAHTIGQAQCSTFRARIYGGDT INAAYAA SLRANCPQTVGSGDGSLANLDTTTANTFDNAYYTNLMSQKGLLHSDQVLFNNDTTDNTVRNFAS NPAAFSSSFTTAMIKMGNIAPKTGTQGQIRLSCSRVNS
SEQ ID Nr. 36 („Cationic peanut peroxidase 1") :
QLSSNFYATKCPNALSTIKSAVNSAVAKEARMGASLLRLHFHDCFVQGCDASVLLDDTSNFTGE KTAGPNANS IRGFEVIDTIKSQVESLCPGVVSCADILAVAARDSVVALGGASWNVLLGRRDSTT ASLSSANSDLPAPFFNLSGLI SAFSNKGFTTKELVTLSGAHTIGQAQCTAFRTRIYNESNIDPT YAKSLQANCPSVGGDTNLSPFDVTTPNKFDNAYYINLRNKKGLLHSDQQLFNGVSTDSQVTAYS NNAATFNTDFGNAMIKMGNLSPLTGTSGQIRTNCRKTN
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung umfasst die zweite Domäne mindestens ein an eine Fc-Region des Antikörpers bindendes Peptid oder
Polypeptid, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G und Varianten davon.
Das mindestens eine, vorzugsweise die mindestens zwei, noch mehr bevorzugt die mindestens drei, noch mehr bevorzugt die mindestens vier, an einen Antikörper bindenden Peptide oder
Polypeptide binden vorzugsweise an eine Fc-Region eines
Antikörpers. Ausgewählt sind derartige Peptide bzw. Polypeptide aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G bzw. Varianten davon.
Protein G weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf:
TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASE LTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPE VIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFT VTE (SEQ ID Nr. 73) Protein A weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf:
AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKF NKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQN AFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEIL HLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLT EEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNK KPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPG DTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPET (SEQ ID Nr. 74)
In einer alternativen Ausführungsform kann das mindestens eine Antikörper bindende Peptid oder Polypeptid an den variablen Bereich der leichten Ketten von Antikörpern binden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zweite Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins daher Protein L, Protein M oder eine Variante davon.
Protein L weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf:
KEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDNGEYTVDVA DKGYTL IKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDN GEYTVDVADKGYTL IKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRY ADLLAKENGKYTVDVADKGYTL IKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFAE ATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTI IRFAGKKVDEKPEEKEQVTIKE IYFEDGTVQT ATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAG (SEQ ID Nr. 75)
Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper bindenden Peptide bzw. Polypeptide sind vorzugsweise Fragmente derselbigen, die in der Lage sind, an einen Antikörper zu binden. Die Bindungsstärke dieser Varianten bzw. Fragmente kann dabei maximal 80%,
vorzugsweise maximal 60%, noch mehr bevorzugt maximal 50%, noch mehr bevorzugt maximal 40%, noch mehr bevorzugt maximal 20%, geringer sein als das Antikörper bindende Peptid oder Polypeptid von dem diese abgeleitet sind. Diese Bindungsstärke kann mit herkömmlichen Bindungsassays bestimmt werden.
Strukturell können sich die Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper bindenden Peptide bzw. Polypeptide von den Peptiden und Polypeptiden, von denen diese Varianten abgeleitet sind, auch in der Aminosäuresequenz unterscheiden. Vorzugsweise weisen diese Varianten mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt
mindestens 95%, insbesondere mindestens 99%, Identität zu den Antikörper bindenden Peptiden und Polypeptiden, von denen diese Varianten abgeleitet sind, auf.
„Identität" zweier oder mehrerer Amino- oder
Nukleinsäuremolküle bedeutet, dass die Sequenzen der Moleküle einen gewissen Grad an Sequenzähnlichkeit teilen, wobei die Sequenzen teilweise identisch sind. Erfindungsgemäß kann die Identität zweier oder mehrere Aminosäure- oder
Nukleinsäuremoleküle mit bekannten Algorithmen bestimmt werden. Besonders bevorzugt wird dabei der Algorithmus von Needleman und Wunsch (J Mol Biol 48 ( 1970 ) : 443 ) verwendet. Deshalb werden
Programme, die auf diesem Algorithmus
basieren, bevorzugt. Die Applikation „Needle", beispielsweise, ist Teil der "The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)" (Trends in Genetics 16 (2000) : 276) . Daher erfolgen die Berechnungen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität vorzugsweise mit dem Programm „Needle", vorzugsweise über den gesamten Bereich der Sequenzen. Die folgenden
Standardeinstellungen werden für den Vergleich von Sequenzen mit „Needle" verwendet: Matrix: EBLOSUM62, Gap opening penalty:
10.0, Gap extension penalty: 0.5.
Das Antikörper bindende Peptid bzw. Polypeptid kann selbst ein Antikörper oder Antikörperfragment sein. Daher umfasst die zweite Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins einen
Antikörper oder ein Antikörperfragment. Das Antikörperfragment umfasst vorzugsweise jene Bereiche eines Antikörpers, die in der Lage sind, an ein Epitop zu binden.
Zwischen der ersten Domäne und der zweiten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann ein Linker angeordnet sein, wobei besonders bevorzugt zwischen der ersten und zweiten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kein Linker
vorgesehen ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Linker 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 3, noch mehr bevorzugt 1 oder 2, Aminosäurereste. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am N-Terminus und/oder C-Terminus des Fusionsproteins ein Tag, vorzugsweise ein Affinitäts-Tag
vorgesehen ist.
Um die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins zu ermöglichen bzw. zu erleichtern, weist dieses am N-Terminus und/oder C-Terminus einen Tag auf. Ein „Tag" ist eine
Verbindung, insbesondere ein Peptid, das aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur eine Bindungsstelle für eine andere Moleküleinheit aufweist, die eine spezifische Bindung dieser anderen Moleküleinheit ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tag ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, StrepTagll und MBP-Tag.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst bzw. besteht das erfindungsgemäße Fusionsprotein eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
SEQ ID Nr. 37:
HHHHHHQLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDAS ILLDNT TSFRTEKDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLG RRDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYN FSNTGLPDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQEL FSSPNATDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSTYKLIL NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVT TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASE LTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE
SEQ ID Nr. 38:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAAS ILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGP SWRVPLGRRDSLQ AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRF IMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSTYKLILNGKTLK GETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVI NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVT TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am 5X- und/oder 3X-Ende des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäurequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid vorgesehen .
Um das erfindungsgemäße Fusionsprotein bei der Expression in einer Wirtszelle aus der Zelle auszuschleußen, umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid . Die
Nukleinsäuresequenz kodierend für das Sekretionssignalpeptid ist dabei „in frame" mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül verknüpft .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Sekretionssignalpeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sekretionssignalpeptiden des
Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors, eines
Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2
(„preScMfa2-proScMfa2") , des Präpeptids der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1 („acid Phosphatase 1"; „prePpPhol") , des Präpeptids der Trichoderma reesei Cellobiohydrolase 2"
(„preTrCbh2") , des Präpeptids des Homo sapiens Serumalbumin
(„preHsAlb") , des Präpeptids der Armoracia rusticana
Meerrettichperoxidase CIA („preArCIA") , des Präpeptids des
Kluyveromyces lactis Killertoxin („preKIKtx") , eines
Präpropeptids bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin
(„preKIKtx-proKIKtx") , Deletionsmutanten davon und Kombinationen davon. Im Falle des Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 1 ist eine Deletion der Aminosäuren N75-I70
(NSTNNGLLFINTTI; SEQ ID Nr. 70) gemeint, im Falle des
Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2 ist eine Deletion der Aminosäuren N52-I65 (NATASGLLFINTTI ; SEQ ID Nr. 71) gemeint. Die entsprechenden vollständigen
Aminosäuresequenzen lauten, wobei die unterstrichenen
Teilbereiche der Sequenzen deletiert werden können:
Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 1: MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLL FINTTIAS IAAKEEGVSLEKREAEA (SEQ ID Nr. 39)
Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2:
MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAI IGYLDFGGDHDIAFLPFSNATASGLLFINTT IAEAAEKEQNTTLAKREAVADA (SEQ ID Nr. 72)
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die Nukleinsäuresequenz für ein Sekretionssignalpeptid, welches eine der folgenden
Aminosäuresequenzen aufweist:
SEQ ID Nr. 39 (Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktor) :
MRFPS IFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLL FINTTIAS IAAKEEGVSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 40 (Deletionsmutante des Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors; „Da"):
MRFPS IFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSAS IAAKEE GVSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 41 (Präpeptid der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1, „prePpPhol") :
MFSP ILSLEI ILALATLQSVFA
SEQ ID Nr. 42 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus P.
pastoris „Acid Phosphatase 1" und dem Propeptid einer
Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „prePpPhol-proDa") :
MFSP ILSLEI ILALATLQSVFAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSAS IAA KEEGVSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 43 (Präpeptid der Trichoderma reesei
„Cellobiohydrolase 2"; „preTrCbh2") MIVGILTTLATLATLAASVPLEER
SEQ ID Nr. 44 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus
Trichoderma reesei „Cellobiohydrolase 2" und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; ,,preTrCbh2-proDa" )
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSAS I AAKEEGVSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 45 (Präpeptid des Homo sapiens Serumalbumin;
„preHsAlb") :
MKWVTFISLLFLFSSAYS
SEQ ID Nr. 46 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Homo sapiens Serumalbumin und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preHsAlb-proDa") :
MKWVTFI SLLFLFSSAYSAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSAS IAAKEEG VSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 47 (Präpeptid der Armoracia rusticana
Meerrettichperoxidase CIA; „preArCla") :
MHFSSSSTLFTCITLIPLVCLILHASLSDA
SEQ ID Nr. 48 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Armoracia rusticana Meerrettichperoxidase CIA und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preArCla-proDa") :
MHFSSSSTLFTCITLIPLVCLILHASLSDAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVL PFSAS IAAKEEGVSLEKREAEA
SEQ ID Nr. 49 (Präpeptid des Kluyveromyces lactis Killertoxin; „preKIKtx") :
MNIFYIFLFLLSFVQGL SEQ ID Nr. 50 (Präpropeptid bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin; „preKIKtx-proKIKtx" ) :
MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLVKR
SEQ ID Nr. 51 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus
Kluyveromyces lactis Killertoxin und dem Propeptid einer
Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preKIKtx-proDa") :
MNIFYIFLFLLSFVQGLAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSAS IAAKEEGV SLEKREAEA
SEQ ID Nr. 52 (Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2; „preScMfa2-proScMfa2") :
MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAI IGYLDFGGDHDIAFLPFSNATASGLLFINTT IAEAAEKEQNTTLAKREAVADA
SEQ ID Nr. 53 (Deletionsmutante des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2; „preScMfa2-proDa2") :
MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAI IGYLDFGGDHDIAFLPFSAEAAEKEQNTTLA KREAVADA
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst oder besteht das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül aus einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 56 und SEQ ID Nr. 57.
SEQ ID Nr. 54:
ATGAGATTCCCATCTATTTTCACCGCTGTCTTGTTCGCTGCCTCCTCTGCATTGGCTGCCCCTG TTAACACTACCACTGAAGACGAGACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCAGTTATCGGTTACTCTGA CCTTGAGGGTGATTTCGACGTCGCTGTTTTGCCTTTCTCTGCTTCCATTGCTGCTAAGGAAGAG GGTGTCTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCACCATCACCACCATCACCAACTTACTCCAA CCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATT GAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAAC GGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCG GTAATGCCAACTCTGCTAGAGGATTTCCAGTCATTGACAGAATGAAGGCTGCCGTTGAATCTGC ATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTA GCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACC TTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAA CGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAAC CAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTC TGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCT GGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAA CAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTC CATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGA CAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTT GTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTA CTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGT TGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTC ATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTT TGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATA CGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGACTTACGATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTT ACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAG TCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGA AAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCT ACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG
SEQ ID Nr. 55:
CACCATCACCACCATCACCAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCA ACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTT GAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACT ACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTAGAGGATTTCCAGTCA TTGACAGAATGAAGGCTGCCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCT GACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGT CGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTA CCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGC CTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAAC TTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTT TGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTT CGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTG TTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAA CCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTAC TCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTG AACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGG TCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAA AACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACT ACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATG CTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGAC TTACGATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAG TTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTA CTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGG TGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG
SEQ ID Nr. 56:
ATGAGATTCCCATCTATTTTCACCGCTGTCTTGTTCGCTGCCTCCTCTGCATTGGCTGCCCCTG TTAACACTACCACTGAAGACGAGACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCAGTTATCGGTTACTCTGA CCTTGAGGGTGATTTCGACGTCGCTGTTTTGCCTTTCTCTGCTTCCATTGCTGCTAAGGAAGAG GGTGTCTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTT GTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTAT TGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATC TTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTA GAGGATTTCCAGTCATTGACAGAATGAAGGCTGCCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTC ATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGG AGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGC CTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATC ATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATG GATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGC AAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCG TACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAA TCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCG CAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTAC TCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACT TACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTG CCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTA CGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTA ACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCA CTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGT TGACGGAGAGTGGACTTACGATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTT ATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCT TGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTA CGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTC ACCGAG
SEQ ID Nr. 57:
CAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCA TTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGA CTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAG AAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTAGAGGATTTCCAGTCATTGACAGAATGAAGGCTG CCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCA ATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAA GCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAG ACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACAC CTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTG CCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAA ATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGT CAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCT ACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCG TCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATT GAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAG GGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCA ACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGA GAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATC AACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGG TCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGACTTACGATGACGCTACTAA GACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACT ACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATG CCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGAC CTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß der
vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann Teil eines Vektors sein. Der Begriff „Vektor" umfasst dabei jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z. B.
ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder in eukaryotische Wirtszellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert . Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide oder Virusgenome. Ein Vektor ist somit ein Nukleinsäuremolekül , das in der Lage ist, ein anderes
Nukleinsäuremolekül , wie die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Fusionsprotein, an die es gebunden ist, zu transportieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül operativ an einen Promotor gebunden oder umfasst einen Promoter, der in der Lage ist, das vom Nukleinsäuremolekül kodierte Fusionsprotein zu steuern.
Um die Expression des vom erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekül kodierten Fusionsproteins zu steuern, ist dieses operativ an einem Promoter gebunden. Der Begriff
„operativ verbunden" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verbindung zwischen der Promotersequenz und des zu exprimierenden Nukleinsäuremoleküls , so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des Nukleinsäuremoleküls zu
initiieren .
Der Begriff „Promoter" bezieht sich auf eine
Kontrollsequenz, die sich stromaufwärts („upstream") vom
Transkriptionsstart eines Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verbundenen
Nukleinsäure gesteuert wird. Das erfindungsgemäße
Nukleinsäuremolekül bildet mit dem Promotor und gegebenenfalls weiteren Elementen (wie z.B. Terminatorsequenzen) eine
Expressionskassette, die ebenfalls Teil eines Vektors sein kann.
Erfindungsgemäß kann ein beliebiger Promoter verwendet werden, vorausgesetzt er ermöglicht die Expression des
erfindungsgemäßen Fusionsproteins in einer geeigneten
Wirtszelle. Der Promoter kann dabei induzierbar oder konstitutiv sein .
Als Promotoren, welche sich erfindungsgemäß eignen in
Wirtszellen, wie Hefezellen, die Expression eines Gens zu steuern, können beispielsweise AUG1, AOD, ENOl, GPMl, HSP82, ICL1, ILV5, GPD1, PX6, TEF, CUPl, PGK, GAPl, TPI, PH05, AOXl, A0X2, DAS, FLD1, GAL10/CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT Promotoren oder Kombinationen oder Varianten der vorstehend genannten Promotoren eingesetzt werden (siehe z.B. Vogl T und Glieder A, New Biotechnology 30 (2013) : 385-404, insbesondere Tabelle 1 von Vogl T und Glieder A) . Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß ein AOXl Promoter bzw. Varianten davon verwendet .
Besonders bevorzugte Promotorvarianten sind in der
WO 2006/089329 beschrieben und umfassen Mutationen (z.B.
Deletionen, Substitutionen) der Nukleotide 170 to 235,
Nukleotide 170 to 191, Nukleotide 192 to 213, Nukleotide 192 to 210, Nukleotide 207 to 209, Nukleotide 214 to 235, nucleotides 304 to 350, Nukleotide 364 to 393, Nukleotide 434 to 508,
Nukleotide 509 to 551, Nukleotide 552 to 560, Nukleotide 585 to 617, Nukleotide 621 to 660, Nukleotide 625 to 683, Nukleotide 736 to, Nukleotide 737 to 738, Nukleotide 726 to 755, Nukleotide 784 to 800 oder Nukleotide 823 to 861 von Seq ID Nr. 58 (Wildtyp AOXl Promotor) und Kombinationen davon.
SEQ ID Nr. 58: ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccac aggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttg caaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagccca gttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgac tttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaac aagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagt ttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaa aagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtca aaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaa aaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgcc gaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgctt ccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaa cccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatc atcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacga cttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc
Der erfindungsgemäße Vektor kann als stabiler
Expressionsvektor, in einem künstlichen Chromosom oder durch Integration in das Chromosom in eine Wirtszelle eingebracht werden. Die Integration in das Chromosom kann erreicht werden, indem man einen Vektor verwendet, der sich als ganzes Element oder mit Teilen davon mit dem Chromosom der Hefe rekombiniert. Geeignete Vektoren können Nukleotidsequenzen enthalten, die mit Nukleotidsequenzen des Wirtszellen-Chromosoms homolog sind.
Ein erfindungsgemäßer Vektor kann einen selektierbaren
Marker enthalten. Die selektierbaren Marker sind häufig Gene, die Antibiotikaresistenz der Wirtszelle ermöglichen oder Gene, die in der Lage sind, jene Wirtszellen zu ergänzen, welche gut charakterisierte metabolische Mängel aufweisen, solche wie z. B. mangelhafte Mutanten in Histidin. Die bevorzugten selektierbaren Marker inkludieren URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 oder Gene, die für eine Antibiotikaresistenz kodieren. Der Vektor kann auch einen Replizierungsursprung haben, der in der Lage ist
Replikation des Vektors in einer Wirtszelle zu vermitteln.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zelle bzw. eine Wirtszelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. Vektoren werden vorzugsweise in Zellen eingebracht, um diese Moleküle für Klonierungs zwecke , beispielsweise, zu vermehren bzw., um die Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in Wirtszellen zu ermöglichen.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede
Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure, vorzugsweise DNA oder RNA, transformierbar oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszelle" umfasst erfindungsgemäß prokaryotische (z.B. E.
coli) und eukaryotische Zellen (z.B. tierische Zellen,
Hefezellen und Insektenzellen) .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine
Hefezelle, wobei besonders bevorzugt methylotrophe Hefen und ganz besonders bevorzugt P. pastoris und Hansenula polymorpha verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfassend die Kultivierung einer Zelle wie oben definiert.
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann mit im Stand der Technik beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in methylotrophen Hefen, wie P. pastoris und Hansenula polymorpha.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Immunoassay, vorzugsweise in einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .
Da die erfindungsgemäßen Fusionsproteine einerseits in der Lage sind an Antikörper bzw. Fragmenten davon zu binden und andererseits Peroxidase-Aktivität aufweisen, eignen sie sich besonders gut für Immunoassays . In derartigen Assays werden üblicherweise die zu bestimmenden Analyten mit Antikörper oder Fragmenten davon markiert. An diese Antikörper bzw. an deren Fragmente können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine binden. Nach dem Entfernen der nicht gebundenen Fusionsproteine durch einen Waschschritt, wird ein Substrat aufgebracht, das von der ersten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins umgesetzt wird. Die Umsetzung des Substrats ist ein Maß dafür, wieviel Fusionsprotein und somit Analyt vorhanden ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Zielmoleküls in einer Probe umfassend die Schritte:
- Bereitstellen eines ersten an ein Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon, der auf einem festen Träger immobilisiert ist;
- Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper oder
Fragment davon,
- Aufbringen eines zweiten an das Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon;
- optionales Entfernen des zweiten Antikörpers oder
Fragments davon, der nicht an das Zielmolekül gebunden ist;
- Aufbringen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins;
- optionales Entfernen des Fusionsproteins, das nicht an den zweiten Antikörper oder des Fragments davon gebunden ist;
- Aufbringen eines nachweisbaren Peroxidasesubstrats auf den festen Träger; und
- Nachweisen der Umsetzung des Peroxidasesubstrats .
Wie bereits erwähnt eignet sich das erfindungsgemäße
Fusionsprotein hervorragend zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Zielmoleküls in einer Probe (z.B. in einem Verfahren wie in Engvall E et al . Immunochemistry 8 (1971) : 871-875
beschrieben) .
Dabei wird zunächst ein an ein Zielmolekül bindender
Antikörper oder Fragment davon auf einem festen Träger
immobilisiert. Dadurch wird es ermöglicht, dass das zu
bestimmende Zielmolekül spezifisch und indirekt auf dem festen Träger gebunden wird. Nach einem Waschschritt, bei dem nicht gebundene Probenbestandteile von der Oberfläche des festen
Trägers entfernt werden, werden weitere Antikörper oder
Fragmente aufgebracht, die ebenfalls in der Lage sind, das
Zielmolekül zu binden. Nach diesem Schritt bzw. nach einem optionalen Waschschritt wird das erfindungsgemäße Fusionsprotein mit dem festen Träger in Kontakt gebracht. Da das Fusionsprotein in der Lage ist an Antikörper zu binden, werden die am
Zielmolekül gebundenen Antikörper mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein „markiert". Nach dem Entfernen von nicht
gebundenem Fusionsprotein wird ein Substrat für Peroxidasen aufgebracht. Dieses üblicherweise farblose Substrat wird von der ersten Domäne des Fusionsproteins in ein färbiges Substrat umgesetzt. Die Umsetzung des Substrats zeigt das Vorhandensein des Zielmoleküls in der ursprünglichen Probe, wobei die
Umsetzung auch quantifizierbar ist.
Als Substrat für die mindestens eine Peroxidase bzw. des mindestens einen katalytisch aktiven Fragments davon können herkömmliche Peroxidase-Substrate eingesetzt werden. Besonders gut eignet sich dabei mindestens ein Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N- ( 4-Aminobutyl ) -N-Ethylisoluminol , 3- Amino-9-Ethylcarbazol, 4-Aminophthalhydrazid, 5- Aminosalicylsäure, 2,2'-Azino-bis ( 3-Ethylbenzothiazolin-6- Sulfonsäure) , 4-Chloro-l-Naphthol , 4-Chloro-7-Nitrobenzofurazan, 3, 3 ' -Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid, 3, 3 ' -Diaminobenzidin (DAB) , o-Dianisidin, Iodonitrotetrazoliumchlorid, Luminol,
Nitrotetrazolium Blue Chlorid, o-Phenylenediamin, Trans-5- Phenyl-4-Pentenyl-Hydroperoxid, Pyrogallol, 3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidin, Tetranitroblue Tetrazolium Chlorid und 2 , 3 , 5-Triphenyltetrazoliumchlorid, Phenol, Indol-3-Essigsäure, Guaiacol, Wasserstoffperoxid, 1- ( 4 , 5-Dimethylthiazol-2-yl ) -3 , 5- diphenylformazan, Tetrazolium Violet und Kombinationen davon. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set umfassend ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und einen an ein Zielmolekül bindenden Antikörper oder ein Fragment davon.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und des folgenden Beispiels näher illustriert ohne jedoch
einschränkend zu sein.
Fig. 1 zeigt rekombinante SpG-HRP Fusionskonstrukte mit bzw. ohne Hexahistidin-Tag (6x H) oder Pentaglycin-Linker (5x G) ; N- terminale Fusionen von SpG (gepunktet) an HRP (ausgefüllt) ; C- terminale Fusionen von SpG (gepunktet) an HRP (ausgefüllt) (A= SpG-HRP; B= 6xH-SpG-HRP; C= SpG-5xG-HRP ; D= 6xH-SpG-5xG-HRP ; E= HRP-SpG; F= 6xH-HRP-SpG) .
Fig. 2 zeigt die Produktion und Aufreinigung eines
rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins. A, Volumetrische
(schwarze Quadrate) und spezifische (graue Dreiecke) HRP- Aktivitäten aus Bioreaktor-Kultivierungen. B,
Größenausschlusschromatogramm von HRP-SpG nach Ni2+
Affinitätschromatographie; durchgehende schwarze Linie, A403;
gepunktete graue Linie, A280.
Fig. 3 zeigt die Detektion von Antigenen durch rekombinantes HRP-SpG Fusionsprotein in direktem ELISA. IgGs von Humanserum (Karo) oder von Hasen-Serum (Quadrat) wurden in Konzentrationen von 20 - 0.01953125 pg/mL als Antigene verwendet. HRP-SpG wurde mit einer Konzentration von 0.1 pg/mL verwendet. Die
Fehlerbalken sind Standardabweichungen aus Triplikatmessungen .
Fig.4 zeigt die Screening Landscapes sechs verschiedener Fusionsproteinkonstrukte aus HRP und SpG mit oder ohne
Hexahistidin-Tag oder Pentaglycin-Linker aus Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab (A= SpG-HRP; B= 6xH-SpG-HRP ; C= SpG-5xG-HRP ; D= 6xH-SpG-5xG-HRP; E= HRP-5xG-SpG; F= HRP-SpG) . Hellgraue Balken sind gemessene Enzymaktivitäten produzierter unmodifizierter Wildtyp-HRP als Positivkontrollen. Schwarze Balken rechts davon sind gemessene Enzymaktivitäten der angegebenen produzierten Fusionsproteinkonstrukte durch verschiedene Transformanten.
BEISPIEL:
Material und Methoden
Stämme und Vektoren
P. pastoris Stämme basierten auf dem Stamm CBS 7435 (ident mit NRRL Y-11430 und ATCC 76273) mit Muts Phänotyp. Als Produktionsstamm für die Herstellung von rekombinanten Proteinen wurde PpFWK3 verwendet (Krainer FW, et al . Sei. Rep .
3 (2013) : 3279-91) . Das Nukleinsäuremolekül codierend das aus drei IgG-Bindungsdomänen bestehende SpG Polypeptid ( Streptococcal protein G; Olsson A, et al . Eur. J. Biochem. 168 ( 1987 ) : 319-24 ; Goward CR, et al . Biochem. J. 267 (1990) : 171-7) wurde Codon- optimiert und als sogenannter "gBlock" als synthetisches
Oligonukleotid bestellt (Integrated DNA Technologies, Belgien):
CTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCACCATCACCACCATCACACTTACAAGTTGATCCTGAACG GAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTT CAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACT TTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCT ACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGC AACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGACTTAC GATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGA CTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTAC CAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTG GATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAGGGAGGAGGTGGTG GACAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTG (SEQ ID Nr. 59)
Sechs Fusionskonstrukte von SpG und HRP CIA
(Meerrettichperoxidase CIA; UniProt ID: K7ZWW6) wurden mit oder ohne Hexahistidin-Tag bzw. Pentaglycin-Linker mit den Primern aus Tabelle 1 erstellt (siehe Fig. 1) .
Tabelle 1. Oligonukleotidprimer .
Name Sequenz SEQ ID Nr. mySpGfw atatCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTACTTACAAGTT 60
GATCCTGAACGGA
mySpG_NHISfw atatCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAG 61
mySpGrvl CAAGAGTTATCGTAGAAGGTTGGAGTAAGTTGCTCGGTG 62
ACGGTGAAGGTCTTAG
mySpGrv2 CAAGAGTTATCGTAGAAGGTTGGAGTAAGTTG 63
oePCR_ClAfw CAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTC 64
oePCR_ClArv atatGCGGCCGCATTATGAGTTAGAG 65
ClArv TGAGTTAGAGTTGACAACACG 66
SpG5fw CGTGTTGTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTG 67 AACGGA
SpG6fw CGTGTTGTCAACTCTAACTCAGGAGGAGGTGGTGGAACT 68
TACAAGTTGATCCTGAACGGA
SpGsCterm_rv atatGCGGCCGCATTACTCGGTGACGGTGAAGGTCTTA 69
Produktion, Aufreinigung und Charakterisierung von HRP-SpG
Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab wurden in Deep-Well- Platten durchgeführt. Die Stämme wurden in 250 pL BMD1%
Minimalmedium (25 μΜ Hemin, 11 g/L alpha-D (+) -glucose
monohydrate, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D(+) -Biotin, 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0) bei 28 °C, 320 rpm
(„revolutions per minute"; Umdrehungen pro Minute) und 80%
Luftfeuchtigkeit gezüchtet. Nach ca. 60 h, wurde die
rekombinante Expression durch Zugabe von 250 pL BMM2 (1% v/v Methanol, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D(+) -Biotin, 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0) induziert. Nach ca. 10, 24 und 48 h folgten drei Zugaben von 50 pL BMM10 (5% v/v Methanol, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D(+) -Biotin, 0.1 M
Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0) . Ca. 72 h nach BMM2-Zugabe wurden die Zellen bei 3220 x g für 15 min abzentrifugiert (Weis R, et al. FEMS Yeast Res. 5 (2004) : 179-189; Krainer FW, et al . Microb. Cell Fact. 14 (2015) :4). HRP Aktivität wurde durch Mischung von 15 pL Kulturüberstand mit 140 pL Assay-Lösung (1 mM ABTS, 0.9 mM H2O2, 50 mM Natriumacetat , pH 4.5) in einer Mikrotiterplatte über einen Absorptionsanstieg bei 405 nm bestimmt (Morawski B, et al . Protein Eng. 13 (2000) : 377-384) .
Bioreaktorkultivierungen wurden in 1.2 L-Biostat® B- Bioreaktoren (Sartorius) durchgeführt. NH4OH wurde sowohl als Stickstoffquelle als auch als pH-Regulator verwendet, um einen pH-Wert von 6 zu erhalten. Ein dC>2-Mindestlevel von 30% wurde durch Kaskadenkontrolle festgelegt. Eine 50 mL-Vorkultur wurde zwei Tage lang bei 28 °C, 90 rpm und 80% Luftfeuchtigkeit kultiviert und zur Inokulation einer Batch-Kultur in 450 mL autoklaviertem BSM Medium mit 2.18 mL PTM1 Lösung und 2.18 mL 200 mg/L D (+) -Biotinlösung benützt. Nach Verbrauch des Glycerins
(erkennbar durch einen steten dC>2-Anstieg) wurde eine Glycerin- Fedbatch-Kultur gestartet (Zugabe von 34.5 g Glycerin über 7 h) . Nach Zugabe von 30 pM Hemin, wurden 60.4 g Methanol über 136.6 h zugegeben, um die PAOXl-regulierte Expression zu induzieren. Die Zellen wurden bei 17700 x g für 40 min abzentrifugiert und der Überstand durch 0.2 μΜ Zelluloseacetat-Filter (Sartorius) filtriert .
Proteinkonzentration und Pufferwechsel wurden mit Vivaflow® 50-Kassetten (30 kDa Molekulargewichtsausschlussgrenze) und
Vivaspin® 20-Zentrifugalkonzentratoren (3 kDa
Molekulargewichtsausschlussgrenze) (Sartorius) durchgeführt. Vor Ni2+ Affinitätschromatographie auf einer HisTrap FF Säule (GE Healthcare) wurde der Puffer zu Kalzium-hältiger Tris- gepufferter Salzlösung (Ca-TBS; 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5 eingestellt mit HCl) gewechselt und ankonzentriert. Die Säulen wurden mit mindestens 5 Säulenvolumina gewaschen. Die Elution wurde mit 100 mM Imidazol in Ca-TBS durchgeführt.
Elutionsfraktionen wurden vereint, zu <1 mL ankonzentriert und auf eine HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 prep grade Säule (GE
Healthcare) zur Größenausschlusschromatographie bei einem Fluss von 0.3 mL/min mit Ca-TBS geladen.
Direkter ELISA wurde mit humanen IgGs oder mit Hasen-IgGs als Antigenen durchgeführt. Durchsichtige MICROLON® high-binding Mikroplatten (Greiner Bio-One) wurden mit 100 pL IgGs mit
Konzentrationen von 20 - 0.01953125 pg/mL in Bindepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0) bei 4 °C über Nacht oder bei 37 °C für 2 h inkubiert. Die Wells wurden dreimal für 5 min bei 600 rpm auf einer Schüttelplattform mit Waschpuffer (0.05% v/v Tween® 20, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5) gewaschen. Blocking wurde durch Inkubation mit 200 pL Blocking-Puffer (1.5% w/v BSA in Waschpuffer) bei 37 °C für 1 h erreicht, gefolgt von drei
Waschschritten. Binden der IgGs durch HRP-SpG Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 100 pL 0.1 pg/mL HRP-SpG (verdünnt in Blocking-Puffer) und Inkubation bei 25 °C für 1 h erreicht, gefolgt von sechs Waschschritten. Nach 15 min Inkubation mit 100 pL Detektionslösung (0.5 mM TMB, 2.9 mM H202 in 50 mM
Natriumeitratpuffer, pH 5.5) und anschließender Zugabe von 100 pL 1 M H2S04 wurden die gebundenden Antigene durch
Absorptionsmessung bei 450 nm detektiert.
Ergebnisse
Rekombinante Fusionsproteine zwischen HRP und SpG weisen eine konstante 1:1 Stöchiometrie auf und sind daher homogener und reproduzierbarer als Konjugate beider Polypeptide. Sechs Fusionsproteinkonstrukte aus HRP und SpG (siehe Fig. 1) wurden generiert und in Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab nach HRP Aktivität gescreent (siehe Fig. 4) . Im Falle einer Fusion von SpG an HRP zeigten drei N-terminale Fusionskonstrukte (SpG-HRP, 6xH-SpG-HRP, SpG-5xG-HRP) nur kaum detektierbare HRP Aktivität. Die Transformation von Konstrukten, bei denen SpG an den C- Terminus der HRP fusioniert war, resultierte überraschenderweise in P. pastoris Stämmen, die Proteine mit einer bis zu 6-mal höheren HRP Aktivität produzierten als Stämme, die Wildtyp-HRP produzierten. Ein Konstrukt 6xH-HRP-SpG (SEQ ID Nr. 37) wurde mit vergleichbaren Ausbeuten produziert wie Konstrukt HRP-SpG (SEQ ID Nr. 38) und wurde für die weiteren Experimente
ausgewählt .
Um ausreichende Mengen für Funktionstests des
Fusionsproteins zu produzieren, wurde der entsprechende Stamm in einem 1,2 L-Bioreaktor kultiviert. Nach insgesamt 160 h Kultur (136 h davon unter Methanol-Induktion) wurden die volumetrischen und spezifischen HRP-Aktivitäten bestimmt. Die finale
volumetrische Aktivität lag bei 183 U/mL, die spezifische
Aktivität bei 227 U/mg (Fig. 2A) . Beide Aktivitäten stiegen auch am Ende der Kultivierung noch an, weshalb bei längerer
Kultivierung sogar noch höhere Ausbeuten erreicht werden können. Basierend auf einer spezifischen Aktivität von 1624±175 U/mg des aufgereinigten Fusionsproteins wurden ca. 113 mg/L des aktiven Fusionsproteins in der Kultur produziert.
Nach Ni2+ Affinitätschromatographie wurde
Größenausschlusschromatographie zur finalen Aufreinigung
durchgeführt. Die Elution von Protein und Häm wurde über die Absorptionen bei 280 bzw. 403 nm verfolgt. Das Häm-hältige
Protein eluierte in einem kleineren ersten und einem
dominanteren Hauptpeak (Fig. 2B) , welche zwei verschiedene
Glycospezies desselben Proteins darstellten. Die beiden Spezies können entweder kombiniert werden, um die Ausbeute funktioneller HRP-SpG zu maximieren, oder der erste kleinere Peak kann
verworfen werden, um die Homogenität der Präparation zu
maximieren .
Um das funktionelle Binden des HRP-SpG Fusionsproteins an IgGs zu zeigen, wurden direkte ELISAS mit immobilisierten IgGs aus menschlichem Serum oder Hasen-Serum als Antigene
durchgeführt. In beiden Fällen konnte ein Konzentrations¬ abhängiges Signal beobachtet werden (Fig. 3) . Dies deutet auf Bindung des rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins an die IgGs der beiden Spezies hin. Fusionsproteine aus beiden
Größenausschluss-Peaks zeigten äquivalente HRP-Aktivitäten und IgG-Bindeverhalten . Folglich handelte es sich bei beiden Spezies tatsächlich um funktionelles Fusionsprotein.
Dieses Beispiel zeigt, dass Fusionskonstrukte von HRP and SpG besonders gut von Wirtszellen wie P. pastoris sekretiert werden, wenn das SpG an den C-Terminus von HRP fusioniert wird. Im Bioreaktor konnte eine Ausbeute von über 110 mg/L
Fusionsprotein erreicht werden. Üblicherweise wird HRP Aktivität von P. pastoris in deutlich geringeren Ausbeuten von unter 10 mg/L (Morawski B, et al . Biotechnol. Bioeng. 76 (2001) : 99-107) produziert. Direkte ELISAS mit IgGs aus zwei Säugetier-Spezies bestätigten zudem die Anwendbarkeit des produzierten
rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins in der Immunohistochemie .

Claims

Patentansprüche :
1. Fusionsprotein umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase oder mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid oder Polypeptid umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne fusioniert ist.
2. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Peroxidase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Meerrettichperoxidase, Peroxidasen aus Acker-Schmalwand,
insbesondere Arabidopsis thaliana peroxidase 34, Peroxidasen aus Sojabohnen, insbesondere So jabohnen-Peroxidase, Peroxidasen aus Tabak, insbesondere Lignin-formende anionische Tabak-Peroxidase, Peroxidasen aus Tomaten, insbesondere „suberization-associated anionic tomato peroxidase, Peroxidasen aus Gerste, insbesondere Gersten-Peroxidase 1, und Peroxidasen aus Erdnüssen,
insbesondere kationische Erdnuss Peroxidase 1.
3. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die zweite Domäne mindestens ein an eine Fc-Region des Antikörpers bindendes Peptid oder Polypeptid, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G und Varianten davon, umfasst.
4. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass umfasst die zweite Domäne Protein L,
Protein M oder eine Variante davon.
5. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass das die zweite Domäne ein Antikörper oder Antikörperfragment ist.
6. Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der ersten Domäne und der zweiten Domäne ein Linker angeordnet ist.
7. Fusionsprotein gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 3, noch mehr bevorzugt 1 oder 2, Aminosäurereste umfasst.
8. Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass am N-Terminus und/oder C-Terminus des
Fusionsproteins ein Tag, vorzugsweise ein Affinitäts-Tag
vorgesehen ist.
9. Fusionsprotein gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Tag ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, StrepTagll und MBP-Tag .
10. Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, dass am 5X- und/oder 3X-Ende des
Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäurequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid vorgesehen ist.
12. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, dass das Sekretionssignalpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alpha-Mating Faktor, Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors, eines Präpropeptids des
Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2, des Präpeptids der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1, des Präpeptids der Trichoderma reesei Cellobiohydrolase 2, des Präpeptids des Homo sapiens Serumalbumin, des Präpeptids der Ärmoracia rusticana Meerrettichperoxidase CIA, des Präpeptids des Kluyveromyces lactis Killertoxin, eines Präpropeptids bestehend aus
Kluyveromyces lactis Killertoxin.
13. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 12.
14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül operativ an einen Promotor gebunden ist.
15. Vektor nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.
16. Zelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 15.
17. Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine Hefezelle, noch mehr bevorzugt eine methylotrophe Hefezelle, noch mehr bevorzugt P. pastoris ist.
18. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfassend die Kultivierung einer Zelle gemäß Anspruch 16 oder 17.
19. Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem Immunoassay, vorzugsweise in einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
20. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines
Zielmoleküls in einer Probe umfassend die Schritte:
- Bereitstellen eines ersten an ein Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon, der auf einem festen Träger immobilisiert ist;
- Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper oder
Fragment davon,
- Aufbringen eines zweiten an das Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon;
- optionales Entfernen des zweiten Antikörpers oder
Fragments davon, der nicht an das Zielmolekül gebunden ist;
- Aufbringen eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9;
- optionales Entfernen des Fusionsproteins, das nicht an den zweiten Antikörper oder des Fragments davon gebunden ist;
- Aufbringen eines nachweisbaren Peroxidasesubstrats auf den festen Träger; und
- Nachweisen der Umsetzung des Peroxidasesubstrats .
21. Set umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen an ein Zielmolekül bindenden Antikörper oder eines Fragments davon.
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ATA50556/2015A AT517379B1 (de) 2015-06-26 2015-06-26 Fusionsprotein
ATA50556/2015 2015-06-26

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WO (1) WO2016207343A1 (de)

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