AT517379A1 - Fusionsprotein - Google Patents

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AT517379A1 ATA50556/2015A AT505562015A AT517379A1 AT 517379 A1 AT517379 A1 AT 517379A1 AT 505562015 A AT505562015 A AT 505562015A AT 517379 A1 AT517379 A1 AT 517379A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase oder mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid oder Polypeptid umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne fusioniert ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine umfassend Peroxidasen und Antikörper bindende Peptide Oder Polypeptide.
Großtechnisch werden Peroxidasen wie Meerrettichperoxidase vorwiegend durch Isolierung aus ihrer natürlichen Umgebung (z.B. Pflanzen) hergestellt. Die rekombinante Herstellung von Peroxidasen ist technisch zwar möglich, jedoch ist die Ausbeute derartiger Verfahren - im Vergleich zur Herstellung anderer rekombinanter Proteine wie Antikörper Oder Serumalbumin - eher gering. Da Peroxidasen jedoch in analytischen und biochemischen Verfahren technisch eingesetzt werden (z.B. bei der Polymerisation von Phenolen und aromatischen Aminen, bei der Papierherstellung), ist es wünschenswert Peroxidasen in ausreichender Menge mit effizienten und kostengünstigen Verfahren herzustellen. Peroxidasen wie Meerrettichperoxidase werden auch bei bestimmten molekularbiologischen Verfahren zur Detektion von Proteinen und Nukleinsäuren (z.B. „Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA), Western Blot, Southern Blot) verwendet. In derartigen Verfahren werden Peroxidasen häufig an Molekülen konjugiert, die ihrerseits in der Lage sind an Antikörper Oder Antikörperfragmenten zu binden (z.B. Protein G und Protein A).
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verfahren und Mittel zur Überexpression von enzymatisch aktiven Peroxidasen bereitzustellen, die es ermöglichen Peroxidasen in einer höheren Ausbeute zu exprimieren als vergleichbare im Stand der Technik üblicherweise eingesetzte Expressionssysteme. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Konstrukte und Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, die Peroxidase-Aktivität aufweisen und in der Lage sind an einen Antikörper Oder Fragment davon zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase Oder mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid Oder Polypeptid umfasst, wobei der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne fusioniert ist.
Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass Peroxidasen Oder katalytisch aktive Fragmente davon besonders gut exprimiert werden können, wenn diese an ein Antikörper bindendes Peptid Oder Polypeptid fusioniert ist. Die enzymatische Aktivität von Peroxidasen Oder katalytisch aktiven Fragmenten davon in Fusionsproteinen, in denen der C-Terminus der Peroxidase bzw. eines katalytisch aktiven Fragments davon an den N-Terminus des Antikörper bindenden Peptids Oder Polypeptids gebunden ist, bleibt dabei zumindest erhalten und kann gegebenenfalls sogar gesteigert werden. Wird hingegen der N-Terminus der ersten Domäne an den C-Terminus der zweiten Domäne fusioniert, wird die katalytische Aktivität der ersten Domäne im Vergleich zum erfindungsgemäßen Fusionsprotein signifikant reduziert Oder gänzlich unterdrückt.
Antikörper bindende Peptide und Polypeptide sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Protein G). Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide und Polypeptide können auch Fragmente von Polypeptiden und Proteinen sein, die selbst in der Lage sind, an Antikörper zu binden. Die Fähigkeit von Polypeptiden bzw. Peptiden Antikörper zu binden, kann durch herkömmliche Bindungsassays bestimmt werden.
Unter dem Begriff „Fusionsprotein" wird ein Protein bzw. Polypeptid verstanden, das wenigstens zwei Polypeptide, Peptide bzw. Domänen aufweist, wobei die einzelnen Protein- bzw.
Polypeptidketten kovalent über Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Erfindungsgemäß ist die erste Dömane mit der zweiten Domäne über eine Peptidbindung kovalent verbunden. „Fusioniert", wie hier verwendet, bedeutet, dass mindestens zwei Protein- bzw. Polypeptidketten über eine Peptidbindung miteinander verbunden sind. Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Der Begriff „Domäne", wie hier verwendet, bezeichnet eine definierte Region eines Proteins Oder Polypeptids, welches durch eine bestimmte Eigenschaft charakterisiert werden kann. Eine erfindungsgemäße Domäne weist vorzugsweise bestimmte biochemische Eigenschaften Oder Funktionalitäten, wie die katalytische Aktivität einer Peroxidase, auf. Eine weitere erfindungsgemäße Domäne zeichnet sich dadurch aus, dass diese in der Lage ist an einen Antikörper Oder einem Fragment davon zu binden.
Die erfindungsgemäße erste Domäne kann ein Oder mehrere Peroxidasen Oder ein Oder mehrere katalytisch aktive Fragmente davon umfassen. Die mehr als eine, vorzugsweise mehr als zwei, drei Oder fünf Peroxidasen sind aneinander fusioniert und bilden die erste Domäne. Die zweite Domäne kann mindestens ein, mindestens zwei, mindestens drei, vorzugsweise mindestens fünf, Antikörper bindende Peptide Oder Polypeptide, welche ebenfalls aneinander fusioniert sind, umfassen. Die aneinander fusionierten Peroxidasen bzw. katalytisch aktiven Fragmente davon und die aneinander fusionierten Antikörper bindenden Peptide Oder Polypeptide weisen unabhängig voneinander enzymatische bzw. Antikörper bindende Eigenschaften auf.
Unter dem Begriff „katalytisch aktives Fragment" bzw. unter dessen homologen Begriff „enzymatisch aktives Fragment" wird ein Fragment eines katalytisch bzw. enzymatisch aktiven Proteins bzw. Polypeptids verstanden, welches zumindest 40%, vorzugsweise mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60%, noch mehr bevorzugte mindestens 70%, noch mehr bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, der Aktivität des Proteins bzw. Polypeptids aufweist, von dem das Fragment abgeleitet ist. Die katalytische bzw. enzymatische Aktivität der erfindungsgemäß eingesetzten Peroxidasen kann mit für den Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden. Für die Bestimmung der Peroxidaseaktivität besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem unter Reduktion eines Co-Substrats, wie z. B. Wasserstoffperoxid, die Oxidation eines fluorometrischen Oder kolorimetrischen Substrats, wie z. B. ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure))
Oder TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) quantifiziert wird (siehe z.B. Morawski, B. et al. Protein Eng. 13(2000):377-84, Josephy, P. D. et al. J. Biol. Chem. 257(1982):3669-75). „Polypeptid" und „Peptid", wie hier verwendet, sind Moleküle umfassend durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren mit einer Kettenlänge von 2 bis 300 Aminosäureresten, wobei „Polypeptide" mindestens 50 Aminosaurereste umfassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Peroxidase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Meerrettichperoxidase, Peroxidasen aus Acker-Schmalwand (z.B. Arabidopsis thaliana peroxidase 34), Peroxidasen aus
Sojabohnen (z.B. Sojabohnen-Peroxidase), Peroxidasen aus Tabak (z.B. Lignin-formende anionische Tabak-Peroxidase; „ligninforming anionic tobacco peroxidase"), Peroxidasen aus Tomaten (z.B. Suberinisierungs-assoziierte anionische Tomaten-Peroxidase; „suberization-associated anionic tomato peroxidase"), Peroxidasen aus Gerste (z. B. Gersten-Peroxidase 1; „barley peroxidase 1") und Peroxidasen aus Erdnüssen (z. B. kationische Erdnuss Peroxidase 1; „cationic peanut peroxidase 1") .
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein umfasst vorzugsweise Meerrettichperoxidase Oder mindestens ein katalytisches Fragment davon. Besonders bevorzugt umfasst oder besteht die Meerrettichperoxidase aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen: SEQ ID Nr. 1:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE
KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLGRRDSLQ
AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGL
PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQELFSSPNA
TDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSLLHDMVEVVDFV
SSM SEQ ID Nr. 2:
QLTPTFYDTSCPNVSNIVRDIIINELRSDPRITASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFLTE KDALGNANSARGFPTVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGPSWRVPLGRRDSLQ AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDAFAKVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPLNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSFADGTQKFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM SEQ ID Nr. 3:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDIIINELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGPSWRVPLGRRDSRQ AFLDLANANLPAPSFTLPELKAAFANVGLNRPSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA
TDTIPLVRSYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV
SSM SEQ ID Nr. 4:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDIIINELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAFGNANSARGFPVVDRIKAAVERACPRTVSCADVLTIAAQQSVNLAGGPSWRVPLGRRDSRQ AFLDLANTNLPAPSFTLPQLKAAFANVGLNRPSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRQQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEQKGLIQSDQELFSSPNA TDTIPLVRSYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPLTGTQGEIRLNCRVVNSNSLLHDIVEVVDFV SSM SEQ ID Nr. 5:
QLSPSFYDKTCPQVFDIATNTIKTALRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE
KDAFGNARSARGFDVIDTMKAAVEKACPKTVSCADLLAIAAQKSVVLAGGPSWKVPSGRRDSLR
GFMDLANDNLPGPSSTLQVLKDKFRNVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCQFIMDRLYNFSNSGK
PDPTLDKSYLSTLRKQCPRNGNLSVLVDFDLRTPTIFDNKYYVNLKENKGLIQSDQELFSSPDA
SDTIPLVRAYADGQGKFFDAFVEAMIRMGNLSPSTGKQGEIRLNCRVVNSKPKIMDVVDTNDFA
SSI SEQ ID Nr. 6:
QLRPDFYFRTCPSVFNIIGDIIVDELRTDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASILLDNSTSFRTE KDAAPNANSARGFGVIDRMKTSLERACPRTVSCADVLTIASQISVLLSGGPWWPVPLGRRDSVE AFFDLANTALPSPFFTLAQLKKAFADVGLNRPSDLVALSGGHTFGRAQCQFVTPRLYNFNGTNR PDPTLDPTYLVQLRALCPQNGNGTVLVNFDVVTPNTFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSSNTFAFFGAFVDAMIRMGNLRPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSSI SEQ ID Nr. 7:
QLSPDIYAKSCPNLLQIVRDQVKIALKAEIRMAASLIRLHFHDCFVNGCDASVLLDGTNSEKLA IPNVNSVRGFEVIDTIKAAVENACPGVVSCADILTLAARDSVYLSGGPQWRVALGRKDGLVANQ SSANNLPSPFEPLDAIIAKFAAVGLNVTDVVALSGAHTFGQAKCDLFSNRLFNFTGAGTPDSTL ETTLLSDLQTVCPIGGNGNKTAPLDRNSTDAFDNNYFKNLLEGKGLLSSDQILFSSDLAVNTTK RLVEAYSRSQYLFFRDFTCSMIRMGSLVNGASGEVRTNCRVIN SEQ ID Nr. 8:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQAFQSDTRIGASLIRLHFHDCFVNGCDASILLDDSGSIQSE KNAGPNANSARGFNVVDNIKTALENTCPGVVSCSDILALASEASVSLTGGP SWTVLLGRRDSLT ANLAGANSAIPSPFEGLSNITSKFSAVGLNTNDLVALSGAHTFGRARCGVFNNRLFNFSGTGNP DPTLNSTLLSSLQQLCPQNGSASTITNLDLSTPDAFDNNYFANLQSNNGLLQSDQELFSTTGSA TIAVVTSFASNQTLFFQAFAQSMINMGNISPLTGSNGEIRLDCKKVNGS SEQ ID Nr. 9:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQAFQSDTRIGASLIRLHFHDCFVNGCDASILLDDSGSIQSE KNAGPNANSARGFNVVDNIKTALENTCPGVVSCSDILALASEASVSLTGGP SWTVLLGRRDSLT ANLAGANSAIPSPFEGLSNITSKFSAVGLNTNDLVALSGAHTFGRARCGVFNNRLFNFSGTGNP DPTLNSTLLSSLQQLCPQNGSASTITNLDLSTPDAFDNNYFANLQSNNGLLQSDQELFSTTGSA TITVVTSFASNQTLFFQAFAQSMINMGNISPLTGSNGEIRLDCKKVNGS SEQ ID Nr. 10:
QLRPDFYSRTCPSVFNIIKNVIVDELQTDPRIAASILRLHFHDCFVRGCDASILLDTSKSFRTE KDAAPNVNSARGFNVIDRMKTALERACPRTVSCADILTIASQISVLLSGGPSWAVPLGRRDSVE AFFDLANTALPSPFFTLAQLKKAFADVGLNRPSDLVALSGGHTFGRARCLFVTARLYNFNGTNR PDPTLNPSYLADLRRLCPRNGNGTVLVNFDVMTPNTFDNQFYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSSNTLSFFGAFADAMIRMGNLRPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSSM SEQ ID Nr. 11:
QLTPTFYDSTCPSVFSIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE KDAAPNANSARGFPVIDTMKAAVERACPRTVSCADLLTIAAQQSVNLAGGPSWRVPLGRRDSVQ AFFDLANTNLPAPFFTLPQLKASFSNVGLDRPEDLVALSGGHTFGKNQCQFIMDRLYNFSNTGL PDPTLNTTYLQTLRVQCPRNGNQSVLVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKEHKGLIQTDQELFSSPNA ADTIPLVRSYADGTQKFFNAFMEAMNRMGNITPLTGTQGQIRQNCRVINSNSLLHDIVEIVDFV SSM SEQ ID Nr. 12:
KLRPDFYLKTCPSVFQIIGNVIVDELQSDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASVLLDNSTSFQSE KDAAPNANSARGFDVVDRMKAALEKACPGTVSCADVLAISAQISVLLSGGPWWPVLLGRRDGVE AFFDLANTALPNPFAPLTELKEKFADVGLKRASDLVALSGAHTFGRAQCLLVTPRLYNFSGTNK PDPTLNPSYLVELRRLCPQNGNGTVLLNFDLVTPNAFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSKNTFAFFGAFVDAIIRMGNIQPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIKGMENDGGVVSSI SEQ ID Nr. 13:
KLRPDFYLKTCPSVFQIIGNVIVDELQSDPRIAASLLRLHFHDCFVRGCDASVLLDNSTSFQSE KDAAPNANSARGFDVVDRMKAALEKACPGTVSCADVLAISAQISVLLSGGPWWPVLLGRRDGVE AFFDLANTALPNPFAPLTELKEKFADVGLKRASDLVALSGAHTFGRAQCLLVTPRLYNFSGTNK PDPTLNPSYLVELRRLCPQNGNGTVLLNFDLVTPNAFDRQYYTNLRNGKGLIQSDQELFSTPGA DTIPLVNLYSKNTFAFFGAFVDAIIRMGNIQPLTGTQGEIRQNCRVVNSRIRGMENDDGVVSSI SEQ ID Nr. 14:
QLTPNFYSTSCPNLLSTVQSAVKSAVNSEARMGASIVRLFFHDCFVNGCDGSILLDDTSSFTGE QNANPNRNSARGFNVIDNIKAAVEKACPGVVSCADILAIAARDSVVVLGGPNWTVKVGRRDART ASQAAANSNIPAPTSSLSQLISSFSAVGLSTRDMVALSGAHTIGQSRCTSFRTRIYNETNINAA FATTRQRTCPRTSGSGDGNLAPLDVTTAASFDNNYFKNLMTQRGLLHSDQELFNGGSTDSIVRG YSNNPSSFSSDFAAAMIKMGDISPLTGSSGEIRKVCGRTN SEQ ID Nr. 15:
QLQMNFYAKSCPNAEKIISDHIQKHIPSGPSLAAPLIRMHFHDCFVRGCDGSVLINSTSGNAEK DSAPNLTLRGFGFVERIKTLLEAECPKTVSCADIIALTARDAVVATGGPSWKVPTGRRDGRISN TTEALNNIPPPTSNFTTLQRLFANQGLNLKDLVLLSGAHTIGVSHCSSMNTRLYNFSTTVKQDP SLDSEYAANLKANKCKSLNDNTTILEMDPGSSKTFDLSYYRLVLKRRGLFQSDSALTTNSATLK MINDLVNGPEKKFLKAFAKSMEKMGRVKVKTGSAGVIRTRCSVAGS SEQ ID Nr. 16:
RLTTNFYSKSCPRFFDIVRDTISNKQITTPTTAAATIRLFFHDCFPNGCDASILISSTAFNTAE RDSSINLSLPGDGFDVIVRAKTAIELACPNTVSCSDIITVATRDLLVTVGGPYYDVYLGRRDSR ISKSSLLTDLLPLPSSPISKTIRQFESKGFTIQEMVALSGAHSIGFSHCKEFVNRVAGNNTGYN PRFAQALKQACSNYPKDPTLSVFNDIMTPNRFDNMYYQNIPKGLGLLESDHGLYSDPRTRPFVD LYARDQDLFFKDFARAMQKLSLFGVKTGRRGEIRRRCDAIN SEQ ID Nr. 17:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQALQSDPRIGASLIRLHFHDCFVNGCDGSLLLDDTGSIQSE
KNAPANANSARGFNVVDDIKTALENACPGIVSCSDILALASEASVSLAGGPSWTVLVGRRDGLT
ANLSGANSSLPSPFEGLNNITSKFLAVGLNTTDVVVLSGAHTFGRGQCVTFNNRLFNFNGTGSP
DPTLNSTLLSSLQQICPQNGSGSAITNLDLTTPDAFDSNYYTNLQSNNGLLQSDQELFSNTGSP
TIAIVILCK SEQ ID Nr. 18:
QLNATFYSGTCPNASAIVRSTIQQALQSDPRIGASLIRLHFHDCFVNGCDGSLLLDDTGSIQSE KNAPANANSARGFNVVDDIKTALENACPGIVSCSDILALASEASVSLAGGP SWTVLVGRRDGLT ANLSGANSSLPSPFEGLNNITSKFLAVGLNTTDVVVLSGAHTFGRGQCVTFNNRLFNFNGTGSP DPTLNSTLLSSLQQICPQNGSGSAITNLDLTTPDAFDSNYYTNLQSNNGLLQSDQELFSNTGSP TIAIVILLQVTKPCFLRLLLSL SEQ ID Nr. 19:
QAISISITIRIGFYLTTCPTAEIIVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVQGCDGSVLISG SNTERTAVPNLSLRGFEVIENAKTQLEAACPGVVSCADILALAARDTVVLTRGIGWQVPTGRRD GRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSALGLNTRDLVVLAGGHTLGTAGCGVFRDRLFNNTDPN VDQPFLTQLQTKCPRNGDGSVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPATRPIV QQLMSSSGNFNAEFARSMVKMSNIGVVTGTNGEIRKVCSAIN SEQ ID Nr. 20:
LSMTYYMMSCPMAEQIVKNSVNNALQADPTLAAGLIRMLFHDCFIEGCDASILLDSTKDNTAEK DSPANLSLRGYEIIDDAKEKVENMCPGVVSCADIVAMAARDAVFWAGGPYYDIPKGRFDGKRSK IEDTRNLPSPFLNASQLIQTFGNRGFSPQDVVALSGAHTLGVARCSSFKARLTTPDSSLDSTFA NTLTRTCNAGDNAEQPFDATRNDFDNAYFNALQRKSGVLFSDQTLFNTPRTRNLVNGYALNQAK FFFDFQQAMRKMSNLDVKLGSQGEIRQNCRTIN SEQ ID Nr. 21:
KKPRRDVPIVKGLSWNFYQRACPKVEKIIKKELKKVFKRDIGLAAAILRIHFHDCFVQGCEASV LLAGSASGPGEQSSIPNLTLRQQAFVVINNLRALVQKQCGQVVSCSDILALAARDSIVLSGGPD YAVPLGRRDSLAFATPETTLANLPPPFANASQLISDFNDRNLNITDLVALSGGHTIGIAHCPSF TDRLYPNQDPTMNKSFANSLKRTCPTANSSNTQVNDIRSPDVFDNKYYVDLMNRQGLFTSDQDL FVDKRTRGIVESFAIDQNLFFDHFTVAMIKMGQMSVLTGTQGEIRSNCSARNTASFISVLEEGI VEEALSMI SEQ ID Nr. 22:
KKPRRDVPIVKGLSWNFYQRACPKVEKIIKKELKKVFKRDIGLAAAILRIHFHDCFVQGCEASV LLAGSASGPGEQSSIPNLTLRQQAFVVINNLRALVQKQCGQVVSCSDILALAARDSIVLSGGPD YAVPLGRRDSLAFATPETTLANLPPPFANASQLISDFNDRNLNITDLVALSGGHTIGIAHCPSF TDRLYPNQDPTMNKSFANSLKRTCPTANSSNTQVNDIRSPDVFDNKYYVDLMNRQGLFTSDQDL
FVDKRTRGIVESFAIDQNLFFDHFTVAMIKMGQMSVLTGTQGEIRSNCSARNTASFISVLVEGI VEEALSMI SEQ ID Nr. 23:
QAAARRPGPISGTRIGFYLTTCPTAEIIVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVLGCDGSV LISGSNTERTAVPNLNLRGFEVIDNAKTQLEATCPGVVSCADILALAARDTVVLTRGLGWQVPT GRRDGRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSAVGLNTRDLVVLAGGHTIGTAGCGVFRDRLFNN TDPNVNQLFLTQLQTQCPQNGDGAVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPAT RPIVQQLMSPRGNFNAEFARSMVRMSNIGVVTGANGEIRRVCSAVN SEQ ID Nr. 24:
QAAARRPGPISGTRIGFYLTTCPTAEIIVRNAVRAGFNSDPRIAPGILRMHFHDCFVLGCDGSV LISGSNTERTAVPNLNLRGFEVIDNAKTQLEATCPGVVSCADILALAARDTWLTRGLGWQVPT GRRDGRVSVASNANNLPGPRDSVAVQQQKFSAVGLNTRDLVVLAGGHTIGTAGCGVFRDRLFNN TDPNVNQLFLTQLQTQCPQNGDGSVRVDLDTGSGTTFDNSYFINLSRGRGVLESDHVLWTDPAT RPIVQQLMSPRGNFNAEFARSMVRMSNIGVVTGANGEIRRVCSAVN SEQ ID Nr. 25:
RLTTNFYSKSCPRFFDIVRDTISNKQITTPTTAAATIRLFFHDCFPNGCDASILISSTAFNTAE RDSSINLSLPGDGFDVIVRAKTAIELACPNTVSCSDIITVATRDLLVTVGGPYYDVYLGRRDSR ISKSSLLTDLLPLPSSPISKTIRQFESKGFTIQEMVALSGAHSIGFSHCKEFVNRVAGNNTGYN PRFAQALKQACSNYPKDPTLSVFNDIMTPNRFDNMYYQNIPKGLGLLESDHGLYSDPRTRPFVD LYARDQDLFFKDFARAMQKLSLFGVKTGRRGEIRRRCDAIN SEQ ID Nr. 26:
DDESNYGGQGKLFPGFYSSSCPKAEEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLL LDSSGSIVTEKNSNPNSRSARGFEVVDEIKAALENECPNTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWM VPLGRRDSTSASLSGSNNNIPAPNNTFNTILSRFNSQGLDLTNVVALSGSHTIGFSRCTSFRQR LYNQSGNGSPDTTLEQSYAANLRHRCPRSGGDQNLSELDINSAGRFDNSYFKNLIENMGLLNSD QVLFSSNDESRELVKKYAEDQEEFFEQFAESMVKMGNISPLTGSSGQIRKNCRKINS SEQ ID Nr. 27:
RRPRVGFYGNRCRKVESIVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMYFHDCFVNGCDGSILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA
SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPSID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAIIER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN SEQ ID Nr. 28:
RRPRVGFYGNRCRKVESIVRSVVRSHFRCNPANAPGILRMHFHDCFVNGCDGSILLAGNTSERT AGPNRSLRGFEAIEEAKTRLENACPNTVSCADILTLAARDAVVWTGGKGWSVPLGRLDGRRSEA SDVNLPGPSDPVAKQKQDFAAKNLNTLDLVTLVGGHTIGTAGCGLVRGRFFNFNGTGQPDPSID PSFVPLVQARCPQNGNATTRVDLDTGSAGDFDTSYLSNVRSSRVVLQSDLVLWKDTETRAIIER LLGLRRPVLRFGSEFGKSMTKMSLIEVKTRLSDGEIRRVCSAIN SEQ ID Nr. 29:
DKSYGGKLFPGFYAHSCPQAGEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLLLDSS
GRIVSEKGSNPNSRSARGFDVVDQIKAELEKQCPGTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWVVSLG
RRDSRSASLSGSNNNIPAPNNTFQTILSKFNRQGLDVTDLVALSGSHTIGFSRCTSFRQRLYNQ
SGNGRPDMTLEQSFAANLRQRCPRSGGDQILSVLDIISAAKFDNSYFKNLIENKGLLNSDQVLF
NSNEKSRELVKKYAEDQGEFFEQFAESMIKMGNISPLTGSSGEIRKNCRKINS SEQ ID Nr. 30:
DKSYGGKLFPGFYAHSCPQAGEIVRSVVAKAVARETRMAASLMRLHFHDCFVQGCDGSLLLDSS
GKIVSEKGSNPNSRSARGFDVVDQIKAELEKQCPGTVSCADALTLAARDSSVLTGGPSWVVSLG
RRDSRSASLSGSNNNIPAPNNTFQTILSKFNRQGLDVTDLVALSGSHTIGFSRCTSFRQRLYNQ
SGNGRPDMTLEQSFAANLRQRCPRSGGDQILSVLDIISAAKFDNSYFKNLIENKGLLNSDQVLF
SSNEKSRELVKKYAEDQGEFFEQFAESMIKMGNISPLTGSSGEIRKNCRKINS
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Oder besteht die erfindungsgemäße Peroxidase aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen: SEQ ID Nr. 31 (Arabidopsis thaliana Peroxidase 34):
QLTPTFYDRSCPNVTNIVRETIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE
KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVERACPRTVSCADMLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLGRRDSLQ
AFLELANANLPAPFFTLPQLKASFRNVGLDRPSDLVALSGGHTFGKNQCQFILDRLYNFSNTGL
PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNRSALVDFDLRTPTVFDNKYYVNLKERKGLIQSDQELFSSPNA
TDTIPLVRAYADGTQTFFNAFVEAMNRMGNITPTTGTQGQIRLNCRVVNSNSLLHDVVDIVDFV
SSM SEQ ID Nr. 32 („Soybean peroxidase"):
QLTPTFYRETCPNLFPIVFGVIFDASFTDPRIGASLMRLHFHDCFVQGCDGSVLLNNTDTIESE QDALPNINSIRGLDVVNDIKTAVENSCPDTVSCADILAIAAEIASVLGGGPGWPVPLGRRDSLT ANRTLANQNLPAPFFNLTQLKASFAVQGLNTLDLVTLSGGHTFGRARCSTFINRLYNFSNTGNP DPTLNTTYLEVLRARCPQNATGDNLTNLDLSTPDQFDNRYYSNLLQLNGLLQSDQELFSTPGAD TIPIVNSFSSNQNTFFSNFRVSMIKMGNIGVLTGDEGEIRLQCNFVNGDSFGLASVASKDAKQK LVAQSK SEQ ID Nr. 33 („Lignin-forming anionic tobacco peroxidase"):
QLSATFYDTTCPNVTSIVRGVMDQRQRTDARAGAKIIRLHFHDCFVNGCDGSILLDTDGTQTEK DAP AN V G AGGF DIVD DIK T ALENVCP GW S CAD IL AL AS EIGVVL AKGP S WQVLF GRKD S L T AN RSGANSDIPSPFETLAVMIPQFTNKGMDLTDLVALSGAHTFGRARCGTFEQRLFNFNGSGNPDL TVDATFLQTLQGICPQGGNNGNTFTNLDISTPNDFDNDYFTNLQSNQGLLQTDQELFSTSGSAT IAIVNRYAGSQTQFFDDFVSSMIKLGNISPLTGTNGQIRTDCKRVN SEQ ID Nr. 34 („Suberization-associated anionic tomato peroxidase"):
GVAIYRNTYEAIIMNNGSLLQNASPHFDSLESGVASILTLNNKKRNSDMYLRQQLTPEACVFSA VRGVVDSAIDAETRMGASLIRLHFHDCFVDGCDGGILLDDINGTFTGEQNSPPNANSARGYEVI AQAKQSVIDTCPNISVSCADILAIAARDSVAKLGGQTYNVALGRSDARTANFTGALTQLPAPFD NLTVQIQKFNDKNFTLREMVALAGAHTVGFARCSTVCTSGNVNPAAQLQCNCSATLTDSDLQQL DTTPTMFDKVYYDNLNNNQGIMFSDQVLTGDATTAGFVTDYSNDVSVFLGDFAAAMIKMGDLPP SAGAQLEIRDVCSRVNPTSVASM SEQ ID Nr. 35 („Barley peroxidase 1"):
QLSPTFYDTSCPRALATIKSGVMAAVTSDPRMGASLLRLHFHDCFVQGCDASVLLSGMEQNAIP NAGSLRGFGVIDSIKTQIEAICKQTVSCADILTVAARDSVVALGGPSWTVPLGRRDSIDANENE ANTDLPGFNSSRAELEAAFLKKGGLNTVDMVALSGAHTIGQAQCSTFRARIYGGDTNINAAYAA SLRANCPQTVGSGDGSLANLDTTTANTFDNAYYTNLMSQKGLLHSDQVLFNNDTTDNTVRNFAS NPAAFSSSFTTAMIKMGNIAPKTGTQGQIRLSCSRVNS SEQ ID Nr. 36 („Cationic peanut peroxidase 1"):
QLSSNFYATKCPNALSTIKSAVNSAVAKEARMGASLLRLHFHDCFVQGCDASVLLDDTSNFTGE KTAGPNANSIRGFEVIDTIKSQVESLCPGVVSCADILAVAARDSVVALGGASWNVLLGRRDSTT ASLSSANSDLPAPFFNLSGLISAFSNKGFTTKELVTLSGAHTIGQAQCTAFRTRIYNESNIDPT YAKSLQANCPSVGGDTNLSPFDVTTPNKFDNAYYINLRNKKGLLHSDQQLFNGVSTDSQVTAYS NNAATFNTDFGNAMIKMGNLSPLTGTSGQIRTNCRKTN
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zweite Domäne mindestens ein an eine Fc-Region des Antikörpers bindendes Peptid Oder Polypeptid, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G und Varianten davon.
Das mindestens eine, vorzugsweise die mindestens zwei, noch mehr bevorzugt die mindestens drei, noch mehr bevorzugt die mindestens vier, an einen Antikörper bindenden Peptide Oder Polypeptide binden vorzugsweise an eine Fc-Region eines Antikörpers. Ausgewählt sind derartige Peptide bzw. Polypeptide aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G bzw. Varianten davon.
Protein G weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf: TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASE LTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPE VIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFT VTE (SEQ ID Nr. 73)
Protein A weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf: AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKF NKDQQ SAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQS LKDDPS Q S TNVLGEAKKLNES QAPKADNNFNKEQQN AFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEIL HLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLT EEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNK KPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPG DTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPET (SEQ ID Nr. 74)
In einer alternativen Ausführungsform kann das mindestens eine Antikörper bindende Peptid Oder Polypeptid an den variablen
Bereich der leichten Ketten von Antikörpern binden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zweite Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins daher Protein L, Protein M Oder eine Variante davon.
Protein L weist vorzugsweise folgende Aminosauresequenz auf: KEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDNGEYTVDVA DKGYTLNIKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDN GEYTVDVADKGYTLNIKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRY ADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFAE ATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTINIRFAGKKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQT ATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAG (SEQ ID Nr. 75)
Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper bindenden Peptide bzw. Polypeptide sind vorzugsweise Fragmente derselbigen, die in der Lage sind, an einen Antikörper zu binden. Die Bindungsstärke dieser Varianten bzw. Fragmente kann dabei maximal 80%, vorzugsweise maximal 60%, noch mehr bevorzugt maximal 50%, noch mehr bevorzugt maximal 40%, noch mehr bevorzugt maximal 20%, geringer sein als das Antikörper bindende Peptid Oder Polypeptid von dem diese abgeleitet sind. Diese Bindungsstärke kann mit herkömmlichen Bindungsassays bestimmt werden.
Strukturell können sich die Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper bindenden Peptide bzw. Polypeptide von den Peptiden und Polypeptiden, von denen diese Varianten abgeleitet sind, auch in der Aminosäuresequenz unterscheiden. Vorzugsweise weisen diese Varianten mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, insbesondere mindestens 99%, Identität zu den Antikörper bindenden Peptiden und Polypeptiden, von denen diese Varianten abgeleitet sind, auf. „Identität" zweier Oder mehrerer Amino- Oder Nukleinsäuremolküle bedeutet, dass die Sequenzen der Moleküle einen gewissen Grad an Sequenzähnlichkeit teilen, wobei die Sequenzen teilweise identisch sind. Erfindungsgemäß kann die Identität zweier Oder mehrere Aminosaure- Oder
Nukleinsäuremoleküle mit bekannten Algorithmen bestimmt werden. Besonders bevorzugt wird dabei der Algorithmus von Needleman und
Wunsch (J Mol Biol 48(1970):443) verwendet. Deshalb werden Programme, die auf diesem Algorithmus basieren, bevorzugt. Die Applikation „Needle", beispielsweise, ist Teil der "The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)" (Trends in Genetics 16(2000):276). Daher erfolgen die Berechnungen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität vorzugsweise mit dem Programm „Needle", vorzugsweise über den gesamten Bereich der Sequenzen. Die folgenden
Standardeinstellungen werden für den Vergleich von Sequenzen mit „Needle" verwendet: Matrix: EBLOSUM62, Gap opening penalty: 10.0, Gap extension penalty: 0.5.
Das Antikörper bindende Peptid bzw. Polypeptid kann selbst ein Antikörper Oder Antikörperfragment sein. Daher umfasst die zweite Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins einen Antikörper Oder ein Antikörperfragment. Das Antikörperfragment umfasst vorzugsweise jene Bereiche eines Antikörpers, die in der Lage sind, an ein Epitop zu binden.
Zwischen der ersten Domäne und der zweiten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann ein Linker angeordnet sein, wobei besonders bevorzugt zwischen der ersten und zweiten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kein Linker vorgesehen ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Linker 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 3, noch mehr bevorzugt 1 Oder 2, Aminosäurereste.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am N-Terminus und/oder C-Terminus des Fusionsproteins ein Tag, vorzugsweise ein Affinitäts-Tag vorgesehen ist.
Urn die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins zu ermöglichen bzw. zu erleichtern, weist dieses am N-Terminus und/oder C-Terminus einen Tag auf. Ein „Tag" ist eine Verbindung, insbesondere ein Peptid, das aufgrund ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur eine Bindungsstelle für eine andere Moleküleinheit aufweist, die eine spezifische Bindung dieser anderen Moleküleinheit ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tag ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, StrepTagll und MBP-Tag.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst bzw. besteht das erfindungsgemäße Fusionsprotein eine der folgenden Aminosäuresequenzen: SEQ ID Nr. 37:
HHHHHHQLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNT
TSFRTEKDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLG
RRDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYN
FSNTGLPDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQEL
FSSPNATDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSTYKLIL
NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVT
TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASE
LTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE SEQ ID Nr. 38:
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTE
KDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLGRRDSLQ
AFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGL
PDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQELFSSPNA
TDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSTYKLILNGKTLK
GETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVI
NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVT
TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist am 5'- und/oder 3'-Ende des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäurequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid vorgesehen.
Urn das erfindungsgemäße Fusionsprotein bei der Expression in einer Wirtszelle aus der Zelle auszuschleußen, umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid. Die
Nukleinsäuresequenz kodierend für das Sekretionssignalpeptid ist dabei „in frame" mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül verknüpft.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Sekretionssignalpeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sekretionssignalpeptiden des Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors, eines Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2 („preScMfa2-proScMfa2"), des Präpeptids der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1 („acid phosphatase 1"; „prePpPhol"), des Präpeptids der Trichoderma reesei Cellobiohydrolase 2" („preTrCbh2"), des Präpeptids des Homo sapiens Serumalbumin („preHsAlb"), des Präpeptids der Armoracia rusticana Meerrettichperoxidase C1A („preArClA"), des Präpeptids des Kluyveromyces lactis Killertoxin („preKlKtx"), eines Präpropeptids bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin („preKIKtx-proKIKtx"), Deletionsmutanten davon und Kombinationen davon. Im Falle des Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 1 ist eine Deletion der Aminosäuren N75-I70 (NSTNNGLLFINTTI; SEQ ID Nr. 70) gemeint, im Falle des Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2 ist eine Deletion der Aminosäuren N52-I65 (NATASGLLFINTTI; SEQ ID Nr. 71) gemeint. Die entsprechenden vollständigen Aminosauresequenzen lauten, wobei die unterstrichenen Teilbereiche der Sequenzen deletiert werden können:
Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 1: MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLL FINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA (SEQ ID Nr. 39)
Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2: MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAIIGYLDFGGDHDIAFLPFSNATASGLLFINTT I_AEAAEKEQNTTLAKREAVADA (SEQ ID Nr. 72)
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die Nukleinsäuresequenz für ein Sekretionssignalpeptid, welches eine der folgenden Aminosauresequenzen aufweist: SEQ ID Nr. 39 (Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktor):
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLL
FINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA SEQ ID Nr. 40 (Deletionsmutante des Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors; „Da"):
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSASIAAKEE GVSLEKREAEA SEQ ID Nr. 41 (Präpeptid der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1, „prePpPhol"):
MFSPILSLEIILALATLQSVFA SEQ ID Nr. 42 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus P. pastoris „Acid Phosphatase 1" und dem Propeptid einer
Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „prePpPhol-proDa"):
MFSPILSLEIILALATLQSVFAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSASIAA KEEGVSLEKREAEA SEQ ID Nr. 43 (Präpeptid der Trichoderma reesei „Cellobiohydrolase 2"; „preTrCbh2")
MIVGILTTLATLATLAASVPLEER SEQ ID Nr. 44 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Trichoderma reesei „Cellobiohydrolase 2" und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preTrCbh2-proDa")
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSASI AAKEEGVSLEKREAEA SEQ ID Nr. 45 (Präpeptid des Homo sapiens Serumalbumin; „preHsAlb"):
MKWVTFISLLFLFSSAYS SEQ ID Nr. 46 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Homo sapiens Serumalbumin und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preHsAlb-proDa"):
MKWVTFISLLFLFSSAYSAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSASIAAKEEG
VSLEKREAEA SEQ ID Nr. 47 (Präpeptid der Armoracia rusticana Meerrettichperoxidase CIA; „preArCla"):
MHFSSSSTLFTCITLIPLVCLILHASLSDA SEQ ID Nr. 48 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Armoracia rusticana Meerrettichperoxidase CIA und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preArCla-proDa"):
MHFSSSSTLFTCITLIPLVCLILHASLSDAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVL
PFSASIAAKEEGVSLEKREAEA SEQ ID Nr. 49 (Präpeptid des Kluyveromyces lactis Killertoxin; „preKlKtx"):
MNIFYIFLFLLSFVQGL SEQ ID Nr. 50 (Präpropeptid bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin; „preKIKtx-proKIKtx"):
MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLVKR SEQ ID Nr. 51 (Kombinationssignalpeptid bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin und dem Propeptid einer Deletionsmutante des alpha-Mating Faktors; „preKIKtx-proDa"):
MNIFYIFLFLLSFVQGLAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSASIAAKEEGV SLEKREAEA SEQ ID Nr. 52 (Präpropeptid des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2; ,,preScMfa2-proScMfa2") :
MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAIIGYLDFGGDHDIAFLPFSNATASGLLFINTT IAEAAEKEQNTTLAKREAVADA SEQ ID Nr. 53 (Deletionsmutante des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2; ,,preScMfa2-proDa2") :
MKFISTFLTFILAAVSVTASSDEDIAQVPAEAIIGYLDFGGDHDIAFLPFSAEAAEKEQNTTLA KREAVADA
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Oder besteht das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül aus einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 56 und SEQ ID Nr. 57. SEQ ID Nr. 54:
ATGAGATTCCCATCTATTTTCACCGCTGTCTTGTTCGCTGCCTCCTCTGCATTGGCTGCCCCTG TTAACACTACCACTGAAGACGAGACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCAGTTATCGGTTACTCTGA CCTTGAGGGTGATTTCGACGTCGCTGTTTTGCCTTTCTCTGCTTCCATTGCTGCTAAGGAAGAG GGTGTCTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCACCATCACCACCATCACCAACTTACTCCAA CCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATT GAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAAC GGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCG GTAAT GCCAAC TC T GC TAGAGGAT T TCCAGTCAT T GACAGAAT GAAGGCTGCCGT T GAAT C T GC ATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTA GCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACC TTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAA CGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAAC CAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTC TGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCT GGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAA CAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTC CATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGA CAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTT GTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTA
CTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGT
TGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTC
ATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTT
TGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATA
CGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGACTTACGATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTT
ACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAG
TCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGA
AAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCT
ACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG SEQ ID Nr. 55:
CACCATCACCACCATCACCAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCA
ACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTT
GAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACT
ACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTAGAGGATTTCCAGTCA
TTGACAGAATGAAGGCTGCCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCT
GACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGT
CGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTA
CCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGC
CTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAAC
TTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTT
TGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTT
CGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTG
TTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAA
CCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTAC
TCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTG
AACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGG
TCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAA
AACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACT
ACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATG
CTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGAC
TTACGATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAG
TTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTA
CTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGG
TGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG SEQ ID Nr. 56:
ATGAGATTCCCATCTATTTTCACCGCTGTCTTGTTCGCTGCCTCCTCTGCATTGGCTGCCCCTG TTAACACTACCACTGAAGACGAGACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCAGTTATCGGTTACTCTGA CCTTGAGGGTGATTTCGACGTCGCTGTTTTGCCTTTCTCTGCTTCCATTGCTGCTAAGGAAGAG GGTGTCTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTT GTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCATTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTAT TGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGACTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATC TTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAGAAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTA GAGGATTTCCAGTCATTGACAGAATGAAGGCTGCCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTC ATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCAATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGG AGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAAGCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGC CTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAGACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATC ATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACACCTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATG GATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTGCCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGC AAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAAATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCG TACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGTCAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAA TCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCTACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCG CAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCGTCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTAC TCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATTGAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACT TACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTG CCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTA CGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTA ACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCA CTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGT TGACGGAGAGT GGAC T T AC GAT GAC GC T AC T AAGAC T T T CAC T GT TAC T GAGAAGC CAGAGGT T ATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCT TGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTA CGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTC ACCGAG SEQ ID Nr. 57:
CAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTGTCCTAATGTGTCCAACATCGTTAGAGACACCA
TTGTCAATGAATTGAGATCAGATCCACGTATTGCTGCATCTATCTTGAGACTTCACTTTCATGA
CTGCTTCGTCAACGGTTGTGATGCTTCCATCTTGCTGGACAACACTACCTCTTTCAGAACTGAG
AAGGACGCTTTCGGTAATGCCAACTCTGCTAGAGGATTTCCAGTCATTGACAGAATGAAGGCTG
CCGTTGAATCTGCATGTCCTAGAACTGTGTCATGTGCTGACCTTCTGACTATTGCCGCTCAGCA
ATCTGTTACCTTAGCTGGTGGACCATCCTGGAGAGTTCCATTGGGTCGTAGAGACTCCCTTCAA
GCCTTTCTGGACCTTGCAAATGCTAACTTGCCTGCTCCATTCTTTACCTTACCTCAATTGAAAG
ACTCTTTCAGAAACGTTGGTCTTAACAGATCATCCGACTTGGTTGCCTTATCTGGAGGTCACAC
CTTTGGTAAGAACCAATGTAGATTCATCATGGATCGTCTGTACAACTTCTCTAACACCGGTTTG CCAGATCCTACTCTGAACACCACTTACTTGCAAACCTTAAGAGGTTTGTGCCCACTTAACGGAA ATCTGTCTGCTCTGGTTGACTTCGATTTGCGTACTCCTACCATCTTCGACAACAAGTACTATGT CAACTTGGAGGAACAGAAGGGTCTTATCCAATCTGACCAGGAGTTGTTCTCCTCTCCTAACGCT ACTGATACCATTCCATTGGTGAGATCCTTCGCAAACTCCACTCAAACCTTCTTTAACGCTTTCG TCGAGGCAATGGACAGAATGGGTAACATTACTCCTTTGACCGGTACTCAAGGACAGATTAGATT GAACTGCCGTGTTGTCAACTCTAACTCAACTTACAAGTTGATCCTGAACGGAAAGACCTTGAAG GGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAGTATGCCA ACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACTTTCACTGTCACTGA GAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCTACAAGTTGGTTATC AACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGCAACTGCCGAAAAGG TC T T CAAGCAAT AC GCt AAt GATAAC GGAGT T GAC GGAGAGT GGAC T TACGAT GAC GC TAC TAA GACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGACTCCAGCAGTTACT ACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTACCAAGGCTGTGGATG CCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTGGATGGTGTTTGGAC CTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAG
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann Teil eines Vektors sein. Der Begriff „Vektor" umfasst dabei jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z. B. ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder in eukaryotische Wirtszellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide Oder Virusgenome. Ein Vektor ist somit ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, ein anderes Nukleinsäuremolekül, wie die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle kodierend für ein Fusionsprotein, an die es gebunden ist, zu transportieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül operativ an einen Promotor gebunden Oder umfasst einen Promoter, der in der Lage ist, das vom Nukleinsäuremolekül kodierte Fusionsprotein zu steuern.
Um die Expression des vom erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül kodierten Fusionsproteins zu steuern, ist dieses operativ an einem Promoter gebunden. Der Begriff „operativ verbunden" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verbindung zwischen der Promotersequenz und des zu exprimierenden Nukleinsäuremoleküls, so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des Nukleinsäuremoleküls zu initiieren.
Der Begriff „Promoter" bezieht sich auf eine Kontrollsequenz, die sich stromaufwärts („upstream") vom Transkriptionsstart ernes Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül bildet mit dem Promotor und gegebenenfalls weiteren Elementen (wie z.B. Terminatorsequenzen) eine Expressionskassette, die ebenfalls Teil eines Vektors sein kann.
Erfindungsgemäß kann ein beliebiger Promoter verwendet werden, vorausgesetzt er ermöglicht die Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in einer geeigneten Wirtszelle. Der Promoter kann dabei induzierbar Oder konstitutiv sein .
Als Promotoren, welche sich erfindungsgemäß eignen in Wirtszellen, wie Hefezellen, die Expression eines Gens zu steuern, können beispielsweise AUG1, AOD, EN01, GPMl, HSP82, ICLlf ILV5, GPDl, PX6, TEF, CUPl, PGK, GAPl, TP I, PH05, AOXl r A0X2, DAS, FLD1, GAL10/CYC1, CYC1, 01iCf ADHr TDH, Kex2, MFa Oder NMT Promotoren oder Kombinationen Oder Varianten der vorstehend genannten Promotoren eingesetzt werden (siehe z.B. Vogl T und Glieder A, New Biotechnology 30(2013):385-404, insbesondere Tabelle 1 von Vogl T und Glieder A) . Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß ein AOXl Promoter bzw. Varianten davon verwendet.
Besonders bevorzugte Promotorvarianten sind in der WO 2006/089329 beschrieben und umfassen Mutationen (z.B. Deletionen, Substitutionen) der Nukleotide 170 to 235,
Nukleotide 170 to 191, Nukleotide 192 to 213, Nukleotide 192 to 210, Nukleotide 207 to 209, Nukleotide 214 to 235, nucleotides 304 to 350, Nukleotide 364 to 393, Nukleotide 434 to 508, Nukleotide 509 to 551, Nukleotide 552 to 560, Nukleotide 585 to 617, Nukleotide 621 to 660, Nukleotide 625 to 683, Nukleotide 736 to, Nukleotide 737 to 738, Nukleotide 726 to 755, Nukleotide 784 to 800 Oder Nukleotide 823 to 861 von Seq ID Nr. 58 (Wildtyp AOX1 Promotor) und Kombinationen davon. SEQ ID Nr. 58: ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccac aggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttg caaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagccca gttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgac tttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaac aagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagt ttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaa aagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtca aaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaa aaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgcc gaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgctt ccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaa cccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatc atcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacga cttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc
Der erfindungsgemäße Vektor kann als stabiler Expressionsvektor, in einem künstlichen Chromosom oder durch Integration in das Chromosom in eine Wirtszelle eingebracht werden. Die Integration in das Chromosom kann erreicht werden, indem man einen Vektor verwendet, der sich als ganzes Element oder mit Teilen davon mit dem Chromosom der Hefe rekombiniert. Geeignete Vektoren können Nukleotidsequenzen enthalten, die mit Nukleotidsequenzen des Wirtszellen-Chromosoms homolog sind.
Ein erfindungsgemäßer Vektor kann einen selektierbaren Marker enthalten. Die selektierbaren Marker sind häufig Gene, die Antibiotikaresistenz der Wirtszelle ermöglichen oder Gene, die in der Lage sind, jene Wirtszellen zu ergänzen, welche gut charakterisierte metabolische Mängel aufweisen, solche wie z. B. mangelhafte Mutanten in Histidin. Die bevorzugten selektierbaren Marker inkludieren URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 Oder Gene, die für eine Antibiotikaresistenz kodieren. Der Vektor kann auch einen Replizierungsursprung haben, der in der Lage ist Replikation des Vektors in einer Wirtszelle zu vermitteln.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zelle bzw. eine Wirtszelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül Oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. Vektoren werden vorzugsweise in Zellen eingebracht, um diese Moleküle für Klonierungszwecke, beispielsweise, zu vermehren bzw., um die Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in Wirtszellen zu ermöglichen.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure, vorzugsweise DNA Oder RNA, transformierbar Oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszelle" umfasst erfindungsgemäß prokaryotische (z.B. E. coli) und eukaryotische Zellen (z.B. tierische Zellen,
Hefezellen und Insektenzellen).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine Hefezelle, wobei besonders bevorzugt methylotrophe Hefen und ganz besonders bevorzugt P. pastoris und Hansenula polymorpha verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfassend die Kultivierung einer Zelle wie oben definiert.
Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann mit im Stand der Technik beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins in methylotrophen Hefen, wie P. pastoris und Hansenula polymorpha.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Immunoassay, vorzugsweise in einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Da die erfindungsgemäßen Fusionsproteine einerseits in der Lage sind an Antikörper bzw. Fragmenten davon zu binden und andererseits Peroxidase-Aktivität aufweisen, eignen sie sich besonders gut für Immunoassays. In derartigen Assays werden üblicherweise die zu bestimmenden Analyten mit Antikörper Oder Fragmenten davon markiert. An diese Antikörper bzw. an deren Fragmente können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine binden.
Nach dem Entfernen der nicht gebundenen Fusionsproteine durch einen Waschschritt, wird ein Substrat aufgebracht, das von der ersten Domäne des erfindungsgemäßen Fusionsproteins umgesetzt wird. Die Umsetzung des Substrats ist ein Maß dafür, wieviel Fusionsprotein und somit Analyt vorhanden ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Zielmoleküls in einer Probe umfassend die Schritte: - Bereitstellen eines ersten an ein Zielmolekül bindenden Antikörpers Oder Fragments davon, der auf einem festen Träger immobilisiert ist; - Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper oder Fragment davon, - Aufbringen eines zweiten an das Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon; - optionales Entfernen des zweiten Antikörpers Oder Fragments davon, der nicht an das Zielmolekül gebunden ist; - Aufbringen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins; - optionales Entfernen des Fusionsproteins, das nicht an den zweiten Antikörper oder des Fragments davon gebunden ist; - Aufbringen eines nachweisbaren Peroxidasesubstrats auf den festen Träger; und - Nachweisen der Umsetzung des Peroxidasesubstrats.
Wie bereits erwähnt eignet sich das erfindungsgemäße
Fusionsprotein hervorragend zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Zielmoleküls in einer Probe (z.B. in einem Verfahren wie in Engvall E et al. Immunochemistry 8(1971):871-875 beschrieben).
Dabei wird zunächst ein an ein Zielmolekül bindender Antikörper oder Fragment davon auf einem festen Träger immobilisiert. Dadurch wird es ermöglicht, dass das zu bestimmende Zielmolekül spezifisch und indirekt auf dem festen Träger gebunden wird. Nach einem Waschschritt, bei dem nicht gebundene Probenbestandteile von der Oberfläche des festen Trägers entfernt werden, werden weitere Antikörper oder Fragmente aufgebracht, die ebenfalls in der Lage sind, das Zielmolekül zu binden. Nach diesem Schritt bzw. nach einem optionalen Waschschritt wird das erfindungsgemäße Fusionsprotein mit dem festen Träger in Kontakt gebracht. Da das Fusionsprotein in der Lage ist an Antikörper zu binden, werden die am Zielmolekül gebundenen Antikörper mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein „markiert". Nach dem Entfernen von nicht gebundenem Fusionsprotein wird ein Substrat für Peroxidasen aufgebracht. Dieses üblicherweise farblose Substrat wird von der ersten Domäne des Fusionsproteins in ein färbiges Substrat umgesetzt. Die Umsetzung des Substrats zeigt das Vorhandensein des Zielmoleküls in der ursprünglichen Probe, wobei die Umsetzung auch quantifizierbar ist.
Als Substrat für die mindestens eine Peroxidase bzw. des mindestens einen katalytisch aktiven Fragments davon können herkömmliche Peroxidase-Substrate eingesetzt werden. Besonders gut eignet sich dabei mindestens ein Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-(4-Aminobutyl)-N-Ethylisoluminol, 3-Amino-9-Ethylcarbazol, 4-Aminophthalhydrazid, 5-Aminosalicylsäure, 2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure), 4-Chloro-l-Naphthol, 4-Chloro-7-Nitrobenzofurazan, 3,3'-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid, 3,3’-Diaminobenzidin (DAB), o-Dianisidin, Iodonitrotetrazoliumchlorid, Luminol, Nitrotetrazolium Blue Chlorid, o-Phenylenediamin, Trans-5-Phenyl-4-Pentenyl-Hydroperoxid, Pyrogallol, 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin, Tetranitroblue Tetrazolium Chlorid und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, Phenol, Indol-3-Essigsäure, Guaiacol, Wasserstoffperoxid, 1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, Tetrazolium Violet und Kombinationen davon.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set umfassend ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und einen an ein Zielmolekül bindenden Antikörper oder ein Fragment davon.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und des folgenden Beispiels näher illustriert ohne jedoch einschränkend zu sein.
Fig. 1 zeigt rekombinante SpG-HRP Fusionskonstrukte mit bzw. ohne Hexahistidin-Tag (6x H) Oder Pentaglycin-Linker (5x G); N-terminale Fusionen von SpG (gepunktet) an HRP (ausgefüllt); C-terminale Fusionen von SpG (gepunktet) an HRP (ausgefüllt) (A= SpG-HRP; B=6xH-SpG-HRP; C=SpG-5xG-HRP; D=6xH-SpG-5xG-HRP; E= HRP-SpG; F= 6xH-HRP-SpG) .
Fig. 2 zeigt die Produktion und Aufreinigung eines rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins. A, Volumetrische (schwarze Quadrate) und spezifische (graue Dreiecke) HRP-Aktivitäten aus Bioreaktor-Kultivierungen. B, Größenausschlusschromatogramm von HRP-SpG nach Ni2+
Affinitätschromatographie; durchgehende schwarze Linie, A403; gepunktete graue Linie, A280.
Fig. 3 zeigt die Detektion von Antigenen durch rekombinantes HRP-SpG Fusionsprotein in direktem ELISA. IgGs von Humanserum (Karo) Oder von Hasen-Serum (Quadrat) wurden in Konzentrationen von 20 - 0.01953125 pg/mL als Antigene verwendet. HRP-SpG wurde mit einer Konzentration von 0.1 pg/mL verwendet. Die Fehlerbalken sind Standardabweichungen aus Triplikatmessungen.
Fig.4 zeigt die Screening Landscapes sechs verschiedener Fusionsproteinkonstrukte aus HRP und SpG mit Oder ohne Hexahistidin-Tag Oder Pentaglycin-Linker aus Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab (A=SpG-HRP; B= 6xH-SpG-HRP; C= SpG-5xG-HRP; D= 6xH-SpG-5xG-HRP; E= HRP-5xG-SpG; F= HRP-SpG) . Hellgraue Balken sind gemessene Enzymaktivitäten produzierter unmodifizierter Wildtyp-HRP als Positivkontrollen. Schwarze Balken rechts davon sind gemessene Enzymaktivitäten der angegebenen produzierten Fusionsproteinkonstrukte durch verschiedene Transformanten. BEISPIEL:
Material und Methoden
Stämme und Vektoren P. pastoris Stämme basierten auf dem Stamm CBS 7435 (ident mit NRRL Y-11430 und ATCC 76273) mit Muts Phänotyp. Als Produktionsstamm für die Herstellung von rekombinanten Proteinen wurde PpFWK3 verwendet (Krainer FW, et al. Sci. Rep. 3(2013):3279-91). Das Nukleinsäuremolekül codierend das aus drei IgG-Bindungsdomänen bestehende SpG Polypeptid (Streptococcal protein G; Olsson A, et al. Eur. J. Biochem. 168 (1987) :319-24; Goward CR, et al. Biochem. J. 267(1990):171-7) wurde Codon-optimiert und als sogenannter "gBlock" als synthetisches Oligonukleotid bestellt (Integrated DNA Technologies, Belgien):
CTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCACCATCACCACCATCACACTTACAAGTTGATCCTGAACG
GAAAGACCTTGAAGGGAGAAACCACTACTGAGGCTGTCGATGCTGCCACTGCCGAAAAGGTCTT
CAAGCAGTATGCCAACGACAACGGTGTTGACGGTGAGTGGACCTACGACGATGCCACCAAAACT
TTCACTGTCACTGAGAAGCCTGAAGTCATTGATGCTTCTGAGTTAACCCCTGCTGTGACTACCT
ACAAGTTGGTTATCAACGGAAAGACTTTGAAGGGTGAAACCACCACTGAAGCCGTTGATGCTGC AACTGCCGAAAAGGTCTTCAAGCAATACGCtAAtGATAACGGAGTTGACGGAGAGTGGACTTAC GATGACGCTACTAAGACTTTCACTGTTACTGAGAAGCCAGAGGTTATCGACGCTTCAGAGTTGA CTCCAGCAGTTACTACTTACAAGTTAGTCATCAACGGAAAGACCTTGAAGGGTGAAACTACTAC CAAGGCTGTGGATGCCGAAACCGCAGAAAAGGCCTTCAAGCAGTACGCTAACGACAATGGTGTG GATGGTGTTTGGACCTACGATGATGCTACTAAGACCTTCACCGTCACCGAGGGAGGAGGTGGTG GACAACTTACTCCAACCTTCTACGATAACTCTTG (SEQ ID Nr. 59)
Sechs Fusionskonstrukte von SpG und HRP CIA (Meerrettichperoxidase CIA; UniProt ID: K7ZWW6) wurden mit Oder ohne Hexahistidin-Tag bzw. Pentaglycin-Linker mit den Primern aus Tabelle 1 erstellt (siehe Fig. 1).
Tabelle 1. Oliaonukleotidorimer.
Produktion, Aufreinigung und Charakterisierung von HRP-SpG
Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab wurden in Deep-Well-Platten durchgeführt. Die Stämme wurden in 250 pL BMD1% Minimalmedium (25 μΜ Hemin, 11 g/L alpha-D(+)-glucose monohydrate, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D(+)-Biotin, 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0) bei 28 °C, 320 rpm („revolutions per minute"; Umdrehungen pro Minute) und 80%
Luftfeuchtigkeit gezüchtet. Nach ca. 60 h, wurde die rekombinante Expression durch Zugabe von 250 pL BMM2 (1% v/v
Methanol, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D(+)-Biotin, 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0) induziert. Nach ca. 10, 24 und 48 h folgten drei Zugaben von 50 pL BMM10 (5% v/v Methanol, 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L D ( + )-Biotin, 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.0). Ca. 72 h nach BMM2-Zugabe wurden die Zellen bei 3220 x g für 15 min abzentrifugiert (Weis R, et al. FEMS Yeast Res. 5(2004):179-189/ Krainer FW, et al. Microb. Cell Fact. 14(2015):4). HRP Aktivität wurde durch Mischung von 15 pL Kulturüberstand mit 140 pL Assay-Lösung (1 mM ABTS, 0.9 mM H202, 50 mM Natriumacetat, pH 4.5) in einer Mikrotiterplatte über einen Absorptionsanstieg bei 405 nm bestimmt (Morawski B, et al. Protein Eng. 13(2000):377-384).
Bioreaktorkultivierungen wurden in 1.2 L-Biostat® B-Bioreaktoren (Sartorius) durchgeführt. NH4OH wurde sowohl als Stickstoffquelle als auch als pH-Regulator verwendet, urn einen pH-Wert von 6 zu erhalten. Ein d02-Mindestlevel von 30% wurde durch Kaskadenkontrolle festgelegt. Eine 50 mL-Vorkultur wurde zwei Tage lang bei 28 °C, 90 rpm und 80% Luftfeuchtigkeit kultiviert und zur Inokulation einer Batch-Kultur in 450 mL autoklaviertem BSM Medium mit 2.18 mL PTM1 Lösung und 2.18 mL 200 mg/L D(+)-Biotinlösung benützt. Nach Verbrauch des Glycerins (erkennbar durch einen steten d02-Anstieg) wurde eine Glycerin-Fedbatch-Kultur gestartet (Zugabe von 34.5 g Glycerin über 7 h). Nach Zugabe von 30 pM Hemin, wurden 60.4 g Methanol über 136.6 h zugegeben, urn die PAOXl-regulierte Expression zu induzieren. Die Zellen wurden bei 17700 x g fiir 40 min abzentrifugiert und der Überstand durch 0.2 pM Zelluloseacetat-Filter (Sartorius) filtriert.
Proteinkonzentration und Pufferwechsel wurden mit Vivaflow® 50-Kassetten (30 kDa Molekulargewichtsausschlussgrenze) und Vivaspin® 2O-Zentrifugalkonzentratoren (3 kDa
Molekulargewichtsausschlussgrenze) (Sartorius) durchgeführt. Vor Ni2+ Affinitätschromatographie auf einer HisTrap FF Säule (GE Healthcare) wurde der Puffer zu Kalzium-hältiger Tris-gepufferter Salzlösung (Ca-TBS; 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5 eingestellt mit HC1) gewechselt und ankonzentriert. Die Säulen wurden mit mindestens 5 Säulenvolumina gewaschen. Die Elution wurde mit 100 mM Imidazol in Ca-TBS durchgeführt.
Elutionsfraktionen wurden vereint, zu <1 mL ankonzentriert und auf eine HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 prep grade Säule (GE Healthcare) zur Größenausschlusschromatographie bei einem Fluss von 0.3 mL/min mit Ca-TBS geladen.
Direkter ELISA wurde mit humanen IgGs Oder mit Hasen-IgGs als Antigenen durchgeführt. Durchsichtige MICROLON® high-binding Mikroplatten (Greiner Bio-One) wurden mit 100 pL IgGs mit Konzentrationen von 20 - 0.01953125 pg/mL in Bindepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0) bei 4 °C über Nacht Oder bei 37 °C für 2 h inkubiert. Die Wells wurden dreimal für 5 min bei 600 rpm auf einer Schüttelplattform mit Waschpuffer (0.05% v/v Tween® 20, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5) gewaschen. Blocking wurde durch Inkubation mit 200 pL Blocking-Puffer (1.5% w/v BSA in Waschpuffer) bei 37 °C für 1 h erreicht, gefolgt von drei Waschschritten. Binden der IgGs durch HRP-SpG Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 100 pL 0.1 pg/mL HRP-SpG (verdünnt in Blocking-Puffer) und Inkubation bei 25 °C für 1 h erreicht, gefolgt von sechs Waschschritten. Nach 15 min Inkubation mit 100 pL Detektionslösung (0.5 mM TMB, 2.9 mM H202 in 50 mM Natriumcitratpuffer, pH 5.5) und anschließender Zugabe von 100 pL 1 M H2S04 wurden die gebundenden Antigene durch Absorptionsmessung bei 450 nm detektiert.
Ergebnisse
Rekombinante Fusionsproteine zwischen HRP und SpG weisen eine konstante 1:1 Stöchiometrie auf und sind daher homogener und reproduzierbarer als Konjugate beider Polypeptide. Sechs Fusionsproteinkonstrukte aus HRP und SpG (siehe Fig. 1) wurden generiert und in Kultivierungen im Mikroliter-Maßstab nach HRP Aktivität gescreent (siehe Fig. 4). Im Falle einer Fusion von SpG an HRP zeigten drei N-terminale Fusionskonstrukte (SpG-HRP, 6xH-SpG-HRP, SpG-5xG-HRP) nur kaum detektierbare HRP Aktivität. Die Transformation von Konstrukten, bei denen SpG an den C-Terminus der HRP fusioniert war, resultierte überraschenderweise in P. pastoris Stämmen, die Proteine mit einer bis zu 6-mal höheren HRP Aktivität produzierten als Stämme, die Wildtyp-HRP produzierten. Ein Konstrukt 6xH-HRP-SpG (SEQ ID Nr. 37) wurde mit vergleichbaren Ausbeuten produziert wie Konstrukt HRP-SpG (SEQ ID Nr. 38) und wurde für die weiteren Experimente ausgewählt.
Um ausreichende Mengen für Funktionstests des Fusionsproteins zu produzieren, wurde der entsprechende Stamm in einem 1,2 L-Bioreaktor kultiviert. Nach insgesamt 160 h Kultur (136 h davon unter Methanol-Induktion) wurden die volumetrischen und spezifischen HRP-Aktivitäten bestimmt. Die finale volumetrische Aktivität lag bei 183 U/mL, die spezifische Aktivität bei 227 U/mg (Fig. 2A). Beide Aktivitäten stiegen auch am Ende der Kultivierung noch an, weshalb bei längerer Kultivierung sogar noch höhere Ausbeuten erreicht werden können. Basierend auf einer spezifischen Aktivität von 1624±175 U/mg des aufgereinigten Fusionsproteins wurden ca. 113 mg/L des aktiven Fusionsproteins in der Kultur produziert.
Nach Ni2+ Affinitätschromatographie wurde Größenausschlusschromatographie zur finalen Aufreinigung durchgeführt. Die Elution von Protein und Häm wurde über die Absorptionen bei 280 bzw. 403 nm verfolgt. Das Häm-hältige Protein eluierte in einem kleineren ersten und einem dominanteren Hauptpeak (Fig. 2B), welche zwei verschiedene Glycospezies desselben Proteins darstellten. Die beiden Spezies können entweder kombiniert werden, um die Ausbeute funktioneller HRP-SpG zu maximieren, oder der erste kleinere Peak kann verworfen werden, um die Homogenität der Präparation zu maximieren.
Um das funktionelle Binden des HRP-SpG Fusionsproteins an IgGs zu zeigen, wurden direkte ELISAs mit immobilisierten IgGs aus menschlichem Serum oder Hasen-Serum als Antigene durchgeführt. In beiden Fallen konnte ein Konzentrations-abhängiges Signal beobachtet werden (Fig. 3). Dies deutet auf Bindung des rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins an die IgGs der beiden Spezies hin. Fusionsproteine aus beiden Größenausschluss-Peaks zeigten äquivalente HRP-Aktivitäten und IgG-Bindeverhalten. Folglich handelte es sich bei beiden Spezies tatsächlich um funktionelles Fusionsprotein.
Dieses Beispiel zeigt, dass Fusionskonstrukte von HRP and SpG besonders gut von Wirtszellen wie P. pastoris sekretiert werden, wenn das SpG an den C-Terminus von HRP fusioniert wird. Im Bioreaktor konnte eine Ausbeute von über 110 mg/L Fusionsprotein erreicht werden. Üblicherweise wird HRP Aktivität von P. pastoris in deutlich geringeren Ausbeuten von unter 10 mg/L (Morawski B, et al. Biotechnol. Bioeng. 76(2001):99-107) produziert. Direkte ELISAs mit IgGs aus zwei Säugetier-Spezies bestätigten zudem die Anwendbarkeit des produzierten rekombinanten HRP-SpG Fusionsproteins in der Immunohistochemie.
SEQUENZPROTOKOLL <110> Technische Universität Graz <120> Fusionsprotein <130> 47346 <160> 75 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 323
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 1
Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 1. 5 10 15 lie Val Arg Asp Thr lie Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val lie 65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Leu Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140
Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser 145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gin 165 170 175
Cys Arg Phe He Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220
Thr Pro Thr lie Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gin 225 230 235 240
Lys Gly Leu He Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255
Thr Asp Thr He Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gin Thr 260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn He Thr 275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin He Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp Met Val Glu Val Val Asp Phe Val 305 310 315 320
Ser Ser Met <210> 2 <211> 323
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 2
Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Thr Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 1. 5 10 15
He Val Arg Asp He He He Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg He 20 25 30
Thr Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Leu Thr Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Leu Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Thr Val 65 70 75 80
Asp Arg lie Lys Ala Ala Val Glu Arg Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Val Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Asn Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140
Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ala Phe Ala Lys Val Gly Leu Asp Arg Pro 145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gin 165 170 175
Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gin Gin 195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Gin Ser Val Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220
Thr Pro Thr Val Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Lys Glu Gin 225 230 235 240
Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255
Thr Asp Thr lie Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asp Gly Thr Gin Lys 260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asn Arg Met Gly Asn lie Thr 275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Glu He Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp lie Val Glu Val Val Asp Phe Val 305 310 315 320
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 3
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He Val Arg Asp He He He Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg He 20 25 30
Ala Ala Ser He Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser He Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Val 65 70 75 80
Asp Arg He Lys Ala Ala Val Glu Arg Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Val Leu Thr He Ala Ala Gin Gin Ser Val Asn Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Arg Gin 115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Ser Phe Thr 130 135 140
Leu Pro Glu Leu Lys Ala Ala Phe Ala Asn Val Gly Leu Asn Arg Pro 145 150 155 160
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Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190
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Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255
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Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asn Arg Met Gly Asn lie Thr 275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Glu lie Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp lie Val Glu Val Val Asp Phe Val 305 310 315 320
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Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60
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Cys Ala Asp Leu Leu Ala lie Ala Ala Gin Lys Ser Val Val Leu Ala 100 105 no
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Cys Gin Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Ser Gly Lys 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asp Lys Ser Tyr Leu Ser Thr Leu Arg Lys Gin 195 200 205
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Phe Phe Asp Ala Phe Val Glu Ala Met He Arg Met Gly Asn Leu Ser 275 280 285
Pro Ser Thr Gly Lys Gin Gly Glu He Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Lys Pro Lys He Met Asp Val Val Asp Thr Asn Asp Phe Ala 305 310 315 320
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 6
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 8
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 9
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Gin Ala Phe Ala Gin Ser Met lie Asn Met Gly Asn He Ser Pro Leu 275 280 285
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 10
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 11
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Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
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Ala Asp Thr lie Pro Leu Val Arg Ser Tyr Ala Asp Gly Thr Gin Lys 260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Met Glu Ala Met Asn Arg Met Gly Asn He Thr 275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg Gin Asn Cys Arg Val He 290 295 300
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 12
Lys Leu Arg Pro Asp Phe Tyr Leu Lys Thr Cys Pro Ser Val Phe Gin 1. 5 10 15 lie lie Gly Asn Val lie Val Asp Glu Leu Gin Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Ala Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Arg Gly 35 40 45
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Lys Asp Ala Ala Pro Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asp Val Val 65 70 75 80
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Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Phe Gly Arg Ala Gin 165 170 175
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<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 13
Lys Leu Arg Pro Asp Phe Tyr Leu Lys Thr Cys Pro Ser Val Phe Gin 1. 5 10 15 lie lie Gly Asn Val lie Val Asp Glu Leu Gin Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Ala Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Arg Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Asp Asn Ser Thr Ser Phe Gin Ser Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Ala Pro Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asp Val Val 65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Cys Pro Gly Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Val Leu Ala lie Ser Ala Gin lie Ser Val Leu Leu Ser 100 105 110
Gly Gly Pro Trp Trp Pro Val Leu Leu Gly Arg Arg Asp Gly Val Glu 115 120 125
Ala Phe Phe Asp Leu Ala Asn Thr Ala Leu Pro Asn Pro Phe Ala Pro 130 135 140
Leu Thr Glu Leu Lys Glu Lys Phe Ala Asp Val Gly Leu Lys Arg Ala 145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Phe Gly Arg Ala Gin 165 170 175
Cys Leu Leu Val Thr Pro Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Gly Thr Asn Lys 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Pro Ser Tyr Leu Val Glu Leu Arg Arg Leu 195 200 205
Cys Pro Gin Asn Gly Asn Gly Thr Val Leu Leu Asn Phe Asp Leu Val 210 215 220
Thr Pro Asn Ala Phe Asp Arg Gin Tyr Tyr Thr Asn Leu Arg Asn Gly 225 230 235 240
Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Thr Pro Gly Ala 245 250 255
Asp Thr lie Pro Leu Val Asn Leu Tyr Ser Lys Asn Thr Phe Ala Phe 260 265 270
Phe Gly Ala Phe Val Asp Ala He lie Arg Met Gly Asn He Gin Pro 275 280 285
Leu Thr Gly Thr Gin Gly Glu He Arg Gin Asn Cys Arg Val Val Asn 290 295 300
Ser Arg He Arg Gly Met Glu Asn Asp Asp Gly Val Val Ser Ser He 305 310 315 320 <210> 14 <211> 296
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 14
Gin Leu Thr Pro Asn Phe Tyr Ser Thr Ser Cys Pro Asn Leu Leu Ser 1. 5 10 15
Thr Val Gin Ser Ala Val Lys Ser Ala Val Asn Ser Glu Ala Arg Met 20 25 30
Gly Ala Ser lie Val Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser lie Leu Leu Asp Asp Thr Ser Ser Phe Thr Gly Glu 50 55 60
Gin Asn Ala Asn Pro Asn Arg Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asn Val lie 65 70 75 80
Asp Asn lie Lys Ala Ala Val Glu Lys Ala Cys Pro Gly Val Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp lie Leu Ala lie Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Val Leu 100 105 110
Gly Gly Pro Asn Trp Thr Val Lys Val Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr 115 120 125
Ala Ser Gin Ala Ala Ala Asn Ser Asn lie Pro Ala Pro Thr Ser Ser 130 135 140
Leu Ser Gin Leu lie Ser Ser Phe Ser Ala Val Gly Leu Ser Thr Arg 145 150 155 160
Asp Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr lie Gly Gin Ser Arg Cys 165 170 175
Thr Ser Phe Arg Thr Arg lie Tyr Asn Glu Thr Asn lie Asn Ala Ala 180 185 190
Phe Ala Thr Thr Arg Gin Arg Thr Cys Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly 195 200 205
Asp Gly Asn Leu Ala Pro Leu Asp Val Thr Thr Ala Ala Ser Phe Asp 210 215 220
Asn Asn Tyr Phe Lys Asn Leu Met Thr Gin Arg Gly Leu Leu His Ser 225 230 235 240
Asp Gin Glu Leu Phe Asn Gly Gly Ser Thr Asp Ser lie Val Arg Gly 245 250 255
Tyr Ser Asn Asn Pro Ser Ser Phe Ser Ser Asp Phe Ala Ala Ala Met 260 265 270 lie Lys Met Gly Asp lie Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Glu lie 275 280 285
Arg Lys Val Cys Gly Arg Thr Asn 290 295 <210> 15 <211> 302
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 15
Gin Leu Gin Met Asn Phe Tyr Ala Lys Ser Cys Pro Asn Ala Glu Lys 1. 5 10 15 lie lie Ser Asp His lie Gin Lys His lie Pro Ser Gly Pro Ser Leu 20 25 30
Ala Ala Pro Leu lie Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Arg Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser Val Leu lie Asn Ser Thr Ser Gly Asn Ala Glu Lys 50 55 60
Asp Ser Ala Pro Asn Leu Thr Leu Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu Arg 65 70 75 80 lie Lys Thr Leu Leu Glu Ala Glu Cys Pro Lys Thr Val Ser Cys Ala 85 90 95
Asp lie lie Ala Leu Thr Ala Arg Asp Ala Val Val Ala Thr Gly Gly 100 105 110
Pro Ser Trp Lys Val Pro Thr Gly Arg Arg Asp Gly Arg lie Ser Asn 115 120 125
Thr Thr Glu Ala Leu Asn Asn lie Pro Pro Pro Thr Ser Asn Phe Thr 130 135 140
Thr Leu Gin Arg Leu Phe Ala Asn Gin Gly Leu Asn Leu Lys Asp Leu 145 150 155 160
Val Leu Leu Ser Gly Ala His Thr lie Gly Val Ser His Cys Ser Ser 165 170 175
Met Asn Thr Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Thr Thr Val Lys Gin Asp Pro 180 185 190
Ser Leu Asp Ser Glu Tyr Ala Ala Asn Leu Lys Ala Asn Lys Cys Lys 195 200 205
Ser Leu Asn Asp Asn Thr Thr lie Leu Glu Met Asp Pro Gly Ser Ser 210 215 220
Lys Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Tyr Arg Leu Val Leu Lys Arg Arg Gly 225 230 235 240
Leu Phe Gin Ser Asp Ser Ala Leu Thr Thr Asn Ser Ala Thr Leu Lys 245 250 255
Met lie Asn Asp Leu Val Asn Gly Pro Glu Lys Lys Phe Leu Lys Ala 260 265 270
Phe Ala Lys Ser Met Glu Lys Met Gly Arg Val Lys Val Lys Thr Gly 275 280 285
Ser Ala Gly Val lie Arg Thr Arg Cys Ser Val Ala Gly Ser 290 295 300 <210> 16 <211> 297
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 Ο 0> 16
Arg Leu Thr Thr Asn Phe Tyr Ser Lys Ser Cys Pro Arg Phe Phe Asp 1. 5 10 15 lie Val Arg Asp Thr lie Ser Asn Lys Gin lie Thr Thr Pro Thr Thr 20 25 30
Ala Ala Ala Thr lie Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe Pro Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu lie Ser Ser Thr Ala Phe Asn Thr Ala Glu 50 55 60
Arg Asp Ser Ser lie Asn Leu Ser Leu Pro Gly Asp Gly Phe Asp Val 65 70 75 80 lie Val Arg Ala Lys Thr Ala lie Glu Leu Ala Cys Pro Asn Thr Val 85 90 95
Ser Cys Ser Asp lie lie Thr Val Ala Thr Arg Asp Leu Leu Val Thr 100 105 110
Val Gly Gly Pro Tyr Tyr Asp Val Tyr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Arg 115 120 125 lie Ser Lys Ser Ser Leu Leu Thr Asp Leu Leu Pro Leu Pro Ser Ser 130 135 140
Pro lie Ser Lys Thr lie Arg Gin Phe Glu Ser Lys Gly Phe Thr lie 145 150 155 160
Gin Glu Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Ser lie Gly Phe Ser His 165 170 175
Cys Lys Glu Phe Val Asn Arg Val Ala Gly Asn Asn Thr Gly Tyr Asn 180 185 190
Pro Arg Phe Ala Gin Ala Leu Lys Gin Ala Cys Ser Asn Tyr Pro Lys 195 200 205
Asp Pro Thr Leu Ser Val Phe Asn Asp lie Met Thr Pro Asn Arg Phe 210 215 220
Asp Asn Met Tyr Tyr Gin Asn lie Pro Lys Gly Leu Gly Leu Leu Glu 225 230 235 240
Ser Asp His Gly Leu Tyr Ser Asp Pro Arg Thr Arg Pro Phe Val Asp 245 250 255
Leu Tyr Ala Arg Asp Gin Asp Leu Phe Phe Lys Asp Phe Ala Arg Ala 260 265 270
Met Gin Lys Leu Ser Leu Phe Gly Val Lys Thr Gly Arg Arg Gly Glu 275 280 285 lie Arg Arg Arg Cys Asp Ala lie Asn 290 295 <210> 17 <211> 265
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 17
Gin Leu Asn Ala Thr Phe Tyr Ser Gly Thr Cys Pro Asn Ala Ser Ala 1. 5 10 15 lie Val Arg Ser Thr lie Gin Gin Ala Leu Gin Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Gly Ala Ser Leu lie Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser Leu Leu Leu Asp Asp Thr Gly Ser lie Gin Ser Glu 50 55 60
Lys Asn Ala Pro Ala Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asn Val Val 65 70 75 80
Asp Asp lie Lys Thr Ala Leu Glu Asn Ala Cys Pro Gly lie Val Ser 85 90 95
Cys Ser Asp lie Leu Ala Leu Ala Ser Glu Ala Ser Val Ser Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Thr Val Leu Val Gly Arg Arg Asp Gly Leu Thr 115 120 125
Ala Asn Leu Ser Gly Ala Asn Ser Ser Leu Pro Ser Pro Phe Glu Gly 130 135 140
Leu Asn Asn lie Thr Ser Lys Phe Leu Ala Val Gly Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160
Asp Val Val Val Leu Ser Gly Ala His Thr Phe Gly Arg Gly Gin Cys 165 170 175
Val Thr Phe Asn Asn Arg Leu Phe Asn Phe Asn Gly Thr Gly Ser Pro 180 185 190
Asp Pro Thr Leu Asn Ser Thr Leu Leu Ser Ser Leu Gin Gin lie Cys 195 200 205
Pro Gin Asn Gly Ser Gly Ser Ala lie Thr Asn Leu Asp Leu Thr Thr 210 215 220
Pro Asp Ala Phe Asp Ser Asn Tyr Tyr Thr Asn Leu Gin Ser Asn Asn 225 230 235 240
Gly Leu Leu Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Asn Thr Gly Ser Pro 245 250 255
Thr lie Ala lie Val lie Leu Cys Lys 260 265 <210> 18 <211> 278
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 18
Gin Leu Asn Ala Thr Phe Tyr Ser Gly Thr Cys Pro Asn Ala Ser Ala 1. 5 10 15 lie Val Arg Ser Thr lie Gin Gin Ala Leu Gin Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Gly Ala Ser Leu lie Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser Leu Leu Leu Asp Asp Thr Gly Ser lie Gin Ser Glu 50 55 60
Lys Asn Ala Pro Ala Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asn Val Val 65 70 75 80
Asp Asp lie Lys Thr Ala Leu Glu Asn Ala Cys Pro Gly lie Val Ser 85 90 95
Cys Ser Asp lie Leu Ala Leu Ala Ser Glu Ala Ser Val Ser Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Thr Val Leu Val Gly Arg Arg Asp Gly Leu Thr 115 120 125
Ala Asn Leu Ser Gly Ala Asn Ser Ser Leu Pro Ser Pro Phe Glu Gly 130 135 140
Leu Asn Asn lie Thr Ser Lys Phe Leu Ala Val Gly Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160
Asp Val Val Val Leu Ser Gly Ala His Thr Phe Gly Arg Gly Gin Cys 165 170 175
Val Thr Phe Asn Asn Arg Leu Phe Asn Phe Asn Gly Thr Gly Ser Pro 180 185 190
Asp Pro Thr Leu Asn Ser Thr Leu Leu Ser Ser Leu Gin Gin lie Cys 195 200 205
Pro Gin Asn Gly Ser Gly Ser Ala lie Thr Asn Leu Asp Leu Thr Thr 210 215 220
Pro Asp Ala Phe Asp Ser Asn Tyr Tyr Thr Asn Leu Gin Ser Asn Asn 225 230 235 240
Gly Leu Leu Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Asn Thr Gly Ser Pro 245 250 255
Thr lie Ala lie Val lie Leu Leu Gin Val Thr Lys Pro Cys Phe Leu 260 265 270
Arg Leu Leu Leu Ser Leu 275 <210> 19 <211> 298
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 19
Gin Ala lie Ser lie Ser lie Thr lie Arg lie Gly Phe Tyr Leu Thr 1. 5 10 15
Thr Cys Pro Thr Ala Glu lie lie Val Arg Asn Ala Val Arg Ala Gly 20 25 30
Phe Asn Ser Asp Pro Arg lie Ala Pro Gly lie Leu Arg Met His Phe 35 40 45
His Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Asp Gly Ser Val Leu lie Ser Gly 50 55 60
Ser Asn Thr Glu Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Ser Leu Arg Gly Phe 65 70 75 80
Glu Val He Glu Asn Ala Lys Thr Gin Leu Glu Ala Ala Cys Pro Gly 85 90 95
Val Val Ser Cys Ala Asp lie Leu Ala Leu Ala Ala Arg Asp Thr Val 100 105 110
Val Leu Thr Arg Gly He Gly Trp Gin Val Pro Thr Gly Arg Arg Asp H5 120 125
Gly Arg Val Ser Val Ala Ser Asn Ala Asn Asn Leu Pro Gly Pro Arg 130 135 140
Asp Ser Val Ala Val Gin Gin Gin Lys Phe Ser Ala Leu Gly Leu Asn 145 150 155 160
Thr Arg Asp Leu Val Val Leu Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Thr Ala 165 170 175
Gly Cys Gly Val Phe Arg Asp Arg Leu Phe Asn Asn Thr Asp Pro Asn 180 185 190
Val Asp Gin Pro Phe Leu Thr Gin Leu Gin Thr Lys Cys Pro Arg Asn 195 200 205
Gly Asp Gly Ser Val Arg Val Asp Leu Asp Thr Gly Ser Gly Thr Thr 210 215 220
Phe Asp Asn Ser Tyr Phe He Asn Leu Ser Arg Gly Arg Gly Val Leu 225 230 235 240
Glu Ser Asp His Val Leu Trp Thr Asp Pro Ala Thr Arg Pro lie Val 245 250 255
Gin Gin Leu Met Ser Ser Ser Gly Asn Phe Asn Ala Glu Phe Ala Arg 260 265 270
Ser Met Val Lys Met Ser Asn He Gly Val Val Thr Gly Thr Asn Gly 275 280 285
Glu He Arg Lys Val Cys Ser Ala He Asn 290 295 <210> 20 <211> 289
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 20
Leu Ser Met Thr Tyr Tyr Met Met Ser Cys Pro Met Ala Glu Gin lie 1. 5 10 15
Val Lys Asn Ser Val Asn Asn Ala Leu Gin Ala Asp Pro Thr Leu Ala 20 25 30
Ala Gly Leu He Arg Met Leu Phe His Asp Cys Phe He Glu Gly Cys 35 40 45
Asp Ala Ser He Leu Leu Asp Ser Thr Lys Asp Asn Thr Ala Glu Lys 50 55 60
Asp Ser Pro Ala Asn Leu Ser Leu Arg Gly Tyr Glu He He Asp Asp 65 70 75 80
Ala Lys Glu Lys Val Glu Asn Met Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala 85 90 95
Asp He Val Ala Met Ala Ala Arg Asp Ala Val Phe Trp Ala Gly Gly 100 105 110
Pro Tyr Tyr Asp lie Pro Lys Gly Arg Phe Asp Gly Lys Arg Ser Lys 115 120 125
He Glu Asp Thr Arg Asn Leu Pro Ser Pro Phe Leu Asn Ala Ser Gin 130 135 140
Leu lie Gin Thr Phe Gly Asn Arg Gly Phe Ser Pro Gin Asp Val Val 145 150 155 160
Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Leu Gly Val Ala Arg Cys Ser Ser Phe 165 170 175
Lys Ala Arg Leu Thr Thr Pro Asp Ser Ser Leu Asp Ser Thr Phe Ala 180 185 190
Asn Thr Leu Thr Arg Thr Cys Asn Ala Gly Asp Asn Ala Glu Gin Pro 195 200 205
Phe Asp Ala Thr Arg Asn Asp Phe Asp Asn Ala Tyr Phe Asn Ala Leu 210 215 220
Gin Arg Lys Ser Gly Val Leu Phe Ser Asp Gin Thr Leu Phe Asn Thr 225 230 235 240
Pro Arg Thr Arg Asn Leu Val Asn Gly Tyr Ala Leu Asn Gin Ala Lys 245 250 255
Phe Phe Phe Asp Phe Gin Gin Ala Met Arg Lys Met Ser Asn Leu Asp 260 265 270
Val Lys Leu Gly Ser Gin Gly Glu He Arg Gin Asn Cys Arg Thr He 275 280 285
Asn <210> 21 <211> 328
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 21
Lys Lys Pro Arg Arg Asp Val Pro He Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn i. ο ιυ 15
Phe Tyr Gin Arg Ala Cys Pro Lys Val Glu Lys lie lie Lys Lys Glu 20 25 30
Leu Lys Lys Val Phe Lys Arg Asp He Gly Leu Ala Ala Ala lie Leu 35 40 45
Arg He His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Glu Ala Ser Val 50 55 60
Leu Leu Ala Gly Ser Ala Ser Gly Pro Gly Glu Gin Ser Ser He Pro 65 70 75 80
Asn Leu Thr Leu Arg Gin Gin Ala Phe Val Val He Asn Asn Leu Arg 85 90 95
Ala Leu Val Gin Lys Gin Cys Gly Gin Val Val Ser Cys Ser Asp He 100 105 HO
Leu Ala Leu Ala Ala Arg Asp Ser He Val Leu Ser Gly Gly Pro Asp 115 120 125
Tyr Ala Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Phe Ala Thr Pro 130 135 140
Glu Thr Thr Leu Ala Asn Leu Pro Pro Pro Phe Ala Asn Ala Ser Gin 145 150 155 160
Leu He Ser Asp Phe Asn Asp Arg Asn Leu Asn He Thr Asp Leu Val 165 170 175
Ala Leu Ser Gly Gly His Thr He Gly He Ala His Cys Pro Ser Phe 180 185 190
Thr Asp Arg Leu Tyr Pro Asn Gin Asp Pro Thr Met Asn Lys Ser Phe 195 200 205
Ala Asn Ser Leu Lys Arg Thr Cys Pro Thr Ala Asn Ser Ser Asn Thr 210 215 220
Gin Val Asn Asp He Arg Ser Pro Asp Val Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr 225 230 235 240
Val Asp Leu Met Asn Arg Gin Gly Leu Phe Thr Ser Asp Gin Asp Leu 245 250 255
Phe Val Asp Lys Arg Thr Arg Gly lie Val Glu Ser Phe Ala lie Asp 260 265 270
Gin Asn Leu Phe Phe Asp His Phe Thr Val Ala Met lie Lys Met Gly 275 280 285
Gin Met Ser Val Leu Thr Gly Thr Gin Gly Glu lie Arg Ser Asn Cys 290 295 300
Ser Ala Arg Asn Thr Ala Ser Phe lie Ser Val Leu Glu Glu Gly lie 305 310 315 320
Val Glu Glu Ala Leu Ser Met lie 325 <210> 22 <211> 328
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 22
Lys Lys Pro Arg Arg Asp Val Pro He Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn 1. 5 10 15
Phe Tyr Gin Arg Ala Cys Pro Lys Val Glu Lys lie He Lys Lys Glu 20 25 30
Leu Lys Lys Val Phe Lys Arg Asp He Gly Leu Ala Ala Ala He Leu 35 40 45
Arg He His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Glu Ala Ser Val 50 55 60
Leu Leu Ala Gly Ser Ala Ser Gly Pro Gly Glu Gin Ser Ser He Pro 65 70 75 80
Asn Leu Thr Leu Arg Gin Gin Ala Phe Val Val He Asn Asn Leu Arg 85 90 95
Ala Leu Val Gin Lys Gin Cys Gly Gin Val Val Ser Cys Ser Asp He 100 105 HO
Leu Ala Leu Ala Ala Arg Asp Ser lie Val Leu Ser Gly Gly Pro Asp 115 120 125
Tyr Ala Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Phe Ala Thr Pro 130 135 140
Glu Thr Thr Leu Ala Asn Leu Pro Pro Pro Phe Ala Asn Ala Ser Gin 145 150 155 160
Leu lie Ser Asp Phe Asn Asp Arg Asn Leu Asn lie Thr Asp Leu Val 165 170 175
Ala Leu Ser Gly Gly His Thr lie Gly lie Ala His Cys Pro Ser Phe 180 185 190
Thr Asp Arg Leu Tyr Pro Asn Gin Asp Pro Thr Met Asn Lys Ser Phe 195 200 205
Ala Asn Ser Leu Lys Arg Thr Cys Pro Thr Ala Asn Ser Ser Asn Thr 210 215 220
Gin Val Asn Asp lie Arg Ser Pro Asp Val Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr 225 230 235 240
Val Asp Leu Met Asn Arg Gin Gly Leu Phe Thr Ser Asp Gin Asp Leu 245 250 255
Phe Val Asp Lys Arg Thr Arg Gly lie Val Glu Ser Phe Ala lie Asp 260 265 270
Gin Asn Leu Phe Phe Asp His Phe Thr Val Ala Met lie Lys Met Gly 275 280 285
Gin Met Ser Val Leu Thr Gly Thr Gin Gly Glu lie Arg Ser Asn Cys 290 295 300
Ser Ala Arg Asn Thr Ala Ser Phe lie Ser Val Leu Val Glu Gly lie 305 310 315 320
Val Glu Glu Ala Leu Ser Met lie 325 < 210 > 23 <211> 302
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 23
Gin Ala Ala Ala Arg Arg Pro Gly Pro lie Ser Gly Thr Arg lie Gly 1. 5 10 15
Phe Tyr Leu Thr Thr Cys Pro Thr Ala Glu lie lie Val Arg Asn Ala 20 25 30
Val Arg Ala Gly Phe Asn Ser Asp Pro Arg lie Ala Pro Gly lie Leu 35 40 45
Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Leu Gly Cys Asp Gly Ser Val 50 55 60
Leu lie Ser Gly Ser Asn Thr Glu Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Asn 65 70 75 80
Leu Arg Gly Phe Glu Val He Asp Asn Ala Lys Thr Gin Leu Glu Ala 85 90 95
Thr Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp lie Leu Ala Leu Ala Ala 100 105 110
Arg Asp Thr Val Val Leu Thr Arg Gly Leu Gly Trp Gin Val Pro Thr 115 120 125
Gly Arg Arg Asp Gly Arg Val Ser Val Ala Ser Asn Ala Asn Asn Leu 130 135 140
Pro Gly Pro Arg Asp Ser Val Ala Val Gin Gin Gin Lys Phe Ser Ala 145 150 155 160
Val Gly Leu Asn Thr Arg Asp Leu Val Val Leu Ala Gly Gly His Thr 165 170 175
He Gly Thr Ala Gly Cys Gly Val Phe Arg Asp Arg Leu Phe Asn Asn 180 185 190
Thr Asp Pro Asn Val Asn Gin Leu Phe Leu Thr Gin Leu Gin Thr Gin 195 200 205
Cys Pro Gin Asn Gly Asp Gly Ala Val Arg Val Asp Leu Asp Thr Gly 210 215 220
Ser Gly Thr Thr Phe Asp Asn Ser Tyr Phe lie Asn Leu Ser Arg Gly 225 230 235 240
Arg Gly Val Leu Glu Ser Asp His Val Leu Trp Thr Asp Pro Ala Thr 245 250 255
Arg Pro lie Val Gin Gin Leu Met Ser Pro Arg Gly Asn Phe Asn Ala 260 265 270
Glu Phe Ala Arg Ser Met Val Arg Met Ser Asn lie Gly Val Val Thr 275 280 285
Gly Ala Asn Gly Glu lie Arg Arg Val Cys Ser Ala Val Asn 290 295 300 <210> 24 <211> 302
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 24
Gin Ala Ala Ala Arg Arg Pro Gly Pro lie Ser Gly Thr Arg lie Gly 1. 5 10 15
Phe Tyr Leu Thr Thr Cys Pro Thr Ala Glu lie lie Val Arg Asn Ala 20 25 30
Val Arg Ala Gly Phe Asn Ser Asp Pro Arg lie Ala Pro Gly lie Leu 35 40 45
Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Leu Gly Cys Asp Gly Ser Val 50 55 60
Leu lie Ser Gly Ser Asn Thr Glu Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Asn 65 70 75 80
Leu Arg Gly Phe Glu Val lie Asp Asn Ala Lys Thr Gin Leu Glu Ala 85 90 95
Thr Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp He Leu Ala Leu Ala Ala 100 105 110
Arg Asp Thr Val Val Leu Thr Arg Gly Leu Gly Trp Gin Val Pro Thr 115 120 125
Gly Arg Arg Asp Gly Arg Val Ser Val Ala Ser Asn Ala Asn Asn Leu 130 135 140
Pro Gly Pro Arg Asp Ser Val Ala Val Gin Gin Gin Lys Phe Ser Ala 145 150 155 160
Val Gly Leu Asn Thr Arg Asp Leu Val Val Leu Ala Gly Gly His Thr 165 170 175 lie Gly Thr Ala Gly Cys Gly Val Phe Arg Asp Arg Leu Phe Asn Asn 180 185 190
Thr Asp Pro Asn Val Asn Gin Leu Phe Leu Thr Gin Leu Gin Thr Gin 195 200 205
Cys Pro Gin Asn Gly Asp Gly Ser Val Arg Val Asp Leu Asp Thr Gly 210 215 220
Ser Gly Thr Thr Phe Asp Asn Ser Tyr Phe He Asn Leu Ser Arg Gly 225 230 235 240
Arg Gly Val Leu Glu Ser Asp His Val Leu Trp Thr Asp Pro Ala Thr 245 250 255
Arg Pro lie Val Gin Gin Leu Met Ser Pro Arg Gly Asn Phe Asn Ala 260 265 270
Glu Phe Ala Arg Ser Met Val Arg Met Ser Asn He Gly Val Val Thr 275 280 285
Gly Ala Asn Gly Glu He Arg Arg Val Cys Ser Ala Val Asn 290 295 300 <210> 25 <211> 297
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 25
Arg Leu Thr Thr Asn Phe Tyr Ser Lys Ser Cys Pro Arg Phe Phe Asp 1. 5 10 15 lie Val Arg Asp Thr lie Ser Asn Lys Gin lie Thr Thr Pro Thr Thr 20 25 30
Ala Ala Ala Thr lie Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe Pro Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu lie Ser Ser Thr Ala Phe Asn Thr Ala Glu 50 55 60
Arg Asp Ser Ser lie Asn Leu Ser Leu Pro Gly Asp Gly Phe Asp Val 65 70 75 80 lie Val Arg Ala Lys Thr Ala lie Glu Leu Ala Cys Pro Asn Thr Val 85 90 95
Ser Cys Ser Asp lie lie Thr Val Ala Thr Arg Asp Leu Leu Val Thr 100 105 110
Val Gly Gly Pro Tyr Tyr Asp Val Tyr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Arg 115 120 125 lie Ser Lys Ser Ser Leu Leu Thr Asp Leu Leu Pro Leu Pro Ser Ser 130 135 140
Pro lie Ser Lys Thr lie Arg Gin Phe Glu Ser Lys Gly Phe Thr lie 145 150 155 160
Gin Glu Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Ser lie Gly Phe Ser His 165 170 175
Cys Lys Glu Phe Val Asn Arg Val Ala Gly Asn Asn Thr Gly Tyr Asn 180 185 190
Pro Arg Phe Ala Gin Ala Leu Lys Gin Ala Cys Ser Asn Tyr Pro Lys 195 200 205
Asp Pro Thr Leu Ser Val Phe Asn Asp lie Met Thr Pro Asn Arg Phe 210 215 220
Asp Asn Met Tyr Tyr Gin Asn He Pro Lys Gly Leu Gly Leu Leu Glu 225 230 235 240
Ser Asp His Gly Leu Tyr Ser Asp Pro Arg Thr Arg Pro Phe Val Asp 245 250 255
Leu Tyr Ala Arg Asp Gin Asp Leu Phe Phe Lys Asp Phe Ala Arg Ala 260 265 270
Met Gin Lys Leu Ser Leu Phe Gly Val Lys Thr Gly Arg Arg Gly Glu 275 280 285 lie Arg Arg Arg Cys Asp Ala lie Asn 290 295 <210> 26 <211> 313
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 26
Asp Asp Glu Ser Asn Tyr Gly Gly Gin Gly Lys Leu Phe Pro Gly Phe 1. 5 10 15
Tyr Ser Ser Ser Cys Pro Lys Ala Glu Glu lie Val Arg Ser Val Val 20 25 30
Ala Lys Ala Val Ala Arg Glu Thr Arg Met Ala Ala Ser Leu Met Arg 35 40 45
Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Asp Gly Ser Leu Leu 50 55 60
Leu Asp Ser Ser Gly Ser He Val Thr Glu Lys Asn Ser Asn Pro Asn 65 70 75 80
Ser Arg Ser Ala Arg Gly Phe Glu Val Val Asp Glu lie Lys Ala Ala 85 90 95
Leu Glu Asn Glu Cys Pro Asn Thr Val Ser Cys Ala Asp Ala Leu Thr 100 105 HO
Leu Ala Ala Arg Asp Ser Ser Val Leu Thr Gly Gly Pro Ser Trp Met 115 120 125
Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ala Ser Leu Ser Gly Ser 130 135 140
Asn Asn Asn lie Pro Ala Pro Asn Asn Thr Phe Asn Thr lie Leu Ser 145 150 155 160
Arg Phe Asn Ser Gin Gly Leu Asp Leu Thr Asn Val Val Ala Leu Ser 165 170 175
Gly Ser His Thr He Gly Phe Ser Arg Cys Thr Ser Phe Arg Gin Arg 180 185 190
Leu Tyr Asn Gin Ser Gly Asn Gly Ser Pro Asp Thr Thr Leu Glu Gin 195 200 205
Ser Tyr Ala Ala Asn Leu Arg His Arg Cys Pro Arg Ser Gly Gly Asp 210 215 220
Gin Asn Leu Ser Glu Leu Asp lie Asn Ser Ala Gly Arg Phe Asp Asn 225 230 235 240
Ser Tyr Phe Lys Asn Leu He Glu Asn Met Gly Leu Leu Asn Ser Asp 245 250 255
Gin Val Leu Phe Ser Ser Asn Asp Glu Ser Arg Glu Leu Val Lys Lys 260 265 270
Tyr Ala Glu Asp Gin Glu Glu Phe Phe Glu Gin Phe Ala Glu Ser Met 275 280 285
Val Lys Met Gly Asn He Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Gin He 290 295 300
Arg Lys Asn Cys Arg Lys He Asn Ser 305 310 <210> 27 <211> 300
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 27
Arg Arg Pro Arg Val Gly Phe Tyr Gly Asn Arg Cys Arg Lys Val Glu 1. 5 10 15
Ser He Val Arg Ser Val Val Arg Ser His Phe Arg Cys Asn Pro Ala 20 25 30
Asn Ala Pro Gly lie Leu Arg Met Tyr Phe His Asp Cys Phe Val Asn 35 40 45
Gly Cys Asp Gly Ser He Leu Leu Ala Gly Asn Thr Ser Glu Arg Thr 50 55 60
Ala Gly Pro Asn Arg Ser Leu Arg Gly Phe Glu Ala lie Glu Glu Ala 65 70 75 80
Lys Thr Arg Leu Glu Asn Ala Cys Pro Asn Thr Val Ser Cys Ala Asp 85 90 95
He Leu Thr Leu Ala Ala Arg Asp Ala Val Val Trp Thr Gly Gly Lys 100 105 110
Gly Trp Ser Val Pro Leu Gly Arg Leu Asp Gly Arg Arg Ser Glu Ala 115 120 125
Ser Asp Val Asn Leu Pro Gly Pro Ser Asp Pro Val Ala Lys Gin Lys 130 135 140
Gin Asp Phe Ala Ala Lys Asn Leu Asn Thr Leu Asp Leu Val Thr Leu 145 150 155 160
Val Gly Gly His Thr He Gly Thr Ala Gly Cys Gly Leu Val Arg Gly 165 170 175
Arg Phe Phe Asn Phe Asn Gly Thr Gly Gin Pro Asp Pro Ser He Asp 180 185 190
Pro Ser Phe Val Pro Leu Val Gin Ala Arg Cys Pro Gin Asn Gly Asn 195 200 205
Ala Thr Thr Arg Val Asp Leu Asp Thr Gly Ser Ala Gly Asp Phe Asp 210 215 220
Thr Ser Tyr Leu Ser Asn Val Arg Ser Ser Arg Val Val Leu Gin Ser 225 230 235 240
Asp Leu Val Leu Trp Lys Asp Thr Glu Thr Arg Ala He He Glu Arg 245 250 255
Leu Leu Gly Leu Arg Arg Pro Val Leu Arg Phe Gly Ser Glu Phe Gly 260 265 270
Lys Ser Met Thr Lys Met Ser Leu lie Glu Val Lys Thr Arg Leu Ser 275 280 285
Asp Gly Glu lie Arg Arg Val Cys Ser Ala lie Asn 290 295 300 <210> 28 <211> 300
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 28
Arg Arg Pro Arg Val Gly Phe Tyr Gly Asn Arg Cys Arg Lys Val Glu 1. 5 10 15
Ser lie Val Arg Ser Val Val Arg Ser His Phe Arg Cys Asn Pro Ala 20 25 30
Asn Ala Pro Gly lie Leu Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Asn 35 40 45
Gly Cys Asp Gly Ser He Leu Leu Ala Gly Asn Thr Ser Glu Arg Thr 50 55 60
Ala Gly Pro Asn Arg Ser Leu Arg Gly Phe Glu Ala lie Glu Glu Ala 65 70 75 80
Lys Thr Arg Leu Glu Asn Ala Cys Pro Asn Thr Val Ser Cys Ala Asp 85 90 95
He Leu Thr Leu Ala Ala Arg Asp Ala Val Val Trp Thr Gly Gly Lys 100 105 110
Gly Trp Ser Val Pro Leu Gly Arg Leu Asp Gly Arg Arg Ser Glu Ala 115 120 125
Ser Asp Val Asn Leu Pro Gly Pro Ser Asp Pro Val Ala Lys Gin Lys 130 135 140
Gin Asp Phe Ala Ala Lys Asn Leu Asn Thr Leu Asp Leu Val Thr Leu 145 150 155 160
Val Gly Gly His Thr He Gly Thr Ala Gly Cys Gly Leu Val Arg Gly 165 170 175
Arg Phe Phe Asn Phe Asn Gly Thr Gly Gin Pro Asp Pro Ser lie Asp 180 185 190
Pro Ser Phe Val Pro Leu Val Gin Ala Arg Cys Pro Gin Asn Gly Asn 195 200 205
Ala Thr Thr Arg Val Asp Leu Asp Thr Gly Ser Ala Gly Asp Phe Asp 210 215 220
Thr Ser Tyr Leu Ser Asn Val Arg Ser Ser Arg Val Val Leu Gin Ser 225 230 235 240
Asp Leu Val Leu Trp Lys Asp Thr Glu Thr Arg Ala He He Glu Arg 245 250 255
Leu Leu Gly Leu Arg Arg Pro Val Leu Arg Phe Gly Ser Glu Phe Gly 260 265 270
Lys Ser Met Thr Lys Met Ser Leu He Glu Val Lys Thr Arg Leu Ser 275 280 285
Asp Gly Glu He Arg Arg Val Cys Ser Ala He Asn 290 295 300 <210> 29 <211> 309
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <4 0 0> 29
Asp Lys Ser Tyr Gly Gly Lys Leu Phe Pro Gly Phe Tyr Ala His Ser 1. 5 10 15
Cys Pro Gin Ala Gly Glu He Val Arg Ser Val Val Ala Lys Ala Val 20 25 30
Ala Arg Glu Thr Arg Met Ala Ala Ser Leu Met Arg Leu His Phe His 35 40 45
Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Asp Gly Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ser 3U 55 60
Gly Arg lie Val Ser Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Ser Arg Ser Ala 65 70 75 80
Arg Gly Phe Asp Val Val Asp Gin He Lys Ala Glu Leu Glu Lys Gin 85 90 95
Cys Pro Gly Thr Val Ser Cys Ala Asp Ala Leu Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110
Asp Ser Ser Val Leu Thr Gly Gly Pro Ser Trp Val Val Ser Leu Gly 115 120 125
Arg Arg Asp Ser Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Ser Asn Asn Asn lie 130 135 140
Pro Ala Pro Asn Asn Thr Phe Gin Thr He Leu Ser Lys Phe Asn Arg 145 150 155 160
Gin Gly Leu Asp Val Thr Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ser His Thr 165 170 175
He Gly Phe Ser Arg Cys Thr Ser Phe Arg Gin Arg Leu Tyr Asn Gin 180 185 190
Ser Gly Asn Gly Arg Pro Asp Met Thr Leu Glu Gin Ser Phe Ala Ala 195 200 205
Asn Leu Arg Gin Arg Cys Pro Arg Ser Gly Gly Asp Gin He Leu Ser 210 215 220
Val Leu Asp He He Ser Ala Ala Lys Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys 225 230 235 240
Asn Leu He Glu Asn Lys Gly Leu Leu Asn Ser Asp Gin Val Leu Phe 245 250 255
Asn Ser Asn Glu Lys Ser Arg Glu Leu Val Lys Lys Tyr Ala Glu Asp 260 265 270
Gin Gly Glu Phe Phe Glu Gin Phe Ala Glu Ser Met He Lys Met Gly 275 280 285
Asn lie Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Glu lie Arg Lys Asn Cys 290 295 300
Arg Lys lie Asn Ser 305 <210> 30 <211> 309
<212> PRT <213> Armoracia rusticana <400> 30
Asp Lys Ser Tyr Gly Gly Lys Leu Phe Pro Gly Phe Tyr Ala His Ser 1. 5 10 15
Cys Pro Gin Ala Gly Glu He Val Arg Ser Val Val Ala Lys Ala Val 20 25 30
Ala Arg Glu Thr Arg Met Ala Ala Ser Leu Met Arg Leu His Phe His 35 40 45
Asp Cys Phe Val Gin Gly Cys Asp Gly Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ser 50 55 60
Gly Lys lie Val Ser Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Ser Arg Ser Ala 65 70 75 80
Arg Gly Phe Asp Val Val Asp Gin He Lys Ala Glu Leu Glu Lys Gin 85 90 95
Cys Pro Gly Thr Val Ser Cys Ala Asp Ala Leu Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110
Asp Ser Ser Val Leu Thr Gly Gly Pro Ser Trp Val Val Ser Leu Gly Π5 120 125
Arg Arg Asp Ser Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Ser Asn Asn Asn lie 130 135 140
Pro Ala Pro Asn Asn Thr Phe Gin Thr lie Leu Ser Lys Phe Asn Arg I45 150 155 160
Gin Gly Leu Asp Val Thr Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ser His Thr 165 170 175 lie Gly Phe Ser Arg Cys Thr Ser Phe Arg Gin Arg Leu Tyr Asn Gin 180 185 190
Ser Gly Asn Gly Arg Pro Asp Met Thr Leu Glu Gin Ser Phe Ala Ala 195 200 205
Asn Leu Arg Gin Arg Cys Pro Arg Ser Gly Gly Asp Gin lie Leu Ser 210 215 220
Val Leu Asp lie lie Ser Ala Ala Lys Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys 225 230 235 240
Asn Leu lie Glu Asn Lys Gly Leu Leu Asn Ser Asp Gin Val Leu Phe 245 250 255
Ser Ser Asn Glu Lys Ser Arg Glu Leu Val Lys Lys Tyr Ala Glu Asp 260 265 270
Gin Gly Glu Phe Phe Glu Gin Phe Ala Glu Ser Met lie Lys Met Gly 275 280 285
Asn lie Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Glu lie Arg Lys Asn Cys 290 295 300
Arg Lys lie Asn Ser 305 <210> 31 <211> 323
<212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <4 0 0> 31
Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Arg Ser Cys Pro Asn Val Thr Asn 1. 5 10 15 lie Val Arg Glu Thr lie Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val lie 65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Arg Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Met Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125
Ala Phe Leu Glu Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140
Leu Pro Gin Leu Lys Ala Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asp Arg Pro 145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gin 165 170 175
Cys Gin Phe lie Leu Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Arg Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220
Thr Pro Thr Val Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Lys Glu Arg 225 230 235 240
Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255
Thr Asp Thr He Pro Leu Val Arg Ala Tyr Ala Asp Gly Thr Gin Thr 260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asn Arg Met Gly Asn lie Thr 275 280 285
Pro Thr Thr Gly Thr Gin Gly Gin He Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp Val Val Asp lie Val Asp Phe Val 305 310 315 320
Ser Ser Met <210> 32 <211> 326
<212> PRT <213> Glycine max <400> 32
Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Asn Leu Phe Pro 1- 5 10 15
He Val Phe Gly Val He Phe Asp Ala Ser Phe Thr Asp Pro Arg lie 20 25 30
Gly Ala Ser Leu Met Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser Val Leu Leu Asn Asn Thr Asp Thr He Glu Ser Glu 50 55 60
Gin Asp Ala Leu Pro Asn He Asn Ser He Arg Gly Leu Asp Val Val 65 70 75 80
Asn Asp lie Lys Thr Ala Val Glu Asn Ser Cys Pro Asp Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp He Leu Ala He Ala Ala Glu He Ala Ser Val Leu Gly 100 105 110
Gly Gly Pro Gly Trp Pro Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Thr 115 120 125
Ala Asn Arg Thr Leu Ala Asn Gin Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Asn 130 135 140
Leu Thr Gin Leu Lys Ala Ser Phe Ala Val Gin Gly Leu Asn Thr Leu 145 150 155 160
Asp Leu Val Thr Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Arg Ala Arg Cys 165 170 175
Ser Thr Phe He Asn Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Asn Pro 180 185 190
Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Glu Val Leu Arg Ala Arg Cys 195 200 205
Pro Gin Asn Ala Thr Gly Asp Asn Leu Thr Asn Leu Asp Leu Ser Thr 210 215 220
Pro Asp Gin Phe Asp Asn Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Leu Gin Leu Asn 225 230 235 240
Gly Leu Leu Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Thr Pro Gly Ala Asp 245 250 255
Thr lie Pro He Val Asn Ser Phe Ser Ser Asn Gin Asn Thr Phe Phe 260 265 270
Ser Asn Phe Arg Val Ser Met He Lys Met Gly Asn He Gly Val Leu 275 280 285
Thr Gly Asp Glu Gly Glu He Arg Leu Gin Cys Asn Phe Val Asn Gly 290 295 300
Asp Ser Phe Gly Leu Ala Ser Val Ala Ser Lys Asp Ala Lys Gin Lys 305 310 315 320
Leu Val Ala Gin Ser Lys 325 <210> 33 <211> 302
<212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 33
Gin Leu Ser Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Thr Cys Pro Asn Val Thr Ser 1. 5 10 15
He Val Arg Gly Val Met Asp Gin Arg Gin Arg Thr Asp Ala Arg Ala 20 25 30
Gly A1a Lys lie lie Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Gly Ser lie Leu Leu Asp Thr Asp Gly Thr Gin Thr Glu Lys 50 55 60
Asp Ala Pro Ala Asn Val Gly Ala Gly Gly Phe Asp lie Val Asp Asp 65 70 75 80 lie Lys Thr Ala Leu Glu Asn Val Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala 85 90 95
Asp lie Leu Ala Leu Ala Ser Glu lie Gly Val Val Leu Ala Lys Gly 100 105 110
Pro Ser Trp Gin Val Leu Phe Gly Arg Lys Asp Ser Leu Thr Ala Asn 115 120 125
Arg Ser Gly Ala Asn Ser Asp He Pro Ser Pro Phe Glu Thr Leu Ala 130 135 140
Val Met lie Pro Gin Phe Thr Asn Lys Gly Met Asp Leu Thr Asp Leu 145 150 155 160
Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Phe Gly Arg Ala Arg Cys Gly Thr 165 170 175
Phe Glu Gin Arg Leu Phe Asn Phe Asn Gly Ser Gly Asn Pro Asp Leu 180 185 190
Thr Val Asp Ala Thr Phe Leu Gin Thr Leu Gin Gly He Cys Pro Gin 195 200 205
Gly Gly Asn Asn Gly Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asp He Ser Thr Pro 210 215 220
Asn Asp Phe Asp Asn Asp Tyr Phe Thr Asn Leu Gin Ser Asn Gin Gly 225 230 235 240
Leu Leu Gin Thr Asp Gin Glu Leu Phe Ser Thr Ser Gly Ser Ala Thr 245 250 255 lie Ala lie Val Asn Arg Tyr Ala Gly Ser Gin Thr Gin Phe Phe Asp 260 265 270
Asp Phe Val Ser Ser Met lie Lys Leu Gly Asn lie Ser Pro Leu Thr 275 280 285
Gly Thr Asn Gly Gin lie Arg Thr Asp Cys Lys Arg Val Asn 290 295 300 <210> 34 <211> 343
<212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 34
Gly Val Ala lie Tyr Arg Asn Thr Tyr Glu Ala lie lie Met Asn Asn 1- 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Gin Asn Ala Ser Pro His Phe Asp Ser Leu Glu Ser 20 25 30
Gly Val Ala Ser lie Leu Thr Leu Asn Asn Lys Lys Arg Asn Ser Asp 35 40 45
Met Tyr Leu Arg Gin Gin Leu Thr Pro Glu Ala Cys Val Phe Ser Ala 50 55 60
Val Arg Gly Val Val Asp Ser Ala lie Asp Ala Glu Thr Arg Met Gly 65 70 75 80
Ala Ser Leu lie Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asp Gly Cys 85 90 95
Asp Gly Gly lie Leu Leu Asp Asp lie Asn Gly Thr Phe Thr Gly Glu 100 105 110
Gin Asn Ser Pro Pro Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Tyr Glu Val lie 115 120 125
Ala Gin Ala Lys Gin Ser Val lie Asp Thr Cys Pro Asn lie Ser Val 130 135 140
Ser Cys Ala Asp lie Leu Ala lie Ala Ala Arg Asp Ser Val Ala Lys 145 150 155 160
Leu Gly Gly Gin Thr Tyr Asn Val Ala Leu Gly Arg Ser Asp Ala Arg 165 170 175
Thr Ala Asn Phe Thr Gly Ala Leu Thr Gin Leu Pro Ala Pro Phe Asp 180 185 190
Asn Leu Thr Val Gin lie Gin Lys Phe Asn Asp Lys Asn Phe Thr Leu 195 200 205
Arg Glu Met Val Ala Leu Ala Gly Ala His Thr Val Gly Phe Ala Arg 210 215 220
Cys Ser Thr Val Cys Thr Ser Gly Asn Val Asn Pro Ala Ala Gin Leu 225 230 235 240
Gin Cys Asn Cys Ser Ala Thr Leu Thr Asp Ser Asp Leu Gin Gin Leu 245 250 255
Asp Thr Thr Pro Thr Met Phe Asp Lys Val Tyr Tyr Asp Asn Leu Asn 260 265 270
Asn Asn Gin Gly lie Met Phe Ser Asp Gin Val Leu Thr Gly Asp Ala 275 280 285
Thr Thr Ala Gly Phe Val Thr Asp Tyr Ser Asn Asp Val Ser Val Phe 290 295 300
Leu Gly Asp Phe Ala Ala Ala Met lie Lys Met Gly Asp Leu Pro Pro 305 310 315 320
Ser Ala Gly Ala Gin Leu Glu lie Arg Asp Val Cys Ser Arg Val Asn 325 330 335
Pro Thr Ser Val Ala Ser Met 340 <210> 35 <211> 294
<212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 35
Gin Leu Ser Pro Thr Phe Tyr Asp Thr Ser Cys Pro Arg Ala Leu Ala X. J iu 15
Thr lie Lys Ser Gly Val Met Ala Ala Val Thr Ser Asp Pro Arg Met 20 25 30
Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Ser Gly Met Glu Gin Asn Ala lie Pro 50 55 60
Asn Ala Gly Ser Leu Arg Gly Phe Gly Val He Asp Ser lie Lys Thr 65 70 75 80
Gin He Glu Ala He Cys Lys Gin Thr Val Ser Cys Ala Asp He Leu 85 90 95
Thr Val Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu Gly Gly Pro Ser Trp 100 105 110
Thr Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser He Asp Ala Asn Glu Asn Glu Π5 120 125
Ala Asn Thr Asp Leu Pro Gly Phe Asn Ser Ser Arg Ala Glu Leu Glu 130 135 140
Ala Ala Phe Leu Lys Lys Gly Gly Leu Asn Thr Val Asp Met Val Ala 145 150 155 160
Leu Ser Gly Ala His Thr He Gly Gin Ala Gin Cys Ser Thr Phe Arg 165 170 175
Ala Arg He Tyr Gly Gly Asp Thr Asn He Asn Ala Ala Tyr Ala Ala 180 185 190
Ser Leu Arg Ala Asn Cys Pro Gin Thr Val Gly Ser Gly Asp Gly Ser 195 200 205
Leu Ala Asn Leu Asp Thr Thr Thr Ala Asn Thr Phe Asp Asn Ala Tyr 210 215 220
Tyr Thr Asn Leu Met Ser Gin Lys Gly Leu Leu His Ser Asp Gin Val 225 230 235 240
Leu Phe Asn Asn Asp Thr Thr Asp Asn Thr Val Arg Asn Phe Ala Ser 245 250 255
Asn Pro Ala Ala Phe Ser Ser Ser Phe Thr Thr Ala Met lie Lys Met 260 265 270
Gly Asn lie Ala Pro Lys Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg Leu Ser 275 280 285
Cys Ser Arg Val Asn Ser 290 <210> 36 <211> 294
<212> PRT <213> Arachis hypogaea <400> 36
Gin Leu Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Thr Lys Cys Pro Asn Ala Leu Ser 1. 5 10 15
Thr He Lys Ser Ala Val Asn Ser Ala Val Ala Lys Glu Ala Arg Met 20 25 30
Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Gin Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Asp Asp Thr Ser Asn Phe Thr Gly Glu 50 55 60
Lys Thr Ala Gly Pro Asn Ala Asn Ser lie Arg Gly Phe Glu Val He 65 70 75 80
Asp Thr lie Lys Ser Gin Val Glu Ser Leu Cys Pro Gly Val Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp He Leu Ala Val Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu 100 105 110
Gly Gly Ala Ser Trp Asn Val Leu Leu Gly Arg Arg Asp Ser Thr Thr 115 120 125
Ala Ser Leu Ser Ser Ala Asn Ser Asp Leu Pro Ala Pro Phe Phe Asn 130 135 140
Leu Ser Gly Leu lie Ser Ala Phe Ser Asn Lys Gly Phe Thr Thr Lys 145 150 155 160
Glu Leu Val Thr Leu Ser Gly Ala His Thr lie Gly Gin Ala Gin Cys 165 170 175
Thr Ala Phe Arg Thr Arg lie Tyr Asn Glu Ser Asn lie Asp Pro Thr 180 185 190
Tyr Ala Lys Ser Leu Gin Ala Asn Cys Pro Ser Val Gly Gly Asp Thr 195 200 205
Asn Leu Ser Pro Phe Asp Val Thr Thr Pro Asn Lys Phe Asp Asn Ala 210 215 220
Tyr Tyr lie Asn Leu Arg Asn Lys Lys Gly Leu Leu His Ser Asp Gin 225 230 235 240
Gin Leu Phe Asn Gly Val Ser Thr Asp Ser Gin Val Thr Ala Tyr Ser 245 250 255
Asn Asn Ala Ala Thr Phe Asn Thr Asp Phe Gly Asn Ala Met lie Lys 260 265 270
Met Gly Asn Leu Ser Pro Leu Thr Gly Thr Ser Gly Gin lie Arg Thr 275 280 285
Asn Cys Arg Lys Thr Asn 290 <210> 37 <211> 509
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <400> 37
His His His His His His Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser 1. 5 10 15
Cys Pro Asn Val Ser Asn He Val Arg Asp Thr lie Val Asn Glu Leu 20 25 30
Arg Ser Asp Pro Arg lie Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His 35 40 45
Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr 50 55 60
Thr Ser Phe Arg Thr Glu Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala 65 70 75 80
Arg Gly Phe Pro Val lie Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala 85 90 95
Cys Pro Arg Thr Val Ser Cys Ala Asp Leu Leu Thr lie Ala Ala Gin 100 105 110
Gin Ser Val Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly 115 120 125
Arg Arg Asp Ser Leu Gin Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu 130 135 140
Pro Ala Pro Phe Phe Thr Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn 145 150 155 160
Val Gly Leu Asn Arg Ser Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His 165 170 175
Thr Phe Gly Lys Asn Gin Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn 180 185 190
Phe Ser Asn Thr Gly Leu Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu 195 200 205
Gin Thr Leu Arg Gly Leu Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu 210 215 220
Val Asp Phe Asp Leu Arg Thr Pro Thr lie Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr 225 230 235 240
Val Asn Leu Glu Glu Gin Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu 245 250 255
Phe Ser Ser Pro Asn Ala Thr Asp Thr lie Pro Leu Val Arg Ser Phe 260 265 270
Ala Asn Ser Thr Gin Thr Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp 275 280 285
Arg Met Gly Asn He Thr Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg 290 295 300
Leu Asn Cys Arg Val Val Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Leu He Leu 305 310 315 320
Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala 325 330 335
Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val 340 345 350
Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 355 360 365
Glu Lys Pro Glu Val He Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr 370 375 380
Thr Tyr Lys Leu Val He Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 385 390 395 400
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr 405 410 415
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 420 425 430
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val He Asp Ala Ser Glu 435 440 445
Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val He Asn Gly Lys Thr 450 455 460
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu 465 470 475 480
Lys Ala Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp 485 490 495
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 500 505 <210> 38 <211> 503
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <400> 38
Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 1. 5 10 15 lie Val Arg Asp Thr lie Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg lie 20 25 30
Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45
Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val lie 65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95
Cys Ala Asp Leu Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140
Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser 145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gin 165 170 175
Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220
Thr Pro Thr lie Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gin 225 230 235 240
Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255
Thr Asp Thr lie Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gin Thr 260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn lie Thr 275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300
Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Lys Leu lie Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys 305 310 315 320
Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val 325 330 335
Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr 340 345 350
Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val lie 355 360 365
Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val lie 370 375 380
Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala 385 390 395 400
Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val 405 410 415
Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 420 425 430
Glu Lys Pro Glu Val lie Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr 435 440 445
Thr Tyr Lys Leu Val lie Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 450 455 460
Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gin Tyr 465 470 475 480
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 485 490 495
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 500 <210> 39 <211> 89
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 39
Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1. 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30 lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60
Phe lie Asn Thr Thr lie Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 40 <211> 75
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 40
Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1. 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30 lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu 50 55 60
Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 65 70 75 <210> 41
<211> 22 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 41
Met Phe Ser Pro lie Leu Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr 1. 5 10 15
Leu Gin Ser Val Phe Ala 20 <210> 42 <211> 78
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 Ο 0> 42
Met Phe Ser Pro lie Leu Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr 1. 5 10 15
Leu Gin Ser Val Phe Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu 20 25 30
Thr Ala Gin lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu 35 40 45
Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Ala Ser lie Ala Ala 50 55 60
Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 65 70 75 <210> 43 <211> 24
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 43
Met lie Val Gly lie Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala 1. 5 10 15
Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg 20 <210> 44
<211> 80 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 44
Met lie Val Gly lie Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala 1. 5 10 15
Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu 20 25 30
Asp Glu Thr Ala Gin lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp 35 40 45
Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Ala Ser lie 50 55 60
Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 65 70 75 80 <210> 45
<211> 18 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 45
Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1. 5 10 15
Tyr Ser <210> 46 <211> 74
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 46
Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1. 5 10 15
Tyr Ser Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin lie 20 25 30
Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp 35 40 45
Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly 50 55 60
Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 65 70 <210> 47 <211> 30
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 47
Met His Phe Ser Ser Ser Ser Thr Leu Phe Thr Cys lie Thr Leu lie 1. 5 10 15
Pro Leu Val Cys Leu lie Leu His Ala Ser Leu Ser Asp Ala 20 25 30 <210> 48
<211> 86 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 48
Met His Phe Ser Ser Ser Ser Thr Leu Phe Thr Cys lie Thr Leu lie 1. 5 10 15
Pro Leu Val Cys Leu lie Leu His Ala Ser Leu Ser Asp Ala Ala Pro 20 25 30
Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin lie Pro Ala Glu Ala 35 40 45
Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu 50 55 60
Pro Phe Ser Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu 65 70 75 80
Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 49 <211> 17
<212> PRT <213> Kiinstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 49
Met Asn lie Phe Tyr lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gin Gly 1. 5 10 15
Leu <210> 50 <211> 29
<212> PRT <213> Kiinstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 50
Met Asn lie Phe Tyr lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gin Gly 1. 5 10 15
Leu Glu His Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Val Lys Arg 20 25 <210> 51 <211> 73
<212> PRT <213> Kiinstliche Sequenz <220> <223> Signalpeptid <400> 51
Met Asn lie Phe Tyr lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gin Gly 1. 5 10 15
Leu Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin lie Pro 20 25 30
Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val 35 40 45
Ala Val Leu Pro Phe Ser Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 50 55 60
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 65 70 <210> 52
<211> 86 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <4 0 0> 52
Met Lys Phe lie Ser Thr Phe Leu Thr Phe lie Leu Ala Ala Val Ser 1. 5 10 15
Val Thr Ala Ser Ser Asp Glu Asp lie Ala Gin Val Pro Ala Glu Ala 20 25 30 lie lie Gly Tyr Leu Asp Phe Gly Gly Asp His Asp lie Ala Phe Leu 35 40 45
Pro Phe Ser Asn Ala Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe lie Asn Thr Thr 50 55 60 lie Ala Glu Ala Ala Glu Lys Glu Gin Asn Thr Thr Leu Ala Lys Arg 65 70 75 80
Glu Ala Val Ala Asp Ala 85 <210> 53 <211> 72
<212> PRT <213> Kiinstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 53
Met Lys Phe lie Ser Thr Phe Leu Thr Phe lie Leu Ala Ala Val Ser 1. 5 10 15
Val Thr Ala Ser Ser Asp Glu Asp lie Ala Gin Val Pro Ala Glu Ala 20 25 30 lie lie Gly Tyr Leu Asp Phe Gly Gly Asp His Asp lie Ala Phe Leu 35 40 45
Pro Phe Ser Ala Glu Ala Ala Glu Lys Glu Gin Asn Thr Thr Leu Ala 50 55 60
Lys Arg Glu Ala Val Ala Asp Ala 65 70 <210> 54 <211> 1752
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <400> 54 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120 tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctgc ttccattgct 180 gctaaggaag agggtgtctc tctcgagaag agagaggccg aagctcacca tcaccaccat 240 caccaactta ctccaacctt ctacgataac tcttgtccta atgtgtccaa catcgttaga 300 gacaccattg tcaatgaatt gagatcagat ccacgtattg ctgcatctat cttgagactt 360 cactttcatg actgcttcgt caacggttgt gatgcttcca tcttgctgga caacactacc 420 tctttcagaa ctgagaagga cgctttcggt aatgccaact ctgctagagg atttccagtc 480 attgacagaa tgaaggctgc cgttgaatct gcatgtccta gaactgtgtc atgtgctgac 540 cttctgacta ttgccgctca gcaatctgtt accttagctg gtggaccatc ctggagagtt 600 ccattgggtc gtagagactc ccttcaagcc tttctggacc ttgcaaatgc taacttgcct 660 gctccattct ttaccttacc tcaattgaaa gactctttca gaaacgttgg tcttaacaga 720 tcatccgact tggttgcctt atctggaggt cacacctttg gtaagaacca atgtagattc 780 atcatggatc gtctgtacaa cttctctaac accggtttgc cagatcctac tctgaacacc 840 acttacttgc aaaccttaag aggtttgtgc ccacttaacg gaaatctgtc tgctctggtt 900 gacttcgatt tgcgtactcc taccatcttc gacaacaagt actatgtcaa cttggaggaa 960 cagaagggtc ttatccaatc tgaccaggag ttgttctcct ctcctaacgc tactgatacc 1020 attccattgg tgagatcctt cgcaaactcc actcaaacct tctttaacgc tttcgtcgag 1080 gcaatggaca gaatgggtaa cattactcct ttgaccggta ctcaaggaca gattagattg 1140 aactgccgtg ttgtcaactc taactcaact tacaagttga tcctgaacgg aaagaccttg 1200 aagggagaaa ccactactga ggctgtcgat gctgccactg ccgaaaaggt cttcaagcag 1260 tatgccaacg acaacggtgt tgacggtgag tggacctacg acgatgccac caaaactttc 1320 actgtcactg agaagcctga agtcattgat gcttctgagt taacccctgc tgtgactacc 1380 tacaagttgg ttatcaacgg aaagactttg aagggtgaaa ccaccactga agccgttgat 1440 gctgcaactg ccgaaaaggt cttcaagcaa tacgctaatg ataacggagt tgacggagag 1500 tggacttacg atgacgctac taagactttc actgttactg agaagccaga ggttatcgac 1560 gcttcagagt tgactccagc agttactact tacaagttag tcatcaacgg aaagaccttg 1620 aagggtgaaa ctactaccaa ggctgtggat gccgaaaccg cagaaaaggc cttcaagcag 1680 tacgctaacg acaatggtgt ggatggtgtt tggacctacg atgatgctac taagaccttc 1740 accgtcaccg ag 1752 <210> 55 <211> 1527
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <4 0 0> 55 caccatcacc accatcacca acttactcca accttctacg ataactcttg tcctaatgtg 60 tccaacatcg ttagagacac cattgtcaat gaattgagat cagatccacg tattgctgca 120 tctatcttga gacttcactt tcatgactgc ttcgtcaacg gttgtgatgc ttccatcttg 180 ctggacaaca ctacctcttt cagaactgag aaggacgctt tcggtaatgc caactctgct 240 agaggatttc cagtcattga cagaatgaag gctgccgttg aatctgcatg tcctagaact 300 gtgtcatgtg ctgaccttct gactattgcc gctcagcaat ctgttacctt agctggtgga 360 ccatcctgga gagttccatt gggtcgtaga gactcccttc aagcctttct ggaccttgca 420 aatgctaact tgcctgctcc attctttacc ttacctcaat tgaaagactc tttcagaaac 480 gttggtctta acagatcatc cgacttggtt gccttatctg gaggtcacac ctttggtaag 540 aaccaatgta gattcatcat ggatcgtctg tacaacttct ctaacaccgg tttgccagat 600 cctactctga acaccactta cttgcaaacc ttaagaggtt tgtgcccact taacggaaat 660 ctgtctgctc tggttgactt cgatttgcgt actcctacca tcttcgacaa caagtactat 720 gtcaacttgg aggaacagaa gggtcttatc caatctgacc aggagttgtt ctcctctcct 780 aacgctactg ataccattcc attggtgaga tccttcgcaa actccactca aaccttcttt 840 aacgctttcg tcgaggcaat ggacagaatg ggtaacatta ctcctttgac cggtactcaa 900 ggacagatta gattgaactg ccgtgttgtc aactctaact caacttacaa gttgatcctg 960 aacggaaaga ccttgaaggg agaaaccact actgaggctg tcgatgctgc cactgccgaa 1020 aaggtcttca agcagtatgc caacgacaac ggtgttgacg gtgagtggac ctacgacgat 1080 gccaccaaaa ctttcactgt cactgagaag cctgaagtca ttgatgcttc tgagttaacc 1140 cctgctgtga ctacctacaa gttggttatc aacggaaaga ctttgaaggg tgaaaccacc 1200 actgaagccg ttgatgctgc aactgccgaa aaggtcttca agcaatacgc taatgataac 1260 ggagttgacg gagagtggac ttacgatgac gctactaaga ctttcactgt tactgagaag 1320 ccagaggtta tcgacgcttc agagttgact ccagcagtta ctacttacaa gttagtcatc 1380 aacggaaaga ccttgaaggg tgaaactact accaaggctg tggatgccga aaccgcagaa 1440 aaggccttca agcagtacgc taacgacaat ggtgtggatg gtgtttggac ctacgatgat 1500 gctactaaga ccttcaccgt caccgag 1527 <210> 56 <211> 1734
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <400> 56 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120 tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctgc ttccattgct 180 gctaaggaag agggtgtctc tctcgagaag agagaggccg aagctcaact tactccaacc 240 ttctacgata actcttgtcc taatgtgtcc aacatcgtta gagacaccat tgtcaatgaa 300 ttgagatcag atccacgtat tgctgcatct atcttgagac ttcactttca tgactgcttc 360 gtcaacggtt gtgatgcttc catcttgctg gacaacacta cctctttcag aactgagaag 420 gacgctttcg gtaatgccaa ctctgctaga ggatttccag tcattgacag aatgaaggct 480 gccgttgaat ctgcatgtcc tagaactgtg tcatgtgctg accttctgac tattgccgct 540 cagcaatctg ttaccttagc tggtggacca tcctggagag ttccattggg tcgtagagac 600 tcccttcaag cctttctgga ccttgcaaat gctaacttgc ctgctccatt ctttacctta 660 cctcaattga aagactcttt cagaaacgtt ggtcttaaca gatcatccga cttggttgcc 720 ttatctggag gtcacacctt tggtaagaac caatgtagat tcatcatgga tcgtctgtac 780 aacttctcta acaccggttt gccagatcct actctgaaca ccacttactt gcaaacctta 840 agaggtttgt gcccacttaa cggaaatctg tctgctctgg ttgacttcga tttgcgtact 900 cctaccatct tcgacaacaa gtactatgtc aacttggagg aacagaaggg tcttatccaa 960 tctgaccagg agttgttctc ctctcctaac gctactgata ccattccatt ggtgagatcc 1020 ttcgcaaact ccactcaaac cttctttaac gctttcgtcg aggcaatgga cagaatgggt 1080 aacattactc ctttgaccgg tactcaagga cagattagat tgaactgccg tgttgtcaac 1140 tctaactcaa cttacaagtt gatcctgaac ggaaagacct tgaagggaga aaccactact 1200 gaggctgtcg atgctgccac tgccgaaaag gtcttcaagc agtatgccaa cgacaacggt 1260 gttgacggtg agtggaccta cgacgatgcc accaaaactt tcactgtcac tgagaagcct 1320 gaagtcattg atgcttctga gttaacccct gctgtgacta cctacaagtt ggttatcaac 1380 ggaaagactt tgaagggtga aaccaccact gaagccgttg atgctgcaac tgccgaaaag 1440 gtcttcaagc aatacgctaa tgataacgga gttgacggag agtggactta cgatgacgct 1500 actaagactt tcactgttac tgagaagcca gaggttatcg acgcttcaga gttgactcca 1560 gcagttacta cttacaagtt agtcatcaac ggaaagacct tgaagggtga aactactacc 1620 aaggctgtgg atgccgaaac cgcagaaaag gccttcaagc agtacgctaa cgacaatggt 1680 gtggatggtg tttggaccta cgatgatgct actaagacct tcaccgtcac cgag 1734 <210> 57 <211> 1509
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Fusionsprotein <4 0 0> 57 caacttactc caaccttcta cgataactct tgtcctaatg tgtccaacat cgttagagac 60 accattgtca atgaattgag atcagatcca cgtattgctg catctatctt gagacttcac 120 tttcatgact gcttcgtcaa cggttgtgat gcttccatct tgctggacaa cactacctct 180 ttcagaactg agaaggacgc tttcggtaat gccaactctg ctagaggatt tccagtcatt 240 gacagaatga aggctgccgt tgaatctgca tgtcctagaa ctgtgtcatg tgctgacctt 300 ctgactattg ccgctcagca atctgttacc ttagctggtg gaccatcctg gagagttcca 360 ttgggtcgta gagactccct tcaagccttt ctggaccttg caaatgctaa cttgcctgct 420 ccattcttta ccttacctca attgaaagac tctttcagaa acgttggtct taacagatca 480 tccgacttgg ttgccttatc tggaggtcac acctttggta agaaccaatg tagattcatc 540 atggatcgtc tgtacaactt ctctaacacc ggtttgccag atcctactct gaacaccact 600 tacttgcaaa ccttaagagg tttgtgccca cttaacggaa atctgtctgc tctggttgac 660 ttcgatttgc gtactcctac catcttcgac aacaagtact atgtcaactt ggaggaacag 720 aagggtctta tccaatctga ccaggagttg ttctcctctc ctaacgctac tgataccatt 780 ccattggtga gatccttcgc aaactccact caaaccttct ttaacgcttt cgtcgaggca 840 atggacagaa tgggtaacat tactcctttg accggtactc aaggacagat tagattgaac 900 tgccgtgttg tcaactctaa ctcaacttac aagttgatcc tgaacggaaa gaccttgaag 960 ggagaaacca ctactgaggc tgtcgatgct gccactgccg aaaaggtctt caagcagtat 1020 gccaacgaca acggtgttga cggtgagtgg acctacgacg atgccaccaa aactttcact 1080 gtcactgaga agcctgaagt cattgatgct tctgagttaa cccctgctgt gactacctac 1140 aagttggtta tcaacggaaa gactttgaag ggtgaaacca ccactgaagc cgttgatgct 1200 gcaactgccg aaaaggtctt caagcaatac gctaatgata acggagttga cggagagtgg 1260 acttacgatg acgctactaa gactttcact gttactgaga agccagaggt tatcgacgct 1320 tcagagttga ctccagcagt tactacttac aagttagtca tcaacggaaa gaccttgaag 1380 ggtgaaacta ctaccaaggc tgtggatgcc gaaaccgcag aaaaggcctt caagcagtac 1440 gctaacgaca atggtgtgga tggtgtttgg acctacgatg atgctactaa gaccttcacc 1500 gtcaccgag 1509 <210> 58 <211> 953
<212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 58 ggtaccagat ctaacatcca aagacgaaag gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 60 ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca aacgcaacag gaggggatac actagcagca 120 gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct cttctcctca acacccactt ttgccatcga 180 aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 240 ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 300 tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 360 tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 420 aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 480 ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 540 gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 600 cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca 660 cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg 720 aatactgctg atagcctaac gttcatgatc aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac 780 agcaatatat aaacagaagg aagctgccct gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat 840 tagcttactt tcataattgc gactggttcc aattgacaag cttttgattt taacgacttt 900 taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa ctaattattg aaagaattca acc 953 <210> 59 <211> 674
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Oligonukleotid <400> 59 ctcgagaaga gagaggccga agctcaccat caccaccatc acacttacaa gttgatcctg 60 aacggaaaga ccttgaaggg agaaaccact actgaggctg tcgatgctgc cactgccgaa 120 aaggtcttca agcagtatgc caacgacaac ggtgttgacg gtgagtggac ctacgacgat 180 gccaccaaaa ctttcactgt cactgagaag cctgaagtca ttgatgcttc tgagttaacc 240 cctgctgtga ctacctacaa gttggttatc aacggaaaga ctttgaaggg tgaaaccacc 300 actgaagccg ttgatgctgc aactgccgaa aaggtcttca agcaatacgc taatgataac 360 ggagttgacg gagagtggac ttacgatgac gctactaaga ctttcactgt tactgagaag 420 ccagaggtta tcgacgcttc agagttgact ccagcagtta ctacttacaa gttagtcatc 480 aacggaaaga ccttgaaggg tgaaactact accaaggctg tggatgccga aaccgcagaa 540 aaggccttca agcagtacgc taacgacaat ggtgtggatg gtgtttggac ctacgatgat 600 gctactaaga ccttcaccgt caccgaggga ggaggtggtg gacaacttac tccaaccttc 660 tacgataact cttg 674 <210> 60 <211> 52
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 60 atatctcgag aagagagagg ccgaagctac ttacaagttg atcctgaacg ga 52
<210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <400> 61 atatctcgag aagagagagg ccgaag 26 <210> 62 <211> 55
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 Ο 0> 62 caagagttat cgtagaaggt tggagtaagt tgctcggtga cggtgaaggt cttag 55 <210> 63 <211> 32
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 63 caagagttat cgtagaaggt tggagtaagt tg 32 <210> 64 <211> 29
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <400> 64 caacttactc caaccttcta cgataactc 29 <210> 65
<211> 26 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 65 atatgcggcc gcattatgag ttagag 26
<210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 6 6 tgagttagag ttgacaacac g 21 <210> 67 <211> 45
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <400> 67 cgtgttgtca actctaactc aacttacaag ttgatcctga acgga 45
<210> 68 <211> 60 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 68 cgtgttgtca actctaactc aggaggaggt ggtggaactt acaagttgat cctgaacgga 60 <210> 69 <211> 38
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Primer <4 0 0> 6 9 atatgcggcc gcattactcg gtgacggtga aggtctta 38 <210> 70 <211> 14
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptidfragment <4 0 0> 70
Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe lie Asn Thr Thr lie 1. 5 10 <210> 71 <211> 14
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptidfragment <400> 71
Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe lie Asn Thr Thr lie 1.5 10 <210> 72
<211> 86 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Signalpeptid <400> 72
Met Lys Phe lie Ser Thr Phe Leu Thr Phe lie Leu Ala Ala Val Ser 1- 5 10 15
Val Thr Ala Ser Ser Asp Glu Asp lie Ala Gin Val Pro Ala Glu Ala 20 25 30 lie lie Gly Tyr Leu Asp Phe Gly Gly Asp His Asp lie Ala Phe Leu 35 40 45
Pro Phe Ser Asn Ala Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe lie Asn Thr Thr 50 55 60 lie Ala Glu Ala Ala Glu Lys Glu Gin Asn Thr Thr Leu Ala Lys Arg 65 70 75 80
Glu Ala Val Ala Asp Ala 85 <210> 73 <211> 195
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Protein G <400> 73
Thr Tyr Lys Leu lie Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 1. 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gin Tyr 20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val lie Asp Ala Ser Glu 50 55 60
Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val lie Asn Gly Lys Thr 65 70 75 80
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu 85 90 95
Lys Val Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp 100 105 110
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu 115 120 125
Val lie Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu 130 135 140
Val lie Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val 145 150 155 160
Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gin Tyr Ala Asn Asp Asn 165 170 175
Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr 180 185 190
Val Thr Glu 195 <210> 74 <211> 441
<212> PRT <213> Kiinstliche Sequenz <22 0> <223> Protein A <4 0 0> 74
Ala Gin His Asp Glu Ala Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Gin Val Leu Asn l. 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu 20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gin Lys 35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gin Gin Asn Lys Phe 50 55 60
Asn Lys Asp Gin Gin Ser Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80
Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp 85 90 95
Pro Ser Gin Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110
Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn 115 120 125
Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg 130 135 140
Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn 145 150 155 160
Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala 165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu 180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser 195 200 205
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240
Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255
Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 260 265 270
Val Ser Lys Glu lie Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin 275 280 285
Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 290 295 300
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys 305 310 315 320
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys 325 330 335
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 340 345 350
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn 355 360 365
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly 370 375 380
Asp Thr Val Asn Asp He Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys 385 390 395 400 lie Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met He Lys Pro Gly 405 410 415
Gin Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gin Pro Ala Asn His Ala Asp Ala 420 425 430
Asn Lys Ala Gin Ala Leu Pro Glu Thr 435 440 <210> 75 <211> 365
<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <22 0> <223> Protein L <400> 75
Lys Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val 1. 5 10 15
Thr lie Lys Ala Asn Leu lie Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gin Thr Ala 20 25 30
Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr 35 40 45
Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala 50 55 60
Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn lie Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr 65 70 75 80
Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr lie Lys Ala Asn Leu lie Tyr 85 90 95
Ala Asp Gly Lys Thr Gin Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu 100 105 110
Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn 115 120 125
Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn lie 130 135 140
Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val 145 150 155 160
Thr lie Lys Ala Asn Leu lie Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gin Thr Ala 165 170 175
Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr 180 185 190
Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala 195 200 205
Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn lie Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr 210 215 220
Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr lie Lys Ala Asn Leu lie Tyr 225 230 235 240
Ala Asp Gly Lys Thr Gin Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu 245 250 255
Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn 260 265 270
Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr lie Asn lie 275 280 285
Arg Phe Ala Gly Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys Glu Gin 290 295 300
Val Thr lie Lys Glu Asn lie Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val Gin Thr 305 310 315 320
Ala Thr Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg 325 330 335
Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu 340 345 350
Glu Asp Gly Gly Tyr Thr lie Asn lie Arg Phe Ala Gly 355 360 365

Claims (21)

  1. Patentansprüche:
    1. Fusionsprotein umfassend eine erste Domäne, die mindestens eine Peroxidase Oder mindestens ein katalytisch aktives Fragment davon umfasst, und eine zweite Domäne, die mindestens ein an einen Antikörper bindendes Peptid Oder Polypeptid umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der C-Terminus der ersten Domäne an den N-Terminus der zweiten Domäne fusioniert ist.
  2. 2. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Peroxidase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Meerrettichperoxidase, Peroxidasen aus Acker-Schmalwand, insbesondere Arabidopsis thaliana peroxidase 34, Peroxidasen aus Sojabohnen, insbesondere Sojabohnen-Peroxidase, Peroxidasen aus Tabak, insbesondere Lignin-formende anionische Tabak-Peroxidase, Peroxidasen aus Tomaten, insbesondere „suberization-associated anionic tomato peroxidase, Peroxidasen aus Gerste, insbesondere Gersten-Peroxidase 1, und Peroxidasen aus Erdnüssen, insbesondere kationische Erdnuss Peroxidase 1.
  3. 3. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 Oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Domäne mindestens ein an eine Fc-Region des Antikörpers bindendes Peptid oder Polypeptid, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein G, Protein A, Protein A/G und Varianten davon, umfasst.
  4. 4. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass umfasst die zweite Domäne Protein L, Protein M oder eine Variante davon.
  5. 5. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das die zweite Domäne ein Antikörper oder Antikörperfragment ist.
  6. 6. Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der ersten Domäne und der zweiten Domäne ein Linker angeordnet ist.
  7. 7. Fusionsprotein gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 3, noch mehr bevorzugt 1 Oder 2, Aminosäurereste umfasst.
  8. 8. Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass am N-Terminus und/oder C-Terminus des Fusionsproteins ein Tag, vorzugsweise ein Affinitäts-Tag vorgesehen ist.
  9. 9. Fusionsprotein gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Tag ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus His-Tag, HA-Tag, Flag-Tag, StrepTagll und MBP-Tag.
  10. 10. Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
  11. 11. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass am 5'- und/oder 3'-Ende des Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäurequenz kodierend für ein Sekretionssignalpeptid vorgesehen ist.
  12. 12. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Sekretionssignalpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alpha-Mating Faktor, Saccharomyces cerevisiae alpha-Mating Faktors, eines Präpropeptids des Saccharomyces cerevisiae Mating Faktor alpha 2, des Präpeptids der Pichia pastoris Saure Phosphatase 1, des Präpeptids der Trichoderma reesei Cellobiohydrolase 2, des Präpeptids des Homo sapiens Serumalbumin, des Präpeptids der Armoracia rusticana Meerrettichperoxidase CIA, des Präpeptids des Kluyveromyces lactis Killertoxin, eines Präpropeptids bestehend aus Kluyveromyces lactis Killertoxin.
  13. 13. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 12.
  14. 14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül operativ an einen Promotor gebunden ist.
  15. 15. Vektor nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.
  16. 16. Zelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 15.
  17. 17. Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle, vorzugsweise eine Hefezelle, noch mehr bevorzugt eine methylotrophe Hefezelle, noch mehr bevorzugt P. pastoris ist.
  18. 18. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfassend die Kultivierung einer Zelle gemäß Anspruch 16 oder 17.
  19. 19. Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem Immunoassay, vorzugsweise in einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
  20. 20. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Zielmoleküls in einer Probe umfassend die Schritte: - Bereitstellen eines ersten an ein Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon, der auf einem festen Träger immobilisiert ist; - Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper oder Fragment davon, - Aufbringen eines zweiten an das Zielmolekül bindenden Antikörpers oder Fragments davon; - optionales Entfernen des zweiten Antikörpers oder Fragments davon, der nicht an das Zielmolekül gebunden ist; - Aufbringen eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9; - optionales Entfernen des Fusionsproteins, das nicht an den zweiten Antikörper oder des Fragments davon gebunden ist; - Aufbringen eines nachweisbaren Peroxidasesubstrats auf den festen Träger; und - Nachweisen der Umsetzung des Peroxidasesubstrats.
  21. 21. Set umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen an ein Zielmolekül bindenden Antikörper Oder eines Fragments davon.
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