WO2016194986A1 - マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 - Google Patents

マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 Download PDF

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antibody
mycoplasma pneumoniae
sample
labeling substance
protein
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PCT/JP2016/066310
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Inventor
鈴木　啓太
久彦 岩本
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田中貴金属工業株式会社
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatography analyzer for detecting Mycoplasma pneumoniae, an immunochromatography kit, and a detection method thereof.
  • Mycoplasma pneumonia is a respiratory infection mainly caused by Mycoplasma pneumoniae.
  • Mycoplasma pneumoniae is a typical causative agent of atypical pneumonia.
  • the age of mycoplasma pneumonia patients is mainly in early childhood, schoolchildhood, and adolescence (5 to 35 years).
  • the initial symptoms are cold syndrome-like symptoms, so-called cold-like symptoms, but cough over time. May continue and may continue for about a month after the fever.
  • mycoplasma pneumonia there is a high need in the medical field to determine the presence or absence of Mycoplasma pneumoniae infection at the early stage of infection for the selection of antibiotics, but by applying it to an immunochromatographic analysis method that is easy to operate, mycoplasma can be quickly and easily performed. ⁇ Pneumoniae can be detected and mycoplasma pneumonia can be diagnosed.
  • the simplest structure of an immunochromatographic analyzer used for immunochromatographic analysis is a structure in which a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, and an absorption part are connected to each other.
  • Patent Document 1 discloses an immunochromatographic analyzer using a monoclonal antibody specific for the P1 protein of Mycoplasma pneumoniae.
  • Patent Document 2 discloses an immunochromatographic analyzer using an antibody specific for Mycoplasma pneumoniae ribosomal protein Ribosomal Protein L7 / L12.
  • the present inventors have focused on the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae as a target protein that can be detected with higher sensitivity than the P1 protein of Mycoplasma pneumoniae, and in particular, recognized a specific site of the P30 protein. It was found that the antibody to detect Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity.
  • mycoplasma pneumoniae infection can be detected quickly and easily with high sensitivity according to an immunochromatography analyzer using an antibody that binds to a specific site of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae, and the present invention has been achieved.
  • An immunochromatography analyzer for detecting Mycoplasma pneumoniae comprising a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part and an absorption part, The immunochromatographic analyzer, wherein the labeling substance holding part and the detection part contain an antibody that strongly recognizes the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • An immunochromatography analysis kit comprising the immunochromatography analyzer according to any one of 1 to 3 above and a sample diluent for diluting and developing the sample. 5.
  • a method for detecting Mycoplasma pneumoniae in a specimen using an immunochromatographic analyzer including a sample addition unit, a labeled substance holding unit, a chromatographic medium unit having a detection unit, and an absorption unit, the following step (1)
  • An immunochromatographic analysis method comprising (4).
  • a step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition portion (2) P30 protein of Mycoplasma pneumoniae having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 held in the labeling substance holding portion
  • a step of recognizing Mycoplasma pneumoniae by an antibody that strongly recognizes domain III (hereinafter referred to as antibody P30 (A))
  • a step of developing the specimen and antibody P30 (A) as a mobile phase in a chromatographic medium part (4)
  • a step of detecting Mycoplasma pneumoniae in the developed mobile phase with the antibody P30 (A) contained in the detection unit
  • Mycoplasma pneumoniae can be detected quickly and easily with high sensitivity by using an immunochromatographic analyzer using an antibody that binds to a specific site of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae. That is, the diagnosis of pneumonia mycoplasma can be performed more reliably and quickly.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view for explaining the structure of an immunochromatographic analyzer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of detection of Mycoplasma pneumoniae using the immunochromatography analyzer of the present invention and measuring the color intensity.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of detection of Mycoplasma pneumoniae using the immunochromatography analyzer of the present invention and measuring the color intensity.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of the detection of Mycoplasma pneumoniae P30 protein using the immunochromatography analyzer of the present invention and the measurement of its color intensity.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view for explaining the structure of an immunochromatographic analyzer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of detection of Mycoplasma pneumoniae using the immunochromatography analyzer of the present invention and measuring the color intensity.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of detection of Mycoplasma pneumoniae using the immunochromatography analyzer of the present invention
  • FIG. 5 is a graph showing the results of performing a competitive inhibition ELISA test using peptide 1 or peptide 2 as an antigen and measuring the color intensity in Test Example 4 using antibody P30 (a).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a competition inhibition ELISA test using peptide 1 or peptide 2 as an antigen and the color intensity measured in test example 4 using antibody P30 (b).
  • the immunochromatography analyzer for detecting Mycoplasma pneumoniae of the present invention is a chromatograph having a sample addition part for adding a specimen, a labeling substance holding part for holding a labeling substance, and a detection part for detecting Mycoplasma pneumoniae. A medium part and an absorption part that absorbs the liquid that has passed through the detection part, wherein the labeling substance holding part and the detection part contain an antibody that strongly recognizes the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae .
  • the antibody used in the immunochromatography analyzer of the present invention is an antibody that strongly recognizes domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae (hereinafter also referred to as antibody P30 (A)).
  • Mycoplasma pneumoniae P30 protein is an adhesion protein consisting of 274 amino acids shown in SEQ ID NO: 1, rich in proline (20.7%), and having a molecular weight of 29,743.
  • domain III of the P30 protein shown in SEQ ID NO: 2 is a region corresponding to the 177th to 274th amino acid sequence of the P30 protein (SEQ ID NO: 1), and is a domain rich in a specific amino acid repetitive sequence.
  • There are three types of amino acid repetitive sequences in domain III 7 amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3 (PGMAPR), 3 amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4 (PGMPPH), and shown in SEQ ID NO: 5 (PGGFPPQ). There are three amino acid sequences.
  • the antibody P30 (A) used in the present invention recognizes domain III rich in this amino acid repetitive sequence. Therefore, by performing analysis using the immunochromatography analyzer of the present invention, the sandwich structure as shown below is obtained. It is estimated that the detection sensitivity is remarkably improved and the effect is remarkably exhibited.
  • antibody P30 (A) when antibody P30 (A) is contained in the labeling substance holding part and the detection part of the immunochromatography analyzer of the present invention, first, antibody P30 (A) held in the labeling substance holding part is Mycoplasma pneumoniae. It binds to part of the repeat sequence of domain III in the P30 protein.
  • the antibody P30 (A) immobilized on the detection unit binds to the same repetitive sequence present at a location different from the location where the antibody P30 (A) held in the labeling substance holding unit is bound, A sandwich structure is formed by sandwiching the P30 protein with the antibody P30 (A), and Mycoplasma pneumoniae is detected.
  • antibody P30 (A) recognizes domain III having the above-mentioned repetitive sequence, it can be estimated that it can recognize a plurality of locations of P30 protein and can increase the detection sensitivity of Mycoplasma pneumoniae. Is done.
  • the antibody P30 (A) used in the present invention preferably recognizes at least the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (PGMAPR) among the repeated sequences of amino acids in the domain III. As shown in the results of Examples below, the antibody recognizing the above sequence more strongly recognizes the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae, so that Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity.
  • PMAPR amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the antibody P30 (A) in the present invention is an antibody that "recognizes strongly the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae" as an antibody having an absorbance at 450 nm of 0.2 Abs or more when performing an ELISA test. Can be defined.
  • ELISA test is performed according to the following protocol.
  • Mycoplasma pneumonia P30 ((amino acids 96-274) was expressed and purified in a conventional manner using Escherichia coli in a 96-well plate for Nunc Immuno modules (Thermo Fisher Scientific, code 469949)
  • ELISA 4Pg / n4 Add 100 ⁇ L of mL in 50 mM carbonate buffer pH 9.5 and incubate at 4 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the P30 solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS). Remove the liquid remaining in the well by tapping on a paper towel.
  • PBST 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody As a primary antibody, anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (A)) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution 100 ⁇ L is added to the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • An antibody having a value obtained by subtracting the absorbance of a blank (secondary antibody without adding a primary antibody, well in which color development reaction was performed) by the above method to be 0.2 Abs or more was designated as “Mycoplasma pneumoniae P30 protein domain III. Antibody ".
  • the antibody P30 (A) in the present invention is an antibody that "recognizes strongly the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae", specifically, the full-length Mycoplasma pneumonia P30 protein (amino acids 1-274: SEQ ID NO: 1) or aminoplasm 96-274 fragment of Mycoplasma pneumonia P30 protein (these proteins are referred to as protein A) and one or more of three types of repeated sequences of amino acids in domain III or domain III (SEQ ID NOs: 3 to 5)
  • a competitive inhibition test competitive inhibition ELISA test
  • the competitive inhibition ELISA test can be defined by either a direct competitive method or an indirect competitive method.
  • ELISA 96-well plate Mycoplasma pneumonia P30 (amino acid 1-274: SEQ ID NO: 1) 4 ngm 50 mL Add 100 ⁇ L of carbonate buffer pH 9.5 and incubate at 4 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the P30 solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS). Remove the liquid remaining in the well by tapping on a paper towel.
  • PBST 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • the BSA solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween20 in PBS).
  • the liquid remaining in the well is removed by tapping on a paper towel to create a full-length protein-fixed well.
  • anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (A)) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution is added to the well as a primary antibody in the full-length protein-fixed well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the primary antibody anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (A)) 5 ⁇ g / mL, and the primary antibody amount 40 times or 80 times the domain III or 100 ⁇ L of a 50% blocking solution containing a domain III fragment containing one or more of the three repeating sequences of amino acids in domain III is added to the wells and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution is removed, and the wells are washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • PBST 0.05% Tween 20 in PBS
  • the absorbance is reduced by 30% or more when the domain III or a fragment of domain III containing one or more of three types of repeating sequences of amino acids in domain III is used 40 times the amount of the primary antibody, or 80 times that of the primary antibody. It can be confirmed that the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae is more strongly recognized if the absorbance when used in an amount decreases by 50% or more.
  • Examples of the antibody P30 (A) used in the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of sensitivity.
  • the antibody P30 (A) can be obtained by purchasing, for example, trade name: Mp-P30-3-AB from Fucal Research.
  • fixed means that the antibody is arranged on a carrier such as a membrane so that it does not move
  • hold means that the inside or the surface of the carrier such as a membrane can move. It means to be placed.
  • a sample addition part also called a sample pad
  • a labeling substance holding part also called a conjugate pad
  • a chromatograph It is comprised from the graph medium part (3), the detection part (4), the absorption part (5), and the backing sheet (6).
  • the sample addition part (1) is a part to which a sample containing a specimen is added in the immunochromatography analyzer.
  • the sample is rapidly absorbed, but it can be constituted by a porous sheet having such a property that the sample moves quickly.
  • the porous sheet include cellulose filter paper, glass fiber, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth.
  • the labeling substance holding part (2) contains a labeling substance (marker substance) described later, and the labeling substance is held as a labeled antibody (hereinafter also simply referred to as a labeled antibody) bound to the antibody P30 (A). Held in the part (2).
  • a labeled antibody hereinafter also simply referred to as a labeled antibody bound to the antibody P30 (A).
  • a film of glass fiber, cellulose or the like is usually used for the labeling substance holding part (2).
  • the content of the labeled antibody in the labeling substance holding part is usually 0.06 to 0.25 ⁇ g / device, preferably 0.1 to 0.2 ⁇ g / device, more preferably 0.1 to 0.15 ⁇ g. / Device.
  • the content of the labeled antibody per unit area of the labeling substance holding part is usually 0.1 to 0.42 ⁇ g / cm 2 , preferably 0.17 to 0.33 ⁇ g / cm 2 , more preferably 0.17 to 0.25 ⁇ g / cm 2 .
  • An enzyme or the like is generally used for labeling a detection reagent in immunochromatographic analysis, but it is preferable to use an insoluble carrier as the labeling substance because it is suitable for visually determining the presence of the substance to be detected.
  • a labeled detection reagent can be prepared by sensitizing the antibody P30 (A) to an insoluble carrier.
  • the means for sensitizing the antibody P30 (A) to the insoluble carrier may be a known method.
  • the insoluble carrier as a labeling substance, metal particles such as gold, silver or platinum, metal oxide particles such as iron oxide, non-metallic particles such as sulfur and latex particles made of synthetic polymer, or other insoluble carriers are used. be able to.
  • the insoluble carrier is a labeling substance suitable for visually determining the presence of the substance to be detected, and is preferably colored to facilitate visual determination.
  • the metal particles and the metal oxide particles themselves exhibit a specific natural color corresponding to the particle diameter, and the color can be used as a label.
  • the average particle diameter of the gold particles is, for example, 10 nm to 250 nm, preferably 35 nm to 120 nm.
  • the average particle diameter was measured with a transmission electron microscope (TEM: manufactured by JEOL Ltd., JEM-2010), and the projected area circle equivalent diameter of 100 particles was measured randomly using a photograph taken. It can be calculated from the average value.
  • the gold particles contained in the labeling substance holding part are usually 0.25 to 0.7 ⁇ g / cm 2 , preferably 0.3 to 0.65 ⁇ g / cm 2 per unit area of the labeling substance holding part, Preferably, it is 0.4 to 0.6 ⁇ g / cm 2 . This is because, by setting the range, the labeled particles are developed in a dispersed state, and the recognition site of the antibody is not hindered and the sensitivity can be increased.
  • the chromatographic medium part (3) is a developed part of the chromatograph.
  • the chromatographic medium part (3) is an inert film made of a microporous material that exhibits capillary action.
  • a membrane made of nitrocellulose hereinafter, Nitrocellulose membrane
  • cellulose acetate membrane hereinafter also referred to as cellulose acetate membrane
  • Cellulose membranes, nylon membranes and porous plastic cloth can also be used.
  • nitrocellulose membrane it is only necessary to mainly contain nitrocellulose, and a membrane mainly composed of nitrocellulose such as a pure product or a nitrocellulose mixed product can be used.
  • the nitrocellulose membrane may further contain a substance that promotes capillary action.
  • a substance that lowers the surface tension of the film surface and brings about hydrophilicity is preferable.
  • a substance having an amphipathic action such as saccharides, amino acid derivatives, fatty acid esters, various synthetic surfactants or alcohols, which does not affect the movement of the detected substance and does not affect the coloring of the labeling substance. No material is preferred.
  • Nitrocellulose membrane is porous and exhibits capillary action.
  • the index of the capillary phenomenon can be confirmed by measuring the water absorption rate (water absorption time: capillary flow time).
  • the water absorption rate affects detection sensitivity and inspection time.
  • the form and size of the chromatographic medium part (3) represented by the above nitrocellulose membrane and cellulose acetate membrane are not particularly limited, and are appropriate in terms of actual operation and reaction results. If it is.
  • the support made of plastic or the like on the back surface of the chromatographic medium part (3).
  • the properties of the support are not particularly limited, but when the measurement result is observed by visual judgment, the support preferably has a color that is not similar to the color caused by the labeling substance. Usually, it is preferably colorless or white.
  • the detection part (4) is formed on the chromatographic medium part (3). That is, the antibody P30 (A) that binds to the substance to be detected Mycoplasma pneumoniae is immobilized at an arbitrary position on the chromatographic medium part (3). Immobilization of the antibody P30 (A) can be performed according to a conventional method.
  • the content of antibody P30 (A) in the detection section (4) is usually 0.1 to 2.5 ⁇ g / device, preferably 0.3 to 2.0 ⁇ g / device, more preferably 0.3 to 1.0 ⁇ g / device. Further, the content of the antibody P30 (A) per unit area of the detection unit (4) is usually 0.04 to 1.0 g / cm 2 , preferably 0.125 to 0.8 ⁇ g / cm 2 . More preferably, it is 0.125 to 0.42 ⁇ g / cm 2 .
  • the chromatographic medium part (3) is blocked by a known method as necessary. Processing can be performed. Generally, proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein or gelatin are preferably used for the blocking treatment. After such blocking treatment, if necessary, for example, one or a combination of two or more surfactants such as Tween 20, Triton X-100, or SDS may be washed.
  • a surfactant such as Tween 20, Triton X-100, or SDS may be washed.
  • the absorption part (5) is installed at the end of the chromatographic medium part (3) in order to absorb a liquid such as a specimen or a developing solution that has passed through the detection part (4).
  • the absorption part (5) contains, for example, glass fiber, pulp, cellulose fiber, or the like, or a non-woven fabric containing a polymer such as an acrylic acid polymer, a hydrophilic drug having an ethylene oxide group or the like. What was made to use is used, Especially preferably, it is a glass fiber.
  • the absorption part (5) is made of glass fiber, the return of the sample liquid can be greatly reduced.
  • the backing sheet (6) is a base material. By applying an adhesive on one side or sticking an adhesive tape, one side has adhesiveness, and the sample addition part (1), labeling substance holding part (2), chromatographic medium part ( 3) A part or all of the detection unit (4) and the absorption unit (5) are provided in close contact with each other.
  • the backing sheet (6) is not particularly limited as long as the backing sheet (6) becomes impermeable and impermeable to the sample solution by the adhesive.
  • the immunochromatographic analyzer produced as described above is usually subjected to a drying process before commercialization.
  • the drying temperature is, for example, 20 to 50 ° C., and the drying time is 0.5 to 1 hour.
  • the immunochromatography analysis kit of the present invention includes the above immunochromatography analyzer and a sample diluent for diluting and developing the sample.
  • the sample diluent can also be used as a developing solution, but usually water is used as a solvent, to which a buffer solution, salt, and nonionic surfactant are further added.
  • a buffer solution for example, one or more of proteins, polymer compounds (PVP, etc.), ionic surfactants or polyanions, or antibacterial agents, chelating agents, etc. for promoting antigen-antibody reactions or suppressing nonspecific reactions May be added.
  • P30 was isolated from the protein complex (P1, P90, P40, P30) present in the cell adhesion organ of Mycoplasma pneumonia, and a nonionic surfactant was diluted with the sample to expose the antigen recognition site of the anti-P30 antibody. It is preferable to make it contain in a liquid.
  • Nonionic surfactants include, for example, Triton X-100 (trade name, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether), Tween 20 (trade name, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), NP-40 (product) Name Nonit 40) and Brij 35 may be mentioned, and one or more may be added.
  • the nonionic surfactant contained in the sample diluent is a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 18. More preferably, 60% or more of the nonionic surfactant contained in the sample diluent is a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 17, and particularly preferably the nonionic surfactant contained in the sample diluent. 100% of the ionic surfactant is a nonionic surfactant having an HLB value of 13-17. Specifically, it is preferable to contain two types of Triton X-100 (HLB value: 13.7) and Tween 20 (HLB value: 16.7) at a mass ratio of 1: 1.
  • the sample and developing solution mixed in advance can be supplied and dropped onto the sample addition unit, or the sample can be supplied to the sample addition unit first. -After dripping, you may make it expand
  • the immunochromatographic analysis method of the present invention includes the following steps (1) to (4), and detects Mycoplasma pneumoniae to be detected contained in a specimen using the above immunochromatographic analyzer.
  • a step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition portion (2) P30 protein of Mycoplasma pneumoniae having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 held in the labeling substance holding portion
  • a step of recognizing Mycoplasma pneumoniae by an antibody that strongly recognizes domain III hereinafter referred to as antibody P30 (A)
  • (3) a step of developing the specimen and antibody P30 (A) as a mobile phase in a chromatographic medium part (4) Process of detecting Mycoplasma pneumoniae in the developed mobile phase with antibody P30 (A) contained in the detection unit Each process will be described below.
  • Step (1) Step of adding a specimen-containing solution obtained by diluting a specimen with a specimen diluent to the sample addition section
  • the specimen is smoothly passed through the immunochromatographic medium without degrading measurement accuracy. It is preferable to adjust or dilute with a sample diluent to a concentration that allows the sample to be transferred to a concentration of 1).
  • the specimen dilution liquid described above can be used.
  • a predetermined amount (usually 0.1 to 2 mL) of the specimen-containing liquid is dropped onto the sample addition part (1). When the specimen-containing liquid is dropped, the specimen-containing liquid starts to move in the sample addition part (1).
  • the specimen used in the present invention is a specimen that may contain Mycoplasma pneumoniae to be detected.
  • step (2) An antibody that strongly recognizes domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 held in the labeling substance holding part (hereinafter referred to as antibody P30 (A)).
  • step (2) the sample-containing liquid added to the sample addition part in step (1) is moved to the labeling substance holding part (2), and the label held in the labeling substance holding part.
  • step (3) the sample-containing liquid added to the sample addition part in step (1) is moved to the labeling substance holding part (2), and the label held in the labeling substance holding part
  • This is a step of recognizing the domain III of the P30 protein in Mycoplasma pneumoniae, which is the substance to be detected in the specimen, by the antibody P30 (A) to which the substance is bound.
  • the above-mentioned labeling substances can be used.
  • the antibody P30 (A) to which the labeling substance is bound recognizes and binds to a part of the specific repeating sequence in the amino acid sequence of domain III of the P30 protein.
  • step (3) Step of developing the sample and antibody P30 (A) as a mobile phase in a chromatographic medium part
  • Mycoplasma pneumoniae which is a substance to be detected in step (2), is labeled in the labeling substance holding part. Is recognized by the antibody P30 (A) bound to the sample, and then the specimen and the antibody P30 (A) are passed over the chromatographic medium as a mobile phase.
  • Step (4) is a step of detecting the mycoplasma in the sample that has passed over the chromatographic medium as the mobile phase.
  • Pneumonier is sandwiched between antibody P30 (A) immobilized on the detection part and antibody P30 (A) to which the labeling substance is bound in the above step (2) by a specific antigen-antibody binding reaction. This is a step of specifically reacting and binding to color the detection part.
  • the antibody P30 (A) immobilized on the detection part is sandwiched between the same repetitive sequences present at a different place from the place where the antibody P30 (A) held in the labeling substance holding part is bound. Combined so as to be sandwiched in a shape.
  • the labeling reagent dissolved in the sample water does not cause a specific binding reaction even if it passes through the detection part on the chromatographic medium part. Do not color.
  • the above peptide 1 is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (PGMPPH) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (PGMAPR).
  • Peptide 2 is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (PGGFPPQ) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (PGMAPR).
  • sample addition part The nonwoven fabric (Millipore company_made: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used as a sample addition part.
  • the labeling substance solution was prepared by the above procedure. After adding 300 ⁇ L of a 10% by mass trehalose aqueous solution and 1.8 mL of distilled water to 300 ⁇ L of the prepared labeling substance solution, uniformly added to a 12 mm ⁇ 300 mm glass fiber pad (Millipore), vacuum is added.
  • the labeling substance holding part was produced by drying with a dryer.
  • chromatographic medium part and detection part As a membrane, a sheet made of nitrocellulose (manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm ⁇ 25 mm) was used. Next, 150 ⁇ L of a solution obtained by diluting the antibody P30 (a) with a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 5% by mass of isopropyl alcohol so as to have a concentration of 1.0 mg / mL was dried with a membrane. An upper chromatographic dispenser “XYZ3050” (manufactured by BIODOT) was applied to the upper detection site (detection line) at a width of 1 mm in an amount of 1 ⁇ L / mm (25 ⁇ L per sheet).
  • a substrate consisting of a backing sheet, a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part having a detection part, absorption for absorbing the developed sample and labeling substance Glass fiber non-woven fabrics were bonded together as a part. And it cut
  • the length of the labeling substance holding part in the sample developing direction was 12 mm.
  • Specimen diluent 1% by mass of nonionic surfactant NP-40 (trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7) manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., trade name Nonidet MN-811 (manufactured by NOF Corporation)
  • NP-40 trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7
  • Nonidet MN-811 manufactured by NOF Corporation
  • a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5) containing a 1: 1 mixture of HLB values 9.3) was prepared, and used as a sample diluent for subjecting the sample to dilution treatment.
  • Mycoplasma pneumonia P30 ((amino acid 96-274) was expressed and purified by a conventional method using Escherichia coli P30Ag) was used. This P30Ag was adjusted to the target concentration of 10 pg / mL with the above extract, and peptide 1 or peptide 2 was prepared so that 400 ng of peptide 1 or peptide 2 was developed, and used as a sample sample. 150 ⁇ L of the sample sample was placed on the sample addition part of the immunochromatography analyzer and developed, and the degree of coloring (coloring intensity) of the detection part was measured with a densitometer (the unit in the table is mAbs).
  • the number of binding sites is small or nonexistent, and a large amount of peptide flows to the absorption unit without being captured by the detection unit. As a result, the amount of labeling substance that is captured and deposited by the detection unit decreases, thereby reducing the color intensity. .
  • the antibody held in the labeling substance holding part binds to Peptide 1 and Peptide 2 prior to P30Ag, so that the amount of the antibody that binds to P30Ag developed later is present in Peptide 1 or Peptide 2. Therefore, the amount of P30Ag captured by the detection unit is relatively higher when the antibody is not bound, and as a result, the color intensity caused by P30Ag detected by the detection unit is low. It will be a hindrance.
  • the antibody P30 (a) used in Test Example 1 is an antibody that strongly recognizes domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae, according to the protocol described in paragraphs [0025] to [0030]
  • the test by the ELISA method was performed. Specifically, whether or not the antibody P30 (a) was an antibody having an absorbance at 450 nm of 0.2 Abs or more with a blank drawn was examined as follows.
  • Mycoplasma pneumonia P30 ((amino acids 96-274) was expressed and purified in an ordinary manner using E. coli 4 g / n (4 Pg / mL). 100 ⁇ L of in 50 mM carbonate buffer pH 9.5 was added and incubated at 4 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the P30 solution was removed, the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS), and the liquid remaining in the wells was removed by tapping on a paper towel.
  • PBST 0.05% Tween 20 in PBS
  • PBST 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • a primary antibody 100 ⁇ L of the antibody P30 (a) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution (primary antibody solution) was added to the well, incubated at 37 ° C. for 1 hour, the primary antibody solution was removed, and the well was removed with 300 ⁇ L PBST (0.05 % Tween20 in PBS).
  • PBST 0.05 % Tween20 in PBS.
  • a secondary antibody 1 mg / mL of Anti Mouse IgG (H + L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., code 04-117611) was added to 100 ⁇ L of the well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • the absorbance at 450 nm obtained by subtracting the absorbance of the blank (secondary antibody without adding the primary antibody, well in which the color reaction was performed) was 0.403 Abs, which was 0.2 Abs or more. I was able to confirm. That is, it was confirmed that the antibody P30 (a) “recognizes strongly the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae”.
  • this antibody P30 (a) is an antibody that "recognizes strongly domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae"
  • competition inhibition ELISA test indirect competition method was performed. Specifically, as a result of competitive inhibition ELISA test using antibody P30 (a), whether or not the absorbance decreased by 30% or more was tested as follows.
  • Nunc Immuno modules manufactured by Thermo Fisher Scientific, code 469949
  • ELISA 96-well plate full length protein Mycoplasma pneumonia P30 (amino acid 1-274: SEQ ID NO: 1) 4 ng / mL in 50 mM carbonate buffer L9.
  • P30 solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween20 in PBS). The liquid remaining in the well was removed by tapping on a paper towel.
  • BSA 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • the BSA solution was then removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the liquid remaining in the well was removed by tapping on a paper towel to create a full-length protein-fixed well.
  • an anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (a)) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution was added to the well as a primary antibody in the full-length protein-fixed well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the primary antibody anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (a)) 5 ⁇ g / mL and 40 times the amount of the primary antibody P30 (a) 100 ⁇ L of a 50% blocking solution containing the peptide 1 (SEQ ID NO: 6: PGMAPRPGMPPHPGMAPR) or peptide 2 (SEQ ID NO: 7: PGMAPRPGFPPQPGMAPR) used in 1 was added to the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • a 50% blocking solution containing the peptide 1 SEQ ID NO: 6: PGMAPRPGMPPHPGMAPR
  • peptide 2 SEQ ID NO: 7: PGMAPRPGFPPQPGMAPR
  • Example 3 ⁇ Preparation of immunochromatography analyzer of the present invention> [Example 1] (1) Preparation of sample addition part The nonwoven fabric (Millipore company_made: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used as a sample addition part.
  • the nonwoven fabric (Millipore company_made: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used as a sample addition part.
  • a phosphate buffer solution pH 7.4 containing 1% by mass of bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, after sufficiently stirring, centrifugation was performed at 8000 ⁇ g for 15 minutes, and the supernatant was removed. Then, 0.1 mL of a phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% by mass of BSA was added.
  • the labeling substance solution was prepared by the above procedure.
  • the labeling substance holding part was produced by drying with a dryer.
  • chromatographic medium part and detection part As a membrane, a sheet made of nitrocellulose (manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm ⁇ 25 mm) was used. Next, 150 ⁇ L of a solution obtained by diluting the antibody P30 (a) with a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 5% by mass of isopropyl alcohol so as to have a concentration of 1.0 mg / mL was dried with a membrane. An upper chromatographic dispenser “XYZ3050” (manufactured by BIODOT) was applied to the upper detection site (detection line) at a width of 1 mm in an amount of 1 ⁇ L / mm (25 ⁇ L per sheet).
  • a goat-derived antiserum having a wide affinity for the gold particle labeling substance dilute a goat-derived antiserum having a wide affinity for the gold particle labeling substance with a phosphate buffer (pH 7.4) downstream of the detection site.
  • the solution was applied to the control site (control line). Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes and dried overnight at room temperature to prepare a chromatographic medium part and a detection part.
  • Specimen diluent 1% by mass of nonionic surfactant NP-40 (trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7) manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd., trade name Nonidet MN-811 (manufactured by NOF Corporation)
  • NP-40 trade name: Nonidet P-40, HLB value 17.7
  • Nonidet MN-811 manufactured by NOF Corporation
  • a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.5) containing a 1: 1 mixture of HLB values 9.3) was prepared, and used as a sample diluent for subjecting the sample to dilution treatment.
  • a specimen sample containing Mycoplasma pneumoniae the color intensity at the detection part was measured when the prepared immunochromatography analyzer was used.
  • a specimen sample containing Mycoplasma pneumoniae a commercially available inactivated Mycoplasma pneumoniae (manufactured by Meridian, trade name Mycoplasma pneumoniae Antigen (FH)), or a pharyngeal wipe from a pneumonia mycoplasma infected person was used.
  • the pharyngeal swab was collected from two subjects with pneumonia mycoplasma infection by wiping the pharynx with a commercially available cotton swab.
  • a commercially available inactivated mycoplasma pneumoniae was adjusted to the target concentration with the above extract and used as a specimen sample (described as a commercially available specimen in Table 3). Further, the collected pharyngeal wiping solution was diluted 20-fold with the above-described sample diluent, and used as sample samples (described as subject 1 and subject 2 in Table 3).
  • the antibody P30 (b) is an antibody that strongly recognizes domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae
  • an ELISA test was performed according to the protocol described in paragraphs [0025] to [0030]. It was. Specifically, whether or not the antibody P30 (b) was an antibody having an absorbance at 450 nm with a blank drawn of 0.2 Abs or more was examined as follows.
  • PBST 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • the antibody P30 (b) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution 100 ⁇ L was added to the well as a primary antibody and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the primary antibody solution antibody P30 (b) was removed, and the well was removed with 300 ⁇ L PBST (0.05 % Tween20 in PBS). As a secondary antibody, 1 mg / mL of Anti Mouse IgG (H + L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., code 04-117611) was added to 100 ⁇ L of the well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • the absorbance at 450 nm obtained by subtracting the absorbance of the blank was 0.061 Abs and less than 0.2 Abs. I was able to confirm. That is, it was confirmed that the antibody P30 (b) was not an antibody that “recognizes strongly the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae”.
  • this antibody P30 (b) is an antibody “recognizes domain III of P30 protein of Mycoplasma pneumoniae”
  • the protocol described in paragraphs [0032] to [0039] is followed.
  • a competitive inhibition ELISA test (indirect competitive method) was performed, and whether or not the absorbance decreased to 30% or less was examined as follows.
  • Nunc Immuno modules manufactured by Thermo Fisher Scientific, code 469949
  • ELISA 96-well plate full length protein Mycoplasma pneumonia P30 (amino acid 1-274: SEQ ID NO: 1) 10 ng / mL in 50 mM carbonate buffer L9.
  • P30 solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween20 in PBS). The liquid remaining in the well was removed by tapping on a paper towel.
  • BSA 5% BSA in PBST
  • BSA manufactured by Oriental Yeast
  • the BSA solution was then removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the liquid remaining in the well was removed by tapping on a paper towel to create a full-length protein-fixed well.
  • an anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (a)) 5 ⁇ g / mL in 50% blocking solution was added to the well as a primary antibody in the full-length protein-fixed well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the primary antibody anti-Mycoplasma pneumoniae P30 antibody (antibody P30 (b)) 5 ⁇ g / mL and the amount that is 40 times the amount of the primary antibody P30 (b)
  • test 100 ⁇ L of a 50% blocking solution containing Peptide 1 (SEQ ID NO: 6: PGMAPRPGMPPHPGMAPR) or Peptide 2 (SEQ ID NO: 7: PGMAPRPGFPPQPGMAPR) used in Example 1 was added to the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the primary antibody solution was removed, and the wells were washed 3 times with 300 ⁇ L PBST (0.05% Tween 20 in PBS).
  • the absorbance of the well added with the primary antibody and the peptide 1 or peptide 2 was not decreased in the peptide 1 compared with the absorbance of the well added only with the primary antibody, and only about 22% in the peptide 2 It was confirmed that the decrease rate was less than 30%. That is, it was confirmed that the antibody P30 (b) was not an antibody that “recognizes strongly the domain III of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae”.
  • Example 2 Except that both the antibody P30 (a) in the labeling substance solution added to the labeling substance holding part and the antibody P30 (a) in the antibody diluent applied to the detection part were changed to the antibody P30 (b), Example 1 was repeated. The results are shown in Table 3 and FIG.
  • Example 2 The composition of the sample diluent was Triton X-100 (trade name, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether, HLB value: 13.7, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Tween 20 (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Example 1 was repeated except that polyoxyethylene sorbitan monolaurate, HLB value: 16.7) was changed. The results are shown in Table 4 and FIG. [Comparative Example 6]
  • Example 2 was repeated except that the antibody P30 (a) in the antibody diluent applied to the detection unit was changed to the antibody P30 (b). The results are shown in Table 4 and FIG.
  • Example 3 The detection sample was changed to P30 protein ((amino acid 96-274) was expressed and purified by a conventional method using E. coli P30Ag), and the composition of the sample dilution was changed to Triton.
  • X-100 (trade name, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether, HLB value: 13.7), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tween 20 (trade name, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , HLB value: 16.7)
  • Example 1 was repeated except that it was changed to a 1: 1 mixture. The results are shown in Table 5 and FIG.
  • Example 3 was repeated except that the antibody P30 (a) in the antibody diluent applied to the detection unit was changed to the antibody P30 (b). The results are shown in Table 5 and FIG.
  • Example 3 was repeated except that the antibody P30 (a) in the antibody dilution solution applied to the detection unit was changed to the antibody P1 (b). The results are shown in Table 5 and FIG.
  • Example 11 Example 3 was repeated except that the antibody P30 (a) in the labeling substance solution added to the labeling substance holding part was changed to the antibody P1 (a). The results are shown in Table 5 and FIG.
  • Mycoplasma pneumoniae can be detected quickly and easily with high sensitivity by using an immunochromatography analyzer using an antibody that binds to a specific site of the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae. It can be used for early diagnosis.
  • Sample pad 2 Labeling substance holding part 3 Chromatographic medium part 4 Detection part 5 Absorption part 6 Backing sheet

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Abstract

本発明は、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを、迅速かつ簡易に検出でき、その結果肺炎マイコプラズマの診断をより確実かつ迅速に行う免疫クロマト分析装置を提供することを目的とする。本発明は、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置に関する。

Description

マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエの検出のための免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析キットおよびその検出方法に関する。
　マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を主な原因とした呼吸器系の感染症である。マイコプラズマ・ニューモニエは非定型肺炎の代表的な起因菌である。マイコプラズマ肺炎患者の年齢は、幼児期、学童期、青年期（５歳から３５歳）が中心であり、初期症状は、風邪症候群様の症状、いわゆる感冒様症状を呈するが、時間の経過と共に咳が強くなり、解熱後も１ヶ月程度続くこともある。
　マイコプラズマ肺炎の診断のために、従来種々の方法が利用されている。例えば、マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体を用いた検出法が利用されている。マイコプラズマ肺炎では、抗生剤選択のために感染初期にマイコプラズマ・ニューモニエ感染の有無を判定したいという医療現場のニーズが高いが、操作が簡便な免疫クロマト分析法に応用することによって、迅速かつ簡易にマイコプラズマ・ニューモニエの検出を行うことができ、マイコプラズマ肺炎の診断を行うことができる。
　免疫クロマト分析法に使用する免疫クロマト分析装置の最も簡単な構造としては、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、及び吸収部が相互に繋がった構造である。
　例えば、特許文献１には、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫クロマト分析装置が開示されている。
　また、特許文献２には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ７／Ｌ１２に特異的な抗体を用いた免疫クロマト分析装置が開示されている。
日本国特開２０１３－７２６６３号公報 日本国特開２０１４－１６７４３９号公報
　しかしながら、従来使用されていたマイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体を用いた免疫クロマト分析装置による診断方法では、マイコプラズマ・ニューモニエに対する感度は十分ではなく、非特異的な反応も多いため、マイコプラズマ・ニューモニエ感染の診断方法としては十分なものではなかった。
　そこで、本発明者らは、鋭意研究した結果、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質よりも高感度で検出し得る標的タンパクとして、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に注目し、特にＰ３０タンパク質の特定の部位を認識する抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できることを見出した。
　また、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置によれば、迅速かつ簡易にマイコプラズマ・ニューモニエ感染を高感度で検出できることを見出し、本発明に至った。
　したがって、本発明は以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
　前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
２．前記抗体が、前記ドメインＩＩＩのうち配列番号３のアミノ酸配列を認識する、前記１に記載の免疫クロマト分析装置。
３．前記標識物質保持部が含有する標識物質が金粒子であり、前記標識物質保持部が前記金粒子を、０．２５～０．７μｇ／ｃｍ２含有する、前記１または２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記１～３のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
５．前記検体希釈液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有する、前記４に記載の免疫クロマト分析キット。
６．前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３～１８の非イオン性界面活性剤である、前記５に記載の免疫クロマト分析キット。
７．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
　本発明によれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置を用いることによって、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを、迅速かつ簡易に検出できる。すなわち、肺炎マイコプラズマの診断をより確実かつ迅速に行うことができる。
図１は、本発明の一実施形態の免疫クロマト分析装置の構造を説明するための断面図である。 図２は、本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。 図３は、本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。 図４は、本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。 図５は、試験例４において、抗体Ｐ３０（ａ）を使用して、ペプチド１またはペプチド２を抗原とした競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。 図６は、試験例４において、抗体Ｐ３０（ｂ）を使用して、ペプチド１またはペプチド２を抗原とした競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。
　以下に、本発明を実施するための形態を説明する。
　本発明の、マイコプラズマ・ニューモニエを検出するための免疫クロマト分析装置は、検体を添加する試料添加部と、標識物質を保持する標識物質保持部と、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、検出部を通過した液体を吸収する吸収部とを備え、標識物質保持部及び検出部が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有することを特徴としている。
　本発明の免疫クロマト分析装置に使用する抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）ともいう）である。
　マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質とは、配列番号１に示される２７４のアミノ酸からなり、プロリンに富み（２０．７％）、分子量２９，７４３の接着タンパク質である。
　また、配列番号２に示されるＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩは、Ｐ３０タンパク質（配列番号１）のうちアミノ酸配列の１７７番目から２７４番目に相当する領域であり、特定のアミノ酸の繰り返し配列に富むドメインである。ドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の繰り返し配列は３種類あり、配列番号３（ＰＧＭＡＰＲ）に示されるアミノ酸配列が７箇所、配列番号４（ＰＧＭＰＰＨ）に示されるアミノ酸配列が３箇所、配列番号５（ＰＧＦＰＰＱ）に示されるアミノ酸配列が３箇所存在する。
　本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）は、このアミノ酸の繰り返し配列に富むドメインＩＩＩを認識するため、本発明の免疫クロマト分析装置を用いて分析を行うことにより、下記に示すようなサンドイッチ構造が形成され、検出感度が格段に向上し、顕著にその効果を発揮するものと推測される。
　すなわち、本発明の免疫クロマト分析装置の標識物質保持部及び検出部に抗体Ｐ３０（Ａ）を含有させた場合、まず、標識物質保持部に保持された抗体Ｐ３０（Ａ）が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の中でドメインＩＩＩの繰り返し配列の一部に結合する。
　続いて、検出部に固定化された抗体Ｐ３０（Ａ）が、標識物質保持部に保持された抗体Ｐ３０（Ａ）が結合した箇所と別の箇所に存在する同じ繰り返し配列に結合することによって、Ｐ３０タンパク質を抗体Ｐ３０（Ａ）で挟むようにしてサンドイッチの構造を形成し、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する。
　このように、抗体Ｐ３０（Ａ）は、上記繰り返し配列を有するドメインＩＩＩを認識するため、Ｐ３０タンパク質の複数の箇所を認識することができ、マイコプラズマ・ニューモニエの検出感度を高めることができるものと推測される。
　本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）は、好ましくは、上記ドメインＩＩＩのアミノ酸の繰り返し配列のうち、少なくとも配列番号３（ＰＧＭＡＰＲ）のアミノ酸配列を認識するものであることが好ましい。下記実施例の結果にも示されているように、上記配列を認識する抗体は、より強くマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識するため、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを検出できる。
　本発明における抗体Ｐ３０（Ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるとは、ＥＬＩＳＡ試験を行ったとき、４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体として定義できる。
　具体的には、以下のプロトコールに従い、ＥＬＩＳＡ試験を行う。まず、Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（（アミノ酸９６－２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートする。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
　ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
　一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
　ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させる。
　マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。
　上記方法で、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた値が、０．２Ａｂｓ以上となる抗体を、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体とした。
　また、本発明における抗体Ｐ３０（Ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるとは、具体的には、全長のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０タンパク質（アミノ酸１－２７４：配列番号１）あるいはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０タンパク質のアミノ酸９６－２７４断片（これらのタンパク質をタンパク質Ａとする）と、ドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列（配列番号３～５）を一以上含むドメインＩＩＩの断片（これらのタンパク質をタンパク質Ｂとする）との、ＥＬＩＳＡ法による競合阻害試験（競合阻害ＥＬＩＳＡ試験）を行ったときに、タンパク質Ａに対する抗体の反応がタンパク質Ｂの存在により反応が阻害される場合におけるその抗体とも定義できる。競合阻害ＥＬＩＳＡ試験としては、直接競合法と間接競合法の何れの試験方法によっても定義できる。
　間接競合法による試験を例示すると、Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（アミノ酸１－２７４：配列番号１）４ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートする。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
　ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成する。
　次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。
　また、上記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬと、上記一次抗体量の４０倍量または８０倍量のドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
　ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させる。
　マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。
　上記方法で、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度より一次抗体とドメインＩＩＩまたはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片を加えたウェルの吸光度が減少することが確認でき、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できる。
　本発明においては、ドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片を一次抗体の４０倍量用いた場合の吸光度が３０％以上減少、または一次抗体の８０倍量用いた場合の吸光度が５０％以上減少すれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩをより強く認識することが確認できる。
　本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）としては、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が挙げられる。感度の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体Ｐ３０（Ａ）は、例えば、Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－３－ＡＢを購入し、入手できる。
　次に、図面を参照しながら本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態について説明する。なお本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「保持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。
　本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料添加部（サンプルパッドともいう）（１）、標識物質保持部（コンジュゲートパッドともいう）（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）およびバッキングシート（６）から構成されている。
　試料添加部（１）は、免疫クロマト分析装置において、検体を含有する試料を添加する部位である。試料添加部（１）では試料が迅速に吸収されるが、速やかに試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。
　標識物質保持部（２）は、後述する標識物質（マーカー物質）を含有しており、該標識物質は上記抗体Ｐ３０（Ａ）と結合した標識抗体（以下単に標識抗体ともいう）として標識物質保持部（２）に保持されている。標識物質保持部内を検体が移動する際に、上記標識抗体と検体中のマイコプラズマ・ニューモニエとが結合する。標識物質保持部（２）には、グラスファイバー、セルロース等の膜が通常使用される。
　標識物質保持部中の標識抗体の含有量は、通常０．０６～０．２５μｇ／装置であり、好ましくは０．１～０．２μｇ／装置であり、より好ましくは０．１～０．１５μｇ／装置である。また、標識物質保持部の単位面積当たりの標識抗体の含有量は、通常０．１～０．４２μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１７～０．３３μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１７～０．２５μｇ／ｃｍ２である。
　免疫クロマト分析における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては不溶性担体を用いることが好ましい。抗体Ｐ３０（Ａ）を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製することができる。なお、抗体Ｐ３０（Ａ）を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。
　標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金等の金属粒子、酸化鉄等の金属酸化物粒子、硫黄等の非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他の不溶性担体を用いることができる。上述のように不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。金属粒子及び金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。
　特に、金粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ～２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ～１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ－２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無造作に１００個の粒子を粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。
　標識物質保持部が含有する金粒子は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．２５～０．７μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．３～０．６５μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．４～０．６μｇ／ｃｍ２である。前記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。
　クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部（３）は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、本発明の効果が向上するという観点から、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下、ニトロセルロースメンブレンともいう）や、酢酸セルロース製のメンブレン（以下、酢酸セルロースメンブレンともいう）が好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレン）も使用可能である。
　ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。
　ニトロセルロースメンブレンは、さらに毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、標識物質の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。
　ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｆｌｏｗ　ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。
　上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部（３）の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部（３）の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
　検出部（４）は、前記クロマトグラフ媒体部（３）上に形成される。すなわち、被検出物質のマイコプラズマ・ニューモニエと結合する前記抗体Ｐ３０（Ａ）が、クロマトグラフ媒体部（３）上の任意の位置に固定化される。前記抗体Ｐ３０（Ａ）の固定化は常法に従って行うことができる。
　検出部（４）における抗体Ｐ３０（Ａ）の含有量は、通常０．１～２．５μｇ／装置であり、好ましくは０．３～２．０μｇ／装置であり、より好ましくは０．３～１．０μｇ／装置である。また、検出部（４）の単位面積当たりの抗体Ｐ３０（Ａ）の含有量は、通常０．０４～１．０ｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１２５～０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１２５～０．４２μｇ／ｃｍ２である。
　また、クロマトグラフ媒体部（３）上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部（３）に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
　吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体部（３）の末端に、検出部（４）を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明の免疫クロマト分析装置において、吸収部（５）は、例えばグラスファイバー、パルプ、セルロースファイバー等、またはそれら不織布にアクリル酸重合体等の高分子、エチレンオキサイド基等を持つ親水性薬剤を含有させたものが用いられ、特に好ましくはグラスファイバーである。吸収部（５）がグラスファイバーからなることによって、試料液の液戻りを大幅に低減することができる。
　バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
　上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０～５０℃、乾燥時間は０．５～１時間である。
　本発明の免疫クロマト分析キットは、上記の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。
　本発明の免疫クロマト分析キットにおいて検体希釈液は、展開液としても使用することができるものであるが、通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩、および非イオン性界面活性剤、さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等々の１種もしくは２種以上を加えてもよい。
　特に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａの細胞接着器官に存在するタンパク質複合体（Ｐ１、Ｐ９０、Ｐ４０、Ｐ３０）からＰ３０を単離し、抗Ｐ３０抗体の抗原認識部位を露出させるために非イオン性界面活性剤を検体希釈液に含有させることが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（商品名、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＮＰ－４０（商品名　ノニテッド４０）、Ｂｒｉｊ３５が挙げられ、１種もしくは２種以上を加えてもよい。
　好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３～１８の非イオン性界面活性剤である。さらに好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の６０％以上が、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン性界面活性剤であり、特に好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の１００％が、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン性界面活性剤である。具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ＨＬＢ値：１３．７）とＴｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ値：１６．７）の２種を、質量比率で１：１の割合で含有させることが好ましい。
　検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体と展開液を予め混合したものを、試料添加部上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体を試料添加部上に供給・滴下した後、展開液を試料添加部上に供給・滴下して展開させてもよい。
　本発明の免疫クロマト分析方法は以下の工程（１）～（４）を含み、上記の免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
　各工程について以下に説明する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
　工程（１）では、第１に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第２に、検体含有液を試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１～２ｍＬ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部（１）中で移動を開始する。
　本発明において使用する検体は、被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエを含む可能性がある検体であり、例えば、生体試料のうち、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、喀痰、肺胞洗浄液等が挙げられるが、これらに限定されない。
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
　工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）により検体中の被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエにおける、Ｐ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識させる工程である。
　標識物質は上記のものを使用できる。前記標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）は、Ｐ３０タンパク質のドメインＩＩＩのアミノ酸配列のうち、上記特定の繰り返し配列の一部を認識し結合する。
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
　工程（３）は、工程（２）において被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエが標識物質保持部において標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）に認識された後、検体および抗体Ｐ３０（Ａ）を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを、検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
　工程（４）は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のマイコプラズマ・ニューモニエが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に固定されている抗体Ｐ３０（Ａ）と、前記工程（２）において標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。
　本工程（４）では、検出部に固定化された抗体Ｐ３０（Ａ）が、標識物質保持部に保持された抗体Ｐ３０（Ａ）が結合した箇所と別の箇所に存在する同じ繰り返し配列にサンドイッチ状に挟まれるように結合する。
　被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
　最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。
　以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
［試験例１］
　本試験では、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識する種類の異なる２つの抗体を用意し、それぞれ抗体がＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのどの部位を認識するかを調べた。使用した抗体は、Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－３－ＡＢ（以下、抗体Ｐ３０（ａ）と表記する）と、Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－９－ＡＢ（以下、抗体Ｐ３０（ｂ）と表記する）の２種類である。この抗体Ｐ３０（ａ）および抗体Ｐ３０（ｂ）が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのどの箇所に結合するのかを、下記の免疫クロマト分析法により検証した。
　まず、上記ドメインＩＩＩにおける３種類のアミノ酸の繰り返し配列（配列番号３～５）のいずれかを含むような以下の２種類のペプチドをペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法により作製した。
　ペプチド１：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ（配列番号６）
　ペプチド２：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ（配列番号７）
　上記ペプチド１は、配列番号４に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＰＰＨ）と配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を有するペプチドである。上記ペプチド２は、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）と配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を有するペプチドである。
　抗体Ｐ３０（ａ）または抗体Ｐ３０（ｂ）がドメインＩＩＩのどの箇所に結合するのかは、以下のようにして判定可能である。
　（１）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
　（２）標識物質保持部の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍＬに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗体Ｐ３０（ａ）（Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－３－ＡＢ）を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。
　次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
　上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
　（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
　メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
　次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、上記抗体Ｐ３０（ａ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
　また、金粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
　（５）検体希釈液
　１質量％の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製ＮＰ－４０（商品名：ノニデットＰ－４０、ＨＬＢ値１７．７）、日油社製商品名ノニデットＭＮ－８１１（ＨＬＢ値　９．３）の１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
　（６）測定
　マイコプラズマ・ニューモニエ、及びペプチド１またはペプチド２を含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（（アミノ酸９６－２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）を使用した。このＰ３０Ａｇを上記抽出液で目的濃度１０ｐｇ/ｍＬに調整し、さらにペプチド１またはペプチド２が４００ｎｇ展開されるように、ペプチド１またはペプチド２を調製し、検体試料とした。
　上記の検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をデンシトメーターにより測定した（表中の単位はｍＡｂｓ）。
＜判定方法＞
　ペプチド１で阻害されペプチド２で阻害されない場合：抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＰＰＨ）に結合する。
　ペプチド１で阻害されずペプチド２で阻害される場合：抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）に結合する。
　ペプチド１で阻害されペプチド２でも阻害される場合：抗体は、配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）に結合する。
　なお、ペプチド１又はペプチド２を検体のＰ３０Ａｇとともに展開させることにより阻害が生じていると考えられるメカニズムを以下に説明する。ペプチド１及びペプチド２は検体のＰ３０Ａｇと比較して分子量がはるかに小さく、また展開させる量もはるかに多いため、Ｐ３０Ａｇよりも早く標識物質保持部に到達し、同部位に保持された抗体と結合して検出部の方へと展開される。しかし、ペプチド１及びペプチド２が有する抗体結合部位はＰ３０Ａｇと比較してはるかに少ないので（１～２箇所）、抗体がすでに結合した状態の多くの上記ペプチドは、検出部に固定された抗体が結合できる箇所が少ないもしくは存在せず、多くのペプチドが検出部で捕捉されぬまま吸収部へと流れていくことになり検出部に捕捉され堆積する標識物質が減少することにより発色強度が減少する。一方、標識物質保持部に保持された抗体は、Ｐ３０Ａｇより先にペプチド１及びペプチド２に結合することにより、後から展開されるＰ３０Ａｇに結合する該抗体の量が、ペプチド１又はペプチド２が存在しない場合と比較して少なくなるため、検出部で捕捉されるＰ３０Ａｇは、該抗体が結合していないものが相対的に多くなり、その結果検出部で検出されるＰ３０Ａｇに起因する発色強度が低くなり、阻害がかかるということになる。
　本試験では、抗体Ｐ３０（ａ）を使用しかつ上記ペプチド１及び２のいずれも使用しなかった場合、抗体Ｐ３０（ａ）を使用しかつペプチド１を使用した場合、抗体Ｐ３０（ａ）を使用しかつペプチド２を使用した場合の３パターンについて、免疫クロマト分析を行い、発色強度を測定した結果を表１に示す。
　また、抗体Ｐ３０（ａ）を抗体Ｐ３０（ｂ）に変更して同様の試験を行った結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１の結果からわかるように、抗体Ｐ３０（ａ）について、ペプチドなしの場合と比較して、ペプチド１を使用した場合及びペプチド２を使用した場合のいずれの場合も発色強度が減少しており、抗体Ｐ３０（ａ）はペプチド１及びペプチド２のいずれにも阻害を受けることがわかる。したがって、抗体Ｐ３０（ａ）は配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を認識することが分かった。
　また、表２の結果からわかるように、抗体Ｐ３０（ｂ）について、ペプチドなしの場合と比較して、ペプチド１を使用した場合は、発色強度に変化は見られなかったが、ペプチド２を使用した場合では発色強度が減少しており、抗体Ｐ３０（ｂ）はペプチド１の阻害を受けずペプチド２の阻害を受けることがわかる。したがって、抗体Ｐ３０（ｂ）は配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）を認識することが分かった。
［試験例２］
　本試験では、下記試験例３で作製する本願発明の免疫クロマト装置に使用する、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識する抗体（抗体Ｐ３０（ａ））が、該ドメインＩＩＩを「強く」認識する抗体であるかを確認するため、段落［００２５］～［００３０］に記載のＥＬＩＳＡ法による試験及び段落［００３２］～［００３９］に記載の競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った。
　まず、試験例１で使用した抗体Ｐ３０（ａ）がマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体であるか否か確認するため、段落［００２５］～［００３０］に記載のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ法による試験を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（ａ）が、ブランクを引いた４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体であるか否か、以下のように実験した。
　まず、Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（（アミノ酸９６－２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファー　ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　一次抗体として前記抗体Ｐ３０（ａ）５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％ブロッキング溶液（一抗体溶液）１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　上記方法でＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた４５０ｎｍの吸光度が０．４０３Ａｂｓであり、０．２Ａｂｓ以上であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（ａ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できた。
　つづいて、この抗体Ｐ３０（ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか否かさらに確認するため、段落［００３２］～［００３９］に記載のプロトコールに従い競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（ａ）を用いて競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った結果、吸光度が３０％以上減少するか否か、以下のように実験した。
　Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（アミノ酸１－２７４：配列番号１）４ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成した。
　次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（ａ））５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　また、上記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（ａ））５μｇ／ｍＬと、前記一次抗体Ｐ３０（ａ）の４０倍量である、試験例１で使用した上記ペプチド１（配列番号６：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ）またはペプチド２（配列番号７：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ）とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた。
　マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、一次抗体と上記ペプチド１またはペプチド２を加えたウェルの吸光度は、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度と比較して、３０％以上減少したことが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（ａ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できた。
［試験例３］
＜本願発明の免疫クロマト分析装置の作製＞
［実施例１］
　（１）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
　（２）標識物質保持部の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍＬに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗体Ｐ３０（ａ）（Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－３－ＡＢ）を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。
　次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
　上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
　（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
　メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
　次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、上記抗体Ｐ３０（ａ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
　また、金粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
　（５）検体希釈液
　１質量％の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製ＮＰ－４０（商品名：ノニデットＰ－４０、ＨＬＢ値１７．７）、日油社製商品名ノニデットＭＮ－８１１（ＨＬＢ値　９．３）の１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
　（６）測定
　マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＦＨ））、または肺炎マイコプラズマ感染者の咽頭拭い液を用いた。咽頭拭い液は、市販の綿棒を用いて咽頭を拭うことで被験者２名の肺炎マイコプラズマ感染者からそれぞれ採取した。
　市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエは、上記抽出液で目的濃度に調整し、検体試料とした（表３中、市販検体と記載）。
　また、採取した咽頭拭い液は、上記検体希釈液で２０倍に希釈し、検体試料とした（表３中、被験者１及び被験者２と記載）。
　上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をデンシトメーターにより測定した（表中の単位はｍＡｂｓ）。結果を表３及び図２に示す。
［比較例１］
　検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、試験例１で使用した抗体Ｐ３０（ｂ）（Ｆｕｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ－Ｐ３０－９－ＡＢ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
　なお、この抗体Ｐ３０（ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」か否か確認するため、段落［００２５］～［００３０］に記載のＥＬＩＳＡ法による試験及び段落［００３２］～［００３９］に記載の競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った。
　まず、抗体Ｐ３０（ｂ）がマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体であるか否か確認するため、段落［００２５］～［００３０］に記載のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ法による試験を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（ｂ）が、ブランクを引いた４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体であるか否か、以下のように実験した。
　Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（（アミノ酸９６－２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファー　ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ　（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　一次抗体として前記抗体Ｐ３０（ｂ）５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液抗体Ｐ３０（ｂ）を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　上記方法でＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた４５０ｎｍの吸光度が０．０６１Ａｂｓであり、０．２Ａｂｓ未満であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。
　つづいて、この抗体Ｐ３０（ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか否かさらに確認するため、段落［００３２］～［００３９］に記載のプロトコールに従い競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行い、吸光度が３０％以下に減少するか否か、以下のように実験した。
　Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ３０（アミノ酸１－２７４：配列番号１）１０ｎｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ブロッキング液として、５％ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成した。
　次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（ａ））５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０％　ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　また、前記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（ｂ））５μｇ／ｍＬと、一次抗体Ｐ３０　（ｂ）量の４０倍量である量、試験例１で使用したペプチド１（配列番号６：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ）またはペプチド２（配列番号７：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ）とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
　二次抗体として、Ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ　Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ　ＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
　ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた。
　マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、一次抗体と上記ペプチド１またはペプチド２を加えたウェルの吸光度は、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度と比較して、ペプチド１では減少が見られず、ペプチド２では約２２％しか減少せず、その減少率は３０％未満であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。
［比較例２］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）の両方を、上記抗体Ｐ３０（ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
［比較例３］
　検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に対する抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名ＭＡｂ　ｔｏ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ１（ｃｌｏｎｅ　Ｂ１９４７Ｍ）：以下、抗体Ｐ１（ｂ）と表記する）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
［比較例４］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に対する抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名ＭＡｂ　ｔｏ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　Ｐ１（ｃｌｏｎｅ　Ｂ１９４８Ｍ）：以下、抗体Ｐ１（ａ）と表記する）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
［比較例５］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ａ）に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２］
　検体希釈液の組成を、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ値：１３．７）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ値：１６．７）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。
［比較例６］
　検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ３０（ｂ）に変更したこと以外は、実施例２を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。
［比較例７］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）の両方を、抗体Ｐ３０（ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例３］
　検出検体を、Ｐ３０タンパク質（（アミノ酸９６－２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）に変更し、検体希釈液の組成を、Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ－１００（和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ値：１３．７）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ値：１６．７）１：１混合物に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例８］
　検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ３０（ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例９］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）の両方を、抗体Ｐ３０（ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例１０］
　検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例１１］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ａ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例１２］
　標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ａ）に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（ａ）を、抗体Ｐ１（ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果より、標識物質保持部及び検出部の両方に、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体Ｐ３０（ａ）を含有させた場合は（実施例１～３）、それ以外の場合（比較例１～１２）と比較して、マイコプラズマ・ニューモニエ、またはＰ３０タンパク質の検出感度が顕著に高いことが分かった。
［試験例４］
　試験例２における抗体Ｐ３０（ａ）および比較例１における抗体Ｐ３０（ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか確認するため、競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。本試験では、競合させるドメインＩＩＩの断片として、試験例１で使用した上記ペプチド１またはペプチド２のいずれかを使用し、さらに上記ペプチドの濃度を下記表６、７のように変更して（×１～×６４０）、試験例２または比較例１に記載の方法と同様にして競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。結果を表６、７に示す。表６は、抗体として抗体Ｐ３０（ａ）を使用した結果であり、表７は、抗体として抗体Ｐ３０（ｂ）を使用した結果である。また表６の結果を図５、表７の結果を図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６及び図５の結果より、ペプチド濃度を一次抗体抗Ｐ３０（ａ）抗体濃度の４０倍とした場合に、ウェルの吸光度がコントロールと比較して３０％以上減少し、８０倍量とした場合でも５０％以上減少することが確認できた。なお、抗体Ｐ３０（ａ）はペプチド１及びペプチド２のいずれにも阻害を受けることから、抗体Ｐ３０（ａ）は配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を認識することが本試験でも確認できた。
　また、表７及び図６の結果より、ペプチド濃度を一次抗体Ｐ３０（ｂ）量の４０倍とした場合でも、ウェルの吸光度がコントロールと比較して約２２％しか減少せず、３０％未満であった。すなわち、抗体Ｐ３０（ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。なお、抗体Ｐ３０（ｂ）はペプチド１の阻害を受けずペプチド２の阻害を受けることから、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）を認識することが本試験でも確認できた。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１５年６月１日付で出願された日本特許出願（特願２０１５－１１１７３２）、及び２０１５年８月３１日付で出願された日本特許出願（特願２０１５－１７１１６３）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明によれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置を用いることによって、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを、迅速かつ簡易に検出できるため、肺炎マイコプラズマの早期の診断に利用することができる。
１　試料添加部（サンプルパッド）
２　標識物質保持部
３　クロマトグラフ媒体部
４　検出部
５　吸収部
６　バッキングシート

Claims (7)

  1. 　試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
    　前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
  2. 　前記抗体が、前記ドメインＩＩＩのうち配列番号３のアミノ酸配列を認識する、請求項１に記載の免疫クロマト分析装置。
  3. 　前記標識物質保持部が含有する標識物質が金粒子であり、前記標識物質保持部が前記金粒子を、０．２５～０．７μｇ／ｃｍ２含有する、請求項１または２に記載の免疫クロマト分析装置。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
  5. 　前記検体希釈液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有する、請求項４に記載の免疫クロマト分析キット。
  6. 　前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３～１８の非イオン性界面活性剤である、請求項５に記載の免疫クロマト分析キット。
  7. 　試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む免疫クロマト分析方法。
    （１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
    （２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
    （３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
    （４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
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