WO2016190475A1 - 싸이오크로멘 타입 화합물 및 그 용도 - Google Patents

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WO2016190475A1
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문봉진
오한빈
강나나
전애란
박계신
백제현
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다이아텍코리아 주식회사
서강대학교산학협력단
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a photodegradable mass labeling substance and its use, which includes matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, and even matrix-less laser desorption / ionization without matrix.
  • a photodegradable mass labeling substance which is readily photolyzed by a predetermined laser wavelength to release a labeled cation at a predetermined predetermined mass for useful use in time-of-flight mass spectrometry.
  • the present invention also relates to a technique for increasing the sensitivity of mass spectrometry by using a compound that forms ions well by light irradiation as a mass labeling material for mass spectrometry.
  • MALDI-TOF mass spectrometry is a method that analyzes the mass by the difference in flight time according to m / z of ions generated by crystallization by adding UV-absorbing matrix to the sample and irradiating with laser. It can be measured with high sensitivity in a short time and is useful for analysis of biopolymers such as proteins, synthetic polymers, and additives.
  • the laser energy irradiated by the ionization technique is transferred to the sample through the crystallized matrix and ionized, selection of an appropriate matrix has a very important effect on the experimental results.
  • a matrix-less LDI-TOF mass spectrometry was introduced to remove the matrix and obtain more accurate experimental results.
  • Patent application No. 10-2014-0050964 name of the invention: a photodegradable mass labeling substance and its use
  • FIG. 2 The above patent document is incorporated herein by reference in that it is well ionized by laser irradiation in the absence of a matrix through the introduction of a mass changer and a reactor.
  • the mass spectrometry spectra of equimolar mixtures of various ferrocene photodegradable mass labeling substances are shown in FIG. 2.
  • the ferrocene-based mass labeling substance has advantages in that it is easier to synthesize than trityl derivatives and has good photolysis efficiency.
  • trityl derivatives there are limitations in solubility in water. Conjugation yield is very low when conjugated with a biomaterial such as glycan.
  • the ratio of the organic solvent is inevitably increased to dissolve the hydrophobic ferrocene or trityl-based labeling substance.
  • MS Shchepinov et al US 6,734,025 B2, 5/2004, which discloses a method for calibration of a mass spectrometer in a similar manner, or constructing and analyzing oligomer libraries labeled with these labels
  • Techniques disclosed in EM Southern et al, US 6,780,981 B1, 8/2004, and disclosed techniques for increasing the mass spectrometry sensitivity of biomaterials with these labels (MS Shchepinov et al, US 2008/0248584 A1), these labels IG Gut, US 2011/0223613, and the like, which disclose a technique for imaging a biological sample by mass spectrometry using an antibody labeled with a substance, are known.
  • the above documents are incorporated herein by reference in that they use the MALDI-TOF method.
  • the present invention forms stable carbocation after photolysis, has high absorbance at a predetermined laser wavelength (particularly, 355 nm), and has a molecular weight of 500 Dalton or less to adjust water.
  • the present invention provides a compound having a high solubility, a hetero atom in a molecular structure, high hydrophilicity, easy synthesis in a high yield, and a structure in which a large number of mass changers can be easily introduced.
  • 2-alkylsulfanyl-2H-thiochromen derivatives according to the present invention are readily photolyzed under conditions of a matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) irradiated with a laser of 355 nm.
  • MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry
  • the thiochrome derivative according to the present invention is characterized in that the cation can be generated only by the irradiated laser, even in a matrix-free condition (matrix-less LDI-TOF MS), unlike the existing MALDI-TOF MS. Therefore, the noise caused by the addition of the matrix can be eliminated at the source, and the polymer material such as the antibody can be detected with high sensitivity.
  • the chromene type compound according to the present invention specifically, the 2-alkylthio- 2H -thiochromen derivative compound can be used as a photodegradable mass labeling substance.
  • the principle is shown in FIG. That is, the compound according to the present invention is a UV absorber capable of absorbing UV, a reactor capable of reacting with biomaterials, a linker that connects therebetween and can be cleaved by light irradiation, and a mass that can be substituted by changing the mass. It consists of a transducer.
  • the present invention provides, in one embodiment, a compound represented by the following formula (I):
  • R 1 is an active reactor that can easily react with functional groups present in the biomaterial or solid phase, such as amines, thiols and the like, for example N-hydroxysuccinimide ester groups, N-hydrides.
  • functional groups present in the biomaterial or solid phase such as amines, thiols and the like, for example N-hydroxysuccinimide ester groups, N-hydrides.
  • the linking portion of the linker is, for example, an alkyl group, but is not limited thereto, and may be an alkyl group including an ether, an aryl group, or a heteroaryl group.
  • the linking portion of the linker is C 1-12 alkyl, C 6-60 aryl, or C 2 -60 heteroaryl group having at least one hetero atom selected from N, S and O.
  • an "alkyl group” is a linear or branched alkyl group such as methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like.
  • C1-60 linear or branched alkyl group preferably C1-12 linear or branched alkyl group.
  • aryl group refers to a C6-60 aryl group of a hydrocarbon ring and includes, for example, a phenyl group, a naphthyl group, and the like, and a "heteroaryl group” in any group possible consisting of N, S, O refers to a C2-60 aromatic heteroaryl group containing at least one hetero atom selected.
  • the "active reactor” includes N-hydroxysuccinimide ester group, N-hydroxy sulfosuccinimide ester group, pentafluorophenyl ester group, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluoro Phenyl ester group, nitrophenyl ester group, 2,4,5-trichlorophenyl ester group, phthalimido ester group, N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarbide ester group, It refers to a maleimide group.
  • the active reactor is an N-hydroxysuccinimide ester group (NHS), a pentafluorophenyl ester group, a nitrophenyl ester group, a maleimide group, more preferably an N-hydroxysuccinimide ester group .
  • NHS N-hydroxysuccinimide ester group
  • pentafluorophenyl ester group a pentafluorophenyl ester group
  • a nitrophenyl ester group a maleimide group
  • a maleimide group more preferably an N-hydroxysuccinimide ester group .
  • R 2 and R 3 in formula I may be identical to each other and are independently hydrogen, alkyl, aryl, alkoxy, alkylamino, alkylthio or a condensed ring.
  • alkyl or “aryl” is as defined above.
  • alkoxy refers to a straight C1-12 alkoxy group or a branched C1-12 group such as methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group or n-pentoxy group. An alkoxy group is said.
  • condensed ring refers to an aromatic heterocyclic group containing at least one heteroatom selected from the group consisting of phenyl groups or O, S, N, at any possible position, in the group consisting of benzene rings or oxygen atoms, sulfur atoms, nitrogen atoms It means a ring obtained by condensation with an aromatic heterocyclic group having 1-3 heteroatoms selected, for example selected from pyrrole, thiophene, indole, furan, imidazole, triazole, diazole, pyrimidine which is either.
  • the condensed ring refers to thiophene, pyrrole, indole, furan, and the like.
  • Ar is an extended ring by a combination of C6-60 aromatic ring, heteroaromatic ring or heteroaromatic ring.
  • Hetero aromatic ring is a heterocyclic group containing O, N or S as a hetero atom, and may be monocyclic or polycyclic, and the carbon number is not particularly limited, but is preferably 2-60 carbon atoms.
  • heterocyclic group examples include thiophene group, furan group, pyrrole group, imidazole group, thiazole group, oxazole group, oxadiazole group, triazole group, pyridyl group, bipyridyl group, triazine group, acridil group, pyridazine group , Quinolinyl group, isoquinoline group, indole group, benzoxazole group, benzimidazole group, benzthiazole group, benzcarbazole group, benzthiophene group, dibenzothiophene group, benzfuranyl group, dibenzofuranyl group, etc.
  • the heteroaromatic ring of Ar is benzene, pyrrole, thiophene, indole, furan, imidazole, triazole, diazole, or pyrimidine.
  • extended ring refers to a condensed ring compound of the heteroaromatic rings described above.
  • Introducing the heterocycle may increase the solubility of the labeling substance in water and increase the stability of the resulting thiochromenium cation.
  • the present invention provides a compound of Formula II to Formula V:
  • R 1 , R 2 , R 3 in Formulas II, III, IV, V are as defined in Formula I above.
  • V, R 4 and A are each an active reactor that can easily react with the reactors present in the biomaterial or solid phase (amines, thiols, etc.), preferably N-hydroxysuccinimide ester groups, N -Hydroxy sulfosuccinimide ester group, pentafluorophenyl ester group, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorophenyl ester group, nitrophenyl ester group, 2,4,5-trichloro
  • the linking moiety is C 1-12 alkyl, C 6 -60 aryl, or C 2 -60 heteroaryl group having at least one hetero atom selected from N, S and O.
  • n is an integer of 1-12.
  • the present invention provides a photodegradable mass labeling substance, and preferably provides a 2-alkylthio-2H-thiochromen derivative used in the MALDI-TOF method or the MALDI-TOF method without a matrix.
  • Such derivatives are represented by the formulas (I) to (V) above.
  • the photodegradable mass labeling material according to the present invention is shown in FIG. 4, wherein, when the laser corresponding to 355 nm is cleaved, the alkyl thio in position 2 is thiochromed by heterolytic cleavage. It is easily detected in the mass spectrometer by the easy formation of thiochromenylium cations. Therefore, ionization can be easily performed by laser irradiation alone, and MALDI-TOF mass spectrometry and matrix-less-LDI-TOF mass spectrometry can be implemented with high precision.
  • examples of the mass labeling substance of the 2-alkylthio-2H-thiochromen type according to the present invention are the following compounds 1, 2 and 3 (3a to 3d).
  • Compounds 1, 2 and 3 have 2-alkylthio-2H-thiochromen as a basic skeleton and have an NHS group (N-hydroxysuccinimidyl ester) capable of reacting with an amine group at the terminal.
  • the alkoxy group (MeO-) is introduce
  • various functional groups R can be introduced to N of the indole ring.
  • the functional group R may be changed to Me, Et, n-Pr, n-Bu, or the like, or may be variously changed in a similar manner.
  • the present invention provides a method for synthesizing a photodegradable mass labeling substance.
  • Synthesis Method 1 is shown below.
  • the mass labeling substance according to the present invention is not limited to being synthesized by the following synthesis method.
  • a thiochromeno [4,3-b] indole series photodegradable mass labeling derivative (3a-3d) can be obtained with high efficiency.
  • various thiochromen-type compounds can be synthesized by using a starting material which has a high overall yield of about 15% and is readily available on the market.
  • the photodegradable mass labeling material according to the invention is a 2-alkylthio-2H-thiochromen of formulas 3a, 3b, 3c, 3d with indole introduced as follows.
  • the present invention provides a conjugate of a mass labeling substance and a biomaterial represented by the following formula Ia.
  • A is an active reactor that can easily react with reactors (amines, thiols, etc.) present in the biomaterial or solid phase, preferably N-hydroxysuccinimide ester groups, N-hydroxy sulfosuccinate Synimide ester group, pentafluorophenyl ester group, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorophenyl ester group, nitrophenyl ester group, 2,4,5-trichlorophenyl ester group, phthal Imide ester group, N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarbide ester group, a linker having a maleimide group and the like, the linking portion of the linker is preferably C1-12 alkyl, C6- 60aryl or a C2-60 heteroaryl group having at least one hetero atom selected from N, S and O.
  • R 2 and R 3 are preferably hydrogen, C 1-12 alkyl, C 6 -60 aryl, C 1-12 alkoxy, C 1-12 alkylamino, C 1-12 alkylthio or a condensed ring, and Ar May be an aromatic ring such as benzene or a heteroaromatic ring selected from pyrrole, thiophene, indole, imidazole, triazole, diazole and pyrimidine.
  • the biomaterial may be an antigen, an antibody, a biomarker, a peptide, a nucleic acid, a glycan, a cell tissue, or the like, and may be applied to various polymer compounds regardless of its kind.
  • the high molecular compound is not limited in molecular weight, but may be 200,000 Da or more.
  • the thiochromen type compound according to the present invention is easy to synthesize and has excellent solubility in water.
  • the photodegradability peculiar to the thiochrome type compound according to the present invention makes it possible to use as a sensitive mass labeling material not only in MALDI-TOF but also in a matrix-less LDI-TOF method.
  • a matrix-less LDI-TOF method since the matrix is omitted, mass spectrometry results of excellent sensitivity can be obtained for various polymer materials.
  • Figure 1 shows a conventional ferrocene-based mass spectrometric label.
  • FIG. 2 shows the mass spectrometry spectra under matrix-free laser desorption ionization conditions of different mass ferrocene-based novel mass spectrometric labeling materials.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of a photodegradable mass labeling substance.
  • FIG. 4 is an operation diagram of a photodegradable mass labeling material based on a 2-alkylthio-2H-thiochromen derivative.
  • FIG. 8 shows the results of sensitivity comparison in matrix-less LDI MS between Compound 3a, which is one of the mass spectrometric labeling substances of the present invention, and a known trityl-SPh derivative.
  • FIG. 9 shows the results of sensitivity comparison in matrix-less LDI MS between compound 3a, which is one of the mass spectrometric labeling substances of the present invention, and the ferrocene-based mass spectrometric labeling substance described in the prior patent.
  • Carboxylic Acid Compounds 8a-8d (1.0 equiv) with N -hydroxy succinate ( N- hydroxysuccinimide, 1.1 equiv) was dissolved in anhydrous dichloromethane under nitrogen atmosphere. Separately dissolved in anhydrous dichloromethane and the reaction mixture N - (3- dimethylaminopropyl) - N '- ethylcarbodiimide hydrochloride - was put (N- (3-dimethylaminopropyl) N- ethylcarbodiimide hydrochloride, 3.0 equiv) solution. After stirring for 4 hours at room temperature, dichloromethane was further added and diluted.
  • N , N' -dicyclohexylcarbodiimide N , N' -dicyclohexylcarbodiimide, 0.010 g, 0.051 mmol
  • anhydrous dichloromethane 0.3 mL
  • the reaction mixture was stirred while gradually raising the temperature to room temperature. After 6 hours, the mixture was cooled to 0 ° C and washed with cold dichloromethane while filtering out the solid that settled to precipitate under reduced pressure. The solvent in the filtrate was all removed under reduced pressure to afford compound 9 as a yellow solid.
  • N - (3- dimethylaminopropyl) - N'- ethylcarbodiimide hydrochloride N- (3-dimethylaminopropyl) - N- ethylcarbodiimide hydrochloride, 0.032 mg, 0.017 mmol
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours and further diluted with dichloromethane (3 mL). The solution was washed twice with water (3 mL), and anhydrous sodium sulfate was added thereto, followed by filtration under reduced pressure.
  • Example 5 compound 1, 2, 3a solubility compare
  • the compound 1, a derivative 3a introduced into the indole than 2 at 355 nm is higher and the absorption and therefore the degree of ionization took place more effectively by the laser irradiation.
  • Inductor-derived derivative 3 was found to have a much higher solubility compared to the conventional ferrocene derivative mass spectrometric label.
  • ferrocene derivatives form a cloud point at the point where 10% of water is added when dissolved in DMSO, whereas 2-alkylthio- 2H -thiochromen derivatives 3a with indole are introduced. Did not form a cloudy point until 30% of water was added.
  • the solvent was dried by dissolving a photodegradable mass labeling substance or a biomaterial labeled with this substance in tetrahydrofuran, taking 1.0 ⁇ l, dropping each point on the plate, and exposing to air at room temperature.
  • the dried samples on the plates were analyzed with a MALDI-TOF mass spectrometer (matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometer, Autoflex Speed series, BrukerDaltonics, Leipzig, Germany). All spectra were measured in cation reflecton mode.
  • the mass range was set at 0-800 Da, after which data analysis was performed using flexAnalysis software.
  • the matrix-less LDI MS spectrum of the mass spectrometric label 3a-3d is shown in FIG. 7.
  • Matrix-less LDI-TOF MS the photolysis reaction as expected occurred, and it was confirmed that the peak corresponding to each cation was detected with high intensity. Characteristic is that a peak corresponding to about 235 m / z is commonly observed, which means that the mass changer is partially dropped during the photolysis process. Fortunately, the ratio is very low, so it is not expected to be a big problem when applied to marker detection in practice.
  • the sensitivity of the new photodegradable mass labeling substance to the matrix-less LDI-TOF MS was compared with the known labeling substance.

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Abstract

본 발명은 광분해성 질량 표지 물질 및 그 용도에 관한 것으로, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법 또는 매트릭스가 없는 LDI-TOF(matrix-less laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법에 유용하게 사용할 수 있는 싸이오크로멘 타입 화합물 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

싸이오크로멘 타입 화합물 및 그 용도
본 발명은 광분해성 질량 표지 물질 및 그 용도에 관한 것으로, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법, 나아가 매트릭스가 없는 LDI-TOF(matrix-less laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법에 유용하게 사용할 수 있도록 소정의 레이저 파장에 의하여 쉽게 광분해되어 미리 예정된 특정한 질량으로 표지된 양이온을 방출하는 광분해성 질량 표지 물질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 광조사에 의해 이온을 잘 형성하는 화합물을 질량분석의 질량 표지 물질로 사용하여 질량분석법의 감도를 높이는 기술에 관한 것이다.
MALDI-TOF 질량분석법은 시료에 UV를 흡수하는 매트릭스를 첨가하여 결정화시킨 후 레이저를 조사하여 이온화 시켜 생성된 이온의 m/z에 따른 비행시간의 차이로 질량을 분석하는 방법으로, 고분자의 절대 질량을 빠른 시간 내에 높은 감도로 측정할 수 있어 단백질 등의 생체 고분자 및 합성 고분자, 첨가제 등의 분석에 유용한 분석법이다. 그러나 이온화 기법으로 조사된 레이저 에너지가 결정화된 매트릭스를 통해 시료로 전달되어 이온화되므로 적당한 매트릭스의 선정이 실험 결과에 매우 중요한 영향을 미친다. 이에 매트릭스를 제거하여 더 정확한 실험 결과를 얻기 위한 매트릭스 없는(matrix-less) LDI-TOF 질량분석법이 도입되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
안정한 양이온을 형성할 수 있는 페로센(ferrocene) 계열의 신규 광분해성 질량 표지 물질이 합성되었다. 이에 관한 특허출원 제10-2014-0050964호 (발명의 명칭: 광분해성 질량 표지 물질 및 그 용도)는 페로센의 알파 위치의 탄소 양이온이 안정하다는 것을 이용한 것으로, 그 구조가 도 1에 나타나 있다. 위 특허문헌은 질량 변화기와 반응기의 도입을 통해 매트릭스가 없는 조건에서 레이저 조사에 의해 이온화가 잘 된다는 점에서 이 출원 명세서에 참고적으로 편입된다. 이와 관련하여 다양한 페로센 광분해성 질량 표지 물질의 등몰량 혼합물의 질량 분석 스펙트럼이 도 2에 나타나 있다.
그러나 페로센 계열의 질량 표지 물질은 트리틸 유도체에 비해 합성이 용이하고 광분해 효율이 좋다는 장점이 있지만, 트리틸 유도체와 더불어 물에 대한 용해도가 낮다는 한계가 있어, 친수성이 강하고 물에 녹는 펩타이드, 핵산, 글라이칸 등의 바이오 물질과 컨쥬게이션을 시킬 때 컨쥬게이션 수율이 매우 낮다는 단점이 있다. 또한 바이오 물질과 컨쥬게이션 반응의 수율을 높이기 위해 유기용매와 물의 혼합물을 사용하더라도, 소수성인 페로센 또는 트리틸 계열의 표지 물질을 녹이기 위해서는 유기용매의 비율이 높아질 수밖에 없다. 이에 따라 컨쥬게이션 도중에 단백질 또는 항체와 같은 바이오 물질의 3차원 구조에 변형이 일어나서 단백질 또는 항체의 특이성을 잃어버리게 된다는 문제가 발생한다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위하여 물에 대한 용해도가 우수한 질량 표지 물질의 개발이 필요한 실정이다.
[비특허문헌]
종래 알려진 질량 표지 물질로서, 특정 조건에서 양이온을 비교적 잘 형성하는 트라이페닐메틸(triphenylmethyl) 또는 트리틸(trityl)기에 질량이 다른 여러 치환기를 도입하여 형성된 여러 개의 질량 표지 물질 및 그 조합 합성법(combinatorial synthesis)이 알려진 바 있다. (문헌: Shchepinov et al, Nucl. Acids Symp. Ser. 1999, 42, 107-108). 이 방법의 특징은 레이저를 조사하여 분자를 이온화시킨 후 비행시간차(time of flight, TOF)를 이용하여 분자량을 검출하는 질량분석법 환경에서, 이온화를 도와주는 매트릭스 (matrix) 없이도 분석시료를 이온화할 수 있다는 점이다.
트리틸 유도체를 이용하여 유사한 방법으로 질량분석기의 보정(calibration) 방법을 개시한 문헌(M. S. Shchepinov et al, US 6,734,025 B2, 5/2004)이나, 이들 표지 물질로 표지된 올리고머 라이브러리를 구축하여 분석한 기술이 개시된 문헌(E. M. Southern et al, US 6,780,981 B1, 8/2004), 이들 표지 물질로 바이오 물질의 질량분석 감도를 높이는 기술이 개시된 문헌(M. S. Shchepinov et al, US 2008/0248584 A1), 이들 표지 물질로 표지된 항체를 사용하여 생체시료를 질량분석기로 이미징한 기술이 개시된 문헌(I. G. Gut, US 2011/0223613) 등이 알려져 있다. 위 문헌들은 MALDI-TOF법을 이용하는 점에서 이 출원 명세서에 참고적으로 편입된다.
이와 같은 필요성에 따라 완성된 본 발명은, 광분해 후 안정한 탄소양이온(carbocation)을 형성하고, 소정의 레이저 파장(특히, 355 nm)에서의 흡광도가 높고, 분자량이 500 Dalton이하로 조절되어 물에 대한 용해도가 높고, 분자 구조에 헤테로 원자를 함유하여 친수성이 높으며, 높은 수율로 쉽게 합성 할 수 있으며, 또한 다수의 질량 변화기를 쉽게 도입할 수 있는 구조의 화합물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명에 따른2-알킬설파닐-2H-싸이오크로멘 유도체는 355 nm 의 레이저가 조사되는 MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry) 조건에서 쉽게 광분해 됨으로써, 특정 질량의 양이온을 방출할 수 있는 광분해성 질량 표지 물질(photo-cleavable mass tag)로 이용할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 싸이오크로멘 유도체는 기존의 MALDI-TOF MS 와는 다르게 매트릭스가 없는 조건(matrix-less LDI-TOF MS)에서도, 조사되는 레이저에 의해서만 양이온이 생성될 수 있다는 것을 특징으로 한다. 그러므로 매트릭스의 첨가로 인한 잡음(noise)을 원천적으로 제거할 수 있고, 항체 같은 고분자 물질을 높은 감도로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 싸이크로멘 타입 화합물, 구체적으로 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘 유도체 화합물은 광분해성 질량 표지 물질로 이용할 수 있다. 그 원리가 도 3에 나타나 있다. 즉, 본 발명에 따른 화합물은UV를 흡수할 수 있는 UV 흡수기, 바이오 물질과 반응할 수 있는 반응기, 그 사이를 연결하고 광조사에 의해 절단될 수 있는 링커, 질량을 변화시켜 치환시킬 수 있는 질량 변화기로 구성된다.
본 발명은 하나의 양태로서 하기 식 I로 표시되는 화합물을 제공한다:
Figure PCTKR2015006167-appb-I000001
: 식 I
식 I에서, R1은 바이오 물질 또는 고체상에 존재하는 작용기, 예를 들면, 아민, 싸이올 등과 쉽게 반응할 수 있는 활성 반응기, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 말레이미드기 등을 가지는 링커이다. 링커의 연결부분은 예를 들어 알킬기이지만, 이에 한정되지 않고 에터를 포함한 알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기가 될 수 있다. 바람직하게 링커의 연결 부분은 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이다.
본원에서 "알킬기"는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기 등의 직쇄 또는 분지쇄형의 알킬기와 같은 C1-60의 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬기를 말하며, 바람직하게는 C1-12의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기이다.
본원에서 "아릴기"는 탄화수소 고리의 C6-60의 아릴기를 의미하며 예를 들면 페닐기, 나프틸기 등을 들 수 있고, "헤테로아릴기"는 어떤 가능한 위치에서 N, S, O로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 이종 원자를 포함하는 C2-60의 방향족 헤테로아릴기를 말한다.
상기 "활성 반응기"는, N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 말레이미드기를 말한다. 바람직하게 활성 반응기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터기 (NHS), 펜타플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 말레이미드기이고, 더 바람직하게는 N-하이드록시숙신이미드 에스터기이다.
식 I에서 R2와 R3는 서로 같을 수 있으며, 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 알콕시, 알킬아미노, 알킬티오 또는 축합고리이다. 여기서 "알킬"이나 "아릴"은 상기 정의된 바와 같다.
본원에서 "알콕시"는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, tert-부톡시기, n-펜톡시기와 같은 직쇄형 C1-12알콕시기나 분지쇄형 C1-12알콕시기를 말한다.
본원에서 "축합고리"는, 어떤 가능한 위치에서 페닐기 또는 O, S, N으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 이종원자를 포함하는 방향족 헤테로시클릭기와, 벤젠고리 또는 산소원자, 황원자, 질소원자로 구성된 군에서 선택된 1-3개 이종원자를 갖는 방향족 헤테로시클릭기와의 축합에 의해 수득되는 고리를 의미하고, 예를 들어, 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이다. 바람직하게 축합고리는 싸이오펜, 피롤, 인돌, 퓨란, 등을 말한다.
식 I에서, Ar은 C6-60의 방향족 고리, 헤테로 방향족 고리 또는 헤테로 방향족 고리의 조합에 의한 확장고리이다. "헤테로 방향족 고리"는, 이종원자로 O, N 또는 S를 포함하는 헤테로고리기로서, 단환식 또는 다환식일 수 있고, 탄소수는 특별히 한정되지 않으나 탄소수 2-60인 것이 바람직하다. 헤테로고리기의 예로는 티오펜기, 퓨란기, 피롤기, 이미다졸기, 티아졸기, 옥사졸기, 옥사디아졸기, 트리아졸기, 피리딜기, 비피리딜기, 트리아진기, 아크리딜기, 피리다진기, 퀴놀리닐기, 이소퀴놀린기, 인돌기, 벤즈옥사졸기, 벤즈이미다졸기, 벤즈티아졸기, 벤즈카바졸기, 벤즈티오펜기, 디벤조티오펜기, 벤즈퓨라닐기, 디벤조퓨라닐기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 Ar의 헤테로 방향족 고리는 벤젠, 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘이다.
본원에서 "확장 고리"란 상기한 헤테로 방향족 고리들의 축합 고리 화합물을 말한다.
헤테로고리를 도입하면 물 속에서 표지 물질의 용해도를 높일 수 있고 생성되는 싸이오크로메닐륨 양이온의 안정성을 높이는 효과도 꾀할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 식 II 내지 식 V의 화합물을 제공한다:
Figure PCTKR2015006167-appb-I000002
: 식 II
Figure PCTKR2015006167-appb-I000003
: 식 III
Figure PCTKR2015006167-appb-I000004
: 식 IV
Figure PCTKR2015006167-appb-I000005
: 식 V
식 II, III, IV, V에서 R1, R2, R3는 상기 식 I에서 정의된 바와 같다.
식 III, V에서 R4와 A는 각각 바이오 물질 또는 고체상에 존재하는 반응기들(아민, 싸이올 등)과 쉽게 반응할 수 있는 활성 반응기, 바람직하게는 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 말레이미드기 등을 가지는 링커이고, 링커의 연결부분은 바람직하게 링커의 연결 부분은 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이다.
식 III에서 n은 1-12의 정수이다.
또 다른 양태로서 본 발명은 광분해성 질량 표지 물질을 제공하며, 바람직하게 MALDI-TOF법 또는 매트릭스 없는 MALDI-TOF법에서 사용되는 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘 유도체를 제공한다. 이러한 유도체는 상기 식 I내지 식 V로 표시된다.
본 발명에 따른 광분해성 질량 표지 물질은, 도 4에 그 원리가 나타나 있는데, 355 nm에 상응하는 레이저를 쪼여주었을 때 2번 위치의 알킬 싸이오기가 이종성 절단(heterolytic cleavage)에 의하여 싸이오크로메닐륨(thiochromenylium) 양이온을 쉽게 형성함으로써 질량분석기에서 쉽게 검출이 된다. 따라서 레이저 조사만으로도 쉽게 이온화가 가능하여, MALDI-TOF 질량 분석은 물론이고 매트릭스 없는(matrix-less)-LDI-TOF질량 분석을 높은 정밀도를 갖도록 구현할 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘 타입의 질량 표지 물질의 예는 하기 화합물 1, 2, 3(3a~3d)이다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000006
화합물 1, 2, 3은 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘을 기본 골격으로 가지고 있고, 아민기와 반응할 수 있는 NHS기(N-하이드록시숙신이미딜 에스터)를 말단에 가지고 있다. 화합물 2의 경우에는 싸이오크로멘의 3, 4위치에 치환된 벤젠고리에 알콕시기(MeO-)가 도입되어 있다. 화합물 3의 경우에는 인돌 고리의 N에 다양한 작용기 R을 도입할 수 있다. 작용기 R은 Me, Et, n-Pr, n-Bu 등으로 변화시킬 수 있고, 또는 이와 유사한 방식으로 다양하게 변화시킬 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 광분해성 질량 표지 물질의 합성 방법을 제공한다. 예시적으로 이하에 합성방법 1을 나타내었다. 이 출원 발명에 따른 질량 표지 물질은 하기 합성 방법에 의하여 합성되는 것에 국한되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000007
합성방법 1에 따르면, 싸이오크로메노[4,3-b]인돌(thiochromeno[4,3-b]indole) 계열의 광분해성 질량 표지 물질 유도체(3a-3d)를 높은 효율로 얻을 수 있다. 또한 합성방법 1에 따르면, 전체 수율이 15% 내외로 높고, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 출발 물질을 이용해서 다양한 싸이오크로멘 타입 화합물을 합성할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 광분해성 질량 표지 물질은 다음과 같이 인돌이 도입된 식 3a, 3b, 3c, 3d 의 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘이다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000008
또한 다른 양태로서, 본 발명은 하기 식Ia로 표시되는 질량 표지 물질과 바이오 물질의 콘쥬게이트를 제공한다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000009
: 식 Ia
식 Ia에서, A는 바이오 물질 또는 고체상에 존재하는 반응기들(아민, 싸이올 등)과 쉽게 반응할 수 있는 활성 반응기, 바람직하게는 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 말레이미드기 등을 가지는 링커이고, 링커의 연결부분은 바람직하게 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이다.
이하에 한정되는 것은 아니지만, R2와 R3는 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오 또는 축합고리인 것이 바람직하며, Ar은 벤젠 등 방향족 고리, 또는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸 및 피리미딘에서 선택되는 헤테로방향족고리일 수 있다.
상기 바이오 물질은 항원, 항체, 바이오 마커, 펩타이드, 핵산, 글라이칸, 세포 조직 등일 수 있으며, 그 종류에 관계 없이 다양한 고분자 화합물에 응용할 수 있다. 예를 들어 고분자 화합물은 분자량에 제한이 있는 것은 아니지만 200,000Da 이상인 것도 좋다.
본 발명에 따른 싸이오크로멘 타입 화합물은 합성이 쉽고 물에 대한 용해도가 우수하다. 또한 본 발명에 따른 싸이오크로멘 타입 화합물 특유의 광분해성은, MALDI-TOF는 물론이고, 나아가 매트릭스 없는 (matrix-less) LDI-TOF법에 있어서 감도 높은 질량 표지 물질로 이용할 수 있게 한다. 특히 매트릭스 없는 LDI-TOF법에서는, 매트릭스가 생략되므로 다양한 고분자 물질에 대하여 우수한 감도의 질량 분석 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 종래의 페로센 계열의 질량분석 표지 물질을 나타낸다.
도 2는 질량이 상이한 페로센 계열의 신규 질량분석 표지 물질들의 매트릭스 없는 레이저 탈착 이온화 (laser desorption ionization) 조건에서의 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 광분해성 질량 표지 물질의 개념도이다.
도 4는 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘 유도체에 기반한 광분해성 질량 표지 물질의 작동도이다.
도5는 화합물 1, 2, 3a의 UV-Vis 흡수 스펙트럼이다.
도 6은 Matrix-less-LDI-TOF-MS에서 얻어진 화합물 3a의 질량분석 스펙트럼이다.
도 7은 질량분석 표지 물질 3a-3d의 matrix-less LDI MS 스펙트럼이다.
도 8는 본 발명의 질량 분석 표지 물질의 하나인 화합물 3a와 기존에 알려진 트리틸-SPh 유도체와의 matrix-less LDI MS에서의 감도 비교 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 질량 분석 표지 물질의 하나인 화합물 3a와 선행특허에 기재된 페로센 계열 질량분석 표지 물질과의 matrix-less LDI MS에서의 감도 비교 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 질량 분석 표지 물질 3d의 matrix-less LDI MS에서의 검출 한계 실험 데이터이다.
실시예 1: 분해성 질량 표지 물질의 합성 (I)
합성방법 1에 나타난 합성 경로에 따라 다음과 같이, 싸이오크로만-4-온과 페닐하이드라진을 출발 물질로 하여 질량 표지 물질 3a-3d를 합성하였다.
(가) 6,11- Dihydrothiochromeno[4,3-b]indole (4) 의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000010
싸이오크로만-4-온 (thiochroman-4-one, 11.4 g, 69.2 mmol)과 페닐하이드라진 (phenylhydrazine, 7.49 g, 6.82 mL, 69.2 mmol) 을 에탄올 (100 mL) 에 녹인 후 트리메틸실릴 클로라이드(trimethylsilyl chloride, 7.52 g, 8.79 mL, 69.2 mmol) 를 재빨리 넣고 마개를 막았다. 이 반응 혼합물을 환류하에 4 시간 동안 가열한 후 식혔다. 용액이 충분히 염기성이 될 때까지 포화 탄산수소나트륨 수용액을 넣고, 에틸 아세테이트 (150 mL)로 희석시켰다. 유기 층은 분리하고 남은 물 층을 에틸 아세테이트 (250 mL x 3)로 세 번 추출 하였다. 모아진 유기 층은 포화 염화 나트륨 수용액으로 씻고, 무수 황산 나트륨을 넣어 감압 여과하였다. 여과된 용매를 감압하에 모두 제거한 후 남은 고체를 디에틸에테르:에틸아세테이트=8:1 (v/v) 에 분산시킨 후 여과하여 화합물 4를 노란색 액체로 얻었다. (11.8 g, 49.7 mmol, 72%): mp = 162-165 °C; Rf = 0.33 (EtOAc:hexane = 1:4); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 11.58 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.13-7.17 (m, 2H), 7.04 (dd, J = 7.2, 7.0 Hz, 1H), 4.28 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): δ 136.7, 132.4, 131.9, 127.5, 127.4, 127.2, 125.9, 125.8, 122.9, 122.4, 119.4, 118.5, 111.4, 105.9, 22.7; IR (ZnSe-ATR) 3336 (w), 1957 (w), 1915 (w), 1871 (w), 1785 (w), 1453 (w), 1440 (w), 1416 (w), 1312 (w), 1276 (w), 1177 (w), 1006 (w), 1036 (w), 918 (w), 864 (w), 761 (m), 733 (vs), 670 (w) cm-1; Anal. Calcd for C15H11NS: C, 75.92; H, 4.67; N, 5.90; S, 13.51. Found: C, 75.92; H, 4.62; N, 5.91; S, 13.63.
(나) 11-alkyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3-b]indoles (5a-5d)의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000011
질소 분위기 하에서 6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indol (4, 1.50 g, 6.32 mmol, 1.0 equiv) 과 소듐 하이드라이드 (60%, dispersion in mineral oil, 0.556 g, 12.6 mmol, 2.0 equiv) 를 섞은 후 무수 디메틸 포름아미드 (10 mL) 를 0 °C 에서 천천히 넣었다. 이 반응 혼합물을 0 °C 에서 30 분 동안 교반한 후, 알킬 할로젠화물 (12.6 mmol, 2.0 equiv) 을 질소 분위기 하에서 빠르게 넣었다. 상온에서 2 시간 동안 교반하고, 물 (10 mL) 과 에틸 아세테이트 (30 mL) 를 차례로 넣었다. 유기 층은 분리하고 남은 물 층을 에틸 아세테이트 (40 mL x 3) 로 세 번 추출 하였다. 모아진 유기 층은 포화 염화 나트륨 수용액으로 씻고, 무수 황산 나트륨을 넣고 감압 여과 하였다. 여액의 용매를 감압하에 모두 제거한 후 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=15:1) 로 정제하여 화합물 5를 노란색 액체로 얻었다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000012
11-Methyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole (5a): 90%; mp = 94-97 °C; Rf = 0.32 (EtOAc:hexane = 1:15); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50-7.54 (m, 2H), 7.33 (dd, J = 7.6, 6.8 Hz, 1H), 7.21-7.25 (m, 2H), 7.11 (d, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 4.15 (s, 2H), 3.95 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 138.5, 134.5, 133.7, 128.6, 127.8, 127.1, 126.2, 125.0, 124.1, 122.5, 119.8, 118.7, 110.3, 109.7, 32.8, 22.8; IR (ZnSe-ATR) 2887 (w), 1908 (w), 1875 (w), 1834 (w), 1470 (w), 1426 (w), 1360 (w), 1275 (w), 1235 (w), 1219 (w), 1121 (w), 1164 (w), 1082 (w), 1046 (w), 943 (w), 821 (w), 737 (vs), 714 (m), 675 (w) cm-1; Anal. Calcd for C16H13NS: C, 76.46; H, 5.21; N, 5.57; S, 12.76. Found: C, 76.49; H, 5.22; N, 5.43; S, 12.64.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000013
11-Ethyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole (5b): 70%; mp = 122-126 °C; Rf = 0.36 (EtOAc:hexane = 1:15); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.51-7.56 (m, 2H), 7.35 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.21-7.26 (m, 2H), 7.12 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 4.40 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H), 1.39 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 137.7, 133.9, 133.7, 128.7, 127.7, 127.0, 126.4, 124.4, 124.3, 122.6, 119.8, 118.8, 118.7, 110.2, 22.7, 15.5, 15.4; IR (ZnSe-ATR) 2970 (w), 1936 (w), 1847 (w), 1477 (w), 1457 (w), 1363 (w), 1340 (w), 1284 (w), 1208 (w), 1162 (w), 1131 (w), 1086 (w), 1040 (w), 1102 (w), 784 (w), 746 (vs), 712 (w), 670 (w) cm-1; Anal. Calcd for C17H15NS: C, 76.94; H, 5.70; N, 5.28; S, 12.08. Found: C, 76.88; H, 5.71; N, 5.29; S, 12.07.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000014
11- Propyl -6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole (5c): 94%; mp = 75-80 °C; Rf = 0.40 (EtOAc:hexane = 1:15); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.20-7.25 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 4.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H), 1.73 (tq, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 0.82 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 138.2, 133.9, 133.8, 128.8, 128.0, 127.1, 126.4, 124.32, 124.26, 122.6, 119.8, 118.8, 110.6, 110.4, 46.1, 23.3, 22.7, 11.0; IR (ZnSe-ATR) 3056 (w), 2970 (w), 1475 (w), 1460 (w), 1414 (w), 1348 (w), 1204 (w), 1158 (w), 1039 (w), 1012 (w), 754 (m), 738 (vs), 669 (w) cm-1; Anal. Calcd for C18H17NS: C, 77.38; H, 6.13; N, 5.01; S, 11.47. Found: C, 77.38; H, 6.17; N, 4.95; S, 11.35.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000015
11-Butyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole (5d): 98%; mp = 86-90 °C; Rf = 0.47 (EtOAc:hexane = 1:15); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.20-7.25 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.12 (s, 2H), 1.68 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.25 (tq, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 0.85 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 138.1, 134.0, 133.8, 128.7, 127.9, 127.0 126.3 124.4, 124.3, 122.5, 119.8, 118.8, 110.6, 110.5, 44.3, 31.9, 22.7, 19.4, 13.5; IR (ZnSe-ATR) 2962 (w), 2921 (w), 1469 (w), 1454 (w), 1360 (w), 1347 (w), 1196 (w), 1120 (w), 1042 (w), 819 (w), 757 (m), 743 (vs), 681 (w) cm-1; Anal. Calcd for C19H19NS: C, 77.77; H, 6.53; N, 4.77; S, 10.93: Found: C, 77.74; H, 6.55; N, 4.81; S, 10.98.
(다) 11-Alkyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3-b]indole 5-oxide (6a-6d)의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000016
11-Alkyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indole (5a-5d, 1.0 equiv) 을 무수 디클로로메탄에 녹인 후, 메타-클로로퍼벤조산 (m-chloroperbenzoic acid 69%, 1.1 equiv) 을 0 °C 에서 넣었다. 이 반응 혼합물을 0 °C 에서 1 시간 동안 교반한 후, 20% 소듐 싸이오설페이트 수용액을 넣어서 반응을 종료 시켰다. 유기 층은 분리하고 남은 물 층을 에틸 아세테이트로 세 번 추출 하였다. 모아진 유기 층은 포화 염화나트륨 수용액으로 씻고, 무수 황산나트륨을 넣고 감압 여과 하였다. 그 이후에는 아래 명시된 방법을 통해서 정제하였다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000017
11-Methyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole 5-oxide (6a): 남은 고체를 디에틸에테르:에틸아세테이트=8:1 (v/v) 에 분산시킨 후 여과하여 화합물 6a를 노란색 액체로 얻었다. (76%): mp = 180-183 °C; Rf = 0.29 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.68-7.71 (m, 2H), 7.58-7.61 (m, 2H), 7.27 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz ,1H), 4.55 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 140.3, 138.6, 133.1, 131.5, 128.4, 127.0, 126.4, 125.9, 125.1, 123.2, 120.2, 119.1, 110.6, 100.7, 44.2, 32.3; IR (ZnSe-ATR) 2962 (w), 1581 (w), 1524 (w), 1468 (w), 1423 (w), 1356 (w), 1367 (w), 1261 (w), 1227 (w), 1123 (w), 1070 (m), 1048 (s), 1ㅇ035 (s), 1025 (m), 1016 (m), 817 (w), 759 (vs), 667 (w) cm-1; HRMS (m/z): [M + Na]+ calcd for C16H13NNaOS, 290.0610; found, 290.0610.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000018
11-Ethyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole 5-oxide (6b): 남은 고체를 디에틸에테르:에틸아세테이트=8:1 (v/v) 에 분산시킨 후 여과하여 화합물 6b를 노란색 액체로 얻었다. (79%): mp = 210-213 °C; Rf = 0.33 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.70-7.75 (m, 3H), 7.59-7.62 (m, 2H), 7.27 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz ,1H), 4.43-4.57 (m, 4H), 1.41 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 140.6, 137.8, 132.3, 131.7, 128.5, 127.0, 126.4, 126.2, 124.4, 123.2, 120.3, 119.2, 110.6, 101.1, 44.2, 15.32, 15.31; IR (ZnSe-ATR) 2974 (w), 1585 (w), 1459 (w), 1339 (w), 1159 (w), 1133 (w), 1075 (w), 1024 (m), 831 (w), 768 (w), 750 (vs), 737 (m), 700 (w), 668 (w) cm-1; HRMS (m/z): [M + Na]+ calcd for C17H15NNaOS, 304.0767; found, 304.0768.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000019
11- Propyl -6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole 5-oxide (6c): 여액을 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=1:1) 로 정제하여 화합물 6c를 노란색 액체로 얻었다. (80%): mp = 128-132 °C; Rf = 0.27 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.69-7.77 (m, 3H), 7.58-7.64 (m, 2H), 7.26 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 4.42-4.46 (m, 3H), 1.77 (tq, J = 7.4, 7.0 Hz, 2H), 0.84 (t, J = 7.4 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 140.6, 138.3, 132.6, 131.6, 128.5, 126.9, 126.6, 126.1, 124.4, 123.2, 120.3, 119.2, 110.9, 101.2, 45.8, 44.1, 23.2, 11.0; IR (ZnSe-ATR) 2958 (w), 1581 (w), 1481 (w), 1455 (w), 1410 (w), 1362 (w), 1209 (w), 1077 (m), 1056 (m), 1036 (m), 1024 (m), 902 (w), 763 (s), 753 (vs), 730 (m) cm-1; HRMS (m/z): [M + Na]+ calcd for C18H17NNaOS, 318.0923; found, 318.0925.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000020
11-Butyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ]indole 5-oxide (6d): 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=1:1) 로 정제하여 화합물 6d를 노란색 액체로 얻었다. (65%): mp = 64-68 °C; Rf = 0.33 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.69-7.71 (m, 2H), 7.58-7.62 (m, 2H), 7.26 (dd, J = 7.8, 7.6 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.8, 7.6 Hz, 1H), 4.41-4.57 (m, 4H), 1.72 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.27 (tq, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 0.85 (t, J = 7.2 Hz, 3H)); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 140.7, 138.2, 132.6, 131.6, 128.5, 126.8, 126.6, 126.1, 124.3, 123.2, 120.3, 119.2, 110.9, 101.2, 44.2, 44.1, 31.8, 19.4, 13.5; IR (ZnSe-ATR) 2950 (w), 1585 (w), 1482 (w), 1456 (w), 1432 (w), 1349 (w), 1266 (w), 1131 (w), 1079 (m), 1052 (m), 1027 (m), 737 (s), 668 (w) cm-1; HRMS (m/z): [M + Na]+ calcd for C19H19NNaOS, 332.1080; found, 332.1080.
(라) 화합물 6으로부터 thiochromeno[4,3-b]indol -5- ium 2,2,2-trifluoroacetate (7a-7d)의 합성 (방법 A)
Figure PCTKR2015006167-appb-I000021
11-Alkyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indole 5-oxide (6a-6d, 1.0 equiv) 를 질소 분위기 하에서 아세토나이트릴에 분산시킨 후, 트리플루오로아세틱 안하이드라이드 (trifluoroacetic anhydride, 3.0 equiv) 를 0 °C 에서 천천히 넣어 주었다. 이 반응 혼합물을 상온에서 5 분 동안 교반한 후, 감압 하에 남은 반응물과 용매를 말려서 제거해 주었다. 남은 고체를 무수 디에틸에테르에 분산시킨 후 0 °C 로 냉각시키고, 차가운 디에틸에테르로 씻으면서 여과함으로써 설포늄염 7a-7d를 진한 노란색 고체로 얻었다. 이 고체는 추가적인 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
(마) 화합물 5로부터 thiochromeno[4,3-b]indol -5- ium 2,2,2-trifluoroacetate (7a-7d)의 합성 (방법 B)
Figure PCTKR2015006167-appb-I000022
질소 분위기 하에서 11-alkyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indole (5a-5d, 1.0 equiv) 과 비스(트리플루오로아세톡시)아이오도벤젠 (bis(trifluoroacetoxy)iodobenzene, 1.1 equiv) 을 섞은 후, 무수 아세토나이트릴을 0 °C 에서 넣었다. 이 반응 혼합물을 상온에서 5 분 동안 교반한 후, 감압 하에 남은 반응물과 용매를 제거해 주었다. 남은 고체를 무수 디에틸에테르에 분산시킨 후 0 °C 로 냉각시키고, 차가운 디에틸에테르로 씻으면서 여과하여 설포늄염 7a-7d를 진한 노란색 고체로 얻었다. 이 고체는 추가적인 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
(바)2,5- Dioxopyrrolidin -1- yl 3-((11-alkyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3-b] indol-6-yl)thio)propanoate ( 8a - 8d )의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000023
설포늄염 (7a-7d, 1.0 equiv) 을 아세토나이트릴에 녹인 후 3-머캅토프로피오닉산 (3-mercaptopropionic acid, 1.0 equiv) 과 탄산나트륨 (1.0 equiv) 을 차례로 넣었다. 이 반응 혼합물이 무색이 될 때까지 (약 20 분) 상온에서 교반한 후, 에틸 아세테이트를 넣어 희석시켰다. 남은 고체가 모두 녹을 때까지 물을 넣은 후 유기 층은 분리하고 남은 물 층을 에틸 아세테이트로 세 번 추출 하였다. 모아진 유기 층을 포화 염화암모늄 수용액과 포화 염화나트륨 수용액 순서로 씻어 주었다. 무수 황산나트륨을 넣고 감압 여과한 후, 여액의 용매를 감압하에 모두 제거하여 화합물 8a-8d를 노란색 고체로 얻었다. 이 고체는 추가적인 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000024
카복실산 화합물 8a-8d (1.0 equiv) 와 N-하이드록시 숙신이드 (N-hydroxysuccinimide, 1.1 equiv) 를 질소 분위기 하에서 무수 디클로로메탄에 녹였다. 이 반응 혼합물에 무수 디클로로메탄에 따로 녹인 N-(3-디메틸아미노프로필)- N'-에틸카르보디이미드 염산염 (N-(3-dimethylaminopropyl)- N-ethylcarbodiimide hydrochloride, 3.0 equiv) 용액을 넣어 주었다. 상온에서 4 시간 동안 교반한 후 디클로로메탄을 더 넣어 희석시켰다. 이 용액을 물로 두 번 씻은 후, 무수 황산나트륨을 넣어 감압 여과하였다. 여액의 용매를 감압 하에 모두 제거한 후 컬럼크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=1:1) 로 정제하여 화합물 3a-3d를 흰색 고체로 얻었다.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000025
2,5- Dioxopyrrolidin -1- yl 3-((11-methyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ] indol-6-yl)thio)propanoate (3a): 31% (화합물 6a로부터 위에 기술된 방법 A1와 B를 이용해서 합성한 수율); mp = 90-96 °C dec; Rf = 0.52 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.4, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 6.23 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.10-3.24 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 1H), 2.75-2.82 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 170.2, 168.0, 138.2, 134.7, 130.5, 129.7, 127.7, 126.8, 126.7, 125.1, 123.0, 122.7, 120.2, 118.7, 110.7, 110.4, 42.9, 33.0, 31.5, 25.7, 25.5; IR (ZnSe-ATR) 1811 (w), 1782 (w), 1732 (s), 1470 (w), 1426 (w), 1361 (w), 1201 (m), 1064 (m), 824 (w), 743 (s), 668 (w) cm-1; Anal. Calcd for C23H20N2O4S2: C, 61.04; H, 4.45; N, 6.19; S, 14.17. Found: C, 61.14; H, 4.48; N, 6.10 S, 14.04.
2,5- Dioxopyrrolidin -1- yl 3-((11-ethyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ] indol-6-yl)thio)propanoate (3b): 30% (화합물 6b로부터 위에 기술된 방법 A1와 B를 이용해서 합성한 수율); mp = 82-87 °C dec; Rf = 0.32 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.44 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.08-3.23 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 1H), 2.75-2.82 (m, 5H), 1.42 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 170.1, 167.9, 137.5, 133.9, 130.6, 129.9, 127.6, 126.9, 126.7, 124.4, 123.1 123.0, 120.3, 118.8, 111.2, 110.4, 42.8, 31.5, 25.7, 25.5, 15.4; IR (ZnSe-ATR) 1810 (w), 1781 (w), 1733 (s), 1459 (w), 1426 (w), 1345 (w), 1203 (m), 1066 (m), 1044 (m), 991 (w), 813 (w), 745 (vs) cm-1; Anal. Calcd for C24H22N2O4S2: C, 61.78; H, 4.75; N, 6.00; S, 13.74. Found: C, 61.83; H, 4.79; N, 5.97 S, 13.91.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000027
2,5- Dioxopyrrolidin -1- yl 3-((11- Propyl -6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ] indol-6-yl)thio)propanoate (3c): 25% (화합물 6c로부터 위에 기술된 방법 A1와 B를 이용해서 합성한 수율); 32% (화합물 5c로부터 위에 기술된 방법 A2와 B를 이용해서 합성한 수율); mp = 77-82 °C dec; Rf = 0.36 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.43 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.31-4.46 (m, 2H), 3.08-3.21 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 1H), 2.75-2.82 (m, 5H), 1.67-1.82 (m, 2H), 0.83 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 170.1, 167.9, 138.0, 134.1, 130.5, 129.9, 127.6, 126.89, 126.90, 124.3, 123.0, 122.9, 120.2, 118.8, 111.5, 110.7, 46.3, 42.7, 31.4, 25.7, 25.5, 23.1, 10.9; IR (ZnSe-ATR) 2961 (w), 1812 (w), 1783 (w), 1733 (s), 1460 (w), 1424 (w), 1348 (m), 1201 (m), 1065 (m), 1045 (m), 908 (w), 810 (w), 744 (vs) cm-1; Anal. Calcd for C25H24N2O4S2: C, 62.48; H, 5.03; N, 5.83; S, 13.34. Found: C, 62.42; H, 5.03; N, 5.82 S, 13.40.
Figure PCTKR2015006167-appb-I000028
2,5- Dioxopyrrolidin -1- yl 3-((11-butyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3- b ] indol-6-yl)thio)propanoate (3d): 36% (화합물 6d으로부터 위에 기술된 방법 A1와 B를 이용해서 합성한 수율); mp = 76-81 °C dec; Rf = 0.35 (EtOAc:hexane = 1:1); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58-7.60 (m, 2H), 7.43 (dd, J = 8.0, 8.0 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.40-4.46 (m, 2H), 3.08-3.21 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 1H), 2.77-2.82 (m, 5H), 1.65-1.75 (m, 2H), 1.21-1.29 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): d 170.1, 167.9, 137.9, 134.2, 130.5, 129.9, 127.6, 126.9, 126.8, 124.3, 123.03, 122.96, 120.2, 118.8, 111.5, 110.6, 44.5, 42.8, 31.8, 31.4, 25.7, 25.5, 19.3, 13.5; IR (ZnSe-ATR) 2954 (w), 2925 (w), 1811 (w), 1783 (w), 1735 (s), 1459 (w), 1422 (w), 1359 (w), 1200 (m), 1066 (m), 1042 (w), 810 (w), 745 (s), 669 (m) cm-1; Anal. Calcd for C26H26N2O4S2: C, 63.14; H, 5.30; N, 5.66; S, 12.96. Found: C, 63.14; H, 5.30; N, 5.69 S, 12.90.
실시예 2: 질량 표지 물질의 합성 (II)
Sodium 1-((3-((11-methyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3-b]indol -6-yl)thio)propanoyl)oxy)-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate (9) 의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000029
3-((11-Methyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indol-6-yl)thio)propanoic acid (8a, 0.015 g, 0.042 mmol), N-하이드록시 설포숙신이미드 소듐염 (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt, 0.009 g, 0.04 mmol), N,N-디메틸피리디늄 파라-톨루엔설포네이트 (N,N -dimethylpyridinium p-toluenesulfonate (DPTS), 0.001 g, 0.004 mmol) 를 무수 디메틸포름아미드 (0.3 mL) 에 질소 분위기에서 녹인 후 0 °C 로 냉각시켰다. 무수 디클로로메탄 (0.3 mL) 에 따로 녹인 N,N뮃-디사이클로헥실카르보디이미드 (N,N뮃-dicyclohexylcarbodiimide, 0.010 g, 0.051 mmol) 용액을 질소 분위기에서 위 반응 혼합물에 천천히 넣어 주었다. 반응 혼합물의 온도를 상온으로 서서히 올리면서 교반 하였다. 6 시간 후 0 °C 로 냉각시키고 침전으로 가라앉은 고체를 감압 여과하면서 차가운 디클로로메탄으로 씻어 주었다. 여액의 용매를 감압 하에 모두 제거하여 화합물 9를 노란색 고체로 얻었다. (45%): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.4, 7.2 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.13-3.19 (m, 4H), 2.94-3.02 (m, 1H), 2.76-2.83 (m, 1H).
실시예 3: 질량 표지 물질의 합성 (III)
Perfluorophenyl 3-((11-methyl-6,11- dihydrothiochromeno[4,3-b]indol -6-yl)thio)propanoate (10) 의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000030
3-((11-Methyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indol-6-yl)thio)propanoic acid (8a, 0.020 g, 0.056 mmol), 과 펜타플루오로페놀 (pentafluorophenol, 0.011 mg, 0.062 mmol) 를 질소 분위기 하에서 무수 디클로로메탄 (0.7 mL) 에 녹였다. 이 반응 혼합물에 무수 디클로로메탄 (0.3 mL) 에 따로 녹인 N-(3-디메틸아미노프로필)- N'-에틸카르보디이미드 염산염 ( N-(3-dimethylaminopropyl)- N-ethylcarbodiimide hydrochloride, 0.032 mg, 0.017 mmol) 용액을 넣어 주었다. 이 반응 혼합물을 상온에서 2.5 시간 동안 교반한 후 디클로로메탄 (3 mL) 을 더 넣어 희석시켰다. 이 용액을 물 (3 mL) 로 두 번 씻은 후, 무수 황산나트륨을 넣어 감압 여과하였다. 여액의 용매를 감압 하에 모두 제거한 후 컬럼크로마토그래피 (헥산:에틸아세테이트=9:1) 로 정제하여 화합물 10을 노란색 고체로 얻었다. (75%): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.55-7.59 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 7.2, 7.2 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.4, 7.2 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 7.2, 6.8 Hz, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.27-3.33 (m, 2H), 2.99-3.02 (m, 1H), 2.83-2.88 (m, 1H).
실시예 4: 질량 표지 물질의 합성 (IV)
Sodium 2,3,5,6- tetrafluoro -4-((3-((11-methyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indol-6-yl)thio)propanoyl)oxy)benzenesulfonate (11) 의 합성
Figure PCTKR2015006167-appb-I000031
3-((11-Methyl-6,11-dihydrothiochromeno[4,3-b]indol-6-yl)thio)propanoic acid (8a, 0.050 g, 0.14 mmol), 소듐 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시벤젠설포네이트 (sodium 2,3,5,6-tetrafluoro-4-hydroxybenzenesulfonate, 0.038 g, 0.14 mmol), N,N-디메틸피리디늄 파라-톨루엔설포네이트 (N,N -dimethylpyridinium p-toluenesulfonate (DPTS), 0.002 g, 0.007 mmol) 를 무수 아세톤/무수 디메틸 포름아미드 (v:v=15:1, 3.0 mL) 에 질소 분위기에서 녹인 후 0 °C 로 냉각시켰다. 무수 아세톤 (1.0 mL) 에 녹인 N,N '-디사이클로헥실카르보디이미드 (N,N '-dicyclohexylcarbodiimide, 0.035 g, 0.17 mmol) 용액을 질소 분위기에서 위 반응 혼합물에 천천히 넣어 주었다. 반응 혼합물의 온도를 상온으로 서서히 올리고 4.5 시간 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 0 °C 로 냉각시킨 후 침전으로 가라앉은 고체를 감압 여과하면서 차가운 디클로로메탄으로 씻어 주었다. 여액의 용매를 감압 하에 모두 제거한 후 컬럼크로마토그래피 (디클로로메탄:아세톤=3:7) 로 정제하여 화합물 11을 노란색 고체로 얻었다. (37%): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): d 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.55-7.60 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 7.2, 7.2 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.0, 7.2 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.20-3.34 (m, 2H), 2.96-3.03 (m, 1H), 2.80-2.89 (m, 1H).
실시예 5: 화합물 1, 2, 3a 의 용해도 비교
Figure PCTKR2015006167-appb-I000032
도 5, 6에 나타난 것처럼, 화합물 1, 2에 비해 인돌을 도입한 유도체 3a는 355 nm에서 흡광도가 더 높고, 그에 따라 레이저 조사에 의한 이온화도 훨씬 효과적으로 일어났다.
인돌을 도입한 유도체 3은 기존의 페로센 유도체 질량분석 표지 물질에 비해 용해도가 매우 향상된 것을 알 수 있었다. 예를 들어 페로센 유도체는 DMSO에 녹였을 때 10%의 물이 첨가된 지점에서 흐린점(cloud point)을 형성하는 반면, 인돌을 도입한 2-알킬싸이오-2H-싸이오크로멘 유도체 3a는 30%의 물이 첨가될 때까지 흐린점을 형성하지 않았다.
실시예 6: matrix-less LDI MS 스펙트럼
(가) 광 분해성 질량 표지 물질 또는 이 물질로 표지된 바이오 물질의 Matrix-less LDI-TOF 실험 방법
광 분해성 질량 표지 물질 또는 이 물질로 표지된 바이오 물질을 테트라하이드로퓨란에 녹인 후, 1.0 μl 를 취해 플레이트 위의 각 점에 떨어뜨리고 실온의 공기 중에 노출 시킴으로써 용매를 건조시켰다. 플레이트 위의 건조된 시료에 MALDI-TOF mass spectrometer (매트릭스 보조 레이저 탈착 비행시간형 질량분석기, Autoflex Speed series, BrukerDaltonics, Leipzig, Germany) 로 분석하였다. 모든 스펙트럼은 양이온 리플렉트론 모드에서 측정되었다. 질량 범위는 0-800 Da 으로 설정되었고, 이후 데이터 분석은 flexAnalysis 소프트웨어를 사용하였다.
(나) 질량분석 표지 물질 3a - 3d 의 matrix-less LDI MS 스펙트럼
질량분석 표지 물질 3a-3d의 matrix-less LDI MS 스펙트럼을 도 7에 나타내었다. Matrix-less LDI-TOF MS 에서는 기대했던 바와 같은 광분해 반응이 일어나서 각 양이온에 해당하는 피크가 높은 세기로 검출되는 것을 확인하였다. 특징적인 것은 약 235 m/z 에 해당하는 피크가 공통적으로 관찰된다는 것인데, 이것은 광분해 과정에서 질량 변화기가 일부 떨어져 나갔음을 의미한다. 다행히도 그 비율이 매우 낮기 때문에 실제로 마커 검출에 적용함에 있어서는 큰 문제가 되지 않을 것으로 예상 된다.
실시예 7: matrix-less LDI MS의 감도 비교
신규 광분해성 질량 표지 물질이 matrix-less LDI-TOF MS에서 검출되는 감도를 기존에 알려진 표지 물질과 상대적으로 비교 측정해 보았다.
기존 문헌에 보고된 광분해성 표지 물질 중의 하나인 트리틸 표지 물질 (trityl-SPh)과 본 발명에 따른 화합물 3a를 같은 양을 넣어 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8로부터, 표지 물질 3a가 트리틸 표지 물질에 비해 110배 정도 높은 감도와 신호 대 잡음비 (signal to noise)를 나타냄을 알 수 있다.
추가적으로 선행 특허 문헌(특허출원 제10-2014-0050964호)에 나타난 페로센 계열의 표지 물질과 matrix-less LDI MS에서의 감도를 비교한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9로부터 본 발명에 따른 표지 물질이 약 4 배 정도 더 높은 검출세기를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 제안된 표지 물질은 기존에 알려진 표지 물질에 비해 훨씬 높은 감도의 질량분석 표지 물질임을 확인하였다.
실시예 8: 질량 표지 물질의 검출 한계
신규 질량 표지 물질의 최소 검출한계(detection limit)를 확인하기 위하여 Matrix-less LDI-TOF MS로 검출 가능한 최소 시료의 양을 알아보는 실험을 하였다. 100/50/10/5/2/1 pmol의 표지 물질을 MALDI 측정용 플레이트 위에 각각 로딩 하여 스펙트럼을 비교해 보았다. 피크 면적(peak area)과 신호-대-잡음비(signal to noise, S/N ratio)를 몰수에 따라 도시화한 결과 모든 표지 물질 (3a, 3b, 3c, 3d) 의 경우에 도 10과 같은 선형의 그래프를 얻을 수 있었다 (대표적으로 3d 의 데이터만 게시함).
이는 본 분석법이 바이오 마커의 정량 분석에 적용 가능함을 시사한다. 재현성있게 검출 가능 한 최소한의 표지 물질의 양은 1 pmol로 측정되었는데, 이 때 신호-대-잡음비는 약 100 내외로 측정 되었다. 더 낮은 몰수의 경우에도 양이온은 검출되지만 플레이트의 스팟 내 측정하는 위치에 따라 검출 세기의 차이가 크게 나는 현상을 발견하였다. 이것은 표지 물질의 결정성이 크기 때문에 일어나는 현상으로써, 물질이 고르게 퍼지지 못하고 일부분에만 결정화되어 뭉쳐있기 때문으로 해석된다. 그러나 표지 물질이 항체에 컨쥬게이션 되면 결정성이 약화되므로 물질이 스팟에 고르게 분포할 수 있고, 따라서 최소 검출 한계도 충분히 개선될 것으로 예상된다.

Claims (9)

  1. 하기 식 I로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000033
    (식 I)
    (상기 식 I에서,
    R1은 말단에 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 또는 말레이미드기의 어느 하나를 반응기로 가지고 있는 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이고,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오 또는 축합고리이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이고,
    Ar은 벤젠, 또는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 헤테로방향족고리이다)
  2. 하기 식 II로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000034
    (식 II)
    (상기 식 II에서,
    R1은 말단에 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 또는 말레이미드기의 어느 하나를 반응기로 가지고 있는 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60헤테로아릴기이고,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오, 또는 축합고리이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이다)
  3. 하기 식 III로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000035
    (식 III)
    (상기 식 III에서,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오, 또는 축합고리이고,
    C(=O)R4는 N-하이드록시숙신이미딜, N-하이드록시 설포숙신이미딜, 펜타플루오로페닐옥시, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐옥시, 니트로페닐옥시, 2,4,5-트리클로로페닐옥시, 프탈이미도일옥시, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이미딜옥시, 또는 말레이미드이고,
    n은 1-12의 정수이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이다)
  4. 하기 식 IV로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000036
    (식 IV)
    (상기 식 IV에서,
    R1은 말단에 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 또는 말레이미드기의 어느 하나를 반응기로 가지고 있는 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이고,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오, 또는 축합고리이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이다)
  5. 하기 식 V로 표시되는 화합물:
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000037
    (식 V)
    (상기 식 V에서,
    A는 말단에 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 또는 말레이미드기의 어느 하나를 반응기로 가지고 있는 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이고,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오, 또는 축합고리이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이고,
    Ar은 벤젠, 또는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 헤테로방향족고리이다)
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량분석법 또는 매트릭스 없는 LDI-TOF(matrix-less laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법에 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 하기 식 Ia로 표시되는 화합물과 바이오 물질의 콘쥬게이트 화합물로서,
    Figure PCTKR2015006167-appb-I000038
    (식 Ia)
    (상기 식 Ia에서,
    A는 말단에 N-하이드록시숙신이미드 에스터기, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터기, 펜타플루오로페닐 에스터기, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐 에스터기, 나이트로페닐 에스터기, 2,4,5-트리클로로페닐 에스터기, 프탈이미도 에스터기, N-하이드록시-5-노보넨-엔도-2,3-다이카보이마이드 에스터기, 또는 말레이미드기의 어느 하나를 반응기로 가지고 있는 C1-12알킬, C6-60아릴, 또는 N, S 및 O에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 가지는 C2-60 헤테로아릴기이고,
    R2와 R3는 독립적으로, 수소, C1-12알킬, C6-60아릴, C1-12알콕시, C1-12알킬아미노, C1-12알킬티오 또는 축합고리이고,
    상기 축합고리는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 퓨란, 이미다졸, 트라이아졸, 다이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 어느 하나이고,
    Ar은 벤젠, 또는 피롤, 싸이오펜, 인돌, 이미다졸, 트라이아졸, 또는 피리미딘에서 선택되는 헤테로방향족고리이다)
    상기 바이오 물질은 항원, 항체, 바이오 마커, 펩타이드, 핵산, 또는 글라이칸인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트 화합물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량분석법 또는 매트릭스 없는 LDI-TOF(matrix-less laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법에 사용되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트 화합물.
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