WO2016178493A1 - 관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 및 이의 용도 - Google Patents

관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 및 이의 용도 Download PDF

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idcc
clostridium butyricum
strain
present
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이승훈
김민구
강대중
강재훈
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일동제약 주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium

Definitions

  • the present invention relates to a tindalized Clostridium butyricum and its use, which have an effect of preventing and treating arthritis, and more particularly, the biomarker C0X-2 and the inflammatory cytokine tumor necrosis f actor- ⁇ (TNF). It relates to a tindalized Clostridium butyricum IDCC 5101 microorganism that contributes to preventing arthritis and relieving symptoms by lowering the level of ⁇ ) and a composition for preventing and treating arthritis comprising the same as an active ingredient.
  • Rheumatoid arthritis is the most common inflammatory arthritis and symptom of synovial hyperplasia and bone and cartilage destruction of the joints.
  • the pathogenesis of rheumatoid arthritis is unclear, but studies show that many cytokines are expressed in the synovial membrane of arthritis animal models and rheumatoid arthritis patients, and that inhibition of these cytokines prevents arthritis symptoms, physical findings and joint destruction. It is thought that cytokines play an important role in the onset and continuation of the disease.
  • the pathogenesis of rheumatoid arthritis is not clear and several models have been proposed, which can be broadly divided into antigen-specific and antigen-nonspecific mechanisms.
  • the causative ⁇ -cell antigen is not yet identified, but it may be caused by a virus or a bacterium.
  • the antigen-presenting cells (Ant igen present cel l, APC) are the primary tissue-compatible antigen (class II).
  • the major histochmpat ibi li ty complex (MHC) provides arthritis-inducing peptides to T cells to activate T cells, and activated T cells cross-react with the sel f-ant igen. Arthritis begins by stimulating macrophages by reacting).
  • TNF— ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • cytokines produced by the synovial membrane and acting as paracrine or autocrine are known to be involved in the continuation and exacerbation of chronic joint inflammation.
  • Studies on cytokine expression in rheumatoid arthritis tissues and synovial fluid have revealed the expression of many types of inflammatory cytokines such as TNF-a, IL- ⁇ , IL-6, GM-CSF, IL-8, and IL-10, TGF Increased expression of anti-inflammatory cytokines such as - ⁇ , inflammatory cytokine inhibitors such as IL-1 receptor antagonist (IL-lRa), and soluble TNFR have been reported, but the production of these inflammatory regulators is sufficient to neutralize the activity of inflammatory cytokines.
  • rheumatoid arthritis will persist and worsen due to the imbalance between the production of inflammatory cytokines and anti-inflammatory substances.
  • Efforts have been made to treat and improve rheumatoid arthritis, an inflammatory autoimmune disease through intestinal immunity, and studies using probiotics such as lactic acid bacteria as a material to control intestinal immunity.
  • the inventors of the present invention to complete the method of tyndal l izat ion that can maximize the anti-inflammatory action of the Clostridium butylideum IDCC 51 material in order to solve the administration problems of the preceding studies as described above , It was confirmed that the mycelium of chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101 shows arteritis alleviation efficacy in a concentration-dependent manner in a rheumatoid arthritis animal model experiment, and finally the present invention was completed. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) having an arthritis prevention and treatment effect.
  • KCTC12738BP Clostridium butyricum IDCC 5101 strain having an arthritis prevention and treatment effect.
  • Another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating arthritis, including the strain and the culture medium of the strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a mycelium of Tindalized Clostridium butyricum IDCC 5101 (Accession No .: KCTC12738BP) having an arthritis prevention and treatment effect.
  • It is another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating arthritis, which comprises the bacterium as an active ingredient.
  • It is another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating arthritis comprising the lysogen of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and a culture medium of the strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is the step of (a) anaerobic culturing Clostridium butyricum IDCC 5101 strain; And (b) the cultured cells and culture medium 111 ⁇ 150 ° C, 0.6 ⁇
  • Arthritis prevention and treatment effect comprising the step of sterilizing by pressing at 1.3 kgf / cm 2 Eggplant is to provide a method for the preparation of tindal Clostridium butyricum IDCC 5101 microorganisms. Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating arthritis by administering an effective amount of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession No .: KCTC12738BP) to an individual in need thereof. Another object of the present invention is to provide a mycelium of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and a use for the preparation of a therapeutic agent for arthritis of the strain.
  • the present invention provides Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession No .: KCTC12738BP) having an arthritis prevention and treatment effect.
  • the present invention to achieve another object of the present invention provides a composition for the prevention and treatment of arthritis comprising the strain and the culture medium of the strain as an active ingredient.
  • the present invention provides a mycelium of chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101 (Accession No .: KCTC12738BP) having the effect of preventing and treating arthritis.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of arthritis, comprising the microorganism as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing and treating arthritis, which comprises a dead body of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and a culture medium of the strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is the step of (a) anaerobic culturing Clostridium butyricum IDCC 5101 strain; And (b) the cultured cells and culture medium 111 ⁇ 150 ° C, 0.6 ⁇
  • Arthritis prevention and treatment effect comprising the step of sterilizing by pressing at 1.3 kgf / cm 2 Provides a method for preparing chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101.
  • the present invention provides an effective amount of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession No .: KCTC12738BP) to an individual in need of an inoculum and culture medium of the strain to prevent or treat arthritis. Provide a way.
  • the present invention provides a microorganism of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and the use for the preparation of a therapeutic agent for arthritis of the strain.
  • Clostridium butyricum IDCC 5101 strain accesion Number: KCTC12738BP
  • the present invention provides Clostridium butyricum IDCC 5101 (Accession No .: KCTC12738BP) having an arthritis prevention and treatment effect.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of arthritis, comprising the strain and the culture medium of the strain as an active ingredient.
  • the composition may include any type of composition including Clostridium butyricum IDCC 5101 (Accession Number: KCTC12738BP), preferably the composition may be a food composition or a pharmaceutical composition, but is not limited thereto. no.
  • tindal Clostridium butyricum IDCC 5101 may be added as it is, or may be used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the term "food” used in the present invention is meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, dairy products, including ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes It includes all foods in a commercial sense.
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • the term "health functional food” used in the present invention refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.
  • 'functional' means to obtain a useful effect for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food can also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in a variety of forms of formulation, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material of food, excellent portability,
  • the health functional food of the present invention can be taken as a supplement for enhancing the effect of the arthritis treatment.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, H regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • it may contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the food composition of the present invention may contain various flavors, natural carbohydrates, and the like as additional components, as in a general beverage.
  • the carbohydrates are sugars such as glucose, monosaccharides such as fructose, malsaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, xyl, sorby and erythritol.
  • the sweetener natural sweeteners such as tautin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used.
  • the ratio may generally be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g, per 100 mL of the composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the mixed amount of Clostridium butyricum IDCC 51 in the food composition of the present invention may be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, 1 g of the specific food material (or sugar of the present invention 1 X 10 8 to 1 g) of the Clostridium butyricum IDCC 5101 of the present invention in the manufacture of food or beverage
  • the daily intake of the chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101 food composition of the present invention is 1 X 10 5 to 1 X 10 10 CFU / kg, preferably lx iO 6 to 1 XK) 8 CFU / kg, Intake may be taken once a day, may be divided several times, but is not limited thereto.
  • the effective dose of the strain in the food composition of the present invention can be used according to the effective dose of the pharmaceutical composition, but may be less than the above range for long term intake for health and hygiene purposes or health control purposes, It is evident that the component can be used in an amount above this range since there is no problem in terms of safety.
  • the composition when the composition is a pharmaceutical composition, it may further include a pharmaceutically acceptable additive in addition to Clostridium butyricum IDCC5101, and pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose.
  • Lactose Lactose, Povidone, Colloidal Silicon Dioxide, Calcium Hydrogen Phosphate, Lactose, Manni, Peel, Arabian Rubber, Pregelatinized Starch, Corn Starch, Powdered Cellulose, Hydroxypropyl Cellulose, Opadry, Starch Glycolic Acid Sodium, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, sucrose, dextrose, sorbitol and talc may be used.
  • Pharmaceutically acceptable additives according to the present invention is preferably included in 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in a variety of oral and parenteral formulations in actual clinical administration, when formulated, diluents such as stratifiers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. are commonly used. Or excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such solid preparations include at least one excipient in Clostridium butyricum IDCC 5101, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, It can be prepared by mixing lactose or gelatin dung.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethylate may be used.
  • suppositories wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • injectables may include conventional additives such as solubilizers, toners, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.
  • the therapeutic compositions of the present invention may include any physiologically acceptable carrier, sibling or stabilizer (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edit ion, Al fonso, R., ed, Mack Publishing Co) (East on, PA: 1995)).
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include monolayer solutions such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; Antioxidants including ascorbic acid; High molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyridone; Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; Monosaccharides, disaccharides, and others, including glucose, mannose, or dextrins carbohydrate; Chelating agents such as EDTA; Sugar alcohols such as manni or sorbbi; Salt-forming counterions such as sodium; And / or nonionic surfactants such as tethers, polyuronics or polyethylene glycol (PEG).
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention to the human body may vary depending on the age, weight, s
  • the arthritis includes osteoarthritis, rheumatoid arthr it is, lupus arthr it is, arthritis arthritis (react ive arthrit is), psoriatic arthritis, etc., preferably It may be, but is not limited to, rheumatoid arthritis or degenerative arthritis.
  • the present invention also provides a bacterium of Tindalized Clostridium butyricum IDCC 5101 (Accession No .: KCTC12738BP) having an arthritis prevention and treatment effect.
  • tindalization refers to a state in which bacteria are killed by a tindal sterilization method which can be generally used in the art.
  • the inventors of the present invention have found that the effect of preventing and treating arthritis when chitindal of Clostridium butyricum is excellent, and the extractability is different from the cells of a substance that exhibits an anti-inflammatory effect according to the chitindalization condition.
  • the Tyndalization method was optimized by evaluating the anti-inflammatory effects of the Tyndal temperature and pressure conditions. That is, according to one embodiment of the present invention, the inventors of the tindalization temperature conditions 90 ° C, Pressurized at 100 ° C, 110 ° C and 121 ° C for 10 minutes, and then cooled again to 50 ° C, and then raised to the respective temperature to maintain the pressurization for 5 minutes and cooled to 40 ° C Dimethyl butyricum was chintalized (Example 2).
  • Clostridium butyricum tinted at m ° c This effect was the most excellent (Example 3).
  • C0X-2 inhibitory activity was not superior to that of Clostridium butyricum bacterium tindalized at 121 ° C. This may be due to the fact that Clostridium butyricum is fragmented by the sterilization of the cells under high pressure and high temperature, resulting in smaller size and favorable conditions for the reaction of substances exhibiting anti-inflammatory effects.
  • the chitin is meant to kill the bacteria at 111 ⁇ 150 ° C, preferably 111 ⁇ 150 ° C, 112-150 ° C, 113-150 ° C, 114-150 ° C, 115 --1501
  • the tindal temperature when the tindal temperature is less than fire, the fragments of the dead microorganisms are not divided into favorable conditions for forming the antimicrobial effect of the dead microorganisms, and when the tindal temperature is higher than 150 ° C. Since the active ingredient of the microorganism does not exhibit anti-inflammatory action due to denaturation, the setting of the above-described chitindalization temperature conditions is very important for the production of Clostridium butyricum ICDD 5101 microorganisms having an anti-inflammatory effect.
  • the chitindal means to kill the bacteria under the pressurized condition
  • the pressurized means that an additional pressure is applied based on the atmospheric pressure of 1 atm (atm). That is, the pressurization condition in the present invention is based on 1 atm, which is normal pressure.
  • the tindal Clostridium IDCC 5101 microorganism is a joint by inhibiting the expression of tumor necrosis factor-a (tumor necrosi sf actor- ⁇ , TNF- ⁇ ) in macrophages It may be characterized by having a salt prevention and treatment effect.
  • Arthritis is a representative chronic inflammatory disease caused by the reaction of a number of cytokines in the body, such as inflammatory reaction occurs, a representative substance causing such inflammation is tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ).
  • TNF-a is a proinf lammatory cytokine that plays an important role in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, Crohn's disease, psoriasis and ankylosing myelitis.
  • Clinically, overproduced TNF— ⁇ produces an inflammatory mediator that stimulates macrophages in arthritis patients to amplify the inflammatory response, and causes adhesion molecules in vascular endothelial cells to induce more inflammatory cells. It also causes islet cells to produce proteases that damage cartilage, bones and ligaments, exacerbating the disease.
  • TNF- ⁇ increases the expression of adhesion molecules such as vascular cel lular adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercel lular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-select in vascular endothelial cells. Induces infiltration of inflammatory cells, decreases the number of T lymphocytes and inhibits the expression of VCAM-1 or E-select in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis treated with anti-TNF- ⁇ antibody. It is known that TNF-a plays an important role in the movement of.
  • VCAM-1 vascular cel lular adhesion molecule 1
  • IAM-1 intercel lular adhesion molecule 1
  • E-select in vascular endothelial cells. Induces infiltration of inflammatory cells, decreases the number of T lymphocytes and inhibits the expression of VCAM-1 or E-select in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis treated with anti-TNF- ⁇ antibody.
  • TNF-a promotes PG production by increasing the expression of secretory phosphol ipase A2 (sPLA2), cyclooxygenase-2 (COX-2) or microsomal PGE2 synthase (mPGES), which are involved in the production of prostaglandin (PG). It promotes the expression of inducible NO synthase (iNOS), an enzyme involved in the production of another inflammatory substance, nitric oxide (NO).
  • iNOS inducible NO synthase
  • TNF- ⁇ acts on synovial fibroblasts to promote cell proliferation, leading to synovial hyperplasia and fibrosis.
  • suppressing the expression of TNF- ⁇ may be the key in the treatment strategy of arthritis, and the inventors of the present invention have shown that the microbial organism of Clostridium butyricum IDCC 5101 is responsible for TNF-a in macrophages. Inhibition of expression revealed that it can be useful for the treatment of arthritis (Example 4).
  • Clostridium butyricum IDCC 5101 did not show a significant effect on the ability to produce IL-6 and IL-10 of macrophages (results not shown), and the inhibition of TNF-a production as described above has an anti-inflammatory effect. It was found that the main mechanism of the. Accordingly, the present invention provides a composition for the prevention and treatment of arthritis, comprising the microorganism as an active ingredient, the composition as described above. The present invention also provides a composition for the prevention and treatment of arthritis, comprising a fungus of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and the culture medium of the strain as an active ingredient. The present composition is as described above.
  • the culture medium is culture medium itself cultured Clostridium butyricum IDCC 5101 according to the present invention in a suitable liquid medium, filtrate (filtered or centrifuged supernatant) from which the strain was removed by filtration or centrifugation of the culture medium, Cell cultures obtained by ultrasonically treating the culture solution or treating the culture solution with lysozyme, and the like, preferably, but not limited to the supernatant after centrifugation.
  • the culture medium may include both a concentrated solution of the culture solution and a dried product of the culture solution.
  • the present invention also provides a composition characterized in that the microorganism is chitindalized.
  • the present invention also provides a composition, characterized in that the tindal is to be sterilized by pressing at 111 ⁇ 150 ° C, 0.6-1.3 kgf / cm 2 .
  • the present invention also comprises the steps of (a) anaerobic culture of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain; And (b) killing the cultured cells and the culture medium at 111-150 ° C. and 0.6-1.3 kgf / cm 2 " to pressurize and sterilize the arthritis Clostridium butyricum IDCC having arthritis prevention and treatment effect. provides a process for the preparation of 5101 cells were used.
  • step (b) four cell manufacturing method of the step (b) is then held 115 ⁇ 150 ° C, 7 ⁇ 15 bungan pressed at 0.1-1.3 kgf / cm 2, 45 and again Angled at 55 ° C and back each
  • tinstrylated clostridium butyricum is tinted.
  • Clostridium butyricum IDCC 5101 may be separated from the culture medium, and only the mycelium may be tindalized, and the strain may be killed by chitinalizing the culture medium containing the strain.
  • the step of centrifuging the culture medium cultured Clostridium butyricum IDCC 5101 to separate the cells and the culture medium to concentrate the culture solution to prepare a concentrate and the separation and the concentrate in advance
  • the method may further include mixing one Clostridium butycum IDCC 5101 cell.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating arthritis by administering in an effective amount to Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession No .: KCTC12738BP) to an individual in need thereof.
  • the present invention also provides the use of a microorganism of Clostridium butyricum IDCC 5101 strain (Accession Number: KCTC12738BP) and the use for the preparation of a therapeutic agent for arthritis of the strain.
  • the 'effective amount' of the present invention when administered to a patient, refers to an amount that exhibits a therapeutic and prophylactic effect or a cancer metastasis inhibiting effect of cancer, and the 'individual' means an animal, preferably a mammal, in particular a human being. It may be an animal, or may be cells, tissues, organs, etc. derived from the animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • Clostridium butyricum IDCC 5101 microorganism of the present invention not only lowers the levels of C0X-2, a biomarker of arthritis, and tumor necrosis factor-a (TNF- ⁇ ), an inflammatory cytokine, Arthritis symptoms have been alleviated in arthritis animal models administered with DI butyricum IDCC 5101.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor-a
  • Figure 1 is a photograph showing the chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101 raw material with the prevention and treatment of arthritis.
  • Figure 2 is a result of comparing the inhibitory effect of the inflammatory protein C0X-2 according to the chitindal process conditions by western blotting method (T121: 121 ° C, Tyndal at 1.0 kgf / cm 2 , T110:
  • Figure 3 is a result showing the effect of chitindal Clostridium butyrithium IDCC 5101 on the inflammatory cytokine TNF- ⁇ secretion.
  • Figure 4 is a result showing the arthritis symptom relief effect in the arthritis model animal of chitindal Clostridium butyricum IDCC 5101.
  • Figure 5 is a result showing the histopathological analysis of the inflammatory effect of improving in the tin dalhwa Clostridium butyric rikeum administration of IDCC 5101 arthritis animal model.
  • the present inventors confirmed the anti-inflammatory activity against 50 kinds of immune-related probiotics possessed by Ildong Pharmaceutical in order to select a strain having excellent anti-inflammatory effect against rheumatoid arthritis.
  • Anti-inflammatory activity was selected through C0X-2 inhibitory effect by treating probiotics and tindal samples of each probiotic in Raw cel l 264.7 cel l.
  • C0X-2 inhibitory effect of each sample was confirmed by western blotting method. Tindals Clostridium butyricum showed the highest anti-inflammatory effect among 50 probiotic and 50 tindal samples IDCC 5101 was finalized.
  • Clostridium butyricum IDCC 5101 showed the best anti-inflammatory effect, which was deposited with the Korea Microbial Resources Center (Accession Number: KCTC12738BP).
  • Optimal anti-inflammatory effect of anti-inflammatory effect Clostridium dibutyricum Establishment of tindal cells
  • the germ cells were germinated through tindalization in order to produce the tindalized Clostridium butyricum IDCC 5101 optimized for the prevention of arthritis. Since anti-chlorine extracts were different from the bacterial cells according to the tin-dalization conditions, the anti-inflammatory effect of the tin-dalization temperature and pressurization conditions was evaluated and optimized.
  • Clostridium butyric spawn is sterile in CBT medium (glucose (w / v), peptone 0.1% (w / v), skim milk powder 0.1% (w / v)), which is a sterile tin production medium sterilized in an 800L / 1KL fermenter. Inoculated and incubated anaerobicly for 16 hours.
  • CBT medium glucose (w / v), peptone 0.1% (w / v), skim milk powder 0.1% (w / v)
  • C0X-2 inhibitory effect measurement method is as follows. Prepare raw 264.7 cells at 2.5 x 10 5 cells / ml, prepare 6 ml wells at 2 ml / well for final 5.0 x 10 3 ⁇ 4 cells / well, and incubate overnight for 24 hours. Each well was treated with 4 ul of LPS (2 ug / ml) and incubated overnight for 24 hours. At the end of incubation, the protein was quantified by BCA method, separated by regular electrophoresis on 10% SDS-polycryl amide gel, and transferred to polyvinyl idene di fluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA) at 100V for 120 minutes.
  • PVDF polyvinyl idene di fluoride
  • the membrane is separated, soaked in a blocking solution (20 ml of 0.1% TBST buffer containing 5% skim milk), blocked for 30 minutes to 1 hour while shaking, and then washed with 0.1% TBST buffer. And reacted with primary antibodies (C0X-2 and ⁇ -actin).
  • COX-2 antibody (1: 1000, Cell Signaling, USA) and ⁇ -act in antibody (1: 5000, Cell Signaling, USA) were used to react overnight at 4 ° C. Then, washing with 0.1% TBST buffer and reacting with a secondary antibody (anti-rabbit polyclonal antibody) for 1 hour 30 minutes.
  • the membrane After washing with 0.1% TBST buffer, the membrane was placed on a 0HP film, wetted with a west-one substrate, and detected by protein expression using Chemi Dox. The results are shown in Table 1 and FIG. 2. As shown in Table 1 and FIG. 2, the Clostridium butyricum IDCC 5101 chitinylated at 121 ° C-1.0 kgf / cm 2 was the best C0X-2 inhibitory effect. This is due to the fact that Clostridium butyricum fragments as the cells are sterilized under high pressure and high temperature, resulting in smaller size and favorable conditions to react with macrophages. .
  • the remaining wells were incubated for 24 hours overnight after treatment with PBS and T121 tindal Clostridium butyricum IDCC 5101 sample (ID-CBT5101) at a negative control of 10%.
  • the culture medium of each well was transferred to a 15 ml falcon tube and centrifuged for 5 minutes at 9,500 rpm. The supernatant of each tube was collected separately and used for the cytokine experiment.
  • the Clostridium butyricum IDCC 5101 (ID-CBT5101) synthase synthesized at 121 ° C-1.0 kgf / cm 2 , like the dexamethasone, a positive control, TNF- ⁇ as an inflammation-inducing cytokine It has been shown to act to inhibit. In contrast, it was confirmed that the secretion of the cytokine IL-10, which exhibits anti-inflammatory mechanism, and the amount of secretion (result not shown) resulted in the formation of the tindalized Clostridium butyridium IDCC 5101 (ID-CBT5101) was found to be effective in easing inflammation.
  • ID-CBT5101 5 ⁇ 10 8 , ⁇ 'CFU / rat administration group.
  • CFA Com lete Freund " s Adjuvant
  • Test substance was prepared immediately before administration and administered orally once a day. The duration of administration was 4 weeks from the day of CFA administration. Green leaf mussel extract milk, a positive control group, was administered at 100 mg / kg, and tindal Clostridium butycum IDCC 5101 (ID-CBT5101) was 5 ⁇ 1 ( ⁇ ).
  • Tindalized Clostridium butyricum IDCC 5101 microorganism of the present invention lowers the levels of C0X-2, a biomarker of arthritis, and Itumor necrosis factor-a (TNF- ⁇ ), an inflammatory cytokine, It has high industrial applicability in that it can be developed as a preventive and therapeutic agent for arthritis by showing the effect of alleviating the symptoms of arthritis in the arthritis animal model administered with Lycum IDCC 5101.

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Abstract

본 발명은 관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 및 이의 용도에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 관절염증의 바이오마커인 COX-2 및 염증성 싸이토카인인 tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 수치를 낮춰 관절염을 예방하고 증상을 완화시키는데 기여하는 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체 및 이를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체는 관절염 동물모델에서 농도 의존적으로 관절염 증상을 완화시켜 관절염 예방 및 치료효과가 있음을 확인하였다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 틴달화 클로스트리디움 부티리큼 및 이의 용도 [기술분야]
본 출원은 2015년 5월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제 1으2015-0062300호 를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 틴달화 클로스트리디움 부티리 쿰 및 이의 용도에 관한 발명으로， 보다 상세하게는 관절염의 바이오마커인 C0X-2 및 염증성 싸이토카인인 tumor necrosis f actor- α (TNF- α )의 수치를 낮춰 관절염 을 예방하고 증상을 완화시키는데 기여하는 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체 및 이를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
류마티스 관절염은 가장 흔히 접하는 염증성 관절염으로 침범된 관절의 활막 증식과 뼈 및 연골이 파괴되는 증상이다. 류마티스 관절염의 발병기전은 명확하지 않으나 관절염 동물모델이나 류마티스 관절염 환자의 활막에서 많은 종류의 싸이토 카인 발현이 보고되고 이들 싸이토카인의 억제가 관절염의 증상， 이학적 소견뿐만 아니라 관절파괴도 막는다는 연구결과들이 있어 질환의 발병과 지속에 싸이토카인 이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 류마티스 관절염의 발병기전은 명확하지 않고 여러 가지 모델이 제시되고 있는데 크게는 항원-특이적 기전과 항원-비특이적 기전으로 나눌 수 있다. 항원-특이적 기전의 경우는 원인이 되는 Τ세포 항원이 아 직 밝혀져 있지 않지만 바이러스나 세균에 의한 것으로 추정되며, 항원제시 세포 (Ant igen present ing cel l , APC)가 주조직 적합항원 (class I I major histochmpat ibi l i ty complex, MHC)을 통해 관절염 유발 펩타이드 (arthritogenic pept ide)를 T세포에 제공하여 T세포를 활성화시키고 활성화된 T세포가 자가항원 (sel f-ant igen)과 교차 반응 (cross-react )하여 대식세포를 자극함으로써 관절염이 시작된다. 항원-비특이적 기전의 관절염 발생은 반복되는 감염, 조직손상， 알레르기， 예방접종등과 같은 비특이적 자극에 의해 활막 내 대식세포가 활성화되고 활성화된 대식세포로부터 생산된 tumor necrosis factor- α (TNF—α)나 granulocyte- macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)등의 싸이토카인에 의해 수지상 세 포 (dendritic eel Is)의 분화가 유도되며 분화된 수지상세포가 강력한 항원제시 세 포로 기능하여 자가항원을 autoreactive T cell에 전달함으로써 T세포가 자극되어 관절염이 시작된다. 관절염이 유발된 후 활막에서 생산되어 paracrine 또는 autocrine으로 작용하는 싸이토카인들이 만성적인 관절 염증의 지속과 악화에 관여 하는 것으로 알려져 있다. 류마티스 관절염 조직 및 활액의 싸이토카인 발현에 대 한 연구에서 TNF-a, IL-Ιβ, IL—6, GM-CSF, IL-8 등과 같은 많은 종류의 염증성 싸이토카인의 발현이 밝혀졌고， IL-10, TGF-β와 같은 항염증성 싸이토카인과 IL-1 receptor antagonist (IL-lRa), soluble TNFR와 같은 염증성 싸이토카인 억제물질 의 발현 증가도 보고되었으나 이들 염증조절물질의 생성이 염증성 싸이토카인의 작 용을 중화시키기에는 충분하지 않은 것으로 생각되었다. 따라서 염증성 싸이토카인 을 포함한 염증물질과 항염증 물질 생성의 불균형에 의해 류마티스 관절염이 지속 되고 악화될 것으로 추측할 수 있다. 염증성 자가면역질환인 류마티스 관절염을 장 관면역올 통해 치료 및 개선하고자 하는 노력이 있었으며， 장관면역을 조절할 수 있는 소재로 유산균 (lactic acid bacteria)과 같은 프로바이오틱스를 사용한 연구 들이 있다. 류마티스 관절염 마우스 모델에서 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)의 섭취가 관절염 억제에 효과가 있었으며 (Life Science, 1998； 63(8) ： 635-644) , 루이스 래트 (Lewis rat)를 이용한 관절염 동물모델에서 락토바실러스 람 노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG)의 섭취가 관절염 억제에 효과가 있다고 보고되었다 (Journal of Nutrition, 2004； 134(8)； 1964-1969) . 선행연구에서 유산균 생균 (live cell)의 섭취 후 효능에 관한 것으로 장관면역의 자극 (immunostimulation)을 일정수준 유지하기 위해서는 일정수의 생균이 장관에 부착 해야함이 알려졌다. 그러나 유산균은 위장관을 통과하는 동안 위산과 담즙산에 의 한 공격으로 죽게 되어 장관 면역을 자극 시킬 수 있는 농도 이하가 되기 쉽다. 따 라서 부착능에 초점에 맞춰 유산균 생균을 오버도스 (overdose)투여함으로써 경제성 이 떨어지게 된다. 또한 류마티스 관절염 환자의 대부분이 관절염에 의한 통증반웅을 줄이기 위 해 NSAID 계열의 소염제나 항생제를 투여하는 현실에서 유산균 생균을 병용투여시 해당 약제에 의해 사멸되기 때문에 소기의 목적을 달성하는데 제한적이라는 문제점 이 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 선행연구의 투여 문제점을 해결하 기 위해 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 51이을 소재로 항염증 작용을 극대화할 수 있는 틴달화 (tyndal l izat ion)방법을 완성하고， 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101의 사균체가 류마티스 관절염 동물모델 실험에서 농도 의존적으로 관절염 완화 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 최종 완성하였다. 따라서， 본 발명의 목적은 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 클로스트리디 움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 균주 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포 함하는 관절염 예방 및 치료용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴달화 클로스트 리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 사균체를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 .및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예 방 및 치료용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주를 혐기 적으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체 및 배양액을 111~150°C , 0.6 ~
1.3 kgf/cm2에서 가압하여 사균화하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하여 관절염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 관절염 치료제 제조를 위한 용도를 제공하 는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 과제를 해결하기 위하여， 본 발명은 관절염 예방 및 치료 효과를 가지 는 클로스트리디움부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)을 제공한다. 본 발명의 다른 목적올 달성하기 위해 본 발명은 상기 균주 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 관절염 예방 및 치료 효과 를 가지는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 사균체를 유효성분으 로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 유효 성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주를 혐기 적으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체 및 배양액을 111~150°C , 0.6 ~
1.3 kgf/cm2에서 가압하여 사균화하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료 효과 를 가지는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체의 제조방법을 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 필요 로 하는 개체에 유효량으로 투여하여 관절염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 관절염 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 균주 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 조성물은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)이 포함되는 어떠한 형태의 조성물도 포함될 수 있으며， 바람직하게는 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물이 식품 조성물일 경우， 틴달화 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상 적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "식품" 은 육류， 소시지， 빵， 초콜릿， 캔디류， 스넥류, 과자류， 피자， 라면， 기타 면류， ¾류， 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프， 음료수， 차， 드링크제, 알코을음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통 상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사 용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용 하여 정제, 캅샐, 분말， 과립， 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품올 말 한다. 여기서 '기능성 '이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거 나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발 명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하 며， 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제 조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제 조될 수 았으며， 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발 생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고， 휴대성이 뛰어나， 본 발명의 건강기 능식품은 관절염 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다. 또한， 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제， 비타민， 전해질， 풍미제， 착색제， 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염， 유기산, 보호성 콜로이드 증점제， H 조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린， 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스， 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조 를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 흔합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제와 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나， 이에 제한되 지 않는다. 또한， 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당， 과 당과 같은 모노사카라이드， 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나， 사카 린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 lOOmL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 식품 조성물 중 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 51이의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방， 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 식품 또는 음 료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1 g (또는 당 본 발명의 균을 1 X 108내지 1
X 1010 개 (균수) 첨가하고， 바람직하게는 5 X 108 내지 5 X 109 개의 양으로 첨가한 다. 또한， 본 발명의 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 식품 조성물의 1 일 섭취량은 1 X 105 내지 1 X 1010 CFU/kg, 바람직하게는 l x iO6 내지 1 X K)8 CFU/kg 이고， 섭취는 하루에 한 번 섭취할 수도 있고， 수회 나누어 섭취할 수도 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물에서 균주의 유효용량은 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적 으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며， 유효성분은 안 전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있 음은 확실하다. 본 발명에서 상기 조성물이 약학적 조성물일 경우， 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC5101 이외에 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적 으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를로오스, 유당， 포비 돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘, 락토스， 만니를， 엿, 아라비아고무， 전호화전분， 옥수수전분, 분말셀를로오스， 히드록시프로필셀를로오스， 오파드라이， 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납， 합성규산알루미늄, 스테아린산， 스테아린산마 그네슘， 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슴， 백당， 덱스트로스， 소르비틀 및 탈 크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아 니다. 또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결 합제， 습윤제， 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함 되며， 이러한 고형제제는 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101에 적어도 하나 이상 의 부형제 예를 들면， 전분, 칼슘 카보네이트， 수크로오스， 락토오스 또는 젤라틴 둥을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동 결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크 로골， 트원 (tween) 61 , 카카오지, 라우린지， 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 한편， 주사제에는 용해제， 둥장화제， 현탁화제， 유화제, 안정화제， 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가포함될 수 있다. 또한， 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체， 부 형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edit ion, Al fonso, R.， ed, Mack Publ ishing Co . (East on, PA: 1995) )를 추가로 포 함할 수 있다. 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에 서 수용자에게 비독성이고， 완층용액， 예를 들어 인산， 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제 ; 쩌분자량 (약 10개 미만의 잔기) 플리펩티드; 단 백질， 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체， 예를 들 어 폴리비닐피를리돈; 아미노산， 예를 들어 글리신， 글루타민， 아스파라긴， 아르기 닌 또는 리신; 단당류， 이당류， 및 글루코스， 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제， 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니를 또는 소르비 를; 염 -형성 반대이온， 예를 들어 나트륨; 및 (또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들 어 트원， 폴루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이， 몸무게， 성 별, 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01
- 100 mg/kg/day이며， 바람직하게는 0.1 - 50 mg/kg/day이며， 더욱 바람직하게는 5
- 10 mg/kg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분 할 투여할 수도 있다. 본 발명에서 상기 관절염은 퇴행성 관절염 (osteoarthrit i s) , 류마티스 관절 염 (Rheumatoid arthr i t is) , 루프스 관절염 ( lupus arthr i t is) , 반웅성 관절염 (react ive arthrit i s) , 건선 관절염 등을 포함하며， 바람직하게는 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절염일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체를 제공한다. 멸균법에 있어서 근래에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 121°C에서 15분간 고온， 고압 멸균을 하는 것이다. 하지만， 고온， 고압 조건에서의 멸균을 견딜 수 없는 대상을 멸균하기 위해서 사용될 수 있는 방법이 틴달 멸균법이다. 본 발명에 서 사용되는 용어인 "틴달화" 는 당업계에서 일반적으로 사용될 수 있는 틴달 멸 균법에 의해 균이 사멸된 상태를 의미한다. 본 발명의 발명자들은 클로스트리디움 부티리큼을 틴달화 할 경우 우수한 관 절염 예방 및 치료 효과가 나타난다는 것을 발견하였고， 틴달화 조건에 따라서 항 염증 효과를 나타내는 물질의 균체로부터 추출성이 상이하기 때문에， 관절염 예방 및 치료에 최적화된 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101의 사균체를 생산하 기 위해 틴달화 온도 조건과 가압조건별 항염증 효과를 평가하여 틴달화 방법을 최 적화 하였다. 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 틴달화 온도조건을 90°C , 100 °C , 110°C 및 121°C에서 각각 10분간 가압 유지한 후， 다시 50°C로 냉각하고 다 시 각각의 온도로 상승시켜 5분간 가압 유지하고 40°C로 냉각시키는 방법으로 클로 스트리디움 부티리쿰을 틴달화 하였다 (실시예 2) . 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 상기 각 온도조건에서 틴달화된 클로스 트리디움 부티리큼의 항염증 효과를 cox-2 저해능을 통해 평가한 결과， m°c에서 틴달화한 클로스티디움 부티리쿰이 그 효과가 가장 우수하였다 (실시예 3) . 클로스 트리디움 부티리쿰을 9(rc , loo °c 및 iio°c에서 틴달화 하여 사멸시킨 사균체는
121°C에서 틴달화한 클로스티디움 부티리쿰 사균체와 비교해 C0X-2 저해능이 우수 하지，못했다. 이는 고압， 고온 조건하에서 균체를 멸균함에 따라 클로스트리디움 부티리쿰이 절편화 ( fragmentat ion)되어 크기가 작아지고， 항염증 효과를 나타내는 물질이 반웅할 수 있는 유리한 조건이 형성되었기 때문으로 사료된다.
상기 121°C에서 틴달화한 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체의 대식 세포의 염증성 싸이토카인과 항염증성 싸이토카인 분비에 미치는 영향을 평가한 결 과， 틴달화한 클로스티디움 부티리쿰 IDCC 5101이 양성 대조물질인 덱사메타손과 마찬가지로 염증성 싸이토카인인 TNF- α의 분비를 직접적으로 억제하는 작용이 있 음을 확인하였다 (실시예 4) . 또한， 틴달화한 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체를 관절염 동물 모델에 4주간 투여한 결과， 관절염 유발 이후 6일째부터 유 의적으로 관절염 증상이 완화되는 효과를 나타냈으며, 투여 종료 후에는 양성 대조 물질인 초록입 흥합추출유 투여군보다 1.5배 관절염 증상 완화효과가 우수한 것으 로 평가되었다 (실시예 5) . 뿐만 아니라, 실험동물의 뒷발을 적출하여 관절조직병리 를 평가한 결과， 틴달화한 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체를 투여한 군 에서 vehi cle군과 비교해 활막 증식 및 염증세포의 침윤이 현저히 감소해 관절염 증상 완화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다 (실시예 5) . 본 발명에서 상기 틴달화는 111 ~ 150 °C 에서 균을 사멸시키는 것을 의미하 며， 바람직하게는 111~150°C , 112-150 °C , 113-150 °C , 114-150 °C , 115- -1501
116- -150 , 117~150°C , 118- -150°C , 119- -150°C , lii- 445 °C , 112- -145 °C , 113- -145 °C
114- -145°C， 115-145 °C， 116- -145°C , 1Γ7- -145 °C ， 118- 445 °C， 119- -145 °C ' 111- -140 °C
112- -140 °C , 113~140°C , 114- -140 °C , 115- -140°C , 116- 440 °C， 117- -140°C , 118- 40 °C
119- -140 °C , 111-135 °C , 112- -135 °C , 113- '135 °C ， 114- 435 °C , 115- -135°C , 116- 435 °C
117- 35°C , 118- 135 °C， 119- -135°C , 111- -130°C ， 112- 30 °C , 113- '130°C , 114- -130 °C 115-130 °C , 116-130 °C , 117-130 °C , 118~130°C , 119-130 °C , 111-125 °C , 112-125 °C , 113-125 °C , 114-125 °C , 115-125 °C , 116~125°C 또는 117~ L25°C 에서 , 가장 바람직하 게는 118 - 125°C에서 가압멸균하여 균을 사멸시키는 것을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편， 상기 틴달화 온도가 lire 미만인 경우에는 사균체의 절편화가 층분하 게 이루어지지 않아 사균체가 항염증 효과를 나타내기에 유리한 조건이 형성되지 않으며， 상기 틴달화 온도가 150°C 초과인 경우에는 사균체의 활성성분이 변성을 일으켜 항염증 작용을 나타내지 못하기 때문에, 상기와 같은 틴달화 온도 조건의 설정이 항염증 효과를 나타내는 클로스트리디움 부티리쿰 ICDD 5101 사균체 제조에 있어서 매우 중요하다. 또한， 본 발명에서 상기 틴달화는 가압조건에서 균을 사멸시키는 것을 의미 하며, 상기 가압이란 상압조건인 1기압 (atm)을 기준으로 추가적인 압력이 가해지는 것을 의미한다. 즉， 본 발명에서의 상기 가압조건은 상압인 1기압 (atm)을 기준으로
0.1 ~ 1.3 kgf/cm2의 압력이 추가적으로 가해지는 것을 의미하며， 바람직하게는，
0.2 ~ 1.3 kgf/cm2' , 0.3 ~ 1.3 kgf/cm2' , 0.4 ~ 1.3 kgf/cm2' , 0.5 ~ 1.3 kgf/cm2' ,
0.6 -1.3 kgf/cm2' ， 0.7 ~ 1.3 kgf/cm2' , 0.8 ~ 1.3 kgf/cm2' , 0.2 ~ 1.2 kgf/cm2' ,
0.3 ~ 1.2 kgf/cm2' , 0.4 ~ 1.2 kgf/cm2' , 0.5 ~ 1.2 kgf/cm2' , 0.6 ~ 1.2 kgf/cm2' ,
0.7 ~ 1.2 kgf/cm2' , 또는 0.8 ~ 1.2 kgf/cm2' 일 수 있으며， 가장 바람직하게는 0.9
~ 1.1 kgf/cm2'일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 틴달화 압력이 0.1 kgf/cm2 미만인 경우에는 사균체의 절편화가 층분하게 이루어지지 않아 사균체가 항염증 효과를 나타내기에 유리한 조건이 형성 되지 않으며, 상기 틴달화 압력이 1.3 kgf/cm2'초과인 경우에는 사균체의 활성성분 이 변성을 일으켜 항염증 작용을 나타내지 못하기 때문에， 상기와 같은 틴달화 압 력 조건의 설정이 항염증 효과를 나타내는 클로스트리디움 부티리쿰 ICDD 5101 사 균체 제조에 있어서 매우 중요하다. 본 발명에서 상기 틴달화 클로스트리디움 IDCC 5101 사균체는 대식세포에서 종양괴사인자 - a ( tumor necrosi s f actor- α , TNF- α )의 발현을 억제함으로써 관절 염 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 관절염은 대표적인 만성 염증성 질환으로 체내 수많은 사이토카인 등의 작용 으로 염증 반웅이 일어나게 되는데 이러한 염증을 일으키는 대표적인 물질이 종양 괴사인자 - α (TNF- α )이다. TNF- a는 류마티스 관절염， 건선성 관절염， 크론병 , 건 선, 강직성 척수염과 같은 염증성 질환에 중요한 역할을 담당하고 있는 proinf lammatory사이토카인이다. 임상적으로 볼 때 과잉 생산된 TNF— α는 관절염 환자의 대식세포를 자극해 염증반응을 증폭시키는 염증성 매개체를 생산하고， 혈관내피세포에서 부착분자를 발현하게 해 더 많은 염증세포들이 염증이 일어난 부위로 모일 수 있도록 하며， 섬 유아세포로 하여금 단백 분해효소를 생산하게해 연골， 뼈， 인대 등에 손상을 입혀 질병을 악화시키게 된다. 뿐만 아니라， TNF- α는 혈관 내피세포에서 vascular cel lular adhesion molecule 1 (VCAM-1) , intercel lular adhesion molecule 1 ( ICAM-1)과 E-select in등과 같은 유착분자 (adhesion molecule) 발현을 증가시켜 염증세포의 침윤을 유도하며， 항 -TNF- α항체를 투여한 류마티스 관절염 환자의 활 막조직에서 T 림프구의 수가 감소하고 VCAM-1이나 E-select in의 발현이 억제되어 염증세포의 염증부위로의 이동에 TNF- a가 중요한 역할한다는 것이 알려져 있다. 또한 TNF- a는 prostaglandin (PG)의 생성에 관여하는 secretory phosphol ipase A2 (sPLA2) , cyclooxygenase-2 (COX-2)나 microsomal PGE2 synthase(mPGES)의 발현을 증가시켜 PG의 생성을 촉진하고， 또 다른 염증 물질인 nitric oxide (NO)의 생성에 관여하는 효소인 inducible NO synthase ( iNOS)의 발현을 촉진한다. 그 외에도 TNF- α는 활막 섬유아세포에 작용하여 세포증식을 촉진하여 활막 과형성 (synovial hyperplasia)와 섬유화를 유도한다. 상기한 바와 같이， TNF- α의 발현을 억제하는 것이 관절염의 치료 전략에 있 어서 핵심이 될 수 있으며， 본 발명의 발명자들은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101의 사균체가 대식세포에서 TNF- a의 발현을 억제한다는 것올 밝혀 관절염 치료 에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 4) .
한편， 본 발명에 따른 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101은 대식세포의 IL- 6 및 IL— 10 생성능에 큰 영향을 나타내지 못했고 (결과 미도시) , 상기한 바와 같은 TNF- a 생성 억제가 항염증 효과의 주요한 기전임을 알 수 있었다. 이에， 본 발명은 상기 사균체를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료 용 조성물을 제공하며, 본 조성물에 관하여는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명은 또한 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예 방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 조성물에 관하여는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에서 상기 배양액은 본 발명에 따른 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체， 상기 배양액을 여과 또는 원심 분리하여 균주를 제거한 여액 (여과액 또는 원심분리한 상등액)， 상기 배양액을 초 음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소 ( lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄 액 등을 포함하며, 바람직하게는 원심분리 후 상층액을 의미하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또한， 상기 배양액은 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물을 모 두 포함할 수 있다. 본 발명은 또한， 상기 사균체는 틴달화된 것임을 특징으로 하는 조성물을 제 공한다. 본 발명은 또한， 상기 틴달화는 111~150°C , 0.6-1.3 kgf/cm2에서 가압하여 사균화시키는 것임을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한， (a) 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주를 혐기적으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체 및 배양액을 111~150°C , 0.6-1.3 kgf/cm2" 에서 가압하여 사균화하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴 달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체의 제조방법을 제공한다. 바람직하게， 상기 (b) 단계의 사균체 제조 방법은 115~150°C , 0.1-1.3 kgf/cm2에서 7 ~ 15 분간 가압 유지한 후， 다시 45 ~ 55°C로 넁각하고 다시 각각의 온도로 상승시켜 3 ~ 7 분간 가압 유지하고 35 - 45 °C로 냉각시키는 방법으로 클 로스트리디움 부티리쿰을 틴달화 하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 사균체 제조방법은 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 을 배양액으로부터 분리하여 균체만을 틴달화 할 수도 있으며， 상기 균주가 포함된 배양액 자체를 틴달화하여 균주를 사멸화시킬 수 있다. 바람직하게는， 상기 (a) 단계 이후에 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 배양한 배양액을 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하는 단계, 상기 배양액을 농 축하여 농축액을 제조하는 단계 및 상기 농축액과 미리 분리한 클로스트리디움 부 티리쿰 IDCC 5101 균체를 흔합하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한， 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하여 관절염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한， 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 관절염 치료제 제조를 위한 용도를 제공한 다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때， 암의 치료 및 예방 효과 또는 암 전이 억제효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체' 란 동물, 바람 직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세 포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (pat ient )일 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체는 관절염의 바이오 마커인 C0X-2 및 염증성 싸이토카인인 tumor necrosis factor- a (TNF- α ) 의 수치를 낮출 뿐만 아니라， 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체 를 투여받은 관절염 동물모델에서 관절염 증상이 완화되는 효과가 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 관절염 예방 및 치료 효능을 가진 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 원료를 나타낸 사진이다. 도 2는 틴달화 공정조건에 따른 염증성 단백질인 C0X-2 저해효과를 western blott ing 방법으로 비교한 결과이다 (T121 ： 121°C , 1.0 kgf/cm2에서 틴달화， T110 ：
110 °C , 0.6 kgf/cm2에서 틴달화， T100 ： 100 °C , 0.1 kgf/cm2에서 틴달화, T90 ： 90 °C
,0 kgf/cm2에서 틴달화) . 도 3은 틴달화 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101이 염증성 싸이토카인인 TNF- α분비에 미치는 영향을 나타낸 결과이다. 도 4는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101의 관절염 모델동물에서 관절염 증상 완화 효과를 나타낸 결과이다.
' 도 5는 틴달화 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101을 투여한 관절염 동물모 델에서 염증개선 효과를 조직병리학적 분석으로 나타낸 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
항염활성 우수균주의 선발
본 발명자들은 류마티스 관절염에 대한 항염 효과가 우수한 균주를 선발하기 위해 일동제약에서 보유하고 있는 면역관련 프로바이오틱스 50종을 대상으로 항염 활성을 확인하였다. 항염 활성은 Raw cel l 264.7 cel l에 각 프로바이오틱스의 생균 및 틴달샘플을 처리하여 C0X-2 저해효과를 통해 선발하였다. 각 샘플의 C0X-2 저해 효과는 western blott ing 방법을 통해 확인하였다. 프로바이오틱스 생균 50종과 틴 달 50종의 샘플 중 가장 높은 항염효과를 나타낸 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 최종 선발하였다.
그 결과 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101이 가장 우수한 항염증 효능을 나타냈으며, 이를 한국 미생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC12738BP) .
<실시예 2>
항염증 효과가우수하클로스트리디응부티리쿰 최적 틴달화조건 설정 관절염 예방치료에 최적화된 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 생산하기 위해 틴달화를 통해 균체를 사균화하였다. 틴달화 조건에 따라서 항염물 질이 균체로부터 추출성이 상이하기 때문에 틴달화 온도와 가압조건별 항염효과를 평가하여 최적화하였다. 클로스트리디움 부티리쿰 종균을 800L/1KL 발효조에서 멸균된 틴달화 생산배 지인 CBT 배지 (포도당 (w/v) , 펩톤 0.1%(w/v) , 탈지분유 0.1% (w/v) )에 무균적 으로 접종하고 16시간 혐기적으로 배양하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이， 틴 달화 온도조건을 90°C , 100 °C , 110 °C , 121°C에서 각각 10분간 0~1.0 kgf/cm2가압유 지한후， 다시 50°C로 냉각하고 다시 각각 온도로 상승시켜 5분간 0~1.0 kgf/cm2가 압유지하고 40°C로 넁각시켜 틴달화하였다.
【표 1】
항염증 작용이 우수한클로스트리디움부티리쿰 IDCC5101의 틴달화조건
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틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101을 20배 감압농축하고 최초 배 양액의 1/10 양에 해당하는 부형제를 흔합한 후， 45T：， 20시간동안 건조하여 최종 온도-압력별 틴달화된 클로스트리디움부티리쿰 원료를 생산하였다. <실시예 3>
조건별 틴달화된 클로스트리디움 부티리큼의 C0X-2 저해효과
각각의 조건별 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101의 항염작용을 측정하기 위해 C0X-2 저해효과를 측정하여 최종 공정을 선발하였다. 보다 자세하게
C0X-2 저해효과 측정법은 다음과 같다. Raw 264.7 cells을 2.5 x 105 cells/ml이 되 도록 준비하고 6-well plate에 2 ml/well에 최종 5.0 x 10¾ cells/well이 되도록 하 며， 24시간 overnight하여 배양한다. 각 well에 LPS (2 ug/ml농도)를 4 ul씩 처리 하고 24시간 overnight 배양하였다. 배양이 종료되면 BCA법으로 단백질 정량을 하고 10% SDS-polycryl amide gel 에서 정기영동으로 분리하고 poly vinyl idene di fluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 100V, 120분 조건으로 전이시켰다. 전이가 종료되면， membrane 을 분리하고 blocking solution (5% skim mi lk를 함유한 0.1% TBST buffer 20 ml) 에 담근 뒤 shaking하면서 30분~1시간 정도 blocking시킨 후, 0.1% TBST buffer로 washing한 뒤, 1차 항체 (C0X-2 및 β-actin)와 반웅시켰다. COX-2 antibody ( 1： 1000, Cell Signaling, USA), β -act in antibody (1 ： 5000, Cell Signaling, USA) 를 이용하여 4°C에서 overnight 반응하였다. 이후， 0.1% TBST buffer로 washing, 2 차 항체 (anti-rabbit polyclonal antibody)와 1시간 30분 반응시켰다. 0.1% TBST buffer로 washing한 후， membrane을 0HP 필름위에 놓고 west -one substrate를 이용 하여 적셔주고， Chemi Dox를 이용하여 단백질 발현을 검출하여 저해정도를 상대 비 교하였다. 이에 대한 결과를 상기 표 1 및 도 2에 나타내었다. 상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이， 121°C-1.0 kgf/cm2에서 틴달화한 클 로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101이 C0X-2 저해효과가 가장 우수하였다. 이는 고 압, 고온 조건하에서 균체를 멸균함에 따라 클로스트리디움 부티리쿰이 절편화 (fragment at ion)되어 크기가 작아지고， 이에 따라 대식세포와 반옹할 수 있는 유리 한 조건이 형성되었기 때문으로사료된다.
<실시예 4>
싸이토카인 (cytokines) 조절을 통한 항염증 효과 평가 실시예 1에서 도출한 T121의 틴달화샘플에 대한 염증성 싸이토카인과 항염증 성 싸이토카인에 미치는 영향을 확인하기 위해 배양한 Raw 264.7 cell을 스크래퍼 (scrapper) 흑은 trypsinize를 사용하여 회수한 뒤， 15 ml falcon tube에 넣고 500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 뒤 1 ml의 complete media를 넣어 재현탁시켜 1 ml당 세포수를 계수하였다. 250,000/ml이 되도록 회석하였다. 6-well plate 각 well에 희석한 cells 2 ml를 넣고 24시간 overnight하여 배양하였다. 6- well plate 각 well의 배지를 sucktion한 후 PBS로 washing하였다. 새 배지를 2 ml 씩 분주한 후 모든 well에 LPS 4 ul씩 (최종 LPS 농도는 2 ul/ml) 처리하고 1번째 well에는 1 mM 텍사메타손 (dexamethasone)을 양성대조물질 (positive control)로 20 ul (최종농도 10 uM/ml) 처리하였다. 나머지 well에는 음성대조군 (negative control)로 PBS와 1/50회석농도인 T121 틴달화 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 샘플 (ID-CBT5101)을 10%씩 처리한 후， 24시간 overnight 하여 배양하였다. 각 well 의 배양액을 15 ml falcon tube에 옮겨 담은 후, 9，500 rpm으로 5분간 원심분리하 였다. 각 tube의 상등액을 따로 회수하여 싸이토카인 실험에 사용하였다. 염증성 싸인토카인 (inflammatory cytokine)인 TNF- α와 항염증성 싸이토카인 (anti¬ inflammatory cytokine)인 IL-10을 통해 항염증 작용을 확인하기 위해 ELISA kit (R&D system)를 사용하였다. 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이， 121°C-1.0 kgf/cm2에서 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (ID-CBT5101) 사균체는 양성대조물질인 덱사메타손과 마찬가지 로 염증 유발 싸이토카인인 TNF-α를 억제하는 작용을 하는 것으로 나타났다. 이와 대조적으로 항염증 기작을 나타내는 싸이토카인인 IL-10와 분비량을 늘리지는 못하 는 것으로 확인됨으로써 (결과 미도시), 본 발명에 따른 틴달화된 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 (ID-CBT5101) 사균체는 염증완화에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
관절염 동물모델에서의 항염증 효능 평가 <5-1>관절염 동물모델 확립
6주령 수컷 Lewis rat (오리엔트바이오사)을 구입하여 1주일 순화기간을 거 친 후 사용 하였다. 동물 사육실 환경은 항온 (22±2°C), 항습 (50~60¾을 유지하 였고 광주기 (08:00-20:00) 및 암주기 (20 :00-08:00)를 12시간 간격으로 조절하였 다. 동물은 poly-sulfone cage에 3마리 혹은 2마리씩 분리하여 사육하였고 사료와 물은 24시간동안 자유급식으로 공급하였다. 시험물질 각 군당 9마리로 4군， 총 36 마리를 사용하였고 각 군은 vehicle, 양성대조군 (초톡잎흥합추출유로써 100mg/kg)，
ID-CBT5101 5χ108, δχΐθ' CFU/rat 투여군이다. 관절염 유발을 위해 Chondrex사에서 구입한 Com lete Freund" s Adjuvant (CFA) (M. tuberculosis 10 mg/ml in mineral oil) 100 ul를 rat 꼬리 기저부에 피내 투여하였다. 투여 후， 11일차부터 관절염 증상이 나타나기 시작하였고 13일차에는모든 rat에서 관절염 증상이 나타났다.
<5-2> 틴달화클로스트리디음부티리큼 IDCC 5101 효능평가
시험물질은투여 직전에 조제하여 하루 한 번 경구로 투여하였다. 투여 기간 은 CFA 투여일부터 4주간 이었다. 양성대조군인 초록잎홍합추출유는 100 mg/kg으로 투여하였으며, 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (ID-CBT5101)은 5χ1(Λ
5xl09 CFU/ml/rat 용량으로 투여하였다. CFA 투여 후, 13일째부터 주 2회 관절염 clinical score를 측정하였다. 측정방법은 하기 표 2와 같다. 각 발의 점수는 0~4 점 사이이며, 네 발 점수의 합을 관절염 clinical score로 나타내었다.
【표 2】
관절염 중증도 평가 점수 시스템
Figure imgf000020_0001
이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이， 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 510KID- CBT5101)올 투여한 실험군 모두에서 농도 의존적으로 관절염 치료효과를 나타내었 으며， 특히， 5 X 109 CFU용량으로 투여한군에서 관절염 유발 (D13)이후 7일째 (D20) 부터 유의적으로 관절염증상이 완화되는 것을 확인할 수 있었으며, 투여 종료 후에 는 양성대조물질인 초록입홍합추출유 투여군보다 1.5배 관절염증상 완화효과가 높 은 것으로 평가되었다.
<5-3> 관절조직병리 평가
마지막 시험물질 투여 24시간 후, 동물을 안락사시키고 뒷발을 적출하였다. 10% 중성 포르말린용액으로 고정시킨 후， 8 > 포름산과 8% 염산을 1 ： 1로 섞은 용 액에 담궈서 탈석회시켰다. 탈석회 완료 후， 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라 핀 블럭올 만들고 5 urn 두께로 잘라 조직슬라이드를 제작하였다. H&E 염색 후， 광 학현미경으로 관찰하여 조직 병리를 평가하였다. 모든 실험결과는 평균 士 표준오 차로 표시하였으며， vehicle 군과 시험물질군과의 비교는 Studenr s t-test (Microsoft Off ice Excel 2010 이용)를 하여 p 값이 5% 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다. 조직병리 평가를 위해 뒷발 조직슬라이드를 제작하고 H&E 염색 후 광학현미 경으로 관찰한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이， 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 ( ID-CBT5101) 투여군 모두에서 vehicle군 대비 활막 증식 및 염증세포 침윤이 감소하였으며 감소 정도는 ci l inical score 감소 정도와 비례함올 확인할 수 있었다. 양성대조물질인 초톡입홍합추출유 투여군과 ID-CBT5101 5 x 108 CFU 투 여군은 활막 증식 및 염증세포 침윤 감소가 vehicle군 대비 가벼운 수준이었고，
ID-CBT 5 X 109 CFU 투여군은 양성대조군과 ID-CBT5101 5 x l f CFU 투여군보다 더 우수한 활막 증식 및 염증세포 침윤감소를 보여 조직병리 결과에서도 우수한 관절 염 완화 효능을 확인할 수 있었다. 이상의 설명으로부터， 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
【산업상 이용가능성】 본 발명의 틴달화된 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 사균체는 관절염의 바이오 마커인 C0X-2 및 염증성 싸이토카인인 Itumor necrosis factor- a (TNF- α ) 의 수치를 낮추고， 틴달화된 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체를 투여받 은 관절염 동물모델에서 관절염 증상을 완화시키는 효과를 나타내 관절염 예방 및 치료제로 개발될 수 있다는 점에서 산업상 이용가능성이 높다.
【수탁번호】
기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
수탁번호 ： KCTC12738BP
수탁일자 ： 20141230
국 제 양 식 특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명
국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신:이 정 지
(137-733) 대한민국 서울특별시 서초구 바우뫼로 27길 2 일동제약 미생물의 표시
기탁자가첨부한 미생물 식별에 대한표시:
국제 기탁기관이 부여한 수탁번호:
KCTC 12738BP
Clostridium butyricum IDCC 5101
Π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지
항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:
[X] 과학적 성질의 설명
[ ] 제안된 분류학상의 위지
(적용시 X표시)
m. 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2014년 12월 30일에 기탁된 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였다.
IV. 이관청구의 수령 본국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.
V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을 가진 자 명청: Korean Collection for Type Cultures
또는 권한을 부여받은공무원 서명:
주소: (305-806) 대한민국 대전 유성구
박두 상 센터장
과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB)
서명일: 2015. 01. 20.
BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지
(원문과상위 없음을확인함) 대리인 ： 변리人 이 희
Figure imgf000023_0001

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 클로스트리디움 부티리큼 IDCC 5101 균 주 (기탁번호: KCTC12738BP) .
【청구항 2】
제 1항의 균주 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용조성물.
【청구항 3]
관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴달화 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체.
【청구항 4】
겨 13항에 있어서， 상기 틴달화는 111~150°C , 0.6 ~ 1.3 kgf/cm2에서 가압하여 사균화하는 것임을 특징으로 하는 사균체.
【청구항 5]
제 3항의 사균체를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용조성물.
【청구항 6]
클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
【청구항 7]
제 6항에 있어서， 상기 사균체는 틴달화된 것임을 특징으로 하는조성물.
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 틴달화는 111-1501；， 0.6 ~ 1.3 kgf/cm2에서 가압하여 사균화하는 것임을 특징으로 하는조성물.
【청구항 9】
(a) 클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주를 혐기적으로 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 균체 및 배양액을 111~150°C , 0.6 ~ 1.3 kgf/cm에서 가압하여 사 균화하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료 효과를 가지는 틴달화 클로스트리 디움 부티리쿰 IDCC 5101 사균체의 제조방법.
【청구항 10]
클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 배양액을 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하여 관절염을 예방 하거나 치료하는 방법 .
【청구항 111
클로스트리디움 부티리쿰 IDCC 5101 균주 (기탁번호: KCTC12738BP)의 사균체 및 상기 균주의 관절염 치료제 제조를 위한 용도.
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