WO2016163385A1 - レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイス - Google Patents

レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイス Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a laser microdissection apparatus, an analysis apparatus including the laser microdissection apparatus, a sampling method, and a device used in the laser microdissection apparatus.
  • a laser microdissection apparatus having excellent workability from collection to analysis.
  • the present invention relates to an analysis apparatus including a laser microdissection apparatus excellent in workability, a sample collection method, and a device used in a laser microdissection apparatus excellent in workability.
  • mass spectrometry imaging that displays what kind of molecules are included in the sample being observed with a microscope is desired rather than simply taking out the sample and analyzing it.
  • a mass microscope that can observe a biological sample with a microscope and perform mass analysis on the biological sample is commercially available.
  • a sample is irradiated with laser light, and the irradiated portion of the sample is ionized for mass analysis (hereinafter referred to as “ionized laser light”). "). Therefore, in order to continuously analyze a sample, after irradiating the sample with ionized laser light, the sample is moved by a length corresponding to the diameter of the ionized laser light, and again irradiated with ionized laser light. It is possible to analyze continuously.
  • the biological sample in the portion irradiated with the ionizing laser beam cannot be completely ionized, and there is a problem in the quantitativeness of the analysis result.
  • the conventional mass microscope is simply a combination of a microscope and a mass spectrometer, and there is a problem that the apparatus becomes large.
  • the present inventor has (1) using a heat-meltable film, once affixing a small piece to the film and performing mass spectrometry on the film, thereby covering a certain part on the living tissue. It is possible to cut out small pieces with positional information and to enable high-sensitivity mass spectrometry that suppresses peaks that contain extraneous materials.
  • LMD Laser microdissection device
  • Non-Patent Document 1 can arrange a continuous minute region of a sample on a heat-meltable film at a desired interval and associate the position coordinates of the sample and the position coordinates of the heat-meltable film with 2 Dimensional and three-dimensional mass imaging can be performed.
  • the LMD described in Non-Patent Document 1 has been developed on the basis of an inverted microscope in consideration of use in a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS). Since the optical system for observing the sample of the inverted microscope is arranged on the lower side of the apparatus, the LMD described in Non-Patent Document 1 is a hot melt that adheres the collected sample onto the slide on which the sample is placed. The dispersive film is disposed, and the light source of the dissection laser light is disposed above.
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer
  • the bonding surface of the sample of the hot melt film faces downward, when dropping the reagent solution for analysis etc. on the bonded sample, the hot melt film is once taken out from the LMD and the sample of the hot melt film is bonded.
  • the surface needs to face up. Therefore, there is a problem that the work becomes complicated and the analysis efficiency is poor.
  • Non-Patent Document 1 irradiates a laser beam with a heat-meltable film in contact with the sample.
  • the sample surface has irregularities at the micro level, and a gap is formed between the heat-meltable film and the sample.
  • a commercially available heat-meltable film is a flat film having no partition or the like. Therefore, when the reagent solution for analysis is dropped onto the heat-meltable film to which the sample is adhered, the reagent solution for analysis diffuses on the heat-meltable film, which may cause contamination. In order to prevent contamination, it is conceivable to widen the interval at which the sample is bonded. However, if the interval at which the sample is bonded is widened, the number of sample spots that can be analyzed per hot-melt film is reduced, and the analysis efficiency is increased. There is a problem that decreases.
  • the present invention is an invention made to solve the above-mentioned conventional problems, and as a result of intensive research, the LMD has a sample on the upper side and a device having a heat-meltable film for bonding the collected sample on the lower side. Deploy. Then, when the disection laser beam is irradiated from below the device, the collected sample adheres to the upper surface of the device, so that the reagent solution for analysis can be directly dropped and the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a laser microdissection apparatus, an analysis apparatus including the laser microdissection apparatus, a sampling method, and a device used in the laser microdissection apparatus.
  • the present invention relates to a laser microdissection apparatus, an analysis apparatus including the laser microdissection apparatus, a sampling method, and a device used in the laser microdissection apparatus described below.
  • a sample moving means for holding a slide on which a sample is placed and moving the slide in a horizontal direction and a vertical direction;
  • a device moving means capable of mounting a device having a heat-meltable film for transferring a sample and moving the device in a horizontal direction;
  • a laser irradiation unit for irradiating a sample with a dissection laser beam, cutting out a sample of the portion irradiated with the dissection laser beam, and adhering the sample to a heat-meltable film,
  • Storage means for associating and storing the position coordinates of the sample where the dissection laser beam is irradiated and the position coordinates of the heat-meltable film where the sample is adhered; and the position coordinates and heat of the sample stored in the storage means
  • a moving means drive control unit for driving and controlling the sample moving means and the device moving means, Including The dissection laser light irradiates the sample through the device from below the device.
  • Laser microdissection device (2) The laser microdissection apparatus according to (1), further including a pressing unit that presses the device having the slide and the heat-meltable film. (3) The laser microdissection apparatus according to (2), wherein the pressing means is a frame body that holds the slide. (4) The sample moving means has an arm for holding the frame, The laser microdissection apparatus according to (2) or (3), wherein the pressing means includes the arm. (5) The sample moving means has a motor that drives an arm that holds the slide, The laser microdissection apparatus according to (3) or (4), wherein the pressing means includes at least the motor and the arm, and the motor biases the arm toward the device with the motor.
  • the laser microdissection apparatus according to any one of (1) to (5) above, comprising a substrate and a device having a heat-meltable film for transferring a sample formed on the substrate.
  • the laser microdissection apparatus according to (6) wherein the surface of the heat-meltable film is formed with regions having different hydrophilicities, and a region with high hydrophilicity is surrounded by a region with low hydrophilicity.
  • a sampling method for collecting a sample on a device having a heat-meltable film using a laser microdissection apparatus Superimposing the position of the sample to be collected on the position of transferring the sample of the heat-meltable film of the device; A pressing step for press-bonding the heat-meltable film and the sample of the device; A sample collection step of irradiating the dissection laser light from below the device, cutting out a sample of the portion irradiated with the dissection laser light, and adhering the sample to the heat-meltable film,
  • a sampling method comprising: (11) A device used in a laser microdissection apparatus, The device includes a substrate and a hot-melt film formed on the substrate for transferring a sample, A device in which the surface of the heat-meltable film is formed of regions having different hydrophilicities, and a region having a high hydrophilicity is surrounded by a region having a low hydrophilicity. (12) The device according to (11), wherein a conductive layer is formed between the heat
  • a sample is disposed on the upper side, and a device having a heat-meltable film for bonding the collected sample is disposed on the lower side. Therefore, since the collected sample adheres to the upper surface of the device, it is possible to drop the reagent solution for analysis or the like after the LMD without performing an operation such as inversion. Therefore, the configuration of the apparatus can be simplified and the working efficiency is improved.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of an LMD 1 (portion surrounded by a dotted line in FIG. 1) of the present invention.
  • FIG. 2 is a drawing-substituting photograph showing an outline of the sample moving means 3.
  • FIG. 3 is a diagram showing an operation example of the first embodiment of the pressing means.
  • FIG. 4 is a diagram showing a second embodiment of the pressing means.
  • FIG. 5 is a top view of the device 20 of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the relationship between the position coordinates of the sample where the dissection laser beam is irradiated and the position coordinates of the heat-meltable film 22 to which the collected sample adheres, and the samples 34a, b, c in FIG. 6 (1).
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of an example of the LMD 1 of the present invention and a schematic diagram of the system.
  • FIG. 8 is a drawing-substituting photograph in which water was dropped onto a region having a high hydrophilicity of the device produced in Example 2.
  • FIG. 9 is a drawing-substituting photograph
  • FIG. 9 (1) is a photograph taken from the side of the pressing means produced in Example 3
  • FIG. 9 (2) is a photograph taken from the bottom.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting photograph
  • FIG. 10 (1) is an enlarged photograph of the device surface of Example 5
  • FIG. 10 (2) is an enlarged photograph of the device surface of Example 6, and
  • FIG. 10 (3) is Comparative Example 1. It is an enlarged photograph of the device surface of.
  • the laser microdissection apparatus the analysis apparatus including the laser microdissection apparatus, the sampling method, and the devices used for the laser microdissection apparatus of the present invention will be described in detail.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of the LMD 1 of the present invention (portion surrounded by a dotted line in FIG. 1).
  • the LMD 1 (a) mounts a device having a heat-meltable film for transferring a sample.
  • Device moving means 2 that can move the device in the horizontal direction
  • sample moving means 3 that holds the slide on which the sample is placed and can move the slide in the horizontal and vertical directions
  • sample A laser beam irradiation unit 4 a storage unit (not shown), and a moving unit drive control unit for cutting out a sample of the portion irradiated with the die section laser beam and bonding the sample to the hot melt film as a sample to be sampled are provided. At least.
  • the LMD 1 of this invention irradiates a disection laser beam from the downward direction of a device
  • the laser irradiation part 4 is arrange
  • the LMD 1 shown in FIG. 1 further includes a light source 5 that emits light for observing a collected sample and an imaging device 6 such as a CCD for acquiring an image.
  • the sample collected by the LMD 1 of the present invention may be analyzed by a known analysis method (apparatus).
  • FIG. 1 shows an example of combination with LC-MS.
  • the device after the sample is collected is sent to the liquid handling unit 7 by the device moving means 2, and a solution for LC-MS analysis is dropped onto the device. Subsequently, it is analyzed by LC-MS.
  • an analyzer including chromatography such as HPLC-fluorescence spectrometer, HPLC-electrochemical detector by liquefying a sample adhered to a heat-meltable film
  • Elemental analyzers such as electron beam microanalyzers, X-ray photoelectron spectrometers, nucleic acid sequence analyzers that amplify genes by PCR or LCR and analyze DNA sequences contained in samples using sequencers, nucleic acids contained in samples Examples thereof include a DNA chip that hybridizes DNA to a template, and a microchip analyzer such as an antibody chip that reacts an antibody with a protein.
  • the LMD1 of the present invention can also be incorporated into the analyzer as a sample collection device for the mass spectrometer, the analyzer including the chromatography, the element analyzer, the nucleic acid sequence analyzer, and the microchip analyzer. Further, when the LMD1 of the present invention is used, the collected sample can be adhered and arranged on the heat-meltable film at a desired interval, and therefore, it can be used as a production apparatus for producing a DNA chip or an antibody chip, for example.
  • the device moving means 2 shown in FIG. 1 includes a device mounting table on which a device can be mounted, a driving source (not shown) for moving the device mounting table in the horizontal direction (X and Y axis directions), and the driving source.
  • a driving force transmission mechanism for transmitting the driving force to the device mounting table is included.
  • a driving source a pulse motor, an ultrasonic motor, or the like may be used.
  • the driving force transmission mechanism may be a known one such as a driving force transmission mechanism for driving a device (chip) mounting table used in a microscope or the like in the horizontal direction.
  • FIG. 2 is a photograph showing an outline of the sample moving means 3.
  • the sample moving means 3 shown in FIG. 2 has an arm 32 on which a slide on which a sample is placed can be placed at one end and the other end can be attached to an arm column 31, and the arm 32 is placed in the horizontal direction (X, Y axes).
  • Arm struts 31 that can rotate and move in the vertical direction (Z-axis direction) are included.
  • a driving source for rotating the arm 32 in the horizontal direction and moving in the vertical direction and a driving force of the driving source are transmitted to move the arm 32 in the rotating and vertical direction.
  • a driving force transmission mechanism is included.
  • a driving source a pulse motor, an ultrasonic motor, or the like may be used.
  • the driving force transmission mechanism may be a known arm mechanism that can rotate in the horizontal direction and move in the vertical direction, such as an arm mechanism for moving the sample of the automatic analyzer.
  • the sample moving means 3 is not limited to the embodiment illustrated in FIG. 2, and there is no particular limitation as long as the sample can be moved in the horizontal direction and the vertical direction.
  • LMD1 of this invention contains the press means which crimps
  • FIG. 2 shows an example in which the pressing means is formed by a heavy frame 33 made of a metal such as stainless steel or titanium.
  • FIG. 3 is a diagram showing an operation example of the first embodiment of the pressing means.
  • FIG. 3 (1) is a side view showing a state before pressing, and the frame 33 as a pressing means has a substantially convex cross section, and can slide in a frame insertion hole formed at the tip of the arm 32. It is inserted to become.
  • a slide 35 on which the sample 34 is placed can be detachably attached to the lower part of the frame 33, and for example, a locking groove, a locking spring mechanism, and the like are formed.
  • a device 20 including a substrate 21 and a heat-meltable film 22 for transferring a sample formed on the substrate 21 is placed on the device moving means 2 of the LMD 1.
  • the upper portion 331 of the frame 33 is formed larger than the frame insertion hole so that the frame 33 is locked to the arm 32.
  • the frame 33 is lowered by lowering the arm 32 downward, and the frame 33 is lowered by lowering the arm 32 even after the sample 34 comes into contact with the heat-meltable film 22.
  • the sample 34 can be pressure-bonded to the heat-meltable film 22 by the weight.
  • the degree of pressure bonding between the sample 34 and the heat-meltable film 22 may be adjusted by the weight of the frame 33.
  • the shape of the frame 33 is not particularly limited as long as it can be slidably inserted into the arm 32, and may be appropriately adjusted to a circle, square, rectangle, or the like according to the shape of the slide on which the sample is placed.
  • the frame 33 when observing the sample collection state or the like, may be formed in a hollow shape so that it can be observed from above the frame 33. Further, as shown in FIG. 3 (3), in order to prevent displacement when the sample 34 comes into contact with the heat-meltable film 22, a displacement preventing member made of silicon rubber, synthetic rubber or the like is used for the frame 33. May be provided.
  • FIG. 4 is a diagram showing a second embodiment of the pressing means.
  • a locking groove or the like to which a slide 35 on which a sample 34 is placed can be detachably attached is formed on the arm 32.
  • the sample 34 comes into contact with the heat-meltable film 22 by lowering the arm 32 downward. After the contact, the sample 34 can be pressure-bonded to the heat-meltable film 22 by the weight of the arm 32 by releasing the transmission between the arm 32 and the driving force transmission mechanism.
  • the slide 35 on which the sample 34 is placed is attached to the arm 32, but the slide 35 is attached to the frame 33 so that the frame 33 can be attached to and detached from the arm 32.
  • the frame body 33 does not need to slide with respect to the arm 32, and needs to be fixed to the arm 32.
  • the pressing means is constituted by the frame 33 and the arm 32, the sample 34 can be pressure-bonded by the hot-melt film 22.
  • the pressing means is formed by the frame 33 and / or the arm 32.
  • the driving source And you may comprise a press means including a driving force transmission mechanism.
  • the arm 32 and the driving force transmission mechanism are not released and the arm 32 can continue to be urged downward. That's fine.
  • the first to fourth embodiments are embodiments in which the pressing means is configured by using the members constituting the LMD 1, but the pressing means is not particularly limited as long as the sample 34 and the heat-meltable film 22 are pressure-bonded.
  • the pressing means may be formed by a clamping means that sandwiches the slide 35 and the device 20 from above and below.
  • the sample 34 and the heat-meltable film 22 can be brought into close contact with each other. As a result, the gap between the sample 34 and the heat-meltable film 22 can be eliminated when irradiating the dissection laser beam, so that the sample cutting accuracy can be improved.
  • FIG. 5 is a top view of the device 20 of the present invention.
  • the device 20 of the present invention is characterized in that the surface of the heat-meltable film 22 is formed in regions having different hydrophilicities.
  • the region 221 with high hydrophilicity is formed in a circular shape, and the region 221 with high hydrophilicity is surrounded by a region 222 with low hydrophilicity.
  • the “region with high hydrophilicity” and the “region with low hydrophilicity” mean not the absolute value of the hydrophilicity but the relative level of the hydrophilicity between the two regions.
  • the device 20 of the present invention is not particularly limited as long as a relatively low hydrophilic region is formed around a high hydrophilic region.
  • a mask having a hole in a portion corresponding to a region having a high degree of hydrophilicity may be covered and subjected to a hydrophilic treatment.
  • a hydrophobic treatment may be performed by covering a mask having a hole in a portion corresponding to a region having low hydrophilicity.
  • Hydrophilic treatment may be performed by a known method, and examples thereof include plasma treatment, surfactant treatment, PVP (polyvinylpyrrolidone) treatment, and photocatalyst.
  • the heat-meltable film 22 exposed from the mask can be plasma-treated for 10 to 30 seconds to introduce hydroxyl groups on the surface.
  • the hydrophobization treatment may be performed by a known method, and examples thereof include hexamethyldisilazane (HMDS) treatment and treatment with a fluorine compound such as a trifluoromethyl group.
  • HMDS hexamethyldisilazane
  • a water-repellent ink such as a fluororesin ink, an organosilane, a silicon ink, or an alkali-soluble resist ink may be printed by an inkjet printer or the like.
  • a well can be produced by hydrophilizing and / or hydrophobizing the surface of the heat-meltable film 22.
  • the well of the device 20 of the present invention is a substantially planar well formed by modifying or coating the surface of the heat-meltable film 22 at the atomic level, and is a well (well) for inserting a solution or the like. It is different from some known microplates.
  • the surface of the heat-meltable film 22 is a substantially planar state, the adhesiveness with a sample is not inhibited in the case of a die section. Further, even if the analysis reagent solution is dropped on the high hydrophilicity region after the sample is adhered to the high hydrophilicity region by LMD, no contamination occurs because the analytical reagent solution does not flow outside the well.
  • the size and shape of the region with high hydrophilicity may be appropriately adjusted according to the analysis method of the sample collected by LMD. For example, when performing LC-MS or nucleic acid amplification, it is sufficient to set the size so that at least the amount of analysis reagent solution necessary for analysis stays in a region with high hydrophilicity due to surface tension.
  • the substrate 21 is not particularly limited as long as it can pass the dissection laser light and can form the heat-meltable film 22.
  • the substrate 21 may be made of glass or light transmissive resin.
  • the heat-meltable film 22 may be laminated on the substrate 21 using spin coating or the like.
  • the heat-meltable film 22 is not particularly limited as long as it can be dissolved by a dissection laser beam irradiated from a laser irradiation unit 4 to be described later and can be bonded without modifying the collected sample.
  • a heat-meltable film it is preferable to use a heat-meltable film having a melting point of about 50 to 70 ° C. as a raw material, since a lower melting point can prevent thermal denaturation of the sample.
  • EVA ethyl vinyl acetate
  • Polyolefin Polyamide, acrylic, polyurethane and the like.
  • an organic dye such as naphthalene cyanine dye may be added to the heat-meltable film, depending on the wavelength section of the dissection laser light source to be used.
  • a suitable organic dye may be selected.
  • the heat-meltable film 22 may be prepared by appropriately blending the above-mentioned heat-meltable film and an organic dye, or a commercially available heat-meltable film can be used. Examples of the commercially available heat-meltable film include a heat-meltable transfer film (manufactured by Electro Seal), a heat-meltable EVA film (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), and the like.
  • the device 20 when using MALDI-TOF-MS after taking a sample by LMD, the device 20 may be subjected to a conductive treatment.
  • a conductive material such as a metal between the substrate 21 and the heat-meltable film 22 may be used.
  • a layer of material may be formed.
  • the device 20 of the present invention is used only for collecting a sample by LMD, such as forming an electrode with a conductive metal in each region 221 having a high degree of hydrophilicity, and measuring a current change after dropping a reagent solution for analysis. Instead, the collected sample can be directly used on the device 20 for analysis.
  • the dissection laser light source included in the laser irradiation unit 4 it is preferable to use a laser beam with a single mode fiber output in order to minimize the irradiation spot, and a near-infrared high NA long focus objective for focusing. It is preferable to use a lens.
  • the pulse width is 0.1 to 100 milliseconds, preferably 5 milliseconds, the wavelength is 785 to 900 nanometers, preferably 808 nanometers, and the output is 0.2 to 0.3 watts.
  • the laser power is preferably from 0.1% to 100%, preferably from 80% to 100%, which can generate pulsed laser light. Specific examples include Z-808-200-SM (manufactured by Lucille). .
  • FIG. 6 is a diagram showing the relationship between the position coordinates of the sample where the dissection laser beam is irradiated and the position coordinates of the hot-melt film 22 to which the collected sample adheres, and shows an example in which the sample is continuously cut out. Yes.
  • the device moving means 2 moves the device 20 to a position where the dissection laser beam is irradiated.
  • the sample moving means 3 moves the sample a to a position where the sample a of the heat-meltable film 22 shown in FIG. The sample 34 is pressed against the heat-meltable film 22 by lowering in the direction.
  • the size A of the sample collected from the sample 34 may be changed according to the target tissue section or the purpose. For example, 1 ⁇ m to 5 ⁇ m for subcellular structure analysis or high spatial resolution, 15 ⁇ m to 30 ⁇ m for collecting single cells, and 50 ⁇ m to 100 ⁇ m for collecting cancer or degenerated sites.
  • the sample may be cut out from the sample 34 by irradiation with a dissection laser beam and collected.
  • the size of the sample to be cut can be adjusted by adjusting the diameter and intensity of the dissection laser light to be radiated, and a sample with the same size as the diameter of the dissection laser light can be cut out.
  • the sample larger than the diameter of the dissection laser beam can also be cut out by increasing the irradiation time.
  • the diameter of the dissection laser beam may be reduced by using an optical aperture, a condenser lens, or the like.
  • the intensity of the dissection laser beam may be changed by changing the voltage of the laser oscillator using a variable resistor or the like.
  • the sample collected from the sample 34 can be adhered to the heat-meltable film 22 at an arbitrary interval larger than the interval of the sample before collection. Therefore, the spatial resolution of the analysis can be improved by adjusting the interval for adhering the collected samples according to the spatial resolution of the analyzer for analyzing the collected samples, the pretreatment of the samples, and the like.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of an example of the LMD 1 of the present invention and a diagram showing an outline of the system.
  • the LMD 1 shown in FIG. 7 is provided with a laser irradiation unit 4 below the device moving means 2.
  • the laser irradiation unit 4 is provided with a not-shown dissection laser light source and a collimator lens 41 disposed on the optical axis of the dissection laser light output from the dissection laser light source.
  • the dissection laser light output from the dissection laser light source passes through the collimator lens 41, travels through the device substrate 21 and the heat-meltable film 22, and is irradiated onto the sample 34.
  • the laser irradiation unit 4 is provided below the device moving unit 2, but the laser irradiation unit 4 is provided above the device moving unit 2 and a device substrate 21 is used using a mirror system. You may enable it to irradiate a disection laser beam from the side.
  • the frame 33 may be formed to be hollow, and the slide 35 on which the sample is placed may be made to be able to irradiate the dissection laser light through the sample by using a light transmissive material. Furthermore, in the case of the embodiment shown in FIG.
  • the arm 32 is formed of a light-transmitting material, or a notch is formed in a portion where the sample is positioned so that the dissection laser light can be irradiated through the sample. It may be. If the sample 34 is disposed on the upper side, the device 20 having the heat-meltable film 22 for bonding the collected sample is disposed on the lower side, and the sample is cut out by irradiating with a dissection laser beam, and then bonded to the thermoplastic film 22, Form may be sufficient.
  • the light source 5 and the imaging device 6 are arranged on the top of the sample 34.
  • the light emitted from the light source 5 is applied to the sample 34 through an optical lens (not shown), a condenser lens, and a hollow portion of the frame 33.
  • a half mirror 51 is provided on the optical axis irradiated from the light source 5, and the imaging device 6 is arranged so that the imaging surface is located at the imaging position of the observation light on the spectral optical axis of the half mirror 51. Yes.
  • a laser controller 62 is connected to the laser irradiation unit 4, and the laser controller 62 is connected to a control computer 64. Further, the control computer 64 is connected to a display unit 65, for example, a pointing device 66 such as a mouse, an imaging device 6, a device moving unit 2, and a moving unit drive control unit 67 that controls driving of the sample moving unit 3. .
  • a display unit 65 for example, a pointing device 66 such as a mouse, an imaging device 6, a device moving unit 2, and a moving unit drive control unit 67 that controls driving of the sample moving unit 3.
  • the control computer 64 is a personal computer or the like incorporating software dedicated to the LMD1 of the present invention. Based on the instructions of the control computer 64, the laser controller 62 outputs the dissection laser light output from the dissection laser light source. The output state is controlled, and the moving means drive control unit 67 controls the power supply and pulse signals for the driving sources of the device moving means 2 and the sample moving means 3.
  • a joystick controller 68 is connected to the moving means drive control unit 67.
  • a joystick (not shown) is incorporated in the joystick controller 68, and a pulse signal corresponding to the operation of the joystick is given to the sample moving means 3.
  • the selection of the drive source of the sample moving means 3 for sending the pulse signal and the rotation direction of the drive source are determined in the tilt direction of the joystick, and the pulse source is oscillated at a frequency corresponding to the tilt angle. It rotates so that the sample moving means 3 moves.
  • the joystick controller 68 is not essential. For example, an image photographed by the imaging device 6 is displayed on the display unit 65, and the display unit 65 is arranged such that the point where the pointing device 66 is inserted is the center of the display unit 65. Is selected on the screen having a touch function and controlled so that the touched position becomes the center of the display unit 65, so that the driving source of the sample moving means 3 can be selected and the driving source can be rotated without using the joystick.
  • the direction may be controlled.
  • the power of the LMD 1 is turned on to activate the dedicated software for the control computer 64, and the device moving means 2 is moved to a predetermined position for initialization according to the initialization operation that is automatically executed.
  • the origin position is detected by an origin detector (not shown), moved to the irradiation area of the dissection laser beam separated from the origin by a predetermined distance, and waits.
  • the position of the device moving means 2 during standby is such that the region having a high hydrophilicity of the heat-meltable film 22 of the device 20 fixed on the device moving means 2 is divided into an irradiation area of the dissection laser light and an irradiation area of the illumination light. It is a position to enter. In this state, the slide 35 to which the sample 34 is fixed is attached to the arm 32 via the frame 33 or directly.
  • illumination light is irradiated from the light source 5 onto the sample 34 on the slide 35, and the observation light of the sample 34 is imaged by the imaging device 6 through the half mirror 51 and displayed on the display unit 65.
  • the position of the sample moving means 3 is finely adjusted by the touch function of the joystick controller 68 or the display unit 65 so that the position where the sample 34 is desired to be collected can be displayed on the display unit 65.
  • a range where the sample 34 displayed on the display unit 65 is desired to be collected is set by the pointing device 66 or the like.
  • the control computer 64 calculates the position coordinates of the sample irradiated with the dissection laser light so that the sample 34 in the set range can be continuously cut out based on the diameter of the dissection laser light to be irradiated.
  • the sample 34 is continuously cut out.
  • the position coordinates of the sample irradiated with the dissection laser beam are set so that the sample in the set range can be cut out at an arbitrary interval. It may be set.
  • the position coordinate setting may be selected from a list stored in the control computer 64 in advance according to the design of the device to be used, such as 96 well, 384 well, etc.
  • the coordinate position may be calculated by the control computer 64 by inputting the interval value.
  • the control computer 64 stores the selected or calculated position coordinates in the storage means (not shown) of the control computer 64, the image of the sample imaged by the imaging device 6, the position coordinates of the sample irradiated with the dissection laser beam, and the dissection laser.
  • the storage sample is stored in association with the position coordinates for bonding the sample collected by light irradiation to the highly hydrophilic region 221 of the heat-meltable film 22 (hereinafter, the stored information is referred to as “collection information”). There is.)
  • the point to be collected by irradiating the dissection laser beam of the sample 34 displayed on the display unit 65 is set by the pointing device 66 or the like, or by image analysis software
  • the position coordinates of the location set in the storage means of the control computer 64 are automatically identified using the color information, dyeing intensity, area of the object, perimeter, major axis, shape, etc.
  • a mark is displayed or a number is displayed in the set order. It is preferable to display.
  • the moving means drive control unit 67 After storing the collection information according to the above procedure, the moving means drive control unit 67 first determines the location of the sample 34 to be irradiated with the dissection laser light on the optical axis of the dissection laser light based on the position coordinate information of the collection information. The sample moving means 3 is driven and controlled so as to be positioned at the position. Next, the moving means drive control unit 67 sets the location of the region having high hydrophilicity of the hot melt film 22 to which the location where the sample 34 is first collected adheres based on the position coordinate information stored in the storage means. The sample moving means 3 is driven and controlled so that the sample 34 is positioned on the optical axis of the section laser light, and then the sample 34 is pressure-bonded to the hot-melt film 22.
  • the laser controller 62 controls to irradiate the dissection laser light from the dissection laser light source.
  • the movement control unit 67 drives and controls the sample moving unit 3 so as to move the sample 34 upward, so that the sample 34 collected first has a high hydrophilicity of the heat-meltable film 22. Peeling is performed with the region 221 adhered. Thereafter, the above-described procedure is repeated until all of the samples to be collected that have been set in advance are bonded and peeled to the highly hydrophilic region 221 of the hot-melt film 22.
  • the sample 34 adhered to the heat-meltable film 22 may be analyzed by a known method as described above.
  • analysis information When the analysis result of the collected sample 34 obtained by the analysis is stored in the storage means, the position coordinate of each collected sample 34 and the analysis result are associated with each other and stored in the storage means (hereinafter, the stored information is referred to as “analysis information”). "). And by performing image composition based on the collection information and analysis information stored in the storage means, the image of the sample is displayed and the analysis result of the sample contained in the location where the sample was collected is also displayed Can do.
  • the sample image and the analysis result are displayed by, for example, reading analysis information by the control computer 64 of the LMD1, and collecting information stored in the storage means of the LMD1 and the read analysis information.
  • the sample image and the analysis result may be displayed together on the display unit 65. If you want to display on the display unit of the analyzer, the collected information is read by the control computer of the analyzer, and the image is constructed based on the analysis information stored in the storage means of the analyzer and the read collected information. What is necessary is just to display a sample image and an analysis result collectively on the display part of an apparatus.
  • image composition is performed based on collection information and analysis information, and the sample image and analysis result may be displayed together on the display unit.
  • the collection information and the analysis information may be read by a personal computer or the like different from the LMD 1 and the analysis apparatus, and the sample image and the analysis result may be displayed together on the display unit of the personal computer.
  • this apparatus can also be automated, it can also be remotely operated and analyzed, and can also perform analysis and inspection from a remote location.
  • the above example shows an example of performing a two-dimensional analysis from a collected sample, but three-dimensional imaging can also be performed using the LMD1 of the present invention or an analyzer incorporating the LMD1.
  • the sample section of the sample section prepared from the tissue By associating and storing whether or not there is, three-dimensional imaging can be easily performed.
  • a position marker may be created by marking with a black ink mark or a female mark by micro-cutting at a specific location, and an image corrected by the image processing function incorporated in the control computer 64 may be displayed.
  • the thickness of each section is very thin, the consecutive sample sections cut out from the tissue are almost the same size.
  • the heat-meltable film 22 dissolves by absorbing the dissection laser light, solidifies again by stopping the irradiation of the dissection laser light, and adheres to the sample cut out by the dissection laser light when solidifying. To do. For this reason, the position coordinates of the sample 34 irradiating the dissection laser light are made the same, and the sample collected by the first irradiation of the dissection laser light is bonded to the preset position of the hot melt film 22, The sample 34 is not moved, but only the heat-meltable film 22 is moved to the bonding position of the sample to be collected next and irradiated with a dissection laser beam.
  • the melted hot-melt film 22 soaks into the recess where the sample has already been collected, but since the hot-melt film 22 is viscous, the melted hot-melt film 22 is dissolved when solidified. Since it is solidified so as to be pulled back to the non-heat-meltable film 22, the sample cut out by the dissection laser beam can be adhered and collected from the sample 34 fixed to the slide 21.
  • the amount of sample that can be collected may vary depending on the depth of the recess.
  • a measuring device for measuring the depth of the sample 34 after collection may be provided. Since the depth of the recess can be measured and the amount of the collected sample can be obtained, the quantitativeness is improved.
  • Example 1 [Production of LMD] Based on an upright microscope, a stepping motor (BioPrecision; made by Rudol) as a driving source, 3D-A-LCS software (made by Lucille) as a moving means drive control unit, and Z-808-200 as a disection laser light source -An LMD of the present invention was produced by attaching SM (Lucille).
  • Example 2 [Production of devices] A heat-meltable film was formed by spin-coating EVA (manufactured by Toyo Adre) on a slide glass. The thickness of the hot melt film was about 5 ⁇ m. Next, using an ink jet printer, a portion corresponding to a region having a low hydrophilicity of the heat-meltable film was printed with water-repellent ink (manufactured by Toyo Adress Co., Ltd .: SS25) to produce the device of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph in which water was dropped on a region having high hydrophilicity of the manufactured device. As is apparent from the photograph, the dropped water remained in the highly hydrophilic region.
  • FIG. 9 (1) is a photograph taken from the side
  • FIG. 9 (2) is a photograph taken from the bottom.
  • the hollow part had a diameter of about 9 mm and a weight of about 33 g.
  • the recessed part was provided in the outer side of the hollow part, and the rubber-made antiskid was inserted.
  • Example 4 By reducing the thickness of the upper part of the pressing means of Example 3, a pressing means having about half the weight of Example 3 was produced.
  • Example 5 The sample was cut out using LMD and adhered to the device by the following procedure.
  • Anasition of analysis organization As an analysis tissue, the brain of an APP / PS1 mouse (10 months old, about 25 g) obtained by the following procedure was used. 1. The mice were anesthetized with diethyl ether, placed in the supine position, and the limbs were fixed. 2. After laparotomy, the diaphragm was incised, and the left and right ribs were incised toward the head. 3. The xiphoid process was pinched and inverted toward the head, and fixed with forceps to expose the heart. 4).
  • the left ventricle was pierced with a winged needle, and 1 ⁇ PBS solution (physiological saline) was injected. 5.
  • the right atrial appendage was incised with a scissors, and blood was removed and perfused with about 70 ml of physiological saline. 6). After perfusion, the head was cut and the brain was removed after craniotomy. 7).
  • the excised brain was half-cut with a sagittal cut, and the cut surface was placed on the lower surface (cut surface) and then frozen in an embedding agent (OCT compound) to prepare a frozen block.
  • OCT compound embedding agent
  • a sample section was prepared by the following procedure. 1. Sections were prepared from the frozen block with a thickness of 10 ⁇ m. A slide glass without a coat was used. 2. The frozen section was dried according to the following procedure. (1) 100% acetone 10 minutes (2) PBS 1 minute (3) 70% ethanol 1 minute (4) 100% ethanol 1 minute (5) 100% ethanol 1 minute (6) 100% xylene 2 minutes (7) 100 % Xylene 2 minutes
  • FIG. 10A is an enlarged photograph of the adhesion surface of the sample cut out in Example 5.
  • Example 6 A sample was cut out in the same procedure as in Example 5 except that the pressing means produced in Example 4 was used instead of the pressing means in Example 3.
  • FIG. 10B is an enlarged photograph of the device surface to which the sample cut out in Example 6 is bonded.
  • FIG. 10 (3) is an enlarged photograph of the device surface of Comparative Example 1.
  • the sample can be transferred to the heat-meltable film by using the pressing means in close contact with the heat-meltable film of the device during LMD. It became clear that the amount of the sample to be transferred differs depending on the degree of the.
  • a device for adhering a collected sample is disposed below the slide on which the sample is placed. Therefore, it can be directly sent to the next processing without changing the direction of the device after sampling. Furthermore, since the surface of the device of the present invention has a planar well structure, a sample collected by LMD can be subjected to various pretreatments or analyzes in the form of a device. Therefore, it can be used as a device for tissue analysis in medical institutions, research institutions such as university medical departments, general hospitals, and the like.

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Abstract

　作業効率の良いレーザーマイクロダイセクション装置を提供することを課題とする。　試料が載置したスライドを保持し、前記試料スライドを水平方向及び垂直方向に移動することができる試料移動手段、試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを載置することができ、前記デバイスを水平方向に移動できるデバイス移動手段、試料にダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱溶融性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段、及び前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱溶融性フィルムの位置座標に基づき、前記試料移動手段及び前記デバイス移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部、を含み、前記ダイセクションレーザー光が前記デバイスの下方からデバイスを通して試料に照射するレーザーマイクロダイセクション装置により、課題が解決できる。

Description

レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイス
　本発明は、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスに関する。特に、ダイセクションレーザー光の照射部をデバイスより下方に配置し、ダイセクションレーザー光をデバイスの下方から試料に照射することで、試料採取後のデバイスに分析用試薬液を滴下する等、試料の採取から分析に至る一連の作業性に優れたレーザーマイクロダイセクション装置に関する。更に、作業性に優れたレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料の採取方法、及び作業性に優れたレーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスに関する。
　近年、生命科学の研究では、ある分子が生体試料のどの場所に存在しているのか、又、生体試料中の興味のある場所にどのような分子が存在しているのかを精度よく分析することが求められている。
　また、生体試料を分析する際には、試料を取り出して単に分析するのではなく、顕微鏡により観察している試料にどの様な分子が含まれているのかを併せて表示する質量分析イメージングが要望されている。当該要望を実現する装置としては、顕微鏡で生体試料を観察し、そして、生体試料を質量分析することができる質量顕微鏡が市販されている。
　通常の質量分析方法は、試料にレーザー光を照射し、照射された部分の試料をイオン化して質量分析している（以下、質量分析装置の試料をイオン化するためのレーザー光を「イオン化レーザー光」と記載することがある。）。したがって、試料を連続的に分析するためには、イオン化レーザー光を試料に照射した後、当該試料をイオン化レーザー光の直径に相当する長さ移動し再度イオン化レーザー光を照射することで、試料を連続的に分析することが可能である。しかしながら、質量分析においては、イオン化レーザー光を照射した部分のみがイオン化するのではなく、イオン化レーザー光の直径に相当する長さを移動した後にイオン化レーザー光を照射しても、移動前の試料も同時にイオン化してしまうという問題がある。そのため、イオン化レーザー光を照射する箇所を連続的に移動することは難しく、使用するイオン化レーザー光の直径にもよるものの空間分解能は約２００μｍ程度であることから、試料を連続的に精密分析することが難しいという問題があった。また、イオン化レーザー光を照射した部分の生体試料を完全にイオン化することはできず、分析結果の定量性にも問題があった。更に、従来の質量顕微鏡は、単に顕微鏡と質量分析装置を組み合わせたもので、装置が大型化するという問題もあった。
　上記問題点を解決するため、本発明者は、（１）熱溶融性フィルムを使って、一度小片をフィルムに貼り付け、そのフィルム上で質量分析することにより、生体組織上のある部分から網羅的に位置情報を持った小片を切り出すことができ、余計なものが混じったピークを抑制した高感度な質量分析が可能となること、（２）レーザーマイクロダイセクション装置（以下、「ＬＭＤ」と記載することがある。）に搭載したオンライン連動座標再現ステージ（測定試料の固定装置）を改良し、座標再現機能ソフトウェアを改造し、レーザー焦点径を１μｍに改造することで、空間分解能を向上できること、（３）座標再現機能を用いて位置決定をしているため、連続する組織切片間の位置情報を正確に再現でき、３次元での質量分析イメージングも実現できること、を見出し発表している（非特許文献１参照）。
平成２６年５月２０日、科学技術振興機構（ＪＳＴ）、名古屋大学、"アルツハイマー病関連分子の脳内分布を３次元で測定することに成功　～ＬＭＤ－ＭＳ法：新しい質量分析イメージング技術の確立～"、〔ｏｎｌｉｎｅ〕、〔平成２７年３月１６日検索〕、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒ／ａｎｎｏｕｎｃｅ／２０１４０５２０／＞
　非特許文献１に記載されているＬＭＤは、試料の連続した微小領域を熱溶融性フィルムに所望の間隔で、且つ試料の位置座標及び熱溶融性フィルムの位置座標を関連付けて配置できることから、２次元及び３次元の質量イメージングを行うことができる。
　しかしながら、上記非特許文献１に記載されているＬＭＤは、マトリックス支援レーザー離脱イオン化飛行時間質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）に用いることを念頭に、倒立顕微鏡をベースに開発している。倒立顕微鏡の試料を観察する光学系は装置の下側に配置されていることから、非特許文献１に記載されているＬＭＤは、試料を載置したスライドの上に採取試料を接着する熱溶融性フィルムを配置し、ダイセクションレーザー光の光源は上方に配置している。
　そのため、熱溶融性フィルムの試料の接着面は下方に向くことから、接着した試料に分析用試薬液等を滴下する場合、熱溶融性フィルムを一度ＬＭＤから取出し、熱溶融性フィルムの試料の接着面を上側に向ける必要がある。したがって、作業が煩雑になり分析効率が悪いという問題がある。
　また、非特許文献１に記載されているＬＭＤは、熱溶融性フィルムを試料に当接してレーザー光を照射している。しかしながら、例えば、包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの切片等を試料として用いる場合、ミクロのレベルでは試料表面は凹凸があり、熱溶融性フィルムと試料の間に隙間が生じ、その結果、試料の熱溶融性フィルムへの転写にばらつきができる可能性がある。
　ところで、市販されている熱溶融性フィルムは、仕切り等のない平面上のフィルムである。そのため、試料が接着した熱溶融性フィルムに分析用試薬液を滴下する場合、熱溶融性フィルム上で分析用試薬液が拡散し、コンタミのおそれがある。コンタミを防止するためには、試料を接着する間隔を広くすることが考えられるが、試料を接着する間隔を広くすると熱溶融性フィルム１枚当たりで分析できるサンプルのスポット数が少なくなり、分析効率が低下するという問題がある。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、ＬＭＤにおいて、試料を上側、採取した試料を接着する熱溶融性フィルムを有するデバイスを下側に配置する。そして、ダイセクションレーザー光をデバイスの下方から照射すると、採取試料はデバイスの上側の面に接着するので、分析用試薬液を直接滴下できること、を新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスを提供することである。
　本発明は、以下に示す、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスに関する。
（１）試料が載置したスライドを保持し、前記スライドを水平方向及び垂直方向に移動することができる試料移動手段、
　試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを載置することができ、前記デバイスを水平方向に移動できるデバイス移動手段、
　試料にダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部、
　ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱溶融性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段、及び
　前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱溶融性フィルムの位置座標に基づき、前記試料移動手段及び前記デバイス移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部、
を含み、
　前記ダイセクションレーザー光が前記デバイスの下方からデバイスを通して試料に照射する、
レーザーマイクロダイセクション装置。
（２）前記スライドと前記熱溶融性フィルムを有するデバイスを圧着する押圧手段を含む上記（１）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（３）前記押圧手段が、前記スライドを保持する枠体である上記（２）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（４）前記試料移動手段が、前記枠体を保持するアームを有し、
　前記押圧手段が、前記アームを含む上記（２）又は（３）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（５）前記試料移動手段が、前記スライドを保持するアームを駆動するモーターを有し、
　前記押圧手段が、少なくとも前記モーターと前記アームを含み、前記モーターで前記アームを前記デバイス方向に付勢する上記（３）又は（４）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（６）基板、該基板上に形成された試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを含む上記（１）～（５）の何れか一に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（７）前記熱溶融性フィルムの表面は親水度の異なる領域で形成され、親水度の高い領域が親水度の低い領域で囲まれている上記（６）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（８）上記（１）～（７）の何れか一に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。
（９）前記分析装置が、質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、及びマイクロチップ分析装置から選ばれる１種である上記（８）に記載の分析装置。
（１０）レーザーマイクロダイセクション装置を用い、熱溶融性フィルムを有するデバイスに試料を採取する試料採取方法であって、
　前記デバイスの熱溶融性フィルムの試料を転写する位置の上に、採取すべき試料の位置を重ねるステップ、
　前記デバイスの熱溶融性フィルムと試料を圧着する押圧ステップ、
　前記デバイスの下方からダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着する試料採取ステップ、
を含む試料採取方法。
（１１）レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスであって、
　前記デバイスは、基板、及び該基板上に形成され試料を転写するための熱溶融性フィルムを含み、
　前記熱溶融性フィルムの表面は親水度の異なる領域で形成され、親水度の高い領域が親水度の低い領域で囲まれているデバイス。
（１２）前記熱溶融性フィルムと基板の間に、導電層が形成されている上記（１１）に記載のデバイス。
　本発明のＬＭＤは、試料を上側、採取した試料を接着する熱溶融性フィルムを有するデバイスを下側に配置している。そのため、採取試料はデバイスの上側の面に接着するので、ＬＭＤの後は反転等の作業をすることなく分析用試薬液の滴下等を行うことができる。したがって、装置の構成を簡単にできるとともに、作業効率が向上する。
図１は、本発明のＬＭＤ１（図１中の点線で囲った部分）の概略を示す図である。 図２は、図面代用写真で、試料移動手段３の概略を示す写真である。 図３は、押圧手段の第１実施形態の動作例を示す図である。 図４は、押圧手段の第２実施形態を示す図である。 図５は、本発明のデバイス２０の上面図である。 図６は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱溶融性フィルム２２の位置座標の関係を表す図で、図６（１）の試料３４ａ、ｂ、ｃを、図６（２）に示す熱溶融性フィルム２２に接着する例を示している。 図７は、本発明のＬＭＤ１の一例の断面図及びシステムの概略を示す図である。 図８は、図面代用写真で、実施例２で作製したデバイスの親水度の高い領域に水を滴下した写真である。 図９は、図面代用写真で、図９（１）は実施例３で作製した押圧手段を側面から撮影した写真、図９（２）は底面から撮影した写真である。 図１０は、図面代用写真で、図１０（１）は実施例５のデバイス表面の拡大写真、図１０（２）は実施例６のデバイス表面の拡大写真、図１０（３）は比較例１のデバイス表面の拡大写真である。
　以下に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、試料採取方法、及レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスについて詳しく説明する。
　図１は、本発明のＬＭＤ１（図１中の点線で囲った部分）の概略を示す図で、ＬＭＤ１は、（ａ）試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを載置することができ、デバイスを水平方向に移動できるデバイス移動手段２、（ｂ）試料が載置したスライドを保持し、スライドを水平方向及び垂直方向に移動することができる試料移動手段３、（ｃ）試料にダイセクションレーザー光を照射し、ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部４、図示しない記憶手段及び移動手段駆動制御部を少なくとも含んでいる。本発明のＬＭＤ１は、ダイセクションレーザー光をデバイスの下方から照射するため、レーザー照射部４は、デバイスをセットする位置より下方に配置されている。図１に示すＬＭＤ１は、更に、採取した試料を観察するための光を照射する光源５、画像を取得するためのＣＣＤ等の撮像装置６を含んでいる。
　本発明のＬＭＤ１により採取した試料は公知の分析方法（装置）により分析をすればよい。図１は、ＬＣ－ＭＳと組み合わす例を示しており、試料を採取した後のデバイスは、デバイス移動手段２によりリキッドハンドリング部７に送られ、ＬＣ－ＭＳ分析用の溶液がデバイスに滴下され、引き続き、ＬＣ－ＭＳで分析される。ＬＣ－ＭＳ以外の分析方法（装置）としては、例えば、熱溶融性フィルムに接着した試料を液化することで、ＨＰＬＣ－蛍光分光機、ＨＰＬＣ－電気化学的検出器等のクロマトグラフィーを含む分析装置、電子線マイクロアナライザ、Ｘ線光電子分光装置等の元素分析装置、ＰＣＲまたはＬＣＲで遺伝子を増幅しシークエンサーを用いて試料に含まれるＤＮＡ配列の解析を行う核酸配列分析装置、試料に含まれる核酸を鋳型にＤＮＡをハイブリダイズするＤＮＡチップ、タンパク質に抗体を反応させる抗体チップ等のマイクロチップ分析装置、等が挙げられる。
　また、本発明のＬＭＤ１は、上記の質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、マイクロチップ分析装置の試料採取装置として、当該分析装置に組み込むこともできる。更に、本発明のＬＭＤ１を用いると、採取した試料を所望の間隔で熱溶融性フィルムに接着・配列できることから、例えば、ＤＮＡチップや抗体チップを製造するための製造装置として使用することもできる。
　図１に示すデバイス移動手段２は、デバイスを載置することができるデバイス載置台と、デバイス載置台を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に移動するための図示しない駆動原及び該駆動原の駆動力をデバイス載置台に伝達する駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、顕微鏡等に使われているデバイス（チップ）載置台を水平方向に駆動するための駆動力伝達機構等、公知のものを用いればよい。
　図２は、試料移動手段３の概略を示す写真である。図２に示す試料移動手段３は、試料が載置したスライドを一端に載置することができ他端はアーム支柱３１に取り付けることができるアーム３２、該アーム３２を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に回転及び垂直方向（Ｚ軸方向）に移動することができるアーム支柱３１が含まれている。また、図２中の楕円部分には、アーム３２を水平方向に回転及び垂直方向に移動するための駆動原及び該駆動原の駆動力を伝達してアーム３２を回転及び垂直方向に移動するための駆動力伝達機構が含まれている。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、自動分析装置のサンプル移動用のアーム機構等、水平方向に回転及び垂直方向に移動することができる公知のアーム機構を用いればよい。なお、試料移動手段３は、図２に例示した実施形態に限定されず、試料を水平方向及び垂直方向に移動することができれば特に制限は無い。
　デバイスの熱溶融性フィルムと試料に隙間があると、採取試料が熱溶融性フィルムに接着し難くなる。そのため、本発明のＬＭＤ１は、試料が載置したスライドと熱溶融性フィルムを有するデバイスを圧着する押圧手段を含んでいる。図２は、ステンレス、チタン等の金属等で作製した重量のある枠体３３で押圧手段を形成した例を示している。
　図３は、押圧手段の第１実施形態の動作例を示す図である。図３（１）は押圧前の状態を示す側面図で、押圧手段である枠体３３は断面が略凸状になっており、アーム３２の先端に形成された枠体挿入孔に摺動可能となるように挿入されている。枠体３３の下方部は、試料３４が載置したスライド３５を着脱自在に取り付け可能となっており、例えば、係止溝、係止バネ機構等が形成されている。一方、ＬＭＤ１のデバイス移動手段２には、基板２１及び該基板２１上に形成された試料を転写するための熱溶融性フィルム２２を含むデバイス２０が載置されている。
　図３（１）に示す押圧前の状態では、枠体３３の上部３３１は枠体挿入孔より大きく形成することで、枠体３３はアーム３２に係止される。そして、図３（２）に示すように、アーム３２を下方に下げることで枠体３３も下がり、試料３４が熱溶融性フィルム２２に当接した後でもアーム３２を下げることで、枠体３３の重量により試料３４を熱溶融性フィルム２２に圧着することができる。試料３４と熱溶融性フィルム２２の圧着の程度は、枠体３３の重量で調整すればよい。枠体３３の形状は、アーム３２に摺動可能に挿入できれば特に制限は無く、試料を載置するスライドの形状に応じて円形、正方形、長方形等、適宜調整すればよい。また、試料の採取状況等を観察する場合は、枠体３３を中空形状とし、枠体３３の上方から観察できるようにしてもよい。また、図３（３）に示すように、試料３４が熱溶融性フィルム２２に当接した際のズレを防止するために、枠体３３に、シリコンゴム、合成ゴム等で作製したズレ防止部材を設けてもよい。
　図４は、押圧手段の第２実施形態を示す図である。図４に示す実施形態では、アーム３２に試料３４が載置したスライド３５を着脱自在に取り付け可能な係止溝等が形成されている。アーム３２を下方に下げることで試料３４が熱溶融性フィルム２２に当接する。当接した後は、アーム３２と駆動力伝達機構の伝達を解除することで、アーム３２の自重により、試料３４を熱溶融性フィルム２２に圧着することができる。なお、図４に示す第２実施形態は、試料３４が載置したスライド３５をアーム３２に取り付けているが、スライド３５を枠体３３に取り付け、枠体３３をアーム３２に着脱自在となるように取り付けた形態を第３実施形態としてもよい。第１実施形態とは異なり、第３実施形態は枠体３３がアーム３２に対して摺動する必要はなく、アーム３２に固定する必要がある。第３実施形態の場合、枠体３３とアーム３２で押圧手段を構成することから、試料３４を熱溶融性フィルム２２により圧着することができる。
　上記の第２実施形態及び第３実施形態は、枠体３３及び／又はアーム３２で押圧手段を形成しているが、第４実施形態として、枠体３３及び／又はアーム３２に加え、駆動原及び駆動力伝達機構を含めて押圧手段を構成してもよい。第４実施形態の場合、アーム３２を下げ、試料３４が熱溶融性フィルム２２に当接した後もアーム３２と駆動力伝達機構の伝達を解除せず、アーム３２を下方向に付勢し続ければよい。
　上記第１～第４実施形態は、ＬＭＤ１を構成する部材を用いて押圧手段を構成する実施形態であるが、押圧手段は試料３４と熱溶融性フィルム２２が圧着すれば特に制限はない。例えば、スライド３５をデバイス２０上の配置した後、スライド３５及びデバイス２０を上下から挟む挟持手段等により押圧手段を形成してもよい。押圧手段を設けることで、試料３４と熱溶融性フィルム２２を密着させることができる。その結果、ダイセクションレーザー光を照射する際に、試料３４と熱溶融性フィルム２２の隙間をなくすことができるので、試料の切り出し精度を向上できる。
　図５は、本発明のデバイス２０の上面図である。本発明のデバイス２０は、熱溶融性フィルム２２の表面が親水度の異なる領域で形成されていることを特徴としている。図５に示す例では、親水度の高い領域２２１が円形状に形成され、親水度の高い領域２２１の周りは、親水度の低い領域２２２で囲まれている。
　なお、本発明の「親水度の高い領域」及び「親水度の低い領域」とは、親水度の絶対値ではなく、２つの領域の親水度の相対的な高低を意味する。本発明のデバイス２０は、親水度の高い領域の周りに相対的に親水度の低い領域が形成されていれば特に制限は無い。例えば、基板２１上に熱溶融性フィルム２２の層を形成後、親水度の高い領域に相当する個所に穴を有するマスクを被せ親水化処理をすればよい。逆に、親水度の低い領域に相当する個所に穴を有するマスクを被せ疎水化処理をしてもよい。また、親水化処理と疎水化処理の両方を行ってもよい。
　親水化処理は公知の方法で行えばよく、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられる。例えば、マスクから露出している熱溶融性フィルム２２を１０～３０秒間プラズマ処理することで、表面に水酸基を導入することができる。疎水化処理も公知の方法で行えばよく、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）処理、トリフルオロメチル基等のフッ素化合物処理が挙げられる。
　マスクを用いた親水化処理及び／又は疎水化処理以外の方法としては、フッ素樹脂系インク、オルガノシラン、シリコン系インク、アルカリ可溶性レジストインク等の撥水性インクをインクジェットプリンター等により印刷してもよい。
　熱溶融性フィルム２２の表面を親水化処理及び／又は疎水化処理することで、ウェルを作製することがでる。なお、本発明のデバイス２０のウェルは、熱溶融性フィルム２２の表面を原子レベルで改質、又はコーティングすることで作製した略平面状のウェルであり、溶液等を挿入するくぼみ（ウェル）のある公知のマイクロプレートとは異なる物である。そして、熱溶融性フィルム２２の表面はほぼ平面状態であることから、ダイセクションの際に試料との密着性を阻害することがない。また、ＬＭＤにより試料を親水度の高い領域に接着した後に分析用試薬液を当該親水度の高い領域に滴下してもウェルの外に分析用試薬液が流れないのでコンタミは発生しない。
　親水度の高い領域の大きさ及び形状は、ＬＭＤにより採取した試料の分析方法に応じて適宜調整すればよい。例えば、ＬＣ－ＭＳや、核酸増幅を行う場合は、少なくとも分析に必要な量の分析用試薬液が表面張力により親水度の高い領域内に留まる大きさとすればよい。
　基板２１は、ダイセクションレーザー光が通過でき、熱溶融性フィルム２２を形成できれば特に制限は無く、例えば、ガラスや光透過性樹脂で作製すればよい。熱溶融性フィルム２２は基板２１の上にスピンコート等を用いて積層すればよい。
　熱溶融性フィルム２２としては、後述するレーザー照射部４から照射したダイセクションレーザー光により溶解し、採取試料を変性させずに接着できるものであれば特に制限は無い。熱溶融性フィルムとしては、融点が低い方が試料の熱変性を防止できることから、融点が約５０－７０℃程度までの熱溶融性フィルムを原料に用いることが好ましく、例えば、エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリオレフィン、ポリアミド、アクリル、ポリウレタン等が挙げられる。また、熱溶融性フィルムには、ダイセクションレーザー光源の波長域のスペクトルを選択的に吸収するため、ナフタレンシアニン染料等の有機染料を添加してもよく、用いるダイセクションレーザー光源の波長域に応じて好適な有機染料を選択すればよい。熱溶融性フィルム２２としては、上記の熱溶融性フィルム及び有機染料を適宜配合して作製してもよいし、市販の熱溶融性フィルムを用いることもできる。市販されている熱溶融性フィルムとしては、例えば、熱溶融性トランスファフィルム（エレクトロシール社製）、熱溶融性ＥＶＡフィルム（シグマ－アルドリッチジャパン社製）等が挙げられる。
　また、ＬＭＤにより試料を採取後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いる場合は、デバイス２０を導電性処理しておいてもよく、例えば、基板２１と熱溶融性フィルム２２の間に金属等の導電性材料の層を形成すればよい。また、各々の親水度が高い領域２２１に導電性金属で電極を形成し、分析用試薬液を滴下した後の電流変化を測定する等、本発明のデバイス２０はＬＭＤによる試料の採取のみに用いられるのではなく、採取した試料をデバイス２０上で直接分析する等、多様な分析に用いることができる。
　レーザー照射部４に含まれるダイセクションレーザー光源としては、照射スポットを最小にするためにシングルモードファイバー出力のレーザー光を用いることが好ましく、また、集光の為の近赤外用高ＮＡ長焦点対物レンズを用いることが好ましい。また、パルス幅は０．１ミリ秒～１００ミリ秒、好ましくは５ミリ秒、波長は７８５ナノメートル～９００ナノメートル、好ましくは８０８ナノメートル、出力は０．２ワット～０．３ワット、照射レーザーパワーは０．１％～１００％、好ましくは８０％～１００％のパルスレーザー光を発生できるものが好ましく、具体的には、Ｚ－８０８－２００－ＳＭ（ルシール社製）等が挙げられる。
　図６は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱溶融性フィルム２２の位置座標の関係を表す図で、試料を連続的に切り出す場合の例を示している。例えば、図６（１）の試料３４をａ、ｂ、ｃのように連続的に切り出す場合、（ｉ）デバイス移動手段２により、デバイス２０をダイセクションレーザー光が照射される位置に移動する。（ｉｉ）次に、試料移動手段３により、試料３４のａが図６（２）に示す熱溶融性フィルム２２の採取試料ａが接着する箇所ａ′に重なる位置に移動し、アーム３２を垂直方向に下げることで試料３４を熱溶融性フィルム２２に圧着させる。（ｉｉｉ）ダイセクションレーザー光を照射することで、試料３４のａの箇所から採取した試料を熱溶融性フィルム２２のａ′の位置に接着し、次いで、アーム３２を垂直方向に上げることで試料３４を熱溶融性フィルム２２から離し、熱溶融性フィルム２２の予め決められた箇所に、試料３４ａを接着する。試料３４ｂ、ｃについても、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の手順を繰り返すことで、試料３４ｂ、ｃを、熱溶融性フィルム２２のｂ′、ｃ′に接着することができる。
　試料３４から採取する試料の大きさＡは、対象とする組織切片や目的に応じて切り出す試料の大きさを変えればよい。例えば、細胞下構造体の分析や高空間分解能を得たい場合には１μｍ～５μｍ、単一細胞を採取する場合には１５μｍ～３０μｍ、癌や変性部位などを採取する場合は５０μｍ～１００μｍの大きさの試料を、ダイセクションレーザー光を照射して試料３４から切り出し採取すればよい。切り出す試料の大きさは、照射するダイセクションレーザー光の直径および強度を調整することで、ダイセクションレーザー光の直径と同じ大きさの試料を切り出すこともできるし、ダイセクションレーザー光の強度を強くしたり照射時間を長くすることで、ダイセクションレーザー光の直径より大きな試料を切り出すこともできる。採取する試料に応じて、ダイセクションレーザー光の直径や強度を適宜調整すればよい。ダイセクションレーザー光の直径は、光学絞りや集光レンズ等を用いて焦点を絞ればよい。ダイセクションレーザー光の強度は、可変抵抗などを用いてレーザーの発振体の電圧を変化させれば良い。
　本発明においては、試料３４から採取した試料を、採取する前の試料の間隔より大きな任意の間隔で熱溶融性フィルム２２に接着できる。したがって、採取した試料を分析する分析装置の空間分解能や試料の前処理等に応じて、採取した試料を接着する間隔を調製することで、分析の空間分解能を向上することができる。
　図７は、本発明のＬＭＤ１の一例の断面図及びシステムの概略を示す図である。図７に示すＬＭＤ１は、デバイス移動手段２の下方にレーザー照射部４が設けられている。レーザー照射部４には、図示しないダイセクションレーザー光源とダイセクションレーザー光源から出力されるダイセクションレーザー光の光軸上に配置されるコリメータレンズ４１が設けられている。ダイセクションレーザー光源から出力されるダイセクションレーザー光は、コリメータレンズ４１を通ってデバイスの基板２１、熱溶融性フィルム２２を進んで試料３４に照射されるようになっている。
　なお、図７に示す実施形態では、レーザー照射部４はデバイス移動手段２の下方に設けられているが、レーザー照射部４をデバイス移動手段２の上方に設け、ミラー系を用いてデバイス基板２１側からダイセクションレーザー光を照射できるようにしてもよい。また、枠体３３を中空となるように形成し、試料を載置するスライド３５も光透過性の材料を用いることで、試料を介してダイセクションレーザー光を照射できるようにしてもよい。更に、図４に示す実施形態の場合は、アーム３２を光透過性の材料で形成、または試料が位置する部分に切欠きを形成することで、試料を介してダイセクションレーザー光を照射できるようにしてもよい。試料３４を上側、採取した試料を接着する熱溶融性フィルム２２を有するデバイス２０を下側に配置し、ダイセクションレーザー光を照射することで試料を切り出し、熱可塑性フィルム２２に接着できれば、その他の形態であってもよい。
　一方、試料３４の上部には、光源５及び撮像装置６が配置されている。光源５より放射された光は、図示しない光学レンズ、集光レンズ、枠体３３の中空形状部分を通して試料３４に照射されるようになっている。また、光源５から照射される光軸上にはハーフミラー５１が設けられ、ハーフミラー５１の分光光軸上の観察光の結像位置に撮像面が位置するように撮像装置６が配置されている。
　レーザー照射部４にはレーザーコントローラ６２が接続され、このレーザーコントローラ６２は、制御用コンピュータ６４に接続されている。また、制御用コンピュータ６４には、表示部６５、例えばマウス等のポインティングデバイス６６、撮像装置６、デバイス移動手段２及び試料移動手段３の駆動制御を行う移動手段駆動制御部６７が接続されている。
　制御用コンピュータ６４は、本発明のＬＭＤ１専用のソフトウェアを組み込んだパーソナルコンピュータ等で、この制御用コンピュータ６４の命令に基づいて、レーザーコントローラ６２により、ダイセクションレーザー光源から出力されるダイセクションレーザー光の出力状態が制御されるとともに、移動手段駆動制御部６７により、デバイス移動手段２及び試料移動手段３の駆動原に対する電源供給とパルス信号が制御されるようになっている。
　移動手段駆動制御部６７には、ジョイスティックコントローラ６８が接続されている。このジョイスティックコントローラ６８には、図示しないジョイスティックが組み込まれ、このジョイスティックの操作に応じたパルス信号を試料移動手段３に与えるようにしている。ここでは、例えば、ジョイスティックの傾き方向で、パルス信号を送る試料移動手段３の駆動原の選択と、駆動原の回転方向が決まり、傾き角度に応じた周波数でパルス信号が発振されて駆動原が回転し、試料移動手段３が移動するようにしている。なお、ジョイスティックコントローラ６８は必須ではなく、例えば、撮像装置６で撮影した画像を表示部６５に表示し、ポインティングデバイス６６を差した箇所が表示部６５の中心となるように、また、表示部６５をタッチ機能を有する画面で作製してタッチした箇所が表示部６５の中心となるように制御することで、ジョイスティックを使用することなく、試料移動手段３の駆動原の選択と、駆動原の回転方向を制御してもよい。
　次に、本発明のＬＭＤ１により試料を切り出す手順と制御用コンピュータ６４に組み込まれた専用ソフトウェアによる動作について説明する。
　まず、ＬＭＤ１の電源を投入して制御用コンピュータ６４の専用ソフトウェアを起動し、自動的に実行される初期化動作に従って、デバイス移動手段２を初期化のために所定の位置に移動する。そして、図示していない原点検出器により原点位置検出を行って、原点から所定の距離だけ離れたダイセクションレーザー光の照射領域へ移動して待機する。待機する時のデバイス移動手段２の位置は、デバイス移動手段２上に固定したデバイス２０の熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域が、ダイセクションレーザー光の照射領域と照明光の照射領域に入る位置である。この状態で、試料３４を固定したスライド３５を枠体３３を介し、又は直接アーム３２に取り付ける。
　次に、光源５から照明光をスライド３５上の試料３４に照射し、ハーフミラー５１を通して試料３４の観察光を撮像装置６で撮像し、表示部６５上に映し出す。その際、ジョイスティックコントローラ６８又は表示部６５のタッチ機能等により試料移動手段３の位置を微調整し、試料３４の採取したい位置を表示部６５に表示できるようにする。
　次に、図６に示すように、試料３４から連続的に試料を切り出す場合には、表示部６５に表示された試料３４の採取したい範囲をポインティングデバイス６６等により設定する。制御用コンピュータ６４は、照射するダイセクションレーザー光の直径に基づき、設定された範囲の試料３４を連続的に切り出せるよう、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標を算出する。なお、前記の例は、試料３４を連続的に切り出す場合であるが、例えば、設定した範囲の試料を任意の間隔をおいて切り出せるように、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標を設定してもよい。
　次に、採取試料を熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域２２１に接着する際の位置座標を設定する。位置座標の設定は、例えば、９６ウェル、３８４ウェル等、使用するデバイスの設計に応じて予め制御用コンピュータ６４に記憶したリストの中から選択してもよいし、制御用コンピュータ６４に、所望の間隔値を入力することで座標位置を制御用コンピュータ６４で計算させてもよい。制御用コンピュータ６４は、選択又は計算した位置座標を、制御用コンピュータ６４の図示しない記憶手段に、撮像装置６で撮像した試料の画像、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標及びダイセクションレーザー光の照射により採取した試料を熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域２２１に接着する位置座標を関連付けて記憶手段に記憶しておく（以下、記憶した情報を「採取情報」と記載することがある。）。
　また、試料３４の採取する位置を任意に設定する場合は、表示部６５に表示された試料３４のダイセクションレーザー光を照射して採取したい箇所をポインティングデバイス６６等により設定、もしくは画像解析ソフトにより色情報、染色強度、目的物の面積、周囲長、長径、形状などを利用して自動的に識別してそれぞれの位置座標を設定し、制御用コンピュータ６４の記憶手段に設定した箇所の位置座標を記憶しておく。その際、表示部６５に表示されている試料３４のポインティングデバイス６６で設定した箇所にも、例えば、マークを表示又は設定した順番毎に数字を表示したりする等、どの箇所の試料を切り出すのか表示することが好ましい。
　上記の手順により採取情報を記憶した後、移動手段駆動制御部６７は、採取情報の位置座標情報に基づき、最初にダイセクションレーザー光を照射する試料３４の箇所がダイセクションレーザー光の光軸上に位置するように試料移動手段３を駆動制御する。次に、移動手段駆動制御部６７は、該記憶手段に記憶された位置座標情報に基づき、試料３４の最初に採取した箇所が接着する熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域の箇所をダイセクションレーザー光の光軸上に位置し、次いで試料３４が熱溶融性フィルム２２に圧着するように試料移動手段３を駆動制御する。
　次に、制御用コンピュータ６４からの指示により、レーザーコントローラ６２はダイセクションレーザー光源からダイセクションレーザー光を照射するよう制御する。ダイセクションレーザー光照射後は、移動制御手段６７は、試料３４を上方に移動するよう試料移動手段３を駆動制御することで、最初に採取した試料３４を熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域２２１に接着させた状態で剥離する。その後は、予め設定した採取する試料の全てを熱溶融性フィルム２２の親水度の高い領域２２１に接着剥離するまで上記手順を繰り返す。熱溶融性フィルム２２に接着した試料３４は、上記のとおり公知の手法により分析を行えばよい。
　分析により得られた採取試料３４の分析結果を記憶手段に記憶する場合には、それぞれの採取試料３４の位置座標と分析結果を関連付けて記憶手段に記憶する（以下、記憶した情報を「分析情報」と記載することがある。）。そして、記憶手段に記憶された採取情報及び分析情報に基づき画像構成を行うことで、試料の画像を表示するとともに、試料を採取した箇所に含まれていた試料の分析結果を併せて表示することができる。
　試料画像と分析結果の表示は、ＬＭＤ１と分析装置が別体の場合は、例えば、ＬＭＤ１の制御用コンピュータ６４により分析情報を読み込み、ＬＭＤ１の記憶手段に記憶されている採取情報と読み込んだ分析情報に基づき画像構成を行い、表示部６５に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。分析装置の表示部に表示を行いたい場合は、分析装置の制御用コンピュータにより採取情報を読み込み、分析装置の記憶手段に記憶されている分析情報と読み込んだ採取情報に基づき画像構成を行い、分析装置の表示部に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。
　ＬＭＤ１を組み込んだ分析装置の場合は、採取情報と分析情報に基づき画像構成を行い、表示部に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。また、採取情報と分析情報を、ＬＭＤ１と分析装置とは別のパーソナルコンピュータ等に読み込ませ、当該パーソナルコンピュータの表示部に試料画像と分析結果を併せて表示してもよい。また、本装置は、自動化することも可能であることから遠隔操作、解析をすることもでき、離れた場所から分析をしたり、検査を行ったりすることもできる。
　上記の例は、採取試料から２次元の分析を行う例を示しているが、本発明のＬＭＤ１又はＬＭＤ１を組み込んだ分析装置を用いて、３次元イメージングを行うこともできる。例えば、同じ組織から複数枚の試料切片を作製し、試料切片毎に上記と同様の手順で採取情報と分析情報を取得する際に、当該試料切片が組織から作製した何枚目の試料切片であるのかを関連付けて記憶することで、簡単に３次元イメージングを行うことができる。このとき各切片の画像の位置ずれをおこさない手段として、（１）検体の包埋時に包埋剤のしかるべき場所に有色ナイロンフロス等を位置マーカとして刺入する、（２）検体中の複数の特定箇所に墨汁等によるマーキングもしくは微小切削によるメスマークを作る等により位置マーカを作成し、制御用コンピュータ６４に組み込んだ画像処理機能により試料採取前に位置補正をした画像を表示すればよい。なお、各切片の厚みは非常に薄い場合には、組織から切り出した連続した試料切片はほとんど同じ大きさであるため、１枚目の試料を上記手順により採取情報を取得した後、２枚目の試料の撮像装置６で撮像した画像を表示部６５に表示する際に、１枚目の画像に重ね合うようにして表示し、１枚目の画像で設定した試料の採取範囲と同じになるように２枚目の画像で試料の採取範囲を設定してもよい。
　また、熱溶融性フィルム２２は、ダイセクションレーザー光を吸収することで溶解し、ダイセクションレーザー光の照射を止めることで再び固化し、固化する際にダイセクションレーザー光により切り出された試料と接着する。そのため、試料３４のダイセクションレーザー光を照射する位置座標を同じにしておき、１回目のダイセクションレーザー光の照射により採取された試料を熱溶融性フィルム２２の予め設定した位置に接着した後、試料３４は移動させず、熱溶融性フィルム２２のみを次に採取する試料の接着位置に移動し、ダイセクションレーザー光を照射する。そうすると、溶解した熱溶融性フィルム２２は、既に試料が採取された凹部に染み込むが、熱溶融性フィルム２２は粘性があることから、溶解した熱溶融性フィルム２２は固化する際には溶解していない熱溶融性フィルム２２に引き戻されるように固化するので、ダイセクションレーザー光で切り出された試料を接着してスライド２１に固定した試料３４から採取することができる。
　なお、上記の方法により試料を採取する場合、凹部の深さにより採取できる試料の量が異なる可能性がある。３次元イメージングをする際の定量性を向上するために、採取後の試料３４の深さを測定するための測定装置を設けてもよい。凹部の深さを測定し、採取された試料の量を求めることができるので、定量性が向上する。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔ＬＭＤの作製〕
　正立顕微鏡をベースに、駆動原としてステッピングモータ（Ｂｉｏ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ；ルードル社製）、移動手段駆動制御部として３Ｄ－Ａ－ＬＣＳソフトウエア（ルシール社製）、ダイセクションレーザー光源としてＺ－８０８－２００－ＳＭ（ルシール社製）を取り付けることで、本発明のＬＭＤを作製した。
＜実施例２＞
〔デバイスの作製〕
　スライドガラス上にＥＶＡ（東洋アドレ社製）をスピンコートすることで熱溶融性フィルムを形成した。熱溶融性フィルムの厚さは約５μｍであった。次に、インクジェットプリンターを用い、熱溶融性フィルムの親水度の低い領域に相当する部分を撥水性インキ（東洋アドレ社製：ＳＳ２５）で印刷して本発明のデバイスを作製した。図８は、作製したデバイスの親水度の高い領域に水を滴下した写真である。写真から明らかなように、滴下した水は親水度の高い領域内に留まっていた。
〔押圧手段の作製〕
＜実施例３＞
　押圧手段は、中空状のステンレスで作製した。図９（１）は側面から撮影した写真、図９（２）は底面から撮影した写真である。中空部分の直径は約９ｍｍで、重量は約３３ｇであった。また、中空部分の外側に凹部を設け、ゴム製の滑り止めを挿入した。
＜実施例４＞
　実施例３の押圧手段の上部の厚みを薄くすることで、実施例３の重量の約半分の押圧手段を作製した。
〔押圧を変化させた際のＬＭＤによる試料の採取〕
＜実施例５＞
　以下の手順により、ＬＭＤを用いて試料を切り出し、デバイスに接着させた。
〔分析組織の取得〕
　分析組織には、以下の手順で取得したＡＰＰ／ＰＳ１マウス（１０ヶ月齢、約２５ｇ）の脳を用いた。
１．マウスをジエチルエーテルで麻酔後、仰臥位にし、四肢を固定した。
２．開腹後、横隔膜を切開し、左右の肋骨を頭部方向へ切開した。
３．剣状突起をつまんで頭部方向へ反転し、鉗子で固定し、心臓を露出させた。
４．左心室に翼状針を刺し、１×ＰＢＳ溶液（生理食塩水）を注入した。
５．剪刀で右心耳を切開し、約７０ｍｌの生理食塩水で脱血・灌流した。
６．灌流後、頭部を切断し、開頭後脳を摘出した。
７．摘出した脳は矢状断で半切し切断面を下面（切削面）に配置後、包埋剤（ＯＣＴコンパウンド）に入れ凍結し、凍結ブロックを作製した。
〔試料切片の作製〕
　上記の手順で得られた凍結ブロックから、以下の手順で試料切片を作製した。
１．凍結ブロックから１０μｍの厚さで切片を作製した。なお、スライドガラスはコートなしのものを使用した。
２．凍結切片を以下の手順で乾燥させた。
（１）１００％アセトン　　　１０分
（２）ＰＢＳ　　　　　　　　　１分
（３）７０％エタノール　　　　１分
（４）１００％エタノール　　　１分
（５）１００％エタノール　　　１分
（６）１００％キシレン　　　　２分
（７）１００％キシレン　　　　２分
〔切片から試料の切出し及び熱可塑性フィルムへの接着〕
　以下の手順により、作製した凍結切片から設定した箇所の試料を採取し、デバイスに接着させた。
（１）実施例１で作製したＬＭＤの電源を入れ、デバイス移動手段の初期化を行った後、デバイスをデバイス移動手段にセットした。また、実施例３で作製した押圧手段を試料移動手段のアームの先端の孔に挿入した後、押圧手段の先端に試料切片が付着しているスライドガラスを試料面を下に向けて取付けた。
（２）凍結切片の画像を表示部に表示し、試料にダイセクションレーザー光を照射する位置座標を設定した。
（３）採取した試料をデバイスの所定の位置に接着するように、位置座標を設定した。
（４）Ｌｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｖ７（ルシール社製）のプログラムに従い、上記（２）及び（３）の位置座標にしたがって、試料にダイセクションレーザー光（出力：３００ｍＡ、照射時間：５ｍｓｅｃ、照射径：３０μｍ）を照射し、切り出した試料をデバイスの予め設定した箇所に接着・回収した。当該実施例で採取した試料の直径は６０μｍとなるようにレーザー強度を調節した。なお、作製したデバイスの親水度の高い領域の大きさとプログラムの関係上、デバイスの親水度の高い一つの領域内に採取した複数の試料が接着するように位置関係を調整した。図１０（１）は実施例５で切り出した試料の接着面の拡大写真である。
＜実施例６＞
　実施例３の押圧手段に代え、実施例４で作製した押圧手段を用いた以外は、実施例５と同様の手順で試料を切り出した。図１０（２）は実施例６で切り出した試料を接着したデバイス表面の拡大写真である。
＜比較例１＞
　押圧手段を用いず試料切片が付着しているスライドガラスを直接試料移動手段のアームに取付け、押圧のない状態でアームを操作して実施例５と同様にダイセクションレーザー光を照射した。図１０（３）は比較例１のデバイス表面の拡大写真である。
　図１０（１）～（３）から明らかなように、ＬＭＤの際に押圧手段を用いて試料とデバイスの熱溶融性フィルムを密着させることで試料を熱溶融性フィルムへ転写できること、更に、押圧の程度により、転写する試料の量が異なることが明らかとなった。
　本発明に係るＬＭＤは、採取試料を接着するデバイスを試料が載置したスライドより下側に配置している。そのため、試料採取後のデバイスの方向等を変えることなく、そのまま次の処理に回すことができる。更に、本発明のデバイスは、表面が平面状のウェル構造となっていることから、ＬＭＤで採取した試料をデバイス状で様々な前処理又は分析を行うことができる。したがって、医療機関や大学医学部などの研究機関、一般病院等において、組織分析のための装置として利用が可能である。

Claims (12)

  1. 　試料が載置したスライドを保持し、前記スライドを水平方向及び垂直方向に移動することができる試料移動手段、
    　試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを載置することができ、前記デバイスを水平方向に移動できるデバイス移動手段、
    　試料にダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部、
    　ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱溶融性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段、及び
    　前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱溶融性フィルムの位置座標に基づき、前記試料移動手段及び前記デバイス移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部、
    を含み、
    　前記ダイセクションレーザー光が前記デバイスの下方からデバイスを通して試料に照射する、
    レーザーマイクロダイセクション装置。
  2. 　前記スライドと前記熱溶融性フィルムを有するデバイスを圧着する押圧手段を含む請求項１に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  3. 　前記押圧手段が、前記スライドを保持する枠体である請求項２に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  4. 　前記試料移動手段が、前記枠体を保持するアームを有し、
    　前記押圧手段が、前記アームを含む請求項２又は３に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  5. 　前記試料移動手段が、前記スライドを保持するアームを駆動するモーターを有し、
    　前記押圧手段が、少なくとも前記モーターと前記アームを含み、前記モーターで前記アームを前記デバイス方向に付勢する請求項３又は４に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  6. 　基板、該基板上に形成された試料を転写するための熱溶融性フィルムを有するデバイスを含む請求項１～５の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  7. 　前記熱溶融性フィルムの表面は親水度の異なる領域で形成され、親水度の高い領域が親水度の低い領域で囲まれている請求項６に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
  8. 　請求項１～７の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。
  9. 　前記分析装置が、質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、及びマイクロチップ分析装置から選ばれる１種である請求項８に記載の分析装置。
  10. 　レーザーマイクロダイセクション装置を用い、熱溶融性フィルムを有するデバイスに試料を採取する試料採取方法であって、
    　前記デバイスの熱溶融性フィルムの試料を転写する位置の上に、採取すべき試料の位置を重ねるステップ、
    　前記デバイスの熱溶融性フィルムと試料を圧着する押圧ステップ、
    　前記デバイスの下方からダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱溶融性フィルムに採取試料として接着する試料採取ステップ、
    を含む試料採取方法。
  11. 　レーザーマイクロダイセクション装置に用いられるデバイスであって、
    　前記デバイスは、基板、及び該基板上に形成され試料を転写するための熱溶融性フィルムを含み、
    　前記熱溶融性フィルムの表面は親水度の異なる領域で形成され、親水度の高い領域が親水度の低い領域で囲まれているデバイス。
  12. 　前記熱溶融性フィルムと基板の間に、導電層が形成されている請求項１１に記載のデバイス。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018091634A (ja) * 2016-11-30 2018-06-14 国立大学法人名古屋大学 試料の処理方法、および試料処理用キット
WO2020045291A1 (ja) * 2018-08-28 2020-03-05 国立大学法人名古屋大学 レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法
WO2020129118A1 (ja) * 2018-12-17 2020-06-25 株式会社島津製作所 質量分析装置
WO2021130840A1 (ja) * 2019-12-24 2021-07-01 株式会社島津製作所 イメージングデータ処理方法、イメージングデータ処理装置、及びイメージングデータ処理用プログラム
WO2021186577A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23 国立大学法人東海国立大学機構 レーザマイクロダイセクション装置、レーザマイクロダイセクション方法、及び定量分析システム
WO2022003890A1 (ja) * 2020-07-02 2022-01-06 株式会社島津製作所 イメージング質量分析装置及びイメージング質量分析データ処理方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112683208B (zh) * 2020-12-04 2022-06-10 中国航空工业集团公司北京航空精密机械研究所 一种获取无基准位置度的方法
EP4053533A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-07 Leica Microsystems CMS GmbH Method for obtaining dissectates from a microscopic sample, laser microdissection system and computer program

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000504824A (ja) * 1996-02-05 2000-04-18 ペー・アー・エル・エム・ゲーエムベーハー レーザー照射を用いる平坦に配置される生物学的対象への非接触顕微注射、分別及び採取方法並びに装置
US20020045270A1 (en) * 2000-09-01 2002-04-18 Martin Schurenberg Structured biosample support plates for mass spectroscopic analyses and procedures for manufacturing and use
JP2002521687A (ja) * 1998-07-30 2002-07-16 アメリカ合衆国 短いパルス時間幅を用いる精密レーザー捕獲微小切出し
JP2002286592A (ja) * 2001-03-22 2002-10-03 Olympus Optical Co Ltd サンプルからその一部分を選抜する方法、その選抜方法に用いる担体、その選抜用担体の製造方法およびその選抜を行う装置
JP2003521685A (ja) * 2000-01-25 2003-07-15 エスエル マイクロテスト ビッセンシャフトリケ ゲレーテ ゲーエムベーハー 生物学的材料層の一部を単離する方法
JP2005534941A (ja) * 2002-07-30 2005-11-17 ライカ マイクロシステムス ヴェツラー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング レーザマイクロダイセクションを用いて切断可能な生物標本用の支持装置

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495195B2 (en) * 1997-02-14 2002-12-17 Arcturus Engineering, Inc. Broadband absorbing film for laser capture microdissection
EP1137923B1 (en) * 1998-12-10 2009-11-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Laser capture microdissection using two laser pulses for expanding and retracting a layer
US6743601B1 (en) * 1998-12-10 2004-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Non-contact laser capture microdissection
WO2001061311A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Arcturus Engineering, Inc. Transfer film for laser microcapture
DE10152404C5 (de) * 2001-10-24 2017-06-08 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Laser-Mikrodissektionssystem
WO2006031574A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-23 Arcturus Bioscience, Inc. Laser microdissection apparatus and method
DE102011001474A1 (de) * 2011-03-22 2012-09-27 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Laser-Mikrodissektionsverfahren und Laser-Mikrodissektionsvorrichtung

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000504824A (ja) * 1996-02-05 2000-04-18 ペー・アー・エル・エム・ゲーエムベーハー レーザー照射を用いる平坦に配置される生物学的対象への非接触顕微注射、分別及び採取方法並びに装置
JP2002521687A (ja) * 1998-07-30 2002-07-16 アメリカ合衆国 短いパルス時間幅を用いる精密レーザー捕獲微小切出し
JP2003521685A (ja) * 2000-01-25 2003-07-15 エスエル マイクロテスト ビッセンシャフトリケ ゲレーテ ゲーエムベーハー 生物学的材料層の一部を単離する方法
US20020045270A1 (en) * 2000-09-01 2002-04-18 Martin Schurenberg Structured biosample support plates for mass spectroscopic analyses and procedures for manufacturing and use
JP2002286592A (ja) * 2001-03-22 2002-10-03 Olympus Optical Co Ltd サンプルからその一部分を選抜する方法、その選抜方法に用いる担体、その選抜用担体の製造方法およびその選抜を行う装置
JP2005534941A (ja) * 2002-07-30 2005-11-17 ライカ マイクロシステムス ヴェツラー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング レーザマイクロダイセクションを用いて切断可能な生物標本用の支持装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY ET AL., ALZHEIMER-BYO KANREN BUNSHI NO NONAI BUNPU O 3-JIGEN DE SOKUTEI SURU KOTO NI SEIKO -LMD-MS-HO: ATARASHII SHITSURYO BUNSEKI IMAGING GIJUTSU NO KAKURITSU, 20 May 2014 (2014-05-20), Retrieved from the Internet <URL:http://www.jst.go.jp/pr/announce/20140520> [retrieved on 20160606] *
See also references of EP3282241A4 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018091634A (ja) * 2016-11-30 2018-06-14 国立大学法人名古屋大学 試料の処理方法、および試料処理用キット
WO2020045291A1 (ja) * 2018-08-28 2020-03-05 国立大学法人名古屋大学 レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法
JPWO2020045291A1 (ja) * 2018-08-28 2021-08-12 国立大学法人東海国立大学機構 レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法
JP7136490B2 (ja) 2018-08-28 2022-09-13 国立大学法人東海国立大学機構 レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法
WO2020129118A1 (ja) * 2018-12-17 2020-06-25 株式会社島津製作所 質量分析装置
WO2021130840A1 (ja) * 2019-12-24 2021-07-01 株式会社島津製作所 イメージングデータ処理方法、イメージングデータ処理装置、及びイメージングデータ処理用プログラム
WO2021186577A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23 国立大学法人東海国立大学機構 レーザマイクロダイセクション装置、レーザマイクロダイセクション方法、及び定量分析システム
WO2022003890A1 (ja) * 2020-07-02 2022-01-06 株式会社島津製作所 イメージング質量分析装置及びイメージング質量分析データ処理方法

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