WO2016153282A1 - 자가포식 특이적 억제제 발굴을 위한 스크리닝 방법 - Google Patents

자가포식 특이적 억제제 발굴을 위한 스크리닝 방법 Download PDF

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김정목
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method for discovering autophagy-specific inhibitors, and more particularly, the present invention processes libraries of candidates and various compounds, peptides, aptamers, and the like, which are expected to inhibit autophagy, Thereby, a method for screening autophagy-specific inhibitors capable of determining whether the inhibition of the formation of the Vps34-Beclin1-ATG14L complex, which plays an important role in the early stage of autophagy, is suitable for high throughput assay in vitro. It relates to a kit that can be used and a method for analyzing the binding capacity of the target protein capable of binding to Vps34 or a complex comprising the same.
  • autophagy pathway comprises two unique ubiquitin-like conjugation systems via Atg8PE (phosphatidylethanolamine) or Atg12Atg5, which comprises the yeast Vps34 homologue, class III PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) and Beclin1 (Yat derived Atg6). Autologgosomes, together with the complex consisting of).
  • Atg8PE phosphatidylethanolamine
  • Atg12Atg5 which comprises the yeast Vps34 homologue
  • class III PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • Beclin1 Yat derived Atg6
  • PI3K / AKT signaling pathway In many cell types, stimulation of the class I PI3K / AKT signaling pathway by growth factors and cytokines has the effect of inhibiting autophagy.
  • the inhibitory effect is expected to be due to class I PI3K / AKT-dependent activation of the rapamycin (TOR) kinase that downregulates autophagy.
  • TOR rapamycin
  • autophagosome precursors do not develop in cells treated with the PI 3-kinase inhibitors wortmannin and 3-methyladenine (3-MA), which are PI3K- in the early stages of autophagy vacuole formation. It suggests the importance of inhibiting the activity of AKT-mTORC1 signaling system.
  • Korean Patent Laid-Open No. 2011-0100435 discloses a pharmaceutical composition for preventing or treating autophagy-related diseases and a screening method thereof.
  • the material that can suppress the autophagy may be used for the treatment of diseases such as inflammatory bowel disease (type 1 diabetes), which is accompanied by autophagy.
  • Korean Patent Publication No. 2012-0088059 discloses a macrophage autophagy inhibitor containing interleukin-10 and an inhibitor of binding of interleukin-10 and IL-10 receptor or an inhibitor of PI3 kinase I activation.
  • Autophagy promoters of macrophages comprising as is disclosed.
  • the present inventors have made intensive studies to develop a method for effectively discovering a substance that specifically modulates only the autophagy process, and as a result, the formation of the Vps34-Beclin1-ATG14L complex which is specifically involved in the autophagy phenomenon was observed.
  • a protocol to screen autophagy-specific inhibitors by screening materials that inhibit the formation of Vps34-Beclin1-ATG14L complexes in various materials. The invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide a method for screening autophagy inhibitors using the Vps34-Beclin1-ATG14L complex.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for autophagy inhibitor screening comprising a Vps34-Beclin1 complex, ATG14L, and an agent capable of measuring levels thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for analyzing the binding force of a target protein capable of binding to Vps34 or a complex comprising the same.
  • the autophagy inhibitor screening method provided by the present invention it is possible to find an agent that can specifically suppress autophagy, and thus can be widely used in the development of various disease treatment compositions through suppression of autophagy. There will be.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an overview of a method for screening autophagy specific inhibitors using the Vps34-Beclin1-ATG14L complex.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of the expression and purification of each protein capable of forming the Vps34-Beclin1-ATG14L complex and electrophoresis thereof.
  • Figure 3a is a graph showing the results of verifying the effect of GST and GSH in the binding of the microwell plate and the Vps34 protein.
  • Figure 3b shows the binding saturation curve of the GST-Vps34 fusion protein on the microwell plate bound to GSH.
  • Figure 3c is a photograph showing the results of Western blot analysis of the GST-Vps34 fusion protein of various concentrations bound to the GSH-coupled microwell plate.
  • Figure 4a is a graph showing the results of verifying the effect of Vps34 in the binding of Beclin1 protein and Vps34-bound microwell plate.
  • Figure 4b shows the binding saturation curve of the Flag-Beclin1 fusion protein on the microwell plate to which Vps34 is bound.
  • Figure 4c is a photograph showing the results of Western blot analysis for the Flag-Beclin1 fusion protein of various concentrations bound to the Vps34-coupled microwell plate.
  • Figure 5a is a graph showing the results of verifying the effect of Beclin1 in the binding of ATG14L protein and microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound.
  • Figure 5b shows the binding saturation curve of the Flag-ATG14L fusion protein for the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound.
  • Figure 5c is a photograph showing the results of Western blot analysis of the Flag-ATG14L fusion protein of various concentrations bound to the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound.
  • Figure 6 is a graph showing the results of verifying the competition inhibitory effect of UVRAG in the binding of ATG14L protein and microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound.
  • the present inventors may target intracellular factors causing autophagy, thereby suppressing autophagy. If the candidate is expected to inhibit the action of the target, it is assumed that the candidate can be regarded as a substance capable of specifically inhibiting the autophagy. Based on this, autophagy was carried out. Attention has been focused on induction / nucleation. The autophagy may be divided into induction / nucleation, membrane elongation / closure, and vesicle trafficking / maturation / fusion / degradation. In addition to autophagy, various factors involved are essential for various intracellular trafficking activities (endosome trafficking, phagocytosis, etc.), and thus are not suitable targets for identifying substances that can specifically inhibit autophagy. Because it does not.
  • ULK1 (ATG1) protein kinase complex and PIK3C3 / VPS34 lipid kinase complex, among which ULK1 (ATG1) protein kinase complex is a variety of protein kinase present in the cell Since all interactions with are considered, we intended to use the PIK3C3 / VPS34 lipid kinase complex, which has relatively few intracellular interactions to consider, as a target to identify substances that can specifically inhibit autophagy. .
  • the lipid phosphorylation activity of the complex is known to be involved in various intracellular actions (phagocytosis, endosome trafficking / maturation, etc.) in addition to autophagy, the formation of the complex rather than target the lipid phosphorylation activity of the complex was used as a target.
  • the PIK3C3 / VPS34 lipid kinase complex can take various forms depending on the components that make up the complex.
  • the complex containing the ATG14L protein as a component (Vps34-Beclin1-ATG14L) is known as a autophagy specific PIK3C3 / VPS34 complex (pro-autophagy complex) and is actually intracellular.
  • the substance that inhibits the formation of the complex can be used as a material that can specifically inhibit autophagy Can be expected to
  • Vps34-Beclin1 is a key site commonly found in various PIK3C3 / VPS34 lipid kinase complexes among the complex (Vps34-Beclin1-ATG14L) including the ATG14L protein as a component, thereby specifically inhibiting autophagy.
  • the binding of ATG14L in the complex (Vps34-Beclin1-ATG14L) was used as a practical target.
  • Vps34-Beclin1-ATG14L a substance that inhibits the binding of ATG14L can be used as a substance that can specifically inhibit autophagy, so as Vps34 and Beclin1.
  • the present invention provides a method for screening autophagy inhibitors using Vps34, Beclin1 and ATG14L as one embodiment.
  • a first method of the screening method of the autophagy inhibitor provided by the present invention comprising the steps of: (a) treating a candidate substance expected to specifically inhibit autophagy in the Vps34-Beclin1-ATG14L complex; And (b) checking the levels of Beclin1 and ATG14L via Vps34.
  • the candidate is not particularly limited thereto, but may be a compound, an extract of natural products, a peptide, an aptamer, or the like.
  • autophagy or autophagocytosis refers to the basic catabolic mechanism involved in the degradation of intracellular organelles that are not needed or exhibit abnormal function using lysosomes.
  • By destroying the intracellular organelles to maintain the intracellular energy level can have the effect of improving cell viability.
  • Substantial autophagy is caused by the degeneration of the cytoplasm and intracellular organs into a double-membrane-bound structure called an autophagosome, which degrades with the lysosome to form an autolysosome. It is known that the material degraded by lysosomes is carried out by a process of hydrolysis and reuse.
  • the autophagy is induced by the formation of the Vps34-Beclin1-ATG14L complex, and can be interpreted as an intracellular action that can be inhibited by a substance that inhibits the binding of ATG14L included in the complex.
  • Vps34 (vacuolar protein sorting 34)", also referred to as “Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3" (PIK3C3), means a protein involved in intracellular autophagy.
  • the Vps34 is classified as a class III PI 3-phosphatase expressed in eukaryotic cells, and exhibits an enzymatic activity of phosphorylating phosphatidylinositol to form phosphatidylinositol (3) -phosphate.
  • Specific sequencing and protein information of the gene encoding the protein is known from NCBI (GenBank: NM_002647, NP_002638, etc.).
  • a protein composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used as Vps34.
  • Beclin1 refers to an ortholog protein of Atg 6 (autophagy-related gene 6) expressed in yeast as a protein expressed by the BECN1 gene. Beclin1 is not only involved in autophagy, but also plays an important role in development, cancer development and neurodegeneration. Specific sequencing and protein information of the gene encoding the protein is known from NCBI (GenBank: NM_003766, NP_003757, etc.). As an example, in the present invention, a protein composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was used as Beclin1.
  • ATG14L autophagy related 14
  • Barkor beclin 1-associated autophagy-related key regulator
  • the method can be performed to screen for agents that can specifically remove ATG14L from the Vps34-Beclin1-ATG14L complex that is specifically formed during autophagy, wherein the agent is capable of only ATG14L from the Vps34-Beclin1-ATG14L complex. Only when specifically removed can the formulation be determined as an autophagy inhibitor. For example, the level of Beclin1 measured in step (b) is not reduced than the level of Beclin1 before reaction with the candidate, and the level of ATG14L measured in step (b) before the reaction with the candidate Only when the level of ATG14L is reduced can a method be used to determine that the candidate is an autophagy inhibitor.
  • the method of measuring the level of the Beclin1 or ATG14L is not particularly limited, but as an example, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Western blotting (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (ELISA) RIA: Radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunoprecipitation assay, and the like.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Western blotting enzyme linked immunosorbent assay
  • ELISA radioimmunoassay
  • Radioimmunoassay Radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunoprecipitation assay, and the like.
  • the term “antibody” refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule. Such an antibody may be obtained by cloning a gene into an expression vector according to a conventional method. The protein encoded by the gene can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods.
  • the form of the antibody is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof may be included in the antibody of the present invention and may include all immunoglobulin antibodies, as well as humanized antibodies. It may also contain a special antibody of.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the antibody may be an antibody that can specifically bind to Vps34, Beclin1 or ATG14L to be measured in the reaction, and preferably a polyclonal that can specifically bind to each protein.
  • Vps34-Beclin1-ATG14L complex may be used in a state that is not particularly immobilized, or may be used in a form fixed to a carrier.
  • a method such as Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Step (b) may be performed, and when used in a fixed state, the step (b) may be performed through an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
  • the carrier is not particularly limited thereto, but may be, for example, a carrier made of a material such as nitrocellulose, polyvinyl resin, polystyrene resin, glass, and as another example. , A film, a 96 well plate, a bead, a slide glass, or the like, and as another example, a nitrocellulose, polyvinyl resin, polystyrene resin or glass film, 96 well plate, bead or slide glass And so on.
  • a screening method can be performed simultaneously on a plurality of candidates.
  • step (b) when the Vps34-Beclin1-ATG14L complex is fixed to the carrier in step (b), to accurately measure the levels of Beclin1 and ATG14L contained in the Vps34-Beclin1-ATG14L complex fixed to the carrier, step (a) After the completion of the washing, the carrier may further include removing Beclin1 and ATG14L not fixed to the carrier.
  • a second method of the screening method of the autophagy inhibitor provided by the present invention comprising the steps of: (a) treating ATG14L with candidates expected to specifically inhibit autophagy in the Vps34-Beclin1 complex; And (b) determining the level of ATG14L bound to the Vps34-Beclin1 complex.
  • the Vps34-Beclin1 complex may also be in a form fixed to the carrier, in this case, the same as described above for the carrier, and in step (b), ATG14L contained in the Vps34-Beclin1-ATG14L complex fixed to the carrier
  • the carrier may be further washed to remove the ATG14L not immobilized on the carrier.
  • the method of confirming the level of the candidate substance, Vps34, Beclin1, ATG14L, ATG14L disclosed in the method is the same as described above.
  • the second method can screen for autophagy inhibitors having different properties than the first provided method.
  • the first provided method is a method for screening a substance capable of specifically removing ATG14L from the Vps34-Beclin1-ATG14L complex as an autophagy inhibitor
  • the second method is to provide the Vps34-Beclin1 complex.
  • a method for screening a substance capable of inhibiting ATG14L from binding to an autophagy inhibitor consequently, autophagy inhibitors having different properties can be screened.
  • the second method can be performed to screen for agents capable of specifically inhibiting the binding of ATG14L to the Vps34-Beclin1 complex that is specifically formed during autophagy, wherein the agent is directed to the Vps34-Beclin1 complex.
  • the agent can be determined as an autophagy inhibitor.
  • the level of ATG14L measured in step (b) is reduced compared to the level of ATG14L identified by reacting with only ATG14L without treating the candidate, the candidate is determined to be an autophagy inhibitor. Can be used.
  • it may be an autophagy specific inhibitor discovery method disclosed in FIG. 1.
  • GST-Vps34 protein is fixed in a fixed direction in a GSH coated microwell plate.
  • Beclin1 and ATG14L proteins were sequentially added to the plate to reconstruct the Vps34-Beclin1-ATG14L complex, which is an essential PIK3C3 / VPS34 complex for promoting autophagy. Binding of each protein was confirmed by ELISA response to each protein.
  • a library of compounds such as compounds, peptides, aptamer libraries were added to the prepared assay plates, and then the levels of Beclin1 and ATG14L remaining on the plates were measured and added. It was confirmed whether the dust had an inhibitory effect.
  • ELISA detection results for Beclin1 and ATG14L proteins will not change (A). If the substance is responsible for the release of GST-Vps34 protein from the plate (B) or inhibits the Vps34-Beclin1 response (C), ELISA detection signals for Beclin1 and ATG14L proteins will be reduced. Substances that inhibit the Vps34-Beclin1 response (C) cannot be autophagy specific inhibitors because the Vps34-Beclin1 response is also observed in the non-phasing PIK3C3 / VPS34 complex. In contrast, if the agent inhibits the binding of ATG14L to the Vps34-Beclin1 complex, the ELISA detection signal for ATG14L but not Beclin1 will be reduced.
  • the present invention provides a kit for autophagy inhibitor screening comprising a Vps34-Beclin1 complex, an ATG14L, an agent capable of measuring the level of Beclin1, and an agent capable of measuring the level of ATG14L.
  • ATG14L is treated with the Vps34-Beclin1 complex to form the Vps34-Beclin1-ATG14L complex, and then the candidate substance expected to be able to specifically inhibit autophagy to the formed complex or Vps34
  • the level of the carrier, ATG14L, or Beclin1, to which the Vps34-Beclin1 complex is immobilized is determined. Kits comprising an agent that can be measured and an agent that can measure the level of ATG14L can be used for autophagy inhibitor screening.
  • the Vps34-Beclin1 complex may be included in a non-fixed state, or may be included in a fixed state on the carrier, which is the same as described above.
  • the term "agent capable of measuring the level of Beclin1” refers to a means for measuring the level of Beclin1 from a complex bound to a carrier in performing the screening method provided by the present invention.
  • the antibody that can specifically bind to Beclin1 the antibody is the same as defined above.
  • agent which can measure the level of ATG14L means a means for measuring the level of ATG14L from the complex bound to the carrier in performing the screening method provided by the present invention.
  • the antibody may specifically bind to ATG14L, and the antibody is the same as defined above.
  • the kit provided in the present invention is in addition to the above-described components (agents capable of measuring the level of the Vps34-Beclin1 complex, ATG14L, Beclin1 formulations and agents capable of measuring the level of ATG14L) in the screening method
  • agents capable of measuring the level of the Vps34-Beclin1 complex ATG14L, Beclin1 formulations and agents capable of measuring the level of ATG14L
  • One or more other constituent compositions, solutions or devices may be included.
  • the kit of the present invention is labeled with a carrier to which the Vps34-Beclin1 complex is immobilized, an antibody capable of specifically binding to ATG14L, Beclin1, an antibody capable of specifically binding to ATG14L, a color development enzyme, or a fluorescent substance Kits for autophagy inhibitor screening comprising secondary antibodies and chromogenic substrates.
  • the chromase is not particularly limited, but peroxidase (peroxidase), alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase) may be used, and the fluorescent substance is not particularly limited thereto, but Fluorescein isothiocyanate (FITC), Rhodamine B-RITC isothiocyanate), and the chromophoric substrate liquid is not particularly limited thereto, but may be ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), OPD (o-phenylenediamine), TMB (3, 3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine).
  • peroxidase peroxidase
  • alkaline phosphatase Alkaline Phosphatase
  • the fluorescent substance is not particularly limited thereto, but Fluorescein isothiocyanate (FITC), Rhodamine B-RITC isothiocyanate
  • the present invention provides a method of preparing a conjugate comprising: (a) treating Vps34 or a complex including Vps34 with a protein of interest to be measured for binding to the Vps34 or a complex to obtain respective binders; And (b) measuring a binding concentration according to the treatment concentration of the target protein, and measuring the binding force of the target protein to the Vps34 or the complex, the target protein capable of binding to the Vps34 or the complex including the same. It provides a method of analyzing the binding force of the.
  • the Vps34 or the complex containing the Vps34 may be in a form fixed to the carrier, the carrier used is the same as described above, in step (b), the level of the conjugate fixed to the carrier accurately measured To this end, after the step (a) is finished, the carrier may be further washed to remove the target protein which is not immobilized on the carrier.
  • the complex of step (a) may be a complex (Vps34-Beclin1 complex) comprising Vps34 ;
  • the target protein of step (a) may be Beclin1 or ATG14L.
  • the binding force measurement in step (b) can be performed using a binding curve prepared using the concentration of the target protein processed in step (a) and the concentration of the conjugate measured in step (b).
  • the method of measuring the concentration of the conjugate is not particularly limited, but, for example, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) ), Radioimmunodiffusion, Ouchterlony immune diffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunoprecipitation assays, and the like.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA Radioimmunoassay
  • Radioimmunodiffusion Ouchterlony immune diffusion
  • rocket immunoelectrophoresis immunoprecipitation assays, and the like.
  • Example One Self-feeding Preparation of protein constituting the complex for promotion
  • a polynucleotide encoding a fusion protein in which a GST residue is bound to the N-terminus of Vps34 a polynucleotide encoding a fusion protein in a form where a Flag residue is bound to the N-terminus of Beclin1, or an N-terminus of ATG14L.
  • Polynucleotides encoding the fusion protein in the form of the flag residues were respectively prepared, and introduced into the mammalian cell expression vector to produce an expression vector capable of expressing each fusion protein.
  • Each of the expression vectors was then introduced into HEK293 cells cultured in DMEM medium containing glucose (25 mM), 10% FBS, and 50 / penicillin / streptomycin to express transformants capable of expressing respective fusion proteins. Produced.
  • Each of the transformants was then cultured, and each of them was then subjected to cold cytolysis buffer (10 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 and protease inhibitors). , pH7.5) to obtain a cell lysate, and the cell lysate was centrifuged (14,000 rpm and 10 minutes) to obtain a supernatant.
  • cold cytolysis buffer (10 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 and protease inhibitors). , pH7.5
  • the supernatant was added to GSH-Sepharose beads (GST-Vps34) or Flag-M2 agarose beads (Flag-Beclin1 or Flag-ATG14L) equilibrated with the lysis buffer, and used for 4 to 2 hours using a rotator. Reacted. The reaction was centrifuged (1,000 rpm and 2 minutes) to recover precipitated beads and then washed with cytolysis buffer containing high concentrations of NaCl (0.5-1 M).
  • the washed beads were finally washed with cytolysis buffer, then using GSH elution buffer (20 mM GSH and 50 mM Tris, pH8.0) or 3XFlag elution buffer (cytolysis buffer containing 200 ng / 3XFlag peptide). Protein was recovered from the beads. The recovered protein was dialyzed overnight at 4 with dialysis solution (10% glycerol and 20 mM Tris, pH8.0) to prepare the respective fusion proteins of interest (FIG. 2).
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of the expression and purification of each protein capable of forming the Vps34-Beclin1-ATG14L complex and electrophoresis thereof. As shown in Figure 2, it was confirmed that each protein constituting the Vps34-Beclin1-ATG14L complex that can promote autophagy is prepared in the form of a fusion protein (GST-Vps34, Flag-Beclin1 or Flag-ATG14L).
  • Example 2 In the fusion protein prepared in Example 1, a microwell plate capable of binding GST-Vps34 was prepared.
  • PBS containing 100 mM GSH (pH 8.0) was added to each well of a 96 well microwell plate and allowed to react overnight at 4 or completely dry at 60 overnight.
  • the microwell plate was then washed with TBST buffer (150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 10 mM Tris, pH8.0) to remove unbound GSH and blocked by treatment with PBS containing 5% skim milk powder.
  • TBST buffer 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 10 mM Tris, pH8.0
  • Example 3-1 ELISA analysis
  • the solution obtained by dissolving the GST-Vps34 fusion protein prepared in Example 1 in TBST buffer was obtained, and the solution was dispensed into each well of the GSH-coupled microwell plate prepared in Example 2, and slowly shaken. Reaction overnight at 4, and to compare to this, the reaction was carried out using a microwell plate without GSH binding instead of the microwell plate with GSH binding or with the Vps34 protein instead of the GST-Vps34 fusion protein. .
  • each well of each microwell plate was washed with TBST buffer containing 0.5% NP-40 (TBST-P5 buffer) and the primary antibody against Vps34 diluted (1: 500) in TBST buffer 50 was dispensed into each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • each well was washed with TBST buffer, HRP-bound secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. The color reaction was then induced using TMB solution as the substrate and the color development was measured at 450 nm to quantify the level of Vps34 protein bound to each microwell plate (FIG. 3A).
  • Figure 3a is a graph showing the results of verifying the effect of GST and GSH in the binding of the microwell plate and the Vps34 protein. As shown in FIG. 3a, when the GST-Vps34 fusion protein was bound to the GSH-coupled microwell plate, it was confirmed that Vps34-coupled microwell plate was most effectively produced.
  • Figure 3b shows the binding saturation curve of the GST-Vps34 fusion protein on the microwell plate bound to GSH. As shown in FIG. 3B, when the GST-Vps34 fusion protein was added to the GSH-coupled microwell plate at a level of 150 to 200 nM, it was confirmed that their binding level did not increase any more.
  • Immunoblotting analysis was performed to compare the binding activity of the GST-Vps34 fusion protein on the GSH-bound microwell plate. That is, GST-Vps34 fusion proteins of various concentrations (42.5, 85, 170, or 340 nM) were added to each well of the microwell plate to which GSH was bound, the wells were washed, and then the buffer for SDS-PAGE sample was added thereto. Then, the GST-Vps34 fusion protein bound to each well was extracted. The extracted GST-Vps34 fusion protein was applied to 10% SDS-PAGE, and Western blot analysis using anti-Vps34 antibody was performed (FIG. 3C).
  • Figure 3c is a photograph showing the results of Western blot analysis of the GST-Vps34 fusion protein of various concentrations bound to the GSH-coupled microwell plate. As shown in FIG. 3C, when the GST-Vps34 fusion protein was added at a concentration of 170 nM or more, the level of GST-Vps34 fusion protein bound to the microwell plate no longer increased, which confirms the result of FIG. 3B. Can know.
  • Example 3-1 A solution obtained by dissolving the Flag-Beclin1 fusion protein prepared in Example 1 in TBST buffer was obtained, and the solution was dispensed into each well of the Vps34-bound microwell plate prepared in Example 3-1, The reaction was carried out for 2 hours at, and in comparison with the microwell plate with nothing bound, instead of the microwell plate with Vps34 bound. After the reaction was completed, the method of Example 3-1 was carried out except that the primary antibody against Beclin1 diluted in TBST buffer (1: 100) was used to bind the Vps34-coupled microwell plate. The level of Beclin1 protein was quantitated (FIG. 4A).
  • Figure 4a is a graph showing the results of verifying the effect of Vps34 in the binding of Beclin1 protein and Vps34-bound microwell plate. As shown in FIG. 4A, when the Flag-Beclin1 fusion protein was bound to the Vps34-coupled microwell plate, it was confirmed that Vps34-Beclin1-coupled microwell plate was most effectively produced.
  • Figure 4b shows the binding saturation curve of the Flag-Beclin1 fusion protein on the microwell plate to which Vps34 is bound. As shown in Figure 4b, when the Flag-Beclin1 fusion protein is added to the Vps34-coupled microwell plate at a level of 1.5 M or more, it was confirmed that their binding level does not increase any more.
  • Flags-Beclin1 fusion proteins of various concentrations (40.18, 0.36, 0.73 or 1.46 M) are added to each well of the microwell plate to which Vps34 is bound, the wells are washed, and the buffer for the SDS-PAGE sample is added.
  • the Flag-Beclin1 fusion protein bound to each well was extracted.
  • the extracted Flag-Beclin1 fusion protein was applied to 10% SDS-PAGE, and Western blot analysis using anti-Beclin1 antibody was performed (FIG. 4C).
  • Figure 4c is a photograph showing the results of Western blot analysis for the Flag-Beclin1 fusion protein of various concentrations bound to the Vps34-coupled microwell plate. As shown in FIG. 4C, when the Flag-Beclin1 fusion protein was added at a concentration of 1.46 M or more, the level of the Vps34-Beclin1 complex bound to the microwell plate no longer increased, which confirms the result of FIG. 4B. Can know.
  • Example 5-1 ELISA analysis
  • a solution obtained by dissolving the Flag-ATG14L fusion protein prepared in Example 1 in TBST buffer was obtained, and the solution was dispensed into each well of the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex prepared in Example 4-1 was bound.
  • the reaction was carried out at room temperature for 2 hours, and for comparison, the reaction was performed using a microwell plate having Vps34 bound instead of a microwell plate having Vps34-Beclin1 complex bound thereto.
  • the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound was carried out by following the method of Example 3-1, except for using the primary antibody against ATG14L diluted (1: 500) in TBST buffer.
  • the level of TG14L protein bound to was quantitated (FIG. 5A).
  • Figure 5a is a graph showing the results of verifying the effect of Beclin1 in the binding of ATG14L protein and microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound. As shown in FIG. 5A, when the Flag-ATG14L fusion protein was bound to the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound, it was confirmed that the microwell plate to which the Vps34-Beclin1-ATG14L complex was bound could be most effectively produced.
  • Figure 5b shows the binding saturation curve of the Flag-ATG14L fusion protein for the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound.
  • FIG. 5B when the Flag-ATG14L fusion protein was added to the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound at a level of 12 nM or more, it was confirmed that their binding level did not increase any more.
  • the immunoblot analysis was performed to compare the binding activity of the Flag-ATG14L fusion protein to the treatment concentrations of the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound. That is, Flags-ATG14L fusion protein at various concentrations (0.78, 1.56, 3.12, 6.25, or 12.5 nM) was added to each well of the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound, the wells were washed, and then the SDS- A PAGE sample buffer was added to extract the Flag-ATG14L fusion protein bound to each well. The extracted Flag-ATG14L fusion protein was applied to 10% SDS-PAGE, and Western blot analysis using anti-ATG14L antibody was performed (FIG. 5C).
  • Figure 5c is a photograph showing the results of Western blot analysis of the Flag-ATG14L fusion protein of various concentrations bound to the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound. As shown in FIG. 5C, when the Flag-ATG14L fusion protein is added at a concentration of 12.5 nM or more, the level of the Vps34-Beclin1-ATG14L complex bound to the microwell plate no longer increases, which confirms the result of FIG. 5B. It was found to be.
  • Example 5-1 Since the substance which inhibits the binding of Beclin1 and ATG14L in the Vps34-Beclin1-ATG14L complex prepared in Example 5-1 can be regarded as an autophagy specific inhibitor, a protein capable of competing with ATG14L in binding to Beclin1 UVRAG, known as, was used to verify the usefulness of the complex.
  • Example 1 except for using a polynucleotide encoding a fusion protein in the form of the flag residues bonded to the N- terminal of the UVRAG, the method of Example 1 was carried out to prepare a Flag-UVRAG fusion protein.
  • Vps34-Beclin1 prepared in Example 4-1 simultaneously with the respective solutions obtained by dissolving the Flag-ATG14L fusion protein prepared in Example 1 or the prepared Flag-UVRAG fusion protein in TBST buffer at various concentrations.
  • the wells were aliquoted into each well of the microwell plate to which the complexes were bound, reacted for 2 hours at room temperature, and then using the respective primary antibodies against ATG14L or UVRAG diluted in TBST buffer (1: 500).
  • the method of Example 3-1 was followed to quantify the level of ATG14L protein bound to the microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex was bound (FIG. 6).
  • Figure 6 is a graph showing the results of verifying the competition inhibitory effect of UVRAG in the binding of ATG14L protein and microwell plate to which the Vps34-Beclin1 complex is bound. As shown in FIG. 6, when UVRAG was not treated, ATG14L protein bound to the microwell plate was detected at a high level, but as the level of UVRAG treatment increased, the level of ATG14L protein bound to the microwell plate was increased. It was confirmed that the decrease.

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Abstract

본 발명은 자가포식을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질 및 다양한 화합물, 펩타이드, 압타머등의 라이브러리를 처리하고, 이에 의하여 자가포식 현상의 초기단계에 중요한 역할을 하는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체의 형성의 저해 여부를 in vitro상에서 고처리량 검정에 적합하게 판별할 수 있는 자가포식 특이적 억제제의 스크리닝 방법, 상기 방법에 사용될 수 있는 키트 및 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 자가포식 억제제 스크리닝 방법을 이용하면, 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 자가포식의 억제를 통한 다양한 질환 치료용 조성물의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

자가포식 특이적 억제제 발굴을 위한 스크리닝 방법
본 발명은 자가포식 특이적 억제제 발굴을 위한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 자가포식을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질 및 다양한 화합물, 펩타이드, 압타머등의 라이브러리를 처리하고, 이에 의하여 자가포식 현상의 초기단계에 중요한 역할을 하는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체의 형성의 저해 여부를 in vitro상에서 고처리량 검정에 적합하게 판별할 수 있는 자가포식 특이적 억제제의 스크리닝 방법, 상기 방법에 사용될 수 있는 키트 및 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법에 관한 것이다.
자가포식(autophagy) 현상은 기아상태생존, 감염성 세균으로부터의 보호 및 신경붕괴조절과 같은 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 이는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다. 초기에는, 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중-막-결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 오토파고좀은 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용된다. 그러나, 이러한 과정에 내재한 분자적 작용기작은 아직 밝혀지지 않았기 때문에 이를 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
지금까지 알려진 바에 의하면, 효모, 초파리 등을 대상으로 수행된 다양한 유전학/생화학적 연구를 통하여 세포내에서 자가포식(autophagy) 현상을 일으키는데 필요한 단백질들이 발굴되었고, 이들의 상관관계를 분석하기 위한 연구가 수행되고 있다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면, 자가포식은 유도단계(induction/nucleation), 세포막 변형단계(membrane elongation/closure) 및 포식단계(vesicle trafficking/maturation/fusion/degradation)의 세 가지 단계로 크게 구분된다고 알려져 있다. 또한, 자가포식 경로는 Atg8PE(phosphatidylethanolamine) 또는 Atg12Atg5을 경유하는 두개의 독특한 유비퀴틴-유사 접합 시스템을 포함하는데, 상기 경로는 효모의 Vps34 동족체인 클라스 III PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)과 Beclin1(효모유래 Atg6의 오토로그)으로 구성된 복합체와 함께 오토파고좀 형성에 관련된다.
많은 종류의 세포에서, 성장요소 및 사이토카인에 의한 class I PI3K/AKT 신호 경로의 자극은 자가포식을 억제하는 효과를 나타낸다. 상기 억제 효과는 아마도 오토파지를 하향 조절하는 라파마이신표적(target of rapamycin(TOR)) 키나아제의 class I PI3K/AKT-의존적 활성화 때문인 것으로 예상되고 있다. 예를 들어, PI 3-키나아제 억제제인 워트마닌(wortmannin) 및 3-메틸아데닌(3-MA)으로 처리한 세포에서는 오토파고좀 전구체가 발생하지 않는데, 이는 오토파지성 액포 형성 초기단계에서 PI3K-AKT-mTORC1 신호전달계의 활성 억제의 중요성을 시사한다. 이러한 자가포식 현상의 억제 또는 활성화는 단순한 세포활성 뿐만 아니라, 상기 세포를 포함하는 생체내 생리학적 또는 병리학적 변화에 큰 영향을 미친다. 근래 다양한 동물모델 및 질병의 유전자 분석 연구를 통하여 자가포식과정이 당뇨, 고혈압등의 대사성 질환, 퇴행성 뇌질환, 감염성 질환, 그리고 암등의 매우 다양한 질환에서 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨으로써 그 중요성이 부각되고 있다. 따라서 자가포식 (autophagy)를 조절하는 물질 발굴은 새로운 작용점을 타겟으로 하는 질병치료제 개발에 매우 중요한 역할을 할 것으로 기대하고 있다.
특히, 암질환의 치료와 관련하여 자가포식 현상을 조절 할 수 있는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이는 상당수의 암세포가 암세포 발생의 초기단계에서는 자가포식 현상을 억제하여 암세포의 성장을 유도하고, 또한 암세포가 형성된 이후에 활성화하여 영양, 산소결핍 및 항암제에 대한 저항성을 나타냄이 보고된바 있다. 따라서, 상기 자가포식 현상을 조절할 수 있는 물질은 암세포에서 항암효과를 나타낸다고 할 수 있으며, 이러한 자가포식 현상을 이용하여 암을 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2011-0100435호에는 자가포식 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝방법이 개시되어 있다.
또한, 상기 자가포식 현상을 억제할 수 있는 물질은 자가포식 현상이 수반되는 염증성 창자병(inflammatory bowel disease), 제1형 당뇨병 등과 같은 질환의 치료에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2012-0088059호에는 인터루킨-10을 유효성분으로 함유하는 대식세포의 자가포식 억제제 및 인터루킨-10과 IL-10 수용체의 결합 저해제 또는 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 대식세포의 자가포식 촉진제가 개시되어 있다.
그러나 현재까지 자가포식 과정만을 특이적으로 조절하는 물질의 부재로 자가포식을 억제하는 PI3K-AKT-mTORC1 신호전달계를 차단하는 물질을 이용하여 자가포식과정을 활성화하거나 자가포식의 최종분해 장소인 리소좀의 기능을 방해하는 물질을 이용하여 자가포식을 억제하는 방법이 이용되고 있다. 하지만 이들은 autophagy뿐만 아니라 다양한 세포내 생리활성을 조절함으로써 자가포식과정을 타겟으로 한 약물개발에 있어 많은 부작용이 예상된다.
본 발명자들은 자가포식과정만을 특이적으로 조절하는 물질을 효과적으로 발굴하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 자가포식 현상에 특이적으로 관여하는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체의 형성을 고처리량 검정법(High-throughput format) 확인할 수 있는 시스템을 고안하였고 이를 이용하여 다양한 물질을 대상으로 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체 형성을 저해하는 물질을 스크리닝하여 자가포식 특이적 억제제를 발굴할 수 있는 프로토콜을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 이용한 자가포식 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Vps34-Beclin1 복합체, ATG14L 및 이들의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 자가포식 억제제 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 자가포식 억제제 스크리닝 방법을 이용하면, 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 자가포식의 억제를 통한 다양한 질환 치료용 조성물의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 이용하여, 자가포식 특이적인 억제제를 스크리닝하는 방법의 개요를 나타내는 개략도이다.
도 2는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 형성할 수 있는 각 단백질을 발현 및 정제하고, 이를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a는 마이크로웰 플레이트와 Vps34 단백질의 결합에 있어서, GST와 GSH의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 GST-Vps34 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다.
도 3c는 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 GST-Vps34 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4a는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트와 Beclin1 단백질의 결합에 있어서, Vps34의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-Beclin1 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다.
도 4c는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 Flag-Beclin1 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5a는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트와 ATG14L 단백질의 결합에 있어서, Beclin1의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-ATG14L 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다.
도 5c는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 Flag-ATG14L 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트와 ATG14L 단백질의 결합에 있어서, UVRAG의 경쟁억제 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 보다 효과적으로 제공할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 자가포식 현상을 유발시키는 세포내 인자를 표적으로 하여, 자가포식을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질이 상기 표적의 작용을 억제할 경우 상기 후보물질을 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질로 간주할 수 있을 것으로 가정하고, 이에 기초하여 다양한 연구를 수행하던 중, 자가포식 현상을 유발하는 유도단계(induction/nucleation)에 주목하게 되었다. 상기 자가포식 현상은 유도단계(induction/nucleation), 세포막 변형단계(membrane elongation/closure) 및 포식단계(vesicle trafficking/maturation/fusion/degradation)로 구분될 수 있는데, 이 중에서 세포막 변형단계 및 포식단계에 관여하는 다양한 인자들은 자가포식 현상 이외에도 세포내 다양한 물질이동 작용(endosome trafficking, phagocytosis 등)에도 필수적으로 관여하기 때문에, 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 발굴하기 위한 표적으로는 적절하지 않기 때문이다.
한편, 상기 유도단계에 관여하는 것으로 알려진 대표적인 인자는 ULK1(ATG1) 단백질 인산화효소 복합체와 PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체인데, 이 중에서 ULK1(ATG1) 단백질 인산화효소 복합체는 세포내에 존재하는 다양한 단백질 인산화효소와의 상호작용을 모두 고려해야 하기 때문에, 상대적으로 고려해야할 세포내 상호작용의 수가 적은 PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체를 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 발굴하기 위한 표적으로 사용하고자 하였다. 그러나, 상기 복합체의 지질 인산화 활성은 자가포식 현상 이외에도 다양한 세포내 작용(phagocytosis, endosome trafficking/maturation 등)에 관여함이 알려져 있으므로, 상기 복합체의 지질 인산화 활성을 표적으로 사용하기 보다는 상기 복합체의 형성여부를 표적으로 사용하고자 하였다.
PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체는 상기 복합체를 구성하는 구성요소에 따라 다양한 형태를 나타낼 수 있다. 이러한 다양한 형태의 PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체 중에서 ATG14L 단백질을 구성요소로 포함하는 복합체(Vps34-Beclin1-ATG14L)는 자가포식 특이적 PIK3C3/VPS34 복합체(pro-autophagy complex)로 알려져 있고, 실제로 세포내에서 ATG14L 발현을 억제하면 PIK3C3/VPS34 복합체의 다양한 기능 중 자가포식 현상만이 특이적으로 억제되므로, 상기 복합체의 형성을 억제하는 물질은 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질로 사용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
또한, 상기 ATG14L 단백질을 구성요소로 포함하는 복합체(Vps34-Beclin1-ATG14L) 중에서 Vps34-Beclin1은 다양한 PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체에서 공통적으로 발견되는 핵심부위이기 때문에, 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 발굴하기 위하여, 상기 복합체(Vps34-Beclin1-ATG14L)에서 ATG14L의 결합여부를 실질적인 표적으로 사용하였다. 즉, PIK3C3/VPS34 지질 인산화효소 복합체(Vps34-Beclin1-ATG14L)를 형성함에 있어서, ATG14L의 결합을 억제하는 물질이 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질로 사용될 수 있으므로, Vps34 및 Beclin1으로 구성된 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질과 ATG14L를 동시에 또는 순차적으로 가하여 상기 복합체(Vps34-Beclin1-ATG14L)가 형성되는지의 여부를 확인함으로써, 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 스크리닝 할 수 있다.
한편, 상술한 자가포식 현상을 특이적으로 억제할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 변형시켜서, Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석할 수 있는데, 상기 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질을 다양한 농도로 처리하고, 상기 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 목적 단백질이 결합된 결합체의 농도를 정량한 다음, 상기 처리된 목적 단백질의 농도와 정량된 결합체의 농도를 이용하여 작성한 결합곡선을 이용하여 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석할 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 Vps34, Beclin1 및 ATG14L를 이용하여 자가포식 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 자가포식 억제제의 스크리닝 방법의 첫 번째 방법으로서, (a) Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 Vps34를 통해 Beclin1 및 ATG14L의 수준을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 후보물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 화합물, 천연물의 추출물, 펩타이드, 앱타머 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어, "자가포식(autophagy or autophagocytosis)"이란, 리소좀을 사용하여 필요없거나 또는 이상기능을 나타내는 세포내 소기관의 분해에 관여하는 기본적인 이화작용기작을 의미하는데, 영양결핍과 같은 특수한 상황에서는 세포내 소기관을 파괴하여 세포내 에너지 수준을 유지함으로써 세포 생존성을 향상시키는 효과를 나타낼 수 있다. 실질적인 자가포식 현상은 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중-막-결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 오토파고좀은 리소좀과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용되는 과정에 의해 수행되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자가포식은 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체의 형성에 의하여 유발되고, 상기 복합체에 포함된 ATG14L의 결합을 억제하는 물질에 의하여 억제될 수 있는 세포내 작용으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어, "Vps34(vacuolar protein sorting 34)"란, "PIK3C3(Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3)"라고도 호칭되고, 세포내 자가포식에 관여하는 단백질을 의미한다. 상기 Vps34는 진핵세포에서 발현되는 Class III PI 3-인산화효소의 일종으로 구분되고, 포스파티딜이노시톨을 인산화시켜서 포스파티딜이노시톨 (3)-인산을 형성하는 효소활성을 나타낸다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_002647, NP_002638 등). 일 례로서, 본 발명에서는 Vps34로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 사용하였다.
본 발명의 용어, "Beclin1"이란, BECN1 유전자에 의하여 발현된 단백질로서 효모에서 발현된 Atg 6(autophagy-related gene 6)의 상동체(ortholog) 단백질을 의미한다. 상기 Beclin1은 자가포식에 관여할 뿐만 아니라, 발달, 암발생 및 신경퇴화에 중요한 역할을 수행한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_003766, NP_003757 등). 일 례로서, 본 발명에서는 Beclin1으로서 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 사용하였다.
본 발명의 용어, "ATG14L(autophagy related 14)"란, "Barkor(beclin 1-associated autophagy-related key regulator)"라고도 호칭되며, Beclin1과 결합하여 자가포식에 관여하는 단백질을 의미한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_014924.4, NP_055739.2 등). 일 례로서, 본 발명에서는 ATG14L로서 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 사용하였다.
상기 방법은 자가포식 과정에서 특이적으로 형성되는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에서 ATG14L를 특이적으로 제거할 수 있는 제제를 스크리닝하기 위하여 수행될 수 있는데, 상기 제제가 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에서 ATG14L 만을 특이적으로 제거할 경우에만, 상기 제제를 자가포식 억제제로서 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 (b) 단계에서 측정된 Beclin1의 수준은 후보물질과의 반응이전의 Beclin1의 수준보다 감소되지 않고, 상기 (b) 단계에서 측정된 ATG14L의 수준이 후보물질과의 반응이전의 ATG14L의 수준보다 감소된 경우에만, 상기 후보물질이 자가포식 억제제인 것으로 판정하는 방법을 사용할 수 있다.
이때, 상기 Beclin1 또는 ATG14L의 수준을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer), 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 상기 반응물에서 측정하고자 하는 Vps34, Beclin1 또는 ATG14L에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
아울러, 상기 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체는 특별히 고정되지 않은 상태로 사용될 수도 있고, 담체에 고정된 형태로 사용될 수도 있는데, 고정되지 않은 상태로 사용될 경우, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 등의 방법을 통하여 (b) 단계를 수행할 수 있고, 담체에 고정된 상태로 사용될 경우, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등의 방법을 통하여 (b) 단계를 수행할 수 있다.
상기 복합체가 담체에 고정된 형태로 사용될 경우, 상기 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 례로서, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐 수지, 폴리스티렌 수지, 유리 등의 재질로 구성되는 담체가 될 수 있고, 다른 예로서, 막, 96웰 플레이트, 비드, 슬라이드 글라스 등의 형태를 갖는 담체가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐 수지, 폴리스티렌 수지 또는 유리재질의 막, 96웰 플레이트, 비드 또는 슬라이드 글라스 등이 될 수 있다. 특히, 상기 담체가 96웰 플레이트의 형태를 갖는 경우, 다수의 후보물질을 대상으로 동시에 스크리닝 방법을 수행할 수 있다.
한편, 상기 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체가 담체에 고정된 경우 상기 (b) 단계에서, 담체에 고정된 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에 포함된 Beclin1 및 ATG14L의 수준을 정확하게 측정하기 위하여, (a) 단계가 종료된 후, 상기 담체를 세척하여, 상기 담체에 고정되지 않은 Beclin1 및 ATG14L을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 자가포식 억제제의 스크리닝 방법의 두 번째 방법으로서, (a) Vps34-Beclin1 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질과 ATG14L을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 Vps34-Beclin1 복합체에 결합된 ATG14L의 수준을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 Vps34-Beclin1 복합체 역시 담체에 고정된 형태가 될 수 있는데, 이 경우, 담체에 대하여는 상술한 바와 동일하고, (b) 단계에서, 담체에 고정된 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에 포함된 ATG14L의 수준을 정확하게 측정하기 위하여, (a) 단계가 종료된 후, 상기 담체를 세척하여, 상기 담체에 고정되지 않은 ATG14L을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 아울러, 상기 방법에 개시된 후보물질, Vps34, Beclin1, ATG14L, ATG14L의 수준을 확인하는 방법 등은 상술한 바와 동일하다.
상기 두 번째 방법은 첫 번째로 제공한 방법과는 다른 특성을 지닌 자가포식 억제제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 첫 번째로 제공한 방법은 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에서 ATG14L를 특이적으로 제거할 수 있는 물질을 자가포식 억제제로서 스크리닝 하는 방법임에 반하여, 두 번째로 제공하는 방법은 Vps34-Beclin1 복합체에 ATG14L이 결합하는 것을 억제할 수 있는 물질을 자가포식 억제제로서 스크리닝 하는 방법이므로, 결과적으로는 다른 특성을 갖는 자가포식 억제제를 각각 스크리닝할 수 있다.
따라서, 상기 두 번째 방법은 자가포식 과정에서 특이적으로 형성되는 Vps34-Beclin1 복합체에 ATG14L의 결합을 특이적으로 억제할 수 있는 제제를 스크리닝하기 위하여 수행될 수 있는데, 상기 제제가 Vps34-Beclin1 복합체에 대한 ATG14L의 결합을 억제할 경우에, 상기 제제를 자가포식 억제제로서 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 (b) 단계에서 측정된 ATG14L의 수준이, 상기 후보물질을 처리하지 않고 ATG14L 만을 가하여 반응시켜서 확인된 ATG14L의 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 후보물질이 자가포식 억제제인 것으로 판정하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 자가포식 억제제의 스크리닝 방법을 도면을 통해 설명하면 다음과 같다.
일 례로서, 도 1에 개시된 자가포식 특이적 억제제 발굴법이 될 수 있다.
GST-Vps34 단백질은 GSH 코팅된 마이크로웰 플레이트에 일정한 방향으로 고정된다. 상기 플레이트에 Beclin1과 ATG14L 단백질을 순차적으로 가하여, 필수적인 자가포식 촉진용 PIK3C3/VPS34 복합체인 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 재구성하였다. 각 단백질의 결합은 각 단백질에 대한 ELISA 반응으로 확인하였다. 자가포식 특이적 억제제를 스크리닝하기 위하여, 화합물, 펩타이트, 앱타머 라이브러리와 같은 목적물질의 라이브러리를 상기 제작된 분석용 플레이트에 가한 다음, 상기 플레이트에 잔류하는 Beclin1과 ATG14L의 수준을 측정하여, 가하여진 물질이 억제효과를 나타내는지의 여부를 확인하였다. 예를 들어, 상기 물질이 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에 영향을 주지 않는다면 Beclin1 및 ATG14L 단백질에 대한 ELISA 검출결과가 변화지 않을 것이다(A). 만일, 상기 물질이 플레이트로부터 GST-Vps34 단백질의 방출원인이 되거나(B) 또는 Vps34-Beclin1 반응을 저해한다면(C), Beclin1 및 ATG14L 단백질에 대한 ELISA 검출신호가 감소될 것이다. Vps34-Beclin1 반응을 억제하는(C) 물질은 자가포식 특이적 억제제가 될 수 없는데, 이는 Vps34-Beclin1 반응이 비자가포식적 PIK3C3/VPS34 복합체에서도 관찰되기 때문이다. 이에 비하여, 상기 물질이 Vps34-Beclin1 복합체에 대한 ATG14L의 결합을 억제한다면, Beclin1이 아닌 ATG14L에 대한 ELISA 검출신호가 감소될 것이다
본 발명은 다른 하나의 양태로서 Vps34-Beclin1 복합체, ATG14L, Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제 및 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 자가포식 억제제 스크리닝용 키트를 제공한다.
상술한 바와 같이, Vps34-Beclin1 복합체에 ATG14L을 처리하여, Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 형성한 다음, 상기 형성된 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리하거나 또는 Vps34-Beclin1 복합체에 ATG14L과 상기 후보물질을 동시에 처리할 경우, 상기 후보물질이 자가포식 억제제로 판정할 수 있는지의 여부를 확인할 수 있으므로, 상기 Vps34-Beclin1 복합체가 고정된 담체, ATG14L, Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제 및 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 키트는 자가포식 억제제 스크리닝을 위하여 사용될 수 있다. 이때, 상기 Vps34-Beclin1 복합체는 특별히 고정되지 않은 상태로 포함될 수도 있고, 담체에 고정된 상태로 포함될 수도 있는데, 상기 담체에 대하여는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 용어 "Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법을 수행함에 있어서, 담체에 결합된 복합체로부터 Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 수단을 의미하는데, 일 례로서, Beclin1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 상기 항체는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
본 발명의 용어 "ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법을 수행함에 있어서, 담체에 결합된 복합체로부터 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 수단을 의미하는데, 일 례로서, ATG14L에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 상기 항체는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
한편, 본 발명에서 제공하는 키트는 상술한 구성요소(Vps34-Beclin1 복합체가 고정된 담체, ATG14L, Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제 및 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제) 이외에도 상기 스크리닝 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
일 례로서, 본 발명의 키트는 Vps34-Beclin1 복합체가 고정된 담체, ATG14L, Beclin1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, ATG14L에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질를 포함하는 자가포식 억제제 스크리닝용 키트가 될 수 있다. 이때, 상기 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 상기 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC(Fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine B-isothiocyanate) 등이 될 수 있으며, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), OPD(o-phenylenediamine), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 등이 될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 (a) Vps34 또는 상기 Vps34를 포함하는 복합체에 상기 Vps34 또는 복합체와의 결합력을 측정하고자 하는 목적 단백질을 농도별로 처리하여 각각의 결합체를 수득하는 단계; 및, (b) 상기 목적 단백질의 처리 농도에 따른 결합체 농도를 측정하여, 상기 Vps34 또는 복합체에 대한 목적 단백질의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 Vps34 또는 상기 Vps34를 포함하는 복합체는 담체에 고정된 형태가 될 수 있고, 이때 사용된 담체는 상술한 바와 동일하며, 상기 (b) 단계에서, 담체에 고정된 결합체의 수준을 정확하게 측정하기 위하여, (a) 단계가 종료된 후, 상기 담체를 세척하여, 상기 담체에 고정되지 않은 목적 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 복합체는 Vps34를 포함하는 복합체(Vps34-Beclin1 복합체)가 될 수 있고; 상기 (a) 단계의 목적 단백질은 Beclin1 또는 ATG14L가 될 수 있다.
또한, (b) 단계의 결합력 측정은, (a) 단계에서 처리된 목적 단백질의 농도와 (b) 단계에서 측정된 결합체의 농도를 이용하여 작성된 결합곡선(binding curve)을 이용하여 수행할 수 있는데, 상기 결합체의 농도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer), 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay) 등이 될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 자가포식 촉진용 복합체를 구성하는 단백질의 제조
먼저, Vps34의 N-말단에 GST 잔기가 결합된 형태의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Beclin1의 N-말단에 Flag 잔기가 결합된 형태의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 ATG14L의 N-말단에 Flag 잔기가 결합된 형태의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 제작하고, 이들을 포유동물세포 발현벡터에 도입하여 각각의 융합단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작하였다.
이어, 상기 각 발현벡터를 글루코스(25 mM), 10% FBS 및 50 / 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양된 HEK293 세포에 각각 도입하여 각각의 융합단백질을 발현시킬 수 있는 형질전환체를 제작하였다.
이어, 상기 각 형질전환체를 배양한 다음, 이들 각각을 차가운 세포용해 완충액(10 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 및 단백질분해효소 억제제, pH7.5)에서 용해시켜서 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물을 원심분리(14,000 rpm 및 10분)하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액을 상기 세포용해 완충액으로 평형화시킨 GSH-세파로스 비드(GST-Vps34) 또는 Flag-M2 아가로스 비드(Flag-Beclin1 또는 Flag-ATG14L)에 가하고, 회전배양기를 사용하여 4 에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 원심분리(1,000 rpm 및 2분)하여 침전된 비드를 회수한 다음, 고농도의 NaCl(0.5 내지 1M)을 포함하는 세포용해 완충액으로 세척하였다. 상기 세척된 비드를 세포용해 완충액으로 최종 세척한 다음, GSH 용출완충액(20 mM GSH 및 50 mM Tris, pH8.0) 또는 3XFlag 용출완충액(200 ng/ 3XFlag 펩타이드를 포함하는 세포용해 완충액)을 사용하여 상기 비드로부터 단백질을 회수하였다. 상기 회수된 단백질을 투석액(10% glycerol 및 20 mM Tris, pH8.0)으로 4에서 하룻밤 동안 투석하여 목적하는 각각의 융합단백질을 제조하였다(도 2).
도 2는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 형성할 수 있는 각 단백질을 발현 및 정제하고, 이를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 자가포식을 촉진할 수 있는 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 구성하는 각 단백질이 융합단백질(GST-Vps34, Flag-Beclin1 또는 Flag-ATG14L)의 형태로 제조됨을 확인하였다.
실시예 2: GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트의 제작
상기 실시예 1에서 제조된 융합단백질 중에서 GST-Vps34가 결합될 수 있는 마이크로웰 플레이트를 제작하였다.
구채적으로, 96웰 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 100 mM GSH (pH8.0)를 포함하는 PBS를 가하고, 4에서 하룻밤동안 반응시키거나 또는 60에서 하룻밤동안 완전히 건조시켰다. 이어, 상기 마이크로웰 플레이트를 TBST 완충액(150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 및 10 mM Tris, pH8.0)으로 세척하여 결합되지 않은 GSH를 제거하고 5% 탈지분유를 포함하는 PBS를 처리하여 블로킹하여, 표면에서 비특이적 결합이 유발되지 않고, GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트를 제작하였다.
실시예 3: GST - Vps34 융합단백질과 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트의 결합활성 분석
실시예 3-1: ELISA 분석
상기 실시예 1에서 제조된 GST-Vps34 융합단백질을 TBST 완충액에 용해시킨 용액을 수득하고, 상기 용액을 상기 실시예 2에서 제작된 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 분주하였으며, 천천히 흔들면서 4에서 하룻밤 동안 반응시키고, 이와 비교하기 위하여, GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트 대신에 GSH가 결합되지 않은 마이크로웰 플레이트를 사용하여 반응시키거나 또는 GST-Vps34 융합단백질 대신에 Vps34 단백질을 사용하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 각 마이크로웰 플레이트의 각 웰을 0.5% NP-40를 포함하는 TBST 완충액(TBST-P5 완충액)으로 세척하고, TBST 완충액에 희석된(1:500) Vps34에 대한 일차항체를 각 웰에 50 씩 분주하였으며, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 각 웰을 TBST 완충액으로 세척하고, HRP가 결합된 2차 항체를 가한 다음 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 기질로서 TMB 용액을 사용하여 발색반응을 유도하고, 발색수준은 450 nm에서 측정함으로써, 각 마이크로웰 플레이트에 결합된 Vps34 단백질의 수준을 정량분석하였다(도 3a).
도 3a는 마이크로웰 플레이트와 Vps34 단백질의 결합에 있어서, GST와 GSH의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, GST-Vps34 융합단백질을 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합시킬 경우, 가장 효과적으로 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트를 제작할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-2: 결합포화곡선 분석
GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 GST-Vps34 융합단백질의 결합포화곡선을 제작하기 위하여, 다양한 농도의 GST-Vps34 융합단백질을 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가하고, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 발색수준을 측정한 다음, 이를 이용하여 결합포화곡선을 제작하였다(도 3b).
도 3b는 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 GST-Vps34 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다. 도 3b에서 보듯이, GST-Vps34 융합단백질을 150 내지 200nM 수준으로 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가할 경우, 이들의 결합수준이 포화되어 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다.
실시예 3-3: 면역블럿 분석
면역블럿 분석을 수행하여, GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 GST-Vps34 융합단백질의 처리농도별 결합활성을 비교하였다. 즉, GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 다양한 농도(42.5, 85, 170 또는 340nM)의 GST-Vps34 융합단백질을 가하여 결합시키고, 상기 웰을 세척한 다음, SDS-PAGE 시료용 완충액을 가하여, 상기 각 웰에 결합된 GST-Vps34 융합단백질을 추출하였다. 상기 추출된 GST-Vps34 융합단백질을 10% SDS-PAGE에 적용하고, 항-Vps34 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3c).
도 3c는 GSH가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 GST-Vps34 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3c에서 보듯이, 170nM 이상의 농도로 GST-Vps34 융합단백질을 가한 경우에는 상기 마이크로웰 플레이트에 결합된 GST-Vps34 융합단백질의 수준이 더 이상 증가하지 않으며, 이는 상기 도 3b의 결과를 검증하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 4: Flag- Beclin1 융합단백질과 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트의 결합활성 분석
실시예 4-1: ELISA 분석
상기 실시예 1에서 제조된 Flag-Beclin1 융합단백질을 TBST 완충액에 용해시킨 용액을 수득하고, 상기 용액을 상기 실시예 3-1에서 제작된 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 분주하였으며, 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 이와 비교하기 위하여, Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트 대신에 아무것도 결합되지 않은 마이크로웰 플레이트를 사용하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, TBST 완충액에 희석된(1:100) Beclin1에 대한 일차항체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 Beclin1 단백질의 수준을 정량분석하였다(도 4a).
도 4a는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트와 Beclin1 단백질의 결합에 있어서, Vps34의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, Flag-Beclin1 융합단백질을 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합시킬 경우, 가장 효과적으로 Vps34-Beclin1이 결합된 마이크로웰 플레이트를 제작할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-2: 결합포화곡선 분석
Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-Beclin1 융합단백질의 결합포화곡선을 제작하기 위하여, 다양한 농도의 Flag-Beclin1 융합단백질을 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가하고, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 발색수준을 측정한 다음, 이를 이용하여 결합포화곡선을 제작하였다(도 4b).
도 4b는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-Beclin1 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다. 도 4b에서 보듯이, Flag-Beclin1 융합단백질을 1.5 M 이상의 수준으로 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가할 경우, 이들의 결합수준이 포화되어 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다.
실시예 4-3: 면역블럿 분석
면역블럿 분석을 수행하여, Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-Beclin1 융합단백질의 처리농도별 결합 활성을 비교하였다. 즉, Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 다양한 농도(40.18, 0.36, 0.73 또는 1.46 M)의 Flag-Beclin1 융합단백질을 가하여 결합시키고, 상기 웰을 세척한 다음, SDS-PAGE 시료용 완충액을 가하여, 상기 각 웰에 결합된 Flag-Beclin1 융합단백질을 추출하였다. 상기 추출된 Flag-Beclin1 융합단백질을 10% SDS-PAGE에 적용하고, 항-Beclin1항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4c).
도 4c는 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 Flag-Beclin1 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4c에서 보듯이, 1.46M 이상의 농도로 Flag-Beclin1 융합단백질을 가한 경우에는 상기 마이크로웰 플레이트에 결합된 Vps34-Beclin1 복합체의 수준이 더 이상 증가하지 않으며, 이는 상기 도 4b의 결과를 검증하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 5: Flag- ATG14L 융합단백질과 Vps34 - Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트의 결합활성 분석
실시예 5-1: ELISA 분석
상기 실시예 1에서 제조된 Flag-ATG14L 융합단백질을 TBST 완충액에 용해시킨 용액을 수득하고, 상기 용액을 상기 실시예 4-1에서 제작된 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 분주하였으며, 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 이와 비교하기 위하여, Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트 대신에 Vps34가 결합된 마이크로웰 플레이트를 사용하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, TBST 완충액에 희석된(1:500) ATG14L에 대한 일차항체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 TG14L 단백질의 수준을 정량분석하였다(도 5a).
도 5a는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트와 ATG14L 단백질의 결합에 있어서, Beclin1의 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, Flag-ATG14L 융합단백질을 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합시킬 경우, 가장 효과적으로 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트를 제작할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5-2: 결합포화곡선 분석
Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-ATG14L 융합단백질의 결합포화곡선을 제작하기 위하여, 다양한 농도의 Flag-ATG14L 융합단백질을 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가하고, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 발색수준을 측정한 다음, 이를 이용하여 결합포화곡선을 제작하였다(도 5b).
도 5b는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-ATG14L 융합단백질의 결합포화곡선을 나타낸다. 도 5b에서 보듯이, Flag-ATG14L 융합단백질을 12 nM 이상의 수준으로 Vps34-Beclin1복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 가할 경우, 이들의 결합수준이 포화되어 더 이상 증가하지 않음을 확인하였다.
실시예 5-3: 면역블럿 분석
면역블럿 분석을 수행하여, Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 대한 Flag-ATG14L 융합단백질의 처리농도별 결합활성을 비교하였다. 즉, Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 다양한 농도(0.78, 1.56, 3.12, 6.25 또는 12.5 nM)의 Flag-ATG14L 융합단백질을 가하여 결합시키고, 상기 웰을 세척한 다음, SDS-PAGE 시료용 완충액을 가하여, 상기 각 웰에 결합된 Flag-ATG14L 융합단백질을 추출하였다. 상기 추출된 Flag-ATG14L 융합단백질을 10% SDS-PAGE에 적용하고, 항-ATG14L 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 5c).
도 5c는 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 다양한 농도의 Flag-ATG14L 융합단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 5c에서 보듯이, 12.5 nM 이상의 농도로 Flag-ATG14L 융합단백질을 가한 경우에는 상기 마이크로웰 플레이트에 결합된 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체의 수준이 더 이상 증가하지 않으며, 이는 상기 도 5b의 결과를 검증하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 6: Vps34 - Beclin1 - ATG14L 복합체를 이용한 자가포식 특이적 억제제 스크리닝 방법의 유용성 검증
상기 실시예 5-1에서 제작된 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체에서 Beclin1과 ATG14L의 결합을 억제하는 물질은 자가포식 특이적 억제제로 간주할 수 있으므로, Beclin1에 대한 결합에 있어서 ATG14L과 경쟁할 수 있는 단백질로 알려진 UVRAG을 사용하여 상기 복합체의 유용성을 검증하고자 하였다.
먼저, UVRAG의 N-말단에 Flag 잔기가 결합된 형태의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 방법을 수행하여 Flag-UVRAG 융합단백질을 제조하였다.
다음으로, 상기 실시예 1에서 제조된 Flag-ATG14L 융합단백질 또는 상기 제조된 Flag-UVRAG 융합단백질을 TBST 완충액에 다양한 농도로 용해시킨 각각의 용액을 동시에 상기 실시예 4-1에서 제작된 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 분주하였으며, 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, TBST 완충액에 희석된(1:500) ATG14L 또는 UVRAG에 대한 각각의 일차항체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트에 결합된 ATG14L 단백질의 수준을 정량분석하였다(도 6).
도 6은 Vps34-Beclin1 복합체가 결합된 마이크로웰 플레이트와 ATG14L 단백질의 결합에 있어서, UVRAG의 경쟁억제 효과를 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, UVRAG이 처리되지 않은 경우에는, 상기 마이크로웰 플레이트에 결합된 ATG14L 단백질이 높은 수준으로 검출되었으나, UVRAG의 처리수준이 증가할 수록 상기 마이크로웰 플레이트에 결합된 ATG14L 단백질의 수준이 감소함을 확인하였다.
따라서, 자가포식을 특이적으로 억제할 것으로 예상되는 Beclin1과 ATG14L의 결합을 억제하는 물질은 상기 Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체를 통해 스크리닝 할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (16)

  1. (a) Vps34(vacuolar protein sorting 34)-Beclin1-ATG14L(autophagy related 14) 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 Vps34를 통해 Beclin1 및 ATG14L의 수준을 확인하는 단계를 포함하는, 자가포식 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Vps34(vacuolar protein sorting 34)-Beclin1-ATG14L(autophagy related 14) 복합체는 담체에 고정된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 측정된 Beclin1의 수준은 후보물질과의 반응이전의 Beclin1의 수준보다 감소되지 않고, 상기 (b) 단계에서 측정된 ATG14L의 수준이 후보물질과의 반응이전의 ATG14L의 수준보다 감소된 경우, 상기 후보물질이 자가포식 억제제인 것으로 판정하는 것인 방법.
  4. (a) Vps34(vacuolar protein sorting 34)-Beclin1 복합체에 자가포식을 특이적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질과 ATG14L(autophagy related 14)을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 Vps34-Beclin1 복합체에 결합된 ATG14L의 수준을 확인하는 단계를 포함하는, 자가포식 억제제의 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 Vps34(vacuolar protein sorting 34)-Beclin1 복합체는 담체에 고정된 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 측정된 ATG14L의 수준이, 상기 후보물질을 처리하지 않고 ATG14L 만을 가하여 반응시켜서 확인된 ATG14L의 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 후보물질이 자가포식 억제제인 것으로 판정하는 것인 방법.
  7. Vps34(vacuolar protein sorting 34)-Beclin1 복합체, ATG14L(autophagy related 14), Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제 및 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 자가포식 억제제 스크리닝용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 Vps34-Beclin1 복합체는 담체에 고정된 것인 키트.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제는 Beclin1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인 것인 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제는 ATG14L에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인 것인 키트.
  11. 제7항에 있어서,
    Vps34-Beclin1-ATG14L 복합체가 고정된 96웰 플레이트, Beclin1의 수준을 측정할 수 있는 제제 및 ATG14L의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것인 키트.
  12. (a) Vps34(vacuolar protein sorting 34) 또는 상기 Vps34를 포함하는 복합체에 상기 Vps34 또는 복합체와의 결합력을 측정하고자 하는 목적 단백질을 농도별로 처리하여 각각의 결합체를 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 목적 단백질의 처리 농도에 따른 결합체 농도를 측정하여, 상기 Vps34 또는 복합체에 대한 목적 단백질의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, Vps34 또는 이를 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 목적 단백질의 결합력을 분석하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 Vps34 또는 상기 Vps34를 포함하는 복합체는 담체에 고정된 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 복합체는 Vps34-Beclin1 복합체인 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 목적 단백질은 Beclin1 또는 ATG14L(autophagy related 14)인 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 결합력 측정은, (a) 단계에서 처리된 목적 단백질의 농도와 (b) 단계에서 측정된 결합체의 농도를 이용하여 작성된 결합곡선(binding curve)을 이용하여 수행되는 것인 방법.
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