KR102323335B1 - Carm1에 의한 pontin의 아르기닌 메틸화를 통한 자가포식 조절 방법 및 그 용도 - Google Patents

Carm1에 의한 pontin의 아르기닌 메틸화를 통한 자가포식 조절 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 핵내에서 작용하는 CARM1-PONTIN-FOXO3a 신호전달체계를 표적으로 하는 자가포식 조절 방법, 또는 자가포식 조절제 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 상기 기전 축을 중심으로 다양한 수준에서 자가포식 조절 문제로 인한 다양한 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CARM1에 의한 PONTIN의 아르기닌 메틸화를 통한 자가포식 조절 방법 및 그 용도 {Method of modulating autophagy mediated by methylation of PONTIN at arginine resisues by CARM1}
본원은 자가포식 조절 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
자가포식(Autophagy)은 세포내 영양분이 부족한 환경에서 세포가 자신의 불필요한 단백질, 노화된 소기관 등을 지질 이중층으로 구성된 자가포식소체(membrane vacuole, autophagosome)가 둘러싼 후 라이소좀과 합쳐져 둘러싸인 내부 물질을 분해하도록 유도하는 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정 (Levine and Klionsky, (2004) Dev Cell 6, 463-377)으로, 결함이 있는 거대 단백질 복합체 및 세포내 소기관을 제거하여, 세포 성장, 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다.
따라서 자가포식 조절에 이상이 있는 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생하는 것으로 알려져 있다 (Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884).
또한 자가포식은 암세포에서 활성화 (Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther.,8(7), 2036-2045)되며, 자가포식 억제제가 항암 치료제로서 작용하는 것으로 알려져 있다 (Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752). 아울러 암 및 신경변성 질환에 추가하여 자가포식은 간 질환, 심장 질환, 근육 질환 및 췌장 질환과 연관된 것으로 알려져 있다 (Levine and Kroemer, (2008), Cell, 132, 27-42; Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)).
따라서, 세포의 자가포식의 조절을 통한 다양한 치료제 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1594168호에는 p62의 ZZ 영역에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도에 대하여 개시하고 있다.
미국 공개특허공보 제2010-0233730호는 치료를 위한 자가포식 조절에 관한 것으로, 세포에 시험물질을 처리한 후 대사 스트레스를 가해 자가포식체(autophagosome)의 세포내 변화 관찰을 통해, 자가포식 조절제를 선별하는 방법을 개시하고 있다.
하지만 이들은 세포질에서 작용하는 자가포식 단백질 기반의 기술로서, 핵 내에서의 전사과정이나 후성유전학적 작용 기전에 기반한 자가포식 조절기술에 대하여는 알려지지 않았으며, 보다 근본적인 조절을 위해 핵내에서 작용하는 기전에 기반한 자가포식 조절제의 개발이 필요하다.
본원은 핵내에서 작용하는 기전에 기반한 자가포식 조절 방법, 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 메틸전달효소인 CARM1 (Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 PONTIN 단백질의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 방법은 포도당이 결핍된 상태에서 CARM1 및 상기 메틸전달효소 CARM1의 기질로서 PONTIN 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 제 1 단계; 상기 세포에 메틸전달효소 CARM1의 상기 PONTIN에 대한 메틸화 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 제 2 단계; 상기 PONTIN 단백질을 상기 세포로부터 분리하는 제 3 단계: 상기 분리된 PONTIN 단백질의 서열번호 1을 기준으로 333번 및 339번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 제 4 단계; 및
상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 제 5 단계를 포함하며, 상기 메틸화 증가는 자가포식 증가, 상기 메틸화 감소는 자가포식 억제를 나타낸다.
다른 구현예에서는 상기 제 1 단계는 FOXO3a 단백질을 추가로 발현하며, 상기 제 4 단계 대신에, 또는 이에 추가하여, 상기 PONTIN 및 FOXO3a 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 측정결과 상기 단백질 간의 결합 증가는 자가포식 증가, 결합 감소는 자가포식 억제를 나타낸다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 PONTIN은 서열번호 2를 기준으로 상기 FOXO3a 단백질의 624, 627, 628, 640 및 642 잔기를 통해 FOXO3a와 결합한다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 상기 제 4 단계에 추가하여, 상기 세포에서 분리된 히스톤 4(H4) 단백질의 아세틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 측정결과 상기 H4 단백질의 아세틸화 증가는 자가포식 증가, 결합 감소는 자가포식 억제를 나타낸다.
또 다른 구현예에서 상기 히스톤 4의 아세틸화는 서열번호 3의 서열을 기준으로 6, 9, 13 및 17번째 라이신 잔기에서 발생한다.
자가포식은 영양분 결핍, 대사성 스트레스, 바이러스 감염, 노화 등 다양한 스트레스 상황에서 활성화되어 세포의 생존 및 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 기작으로 자가포식 신호 조절에 문제가 생겼을 때 암과 퇴행성 뇌질환 등 여러 질병과 관련이 깊다. 핵 내에서 작용하는 기전에 기반한 자가포식 조절 방법을 스크리닝을 통해 알 수 있다면 자가포식 이상에 기인한 질환들 (암, 퇴행성 뇌 질환 등)의 새로운 치료 표적을 발굴하는 과정에서 이론적인 기반 지식을 제공할 수 있다.
이에 본원에 따른 CARM1-PONTIN-FOXO3a 신호전달체계를 표적으로 하는 자가포식 조절 방법은 다양한 수준에서 자가포식 조절문제로 인한 다양한 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 CARM1에 의해 Pontin의 R333, R339 잔기가 아르기닌 메틸화 된다. (a) HEK293T에 발현시킨 Flag-CARM1을 Flag-M2 agarose를 이용하여 pulldown함. Mass spectrometric 분석을 통해 포도당 결핍 상황에서 CARM1과 결합하는 단백질인 Pontin을 규명함. (b) affinity chromatography에서 나온 eluate에서 CARM1의 결합 단백질로서 Pontin을 immunoblot으로 보임. (c) CARM1과 Pontin/Reptin의 결합을 GST pulldown 실험을 보임. (d) His-Pontin과 HA-CARM1 WT / R169A 돌연변이를 이용하여 in vitro 메틸화 실험 결과. (e) GST-Pontin WT과 R333/339A 돌연변이를 HA-CARM1을 이용하여 in vitro 메틸화 시킴. 이후 Rme2a 항체로 immunoblot한 결과 (f) Pontin WT, R333K/R339K, R333A/R339A 돌연변이를 이용하여 in vitro 메틸화 실험 결과. RI 이용한 버전 (g) Pontin의 구조와 R333, R339 잔기 (h) 여러 종에서의 Pontin 단백질 서열과 보존된 R333, R339 잔기. (i) 제작한 Pontin 메틸화 항체를 dot blot을 통해 확인. 사용한 펩타이드 Methyl peptide sequence: IVIFASNR(me2)GNCVIR(me2) GTEDITS; Non-methyl peptide sequence: IVIFASNRGNCVIRGTEDITS. (j) GST-Pontin WT, R333A, R339A, R333/339A과 CARM1을 이용하여 in vitro 메틸화 진행. 이후 Rme2a 항체로 immunoblot. (k) GST-Pontin WT, R333K, R339K ,R333/339K로 위와 동일한 실험 결과. Rme2a 항체와 Pontin 메틸화 항체 사용. (l) His-Pontin과 HA-CARM1 WT/R169A를 이용하여 in vitro 메틸화 실험 진행. Pontin 메틸화 항체로 확인한 결과이다.
도 2는 CARM1에 의한 Pontin의 메틸화는 포도당 결핍 상태에서 핵 안에서 일어난다. (a) 포도당 결핍 18시간 상황에서 HeLa 세포에서의 CARM1과 Pontin의 결합 (b) CARM1 inhibitor EZM2302 (100 nM), EPZ025654 (100 nM)를 96시간 처리한 뒤 Pontin의 메틸화 측정. (c) CARM1 WT MEF와 knockout MEF에서의 포도당 결핍 상황에서의 Pontin 메틸화 변화 (d) CARM1 KO MEF에 CARM1 WT 혹은 R169A를 발현시킨 뒤 Pontin 메틸화 변화 (e) MEF의 핵과 세포질에서의 Pontin 메틸화 변화 (f) Pontin 메틸화와 CARM1을 찍은 confocal 이미지.
도 3은 Pontin의 메틸화가 결핍 의존적 자가포식의 증가에 중요하다. (a) Pontin f/f MEF에 Flag-Pontin WT or R333A/R339A (RA) stable하게 발현시키는 방법 모델 (b) Pontin의 protein 발현 레벨 (c) Pontin f/f + Flag Pontin WT/RK,RA MEF에 cre 처리 후 Pontin 메틸화 항체로 IP (d) 대표적인 GFP-LC3 puncta 이미지. Scale bar 20um, 그래프는 LC3-positive 세포수를 정량화 한 것 (e) Pontin WT, RA MEF에서 immuneblot 결과. 숫자는 LC3-II/bactin 비율 (f) bafilomycin A1 처리 유무에 따른 대표적인 GFP-LC3 puncta 이미지. (g) Bafilomycin A1과 Chloroquine 처리 유무에 따른 자가포식 flux 측정. 숫자는 LC3-II/bactin 비율 (h) CYTO-ID를 이용하여 염색 후 대표적인 confocal 이미지 (i) Pontin WT, RA MEF에서 mCherry-GFP-LC3를 이용한 대표적인 confocal 이미지. mCherry와 GFP 시그널이 같이 있는 노란 puncta의 경우 라이소좀과 결합하지 않은 자가포식 포자(파고포어, 오토파고좀)이며, 빨간 puncta는 산성화된 자가포식 포자(앰피좀, 오토라이소좀)임.
도 4는 많은 자가포식과 라이소좀 유전자들이 Pontin의 메틸화에 의해 조절되는 것을 RNA-sequencing을 통해 확인했다. (a) RNA-seq 분석 방식 (b) Hierarchical clustering을 통해 4131개의 DEG가 나옴 (c) 유전자군 1에대한 DAVID를 이용하여 Gene ontology와 KEGG pathway 분석 (d) 대표적인 GSEA 결과 (e) 자가포식 과정으로 분류한 Pontin 메틸화 의존적인 유전자들 (f) Pontin 메틸화 의존적인 자가포식 혹은 라이소좀 관련 유전자들의 qRT-PCR 결과 (g) 포도당 결핍 상태에서의 Pontin WT,RK,RA에서의 타겟 단백질의 발현 정도를 immunoblot으로 확인한 결과이다.
도 5는 Pontin과 FOXO3a가 메틸화를 통해 결합한다. (a) EnrichR을 이용한 Pontin 메틸화 의존적인 유전자들의 전사인자 분석 (b) Pontin 메틸화 ChIP-seq 결과를 이용한 Binding motif 분석 (c) Pontin과 여러 자가포식 관련 전사인자와의 결합 여부 확인 (d) Pontin WT, RK, RA와 FOXO3a의 결합 여부 확인 (e, f) CARM1 KO에서 Pontin과 FOXO3a의 결합 확인 (g) CARM1 inhibitor인 EZM2302와 EPZ025654 처리 후 Pontin과 FOXO3a의 결합 여부 확인 (h) in vitro 메틸화 실험 이후 진행된 GST pulldown 실험 순서 및 결과 (i) Pontin 메틸화 유무 펩타이드를 이용한 immunodot 실험 결과 (j) Pontin과 FOXO3a의 여러 aromatic 잔기 돌연변이와 결합 여부 확인 (k) FOXO3a WT과 F640/642L 돌연변이를 이용하여 Pontin과의 결합 여부 확인한 결과이다.
도 6은 메틸화된 Pontin과 Tip60가 FOXO3a 타겟 유전자들을 H4 acetylation을 통해 활성화 시킨다. (a) Pontin WT/RK를 이용한 루시퍼레이즈 실험 결과 (b) FOXO3a WT, F640/642L을 이용한 루시퍼레이즈 실험 결과 (c) Pontin 메틸화 ChIP-seq 결과를 이용하여 TSS 근처의 peak과 멀리있는 peak들을 Heatmap으로 보여준 결과. (d) Map1lc3b의 프로모터와 인핸서 부근에서의 Pontin 메틸화 ChIP-seq peak 표시 (e) CARM1 WT/KO MEF에서 FOXO3a 결합 부위에서의 CHIP 결과 (f) Pontin 유무에 따른 FOXO3a와 Tip60의 결합 (g) Pontin WT/RK와 Tip60의 결합 확인한 결과이다.
도 7은 Pontin의 메틸화 의존적인 자가포식 유전자들의 활성에 Tip60가 중요하다. (a) Tip60 knockdown 유무에 따른 자가포식 flux 정도. 숫자는 LC3-II/bactin 비율 (b) Tip60 knockdown 유무에 따른 Pontin 메틸화 의존적/비의존적 유전자들의 mRNA 발현 변화 (c) Tip60 knockdown한 세포에서 FOXO3a, Pontin메틸, H4 아세틸화, Tip60에 대한 ChIP 결과 (d) Tip60 knockdown 유무와 Pontin WT/RA에 따른 Pontin 메틸화 의존적 유전자들의 발현 패턴 (e) Tip60 knockdown 유무와 Pontin WT/RA에 따른 LC3 발현 차이. 숫자는 LC3-II/bactin 비율 (f) 모델 그림이다.
도 8은 CARM1-Pontin-FOXO3a 축이 자가포식 유전자들의 인핸서 활성에 역할을 한다. (a, b) FOXO3a, Pontin메틸, H4아세틸, Tip60, H3R17me2를 이용하여 Map1lc3b, Ctns, Atg14에서FOXO3a 결합 부위(a), TFEB 결합 부위(b) 에서 ChIP한 결과. Pontin WT, RK에서 진행함. (c) Map1lc3b의 프로모터와 인핸서 부분의 결합을 보기 위해 진행된 3C 결과. PCR 이후 DNA gel로 확인한 데이터. 오른쪽은 그 모델. (d) Pontin WT/RA MEF에서 자가포식과 라이소좀 관련 유전자들의 eRNA를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9는 본원에서 규명된 기전을 나타내는 모델 그림이다.
본원에서는 CARM1->PONTIN->FOXO3로 이어지는 경로가 포도당 결핍상황에서 세포의 자가포식 조절에 중요한 기전임을 규명하였다. 구체적으로 CARM1은 PONTIN을 메틸화시키고, 메틸화된 PONTIN (Tip60와 결합)은 FOXO3와 결합하여 복합체를 형성하고, 이러한 복합체는 자가포식에 관여하는 유전자에서 발견되는 인핸서에 결합하여 이들 유전자의 전사를 조절하는 방식으로 자가포식 조절에 관여하며, 자가포식이 증가한다.
세포에게 있어서 영양분 대사의 항상성 유지는 세포의 건강과 기능에 중요하다. 자가포식은 영양분 부족 상태에서 대표적인 방어기작 중 하나로 영양분이 부족할 때 자가포식을 통해 영양분을 스스로 공급받아 생존에 도움을 준다.
본원에서 자가포식(autophagy 또는 autophagocytosis)이란 라이소좀을 이용하여 세포내 불필요하거나 변성된 단백질을 포함하는 다양한 세포구성성분을 제거하는 이화작용을 일컫는 것이다. 자가포식 조절에 이상이 있는 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생하는 것으로 알려져 있다 (Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884). 또한 자가포식은 암세포에서 활성화 (Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther.,8(7), 2036-2045)되며, 자가포식 억제제가 항암 치료제로서 작용하는 것으로 알려져 있다 (Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752). 아울러 암 및 신경변성 질환에 추가하여 자가포식은 간 질환, 심장 질환, 근육 질환 및 췌장 질환과 연관된 것으로 알려져 있다 (Levine and Kroemer, (2008), Cell, 132, 27-42; Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)). 따라서 본원에 개시된 기술을 이용한 자가포식 조절제, 조절방법은 자가포식 조절 이상으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
이에 한 양태에서 본원은 메틸전달효소인 CARM1 (Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 PONTIN 단백질의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 방법은 포도당이 결핍된 상태에서 CARM1 및 상기 메틸전달효소 CARM1의 기질로서 PONTIN 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 제 1 단계; 상기 세포에 메틸전달효소 CARM1의 상기 PONTIN에 대한 메틸화 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 제 2 단계; 상기 PONTIN 단백질을 상기 세포로부터 분리하는 제 3 단계: 상기 분리된 PONTIN 단백질의 서열번호 1을 기준으로 333번 및 339번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 제 4 단계; 및 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 제 5 단계를 포함하며, 상기 메틸화 증가는 자가포식 증가, 상기 메틸화 감소는 자가포식 억제를 나타낸다.
본원에서 조절(modulation)이란, 특정 생물학적 기능의 활성화, 자극 또는 상향 조절, 또는 저하 또는 하향 조절, 또는 양쪽 모두를 포함하며, 인 비트로 상태에서의 조절, 인비보 상태에서의 조절, 엑스비보 상태에서의 조절을 모두 포함하는 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 CARM1 (coactivator-associated arginine methyltransferase 1) 또는 PRMT4 (protein arginine N-methyltransferase 4)는 알파 헬릭스 및 베타 시트로 구성된 S-아데노실-L-메치오닌으로부터 알지닌 잔기의 곁가지 질소의 메틸화를 촉매하는 효소이며, 포유동물에서 CARM1의 유전자 및 단백질 서열은 공지된 것으로 예를 들면 인간 유전자 및 단백질 서열은 Gene ID: 10498, Protein ID: NP_954592.1로 공지되어 있다. 본원에 따른 방법에서는 상기와 같은 메틸화효소 기능을 갖는 한 다양한 유래, 그리고 각 유래의 단백질 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 전장 또는 단편이 사용될 수 있다.
본원에 따른 상기 방법에서 CARM1의 기질(substrate)은 PONTIN이다.
본원에서 PONTIN은 ATPase와 DNA헬리카제 기능을 갖는 염색질 리모델링 인자(chromatin remodeling factor)이며, 예를 들면 인간 유전자 및 단백질 서열은 각각 Gene ID: 8607, Protein ID: NP_003698.1로 공지되어 있다. 본원에 따른 방법에서는 상기와 같은 메틸화효소 기능을 갖는 한 다양한 유래, 그리고 각 유래의 단백질 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 전장 또는 단편이 사용될 수 있다.
PONTIN은 CARM1 단백질에 의해 서열번호 1의 서열을 기준으로 333번 및 339번째 알지닌 잔기가 매틸화된다.
메틸화된 PONTIN은 그 다음 단계에서 FOXO3a와 결합한다.
메틸화된 PONTIN은 FOXO3a의 624, 627, 628, 640 및 642번째 잔기 (서열번호 2의 서열 기준)와 접촉을 통해 결합한다.
본원에서 FOXO3a는 Forkhead box protein3a의 약자로써 세포 성장, 증식, 분화. 수명과 항상성 유지에 관여하는 전사조절인자다. 그 유전자 및 단백질 서열은 각각 Gene ID: 2309, Protein ID:NP_001446.1로 공지되어 있다. 본원에 따른 방법에서는 상기와 같은 메틸화효소 기능을 갖는 한 다양한 유래, 그리고 각 유래의 단백질 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 전장 또는 단편이 사용될 수 있다.
본원에서는 특히 CARM1에 의한 PONTIN 메틸화가 FOXO3a의 결합을 유도하고, 결국 CARM1-Pontin-FOXO3a 축이 H4 아세틸화를 통해 인핸서에서 작용하여 자가포식 관련 유전자들의 coactivator로서 작동할 수 있음을 규명하였다.
이에 본원에 따른 방법은 히스톤 4의 아세틸화를 추가로 측정할 수 있다. 히스톤은 염색질(chromatin)을 구성하는 중심단백질로, DNA 사슬을 감는 실패 역할을 해서 DNA를 응축하며, 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 히스톤 단백질에는 H1, H2A, H2B, H3 및 H4 등이 존재하며, H2A, H2B, H3 및 H4가 각각 두 개씩 모여 8량체인 코어 히스톤을 형성하고, H1은 연결체이다. 코어 히스톤은 매우 잘 보존된 서열을 갖으며, 다양한 변이체 또한 발견되며, 이러한 서열은 공개된 히스톤 DB2.0을 참조할 수 있다. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/HistoneDB2.0/index.fcgi/browse/). 본원에서 규명된 기전에 관여하는 히스톤 H4의 서열 (Gene ID: 8359, Protein ID: NP_003529.1)에서 H4의 6, 9, 13 및 17번째 라이신 잔기 (서열번호 3의 서열을 기준)를 아세틸화시킨다.
실질적으로 동일한이란, 단백질 및 핵산 서열 수준에 모두 적용되며, 참조 또는 기준이 되는 서열과 비교하여, 염기 또는 아미노산 잔기에 하나 이상의 치환, 결손, 또는 부가가 있을 수 있으나, 전체적으로 볼 때 기능에 차이가 없거나 기능을 나쁘게하지 않는 수준의 기능을 갖는 것을 의미한다. 상동성은 대상이 되는 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상, 특히 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 상기 단백질을 발현하는 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 세포를 이용하여 수행되는 경우 단백질은 이를 발현하는 세포로 제공될 수 있다.
본원에 따른 PONTIN 단백질의 메틸화정도 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
본원의 방법에 사용되는 시험물질은 CARM1-PONTIN-FOXO3a 신호전달시스템에 작용하여 포도당이 결핍된 상태에서 PONTIN 메틸화를 조절할 것으로 기대되는 물질로, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 저분자화합물이 시험물질로 사용될 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다. 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 동물 세포주에 트랜스팩션한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.
또는 스크리닝 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.
본원에 따른 방법에서 메틸화 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 PONTIN 333 및 339번째 잔기의 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하고, 이를 다양한 질환의 치료제로 개발 할 수 있다.
실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 자가포식을 조절하는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상, 또는 이 이상을 증가 또는 감소된 것을 후보물질로 선별할 수 있다.
본원에 따른 방법에서는 PONTIN과 FOXO3a의 결합을 검출하는 단계를 추가로 또는 PONTIN의 메틸화 대신에 포함할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.
본원에 따른 다양한 스크리닝 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 다양한 스크리닝 방법에 의해 스크리닝될 수 있는 자기포식 조절제는, 자가포식에 이상이 있는 경우 변성된 단백질의 축적으로 인해 다양한 질환 또는 자가포식의 과다 활성과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 신경퇴행성질환을 포함하는 신경변성 질환, 간질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 과오종 증후군, 유전성 근육 질환, 근 질환 또는 암(Hara t et al Nature 2006, Mizushima n et al Genes & Dev. 2007, Takamura a et al Genes & Dev. 2011, Ratuo p et al J Hepatology 2010 등 참조) 등의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 물질이다. 예를 들면 신경변성 질환은, 예를 들면 부신성 백색질형성장애(Adrenal Leukodystrophy), 알콜중독, 알렉산더병(Alexander's disease), 알퍼병(Alper's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증, 모세관확장실조(ataxiatelangiectasia), 배튼병(Batten disease), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 캐너번병(Canavan disease), 뇌성마비, 코케인 증후군(cockayne syndrome), 피질기저퇴화(corticobasal degeneration), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 치명성 가계 불면증(familial fatal insomnia), 전두엽 측두엽 변성증(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), HIV-관련 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe's [0016] disease), 레비소체 치매(Lewy body dementia), 신경보렐리아증(neuroborreliosis), 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성경화증(multiple sclerosis), 발작수면 (narcolepsy), 니이만-픽병(Niemann Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 픽병(Pick's disease), 원발가쪽경화증(primary lateral sclerosis), 프리온 질환(prion disease), 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 레프숨병(Refsum's disease), 잔트호프병(Sandhoff disease), 실더병(Schilder's disease), 유독성 빈혈 속발성의 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼 병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 스틸-리차드슨-올스제위스키 병(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독(Tabes dorsalis), 독성 뇌병증(toxic encephalopathy)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 단백질변성과 관련된 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비 소체 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 헌팅톤병, 척수소뇌성 실조증 또는 척수구근 근위축증(spinobulbar musclular atrophy)을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 자가면역 질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증로 구성된 군으로부터 선택되는 자가면역질환이다.
또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 심혈관질환은 광동맥성심장병, 심근증, 고혈압성심장질환, 심부전, 폐성심, 심율동장애, 심장 내막염, 염증성 심비대증, 심근염, 심장판막증, 뇌혈관장애, 하지동맥질환, 선천성 심질환 및 심장 류머티즘으로 구성된 군으로부터 선택되는 심혈관질환이다.
또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 대사질환은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증 및 고인슐린혈증으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환이다.
또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 방법 및 실험 재료
Pontin의 R333, R339를 인지하는 항체는 해당 펩타이드를 이용하여 Peptron에서 제작하였다.
Generation of Pontin f/f MEFs 및 세포배양
Pontin f/f MEF는 Pontin KO 쥐를 이용하여 3T3 방식으로 제작하였다.
Pontin f/f MEF에 Flag-tagged Pontin WT, RK, RA를 렌티바이러스로 감염 시킨 뒤, hygromycin을 이용하여 1주간 selection하였다.
친화도 정제를 통한 CARM1 결합 단백질 규명
HEK293T에 Flag-tagged CARM1 발현시킴. Flag M2 affinity gel (100ul of 50% slurry) (sigma)로 CARM1을 당긴 뒤 20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 15 % Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM PMSF, 0.05 % Nonidet P40, and 150 mM KCl로 wash하여 비특이적 결합 떨어트림. 이후 Flag 펩타이드 (0.2 mg/ml)을 이용하여 bead로부터 CARM1 및 복합체를 떨어트림. 이후 SDS-PAGE를 통해 젤을 달린 뒤 LC-MS/MS를 통해 단백질 정보 분석.
Bacterial expression and GST pull-down assay
GST-tagged construct는 Rosetta E. coli에 transformation된 뒤 단백질 발현에 이용. 이후 glutathione bead로 뽑음. His-tagged Pontin의 경우 M15[pREP4] E. coli에서 키운 뒤 Ni-NTA bead를 통해 뽑음. In vitro translated 단백질은 TNT Quick Coupled Transcription/Translation system (Promega) 설명서대로 뽑음. 뽑은 단백질과 in vitro translated protein은 binding buffer (125 mM NaCl, 20 mM Tris [pH 7.5], 10 % glycerol, 0.1 % NP40, and 0.5 mM DTT supplemented with protease inhibitors)에서 GST pulldown 실험에 이용. 이후 4번의 wash 이후 SDS sample buffer 처리 후 gel 달림.
In vitro methylation assay
In vitro methylation 실험은 비드와 결합된 His-Pontin 혹은 GST-Pontin 과 함께 구매한recombinant CARM1 (Active Motif, 31347) 단백질 혹은 HA-CARM1 WT/R169A 돌연변이 단백질과 함께 진행. 반응은 PBS buffer에서 30도 3시간으로 진행되었고 5X sampling buffer를 넣고 5분간 끓여서 종결. SDS-PAGE에 달린 뒤 PVDF membrane에 semi-dry electroblotter를 통해 옮김. Rme2a or Pontin-me 항체를 통해 immunoblot 진행.
In vitro methylation assay using 3H-SAM
GST-Pontin 과 구매한 recombinant CARM1 (Active Motif, 31347) 단백질을 methylation buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM -mercaptoethanol, and 250 mM sucrose) with 1 μCi of 3H-SAM에 넣은 뒤 30 ℃ 에서 하루 놔둠. Reaction buffer 제거 후 2X sampling buffer를 넣어준 뒤 10분간 끓임 이후 SDS-PAGE에 달린 뒤 필름을 이용하여 관찰.
Immunodot blot assay
Non-methylated Pontin peptide와 methylated Pontin peptide를 membrane에 점으로 찍음. 충분히 말린 뒤, PBST에 녹인 5% milk로 1시간 blocking 진행. purified GST-FOXO3a proteins (1 μg/ml)을 넣은 protein-binding buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 10 % glycerol, 0.1 % Tween-20, 2 % skim milk powder and 1 mM DTT),를 이용하여 membrane에 결합 시킴. 이후 GST antibody를 이용한 immunoblot을 진행.
Lentivirus construction and production
3X Flag-Pontin WT, RK and RA는 pLVX vector, lentiviral shRNA constructs는 pLKO.1 vector에 클로닝함. Lentiviral constructs는 packaging vectors (psPAX2 and VSV-G)와 함께 HEK293T 세포에 transfection, 48시간 뒤에 0.45-μm filter를 통해 배양액을 모음. shRNA 시퀀스 정보 Tip60; 5’-GCAACGCCACTTGACCAAATG-3’, Pontin; 5’-GTGGCGTCATAGTAGAATTA A-3’, FOXO1/3/4; 5’-CTGTGTGCCCTACTTCAAGGA-3’.
Autophagic vacuole staining
Autophagic vacuoles은 Cyto-ID autophagy detection kit (Enzo Life Sciences, ENZ-51031)를 이용하여 염색함. 세포는 coverslips에 2 x 10^4개와 함께 Cyto-ID green detection reagent (1:500)과 Hoechst 33342 (1:1000)가 섞인 미디어를 넣어줌. 37 ℃에서 30 min 놔둔 뒤 PBS로 wash 후 2% paraformaldehyde/PBS를 넣어준 뒤 상온에서 10분간 고정. 이후 confocal microscope (Zeiss, LSM700)로 이미지 촬영.
Luciferase assay
MEFs에 6X canonical FOXO response element (6x DBE-luciferase)를 함께 transfection해서 진행. Luciferase activity는 transfection 이후 36시간 뒤에 측정하였으며 beta-galactosidase 발현으로 정량함.
RNA-seq analysis
RNA-seq libraries는 TruSeq RNA sample prep kit v2 (Illumina) 방식으로 제작함. RNA-seq libraries는 paired-end sequence 방식으로 Illumina HiSeq 4000 (Macrogen)을 통해 시퀀싱됨. RNA-seq data는 Tophat package를 통해 mouse genome (mm9)에 mapping함. Differential analysis는 EdgeR package를 통해 분석됨. Differentially regulated genes은 false discovery rate (FDR) cut-off 1 x 10^-5. Hierarchical clustering 분석은 모든 상황에서의 유전자 발현 수치로 함. Ward’s criterion for genes with 1 - (correlation coefficient)가 distance measure에 사용됨. Clustering heatmap은 z-scor 기준으로 그림. Functional enrichment analysis of GOBPs and KEGG pathways는 DAVID software를 통해서 하였고 Gene set enrichment analysis는 GSEA (version 3.0) software를 이용. The phenotype label for GSEA was set WT_normal: WT_Glc starv.: RA_normal: RA_Glc starv. = 1: 3: 1: 1.7, then Pearson correlation coefficient was calculated per gene for ranking. Gene sets은 Molecular Signature Database (MSigDB) v6.2에서 얻음.
ChIP-seq analysis
ChIP-seq libraries는 TruSeq DNA Sample prep Kit 방식으로 제작함. ChIP-seq libraries는 paired-end 방식으로 Illumina platform (MACROGEN)에서 시퀀싱됨. ChIP-seq reads는 mouse reference genome (GRCm38/mm10)에 Bowtie2를 이용하여 mapping함. methylated Pontin peak의 경우 Homer (v4.7.2)를 통해 제작. 우리가 제작한 Pontin 메틸화 항체 사용하였다.
실시예 1. Pontin의 R333, R339 아미노산 잔기가 CARM1에 의해 333과 339 잔기의 아르기닌이 메틸화됨을 규명
포도당 결핍 상황에서 자가포식 관련 전사 조절을 한다고 알려진 CARM1의 결합 파트너를 찾기 위해 tandem affinity purification을 통해 CARM1과 결합하는 단백질들을 분리했다. 흥미롭게도 LC-MS/MS를 통해 Pontin이라는 크로마틴 재배치 인자가 나왔다 (도 1a). Pontin과 CARM1이 실제로 결합하는지 확인하기 위해 위에서 뽑은 CARM1 복합체 eluate에 Pontin을 인지하는 항체로 확인하였다 (도 1b). Pontin과 CARM1이 직접적으로 결합하는지 확인하기 위해 Gglutathione S-transferase (GST)를 붙은 CARM1과 in vitro로 뽑은 Pontin 단백질과의 결합을 GST pulldown assay를 통해 확인하였다. Pontin과 복합체를 이룬다고 잘 알려진 Reptin도 같이 확인하였다. 실험 결과 CARM1은 Reptin과 결합하지 않고 Pontin과 선택적이게 결합하였다 (도 1c).
다음으로 CARM1 WT과 효소 활성이 망가진 R169A 돌연변이를 이용하여 Pontin이 CARM1에 의해 아르기닌 메틸화가 될 수 있는지 in vitro methylation assay를 통해 확인해보았다. 오직 CARM1 WT을 넣어주었을 때만 Pontin이 in vitro 메틸화가 되는 것을 확인하였다 (도 1d). 이를 통해 CARM1의 효소 활성이 Pontin의 아르기닌 메틸화에 중요하다는 것을 확인했다. 다음으로 CARM1에 의해 메틸화되는 Pontin이 아미노산 잔기를 찾기 위해 인터넷에 오픈된 메틸화 예측 프로그램을 사용하였고 예측된 아르기닌 잔기들을 알라닌으로 교체한 돌연변이들을 만들었다. 실험 결과 아르기닌 R333과 R339를 각각 하나씩 알라닌으로 치환한 돌연변이에서 메틸화가 감소되어 있는 것을 보았고 둘을 동시에 돌연변이 시켰을 때 Pontin의 메틸화가 완전히 사라지는 것을 확인하였다 (도 1e). 방사선동위원소 3H-S-Adenosyl methionine (SAM)을 이용하여 Pontin WT과 여러 돌연변이에서 in vitro 메틸화 실험을 진행하였을 때도 Pontin의 WT은 메틸화되는 반면, 333, 및 339번째 아르기닌을 알라닌이나 라이신으로 돌연변이의 경우 메틸화가 되지 않는 것을 확인하였다 (도 1f). 실제로 Pontin의 구조를 확인하였을 때 R333과 R339는 가까운 위치에 존재하였으며 (도 1g), 여러 종에서도 두 아르기닌뿐만 아니라 주변 아미노산 잔기도 종간 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다 (도 1h).
추가 연구를 위해 Pontin의 아르기닌 메틸화를 인지할 수 있는 항체를 제작하였다. Dot blot을 통해 우리가 제작한 Pontin 메틸화 항체가 잘 작동하는 것을 확인하였으며 (도 1i), in vitro 메틸화 실험을 통해서도 항체의 특이성이 확인되었다 (도 1j). R333/339A뿐만 아니라 R333/339K 돌연변이에서도 동일하게 항체가 잘 작동하는 것을 확인하였다 (도 1k). CARM1의 WT과 효소 활성이 망가진 돌연변이를 이용하여 in vitro 메틸화 실험을 하였을 때 WT에 의해서만 Pontin의 메틸화가 증가하는 것을 직접 만든 항체로 재확인하였다 (도 1l). Pontin의 아르기닌 메틸화가 다른 아르기닌 메틸화 효소에서도 일어나는 것이 보고되었었기에 Pontin 메틸화 항체가 CARM1이 아닌 다른 아르기닌 메틸화 효소에 의해 일어나는 메틸화를 잡는지 확인하였다. 실험 결과 Pontin의 경우 CARM1/PRMT4 뿐만 아니라 PRMT5, PRMT6와도 결합할 수 있었지만 (결과나타내지 않음), 우리가 제작한 Pontin 메틸화 항체는 CARM1에 의한 메틸화만 인지하는 것을 확인하였다. 종합하면 우리는 CARM1에 의해 Pontin의 아르기닌 333, 339번 잔기가 메틸화되는 것을 in vivo, in vitro 실험을 통해 증명하였다.
실시예 2. CARM1에 의한 Pontin의 메틸화의 기전 규명: 포도당 결핍 상태에서 핵 안에서 발생
CARM1의 단백질이 포도당 결핍 상황에서 증가하는 것이 알려져 있었기에 Pontin과 CARM1의 결합이 결핍 상태에서 증가되는지 확인해보았다. CARM1과 Pontin의 결합이 포도당 결핍 상황에서 증가하는 것을 확인하였다 (도 2a). 우리는 다음으로 이렇게 증가된 결합에 의해 Pontin이 메틸화가 증가되는지 확인해보았다. 우리는 포도당 결핍 상태에서 Pontin의 메틸화가 증가하는 반면, CARM1 특이적인 억제제인 EZM2302 (CAS No. : 1628830-21-6) 와 EPZ025654 (CAS No: 1888328-89-9)를 처리하였을 때 Pontin의 메틸화가 덜 증가하는 것을 확인하였다 (도 2b). CARM1 WT MEF와 CARM1 knockout MEF 세포를 이용하여 보았을 때 CARM1이 존재하는 세포에서만 포도당 결핍 특이적인 Pontin의 메틸화 증가를 관찰하였다 (도 2c). 또한 CARM1 knockout MEF에 CARM1 WT과 효소활성 돌연변이를 발현시켰을 때 CARM1 WT에서만 Pontin의 메틸화가 회복되는 것을 보았다 (도 2d). 이를 통해 Pontin의 메틸화가 CARM1 의존적이라는 것을 다시 한 번 확인하였다. 이전 보고에 따르면 CARM1은 핵 안에서 안정화되기 때문에 우리는 cellular fractionation 실험 (도 2e)과 immunocytochemistry analysis (도 2f)를 이용해 Pontin의 메틸화를 확인해본 결과 포도당 결핍 특이적이게 핵 안에서 증가하는 것을 확인하였다.
Pontin과 Reptin은 핵 안에서 hetero-dodecamer 복합체를 이루는 것이 알려져 있기에 Pontin의 메틸화가 복합체에 끼치는 영향을 확인해보았다. In vitro 메틸화 실험 이후 in vitro binding assay를 하였을 때 Pontin과 Reptin의 복합체 형성에 Pontin의 메틸화가 영향을 주지 않는 것을 보았다 (결과 나타내지 않음). 또한 아르기닌 돌연변이도 복합체 형성에 영향을 주지 않았다 (결과 나타내지 않음). 종합하면 우리는 Pontin의 메틸화가 CARM1의 Reptin과의 결합에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3. Pontin의 메틸화가 포도당 결핍 의존적 자가포식의 증가에 중요함을 규명
포도당 결핍 상황에서 증가하는 Pontin의 메틸화의 역할을 알아보기 위해 우리는 Flag-tagged Pontin WT과 아르기닌 돌연변이들(R333/339K, R333/339A)을 발현시킨 Pontin f/f MEF를 제작하였다 (도 3a). 이렇게 제작된 세포는 Cre 바이러스를 감염시켜주면 원래 세포의 DNA에서 발현되던 endogenous Pontin이 제거되게 되며, 세포 내에 우리가 발현시킨 Flag-tagged Pontin만 존재하게 된다. 실제로 우리가 제작한 세포를 보면 cre 처리 이후 endogeneous Pontin은 사라지는 것을 확인하였으며, 발현시킨 Pontin WT, RK, RA가 endogenous Pontin의 발현량만큼 발현하는 것을 보았다 (도 3b). 이렇게 제작된 세포를 이용하여 추가 실험들을 진행하였다. Pontin의 메틸화는 Pontin WT MEF에서는 관찰되었지만, RK, RA MEF에서는 관찰되지 않았다 (도 3c). 포도당 결핍 뿐만 아니라 Rapamycin 처리나 아미노산 결핍 상황에서도 Pontin의 메틸화가 증가하였다 (결과 나타내지 않음). 우리는 이전에 Pontin KO MEF에서 자가포식이 망가져 있는 것을 GFP-LC3 puncta assay를 통해 보았었다 (결과 나타내지 않음). Pontin의 메틸화에 따른 자가포식의 변화를 보기 위해 우리가 제작한 세포에서 GFP-LC3 puncta 실험을 진행하였다. 실험 결과 Pontin WT MEF에서는 GFP-LC3 puncta가 포도당 결핍 특이적이게 증가하는 것이 보였으나 Pontin RA MEF에서는 변하지 않는 것을 보았다 (도 3d). Rapamycin 처리나 아미노산 결핍 상황에서도 같은 결과를 얻었다 (결과 나타내지 않음). 또한 western blot을 통해 자가포식의 활성도의 척도 중 하나인 LC3-II의 lipidation 비율을 보았을 때 Pontin WT MEF에서는 LC-3 II가 증가하였으나 Pontin Rk, RA MEF에서는 증가하지 않는 것을 보았다 (도 3e).
다음으로 우리는 자가포식 flux를 보기 위해 자가포식의 maturation을 방해하는 물질인 Bafilomycin A1이나 Chloroquine을 처리하였다. GFP-LC3 puncta 실험을 통해 Pontin WT MEF의 경우 자가포식의 flux를 막았을 때 GFP-LC3 puncta가 쌓이는 것을 볼 수 있었지만 Pontin RA MEF에서는 쌓이지 않는 것을 확인하였다 (도 3f). Immunoblot 실험을 통해서도 Bafilomycin A1이나 Chloroquine을 처리하였을 때 LC3-II가 WT에서는 증가하지만 RA에서는 많이 증가하지 못하는 것을 보았다 (도 3g). 추가로 자가포식 vacuole을 염색하는 Cyto-ID를 이용하였을 때도 비슷한 결과를 얻었다 (도 3h). 자가포식의 진행 과정 중 어느 단계가 망가져있는지 확인하기 위해 mCherry-GFP-LC3 리포터를 이용한 실험을 진행하였다. 자가포식 과정 중 오토파고좀은 라이소좀과 결합하면서 pH가 낮아지게 되는데 이때 GFP의 초록색 시그널이 약해지게 된다. 반면 mCherry의 빨간색은 pH에 영향을 받지 않기에 오토파고좀의 경우 초록과 빨강이 합쳐진 노란 빛을 띄는 반면, 라이소좀과 결합한 오토라이소좀은 빨간 빛을 띄게 된다. 이를 이용하여 실험하였을 때 Pontin RA MEF에서는 포도당 결핍 상황에서 오토파고좀과 오토라이소좀의 비율이 바뀌지는 않았으며, 전체적인 개수가 WT MEF에 비해 감소하는 것을 보았다 (도 3i). 이 데이터를 통해 우리는 CARM1에 의한 Pontin의 메틸화가 자가포식 자체의 증가에 중요하다는 것을 알 수 있었다.
Pontin의 메틸화에 의한 자가포식 조절이 보편적인 자가포식 조절기작인지 확인하기 위해 MEF 세포 뿐만 아니라 HepG2, HeLa와 같은 인간 세포에서도 확인해보았다. 포도당 결핍 상황에서 두 세포 모두에서 CARM1의 핵 안에서의 증가와 Pontin의 메틸화의 증가를 볼 수 있었다 (결과는 나타내지 않음). HepG2, HeLa에서도 endogenous Pontin을 knockdown시켜준 뒤 Pontin WT과 RA를 발현시켜주었다. 우리는 이 세포들에서도 Pontin WT 세포에서 Bafilomycin A1 의존적이게 LC3-II가 증가하는 것을 보았으며, Pontin RA 세포에서는 그렇지 못하는 것을 보았다. 우리는 이 데이터를 통해 Pontin의 메틸화에 의한 자가포식 조절이 여러 다양한 다른 세포에서도 공통적이라는 것을 확인했다.
세포에게 있어서 영양분 대사의 항상성 유지는 세포의 건강과 기능에 중요하다. 자가포식은 영양분 부족 상태에서 대표적인 방어기작 중 하나로 영양분이 부족할 때 자가포식을 통해 영양분을 스스로 공급받아 생존에 도움을 준다. Pontin의 메틸화에 따른 세포 생존을 보기 위해 Pontin WT과 RK MEF의 세포 성장율을 보았다. Pontin WT MEF의 경우 포도당 결핍 15-18시간부터 성장이 증가되지 못하며 24시간 이후부터 빠르게 죽기 시작한다. 하지만 Pontin RK MEF의 경우 포도당 결핍 12시간까지는 WT MEF와 큰 차이가 없지만 12시간 이후 빠르게 죽기 시작하였다 (결과 나타내지 않음). 다음으로 우리는 세포의 생존율을 확인해보았다. 성장률과 마찬가지로 Pontin WT MEF의 경우 포도당 결핍 24시간 이후에 세포 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 하지만 Pontin RK MEF의 경우 포도당 결핍 18시간 이후부터 생존율이 감소하였다 (결과 나타내지 않음). 종합하면, 우리의 결과는 Pontin의 메틸화에 따라 포도당 결핍 상황에서 세포의 성장과 생존에 영향을 주며, 지속되는 결핍 상황에서 세포의 생존에 있어서 자가포식의 전사 조절의 중요성을 보여준다.
실시예 4. 다수의 자가포식과 라이소좀 유전자들이 Pontin의 메틸화에 의해 조절되는 것을 규명
Pontin의 메틸화가 포도당 결핍 상황에서 핵 안에서 증가하기 때문에 우리는 Pontin의 메틸화가 자가포식 유전자 조절에 중요할 것이라 가정하였다. 어떤 유전자들이 Pontin 메틸화에 의해 조절되는지 확인하기 위해 우리는 Pontin WT, RA MEF에 포도당 결핍 유무에 따라 RNA-sequencing을 진행하였다 (도 4a). PCA를 통해 우리는 Pontin WT, RA MEF가 정상 상황에서는 비슷한 유전자 발현 패턴을 가지지만 포도당 결핍 상황에서는 전체적인 유전자 발현 패턴이 달라지는 것을 확인하였다 (결과 나타내지 않음). 우리는 DEG들을 6개의 유전자군으로 나뉜 히트맵을 얻었다 (도 4b). 유전자군들을 이용하여 Gene ontology와 pathway를 살펴보았을 때 유전자군 1번에서 자가포식과 라이소좀 관련 유전자들이 매우 많이 나왔다 (도 4c). 실제로 자가포식과 라이소좀에 영향을 주는 유전자군을 찾기 위해 우리는 Gene Set Enrichmnet Analysis (GSEA)를 진행하였다. 우리는 결과를 통해 자가포식 조절과 라이소좀 조절, 그리고 파고포어 형성과 관련된 유전자군과 유전자군 1번이 상관 관계가 높은 것을 찾았다 (도 4d).
다음으로 우리는 메틸화된 Pontin이 자가포식 과정에서 어떻게 중요한 역할을 하는지 살펴보았다. 자가포식의 조절을 중심으로 RNA-sequencing 데이터를 분석하였다. 흥미롭게도 자가포식 시작과 파고포어 nucleation과 팽창, 그리고 cargo recruitment/trafficking과 관련된 유전자들이 Pontin RA MEF에서 낮은 것을 확인하였다 (도 4e). Quantitative RT-PCR과 immunoblot을 통해 실제로 이러한 유전자들과 단백질들의 발현이 Pontin 메틸화 의존적이라는 것을 확인했다 (도 4f, g). 또한 HepG2와 HeLa와 같은 다른 세포에서도 같은 결과를 얻었으며, Rapamycin 처리나 아미노산 결핍 상황에서도 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. 종합하면 우리는 영양소 결핍 상태에서 증가되는 Pontin의 메틸화가 자가포식과 라이소좀 관련 유전자들을 활성화 시키는데 중요하며, 이런 조절이 자가포식의 초기 단계부터 영향을 줄 수 있다는 사실을 밝혔다.
실시예 5. 메틸환된 Pontin과 FOXO3a의 결합
Pontin의 경우 여러 전사인자의 공활성자로 알려져 있기 때문에 우리는 Pontin의 메틸화가 특정 전사인자와의 결합에 영향을 주지 않을까 생각했다. Pontin 메틸화 의존적이게 결합하는 전사인자를 찾기 위해 우리는 RNA-seq에서 얻은 타겟 유전자를 이용하여 전사인자 스크리닝을 하였다. 이를 통해 우리는 자가포식과 관련 깊은 몇 개의 후보 전사인자를 얻을 수 있었다 (도 5a). 추가로 우리는 Pontin 메틸화 항체를 이용하여 ChIP-seq을 진행하였다. Pontin의 메틸화가 결합하는 크로마틴들의 모티프 분석을 통해 우리는 FOXO3a 결합 부분이 높게 나오는 것을 확인하였다 (도 5b). 우리는 후보 전사인자들이 실제로 Pontin과 결합하는지 확인하기 위해 포도당 결핍 상황에서 결합 여부를 확인해보았다. 실험 결과 Pontin이 FOXO3a와는 결합하지만 다른 후보 전사인자들과는 결합하지 않는 것을 확인했다 (도 5c). Pontin과 FOXO3a의 결합은 메틸화 의존적이었으며, Pontin WT은 결합할 수 있지만 Pontin RA, RK는 결합하지 못하는 것을 확인했다 (도 5d). Pontin과 FOXO3a의 결합에 메틸화가 중요한지 더 확실히 하기 위해 우리는 CARM1에 따른 두 단백질의 결합을 보았다. CARM1 KO MEF에서 Pontin과 FOXO3a가 결합하지 못하는 것을 보았으며 (도 5e, f), CARM1 특이적인 inhibitor를 처리하였을 때 Pontin과 FOXO3a의 결합이 감소하는 것을 확인하였다 (도 5g). 이를 통해 Pontin과 FOXO3a의 결합에 있어서 CARM1에 의한 메틸화가 중요하다는 것을 알았다.
다음으로 우리는 Pontin과 FOXO3a의 직접적인 결합을 보기 위해 in vitro GST pulldown 실험을 진행하였다. In vitro 메틸화를 통해 Pontin을 메틸화 시킨 뒤, 우리는 GST-FOXO3a와 결합을 보았다. 실험 결과 FOXO3a와 메틸화된 Pontin은 결합하는 반면, 메틸화 시키지 않은 Pontin은 결합하지 못하는 것을 보았다 (도 5h). 추가로 Immunodot blot 실험을 통해 FOXO3a가 메틸화된 Pontin 펩타이드와는 결합하는 반면, 메틸화되지 않은 Pontin 펩타이드에는 결합하지 못하는 것을 확인했다 (도 5i). FOXO3a의 어느 위치에 Pontin이 결합하는지 알아보기 위해 우리는 FOXO3a의 여러 돌연변이를 이용하여 Pontin과의 결합을 보았다. 우리는 FOXO3a의 418-673 아미노산 부분에 Pontin이 결합하는 것을 확인하였으며, 추가 실험을 통해 FOXO3a의 CR3 domain인 610-650 아미노산 부분에서 Pontin과의 결합이 일어나는 것을 찾았다.
아르기닌 메틸화를 인지할 수 있는 아르기닌 메틸화 인지 도메인의 경우 aromatic 잔기에 의해 메틸화가 인지된다는 것이 보고되어있다. 우리는 FOXO3a의 메틸화 인지 잔기를 찾기 위해 첫 번째로 CR3 domain에 존재하는 aromatic 잔기들을 하나씩 돌연변이 시켰다. 실험 결과 FOXO3a의 F640과 F642를 류신으로 각각 돌연변이 시켰을 때 Pontin과의 결합이 감소하는 것을 확인하였으며, 두 페닐알라닌을 모두 류신으로 치환하였을 때 Pontin과의 결합이 완전히 사라지는 것을 보았다 (도 5j). 또한 in vitro GST pulldown을 통해 FOXO3a F640/642L 돌연변이가 메틸화된 Pontin과 결합하지 못하는 것을 확인했다 (도 5k). 이를 통해 우리는 FOXO3a의 F640과 F642가 Pontin의 메틸화 인지에 중요할 것이라 생각했다.
다른 한편으로 우리는 FOXO3a와 Pontin의 구조를 통해 메틸화 인지 구조를 모델링을 통해 예측해보았다. FOXO3a는 hydrophobic 잔기인 M624, I627, I628이 Pontin의 메틸화를 인지할 수 있을 것으로 예상되었다. 이를 확인해보기 위해 우리는 위의 세 잔기를 모두 돌연변이 시킨 FOXO3a 3A 돌연변이와 WT을 이용하여 Pontin과의 결합을 보았다. GST pulldown 실험을 통해 우리는 FOXO3a 3A 돌연변이의 경우 Pontin과 결합하지 못하는 것을 보았으며, 세포 실험을 통해서도 같은 결과를 확인하였다. 이를 통해 우리는 FOXO3a의 M624, I627, I628 또한 Pontin의 메틸화 인지에 중요할 것을 생각했다.
실시예 6. 메틸화된 Pontin과 Tip60가 FOXO3a 타겟 유전자들을 H4 acetylation을 통해 활성화 시킴을 규명
메틸화된 Pontin이 FOXO3a의 공활성체로 작동하는지 확인해보기 위해 FOXO 결합 위치를 가지는 luciferase reporter를 이용하여 luciferase 실험을 진행하였다. Pontin WT에서는 포도당 결핍 상황에서 luciferase 활성이 증가하였지만 Pontin RK, RA 돌연변이에서는 증가하지 않았다 (도 6a). 또한 FOXO3a F640/642L이나 3A 돌연변이에서는 Pontin에 의한 추가적인 전사 활성의 증가가 안보였다 (도 6b). 메틸화된 Pontin이 어떻게 FOXO3a 타겟 유전자들을 조절하는지 확인하기 위해서 Pontin 메틸화 ChIP-seq 데이터를 살펴보았다. 우리는 메틸화된 Pontin이 전사시작 주변부 뿐만 아니라 H3K4me1와 H3K27Ac이 높은 인핸서 부분에도 결합 할 수 있다는 것을 보았다 (도 6c). 흥미롭게도 메틸화 Pontin peak 중 FOXO3a 모티프를 가지고 있는 것 중 36%가 TSS로부터 멀리 떨어져 있었다. 대표적인 자가포식 유전자인 Map1lc3b의 유전자 근처에서 Pontin 메틸화 ChIP-seq peak을 살펴보았을 때 전사시작부위 뿐만 아니라 먼 부분에서도 결합하는 것을 확인하였다 (도 6d). 우리는 ChIP을 통해 포도당 결핍 상황에서 Pontin이 유전자 전사 시작부분 근처(-1.2kb) 뿐만 아니라 멀리있는 부분(-11.3kb, -5kb)까지 결합 할 수 있다는 것을 확인하였다 (결과 나타내지 않음). 하지만 Pontin RA MEF에서는 Pontin의 recruitment가 망가지는 것을 보았다 (결과 나타내지 않음). 이런 데이터를 통해 우리는 Pontin의 메틸화를 통한 FOXO3a와의 결합을 통해 FOXO3a의 공활성체로서 작동할 수 있음을 보여주었다.
우리는 다음으로 Pontin의 결합이 어떻게 FOXO3a 타겟 유전자들의 전사 활성을 올려줄 수 있는지 살펴보았다. Pontin은 잘 알려진 Tip60의 복합체 중 하나의 요소로 Tip60 복합체의 경우 히스톤 아세틸화를 통해 전사 활성에 중요한 역할을 한다. 이를 확인해보기 위해서 우리는 FOXO3a 결합 위치에 Pontin과 함께 Tip60와 H4 아세틸화가 변하는지 확인해보았다. ChIP 실험을 통해 우리는 Tip60와 함께 H4 아세틸화가 포도당 결핍 특이적이게 증가하는 것을 확인했다 (도 6e). 흥미롭게도 Tip60와 H4 아세틸화가 CARM1 KO MEF에서는 recruit되지 않는 것을 통해 Pontin의 메틸화 상태 의존적이라는 것을 알 수 있었다 (도 6e). FOXO3a와 Tip60의 결합이 Pontin이 존재할 때 증가하는 것을 확인할 수 있었지만 (도 6f), Pontin과 Tip60의 결합은 메틸화 여부와 관련이 없었다 (도 6g). 종합하면 우리는 메틸화된 Pontin이 Tip60를 FOXO3a 위치에 데려와서 자가포식 관련 유전자들의 coactivator로서 작동할 수 있음을 밝혔다.
실시예 7. Pontin의 메틸화 의존적인 자가포식 유전자들의 활성에 Tip60가 중요함을 규명
자가포식 유전자들의 조절에서 Tip60의 중요성을 보기 위해 shRNA를 이용한 Tip60 knockdown MEF를 제작하였다. Bafilomycin A1을 처리하여 자가포식 flux를 살펴보았을 때 Tip60가 없으면 LC3-II의 증가가 잘 관찰되지 않았다 (도 7a). 이를 통해 Tip60가 자가포식의 증가에도 관여되어 있음을 확인했다. 다음으로 qRT-PCR을 통해 앞에서 살펴본 Pontin 메틸화 의존적인 타겟 유전자들이 Tip60가 없을 때 어떻게 변하는지 보았다. 포도당 결핍 특이적이게 전사가 증가되는 Map1lc3b, Sirt1, Bnip3, Ctns는 WT에서 잘 올라가지만 Tip60가 없을 때 증가하지 못하는 것을 보았다 (도 7b). 반면, Pontin의 메틸화에 의존적이지 않는 자가포식 유전자의 경우 Tip60와도 관련이 없었다 (도 7b). 이를 통해 우리는 Pontin의 메틸화와 Tip60가 연관되어 있음을 다시 한번 확인하였다. 다음으로 우리는 ChIP실험을 통해 Tip60가 없을 때 FOXO3a와 Pontin, 그리고 H4 아세틸화가 어떻게 변하는지 확인하였다. Tip60가 없을 때 FOXO3a와 메틸화된 Pontin은 잘 recruit 되지만 H4 아세틸의 증가가 망가지는 것을 ChIP 실험을 통해 확인하였다 (도 7c).
Tip60를 knockdown하거나 Pontin의 메틸화를 망가트렸을 때 FOXO 타겟 유전자의 증가가 비슷하게 망가지는 것을 볼 수 있었으며, 둘을 동시에 망가트렸을 때 추가적인 감소가 보이지는 않았다 (도 7d). 이를 통해 우리는 Tip60와 동반하는 H4 아세틸화를 통한 FOXO 타겟 유전자 조절이 Pontin의 메틸화를 통해 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 immunoblot을 통한 LC3-II의 증가 또한 비슷한 결과를 보였다 (도 7e). 종합하면, Pontin의 메틸화가 Tip60의 FOXO3a response element 결합에 중요하며 이에 따른 H4 아세틸화가 자가포식 유전자 활성에 중요하다는 것을 밝혔다 (도 7f).
실시예 8. CARM1-Pontin-FOXO3a 축이 자가포식 유전자들의 인핸서 활성에 역할을 함을 규명
이전 연구에서 우리는 AMPK에 의한 FOXO3a 인산화가 Skp2 억제에 중요하다는 것을 밝혔다. Pontin의 메틸화에 의해 혹시 Skp2가 조절될 수 있는지 확인해보았지만 Skp2 mRNA의 감소에 영향이 없었으며, Skp2 promoter에도 Pontin과 H4 아세틸화가 recruit되지 않았다. 또한 Pontin의 메틸화가 망가져도 CARM1의 안정화에는 영향이 없음을 보았다. 우리는 이전 연구에서 증가된 CARM1이 TFEB과 결합하여 H3R17 메틸화를 증가시키는 것을 밝혔다. Map1lc3b의 경우 두 전사인자 TFEB과 FOXO3a에 의해 조절되기 때문에 CARM1-Pontin-FOXO3a 축과 TFEB-CARM1 축이 어떻게 작동하는지를 살펴보았다.
CARM1은 FOXO3a 결합 부분과 TFEB 결합 부분 모두에 관여하기 때문에 우리는 CARM1이 두 부분에 모두 결합할 수 있는지 확인해보았다. ChIP을 통해 보았을 때 TFEB 결합 부위인 CLEAR 모티프에서는 CARM1이 결합하고 H3R17me2의 증가가 보였지만, FOXO3a 결합 부위에서는 CARM1의 결합이 보이지 않았다. 우리는 FOXO 결합 부위에서는 메틸화된 Pontin을 비롯한 Tip60와 H4 아세틸화가 잘 증가하는 것을 확인하였다. 하지만 Pontin RK, RA 돌연변이에서는 Pontin을 비롯한 Tip60, H4 아세틸화가 오지 않았다 (도 8a). 반면, TFEB 결합 부위에서는 FOXO3a, Pontin, Tip60 모두 recruit되지 않았으며 Pontin의 메틸화 유무와 상관없이 H3R17me2이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 8b). 종합하면 CARM1-Pontin-FOXO3a 축과 TFEB-CARM1 축이 동일한 유전자를 조절하지만 각각의 결합부위에서 독립적이게 작동함을 확인하였다.
FOXO3a의 경우 인핸서에서도 작동할 수 있는 것이 알려져 있었기에 Pontin-Tip60가 결합하는 부분이 인핸서로서 작동할 수 있는지 확인해보았다. Map1lc3b의 -11.3kb와 -5kb에 결합하는 Pontin-Tip60가 Map1lc3b의 인핸서로 작동할 수 있는지 확인해보기 위해 3C 실험을 진행하였다. 3C 실험을 통해 Map1lc3b의 -11.3kb와 -5kb 부분이 프로모터 부분과 근접한다는 것을 확인하였다 (도 8c). 우리는 다음으로 인핸서의 활성 여부를 확인하기 위해 eRNA를 qRT-PCR을 통해 확인해보았다 (도 8d). Pontin WT MEF에서는 포도당 결핍 특이적이게 eRNA가 증가하는 것을 확인하였지만 Pontin RA MEF에서는 증가하지 못하는 것을 관찰하였다. 종합하면 CARM1-Pontin-FOXO3a 축이 H4 아세틸화를 통해 인핸서에서 작동할 수 있음을 밝혔다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
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Gly Lys Thr Ile Ser His Val Ile Ile Gly 145 150 155 160 Leu Lys Thr Ala Lys Gly Thr Lys Gln Leu Lys Leu Asp Pro Ser Ile 165 170 175 Phe Glu Ser Leu Gln Lys Glu Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Tyr 180 185 190 Ile Glu Ala Asn Ser Gly Ala Val Lys Arg Gln Gly Arg Cys Asp Thr 195 200 205 Tyr Ala Thr Glu Phe Asp Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Val Pro Leu Pro 210 215 220 Lys Gly Asp Val His Lys Lys Lys Glu Ile Ile Gln Asp Val Thr Leu 225 230 235 240 His Asp Leu Asp Val Ala Asn Ala Arg Pro Gln Gly Gly Gln Asp Ile 245 250 255 Leu Ser Met Met Gly Gln Leu Met Lys Pro Lys Lys Thr Glu Ile Thr 260 265 270 Asp Lys Leu Arg Gly Glu Ile Asn Lys Val Val Asn Lys Tyr Ile Asp 275 280 285 Gln Gly Ile Ala Glu Leu Val Pro Gly Val Leu Phe Val Asp Glu Val 290 295 300 His Met Leu Asp Ile Glu Cys Phe Thr Tyr Leu His Arg Ala Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ala Pro Ile Val Ile Phe Ala Ser Asn Arg Gly Asn Cys 325 330 335 Val Ile Arg Gly Thr Glu Asp Ile Thr Ser Pro His Gly Ile Pro Leu 340 345 350 Asp Leu Leu Asp Arg Val Met Ile Ile Arg Thr Met Leu Tyr Thr Pro 355 360 365 Gln Glu Met Lys Gln Ile Ile Lys Ile Arg Ala Gln Thr Glu Gly Ile 370 375 380 Asn Ile Ser Glu Glu Ala Leu Asn His Leu Gly Glu Ile Gly Thr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Leu Arg Tyr Ser Val Gln Leu Leu Thr Pro Ala Asn Leu Leu 405 410 415 Ala Lys Ile Asn Gly Lys Asp Ser Ile Glu Lys Glu His Val Glu Glu 420 425 430 Ile Ser Glu Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ala Lys Ile Leu Ala 435 440 445 Asp Gln Gln Asp Lys Tyr Met Lys 450 455 <210> 2 <211> 673 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(673) <223> FOXO3a <400> 2 Met Ala Glu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Leu Ser Pro Leu Glu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Pro Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr 20 25 30 Trp Pro Leu Gln Arg Pro Glu Leu Gln Ala Ser Pro Ala Lys Pro Ser 35 40 45 Gly Glu Thr Ala Ala Asp Ser Met Ile Pro Glu Glu Glu Asp Asp Glu 50 55 60 Asp Asp Glu Asp Gly Gly Gly Arg Ala Gly Ser Ala Met Ala Ile Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Leu Leu Leu Glu Asp 85 90 95 Ser Ala Arg Val Leu Ala Pro Gly Gly Gln Asp Pro Gly Ser Gly Pro 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Thr Gln Ala Leu Leu Gln 115 120 125 Pro Gln Gln Pro Leu Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gln Pro Arg Lys Cys Ser Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Leu 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Leu Ile Thr Arg Ala Ile Glu Ser Ser Pro Asp Lys 165 170 175 Arg Leu Thr Leu Ser Gln Ile Tyr Glu Trp Met Val Arg Cys Val Pro 180 185 190 Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn 195 200 205 Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Arg Phe Met Arg Val Gln 210 215 220 Asn Glu Gly Thr Gly Lys Ser Ser Trp Trp Ile Ile Asn Pro Asp Gly 225 230 235 240 Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg Arg Arg Ala Val Ser Met Asp Asn 245 250 255 Ser Asn Lys Tyr Thr Lys Ser Arg Gly Arg Ala Ala Lys Lys Lys Ala 260 265 270 Ala Leu Gln Thr Ala Pro Glu Ser Ala Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu 275 280 285 Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp 290 295 300 Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg Thr Asn Ser Asn Ala Ser Thr Val 305 310 315 320 Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Met Ala Ser Thr Glu Leu Asp Glu Val 325 330 335 Gln Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg 355 360 365 Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met Asn Leu Asn Asp Gly Leu Thr Glu 370 375 380 Asn Leu Met Asp Asp Leu Leu Asp Asn Ile Thr Leu Pro Pro Ser Gln 385 390 395 400 Pro Ser Pro Thr Gly Gly Leu Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Pro Tyr 405 410 415 Thr Thr Lys Gly Ser Gly Leu Gly Ser Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser 420 425 430 Thr Val Phe Gly Pro Ser Ser Leu Asn Ser Leu Arg Gln Ser Pro Met 435 440 445 Gln Thr Ile Gln Glu Asn Lys Pro Ala Thr Phe Ser Ser Met Ser His 450 455 460 Tyr Gly Asn Gln Thr Leu Gln Asp Leu Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser 465 470 475 480 His Ser Asp Val Met Met Thr Gln Ser Asp Pro Leu Met Ser Gln Ala 485 490 495 Ser Thr Ala Val Ser Ala Gln Asn Ser Arg Arg Asn Val Met Leu Arg 500 505 510 Asn Asp Pro Met Met Ser Phe Ala Ala Gln Pro Asn Gln Gly Ser Leu 515 520 525 Val Asn Gln Asn Leu Leu His His Gln His Gln Thr Gln Gly Ala Leu 530 535 540 Gly Gly Ser Arg Ala Leu Ser Asn Ser Val Ser Asn Met Gly Leu Ser 545 550 555 560 Glu Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys His Gln Gln Gln Ser Pro Val 565 570 575 Ser Gln Ser Met Gln Thr Leu Ser Asp Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu 580 585 590 Tyr Ser Thr Ser Ala Asn Leu Pro Val Met Gly His Glu Lys Phe Pro 595 600 605 Ser Asp Leu Asp Leu Asp Met Phe Asn Gly Ser Leu Glu Cys Asp Met 610 615 620 Glu Ser Ile Ile Arg Ser Glu Leu Met Asp Ala Asp Gly Leu Asp Phe 625 630 635 640 Asn Phe Asp Ser Leu Ile Ser Thr Gln Asn Val Val Gly Leu Asn Val 645 650 655 Gly Asn Phe Thr Gly Ala Lys Gln Ala Ser Ser Gln Ser Trp Val Pro 660 665 670 Gly <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(103) <223> Histon 4 <400> 3 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala 1 5 10 15 Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys 20 25 30 Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu 50 55 60 Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys 65 70 75 80 Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg 85 90 95 Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly 100

Claims (5)

  1. 메틸전달효소인 CARM1 (Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 PONTIN 단백질의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은
    포도당이 결핍된 상태에서 CARM1 및 상기 메틸전달효소 CARM1의 기질로서 PONTIN 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 제 1 단계;
    상기 세포에 메틸전달효소 CARM1의 상기 PONTIN에 대한 메틸화 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 제 2 단계;
    상기 PONTIN 단백질을 상기 세포로부터 분리하는 제 3 단계:
    상기 분리된 PONTIN 단백질의 서열번호 1을 기준으로 333번 및 339번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 제 4 단계; 및
    상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 제 5 단계를 포함하며, 상기 메틸화 증가는 자가포식 증가, 상기 메틸화 감소는 자가포식 억제를 나타내는 것인, CARM1 및 PONTIN에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 단계는 FOXO3a 단백질을 추가로 발현하며,
    상기 제 4 단계 대신에, 또는 이에 추가하여, 상기 PONTIN 및 FOXO3a 단백질의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 측정결과 상기 단백질 간의 결합 증가는 자가포식 증가, 결합 감소는 자가포식 억제를 나타내는 것인, CARM1 및 PONTIN에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 PONTIN은 서열번호 2를 기준으로 상기 FOXO3a 단백질의 624, 627, 628, 640 및 642 잔기를 통해 결합하는 것인, CARM1 및 PONTIN에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 4 단계에 추가하여, 상기 세포에서 분리된 히스톤 4(H4) 단백질의 아세틸화 여부를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 측정결과 상기 H4 단백질의 아세틸화 증가는 자가포식 증가, 결합 감소는 자가포식 억제를 나타내는 것인, CARM1 및 PONTIN에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 히스톤 4의 아세틸화는 서열번호 3의 서열을 기준으로 6, 9, 13 및 17번째 라이신 잔기에서 발생하는 것인, CARM1 및 PONTIN에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
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