KR20180026154A - 자가포식 조절제 스크리닝 방법 및 자가포식-관련 질환의 진단방법 - Google Patents

자가포식 조절제 스크리닝 방법 및 자가포식-관련 질환의 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가포식 조절제 스크리닝 방법 및 자가포식-관련 질환의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석함으로써 자가포식 조절제를 스크리닝 하는 방법 또는 자가포식-관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의할 경우, 자가포식 조절제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있어 자가포식-관련 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 자가포식-관련 질환의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

자가포식 조절제 스크리닝 방법 및 자가포식-관련 질환의 진단방법{Method for screening autophagy modulator and method for diagnosing autophagy-related disease}
본 발명은 자가포식 조절제 스크리닝 방법 및 자가포식-관련 질환의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석함으로써 자가포식 조절제를 스크리닝 하는 방법 또는 자가포식-관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
자가포식(autophagy) 현상은 기아상태생존, 감염성 세균으로부터의 보호 및 신경붕괴조절과 같은 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 이는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다. 초기에는, 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중-막-결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 오토파고좀은 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용된다. 그러나, 이러한 과정에 내재한 분자적 작용기작은 아직 밝혀지지 않았기 때문에 이를 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
지금까지 알려진 바에 의하면, 효모, 초파리 등을 대상으로 수행된 다양한 유전학/생화학적 연구를 통하여 세포 내에서 자가포식(autophagy) 현상을 일으키는데 필요한 단백질들이 발굴되었고, 이들의 상관관계를 분석하기 위한 연구가 수행되고 있다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면, 자가포식은 유도단계(induction/nucleation), 세포막 변형단계(membrane elongation/closure) 및 포식단계(vesicle trafficking/maturation/fusion/degradation)의 세 가지 단계로 크게 구분된다고 알려져 있다. 또한, 자가포식 경로는 Atg8PE(phosphatidylethanolamine) 또는 Atg12Atg5을 경유하는 두개의 독특한 유비퀴틴-유사 접합 시스템을 포함하는데, 상기 경로는 효모의 Vps34 동족체인 클라스 III PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)과 Beclin1(효모유래 Atg6의 오토로그)으로 구성된 복합체와 함께 오토파고좀 형성에 관련된다.
많은 종류의 세포에서, 성장요소 및 사이토카인에 의한 class I PI3K/AKT 신호 경로의 자극은 자가포식을 억제하는 효과를 나타낸다. 상기 억제 효과는 아마도 오토파지를 하향 조절하는 라파마이신표적(target of rapamycin(TOR)) 키나아제의 class I PI3K/AKT-의존적 활성화 때문인 것으로 예상되고 있다. 예를 들어, PI 3-키나아제 억제제인 워트마닌(wortmannin) 및 3-메틸아데닌(3-MA)으로 처리한 세포에서는 오토파고좀 전구체가 발생하지 않는데, 이는 오토파지성 액포 형성 초기단계에서 PI3K-AKT-mTORC1 신호전달계의 활성 억제의 중요성을 시사한다. 이러한 자가포식 현상의 억제 또는 활성화는 단순한 세포활성 뿐만 아니라, 상기 세포를 포함하는 생체내 생리학적 또는 병리학적 변화에 큰 영향을 미친다. 근래 다양한 동물모델 및 질병의 유전자 분석 연구를 통하여 자가포식과정이 당뇨, 고혈압등의 대사성 질환, 퇴행성 뇌질환, 감염성 질환, 그리고 암등의 매우 다양한 질환에서 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨으로써 그 중요성이 부각되고 있다. 따라서 자가포식(autophagy)을 조절하는 물질 발굴은 새로운 작용점을 타겟으로 하는 질병치료제 개발에 매우 중요한 역할을 할 것으로 기대되며, 자가포식과 관련된 일련의 신호전달체계를 규명할 수 있다면 이를 이용하여 자가포식과 관련된 질환의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대가 되고 있다.
이에, 본 발명자들은 자가포식과 관련된 세포 내 신호전달체계를 규명하기 위한 연구를 진행하던 중, ULK1(serine/threonine-protein kinase)이 류신-tRNA-합성효소(leucyl-tRNA synthetase, 이하 “LRS"라 함)의 특정 잔기를 인산화함으로써 자가포식을 유도하여 글루코스 결핍 환경에서 세포를 보호할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 자가포식(autophagy) 조절제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
(a) LRS(Leucyl-tRNA synthetase) 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계;
(c) 상기 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제(activator)로 판정하고, 상기 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 LRS 단백질에 결합한 항체의 양을 분석하여 정상대조구에 비해 그 양이 감소한 경우 자가포식 관련 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 자가포식(autophagy) 조절제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) LRS(Leucyl-tRNA synthetase) 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계;
(c) 상기 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제(activator)로 판정하고, 상기 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 LRS 단백질에 결합한 항체의 양을 분석하여 정상대조구에 비해 그 양이 감소한 경우 자가포식 관련 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 자가포식(autophagy) 조절제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) LRS(Leucyl-tRNA synthetase) 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계;
(c) 상기 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제(activator)로 판정하고, 상기 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정하는 단계.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 (i) 글루코스가 결핍되어 있는 환경에서 ULK1이 LRS와 상호작용하여 LRS의 391번째 및/또는 720번째 아미노산 잔기인 세린(serine)을 인산화 한다는 점, (ii) S391 및/또는 S720이 인산화된 LRS는 아미노아실화 활성(aminoacylation activity)을 상실한다는 점 및 (iii) S391 및/또는 S720이 인산화된 LRS는 mTORC1을 활성화시키지 못해 세포의 자가포식(autophagy)이 증대된다는 점을 발견하였다.
즉, 본 발명은 상기 (i) 내기 (iii)의 신규한 발견에 기초한 것으로, 이는 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 바이다.
(a) LRS ( Leucyl - tRNA synthetase ) 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
본 발명에서 상기 LRS 단백질을 발현하는 세포는 LRS 단백질이 내인적으로(endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며, 또는 LRS를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현 되도록 하여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 상기 세포는 예컨대, 293T 세포, HEK293T 세포, MEF(mouse embryonic fibroblasts) 또는 HeLa 세포일 수 있다.
상기 동물세포를 배양하기위해 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)),α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle'smedium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal.Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)),McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G.et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.
본 발명에서 LRS는 류실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 LRS는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다(Genbank Accession No. NP_064502.9). 또한 본 발명의 LRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％,72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,"실질적으로 동질의 생리활성"이란 RagD와 결합하고, Rag GTPase에 대한 GTPase-activating protein(GAP) 기능을 하여 mTORC1을 활성화하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 LRS 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 LRS 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 LRS 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 발명의 상기 방법에 따르면, 우선 LRS 단백질을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 처리한다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린(serine) 아미노산 잔기의 인산화(phosphorylation)에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학물질, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험 물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다.
시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 (a) 단계 이후에 세포를 글루코스(glucose)가 결핍된 환경에서 일정한 시간동안 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 글루코스가 결핍된 환경에서 세포 내 ULK1이 LRS와 상호작용하여 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기를 인산화 시키는 것이 현저히 증가하였으며, 따라서, 본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계 이후에 세포를 글루코스가 결핍된 환경에 노출시킴으로써 LRS의 인산화를 유도하는 단계가 추가될 수 있다.
글루코스가 결핍된 환경에서 세포를 배양하는 시간은 5분 내지 1시간일 수 있으며, 통상의 기술자가 반복실험을 통해 적절한 시간 조건을 선택할 수 있다.
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린( serine ) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계;
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 처리된 시험물질이 세포 내 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 아미노산 잔기인 세린을 인산화 시키는 정도를 분석하는 단계이다.
상기 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도를 분석하기 위해서는 당업계의 어떠한 인산화 분석 방법도 이용할 수 있으며, 예컨대, 웨스턴 블럿, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Lequin R (2005)), 질량분석법(mass-spectrometry), 오토라디오그래프(autoradiograph) 또는 세포 내 유동 세포분석법(Intracellular Flow Cytometry, http://www.abcam.com/?pageconfig=resource&rid=12060) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도의 분석은 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시하는 것일 수 있다.
(c) 상기 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절( up - regulation ) 되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제( activator )로 판정하고, 상기 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절( down - regulation )되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정하는 단계;
본 명세서에서 사용되는 용어 “상향-조절”은 자가포식 신호전달이 활성화되지 않은 때[예컨대, 동물 세포의 정상(normal) 상태]를 기준으로 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도가 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 증가된 양상을 나타내는 경우를 의미하는 것으로, 이를 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절 되었다고 판단한다.
상기 자가포식 활성제는 암, 퇴행성 신경질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 감염성 질환 또는 염증성 질환 등을 진단 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 이용될 수 있다(EP2383294, Cell. 2008 January 11; 132(1): 27?42. 참고).
본 명세서에서 사용되는 용어 “하향-조절”은 공지된 자가포식-유도 활성제인 아미다론 히드로클로라이드(Amiodarone hydrochloride), 프리펠딘 A(Brefeldin A), 카르바마제핀(Carbamazepine), 덱사메타손(Dexamethasone), 돌소몰핀 다이히드로클로라이드(Dorsomorphin dihydrochloride), EB 1089(비타민 D 수용체 아고니스트), GF 109203X(프로테인 키나아제 C 억제제), L-690,330(이노시톨모노포스페이트 억제제), NF449(P2X1 안타고니스트), 니클로사마이드(Niclosamide), 니모디핀(Nimodipine), 니트리디핀(Nitrendipine), PI103 히드로클로라이드(PI 3-키나아제, mTOR 및 DNA-PK의 억제제), 피피스린-α 히드로브로마이드(Pifithrin-αhydrobromide), 라파마이신(Rapamycin), 로트렐인(Rottlerin), SMER 28, 테모졸로마이드(Temozolomide), 탑시가르긴(Thapsigargin), 토린(Torin), 투니카마이신(Tunicamycin), 발포산(Valproic acid) 및 베라파밀 히드로클로라이드(Verapamil hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성제를 처리하는 경우에 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도가 감소된 양상을 나타내는 경우에, 이를 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절되었다고 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서 LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린(serine)이 인산화되면 LRS에 의해 매개되던 mTORC1 활성화가 저해되고, 글루코스가 결핍된 환경에서 자가포식(autophagy)이 증대되어 세포의 생존율이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, LRS의 391번째 및/또는 720번째 잔기의 인산화 감소는 자가포식 작용이 정상적으로 발휘되지 않아 발생하는 질환들과 밀접하게 연관이 되어 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린(serine)의 인산화 정도를 평가함으로써 자가포식-관련 질환을 보다 정확하게 예측하고 진단하는 것이 가능하다. 본 발명에서 상기??진단??은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 인산화 정도를 측정하는 제제는 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린(serine)이 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하다. 상기 항체는 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린(serine)이 인산화된 경우 이를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 인산화 정도를 판단할 수 있다.
본 발명에서 상기 자가포식-관련 질환은 암, 퇴행성 신경질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 질환과 자가포식과의 관련성에 대해서는 “Cell. 2008 January 11; 132(1): 27?42”를 참조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 자가포식-관련 질환은 암 또는 퇴행성 신경질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson'sdisease), 헌팅턴 질환(Huntington's disease) 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 심혈관질환은 광동맥성심장병, 심근증, 고혈압성심장질환, 심부전, 폐성심, 심율동장애, 심장 내막염, 염증성 심비대증, 심근염, 심장판막증, 뇌혈관장애, 하지동맥질환, 선천성 심질환 및 심장 류머티즘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 감염성 질환은 바이러스(예컨대 아데노바이러스, 허르페스바이러스(예를 들어 HSV-I, HSV-II, CMV 또는 VZV), 폭스바이러스(예를 들어 천연두(variola), 백시니아 또는 물사마귀바이러스(molluscum contagiosum)와 같은 진성두창바이러스(orthopoxvirus), 피코르나바이러스(예를 들어 리노바이러스 또는 엔테로바이러스)), 오르토믹소바이러스 (예를 들어 인플루엔자바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어 5-파라인플루엔자바이러스, 유핸성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스 및 호흡기합포체 바이러스), 코로나 바이러스(예를 들어 SARS), 파포바바이러스(예를 들어 성기사마귀, 보통사마귀 또는 족저 사마귀를 유발하는 파필로마 바이러스), 헤파드나바이러스(예를 들어 B형간염 바이러스), 플라비바이러스(예를 들어 C형간염 바이러스 또는 뎅기열바이러스(Dengue virus)) 또는 레트로바이러스(예를 들어 HIV와 같은 렌티바이러스))에 의한 감염성 질환, 박테리아(예컨대 에스케리치아, 엔테로박터, 살모넬라, 스타필로코커스, 쉬겔라, 리스테리아, 에어로박터, 헬리코박터, 클레브시엘라, 프로테우스, 수도모나스, 나이세리아, 클로스트리듐, 바실러스, 코리네박테리움, 마이코박테리움, 캠필로박터,비브리오, 세라티아, 프로비덴시아, 크로모박테리움, 브루셀라, 예르시니아, 해모필러스 또는 보르데텔라 속)에 의한 감염성 질환 및 그 밖의 다른 감염성 질병(예를 들어 클라미디아와 칸디다증, 국균증, 히스토마플라스마증 및 크립토콕쿠스 뇌막염을 포함하는 진균성 질병 및 말라리아, 뉴머시스터스성 폐렴, 리슈마니아증, 립토스포리디움증, 톡소포자충증 및 트리파소노마 감염을 포함하는 기생충성 질환)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 골관절염, 류마티스 관절염, 통풍, 강직성 척추염, 건염, 건막염, 류마티스 열, 루프스, 섬유근통(Fibromyalgia), 건선 관절염, 천식, 아토피, 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 LRS 단백질에 결합한 항체의 양을 분석하여 정상대조구에 비해 그 양이 감소한 경우 자가포식 관련 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, LRS의 391번째 및/또는 720번째 잔기의 인산화는 자가포식을 촉진하고 세포의 성장 조절을 정상화하는 것에 관련이 되어 있기 때문에, LRS의 391번째 및/또는 720번째 잔기의 인산화 여부를 검출함으로써 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease)의 진단이 가능하다.
본 발명에서 상기 자가포식-관련 질환은 암, 퇴행성 신경질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
상기 시료는 자가포식-관련 질환 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액일 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.
(b) 상기 시료에 391번째 및 720번째 세린( serine ) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;
상기 (b) 단계는 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도를 판단하기 위하여, 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 항체를 시료와 접촉시키는 단계로서, LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화가 정상대조구와 비교해 증가되어 있는 경우에는 자가포식이 활성화 되어 있는 것으로, 인산화가 정상대조구와 비교해 감소되어 있는 경우에는 자가포식이 정상적으로 작동하지 않는 것으로 판단할 수 있다.
(c) 상기 (b) 단계에서 LRS 단백질에 결합한 항체의 양을 분석하여 정상대조 구에 비해 그 양이 감소한 경우 자가포식-관련 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계;
상기 (c) 단계는 LRS의 인산화된 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 항체가 LRS 단백질과 결합한 양을 분석하는 단계로서, 상기 (c) 단계에서 측정한 피검체의 LRS 단백질 인산화 정도를, 동일한 방법으로 측정한 정상대조구의 LRS 단백질 인산화 정도와 비교한다.
LRS 단백질의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기의 인산화가 정상대조구에 비하여 감소한 피검체는 자가포식-관련 질환에 걸린 것으로 판정할 수 있다. 상기 인산화가 감소했다는 것은 정상대조구에 비하여 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%까지 감소했다는 것을 의미한다.
본 발명은 ULK1이 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기를 인산화하여 자가포식(autophagy) 과정을 조절한다는 발견에 기초한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 자가포식 조절제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있어 자가포식-관련 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 자가포식-관련 질환의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 글루코스에 의한 mTORC1 활성화에 LRS가 관여되어 있음을 확인한 도면이다.
도 1A는 LRS 야생형(wild type) 과 hetero MEF 에서 글루코스를 30분간 차단한 후, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하였을 때 mTORC1 의 카이나제 활성(kinase activity)을 mTORC1의 기질 중 하나인 S6K 의 인산화 정도를 통해서 확인한 결과이다.
도 1B는 LRS 야생형(WT)과 overexpression transgenic (TG) MEF에서 글루코스를 30 분간 차단한 후, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하였을 때 mTORC1 카이나제 활성을 S6K의 인산화 정도를 통해서 측정한 결과이다.
도 1C는 293T (human embryonic kidney cell line) 세포에 non-targeting control siRNA (si-con) 또는 LRS 를 표적하는 siRNA (si-LRS)를 각각 형질전환하고, 72시간 후에 0, 5, 10, 20, 40분 동안 글루코스를 차단하여 mTORC1 카이나제 활성이 얼마나 남아있는지를 S6K의 인산화 정도를 통해 측정한 결과이다.
도 2는 글루코스가 부족한 조건에서 LRS와 ULK1이 상호작용을 한다는 것을 확인한 결과이다.
도 2A는 293T 세포를 Flag 태그된 LRS로 형질전환하여 LRS를 과발현시키고 24시간 후에 글루코스를 30분간 차단하고, 다시 글루코스를 각각 3분, 10분 또는 30분 동안 공급하고 나서 LRS와 ULK1의 상호작용을 co-IP (co-immunoprecipitation)을 통해서 확인한 결과이다(WCL: whole cell lysate).
도 2B는 HeLa 세포에 myc 태그된 ULK1을 형질전환하여 ULK1을 과발현하고, 24시간 후에 30분 동안 글루코스를 차단하고, 10분 동안 다시 글루코스를 공급한 후, 세포를 고정하고 permeabilization하고 LRS 항체를 488(green)으로, Myc 항체를 594(red)로 하여 형광현미경으로 관찰한한 결과이다(우측 그래프는 LRS와 ULK1이 중첩되는 부분의 비율을 대조군과의 상대적인 비율로 정량화한 결과이다.).
도 3은 ULK1이 LRS의 391번째 및/또는 720번째 아미노산 잔기인 세린을 인산화한다는 것을 확인한 결과이다.
도 3A는 293T 세포를 myc 태그된 ULK1로 형질전환하고 24시간 경과 후, 40분 동안 글루코스를 차단한 후에 IP 한 bead 에 E. coli 에서 정제한 His 태그된 LRS 단백질을 넣고 incubation 하여 ULK1에 의해 LRS가 인산화 되는지를 in vitro kinase assay 를 통해 확인한 결과이다.
도 3B는 293T 세포를 myc 태그된 LRS로 형질전환하고 24시간이 경과한 후, 2시간 동안 글루코스가 있는 조건 또는 글루코스가 없는 조건에서 배양하고, Myc 항체로 IP 하고 phospho-serine 또는 phospho-threonine 항체로 LRS의 인산화 잔기를 확인한 결과이다(IP: immunoprecipitation, WCL: whole cell lysate).
도 3C는 도 3A의 실험에서 사용한 샘플과 동일한 샘플을 mass spectroscopy를 통해 분석하여 LRS가 인산화되는 잔기를 확인한 결과이다.
도 3D는 LRS의 S391 및 S720의 세린을 알라닌으로 치환한 LRS(LRS S391A/S720A, 2SA)가 ULK1에 의해 인산화 되는지 여부를 in vitro kinase assay를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 인산화된 LRS가 아미노아실화 활성(aminoacylation activity)을 상실한다는 것을 확인한 결과이다.
도 4A는 LRS가 아미노아실화 활성을 발휘할 때 ATP와 tRNA의 결합에 중요한KMSKS motif의 마지막 세린인 S720이라는 것을 나타낸 도면이다.
도 4B는 293T 세포에 대조군 벡터, myc 태그된 EPRS, myc 태그된 LRS를 과발현하고 24시간 후에 myc 항체로 IP. Bead 에 있는 LRS를 radio isotope labelled leucine ([3H] leucine)과 incubation하여 각각의 단백질에 결합하는 류신의 양을 LSC (liquid scintillation counter)로 측정한 결과이다.
도 4C는 LRS 야생형, LRS S391A/S720A(LRS 2SA, phosphorylation deficient) 돌연변이, LRS S391E/S720E (LRS 2SE, phosphorylation mimic) 돌연변이에서 leucine binding assay를 수행한 결과이다.
도 5는 글루코스에 의한 mTORC1 활성화가 LRS의 인산화에 의해 감소되는 것을 확인한 결과이다.
도 5A는 293T 세포를 si-con 또는 si-LRS (LRS의 UTR region targeting. 외부에서 넣어준 plasmid DNA 에서 유래한 mRNA 는 targeting 하지 않고, endogenous LRS 만을 targeting)로 형질전환하고, 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA mutant, 2SE mutant를 각각 형질전환하여 siRNA 는 72 시간, plasmid DNA 는 24 시간이 될 때, 30 분 동안 글루코스를 차단하고, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하고, mTORC1 활성화 정도를 S6K 의 인산화 정도를 통해서 확인한 결과이다.
도 5B는 293T 세포에 si-con 과 si-LRS를 형질전환한 후, 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA mutant, 2SE mutant를 형질전환하고, FACS 에서 FSC (forward scattering)를 분석하여 세포의 크기를 측정한 결과이다.
도 5C는 RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA, 2SE mutants를 형질전환 한 후 자가포식이 얼마나 일어났는지를 LC3-II의 발현 정도를 통해서 확인한 결과이다.
도 6 및 도 7은 LRS 인산화가 글루코스가 부족한 환경에서 세포를 보호한다는 것을 확인한 결과이다.
도 6A는 RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 13C stable isotope labeled leucine을 uptake 시킨 후 류신이 분해되어 ATP 를 생성하기 위해 만드는 물질인 citric acid의 양을 high glucose (25 mM glucose)와 low glucose (1 mM glucose) 조건에서 측정한 결과이다.
도 6B는 RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 low glucose condition을 주고, 류신의 양을 농도 의존적으로 증가시킨 후, YOYO-1 dye 염색을 통해 세포독성을 측정한 결과이다.
도 7A는 RD에 si-con과 si-ULK1을 형질전환하고 High glucose, low glucose, low glucose + 류신공급 조건에서 실험을 수행하며, YOYO-1 dye 염색을 통해 세포독성을 측정한 결과이다.
도 7B는 RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA, 2SE mutants를 형질전환 시킨 후 자가포식이 얼마나 일어났는지를 LC3-II의 발현량을 통해서 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 실험물질
DMSO, glucose와 LDH assay kit은 sigma에서 구입했으며, control siRNA와 LRS siRNA는 Dharmacon에서 13C-leucine은 perkin elmer에서 LRS 항체는 Neomics와 bethyl에서, ULK1 항체는 abcam에서 pACC, ACC, p-S6K, S6K, p-AMPK, AMPK, LC3-I, LC3-II, actin의 항체는 cell signaling에서 myc 항체는 bethyl과 santacruz에서 구입했다.
2. 세포배양
HEK-293, HeLa 세포는 ATCC에서 구입했고 LRS +/+, +/-, TG MEF 세포는 embryo를 13.5 day에서 sacrified 하고 fibroblast를 isolation해서 얻으며 high glucose DMEM+10% FBS medium 에서 배양하였다. RD (Human muscle rhabdomyosarcoma cell lines)은 DMEM+10% FBS medium에서 배양하였다. RD 세포는 myc-EV, myc-LRs, myc-LRS 2SA, myc-LRS2SE의 lentivirus를 만들어서 세포의 infection 시키고 puromycine 으로 selection을 한후 LRSS의 과발현을 위해서 DOX의 (2ug/ml) 농도로 3일을 처리하였다.
3. 웨스턴 블롯(Western blotting) 및 면역침강법(Immunoprecipitation)
HEK-293, HeLa, MEF 세포 lysate는 동일 단백질의 양을 bradford를 통해서 정량을 하고 Lamemmli sample buffer를 넣고 95°에서 5분 동안 끓였다. denatured 단백질을 SDS-PAGE를 통해서 분리하고 nitrocellulose membrane으로 transfer 했다. membrane은 5% 탈지분유를 TTBS (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)에 녹인 용액으로 blocking 했다. membrane은 각각의 1차 항체로 incubation하고 Horseradish peroxidase (HRP)가 conjugation된 2차 항체로 반응시켰다. 검출은 chemiluminescence kit를 이용해서 측정했다. Immunoprecipitation은 Strep-tagged EPRS을 세포 lysis buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glycerol) 로 용해시킨 lysates 2 mg과 4°에서 9시간동안 incubation 했다. Protein A-sepharose bead를 2시간 동안 추가적으로 incubation 했다. Quick spin을 해서 washing (PBS+0.5% TX-100) buffer로 3번 washing 했다. Lamemmli samples buffer를 넣고 95°에서 5분 동안 끓인 후에 western blotting을 진행했다.
4. 면역세포화학(Immunocytochemistry)
poly-L-lysine으로 코팅이 된 cover slide에 HEK-293 세포를 깐후, 24시간 후에 포도당을 처리한후, 4% formadehyde로 세포를 고정하고 blocking solution으로 1시간 처리하고 보고자하는 1차 항체를 overnight동안 incubation을 하고, Alexa 499, Alexa-594 항체가 conjugation된 2차 항체를 1시간동안 incubation을 했다. mounting solution으로 처리하고 confocal microscope로 세포 이미지를 관찰했다.
5. 오토라디오그래피(Autoradiography)
Myc-ULK1을 과발현 세포에서 IP 한후 정제된 His-LRS 또는 BSA를 32P-ATP와 2시간 동안 incubation을 한다. 반응이 끝난 후, lamemmli sample buffer를 넣고 95°에서 5분 동안 끓였다. denatured 단백질을 SDS-PAGE를 통해서 분리하고 gel을 nitrocellulose membrane으로 transfer 했다. Autoradio signal을 scintillation detector로 검출했다. 동일양의 단백질을 SDS-PAGE를 통해서 분리하고 coomassie staining을 해서 normalization을 했다.
6. 류신 결합 어세이(Leucine binding assay)
Myc-LRS WT, 2SA, 2SE or Myc-EPRS를 세포에서 IP한 후 13C-Leucine을 binding buffer (50mM Hepes-NaOH, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100)와 4시간 동안 incubation을 했다. Washing buffer (50mM Hepes-NaOH, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, cold leucine)로 1ml씩 3번 씻어줬다. 각각의 샘플을 cocktail solution을 500ul씩 넣어주고 liquid scintillation counter로 값을 읽어줬다.
7. FACS
HEK-293 세포에 Myc-LRS WT, 2SA, 2SE을 과발현 시키고 24시간 후에, PBS로 3번 washing을 한후 forward scattering (FSC)를 분석하여 세포의 크기를 측정했다.
8. 세포 사멸 어세이(cell death assay)
RD 세포를 Myc-LRS WT, 2SA, 2SE을 과발현 시키후 24시간 동안 low 포도당 조건으로 처리한 후, leucine의 양을 농도 의존적으로 처리를 한다. YOYO-1 염색 시약을 통해서 세포 사멸을 측정했다. 세포가 사멸을 해서 핵 안의 DNA가 밖으로 흘러나오게 되면 YOYO-1 시약과 반응하여 fluorescence signal이 나오게 된다. 그 시그널을 검출하여 image를 얻고 imageJ의 소프트웨어를 이용해서 이미지를 정량화했다.
<실험결과>
1. 글루코스에 의한 mTORC1 활성화가 LRS에 의해 매개됨
세포의 성장과 증식을 조절하는 경로의 중심에 있는 mTOR (mammalian target of rapamycin)은 macrolide계 항생제인 rapamycin의 표적단백질로서 단백질인산화효소(protein kinase)의 활성을 가지고 있다. 세포 외부의 영양상태와 성장인자를 인지하여 세포내 신호전달(signal transduction) 경로를 통해 세포의 성장과 증식을 조절한다. 하지만 세포 내외의 상황에 따라 mTOR 작용이 멈추면 자가포식경로가 유도된다. 이에, 본 발명자들은 LRS가 글루코스에 의한 mTORC1 활성화에 직접적으로 관여하는지 여부를 판단하고자 하였다.
LRS 야생형(wild type) 과 hetero MEF 에서 글루코스를 30분간 차단한 후, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하였을 때 mTORC1 의 카이나제 활성(kinase activity)을 mTORC1의 기질 중 하나인 S6K 의 인산화 정도를 통해서 측정하였다. 그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이 LRS hetero MEF 에서 글루코스에 의한 mTORC1 활성이 감소되어 있음을 확인하였다.
그 다음으로, LRS 야생형(WT)과 overexpression transgenic (TG) MEF에서 글루코스를 30 분간 차단한 후, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하였을 때 mTORC1 카이나제 활성을 S6K의 인산화 정도를 통해서 측정하였다. 그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, LRS TG MEF 에서 글루코스에 의한 mTORC1 활성이 증가되어 있음을 알 수 있었다.
또한, 293T (human embryonic kidney cell line) 세포에 non-targeting control siRNA (si-con) 또는 LRS 를 표적하는 siRNA (si-LRS)를 각각 형질전환하고, 72시간 후에 0, 5, 10, 20, 40분 동안 글루코스를 차단하여 mTORC1 카이나제 활성이 얼마나 남아있는지를 S6K의 인산화 정도를 통해 측정하였다. 그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이 LRS 가 knockdown 되었을 때, 글루코스 결손에 더 민감하게 하게 mTORC1 의 활성이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 글루코스에 의한 mTORC1 활성화에는 LRS가 밀접하게 관여되어 있다는 것을 알 수 있었다.
2. 글루코스의 차단에 대응하여 LRS는 ULK1과 결합함
글루코스에 의한 mTORC1 활성화가 LRS를 매개한다는 것을 확인한 후, 이러한 LRS와 mTORC1의 신호전달체계의 상위 signal을 확인하고자 하였다.
293T 세포를 Flag 태그된 LRS로 형질전환하여 LRS를 과발현시키고 24시간 후에 글루코스를 30분간 차단하고, 다시 글루코스를 각각 3분, 10분 또는 30분 동안 공급하고 나서 LRS와 ULK1의 상호작용을 co-IP (co-immunoprecipitation)을 통해서 확인하였다. 즉, Flag 항체로 IP 한 후에 ULK1 항체로 detection 한 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이 글루코스가 없는 환경에서 LRS와 ULK1이 결합한다는 것을 알 수 있었다.
또한, HeLa 세포에 myc 태그된 ULK1을 형질전환하여 ULK1을 과발현하고, 24 시간 후에 30분 동안 글루코스를 차단하고, 10분 동안 다시 글루코스를 공급하였다. 세포를 고정하고, permeabilization하고 LRS 항체를 488(green)으로, Myc 항체를 594(red)로 하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이 글루코스가 없는 환경에서 LRS와 ULK1이 같은 곳에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 글루코스가 결핍된 환경에서 LRS는 ULK1과 상호결합한다는 것을 확인할 수 있었다.
3. ULK1은 LRS의 391번째 및 720번째 아미노산 잔기인 세린을 인산화 시킴
상기 실험결과 2를 통해 글루코스가 차단된 환경에서 ULK1은 LRS와 상호결합한다는 것을 확인한 후, 세린/트레오닌 카이나제인 ULK1이 LRS의 아미노산 서열에 어떤 영향을 나타내는지 확인하고자 하였다.
293T 세포를 myc 태그된 ULK1로 형질전환하고 24시간 경과 후, 40분 동안 글루코스를 차단한 후에 IP 한 bead 에 E. coli 에서 정제한 His 태그된 LRS 단백질을 넣고 incubation 하여 ULK1에 의해 LRS가 인산화 되는지를 in vitro kinase assay 를 통해 확인하였다. 즉, 인산화에 사용되는 ATP 의 gamma phosphate가 radio isotope labeling 된 것을 사용하여 autoradiograph을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이 ULK1 에 의해 BSA(bovine serum albumin)는 인산화 되지 않지만, LRS는 인산화 되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, LRS가 ULK1에 의해 인산화 된다는 것을 확인하였고 그 다음으로 LRS의 어떤 잔기가 인산화 되는지를 확인하고자 하였다. 293T 세포를 myc 태그된 LRS로 형질전환하고 24시간이 경과한 후, 2시간 동안 글루코스가 있는 조건 또는 글루코스가 없는 조건에서 배양하였다. Myc 항체로 IP 하고 phospho-serine 또는 phospho-threonine 항체로 LRS의 인산화 잔기를 확인하였다(ULK1 이 serine/threonine kinase 이기 때문). 그 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이 LRS는 글루코스가 없을 때 세린(serine) 잔기가 인산화 된다는 것을 확인할 수 있었다.
그 다음으로, LRS에서 ULK1에 의해 인산화되는 아미노산 잔기를 확인하고자 하였다. 상기 도 3A의 실험에서 사용한 샘플과 동일한 샘플을 mass spectroscopy를 통해 분석하여 LRS가 인산화되는 잔기를 확인하였다. 그 결과, 도 3C에서 볼 수 있는 바와 같이, LRS의 아미노산 서열 중 391번째(S391) 및 720번째(S720) 잔기인 세린에서 가장 많은 phosphopeptide 수를 확인할 수 있었다.
상기 결과를 다시한번 확인하기 위해 S391과 S720이 인산화되지 않도록 세린을 알라닌으로 치환한 LRS(LRS S391A/S720A, LRS 2SA)에서 in vitro kinase assay 를 통해 야생형은 인산화가 되지만, LRS 2SA mutant 에서는 인산화가 되지 않는 것을 확인하였(도 3D).
상기 결과를 통해 ULK1에 의한 LRS의 인산화 위치가 S391 과 S720 이라는 것을 확인하였다.
4. 인산화된 LRS는 아미노아실 tRNA 합성효소의 기능을 상실함
여러 생물에서 LRS S720 잔기를 전후로 amino acid sequence alignment 를 진행한 결과 S720 은 KMSKS motif 의 마지막 세린으로, LRS가 aminoacylation activity를 수행할 때 기질인 ATP 와 tRNA의 결합에 중요하다고 알려져 있다(도 4A).
293T 세포에 대조군 벡터, myc 태그된 EPRS, myc 태그된 LRS를 과발현하고 24시간 후에 myc 항체로 IP. Bead 에 있는 LRS를 radio isotope labelled leucine ([3H] leucine)과 incubation하여 각각의 단백질에 결합하는 류신의 양을 LSC (liquid scintillation counter)로 측정하였다. 과량의 isotope free leucine을 함께 넣어 경쟁시킴으로써 특이적인 결합이 일어났음을 확인하였다. 대조군 벡터에 결합한 류신의 양을 각 단백질에 결합한 류신의 양에서 뺀 수치를 그래프로 나타내어 도 4B에 나타내었다. 도 4B를 통해 류신은 ATP가 존재할 때에만 LRS에 잘 결합 할 수 있음을 알 수 있었다.
LRS 야생형, LRS S391A/S720A(LRS 2SA, phosphorylation deficient) 돌연변이, LRS S391E/S720E (LRS 2SE, phosphorylation mimic) 돌연변이에서 leucine binding assay를 수행하였다. 도 4C에 나타낸 바와 같이, LRS 2SA, LRS 2SE 돌연변이는 류신 결합력이 없음을 알 수 있었다. 상기 도 A 와 도 B의 결과로부터 LRS의 인산화가 ATP의 LRS에의 결합에 영향을 주어 결과적으로 LRS에 류신의 결합도 일어나지 않는 것임을 알 수 있었다.
5. LRS가 인산화되면 글루코스에 의해 유도되는 mTORC1의 활성화가 약화됨
293T 세포를 si-con 또는 si-LRS (LRS의 UTR region targeting. 외부에서 넣어준 plasmid DNA 에서 유래한 mRNA 는 targeting 하지 않고, endogenous LRS 만을 targeting)로 형질전환하고, 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA mutant, 2SE mutant를 각각 형질전환하여 siRNA 는 72 시간, plasmid DNA 는 24 시간이 될 때, 30 분 동안 글루코스를 차단하고, 10분 동안 글루코스를 다시 공급하고, mTORC1 활성화 정도를 S6K 의 인산화 정도를 통해서 확인하였다. 그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, LRS 2SA, 2SE mutants는 글루코스에 의한 mTORC1 활성화를 유도하지 못함을 확인하였다. LRS 2SA, 2SE mutants는 류신과 결합하지 않기 때문인 것을 알 수 있으며, 이는 LRS에 의한 mTORC1 활성화가 류신과의 결합을 통해서 일어난다고 밝힌 기존 연구의 결과와 일치하는 것이다.
293T 세포에 si-con 과 si-LRS를 형질전환한 후, 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA mutant, 2SE mutant를 형질전환시켰다.. FACS 에서 FSC (forward scattering)를 분석하여 세포의 크기를 측정하였다. mTORC1이 활성화되면 세포의 크기가 커지는 것으로 보고되고 있으며, 도 5B에 나타낸 바와 같이, mTORC1의 활성화가 정상적으로 나타나지 않는 LRS 2SA, 2SE mutants의 경우 LRS 야생형에 비해 세포의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.
RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA, 2SE mutants를 형질전환 한 후 자가포식이 얼마나 일어났는지를 LC3-II의 발현 정도를 통해서 확인하였다. LRS가 과발현되면 mTORC1가 활성화되어 자가포식이 감소한다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, LRS WT 과발현에 의한 자가포식 감소 효과가 LRS 2SA, 2SE mutants에서는 확인되지 않았다.
6. LRS의 인산화는 글루코스 결핍 환경에서 세포를 보호함
RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 13C stable isotope labeled leucine을 uptake 시킨 후 류신이 분해되어 ATP 를 생성하기 위해 만드는 물질인 citric acid의 양을 high glucose (25 mM glucose)와 low glucose (1 mM glucose) 조건에서 측정하였다. 그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 전체 citric acid 중에서 13C 를 포함하는 citric acid 의 비율이 low glucose condition에서 증가하였다. 이는 low glucose condition에서는 LRS가 ULK1에 의해 인산화되어 류신이 LRS에 결합하지 않으며, 류신이 ATP를 생성하는데 사용되어 이로부터 유래한 citric acid 의 비율이 증가했다는 것을 알 수 있었다.
RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 low glucose condition을 주고, 류신의 양을 농도 의존적으로 증가시킨 후, YOYO-1 dye 염색을 통해 세포독성을 측정하였다. 특정 농도까지는 류신이 증가할수록 low glucose condition에서 세포 사멸이 감소하는 결과가 나타났다(도 6B). 즉, low glucose condition에서 류신의 증가가 세포의 사멸을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
RD에 si-con과 si-ULK1을 형질전환하고 High glucose, low glucose, low glucose + 류신공급 조건에서 실험을 수행하였다. 이 때 YOYO-1 dye 염색을 통해 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, Low glucose condition에서 증가하는 세포사멸이 류신 공급군에서는 감소하는 경향이 나타났다. ULK1 을 결손시킨 세포군에서는 류신 공급에 의한 세포사멸 감소 효과가 나타나지 않았다. 이는 low glucose condition에서 류신 공급에 의한 세포사멸의 감소가 ULK1 의존적이라는 것을 의미한다. 즉, low glucose 조건에서는 ULK1이 LRS를 인산화시키고, 결과적으로 류신이 LRS와 결합하지 못하고 ATP의 생성에 사용되기 때문에 세포의 사멸이 감소될 수 있는 것으로 판단할 수 있었다.
RD(human muscle rhabdomyosarcoma cell line)에 대조군 벡터, myc 태그된 LRS 야생형, 2SA, 2SE mutants를 형질전환 시킨 후 자가포식이 얼마나 일어났는지를 LC3-II의 발현량을 통해서 확인하였다. 그 결과, 도 7B에 나타낸 바와 같이 mTORC1 이 활성화되어 있으면 자가포식이 감소되어야 하는데, LRS WT 과발현에 의한 자가포식 감소 효과가 LRS 2SA, 2SE mutants 에서는 나타나지 않았다.
본 발명은 ULK1이 LRS의 391번째 및/또는 720번째 세린 아미노산 잔기를 인산화하여 자가포식(autophagy) 과정을 조절한다는 발견에 기초한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 자가포식 조절제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있어 자가포식-관련 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 자가포식-관련 질환의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
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Gly Ser Ser Lys Tyr Gln Trp Gly Ile 145 150 155 160 Met Lys Ser Leu Gly Leu Ser Asp Glu Glu Ile Val Lys Phe Ser Glu 165 170 175 Ala Glu His Trp Leu Asp Tyr Phe Pro Pro Leu Ala Ile Gln Asp Leu 180 185 190 Lys Arg Met Gly Leu Lys Val Asp Trp Arg Arg Ser Phe Ile Thr Thr 195 200 205 Asp Val Asn Pro Tyr Tyr Asp Ser Phe Val Arg Trp Gln Phe Leu Thr 210 215 220 Leu Arg Glu Arg Asn Lys Ile Lys Phe Gly Lys Arg Tyr Thr Ile Tyr 225 230 235 240 Ser Pro Lys Asp Gly Gln Pro Cys Met Asp His Asp Arg Gln Thr Gly 245 250 255 Glu Gly Val Gly Pro Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Lys Leu Lys Val Leu 260 265 270 Glu Pro Tyr Pro Ser Lys Leu Ser Gly Leu Lys Gly Lys Asn Ile Phe 275 280 285 Leu Val Ala Ala Thr Leu Arg Pro Glu Thr Met Phe Gly Gln Thr Asn 290 295 300 Cys Trp Val Arg Pro Asp Met Lys Tyr Ile Gly Phe Glu Thr Val Asn 305 310 315 320 Gly Asp Ile Phe Ile Cys Thr Gln Lys Ala Ala Arg Asn Met Ser Tyr 325 330 335 Gln Gly Phe Thr Lys Asp Asn Gly Val Val Pro Val Val Lys Glu Leu 340 345 350 Met Gly Glu Glu Ile Leu Gly Ala Ser Leu Ser Ala Pro Leu Thr Ser 355 360 365 Tyr Lys Val Ile Tyr Val Leu Pro Met Leu Thr Ile Lys Glu Asp Lys 370 375 380 Gly Thr Gly Val Val Thr Ser Val Pro Ser Asp Ser Pro Asp Asp Ile 385 390 395 400 Ala Ala Leu Arg Asp Leu Lys Lys Lys Gln Ala Leu Arg Ala Lys Tyr 405 410 415 Gly Ile Arg Asp Asp Met Val Leu Pro Phe Glu Pro Val Pro Val Ile 420 425 430 Glu Ile Pro Gly Phe Gly Asn Leu Ser Ala Val Thr Ile Cys Asp Glu 435 440 445 Leu Lys Ile Gln Ser Gln Asn Asp Arg Glu Lys Leu Ala Glu Ala Lys 450 455 460 Glu Lys Ile Tyr Leu Lys Gly Phe Tyr Glu Gly Ile Met Leu Val Asp 465 470 475 480 Gly Phe Lys Gly Gln Lys Val Gln Asp Val Lys Lys Thr Ile Gln Lys 485 490 495 Lys Met Ile Asp Ala Gly Asp Ala Leu Ile Tyr Met Glu Pro Glu Lys 500 505 510 Gln Val Met Ser Arg Ser Ser Asp Glu Cys Val Val Ala Leu Cys Asp 515 520 525 Gln Trp Tyr Leu Asp Tyr Gly Glu Glu Asn Trp Lys Lys Gln Thr Ser 530 535 540 Gln Cys Leu Lys Asn Leu Glu Thr Phe Cys Glu Glu Thr Arg Arg Asn 545 550 555 560 Phe Glu Ala Thr Leu Gly Trp Leu Gln Glu His Ala Cys Ser Arg Thr 565 570 575 Tyr Gly Leu Gly Thr His Leu Pro Trp Asp Glu Gln Trp Leu Ile Glu 580 585 590 Ser Leu Ser Asp Ser Thr Ile Tyr Met Ala Phe Tyr Thr Val Ala His 595 600 605 Leu Leu Gln Gly Gly Asn Leu His Gly Gln Ala Glu Ser Pro Leu Gly 610 615 620 Ile Arg Pro Gln Gln Met Thr Lys Glu Val Trp Asp Tyr Val Phe Phe 625 630 635 640 Lys Glu Ala Pro Phe Pro Lys Thr Gln Ile Ala Lys Glu Lys Leu Asp 645 650 655 Gln Leu Lys Gln Glu Phe Glu Phe Trp Tyr Pro Val Asp Leu Arg Val 660 665 670 Ser Gly Lys Asp Leu Val Pro Asn His Leu Ser Tyr Tyr Leu Tyr Asn 675 680 685 His Val Ala Met Trp Pro Glu Gln Ser Asp Lys Trp Pro Thr Ala Val 690 695 700 Arg Ala Asn Gly His Leu Leu Leu Asn Ser Glu Lys Met Ser Lys Ser 705 710 715 720 Thr Gly Asn Phe Leu Thr Leu Thr Gln Ala Ile Asp Lys Phe Ser Ala 725 730 735 Asp Gly Met Arg Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly Asp Thr Val Glu Asp 740 745 750 Ala Asn Phe Val Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Ile Leu Arg Leu Tyr 755 760 765 Thr Trp Val Glu Trp Val Lys Glu Met Val Ala Asn Trp Asp Ser Leu 770 775 780 Arg Ser Gly Pro Ala Ser Thr Phe Asn Asp Arg Val Phe Ala Ser Glu 785 790 795 800 Leu Asn Ala Gly Ile Ile Lys Thr Asp Gln Asn Tyr Glu Lys Met Met 805 810 815 Phe Lys Glu Ala Leu Lys Thr Gly Phe Phe Glu Phe Gln Ala Ala Lys 820 825 830 Asp Lys Tyr Arg Glu Leu Ala Val Glu Gly Met His Arg Glu Leu Val 835 840 845 Phe Arg Phe Ile Glu Val Gln Thr Leu Leu Leu Ala Pro Phe Cys Pro 850 855 860 His Leu Cys Glu His Ile Trp Thr Leu Leu Gly Lys Pro Asp Ser Ile 865 870 875 880 Met Asn Ala Ser Trp Pro Val Ala Gly Pro Val Asn Glu Val Leu Ile 885 890 895 His Ser Ser Gln Tyr Leu Met Glu Val Thr His Asp Leu Arg Leu Arg 900 905 910 Leu Lys Asn Tyr Met Met Pro Ala Lys Gly Lys Lys Thr Asp Lys Gln 915 920 925 Pro Leu Gln Lys Pro Ser His Cys Thr Ile Tyr Val Ala Lys Asn Tyr 930 935 940 Pro Pro Trp Gln His Thr Thr Leu Ser Val Leu Arg Lys His Phe Glu 945 950 955 960 Ala Asn Asn Gly Lys Leu Pro Asp Asn Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu 965 970 975 Gly Ser Met Pro Glu Leu Lys Lys Tyr Met Lys Lys Val Met Pro Phe 980 985 990 Val Ala Met Ile Lys Glu Asn Leu Glu Lys Met Gly Pro Arg Ile Leu 995 1000 1005 Asp Leu Gln Leu Glu Phe Asp Glu Lys Ala Val Leu Glu Asn Ile Val 1010 1015 1020 Tyr Leu Thr Asn Ser Leu Glu Leu Glu His Ile Glu Val Lys Phe Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Glu Ala Glu Asp Lys Ile Arg Glu Asp Cys Cys Pro Gly Lys Pro 1045 1050 1055 Leu Asn Val Phe Arg Ile Glu Pro Gly Val Ser Val Ser Leu Val Asn 1060 1065 1070 Pro Gln Pro Ser Asn Gly His Ser Thr Lys Ile Glu Ile Arg Gln Gly 1075 1080 1085 Asp Asn Cys Asp Ser Ile Ile Arg Arg Leu Met Lys Met Asn Arg Gly 1090 1095 1100 Ile Lys Asp Leu Ser Lys Val Lys Leu Met Arg Phe Asp Asp Pro Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Gly Pro Arg Arg Val Pro Val Leu Gly Lys Glu Tyr Thr Glu Lys 1125 1130 1135 Thr Pro Ile Ser Glu His Ala Val Phe Asn Val Asp Leu Met Ser Lys 1140 1145 1150 Lys Ile His Leu Thr Glu Asn Gly Ile Arg Val Asp Ile Gly Asp Thr 1155 1160 1165 Ile Ile Tyr Leu Val His 1170

Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는 자가포식(autophagy) 조절제 스크리닝 방법:
    (a) LRS(Leucyl-tRNA synthetase) 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계;
    (c) 상기 LRS 단백질의 인산화가 상향-조절(up-regulation) 되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제(activator)로 판정하고, 상기 LRS 단백질의 인산화가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 세포를 글루코스(glucose)가 결핍된 환경에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도의 분석은 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  4. LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인산화 정도를 측정하는 제제는 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 자가포식-관련 질환은 암, 퇴행성 신경질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료에 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 LRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 LRS 단백질에 결합한 항체의 양을 분석하여 정상대조구에 비해 그 양이 감소한 경우 자가포식 관련 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 LRS 단백질의 391번째 및 720번째 세린(serine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기에서의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 방법.
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