KR101771851B1

KR101771851B1 - AMPK-Skp2-CARM1 경로에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR101771851B1
Application number: KR1020160057891A
Authority: KR
Inventors: 백성희; 신희재; 김현경
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-08-25

Abstract

본원은 핵내에서 작용하는 AMPK-FOXO3a-SKP2 신호전달체계를 표적으로 하는 자가포식 조절 방법, 또는 자가포식 조절제 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 상기 기전 축을 중심으로 다양한 수준에서 자가포식 조절문제로 인한 다양한 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

AMPK-Skp2-CARM1 경로에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도 {Method for modulating autophagy mediated by AMPK-Skp2-CARM1 pathway and its use}

본원은 자가포식 조절 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

자가포식(Autophagy)은 세포내 영양분이 부족한 환경에서 세포가 자신의 불필요한 단백질, 노화된 소기관 등을 지질 이중층으로 구성된 자가포식소체(membrane vacuole, autophagosome)가 둘러싼 후 라이소좀과 합쳐져 둘러싸인 내부 물질을 분해하도록 유도하는 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정(Levine and Klionsky, (2004) Dev Cell 6, 463-377)으로, 결함이 있는 거대 단백질 복합체 및 세포내 소기관을 제거하여, 세포 성장, 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다.

따라서 자가포식 조절에 이상이 있는 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생하는 것으로 알려져 있다(Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884).

또한 자가포식은 암세포에서 활성화 (Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther.,8(7), 2036-2045)되며, 자가포식 억제제가 항암 치료제로서 작용하는 것으로 알려져 있다 (Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752). 아울러 암 및 신경변성 질환에 추가하여 자가포식은 간 질환, 심장 질환, 근육 질환 및 췌장 질환과 연관된 것으로 알려져 있다 (Levine and Kroemer, (2008), Cell, 132, 27-42; Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)).

따라서, 세포의 자가포식의 조절을 통한 다양한 치료제 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1594168호에는 p62의 ZZ 영역에 의해 매개되는 자가포식 조절 방법 및 그 용도에 대하여 개시하고 있다.

미국 공개특허공보 제2010-0233730호는 치료를 위한 자가포식 조절에 관한 것으로, 세포에 시험물질을 처리한 후 대사 스트레스를 가해 자가포식체(autophagosome)의 세포내 변화 관찰을 통해, 자가포식 조절제를 선별하는 방법을 개시하고 있다.

하지만 이들은 세포질에서 작용하는 자가포식 단백질 기반의 기술로서, 핵 내에서의 전사과정이나 후성유전학적 작용 기전에 기반한 자가포식 조절기술에 대하여는 알려지지 않았으며, 보다 근본적인 조절을 위해 핵내에서 작용하는 기전에 기반한 자가포식 조절제의 개발이 필요하다.

본원은 핵내에서 작용하는 기전에 기반한 자가포식 조절 방법, 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 H3 (Histon 3) 단백질의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 상기 방법은 CARM1 단백질, 이의 H3에 대한 메틸전달효소 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 및 상기 CARM1의 메틸전달효소 활성의 기질로서 H3 단백질을 배양하는 단계로, 상기 H3 단백질은 서열번호 1의 서열을 기준으로 17번 잔기를 포함하는 폴리펩타이드이며, 상기 H3 단백질을 상기 배양물로부터 분리하는 단계: 상기 분리된 H3 단백질의 17번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3 단백질의 17번째 잔기의 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서 본원은 SKP2 및 CARM1 경로를 통한 자가포식 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 SKP2(S-phase kinase-associated protein 2) 및 CARM1을 제공하는 단계; 상기 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉하는 단계; 상기 단백질간의 상호작용을 검출하는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 SKP2 및 CARM1의 상호작용이 증가 또는 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 조절제로 선별하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 세포에서 AMPK에 의해 조절되는 FOXO3a (Forkhead box O3)-> SKP2-> CARM1 경로를 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 상기 AMPK, FOXO3a, SKP2, CARM1 및 H3를 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계; 상기 FOXO3a 단백질의 인산화, 상기 SKP2의 전사 (transcription), 상기 CARM1 단백질의 농도를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 증가하고, SKP2의 전사가 억제되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 증가하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하거나; 또는 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 감소하고, SKP2의 전사가 증가되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 감소하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

다른 구현예에서 상기 방법은 상기 세포는 H3를 추가로 발현하며, 상기 검출하는 단계 대신에, 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화로 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 선별하는 단계 대신에, 상기 측정결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하고, 또는 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절용 키트 또는 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 히스톤 H3의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절제를 포함하는 인비트로에서 세포의 자가포식 조절용 키트 또는 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 히스톤 H3 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 상기 조성물, 방법 또는 키트에 사용될 수 있는메틸화 조절제는 엘라그산(ellagic acid)을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법.

본원에 따른 AMPK-Skp2-CARM1 신호전달체계를 표적으로 하는 자가포식 조절 방법은 다양한 수준에서 자가포식 조절문제로 인한 다양한 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 CARM1에 의하여 증가된 H3R17 디메틸화가 정상적인 자가포식 작용에 핵심적임을 나타낸 것이다. (a, b) 당 결핍 상황에서 다양한 히스톤 표식과 CARM1에 대한 면역블랏 분석을 나타낸 것이다. (c) WT, Carm1 KO 또는 KI MEFs 에 대한 면역블랏 분석을 나타낸 것이다. LC3-II/LC3-I 비율을 나타낸다. (d) GFP-LC3 puncta 형성 관찰한 대표적인 confocal 이미지를 나타낸 것이다. 그래프는 LC3-양성 punctate cells을 정량화 한 것이다. 스케일 바, 10 μm. (e) 대표적인 TEM 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 2 mm. 박스 친 부분의 높은 배율 이미지는 오른쪽에 있다. 스케일 바, 0.5 mm. 자가포식소체(푸른색 화살표), 자가용해소체(붉은 화살표) 및 다층판체(multilamellar body) (노란 화살표). (f) GFP-LC3 puncta 형성 관찰한 대표적인 confocal 이미지. 엘라그산(100 mM). 스케일 바, 10 mm. 바, 평균 ± s.e.m.; n=5, 100여개 이상의 세포; ** p<0.01. 통계 분석 기법은 one-tailed t-test임 (d,f).
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 CARM1이 정상 상황에서 핵에서의 Skp2-SCF E3 리가아제에 의해 분해됨을 나타낸 것이다. (a) MEFs에 당 결핍 상황 유도 후 MG132 (5 mg/ml) 처리하지 않았을 때 (왼쪽) 또는 처리하였을 때 (오른쪽)(5 mg/ml)를 면역블랏 분석한 것이다. (b) CARM1 WT 및 유비퀴틴 되지 않는 변이 단백질 K471R을 이용한 In vivo 유비퀴틴화 실험을 나타낸 것이다. (c) CARM1의 상호 작용 복합체를 분석한 것이다. (d) Skp2와 PRMTs 사이의 상호작용을 분석한 것이다. (e) 당 결핍 세포를 이용하여 면역블랏 분석한 것이다. (f, g) CARM1의 In vivo 유비퀴틴화를 나타낸 것이다. (h) 대표적인 confocal 이미지이다. 스케일 바 20 μm. (i) Skp2-SCF E3 복합체에 의한 CARM1 분해 과정에 대한 모식도이다.
도 3은 당 결핍 상황에서의 Skp2 감소가 AMPK에 의존적인 것을 나타낸 것이다. (a) 당 결핍 상황에 노출된 MEFs를 이용해 표기된 항체로 분석한 것이다. (b) WT 과 Ampk DKO MEFs 의 핵 구획을 이용해서 면역블랏 분석한 것이다. (c, d) Skp2의 qRT-PCR을 나타낸 것이다. (e) Skp2 promoter (왼쪽)의 모식도를 나타낸 것이다. Skp2 WT 또는 FRE 돌연변이 프로모터의 루시퍼라아제 활성도를 측정한 것이다(오른쪽). (f) Skp2 프로모터에서의 ChIP 분석을 나타낸 것이다. (g) Foxo 1/3/4 TKO MEFs에서 Skp2 mRNA 수준을 측정한 것이다. (h) Skp2 프로모터에서의 ChIP 분석을 나타낸 것이다(왼쪽). AMPK-FOXO 축에 의한 Skp2 조절 기전 모식도이다(오른쪽). 바, 평균 ± s.e.m.; n=3; NS=Non-Significant, ** p<0.01, *** p<0.001. 통계 분석 기법은 one-tailed t-test임 (c-h). (i) Foxo1/3/4 TKO MEFs에서 면역블랏 분석을 나타낸 것이다. (j) GFP-LC3 puncta 형성 관찰한 대표적인 confocal 이미지이다. 스케일바, 20 mm, 바, 평균± s.e.m; n=5, 80여개 이상의 세포; ** p<0.01, *** p<0.001통계 분석 기법은one-tailed t-test임 (k) 전세포(whole cell) 추출물에서의 면역블랏 분석을 나타낸 것이다(왼쪽). 자가포식에서 AMPK-Skp2-CARM1 신호 전달 축에 대한 모식도이다(오른쪽).
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 CARM1이 TFEB을 통해 자가포식 및 라이소좀 유전자들의 전사과정에서 공 활성 인자로 역할한다는 것을 나타낸 것이다. (a) CARM1과 TFEB의 결합을 나타낸 것이다. (b) 대표적인 confocal 이미지이다. 스케일바, 10 mm. (c) 2X CLEAR (TFEB RE)-루시퍼라아제 리포터 실험을 나타낸 것이다. 바, 평균± s.e.m; n=3; ** p<0.01. 통계 분석 기법은 one-tailed t-test임. (d-f) TFEB knockdown후 TFEB-의존적이면서, CARM1-의존적인 E) 또는 CARM1-비 의존적인 (f) 프로모터에서 ChIP 분석을 나타낸 것이다. 바, 평균 ± s.e.m; n=3. (g), Flag-TFEB을 형질 주입한 WT 과 Carm1 KO MEFs 에서 면역블랏 분석을 나타낸 것이다. (h) 정상 식이 또는 금식 시킨 마우스에 대조군과 엘라그산을 처리한 후 간 조직을 확보해 수행한 면역블랏 분석을 나타낸 것이다(n=3 그룹당). (i) WT 마우스의 간 조직에서 자가포식 또는 라이소좀 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 바, 평균 ± s.e.m; n=3 그룹당. *p<0.05, ** p<0.01

본원은 알지닌 메틸화효소인 CARM1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1)에 의한 히스톤 H3의 알지닌 메틸화 조절이 자가포식 활성에 핵심적이며, 이 과정에서 AMPK-FOXO3a-SKP2-CARM1으로 이어지는 신호전달 축을 새롭게 규명한 것에 근거한 것이다.

구체적으로 정상상황에서는 CARM1은 SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)라고 하는 유비퀴틴화 효소에 의해 핵 내에서 지속적으로 분해된다. 하지만 세포가 영양분 고갈 상황에 놓이게 되면 핵 내에 AMPK (AMP-activated protein kinase)라고 하는 인산화 효소가 FOXO3a (Forkhead box O3)라는 단백질을 인산화 시키고, 이어 인산화된 FOXO3a는 skp2의 전사를 저해하여 그 결과 CARM1 단백질이 안정화됨으로써 히스톤 H3 17번 알지닌의 메틸화가 증가됨을 규명하였다.

또한 안정화된 CARM1 단백질이 TFEB (Transcription Factor EB)라는 전사인자의 활성 인자로 작용하여 자가포식 관련 유전자의 발현 조절은 물론, 라이소좀 관련 유전자들의 발현 또한 조절함을 규명하였다.

따라서 본원은 상기 본원에서 규명된 AMPK-FOXO3a-SKP2-CARM1으로 이어지는 핵내 자가포식 신호전달 축의 다양한 측면 및 이에 관여하는 단백질의 작용에 근거하여 다양한 수준에서 자가포식 조절제 스크리닝 방법, 자가포식 조절 방법, 자가포식 조절 키트를 제공한다.

한 양태에서 본원은 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 H3 (Histon 3) 단백질의 17번 잔기의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 CARM1 단백질, 이의 H3에 대한 메틸전달효소 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 및 상기 CARM1의 메틸전달효소 활성의 기질로서 H3 단백질을 배양하는 단계로, 상기 H3 단백질은 서열번호 1의 서열을 기준으로 17번 잔기를 포함하는 폴리펩타이드이며, 상기 히스톤 H3 단백질을 상기 배양물로부터 분리하는 단계: 상기 분리된 H3 단백질의 17번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3 단백질의 17번째 잔기의 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에서 자가포식 (autophagy 또는 autophagocytosis)이란 라이소좀을 이용하여 세포내 불필요하거나 변성된 단백질을 포함하는 다양한 세포구성성분을 제거하는 이화작용을 일컫는 것이다. 자가포식 조절에 이상이 있는 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생하는 것으로 알려져 있다(Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884). 또한 자가포식은 암세포에서 활성화 (Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther.,8(7), 2036-2045)되며, 자가포식 억제제가 항암 치료제로서 작용하는 것으로 알려져 있다 (Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752). 아울러 암 및 신경변성 질환에 추가하여 자가포식은 간 질환, 심장 질환, 근육 질환 및 췌장 질환과 연관된 것으로 알려져 있다 (Levine and Kroemer, (2008), Cell, 132, 27-42; Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)). 따라서 본원에 개시된 기술을 이용한 자가포식 조절제, 조절방법은 자가포식 조절 이상으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에서 조절 (modulation)이란, 특정 생물학적 기능의 활성화, 자극 또는 상향 조절, 또는 저하 또는 하향 조절, 또는 양쪽 모두를 포함하며, 인 비트로 상태에서의 조절, 인비보 상태에서의 조절, 엑스비보 상태에서의 조절을 모두 포함하는 것이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 CARM1 (coactivator-associated arginine methyltransferase 1) 또는 PRMT4 (protein arginine N-methyltransferase 4)는 알파 헬릭스 및 베타 시트로 구성된 S-아데노실-L-메치오닌으로부터 알지닌 잔기의 곁가지 질소의 메틸화를 촉매하는 효소이며, 포유동물에서 CARM1의 유전자 및 단백질 서열은 공지된 것으로 예를 들면 인간 유전자 및 단백질 서열은 Gene ID: 10498, Protein ID: NP_954592.1로 공지되어 있다. 본원에 따른 방법에서는 상기와 같은 메틸화효소 기능을 갖는 한 다양한 유래, 그리고 각 유래의 단백질 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 전장 또는 단편이 사용될 수 있다.

실질적으로 동일한 이란, 단백질 및 핵산 서열 수준에 모두 적용되며, 참조 또는 기준이 되는 서열과 비교하여, 염기 또는 아미노산 잔기에 하나 이상의 치환, 결손, 또는 부가가 있을 수 있으나, 전체적으로 볼 때 기능에 차이가 없거나 기능을 나쁘게하지 않는 수준의 기능을 갖는 것을 의미한다. 상동성은 대상이 되는 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상, 특히 95%이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc . Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl . BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth . Mol . Biol . (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본원에 따른 상기 방법에서 CARM1의 기질(substrate)은 히스톤 H3이다. CARM1은 앞서 언급한 바와 같이 S-아데노실메티오닌을 이용하여 알지닌 잔기를 메틸화하는 반응을 촉매한다. 본원에서는 특히 CARM1에 의한 히스톤 H3의 17번째 알지닌의 메틸화가 자가포식 조절과 관련이 있음을 규명하였다. 히스톤은 염색질 (chromatin)을 구성하는 중심단백질로, DNA 사슬을 감는 실패 역할을 해서 DNA를 응축하며, 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 히스톤 단백질에는 H1, H2A, H2B, H3 및 H4 등이 존재하며, H2A, H2B, H3 및 H4가 각각 두 개씩 모여 8량체인 코어 히스톤을 형성하고, H1은 연결체이다. 코어 히스톤은 매우 잘 보존된 서열을 갖으며, 다양한 변이체 또한 발견되며, 이러한 서열은 공개된 히스톤 DB2.0을 참조할 수 있다. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/HistoneDB2.0/index.fcgi/browse/). 본원에서 규명된 기전에 관여하는 히스톤 H3의 서열 (Gene ID: 8350~8357)은 서열번호 1로 표시될 수 있으며, 이를 기준으로 17번째 알지닌의 메틸화를 판단한다.

앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 히스톤 H3는 본원에서 규명된 CARM1에 의해 메틸화되는 17번째 알지닌 잔기를 포함하는 한 다양한 유래의 합성 또는 천연의 전장 또는 그 단편이 사용될 수 있으며, 이와 실질적으로 동일한 서열도 포함된다.

상술한 바와 같이 CARM1 단백질, 이의 H3에 대한 메틸전달효소 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 및 상기 CARM1의 메틸전달효소 활성의 기질로서 H3 단백질을 혼합하여 배양하는 경우, CARM1 단백질에 의한 H3 메틸화에 영향을 끼지는 물질을 선별할 수 있다.

본원에 따른 방법은 세포외에서 또는 상기 단백질을 발현하는 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 세포를 이용하여 수행되는 경우 단백질은 이를 발현하는 세포로 제공될 수 있다.

일 구현예에서는 세포외에서 수행되며, 이를 위해 표지된 S-아데노실메티오닌을 반응에 포함하여 히스톤 H3를 표지하고, 상기 혼합물에서 H3 단백질을 분리하여상기 단백질에서 H3 단백질 17번째 잔기의 메틸화정도를 측정할 수 있다. 단백질 분리는 당업계에 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있으며 예를 들면 크로마토그래피 또는 특정 크기의 분자량을 갖는 물질 만을 통과시키는 막을 이용하여 수행될 수 있으며, 단백질 17번째 잔기의 메틸화정도 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 AMPK-FOXO3a-SKP2 신호전달시스템에 작용하여 CARM1의 양을 조절하고 히스톤 H3의 메틸화를 조절할 것으로 기대되는 물질로, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서는 저분자화합물이 시험물질로 사용될 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다. 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 동물 세포주에 트랜스팩션한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.

또는 스크리닝 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.

본원에 따른 방법에서 히스톤 H3의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3 단백질의 17번째 잔기의 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하고, 이를 다양한 질환의 치료제로 개발 할 수 있다.

실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 자가포식을 조절하는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상, 또는 이 이상을 증가 또는 감소된 것을 후보물질로 선별할 수 있다.

자가포식 조절제는 본원에서 규명된 경로의 다양한 측면을 이용하여 개발될 수 있다. 본원에서는 정상 상황에서는 Skp2를 포함한 E3 효소 복합체에 의해 CARM1이 유비퀴틴화 되어 분해되어 세포내 농도가 낮아 자가포식이 일어나지 않지만, 자가포식이 필요한 상황 예를 들면 당 고갈 상황에서는 Skp2의 전사가 억제되고, 그 결과 CARM1이 안정화되어 그 농도가 높아지는 것을 발견하였다. 따라서, 치료제 개발을 위해 SKP2 단백질과 CARM1의 상호작용을 억제하는 물질은 CARM1의 분해를 억제하여 그 농도를 증가시키고 그 결과 히스톤 H3의 메틸화가 촉진되어 자가포식이 활성화 될 것이고, 상호작용을 촉진하는 물질은 그 반대의 효과를 가져올 것이다.

이런 측면에서 다른 양태에서 본원은 FOXO3a (Forkhead box O3)-SKP2-CARM1 경로에서 SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)에 의한 CARM1을 조절하는 기전을 이용한 SKP2 및 CARM1 경로를 통한 자가포식 조절제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 SKP2(S-phase kinase-associated protein 2) 및 CARM1을 제공하는 단계; 상기 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉하는 단계; 상기 단백질간의 상호작용을 검출하는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 SKP2 및 CARM1의 상호작용이 증가 또는 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 조절제로 선별하는 단계를 포함한다.

SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)는 E3 유비퀴틴 단백질 라이게이즈로 그 서열은 공지된 것으로 인간에서 cDNA 및 단백질 서열은 각각 NM_001243120 및 NP_001230049로 공지되어 있으며 구체적 실험조건에 맞추어 다양한 유래의 전장 또는 그 단편 또는 상기 서열과 실질적으로 동일한 서열의 단백질이 사용될 수 있으며 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 단백질의 제조는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 단백질의 상호작용은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 시험물질의 부재 또는 존재하에서 상호작용을 확인할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.

그 외 상기 방법에 사용되는 시험물질의 종류 등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이 자가포식 조절제는 본원에서 규명된 경로의 다양한 측면을 이용하여 개발될 수 있다. 본원에서는 정상 상황에서는 Skp2를 포함한 E3 효소 복합체에 의해 CARM1이 유비퀴틴화 되어 분해되어 세포내 농도가 낮아 자가포식이 일어나지 않지만, 자가포식이 필요한 상황 예를 들면 당 고갈 상황에서는 Skp2의 전사가 억제되고, 그 결과 CARM1이 안정화되어 그 농도가 높아지는 것을 발견하였다. 상기 Skp2의 전사는 인산화된 FOXO3a에 의해 조절되고, FOXO3a의 인산화는 AMPK에 의해 조절되는 것을 발견하였다.

따라서 또 다른 양태에서 본원은 세포에서 AMPK에 의해 조절되는 FOXO3a (Forkhead box O3)- SKP2- CARM1 경로를 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 상기 AMPK, FOXO3a, SKP2, CARM1 및 H3를 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계; 상기 FOXO3a 단백질의 인산화, 상기 SKP2의 전사 (transcription), 상기 CARM1 단백질의 농도를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 증가하고, SKP2의 전사가 억제되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 증가하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하거나; 또는 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 감소하고, SKP2의 전사가 증가되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 감소하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 상기 방법에 사용되는 AMPK는 AMP-activated protein kinase의 약자로써 당 결핍에 반응하여 활성화되며 에너지 항상성 유지에 중요한 인산화 효소이며 그 유전자 및 단백질 서열은 각각 Gene ID: 5562, Protein ID: NP_006242.5로 공지되어 있다.

FOXO3a는 Forkhead box protein3a의 약자로써 세포 성장, 증식, 분화. 수명과 항상성 유지에 관여하는 전사조절인자다. AMPK 인산화 효소에 의해 인산화되면 전사조절 활성이 증가하며, 그 유전자 및 단백질 서열은 각각 Gene ID: 2309, Protein ID:NP_001446.1로 공지되어 있다.

본원에 따른 상기 방법에서 상기 세포는 H3를 추가로 발현하며, 이 경우, 상기 검출하는 단계 대신에, 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화로 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 선별하는 단계 대신에, 상기 측정결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하고, 또는 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 따른 상기 방법에 사용되는 단백질의 제조방법, 시험물질은 앞서 언급한 바를 참조 할 수 있다.

본원에 따른 상기 방법에 사용되는 FOXO3a의 인산화, SKP2의 전사, 상기 CARM1 단백질의 농도는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있으며, 예를 들면 항체를 이용한 웨스턴블랏, RT-PCR 등을 이용하여 수행될 수 있으며, 또한 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 다양한 스크리닝 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 다양한 스크리닝 방법에 의해 스크리닝될 수 있는 자기포식 조절제는, 자가포식에 이상이 있는 경우 변성된 단백질의 축적으로 인해 다양한 질환 또는 자가포식의 과다 활성과 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 신경퇴행성질환을 포함하는 신경변성 질환, 간질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 과오종 증후군, 유전성 근육 질환, 근 질환 또는 암(Hara t et al Nature 2006, Mizushima n et al Genes & Dev. 2007, Takamura a et al Genes & Dev. 2011, Ratuo p et al J Hepatology 2010 등 참조) 등의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 물질이다. 예를 들면 신경변성 질환은, 예를 들면 부신성 백색질형성장애(Adrenal Leukodystrophy), 알콜중독, 알렉산더병(Alexander's disease), 알퍼병(Alper's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증, 모세관확장실조(ataxiatelangiectasia), 배튼병(Batten disease), 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 캐너번병(Canavan disease), 뇌성마비, 코케인 증후군(cockayne syndrome), 피질기저퇴화(corticobasal degeneration), 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jakob disease), 치명성 가계 불면증 (familial fatal insomnia), 전두엽 측두엽 변성증(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), HIV-관련 치매, 케네디병(Kennedy's disease), 크라베병(Krabbe's [0016] disease), 레비소체 치매(Lewy body dementia), 신경보렐리아증(neuroborreliosis), 마카도 조셉 병(Machado-Joseph disease), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 다발성경화증(multiple sclerosis), 발작수면 (narcolepsy), 니이만-픽병(Niemann Pick disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 픽병(Pick's disease), 원발가쪽경화증(primary lateral sclerosis), 프리온 질환(prion disease), 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy), 레프숨병(Refsum's disease), 잔트호프병(Sandhoff disease), 실더병(Schilder's disease), 유독성 빈혈 속발성의 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼 병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수근위축증(spinal muscular atrophy), 스틸-리차드슨-올스제위스키 병(Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독(Tabes dorsalis), 독성 뇌병증(toxic encephalopathy)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 단백질변성과 관련된 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비 소체 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 헌팅톤병, 척수소뇌성 실조증 또는 척수구근 근위축증(spinobulbar musclular atrophy)을 포함한다.

또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 자가면역 질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증로 구성된 군으로부터 선택되는 자가면역질환이다.

또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 심혈관질환은 광동맥성심장병, 심근증, 고혈압성심장질환, 심부전, 폐성심, 심율동장애, 심장 내막염, 염증성 심비대증, 심근염, 심장판막증, 뇌혈관장애, 하지동맥질환, 선천성 심질환 및 심장 류머티즘으로 구성된 군으로부터 선택되는 심혈관질환이다.

또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 대사질환은 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증 및 고인슐린혈증으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환이다.

또다른 구현예에서, 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.

본원에서는 또한 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1)이 전사인자인 TFEB (Transcription Factor EB)의 공동활성인자 (coactivator)로 작용하여 TFEB에 의해 조절되는 자가포식은 물론 다양한 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 발견하였다. 상기 “TFEB”는 라이소좀 생체내 합성(lysosomal biogenesis)에 관여하는 마스터유전자로서, TFEB를 표적으로 하여 신경퇴행성 질환에 대한 치료제 개발(Dehay, B. et al. "Pathogenic lysosomal depletion in Parkinson’disease." J. Neurosci. 30, 1253512544 (2010); Tsunemi, T. et al. "PGC1α rescues Huntington’disease proteotoxicity by preventing oxidative stress and promoting TFEB function." Sci. Transl. Med. 4, 142ra97 (2012) ; Medina, D. L. et al. "Transcriptional activation of lysosomal exocytosis promotes cellular clearance." Dev. Cell 21, 421430 (2011); Sardiello, M. et al. "A gene network regulating lysosomal biogenesis and function." Science 325, 473477 (2009)), 대사질환 치료제 개발(Spampanato, C. et al. "Transcription factor EB (TFEB) is a new therapeutic target for Pompe disease." EMBO Mol Med. 11 Apr 2013 (doi:10.1002/emmm.201202176) ; Pastore, N. et al. "Gene transfer of master autophagy regulator TFEB results in clearance of toxic protein and correction of hepatic disease in α1anti-trypsin deficiency." EMBO Mol. Med. 5, 397412 (2013))이 이루어지고 있다. 하지만 본원에서는 TFEB의 과발현만으로는 자가포식이 조절되지 않으며, 공활성인자인 CARM1이 필요한 것을 규명하였다.

따라서 이런 측면에서 본원은 또한 CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 TFEB의 활성화제로서 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법 또는 상기 단백질을 포함하는 자가포식 조절 키트에 관한 것이다. TFEB (Transcription Factor EB) 서열은 공지된 것으로 Gene ID: 7942, Protein ID: NP_001161299.2로 공지되어 있다.

앞서 언급한 바와 같이 정상상황에서는 CARM1은 SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)라고 하는 유비퀴틴화 효소에 의해 핵 내에서 지속적으로 분해된다. 하지만 세포가 영양분 고갈 상황에 놓이게 되면 핵 내에 AMPK (AMP-activated protein kinase)라고 하는 인산화 효소가 FOXO3a (Forkhead box O3)라는 단백질을 인산화 시키고, 이어 인산화된 FOXO3a는 skp2의 전사를 저해하여 그 결과 CARM1 단백질이 안정화됨으로써 히스톤 H3 17번 알지닌의 메틸화가 증가됨을 규명하였다.

히스톤 H3 17번 알지닌의 메틸화 조절제를 포함하는 자가포식 조절제 또는 키트, 또는 히스톤 H3 17번 알지닌의 메틸화 조절제를 인비트로에서 세포에 처리하는 자가포식 조절방법에 관한 것이다.

본원은 CARM1 단백질에 의한 히스톤 H3 17번째 알지닌 잔기의 메틸화가 자가포식 조절에 중요하다는 것을 규명한 것으로 따라서 히스톤 H3 17번째 알지닌 잔기의 메틸화할 수 있는 다양한 물질이 본원의 범위에 포함된다. 일 구현예에서는 엘라그산이 사용되나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원의 상기 “엘라그산”은 폴리페놀 4개의 고리로 구성되어 있는 화합물로, 식물체 내에서는 전구물질인 엘라기탄닌(ellagitannin) 형태로 존재하며 본원에 따른 활성을 갖는 한 이의 유도체도 포함하는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

재료 및 방법

항체 및 시약. 본원 실험에 사용되었으며 상업적으로 판매되는 항체는 하기과 같다 : Anti-AMPKa1 (ab110036), anti-AMPKa2 (ab3760), anti-ATG14 (ab173943), anti-FOXO3a (ab12162), anti-histone H3 (ab1791), anti-H3R17me2 (ab8284), anti-H3K4me3 (ab8580), anti-H3K9me3 (ab8898), anti-H3K36me3 (ab9050), anti-PI3K Class 3 (ab124905), 및 anti-TFEB (ab2636)는 Abcam사에서 구매하였다. Anti-AMPK (#2532), anti-ATG12 (#4180), anti-CARM1 (#3379 for IB, #12495 for IP 및 ChIP), anti-LC3 (#2775), anti-phospho-AMPKa T172 (#2535), anti-phospho-FOXO3a S413 (#8174), anti-SQSTM1/p62 (#5114), 및 anti-TFE3 (#14779)는 Cell Signaling technology사에서 구매하였다. Anti-Skp2 (sc-7164), anti-CUL1 (sc-17775), anti-Tubulin (sc-8035), 및 anti-Lamin A/C (sc-6215)는 Santa Cruz biotechnology사에서 구매하였다. Anti-Flag (F3165), anti-ULK1 (A7481) 및 anti-b-actin (A1978)은 Sigma사에서, anti-HA antibody (#MMS-101R)는 Covance사에서 구매하였으며 anti-tubulin antibody (LF-PA0146A) 는 Abfrontier에서 구매하였다. 실험에 사용된 화합물들은 아래와 같다. 라파마이신 (R-5000)은 LC laboratories에서 구매하였고, 시클로헥시미드(C4859), AICAR (A9978)와 펜포르민(P7045)은 Sigma 사에서, 바필로마이신 A1 (#11038)과 엘라그산(#10569)는 Cayman사에서, Compound C는 Calbiochem (#171260)사, 그리고 MG132 (M-1157) A.G. Scientific 사에서 구매하였다.

세포 배양 및 shRNA 녹다운 세포의 배양(generation). HEK293T, HeLa, HepG2 cells, WT, Carm1 KO, Ampk DKO, Foxo1.3.4 f/f MEFs 는 10% 소혈청과 항생제가 들어간 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)를 이용하여 5% CO₂, 37℃인큐베이터에서 배양하였다. 모든 세포주는 마이코플라즈마 감염 여부를 확인하였다. 당 결핍 상황을 만들기 위해 세포주를 PBS로 씻어주고 10 % dialyzed FBS가 들어간 당 결핍 DMEM을 이용하였다. 트랜스팩션은 제공된 프로토콜에 따라 Turbofect (Fermentas)와 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 이용하였다. 녹다운 세포주를 만들기 위해 lentiviral shRNA를 바이러스 패키징 플라스미드와 (psPAX2 and pMD2.G) 함께 먼저 HEK293T에 주입하였다. 3일 후에 바이러스가 포함된 상층액을 따서 0.45-mm 필터에 걸러 목표로 하는 세포주에 감염시켰다. 감염된 세포주는 5 mg/ml puromycin 으로 선별하였다. shRNAs 시퀀스는 아래와 같음 : mCARM1-1; 5’-TCAGGGACATGTCTGC TTATT-3’, mCARM1-2; 5’-GCCTGAGCAAGTGGACATTAT-3’, mTFE3-1; 5’-GTGGATTA CATCCGCAAATTA-3’, mTFE3-2; 5’-TGTGGATTACATCCGCAAATT-3’, mTFEB-1; 5’-GC AGGCTGTCATGCATTATAT-3’, mTFEB-2; 5’-CCAAGAAGGATCTGGACTTAA-3’, mSkp2; 5’-GCAAGACTTCTGAACTGCTAT-3’, hCUL1-1; 5’-GATTTGATGGATGAGAGTG TA-3’, hCUL1-2; 5’- CCCGCAGCAAATAGTTCATGT-3’, hSkp2-1; 5’-TTCCGCTGCCCAC GATCATTT-3’, hSkp2-2; 5’-AGTCGGTGCTATGATATAATA-3’.

동물 실험. 모든 동물 실험은 서울대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 규정을 준수하였다. 8주에서 10주 사이의 정상 C57BL/6J 마우스에 대조군(PEG400)과 엘라그산(10 mg/kg/day)를 복강에 연속 4일간 주사하였다. 24시간 동안 정상 식이와 금식 상황에 노출시킨 마우스에서 간 조직을 확보하였고 통계적 분석을 위해 각 샘플은 최소 3마리 이상 사용하였다.

전세포 용해물 (Whole-cell lysate ) 제조 및 초원심세포분획법 (subcellular fractionation). 모든 세포는 차가운 PBS로 씻어준 후 RIPA buffer (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], and 2 mM EDTA [pH 8.0] )에 단백질 분해효소 저해제를 넣어 용해하였다. 또한 Branson Sonifier 450을 이용하여 출력 3, duty cycle 30에서 5 pulses만큼 음파처리 하였다. 세포질과 핵 구획을 나누기 위해 DTT, PMSF, 단백질 분해효소 저해제를 첨가한 harvest buffer (10 mM HEPES [pH 7.9], 50 mM NaCl, 0.5 M sucrose, 0.1 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100)에서 5분간 두었다가 4℃, 1,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액 (세포질 성분)은 다른 튜브에 분리시키고 핵 침전은 다시 500ml의 buffer A (10 mM HEPES [pH 7.9], 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, and 0.1 mM EGTA)로 씻어준 후 4℃, 1,000rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 이후 상층액은 버리고 남은 침전(핵 구획 성분)은 RIPA buffer로 풀어서 음파처리 하였다. 모든 세포 용해물들은 Bradford 기법으로 정량하여 SDS-PAGE로 분석하였다.

전자현미경 관찰. 세포들은 상온에서 1시간 동안 0.1 M sodium cacodylate containing 4 % glutaraldehyde, 1 % paraformaldehyde 용액으로 고정시켰다. 0.1 M sodium cacodylate로 3번 씻어준 후 50%에탄올에서 시작하여 100%에탄올까지 각 단계마다 20분씩 에탄올의 농도 변화도에 따라 탈수과정을 거쳤다. 그 후에 에탄올에 녹인 농축된 propylene oxide에 담궈둔 후 Eponate 812 resin의 농도를 높이면서 세포에 스며들게 하였다. 샘플은 65 ℃ 오븐에 밤새 두었다가 Ultra microtome 65를 이용해 절단하였다. 샘플 단면은 한국 기초과학 연구원에 구비된 energy filtering TEM unit (LEO-192AB OMEGA, Carl Zeiss)을 통해 관찰하였다.

면역형광 분석. 면역세포화학법은 기존에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 커버슬립 위에 7 x 10⁴개의 세포를 배양한 후 PBS로 씻고 2 % 파라포름알데히드를 이용해 상온에서 10분간 고정시켰다. 고정된 세포는 0.1 % Triton X-100 in PBS (PBS-T)에 10분간 담궈 투과도를 높였다. 그 후 PBST에 녹인 3 % 소혈청을 이용해 30분간 블락킹하였다. 염색을 위해 상온에서 항체를 2시간 동안 먹인 이후 형광물질이 라벨링된 이차 항체를 1시간동안 순차적으로 결합시켰다. 세포를 마운팅 한 후 confocal microscope (Zeiss, LSM700)를 이용해 이미지를 얻었다. 자가포식 현상 관찰을 위해 MEF 세포들은 GFP-LC3를 주입시켜 사용하였으며 커버슬립으로 계대배양해서 사용하였다. 정상 배지와 당 결핍 배지를 18시간 처리한 후 사용하거나 라파마이신 또는 엘라그산를 18시간 처리하여 실험하였다. BiFC 실험을 위해서는 pHA-CARM1-VC155 와 pFlag-TFEB-VN173 DNA를 사용하였다.

유비퀴틴화 분석법. 유비퀴틴화 실험은 기존에 보고된 논문에 따라 수행하였다. HisMax-tagged 유비퀴틴을 비롯한 다양한 플라스미드의 조합을 세포에 주입한 후 48시간동안 배양하였다가 5 mg/ml 농도의 MG132를 4시간 동안 처리하였다. 후에 buffer A (6 M guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 0.01M Tris-Cl[pH8.0], 5mM 이미다졸, 및 10mM β-mercaptoethanol)로 용해하고 Ni² ⁺-NTA beads(QIAGEN)로 상온에서 4시간 이상 결합시켰다. Bead는 buffer A, buffer B (8 M urea, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01M Tris-Cl[pH8.0], 및 10mM β-mercaptoethanol), buffer C (8 M urea, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01M Tris-Cl[pH6.3], 및 10mM β-mercaptoethanol) 순서대로 씻어주고 침전되어 나온 단백질은 buffer D (200 mM imidazole, 0.15 M Tris-Cl [pH 6.7], 30 % glycerol, 0.72 M b-mercaptoethanol, 및 5 % SDS)로 녹여 용해하고 면역블랏팅 방법으로 분석하였다.

박테리아 발현 및 GST 풀-다운 분석법. GST가 부착된 DNA를 Rosetta Escherichia coli에 형질전환 시키고 글루타치온 비드(GE Healthcare)를 이용해 정제하였다. TNT Quick Coupled Transcription/Translation system (Promega)를 통해 35S-메치오닌이 라벨링된 TFEB 결실 및 CARM1 결실 단백질을 생산하였다. 정제된 단백질과 in vitro에서 번역된 단백질을 DTT 와 단백질 분해효소 저해제가 첨가된 결합 버퍼(125 mM NaCl, 20 mM Tris [pH 7.5], 10 % glycerol, 0.1 % NP-40, 0.5)에 넣어 GST 풀-다운 실험을 수행하였다. 이 후 희석 버퍼에서 4번 씻어주고 SDS 샘플 버퍼를 넣어 끓인 다음 면역블랏팅 기법으로 분석하였다.

인비트로 키나아제 분석법. GST-Skp2와 베클린(1-148 아미노산)을 글루타치온 비드로 정제하고 용출 버퍼(50 mM Tris-Hcl [pH 8.0], 100 mM NaCl, 10 mM L-glutathione reduced (SIGMA) 로 추출하였다. HA-AMPKa1 constitute active (CA)와 Flag-AMPKβ , HA-AMPK γ를 함께 HEK293T 세포에 주입시킨 후 Flag-M2 비드(SIGMA)를 이용하여 면역 침전 해내고 용출 버퍼(0.1 mg/ml in TBS)에 녹인 3X-Flag 펩타이드를 이용해 추출하였다. 각각 기질들은 1 μg 사용했으며 AMPK복합체와 함께 키나아제 반응 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 0.4mM EDTA, 및 0.05mM DTT)에서 반응시켰다. 반응 시, 150 μM AMP와 2 μCi에 해당하는 방사성표지를 한 [γ-32p]ATP를 함께 넣어주고 30°C에서 15분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 SDS sampling buffer를 넣어 끓여주고 인산화는 SDS-PAGE를 달려 자기 방사법으로 확인하였다.

리포터 플라스미드의 구축 및 루시퍼라아제 분석법. Skp2 프로모터(전사 시작지점 상위 1kb로부터 하위 200bp까지)와 2X CLEAR (GTCACGTGACCCCAGGGTCACGTGAC) 시퀀스는 pGL2-루시퍼라아제 리포터 벡터(Promega)에 클로닝하였다. Skp2 프로모터의 FOXO 반응 요소(FRE) 돌연변이의 경우 부뒤 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 제작되었다. MEF에 일시적으로 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 주입한지 36시간 후 루시퍼라아제 활성도를 측정하였으며 β-갈락토시다아제 발현양으로 보정하였다.

정량적 RT- PCR . RNA는 Trizol (Invitrogen)을 이용하여 추출하고 2.5 mg의 RNA를 M-MLV cDNA Synthesis kit (Enzynomics)으로 역전사시켰다. mRNA의 양은 SYBR TOPreal qPCR 2x PreMix (Enzynomic)를 사용하여 ABI prism 7500 system 과 BioRad CFX384로 분석하였다. mRNA의 양적 분석은 ddCt method를 사용하였고 HPRT, GAPDH 와 β-actin으로 보정하였다. 마우스 간 조직에서의 mRNA 측정은 36B4 유전자로 보정하였다. 모든 반응은 세번 반복하였다. 실험에 사용된 마우스 프라이머 시퀀스는 하기와 같다: β-actin; forward (fwd) 5’-TAGCCATCCAGGCTGTGC TG-3’, reverse (rev) 5’-CAGGATCTTCATGAGGTAGTC-3’; GAPDH; fwd 5’-CATGGCCTT CCGTGTTCCTA-3’, rev 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG A-3’; HPRT; fwd 5’-GCTGGT GAAAAGGACCTCTCG-3’, rev 5’-CCACAGGACTAGAACACCTGC-3’; 36B4; fwd 5’-CA ACCCAGCTCTGGAGAAAC-3’, rev 5’-CCAACAGCATATCCCGAATC-3’; ULK1; fwd 5’-GCTCCGGTGACTTACAAAGCTG-3’, rev 5’-GCTGACTCCAAGCCAAAGCA-3’; Map1lc3b; fwd 5’-CACTGCTCTGTCTTGTGTAGGTTG-3’, rev 5’-TCGTTGTGCCTTTATT AGTGCATC-3’; ATG12; fwd 5’-TCCGTGCCATCACATACACA-3’, rev 5’-TAAGACTGCT GTGGGGCTGA-3’; ATG13; fwd 5’-CCAGGCTCGACTTGGAGAAAA-3, rev 5’-AGATTTC CACACACATAGATCGC-3’; ATG14; fwd 5’-AGCGGTGATTTCGTCTATTTCG-3’, rev 5’-GCTGTTCAATCCTCATCTTGCAT-3’; SIRT1; fwd 5’-GATACCTTGGAGCAGGTTGC-3’, rev 5’-CTCCACGAACAGCTTCACAA-3’ ; Sqstm1; fwd 5’- ATGTGGAACATGGAGGGA AGA-3’, rev 5’-GGAGTTCACCTGTAGATGGGT-3’; Vps11; fwd 5’-AAAAGAGAGACGG TGGCAATC-3’, rev 5’-AGCCCAGTAACGGGATAGTTG-3’; Atp6v1c1; fwd 5’-ACTGAGT TCTGGCTCATATCTGC-3’, rev 5’-TGGAAGAGACGGCAA GATTATTG-3’; Hexb; fwd 5’-CTGGTGTCGCTAGTGTCGC-3’, rev 5’-CAGGGCCATGATGTCTCTTGT-3’; Neu1; fwd 5’-GGACCGCTGAGCTATTGGG-3’, rev 5’-CGGGATGCGGAAAGTGTCTA-3’; Mcoln1; fwd 5’-CTGACCCCCAATCCTGGGTAT-3’, rev 5’-GGCCCGGAACTTGTCACAT-3’; Ctns; fwd 5’-ATGAGGAGGAATTGGCTGCTT-3’, rev 5’-ACGTTGGTTGAACTGCCATTTT-3’; Hspa5; fwd 5’-ACTTGGGGACCACCTATTCCT-3’, rev 5’-ATCGCCAATCAGACGCTCC-3’; Skp2; fwd 5’-CCTCCAAGGAAACGAGTCAAG-3’, rev 5’-CAGGAGACACCTGGAAA GTTC-3’.

ChIP , two step- ChIP 분석법 및 qRT - PCR 분석. ChIP 및 two step-ChIP은 기존에 보고된 방법에 따랐다. 세포를 1% 포름알데히드로 상온에서 10분간 고정시킨 후 글라이신으로 소거하고 50mM Tris-HCl (pH8.1), 10mM EDTA, 1% SDS buffer로 용해시켜 음파 분해하였다. 250 bp정도의 DNA 파편들을 포함한 크로마틴 용출액은 희석 버퍼(1% Triton X-100, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.1)로 10배 희석하였다. 4℃에서 밤새도록 면역침전을 유도한 후 45ul의 protein A/G sepharose를 2시간 동안 반응시켜 면역복합체를 캡쳐하였다. 비드는 저염 세척 버퍼(low-salt wash buffer ; 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl (pH 8.1), 150mM NaCl), 고염 세척 버퍼(high-salt wash buffer ; 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl (pH 8.1), 500mM NaCl), buffer III buffer (0.25M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 10mM Tris-HCl (pH 8.1), 1mM EDTA), TE buffer (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5M EDTA) 순으로 씻어주고 용출 버퍼(1% SDS, 0.1M NaHCO3)로 추출하였다. 상층액은 역-교차링크를 위해 65℃에서 밤새도록 인큐베이션하고 37℃에서 2시간 동안 RNase A 를, 55℃에서 2시간 동안 proteinase K를 순차적으로 처리하였다. ChIP 샘플과 input DNA는 추출 후 qRT-PCR을 통해 분석하거나 시퀀싱 라이브러리 제작에 사용되었다. two-step ChIP 실험에서는 첫 면역침전 반응물을 37℃ 에서 30분 동안 10mM DTT와 인큐베이션 하여 추출하고 이를 다시 ChIP dilution buffer로 1:50만큼 희석하여 두번째 항체를 이용하여 재-면역침전반응에 들어갔다. Two-step ChIP 실험 역시 처음 면역침전법과 같은 방법으로 수행하였다. 결합한 DNA를 정량하기 위해 정량적 PCR (qPCR)기법이 사용되었으며 그 값은 Input에 대한 대비값과 IgG에 대한 비율로 계산되었다. 모든 반응은 세번 반복하였다. 사용된 프라이머 시퀀스는 하기와 같다: Map1lc3b; fwd 5’-AGCCAGTGGGATATTGGTCT-3’, rev 5’-AGAGCCTGCGGTACCCTAC-3’; ATG14; fwd 5’-GAGACGCCATGATGATCTGA-3’, rev 5’-GCCAAGGAGTGTGGGAAG TA-3’; Atp6v1c1; fwd 5’-ACTCAGTGGCAGAAGGGAGA-3’, rev 5’-AAACACCCAGTGGA GACT GC-3’; Hexb; fwd 5’-GAATTGGGACTGTGGTCGAT-3’, rev 5’-CTAGTGTCGCTGG CCCTA GT-3’; Hspa5; fwd 5’-ATTGGTGGCCGTTAAGAATG-3’, rev 5’-TGAAGTCGCTA CTCGTT GGA-3’; Ctns; fwd 5’-CCTCTGGTAGCGTAGGT-3’, rev 5’-GCTTTTGGTGAGGT CTGTCC-3’; Vps11; fwd 5’-GGGCCGATCTTAACCTTTGT-3’, rev 5’-AGCCCAGATGTCT TTTGTGG-3’.

통계 분석. 모든 실험은 각각 3번의 반복으로 진행됨. GFP-LC3 puncta 카운팅은 다섯번의 랜덤한 confocal 이미지를 선택하여 GFP-positive dots이 관찰되는 경우를 계산하였다. 평균적으로 각 그룹당 80여개의 세포를 관찰하였으며 p-values는 one-tailed t-test를 사용함. 동물 실험에서의 실험당 샘플사이즈는 통계학적 의미를 지니는 기존의 연구들에 기반하여 경험적으로 결정하였다. 엘라그산 처리 실험에 쓰인 마우스는 랜덤하게 선택하였으며 실험자는 이성적이고 논리적으로 실험을 수행하였다. 값은 평균 ± s.e.m으로 표현되며, 유의미성은 two-tailed, unpaired t-test를 사용하여 분석하였다. 0.05이하의 p-value값은 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1. CARM1에 의하여 H3R17 디메틸화(dimethylation)가 증가되는 것이 정상적인 자가포식 작용에 핵심적임을 확인함.

본 발명자는 자가포식 과정에서 핵 내의 역할을 규명하기 위해, 전사 과정 및 후성 유전학적 조절 측면에서 자가포식의 정교한 조절에 관여하는 핵심적인 히스톤 변형이 있을 것이라는 가설을 세웠다. 따라서 당 고갈 상황에서 변화되는 특정 히스톤 변형을 찾기 위해 마우스 배아섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast, MEF)에서 자가포식을 유도하였다. 이 과정에서 당 고갈 상황일 때 H3R17me2이 증가되는 현상을 관찰하였으며 (도 1a) 이러한 현상은 아미노산 고갈이나 라파마이신Rapamycin처리에 의해서도 확인되었다. 흥미롭게도 영양분 고갈 상황에서 CARM1 단백질 또한 증가되는 것을 관찰하였다 (도 1b).

CARM1의 증가 및 H3R17me2의 증가가 자가포식 현상과 관련 있는지 확인하기 위해 자가포식 현상의 보편적인 지표로서 비 지질화된 LC3-Ⅰ 대비 지질화된 LC3-Ⅱ의 증가된 비율을 확인하였다. CARM1의 증가와 함께 LC3-Ⅱ 증가 또한 동반되었다(도 1c). 자가포식에 의한 분해과정의 문제로 인해 LC3-Ⅱ의 비율이 감소했음을 재확인하기 위해 p62의 양적 변화를 이용하여 자가포식 활성도를 관찰하였다. 정상 MEF의 경우 당 결핍 현상에 의해 p62 단백질의 분해 및 LC3-Ⅱ가 축적되는 현상이 관찰되었지만 CARM1 결손(KO) 및 CARM1효소 활성이 없는 변이 MEF (KI MEFs)에서는 그런 현상이 보이지 않았다(도 1c).

CARM1의 자가포식 과정에서의 역할에 대해 더 확인해 보고자 GFP-LC3에 의한 자가포식소체 형성을 관찰하였다. 정상 MEFs에 대비하여 CARM1 KO 및 KI MEFs의 경우 LC3-punctated 세포 증가가 확연히 감소했음을 확인하였다. 또한 자가포식 저해제인 바필로마이신 A1을 이용하여 LC3-flux 실험을 수행하였다. 웨스턴 블랏 방법 및 자가포식소체 형성 및 성숙과정을 동시에 관찰할 수 있는 mcherry GFP-LC3 를 이용한 이미징 실험을 통해 CARM1이 소실된 경우 자가포식 플럭스(flux)에 문제가 생기는 것을 관찰하였다. 뿐만 아니라 H3R17me2을 선택적으로 저해하는 폴리페놀계 물질인 엘라그산(Ellagic acid)을 처리한 경우에도 자가포식 프로세스에 문제가 생김을 확인하였다 (도 1f).

실시예 2. CARM1이 정상 상황에서 핵에서의 Skp2-SCF E3 리가아제에 의해 분해됨을 확인함.

다음으로 본원 발명자는 CARM1이 어떻게 당 결핍 상황에서 증가되는지를 관찰하였다. 그 결과 당 결핍 상황을 유도했을 때 핵에서만 CARM1단백질이 증가되는 것을 확인하였다 (도 2a, 왼쪽 패널). 26S 프로테아좀 저해제인 MG132를 처리하면 CARM1의 분해가 핵 내에서 저해됨을 알 수 있었다(도 2a, 오른쪽 패널). 당 결핍 상황에서 CARM1의 유비퀴틴화는 상당히 감소하였고 CARM1의 K471R 돌연변이의 경우 유비퀴틴화 되지 않음을 확인함으로서 K471 아미노산이 CARM1의 유비퀴틴화 자리임을 동정할 수 있었다(도 2b). 다음으로 CARM1의 유비퀴틴화 효소를 찾고자 하였고 그 과정에서 CARM1의 결합 단백질로서 Skp2라고 하는 SCF-E3 유비퀴틴화 효소 복합체의 F-box 단백질 및 CUL1을 동정하였다(도 2c). CARM1은 Skp2 및 CUL1과 특이적으로 결합함을 확인하였다.

CARM1이 당 고갈 상황에서는 안정화되고 정상 상황에서는 Skp2를 포함한 E3 효소 복합체에 의해 유비퀴틴화 될 수 있기 때문에 Skp2의 단백질 발현양 변화를 확인하였다. 당 고갈 상황에서 Skp2 발현이 감소되면 CARM1 단백질 양이 증가되었다. Skp2의 감소에 의해 이미 알려진 다른 Skp2-SCF의 기질 또한 안정화됨을 추가로 확인하였다. 또한 Skp2의 발현을 감소시켰을 때 핵에서 CARM1의 유비퀴틴화가 저해됨을 확인하였고 (Fig. 2f) CARM1 단백질의 반감기가 확연히 증가됨을 알 수 있었다. 반대로 당 고갈상황에서 Skp2 WT을 과발현한 경우, CARM1의 단백질 발현 및 반감기가 줄어들었지만 Skp2-SCF 복합체의 기능 소실 Skp2 DF mutant 과발현한 경우는 그러한 현상이 관찰되지 않았다(도 2g 및 h). 이것은 아마도 Skp2가 주로 핵에서 발현하기 때문에 핵 내에서 CARM1을 선택적으로 유비퀴틴화 시켰을 것으로 생각된다. 당 고갈 상황에서 Skp2를 감소시키면 CUL1과 CARM1사이의 결합력이 상당히 저해되는 현상도 관찰하였다. 그리고 SCF-복합체 단백질인 CUL1 또한 CAMR1의 단백질 발현을 조절하였다. 종합적으로 이와 같은 결과들은 Skp2를 포함하는 SCF-E3 효소 복합체가 정상 상황에서 핵 내의 CARM1 단백질 분해에 핵심적으로 작용했음을 의미한다(도. 2i).

실시예 3. 당 결핍 상황에서는 Skp2 감소가 AMPK에 의존적임을 확인함.

기존에 보고된 바에 따르면 당 결핍에 따라 AMPK 효소가 활성화 되어 자가포식을 유도한다고 한다. 하지만 핵에 존재하는 AMPK와 자가포식의 연결고리는 지금까지 연구되어 있지 않기 때문에 본원을 통해 AMPK가 핵 내에서 자가포식의 전사조절에 어떻게 관여하는지 관찰하고자 하였다. 본 발명자는 핵에서 당 결핍 상황이 왔을 때 AMPKa2와 인산화된 AMPK (활성화 된 AMPK)의 양이 핵에서 증가하는 것을 관찰하였다(도 3a). 증가된 AMPKa2는 전사 후 조절이 아닌, 전사 활성 증가에 따른 결과임을 확인하였다. AMPKa2는 주로 핵에서 발현하기 때문에 핵에서 고유의 역할을 할 것이라 추측할 수 있다. AMPK는 CARM1 혹은 Skp2와 결합하거나 이들을 인산화시키지 않는다. 하지만 AMPK 활성화를 유도하는 아미노이미다졸 카복사미드 리보뉴클레오타이드(AICAR) 혹은 펜포르민을 처리하였을 때 CARM1의 증가와 Skp2의 감소가 보였으며 Compound C로 AMPK 활성을 억제하면 이 현상이 일어나지 않는 것을 확인하였다.

그 다음 Ampka1- 및 Ampka2- 유전자가 결손된 (Ampk DKO) 배아섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast, MEF)를 사용하여 CARM1과 Skp2의 발현을 확인하였다. Ampk DKO MEF 핵에서는 CARM1 증가와 Skp2의 감소가 관찰되지 않았다(도 3b). CARM1의 반감기 또한 Ampk DKO MEF에서 상당히 감소되어 있었다. 하지만 AMPKa2 WT을 과발현한 Ampk DKO MEF는 WT MEF과 비슷한 경향성을 보였다. AMPKa2 활성이 없는 dominant negative(DN) mutant의 경우 그런 회복이 관찰되지 않았다. Ampk DKO MEF에서 Skp2를 억제하였을 때 CARM1의 양이 증가하는 것으로 보아, Ampk DKO MEF에서 CARM1의 양 감소는 Skp2에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 또한 CARM1과 CUL1의 결합이 Skp2을 매개한 것이기 때문에 CARM1-CUL1의 결합은 Ampk DKO MEF에서 당 결핍이 와도 유지됨을 알 수 있었다.

당 결핍에 따른 Skp2감소는 단백질 분해에 따른 감소가 아닌 전사과정에서 조절된다(도 3c). Ampk DKO MEF에서는 당 결핍에 따른 Skp2감소가 관찰되지 않지만 AMPKa2 WT이 과발현되면 skp2양이 감소한다(도 3d). 따라서, AMPKa2에 의한 Skp2 조절 기전이 있다는 전제 하에 다음 실험을 진행하였다. AMPK-FOXO 축은 종간 보존이 잘 되어 있으며 영양 감지 신호조절과 생물 항상성 유지에 필수적이다. AMPK는 FOXO3a를 인산화시키고 FOXO3a의 전자과정 활성을 조절한다. FOXO는 주로 전자조절 활성화 인자로 알려져 있지만 억제 역할도 보고되었다. Skp2 프로모터에 종간 보존이 잘 된 FOXO response element (FRE-FOXO 전자조절 인자가 결합할 수 있는 DNA 서열)가 있다(도 3e). 따라서 FOXO가 Skp2에 대해 전사조절 억제 역할을 수행할 것이라 가정하고 루시퍼라아제-리포터 실험을 수행하였다. Skp2 프로모터-루시퍼라아제 활성은 당 결핍에 의해 감소하고, FRE가 없어진 돌연변이 promoter는 그런 결과를 보이지 않았다(도 3e). 또한 Skp2 mRNA양은 Foxo1/3/4 KO (TKO) MEF에서 감소하지 않았다. 이는 곧, FOXO가 Skp2의 전사조절을 억제한다는 사실을 뒷받침한다.

당 결핍은 AMPK에 의한 FOXO3a의 인산화를 유도한다. 또한 AMPKa2와 인산화된 FOXO3a는 당 결핍 상황에서 Skp2 프로모터에 결합한다(도 3f). 인산화된 FOXO3의 겹합은 RNA Pol II (전사 억제 마커)의 감소를 동반했다. 흥미롭게도 Foxo 1/3/4 TKO MEF에 FOXO3a WT을 발현시키면 Skp2의 감소가 보이지만 DNA에 결합 못 하는 FOXO3a H212R 혹은 AMPK에 의해 인산화 되지 못 하는 SA mutant는 그러지 못했다(도 3g). 또한 FOXO3a WT은 Skp2 promoter에 결합하지만 FOXO3a SA mutant는 결합하지 못했다(도 3h). 이는 곧, FOXO3가 Skp2 promoter에 결합하는데 있어 AMPK에 의한 FOXO3a 인산화가 필수적임을 시사한다. FOXO TKO MEF에 FOXO3a SA mutant가 발현된 경우 Skp2는 감소하지 않고 자가포식 현상 또한 저해되어 있음을 확인하였다 (도 3i).

Ampk DKO MEF에서 Skp2를 억제하였을 때 자가포식 현상의 증가를 관찰할 수 있었다(도 3j 및 k). CARM1의 과발현으로도 Ampk DKO MEF에서 자가포식 현상이 복구되는지 관찰하였다. CARM1 WT 혹은 K471R mutant는 GFP-LC3 puncta 증가를 유도하였으나, 효소활성이 없는 CARM1 R169A mutant는 그렇지 않았다.

종합적으로 본원에서는 당 결핍에 따른 새로운 신호전달 축을 밝혔으며, 그것은 핵에 존재하는 AMPKa2의 증가로 인해 FOXO3a가 Skp2를 억제하고 양이 감소된 Skp2에 의해 CARM1은 안정화 된다는 것이다.

실시예 4. CARM1이 TFEB을 통해 자가포식 및 라이소좀 유전자들의 전사과정에서 공 활성 인자로 역할 함을 확인함.

TFEB은 라이소좀 발생 및 자가포식 조절의 마스터 조절자다. 당 결핍 상황이 왔을 때 CARM1과 TFEB은 핵에서 결합하였다 (도 4a 및 b). 이 결합은 AMPK유무에 영향을 받지 않았다. CARM1은 TFEB의 전자조절 영역 (domain)에 결합하고 TFEB은 CARM1의 효소 활성조절 영역에 결합한다. CARM1은 TFE3와도 결합하지만, TFEB을 억제하였을 때 자가포식 관련 유전자들의 발현들이 영향을 받았기 때문에 TFEB에 집중하여 연구를 진행하였다.

TFEB 결합 인자(CLEAR)가 2개 있는 2x CLEAR-루시퍼라아제 리포터를 이용하여 실험해보았을 때 TFEB에 의해 증가된 활성이 CARM1이 추가되었을 때 더욱 증가되는 것을 관찰하였다(도 4c). CARM1에 의해 조절되는 타겟 유전자들이 TFEB에 의해 조절되는지를 알아보기 위해, 타겟 유전자들 프로모터에 CLEAR motif 존재 여부를 확인하고 ChIP실험을 수행하였다. TFEB의 발현을 억제하였을 때 CARM1과 그에 따른 H3R17메틸화 증가가 관찰되지 않았다(도 4d 및 e). CARM1에 의해 조절되지 않는 유전자들은 CARM1이 그 프로모터에 오지 않았다(도 4f). 한편으로 TFEB 타겟 중 일부는 포도당 결핍상황이 왔을 때 CARM1 발현이 억제되면 발현 증가가 관찰되지 않았다. CARM1 발현 억제는 H3R17메틸화의 감소로 이어졌다. 하지만 TFEB의 DNA결합에는 영향을 미치지 않았다. 면역염색법으로 CARM1에 의해 조절 받는 중요한 자가포식 인자들이 당 결핍상황에서 증가하고 CARM1이 결손된 배아섬유아세포(MEF)에서는 그 증가가 보이지 않는 것을 확인하였다. 또한 two-step ChIP실험을 통해 TFEB타겟 유전자 프로모터에 TFEB과 CARM1이 같이 오는 것을 확인하였다.

기존 보고에 따르면 TFEB 과발현만으로도 자가포식을 유도할 수 있다고 한다. 하지만 CARM1이 결손된 MEF에서는 TFEB을 과발현하여도 자가포식소체(autophagosome) 증가 및 LC3-II증가가 관찰되지 않는 것을 보아 CARM1이 없으면 자가포식이 제대로 못 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 4g). CARM1타겟 유전자 발현 및 H3R17메틸화의 증가가 Ampk DKO MEF에서 관찰되지 않았는데 이는 앞에서 보여준 바와 같이 CARM1이 Ampk DKO MEF에서 증가하지 못했기 때문이다. 하지만 Skp2 억제로 인해 CARM1 타겟 유전자들의 발현이 증가하는 것을 보아, Ampk DKO MEF에서 Skp2가 억제되면서 자가포식이 어느 정도 회복되는 것은 자가포식 및 라이조좀 유전자들의 발현증가에 의한 것임을 암시한다. 종합적으로 CARM1이 TFEB의 중요한 공활성화인자 (coactivator)임을 보여주었다.

CARM1증가와 이에 따른 H3R17메틸화 증가가 생체 내(in vivo) 자가포식과도 연결되어 있는지 알아보기 위해, 쥐에서 간의 자가포식을 관찰하였다. WT 쥐를 굶겼을 때 간 조직에서 CARM1의 증가와 LC3 전환(conversion)이 잘 보였다. 하지만 엘라그산을 처리를 한 쥐들은 굶었음에도 불구하고 LC3전환이 다소 미비한 것을 관찰하였다(도 4h). CARM1 타겟 유전자인 자가포식 및 라이소좀 유전자들의 발현 또한 증가하지 못하였다(도 4i). 엘라그산을 처리하게 되면 CARM1에 의해 조절되는 상당수의 유전자가 증가하지 못하였다. 또한 ChIP실험을 통해 엘라그산 처리시 CARM1의 프로모터 결합과 H3R17메틸화의 증가를 억제하는 것을 확인하였다 (Extended Data Fig. 9d-f). 엘라그산이 CARM1을 매개한 자가포식을 거의 완벽하게 억제할 수 있는 것을 보아, 엘라그산이 자가포식과 연결된 질환 치료제로서 기능 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

본원 발명은 에너지감지, 후성유전학과 자가포식 전사조절의 연결을 제시한다. 본원은 CARM1 안정화에 초점이 맞춰져 있지만, 다른 히스톤 조절인자들도 이와 유사한 방식으로 조절될 가능성이 있고 이런 조절 방식이 핵에서 표적 유전자들을 효율적으로 조절하는 방법일 것이라 추측한다. 또한 본원은 당 결핍상황이 지속되고 자가포식을 유지하기 위해 자가포식 유전자들의 전사조절이 필요해지면, AMPK가 핵에서 양이 늘어나고 활발하게 전사조절에 관여하는 것을 밝혔다. 본원 명세서는 AMPK-Skp2-CARM1 신호전달체계를 표적으로 하여 자가포식 활성문제로 인한 질환 치료제 개발 가능성을 보여준다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Method for modulating autophagy mediated by AMPK-Skp2-CARM1 pathway and its use <130> DP201604003P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(135) <223> Histon 3, residue 17 of which may be methylated. <400> 1 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr 20 25 30 Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu 35 40 45 Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys 50 55 60 Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr 65 70 75 80 Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Cys 85 90 95 Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala Ile 100 105 110 His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg 115 120 125 Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 130 135

Claims

CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1)에 의한 H3 (Histon 3) 단백질의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절을 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은
CARM1 단백질, 이의 H3에 대한 메틸전달효소 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 및 상기 CARM1의 메틸전달효소 활성의 기질로서 서열번호 1의 서열을 기준으로 17번 잔기를 포함하는 H3 단백질을 배양하는 단계;
상기 H3 단백질을 상기 배양물로부터 분리하는 단계:
상기 분리된 H3 단백질의 17번째 잔기에서의 메틸화정도를 측정하는 단계; 및
상기 측정결과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우 상기 H3 단백질의 17번째 잔기의 메틸화가 증가 또는 감소한 경우, 이를 자가포식을 조절하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, CARM1 및 H3에 의해 조절되는 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
SKP2(S-phase kinase-associated protein 2) 및 CARM1을 제공하는 단계;
상기 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉하는 단계;
상기 단백질간의 상호작용을 검출하는 단계; 및
상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 SKP2 및 CARM1의 상호작용이 증가 또는 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 조절제로 선별하는 단계를 포함하는, SKP2 및 CARM1 경로를 통한 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
세포에서 AMPK에 의해 조절되는 FOXO3a (Forkhead box O3)-> SKP2-> CARM1 경로를 통해 자가포식을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로,
상기 AMPK, FOXO3a, SKP2, CARM1 및 H3를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계;
상기 FOXO3a 단백질의 인산화, 상기 SKP2의 전사 (transcription), 상기 CARM1 단백질의 농도를 검출하는 단계; 및
상기 검출결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 증가하고, SKP2의 전사가 억제되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 증가하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하거나; 또는 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 FOXO3a의 인산화가 감소하고, SKP2의 전사가 증가되고, 상기 CARM1 단백질의 농도가 감소하는 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 세포는 H3를 추가로 발현하며, 상기 검출하는 단계 대신에, 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화로 측정하는 단계; 및
상기 후보물질을 선별하는 단계 대신에, 상기 측정결과 상기 세포에 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 활성화 후보물질로 선별하고, 또는 상기 H3 단백질의 17번 잔기의 아세틸화가 감소한 경우, 상기 시험물질을 자가포식 억제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 자가포식 조절제 스크리닝 방법.
CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법.
CARM1(Coactivator Associated argine methyltransferase 1) 단독, 또는 CARM1 및 TFEB (Transcription Factor EB)를 포함하는 인비트로에서 세포의 자가포식 조절용 키트.
히스톤 H3의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절제를 포함하는 인비트로에서 세포의 자가포식 조절용 키트.
히스톤 H3의 17번 알지닌 잔기의 메틸화 조절제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 자가포식 조절 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 메틸화 조절제는 엘라그산(ellagic acid)인, 인비트로에서 자가포식 조절 방법.