WO2016131897A1 - Utilisation d'un extrait de ruscus dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont les veines pathologiques presentent une reponse fonctionnelle vasodilatatrice a l'acetylcholine alteree - Google Patents

Utilisation d'un extrait de ruscus dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont les veines pathologiques presentent une reponse fonctionnelle vasodilatatrice a l'acetylcholine alteree Download PDF

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WO2016131897A1
WO2016131897A1 PCT/EP2016/053411 EP2016053411W WO2016131897A1 WO 2016131897 A1 WO2016131897 A1 WO 2016131897A1 EP 2016053411 W EP2016053411 W EP 2016053411W WO 2016131897 A1 WO2016131897 A1 WO 2016131897A1
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WO
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venous insufficiency
venous
treatment
extract
patients
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PCT/EP2016/053411
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Didier Cussac
Isabelle RAULY-LESTIENNE
Peter HEUSLER
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/896—Liliaceae (Lily family), e.g. daylily, plantain lily, Hyacinth or narcissus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Definitions

  • the present invention relates to the use of an extract of Ruscus (Liliaceae) and in particular Ruscus aculeatus L. in the treatment of venous insufficiency and in particular varicose veins, in patients whose pathological veins have a vasodilating functional response to Acetylcholine or carbachol, altered.
  • Chronic venous insufficiency includes all manifestations related to a functional or physical abnormality of the venous system caused by valvular incontinence with or without associated venous obstruction. This venous dysfunction can be congenital or acquired.
  • the venous system is ensured by three successive systems: the sole of Lejars which depends on the plantar static and the progress of the step, the muscular pump of the calf, essential and the abdomino-diaphragmatic system.
  • the veins in the lower limbs have valves that prevent reflux.
  • Varicose veins are defined as veins whose wall is pathological and which become dilated and tortuous with valvular incontinence. There are two types of varicose veins, systematized varicose veins, they are developed at the expense of large and small saphenous networks and non-systemized or diffuse varicose veins, still called non-saphenous veins. Varicose veins can be either primary or secondary to post-phlebitic disease. A varix is called primary when it occurs on its own, without a causal mechanical factor.
  • Venous thrombosis can cause post-thrombotic disease, especially if it is poorly or inadequately treated.
  • the essential mechanism is the destruction valvular, source of reflux, with or without residual obstruction. The risk is particularly important in case of over-popliteal thrombosis. Chronic obstruction of the common femoral vein is also very pejorative.
  • This term is reserved for failing venous return with morphologically normal veins. This situation may be related to a decrease in walking, a tibiotarsal ankylosis, a loss of muscle volume, or an alteration of the cardiorespiratory dynamic. It is frequently encountered in elderly subjects.
  • venous insufficiency There are other causes of venous insufficiency, but they represent only a small part of the causes of venous insufficiency, they are venous or arteriovenous malformations, chronic extrinsic venous compression and valvular dysgenesis.
  • thrombotic and haemorrhagic complications may be superficial or deep vein thrombosis.
  • Superficial venous thrombosis occurs on a vein whose wall is altered and results in an inflammatory red indurated cord in the path of a varicose vein.
  • Segmental superficial venous thrombosis which has a common evolutionary potential from extensive saphenous thrombosis to buttocks or perforating veins with a risk of deep vein thrombosis and pulmonary embolism, should be distinguished.
  • These superficial vein thromboses on varices are to be differentiated from superficial vein thromboses on healthy veins.
  • Venous stasis associated with valve changes is conducive to the occurrence of deep vein thrombosis.
  • rupture of a varicose bulb is a classic but rare haemorrhagic complication of varicose veins. It should be curbed quickly by local compression and elevation of the limb.
  • the positive diagnosis of chronic venous insufficiency is essentially clinical.
  • the etiological diagnosis and the importance of the lesions in question are specified by complementary examinations, in the first place Doppler examination and ultrasound.
  • the clinical evaluation begins with an interrogation.
  • the clinical examination is done in standing position, it makes it possible to specify the systematized character or not of the varicose veins, the trophic complications, to select the patients who require complementary explorations which will specify the therapeutic indications.
  • Continuous Doppler examination is an extension of clinical examination and allows to highlight a pathological venous reflux (ostial or truncal valve insufficiency), a perforating vein incontinence.
  • Ultrasound can visualize sequelae of venous thrombosis (reflux or obstruction), or venous compression.
  • Doppler ultrasound allows complete and detailed examination, both morphological and dynamic, of the venous circulation.
  • the therapeutic management of venous insufficiency is initially focused on medical treatment and then surgical treatment.
  • the first step is to seek to correct the factors favoring venous insufficiency, to have a regular physical activity (walking), to avoid prolonged standing, to reduce an overweight, to avoid heat exposures, to raise the feet of the bed (postural drainage). during sleep).
  • the next measure is compression / compression, it is a medical procedure. It consists of the application on a limb segment of a pressure by an elastic material (bands or socks, stockings, tights).
  • the conventional elastic compression currently prescribed in the treatment of moderate, severe and severe chronic venous insufficiency responds to the principle of degressivity: the pressure is maximal in the ankle and then decreases towards the calf and the thigh, this principle is used regardless of the stage of venous insufficiency.
  • the compression reduces the dilation of the veins and increases the flow velocity of the venous blood. It decreases the limb volume with an anti-edema effect and improves the effectiveness of the calf muscle pump when walking.
  • Sclerotherapy consists of inject a sclerosant into a varicose vein. It is usually reserved for non-systemic varicose veins or in addition to the weaning surgery. Stripping or stripping is the traditional operation for the removal of large varicose veins.
  • Outpatient phlebectomies consist in extracting residual varicose veins.
  • cryosurgery which consists of freezing the vein with nitrogen.
  • the drug treatments consist of two classes, the anticoagulant treatments that are reserved for curative deep venous thromboses and extensive superficial venous thromboses and as a preventive measure in circumstances at risk.
  • the second class brings together the venotonic or phlebotropic, also called veinotropic.
  • the second activity is a decrease in the capillary permeability that favors edema
  • a third known effect is a rheological activity, that is to say that it improves the viscosity of the red blood cells and therefore it allows a better perfusion, finally it is often reported an anti-inflammatory effect.
  • Phlebotropes can be used:
  • varicose veins stage In the varicose veins stage, with or without skin and tissue alteration, they can be used adjuvantly to the operative treatment of varicose veins, if the symptoms are present or persist.
  • Natural substances with veinotonic activity come from the following chemical classes: flavonoids, antocyanes and proanthocynidines, saponins and coumarins.
  • the pharmacological actions of flavonoids are multiple, an anti-oedematous effect, a decrease in capillary permeability, an antiphlogistic effect, an increase in capillary resistance and a decrease in erythrocyte aggregation.
  • Phlebotropic activity flavonoids include hesperidin, diosmin, rutin and toxutin.
  • Anthocyanins and proanthocyanidins act only by a decrease in capillary permeability.
  • Coumarins act through various pharmacological actions, an anti-oedematous effect, an increase in macrophage activity and an increase in lymphatic flow, the main coumarins with phlebotropic activity are aesculin, aesculin and coumarins of sweet clover. and odorous aspheric. Finally, saponins, their pharmacological actions are an anti-oedematous effect, a decrease in capillary permeability and a venotonic effect.
  • the saponins include aescin and ruscin.
  • the ruscin is isolated from the small holly, Ruscus aculeatus L. of the family Liliaceae, also called buntings, boxwood, thorny myrtle, rat spine or hello hornet. This is a woody, evergreen sub-shrub. Its fruits are red berries with ornamental virtues.
  • the part of the plant used in medical use is the rhizome.
  • the main constituents are steroidal saponosides, neoruscin leading to neoruscogenin, neoruscoside, ruscoside, ruscin leading to ruscogenin, aculosides A and B.
  • saponosides There are also other constituents, sterols, fatty acids, oses, essential oils, benzofuran derivatives, flavonoids ...
  • saponosides The known mode of action of saponosides is through stimulation of post-junctional alpha-adrenergic receptors of the smooth cell of the wall vascular.
  • the inventors therefore conclude that the Ruscus extract acting as agonists on the M1, M3 and / or M5 muscarinic receptors would make it possible to restore this altered endothelial function.
  • a Doppler evaluation of vasodilator responses to acetylcholine would make it possible to select patients who have a vasodilator functional response to altered acetylcholine and therefore to offer them a treatment. adapted to their needs.
  • this acetylcholine challenge could be replaced by carbachol, a muscarinic receptor agonist, with acetylcholine having the disadvantage of impacting other families of receptors, nicotinic in particular.
  • This evaluation of the functional response to acetylcholine or carbachol can be done routinely, as a minimally invasive and decision-making diagnostic element for treatment with a Ruscus extract.
  • vasodilator functional response to altered acetylcholine is understood to mean a vasodilator response, evaluated in particular by Doppler, decreased by more than 20% compared to the standard conditions observed on a similar healthy vein, ie - say same caliber and same positioning.
  • the vasodilator functional response to acetylcholine is decreased by more than 30% relative to the control conditions.
  • the vasodilator functional response to acetylcholine is decreased by more than 50% compared to the control conditions.
  • the present invention relates to the use of a Ruscus extract for its use as a medicament for the treatment of venous insufficiency in patients whose affected veins have a vasodilator functional response to altered acetylcholine.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a Ruscus extract as active ingredient and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention relates to an extract of Ruscus aculeatus L. for use as a medicament for the treatment of venous insufficiency in patients whose affected vein (s) have a vasodilator functional response to acetylcholine or carbachol, altered; characterized in that the patients are overexpressing muscarinic receptors, especially muscarinic receptors of subtype M1 and M3.
  • the venous tissues of patients are overexpressed muscarinic receptors, including muscarinic receptors subtype M1 and M3.
  • saphenous vein tissue More particularly, it is saphenous vein tissue.
  • overexpression of muscarinic receptors is meant overexpression of the genes encoding these receptors in these selected patients. This gene overexpression leads to a greater amount of muscarinic receptors in said patients.
  • the level of expression of each of said genes coding for the muscarinic receptors is determined by measuring the level of expression of the polypeptides encoded by said gene or a fragment thereof, or by determining the level of expression of the mRNA of said gene or a fragment thereof .
  • the determination of the level of expression of each of said genes encoding muscarinic receptors may be performed by analyzing the expression of mRNA transcripts or mRNA precursors, such as native RNA. of said gene.
  • Said assay can be performed by preparing the mRNA / cDNA of cells from a biological sample of a patient's vein, and hybridizing the mRNA / cDNA with a reference polynucleotide.
  • the mRNA / cDNA prepared can be used in a hybridization or amplification assay which includes, but is not limited to, Southern and Northen analyzes, polymerase chain reaction (PCR) assays, such as quantitative PCR (Taqman ) and the use of "probes arrays" such as GeneChip® DNA templates (AFFYMETRIX).
  • PCR polymerase chain reaction
  • probes arrays such as GeneChip® DNA templates (AFFYMETRIX).
  • the analysis of the expression of transcribed mRNA of each of said genes involves a nucleic acid amplification process, such as, for example, RT-PCR, ligase chain reaction, self-sustaining sequence replication. , the transcriptional amplification system. , "Q-Beta Replicase", “rolling circle replication” or any other nucleic acid amplification method, followed by a step of detecting amplified molecules by techniques well known to those skilled in the art. These detection modes are particularly useful for the detection of nucleic acid molecules in very small quantities.
  • the amplification primers are defined as a pair of nucleic acid molecules that can respectively match the 3 'and 5' regions of a gene specifically (positive and negative strands, or vice versa) and frame a short region of said gene.
  • overexpression is meant a significantly higher level of expression of the gene (s) relative to the level of expression of a reference gene of the tissue in question.
  • overexpression is understood to mean a level of expression in a biological sample which is greater than at least 50% of the level of expression of at least one reference gene, preferably greater than at least 100% of the level of expression. expression of at least one reference gene, and particularly preferably greater than 150 ⁇ 6 at the level of expression of at least one reference gene.
  • overexpression means a level of expression in a biological sample that is greater than at least 50% of the average level of expression of two reference genes, preferably greater than at least 100% of the average expression level of two reference genes, and particularly preferably greater than 150% of the average level of expression of two reference genes.
  • overexpression is understood to mean that the muscarinic receptor genes, in particular M1 and M3, are expressed 1.5 times more than the average level of expression of two reference genes, particularly twice as much as the average expression level of two reference genes, more particularly 2.5 times more than the average expression level of two reference genes, more particularly 3 times more than the average level of expression of two reference genes.
  • the person skilled in the art knows how to choose the at least one household gene, in the group consisting of beta 2 microglobulin, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Cyclophilin A (Peptidylpropyl isomerase A), Cyclophilin B (Peptidylpropyl isomerase B), Ribosomal protein broad PO , Hydrogenase succinate subunit A, Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, Gamma 1 translation elongation factor, Ubiquitin C.
  • the at least one reference gene, or housekeeping gene is selected from the group consisting of Beta 2 microglobulin, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Cyclophilin A (Peptidylpropyl isomerase A), Cyclophilin B (Peptidylpropyl isomerase B), Ribosomal Protein Wide PO, Succinate Hydrogenase Subunit A, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1, Gamma 1 Trans Translation Elongation Factor, Ubiquitin C.
  • the at least one reference gene, or housekeeping gene is selected from the group consisting of Cyclophilin A (peptidylpropyl isomerase A) and RPLPO (ribosomal protein wide PO).
  • muscarinic receptor gene expression is thus normalized with respect to Cyclophilin A expression.
  • muscarinic receptor gene expression is normalized to RPLPO expression.
  • muscarinic receptor gene expression is normalized to mean the expression of Cyclophilin A and RPLPO.
  • the Ruscus extract according to the present invention can be advantageously prepared according to European Patent EP0112770.
  • compositions according to the present invention can be formulated for administration to humans.
  • the compositions according to the invention can be administered orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, transdermally, locally or rectally or even intra-nasally.
  • the active ingredient can be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, to humans.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual and oral forms of administration, subcutaneous forms of administration or transdermal, topical, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular, forms of rectal administration.
  • the main active ingredient is mixed with a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic, silica or like.
  • a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic, silica or like.
  • the tablets may be coated with sucrose or other suitable materials or they may be treated so that they have prolonged or delayed activity and continuously release a predetermined amount of active ingredient.
  • a preparation in capsules is obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • a syrup or elixir preparation may contain the active ingredient together with a sweetener, an antiseptic, as well as a flavoring agent and a suitable colorant.
  • the water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersing agents or wetting agents, or suspending agents, as well as with taste correctors or sweeteners.
  • suppositories are used which are prepared with binders melting at the rectal temperature, for example cocoa butter or polyethylene glycols.
  • parenteral intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous
  • intranasal or intraocular administration aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile and injectable solutions containing dispersants and / or wetting agents are used. pharmacologically compatible.
  • the active ingredient can also be formulated microcapsules, optionally with one or more additive carriers.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is intended for oral administration.
  • the Ruscus extract of the pharmaceutical composition according to the invention binds to muscarinic M1 and / or M3 receptors and results in a functional response to increased permeability.
  • the venous tissues of the selected patients have overexpression of muscarinic receptors, in particular M1 and M3.
  • the extract of the pharmaceutical composition according to the invention acts as a muscarinic receptor agonist, in particular the M1 and M3 receptors, and allows the restoration of the altered endothelial function and stimulates the venous tone.
  • Membrane preparations of CHO-K1 cells stably expressing two human muscarinic receptor subtypes are purchased (Perkin Elmer). These different membranes are incubated for two hours in 20 mM of HEPES buffer (pH 7.4) in the presence of 0.2 nM of the [ 3 H] N-methyl-scopolamine ligand in competition with the Ruscus extract. Non-specific binding is determined in the presence of 10 ⁇ of atropine (non-selective muscarinic receptor antagonist).
  • the tested Ruscus extract is prepared according to the EP patent
  • the Ruscus extract binds to the muscarinic receptors of subtype M1 and M3 with respective affinities of 61.9 ⁇ g / ml and 96.1 ⁇ g / ml.
  • Example 1 The cells of Example 1 are transiently transfected by electroporation (250 mV, 250 ⁇ F) with 10 ⁇ g of plasmids containing the different human muscarinic receptor subtypes (hM1, hM3 and hM5). These are the three subtypes that are coupled to a Gq protein, M2 and M4 being coupled to a Gi protein.
  • the cells are seeded in 96-well plates. Forty-eight hours after transfection, the cell culture medium is replaced by 200 ⁇ l per well of medium containing a fluorescence indicator, Fluo-4.
  • the 96-well plates are transferred to a fluorescence reader (ycell, Hamamatsu).
  • the device transfers 20 ⁇ of the microplate containing the test compounds to the cells and the fluorescence reading is carried out every second for 3 minutes.
  • the peak value of the fluorescence peak for each concentration tested is used to determine the potency and efficacy of the compound.
  • Each value represents the average of 3 wells, the fluorescence is expressed in arbitrary units ( Figure 1).
  • Carbachol is a muscarinic receptor agonist with an affinity similar to acetylcholine;
  • Example 1 The cells of Example 1 are transiently transfected with Lipofectamine Plus according to the supplier's recommendations with 3 ⁇ g of plasmids containing the different human muscarinic receptor subtypes (hM1, hM3 and hM5) and 10 ⁇ g of plasmids containing the reporter gene. AP-1 luciferase. Twenty-four hours after transfection the cells are reseeded in density-dense 96-well plates of 20000 cells per well. Twenty-four hours later, the cell culture medium is replaced by Opti-MEM 1 without phenol red and placed in the presence of test compounds for eight hours at 37 ° C. in a final volume of 50 ⁇ M.
  • hM1, hM3 and hM5 the cells of Example 1 are transiently transfected with Lipofectamine Plus according to the supplier's recommendations with 3 ⁇ g of plasmids containing the different human muscarinic receptor subtypes (hM1, hM3 and hM5) and
  • Luciferase activity is evaluated with the BriteLite Luciferase kit according to the supplier's instructions. Fifty ⁇ l of the reconstituted BriteLite reagent are added per well, after five minutes of incubation in the dark luminescence is measured using a counter of the type TopCount.
  • a large increase in luciferase activity is measured after distribution of a muscarinic agonist, carbachol on CHO-K1 cells transiently expressing the API reporter gene and either the muscarinic human receptor hM1, hM3 or hM5 ( Figure 2).
  • This answer is concentration-dependent.
  • the distribution of diosmin does not induce an increase in luciferase activity regardless of the concentration tested.
  • the distribution of the Ruscus extract induces an increase in luciferase activity as a function of the distributed concentration ( Figure 2).
  • the cheek pouches are dissected according to the method of Duling (Duling, Microvascular Res., 5, 423-429, 1973) modified by Svensjo (Svensjo et al., Uppsala J. Med., Sci 83, 71-79 , 1978). Briefly, the cheek pocket is turned over and placed on a microscope stage. An area of approximately 1 cm 2 is prepared for microscopy of permeability of macromolecules. The cheek pouch is continuously superfused with 5 ml / min with HEPES / HC03- buffer. The pH is maintained at 7.4 by bubbling the solution with 5% CO 2 and 95% N 2 .
  • FITC-dextran in glucose, macromolecular marker
  • glucose a solution of FITC-dextran in glucose, macromolecular marker
  • Microvascular permeability to macromolecules is quantified by counting the number of sites of extravasation, that is to say of leakage of fluorescent plasma visualized by fluorescent tracer in venules post ⁇ capillaries. The observations are made using a Leitz Ortholux microscope with a 3.5x objective and a 490 nm wavelength excitation filter.
  • Measurement of the number of "leakage” sites is performed by scanning the observation area with different standardized intervals, 5 minutes after the last topical application of histamine (2 applications separated by an interval of 35 minutes and a final concentration of 2 x 10 ⁇ 6 M). "Leakage” sites are considered if their diameter is greater than 100 ⁇ . The number of "leak” sites is reported per square centimeter. In the case of blocking the effect of Ruscus, atropine 0.1 or 1 ⁇ is applied beforehand to histamine.
  • Fragments of 1 cm are opened longitudinally and cleaned of the blood, they are cut into smaller pieces (2 mm) in RNAlater. They are then transferred to Precellys 24 CK28R ball tubes, filled with 800 ⁇ l RNAlater and 1% beta-mercaptoethanol. Precellys 24 grinding is carried out at 6500 rpm at 10 ° C. Manual extraction is then performed with RNeasy fibrous tissue mini kit after treatment with proteinase K and centrifugation to remove debris. Extraction on 900 ⁇ of supernatant is performed according to the Qiagen protocol with column DNase digestion, elution in 30 ⁇ l of water. The quantification is carried out on a spectrophotometer and the RNAs are analyzed on Bioanalyser.
  • the reverse transcription is performed using the Qiagen iscript kit according to the manufacturer's instructions.
  • Quantitative real-time PCR is performed on the cDNA obtained after reverse transcription of 500 ng of total RNA for each sample.
  • the primers chosen to amplify a fragment of the gene of interest are first tested on cDNA dilutions of 10 to 10 to verify their effectiveness.
  • the reaction of qPCR is carried out in a 96 well plate adapted to the Thermocycler C1000 equipped with the "CFX real-time System" in a final reaction volume of 15 ⁇ per well:
  • Negative controls are performed without cDNA for each pair of primers.
  • the plate is covered with a Biorad transparent adhesive and centrifuged at 1000 rpm for 1 minute to collect the reagents at the bottom of the wells.
  • the plate is then placed in the Themocycler and an adapted and optimized protocol is applied, 1 cycle of 45 seconds at 98 ° C (activation of the enzyme), 40 cycles of 2 seconds at 95 ° C (DNA denaturation) followed by 5 seconds at 62 ° C (hybridization of oligos and extension of the complementary strand) then temperature increase from 70 ° C to 90 ° C by incrementing 0.5 ° C (melting curve).
  • the data are in the form of fluorescence units as a function of temperature cycles. They are analyzed by the software "CFX manager" which calculates the expression of normalized genes of interest by the expression of reference genes chosen for their stability.
  • the melting curves make it possible to check the specificity of the amplicons (specific melting temperature at an amplicon length).
  • the amplicons are sequenced on an ABI 310 sequencer to verify that the sequence corresponds to that of the gene of interest.
  • the expression of the 5 muscarinic receptor subtypes hM1 to hM5 was therefore measured on 5 cDNA of 5 saphenous veins VS1 to VS5.
  • the 5 receptor subtypes are expressed in the pathological saphenous veins studied.
  • the hM3 subtype seems to be the most expressed.
  • the inventors then focused on the subtypes hM1 and hM3, the most interesting subtypes in the activity of ruscus.
  • Figure 5 shows the relative amount (normalized to the mean of the two reference genes) of mRNA for the hM1 and hM3 subtypes. On average in 5 pathological saphenous veins the hM3 subtype is at least 2 times more expressed than the hM1 subtype.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de Ruscus dans le traitement de l'insuffisance veineuse et notamment des varices, chez des patients dont les veines pathologiques présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à l'acétylcholine altérée.

Description

UTILISATION D'UN EXTRAIT DE RUSCUS DANS LE TRAITEMENT DE L'INSUFFISANCE VEINEUSE CHEZ DES PATIENTS DONT LES VEINES PATHOLOGIQUES PRESENTENT UNE REPONSE FONCTIONNELLE VASODILATATRICE A L' ACETYLCHOLINE ALTEREE
La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de Ruscus (Liliaceae) et en particulier de Ruscus aculeatus L. dans le traitement de l'insuffisance veineuse et notamment des varices, chez des patients dont les veines pathologiques présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine ou au carbachol, altérée.
L' insuffisance veineuse chronique des membres inférieurs est un problème de santé publique important. Sa prévalence globale est estimée entre 11 et 24% dans les pays industrialisés avec une nette prépondérance féminine (sex- ratio = 1/3). L'insuffisance veineuse chronique englobe toutes les manifestations en rapport avec une anomalie fonctionnelle ou physique du système veineux causée par une incontinence valvulaire avec ou sans obstruction veineuse associée. Ce dysfonctionnement veineux peut être congénital ou acquis. Il existe deux réseaux veineux du membre inférieur, le réseau veineux profond qui draine 90% du sang veineux et le réseau veineux superficiel constitué par les veines saphènes qui prennent en charge les 10% restants. Ces deux réseaux sont reliés par des veines perforantes. Le système veineux est assuré par trois systèmes successifs : la semelle plantaire de Lejars qui dépend de la statique plantaire et du déroulement du pas, la pompe musculaire du mollet, essentielle et le système abdomino-diaphragmatique . Les veines des membres inférieurs sont pourvues de valvules qui empêchent le reflux.
Trois mécanismes essentiels contribuent à la défaillance du retour veineux, la maladie variqueuse, le syndrome post- thrombotique et l'insuffisance veineuse fonctionnelle. - La maladie variqueuse :
Les varices se définissent comme des veines dont la paroi est pathologique et qui deviennent dilatées et tortueuses avec incontinence valvulaire. Il existe deux types de varices, les varices systématisées, elles sont développées aux dépens des réseaux grande et petite saphènes et les varices non systématisées ou diffuses, dites encore non-saphènes . Les varices peuvent être soit primaires, soit secondaires à une maladie post-phlébitique . Une varice est dite primaire lorsqu'elle survient d'elle-même, sans facteur mécanique causal. Elle est dite secondaire lorsqu'elle survient suite à un autre problème sous-jacent tel une obstruction sur des vaisseaux profonds, servant alors de voie de circulation alternative, un reflux veineux profond suite par exemple à une absence congénitale de valvules veineuses ou à une destruction post-thrombotique, ou plus rarement lors de shunt artério- veineux. L'incontinence des perforantes de cheville joue un rôle fondamental dans l'apparition d'une insuffisance veineuse chronique. Les varices peuvent être fonctionnellement muettes et s'exprimer par un préjudice esthétique ou bien provoquer des signes d'insuffisance veineuse chronique. L'explication véritable est mal appréhendée. Une prédisposition génétique est indiscutable. Les facteurs déclenchant identifiés sont la stase veineuse provoquée entre autres par la grossesse, l'obésité, la constipation, la striction vestimentaire, la sédentarité, la station debout prolongée. Les facteurs alimentaires aggravent la déficience liée au terrain, l'évolution des habitudes alimentaires introduit un déséquilibre qui favorise la peroxydation nocive des membranes cellulaires veineuses.
- Le syndrome post-thrombotique :
La thrombose veineuse peut générer une maladie post- thrombotique, surtout si elle est mal ou insuffisamment traitée. Le mécanisme essentiel en est la destruction valvulaire, source de reflux, avec ou sans obstruction résiduelle. Le risque est particulièrement important en cas de thrombose suro-poplitée . L'obstruction chronique de la veine fémorale commune est également très péjorative.
- l'insuffisance veineuse fonctionnelle :
Ce terme est réservé au retour veineux défaillant avec des veines morphologiquement normales. Cette situation peut être liée à une diminution de la marche, une ankylose tibio- tarsienne, à une perte du volume musculaire, ou encore à une altération de la dynamique cardio-respiratoire. Elle est fréquemment rencontrée chez le sujet âgé.
Il existe d'autres causes d'insuffisances veineuses, mais elles ne représentent qu'une partie infime des causes d'insuffisance veineuse, il s'agit de malformations veineuses ou artério-veineuses , les compressions veineuses extrinsèques chroniques et les dysgénésies valvulaires.
Les signes fonctionnels de l'insuffisance veineuse chronique sont nombreux, fréquents, variés et peu spécifiques comme les jambes lourdes, les crampes, les démangeaisons. Ils sont classiquement aggravés au cours de la journée, après station debout ou assise prolongée, par la chaleur et sont améliorés par le froid, la surélévation des membres inférieurs, l'exercice physique, ou la contention-compression veineuse .
Il existe des signes physiques, ils sont recherchés chez un malade en position debout.
- les signes de stase : l'œdème du pied et les varicosités bleutées de la cheville et de l'arche plantaire ;
- les signes du retentissement tissulaire avec des lésions uniquement cutanées, les dermites purpuriques et pigmentées, l'atrophie blanche de Milian, l'eczéma et avec des lésions cutanées et sous-cutanées, la dermo- hypodermite de stase, la stase lymphatique et enfin des ulcères. L'évolution de l'insuffisance veineuse chronique aboutit à l'ulcère veineux dont les principales caractéristiques sont le caractère indolore, non creusant, le fond humide et le siège péri-malléolaire .
Les complications propres aux varices sont de deux ordres, les complications thrombotiques et hémorragiques. Les complications thrombotiques peuvent être la thrombose veineuse superficielle ou profonde. La thrombose veineuse superficielle survient sur une veine dont la paroi est altérée et se traduit par un cordon rouge induré inflammatoire sur le trajet d'une varice. On doit distinguer les thromboses veineuses superficielles segmentaires dont le potentiel évolutif est banal des thromboses saphènes extensives vers les crosses ou par les veines perforantes avec un risque de thrombose veineuse profonde et d'embolie pulmonaire. Ces thromboses veineuses superficielles sur varices sont à différencier des thromboses veineuses superficielles sur veines saines. La stase veineuse liée aux altérations valvulaires est propice à la survenue de thromboses veineuses profondes. Pour les complications hémorragiques, la rupture d'une ampoule variqueuse est une complication hémorragique classique mais rare des varices. Il convient de la juguler rapidement par une compression locale et une surélévation du membre.
Le diagnostic positif d' insuffisance veineuse chronique est essentiellement clinique. Le diagnostic étiologique et l'importance des lésions en cause sont précisées par des examens complémentaires, en premier lieu l'examen doppler et 1 ' échographie . L'évaluation clinique commence par un interrogatoire. L'examen clinique se fait en position debout, il permet de préciser le caractère systématisé ou non des varices, les complications trophiques, de sélectionner les patients qui nécessitent des explorations complémentaires qui préciseront les indications thérapeutiques. L'examen au Doppler continu est la prolongation de l'examen clinique et permet de mettre en évidence un reflux veineux pathologique (par insuffisance valvulaire ostiale ou tronculaire) , une incontinence de veine perforante. L' échographie permet de visualiser des séquelles de thrombose veineuse (reflux ou obstruction), ou encore une compression veineuse. L' échographie doppler permet donc l'examen complet et détaillé, à la fois morphologique et dynamique, de la circulation veineuse. Il existe d'autres techniques mais elles sont d'indication plus rare, comme la pléthysmographie, la mesure de la pression veineuse ambulatoire, la phlébographie .
La prise en charge thérapeutique de l'insuffisance veineuse est axée dans un premier temps sur le traitement médical puis le traitement chirurgical. La première mesure est de chercher à corriger les facteurs favorisant l'insuffisance veineuse, avoir une activité physique régulière (marche) , éviter la station debout prolongée, réduire un surpoids, éviter les expositions à la chaleur, surélever les pieds du lit (drainage postural lors du sommeil) . La mesure suivante est la contention/compression, il s'agit d'un acte médical. Il consiste en l'application sur un segment de membre d'une pression par un matériel élastique (bandes ou chaussettes, bas, collants) . La compression élastique classique prescrite à l'heure actuelle dans le traitement de l'insuffisance veineuse chronique modérée, importante et sévère, répond au principe de dégressivité : la pression est maximale en cheville puis diminue en remontant vers le mollet et la cuisse, ce principe est utilisé quel que soit le stade de l'insuffisance veineuse. La compression réduit la dilatation des veines et augmente la vitesse d'écoulement du sang veineux. Elle diminue le volume du membre avec un effet anti-œdème et elle améliore l'efficacité de la pompe musculaire du mollet lors de la marche .
Il existe des traitements opératoires, visant à agir directement sur les varices. La sclérothérapie consiste à injecter un produit sclérosant dans une varice. Elle est habituellement réservée à des varices non systématisées ou en complément de la chirurgie d'éveinage. L'éveinage ou le stripping est l'opération traditionnelle pour l'élimination des varices importantes. Les phlébectomies ambulatoires consistent à extraire les varices résiduelles. Et enfin la cryochirurgie qui consiste à la congélation de la veine à 1 ' azote .
Les traitements médicamenteux consistent en deux classes, les traitements anticoagulants qui sont réservés à titre curatif aux thromboses veineuses profondes et aux thromboses veineuses superficielles extensives et à titre préventif lors de circonstances à risque. La seconde classe rassemble les veinotoniques ou phlébotropes , appelés encore veinotropes. La plupart des études montrent que les veinotoniques ont plusieurs grandes activités. La première est une amélioration de la tonicité des parois de la veine. La seconde activité, c'est une diminution de la perméabilité capillaire qui favorise les œdèmes, un troisième effet connu est une activité rhéologique c'est-à-dire que cela améliore la viscosité des globules rouges et donc cela permet une meilleure perfusion, enfin il est souvent rapporté un effet anti-inflammatoire.
Les phlébotropes peuvent être utilisés :
- dès le stade précoce, soit de façon isolée, pour soulager lourdeurs, douleurs, crampes, sensations de gonflement. Soit en association avec la compression. L'hygiène de vie garde bien entendu toute sa place.
- Au stade des varices, avec ou sans altération de la peau et des tissus, ils pourront être utilisés de façon adjuvantes aux traitements opératoires des varices, si les symptômes sont présents ou persistent.
- Au stade d'ulcère veineux, par leur action anti¬ inflammatoire, ils pourraient accélérer la cicatrisation, associés aux traitements locaux, à la compression, et aux traitements opératoires le cas échéant.
Les substances naturelles à activité veinotonique sont issues des classes chimiques suivantes : les flavonoïdes, les antocyanes et proanthocynidines , les saponines et les coumarines .
Les actions pharmacologiques des flavonoïdes sont multiples, un effet anti-œdémateux, une diminution de la perméabilité capillaire, un effet antiphlogistique, une augmentation de la résistance capillaire et une diminution de l'agrégation érythrocytaire . On peut citer comme flavonoïdes à activité phlébotrope, l' hespéridine, la diosmine, la rutine et la toxérutine. Les anthocyanes et proanthocyanidines agissent uniquement par une diminution de la perméabilité capillaire. Les coumarines agissent par diverses actions pharmacologiques, un effet anti-œdémateux, une augmentation de l'activité des macrophages et une augmentation du flux lymphatique, les principales coumarines ayant une activité phlébotrope sont 1' aesculétine, l'aesculine ainsi que les coumarines du mélilot et de l'aspérale odorante. Enfin les saponines, leurs actions pharmacologiques sont un effet anti-œdémateux, une diminution de la perméabilité capillaire et un effet veinotonique. On peut citer comme saponines l'aescine et la ruscine.
La ruscine est isolée à partir du petit houx, Ruscus aculeatus L. de la famille des Liliaceae, appelé aussi fragon, buis piquant, myrte épineux, épine de rat ou houx frelon. Il s'agit d'un sous-arbrisseau ligneux, persistant. Ses fruits sont des baies rouges aux vertus ornementales. La partie de la plante utilisée en usage médical est le rhizome. Les principaux constituants sont des saponosides stéroïdiques , la néoruscine conduisant à la néoruscogénine, le néoruscoside, le ruscoside, la ruscine conduisant à la ruscogénine, les aculéosides A et B. Il existe également d'autres constituants, des stérols, des acides gras, des oses, des huiles essentielles, des dérivés benzofuraniques , des flavonoïdes ... Le mode d'action connu des saponosides passe par une stimulation des récepteurs alpha-adrénergiques post- jonctionnels de la cellule lisse de la paroi vasculaire.
Il est bien connu que les substances stéroliques du Ruscus aculeatus, c'est-à-dire les Ruscogénines et les saponines correspondantes, sont douées de propriétés veinotoniques , et constituent d'ailleurs les principes actifs de diverses spécialités pharmaceutiques.
Actuellement un médicament non soumis à prescription à base de Ruscus, d' hespéridine méthylchalcone et d'acide ascorbique est commercialisé.
Le traitement médical par cet extrait de Ruscus se caractérise par une grande variabilité interindividuelle. De façon surprenante, les inventeurs ont montré qu'un extrait de Ruscus se liait aux récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3 entraînant une réponse fonctionnelle sur la perméabilité. Ainsi en sélectionnant les patients présentant des récepteurs muscariniques, notamment de sous-type Ml et M3, les réponses à l'extrait de Ruscus seront forcément accrues et surtout la variabilité interindividuelle sera largement diminuée .
Malgré la chirurgie relativement efficace, le taux de récidive des ulcères veineux reste élevé. Ceci peut être expliqué au moins en partie par une dysfonction endothéliale au niveau micro-vasculaire qui persiste après la chirurgie.
La fonction endothéliale de micro-vaisseaux cutanés a été étudié chez des patients atteints d' insuffisance veineuse par l'évaluation des débits sanguins par la technique du Doppler (Klonizakis et al., Microvascular Res. 77, 158-162, 2009). Une courbe dose-réponse à 1 ' acétylcholine est comparée chez des volontaires sains en position debout et allongée, et chez des patients ayant subi une chirurgie suite à des varices. En position allongée, les réponses à 1 ' acétylcholine ne sont pas différentes entre les patients et les sujets sains. En revanche, en position debout, la réponse vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine est significativement atténuée chez les patients, révélant une fonction endothéliale altérée. Des résultats équivalents ont été retrouvés dans l'étude publiée par Carrasco et al., (Angiology, 60(6), 763-771, 2009).
Les inventeurs concluent donc que l'extrait de Ruscus agissant comme agonistes sur les récepteurs muscariniques de type Ml, M3 et/ou M5 permettrait de restaurer cette fonction endothéliale altérée. Lors de l'examen clinique relativement habituel chez des patients présentant une insuffisance veineuse, une évaluation par Doppler des réponses vasodilatatrices à 1 ' acétylcholine permettrait de sélectionner les patients qui présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine altérée et donc de leur proposer un traitement adapté à leur besoin. Il est à noter que ce challenge à 1 ' acétylcholine pourrait être remplacé par le carbachol, agoniste des récepteurs muscariniques, 1 ' acétylcholine ayant l'inconvénient d' impacter d'autres familles de récepteurs, nicotiniques en particulier.
Cette évaluation de la réponse fonctionnelle à 1 ' acétylcholine ou au carbachol peut se faire en routine, comme un élément de diagnostic peu invasif et décisionnel pour le traitement avec un extrait de Ruscus.
Dans la présente invention, on entend par réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine altérée, une réponse vasodilatatrice, évaluée en particulier par Doppler, diminuée de plus de 20% par rapport aux conditions standards observées sur une veine saine similaire, c'est-à-dire de même calibre et même positionnement. Préférentiellement , la réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine est diminuée de plus de 30% par rapport aux conditions contrôles. De façon encore préférée, la réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine est diminuée de plus de 50% par rapport aux conditions contrôles.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de Ruscus pour son utilisation comme médicament destiné au traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine altérée.
La présente invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant un extrait de Ruscus comme principe actif et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont la ou les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine ou au carbachol, altérée ; caractérisé en ce que les patients présentent une surexpression des récepteurs muscariniques, notamment des récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3.
Dans un mode particulier, les tissus veineux des patients présentent une surexpression des récepteurs muscariniques, notamment des récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3.
Plus particulièrement encore, il s'agit du tissu des veines saphènes .
Par l'expression « surexpression des récepteurs muscariniques » on entend une surexpression des gènes codant pour ces récepteurs chez ces patients ainsi sélectionnés. Cette surexpression génique entraîne une plus grande quantité de récepteurs muscariniques chez lesdits patients.
Le niveau d'expression de chacun desdits gènes codant pour les récepteurs muscariniques est déterminé par la mesure du niveau d'expression des polypeptides codés par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par la détermination du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui- ci .
Dans un mode de réalisation préféré, la détermination du niveau d'expression de chacun desdits gènes codant pour les récepteurs muscariniques peut être effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique de veine d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction ») , telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip® (AFFYMETRIX) .
Avantageusement, l'analyse de l'expression d'ARNm transcrit de chacun desdits gènes implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR, la réaction en chaîne par la ligase, la réplication de séquences auto- entretenue, le système d'amplification transcriptionnelle . , la « Q-Beta Replicase », la « rolling circle réplication » ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités.
Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d' acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène .
On entend par « surexpression », un niveau d'expression significativement plus élevé du ou des gènes par rapport au niveau d'expression d'un gène de référence du tissus considéré .
De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 50% du niveau d'expression d'au moins un gène de référence, de préférence supérieur à au moins 100% du niveau d'expression d'au moins un gène de référence, et de manière particulièrement préférée supérieur à 150 ~6 au niveau d'expression d'au moins un gène de référence.
Dans un mode de réalisation on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 50% de la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence, de préférence supérieur à au moins 100% de la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence, et de manière particulièrement préférée supérieur à 150% de la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence .
Exprimé sous une autre forme, on entend par surexpression le fait que les gènes des récepteurs muscariniques , en particuliers Ml et M3, sont exprimés 1.5 fois plus que la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence, particulièrement 2 fois plus que la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence, plus particulièrement 2.5 fois plus que la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence, plus particulièrement 3 fois plus que la moyenne du niveau d'expression de deux gènes de référence.
En quantification relative d'expression de gène, l'expression d'un gène cible est exprimée par rapport à un gène de référence d'expression stable sous forme d'un rapport. Ces gènes de référence, appelés également gènes ménagers, ne varient pas dans les tissus étudiés
Lorsque l'on choisit un gène ménager comme référence, on doit choisir un gène dont l'expression est constante dans les conditions expérimentales testées. En fait il est parfois nécessaire de tester un panel de gènes ménagers pour choisir celui ou ceux qui ne sont pas régulés par les conditions expérimentales. L'homme du métier sait choisir le au moins un gène ménager, dans le groupe constitué par Béta 2 microglobuline, Glyceraldéhyde -3-phosphate dehydrogenase, Cyclophilin A ( Peptidylpropyl isomerase A) , Cyclophilin B ( Peptidylpropyl isomerase B) , Ribosomal protein large PO, Succinate dehydrogenase sous unité A, Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, facteur Gamma 1 d'élongation de la traduction, Ubiquitine C.
Dans le cas de la présente invention, le au moins un gène de référence, ou gène ménager, est choisi dans le groupe constitué par Béta 2 microglobuline, Glyceraldéhyde -3- phosphate dehydrogenase, Cyclophilin A (Peptidylpropyl isomerase A) , Cyclophilin B (Peptidylpropyl isomerase B) , Ribosomal protein large PO, Succinate dehydrogenase sous unité A, Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, facteur Gamma 1 d'élongation de la traduction, Ubiquitine C.
De manière préférée, le au moins un gène de référence, ou gène ménager, est choisi dans le groupe constitué par Cyclophilin A (peptidylpropyl isomerase A) et RPLPO (ribosomal protein large PO) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'expression de gène de récepteurs muscariniques , particulièrement Ml et M3, est ainsi normalisée par rapport à l'expression de Cyclophilin A.
Dans un mode de réalisation particulier, l'expression de gène de récepteurs muscariniques, particulièrement Ml et M3, est normalisée par rapport à l'expression de RPLPO.
Dans un mode de réalisation particulier, l'expression de gène de récepteurs muscariniques, particulièrement Ml et M3, est normalisée par rapport à la moyenne de l'expression de Cyclophilin A et de RPLPO.
L'extrait de Ruscus selon la présente invention peut être avantageusement préparé selon le brevet européen EP0112770.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être formulées pour l'administration à l'être humain. Les compositions selon l'invention peuvent être administrées par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale ou bien encore intra-nasale . Dans ce cas le principe actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration sous-cutanée ou transdermique, topique, intramusculaire, intraveineuse, intra-nasale ou intraoculaires , les formes d'administration rectale.
Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange le ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique, la silice ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d' autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.
On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié.
Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillant, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants .
Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylènes glycols.
Pour une administration parentérale (intraveineuse, intramusculaire, intradermique, sous-cutanée) , intra-nasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.
Le principe actif peut également être formulé sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs .
Avantageusement, la composition pharmaceutique selon la présente invention est destinée à une administration par voie orale .
De manière avantageuse, l'extrait de Ruscus de la composition pharmaceutique selon l'invention se lie aux récepteurs muscariniques Ml et/ou M3 et entraîne une réponse fonctionnelle sur la perméabilité accrue.
Il s'en suit que les patients présentant une surexpression des récepteurs muscariniques, en particulier Ml et M3, répondront de manière accrue à la composition pharmaceutique selon l'invention et seront donc plus réceptifs au traitement de l'insuffisance veineuse par cette composition.
De manière particulière, les tissus veineux des patients sélectionnés présentent une surexpression des récepteurs muscariniques, en particulier Ml et M3.
Comme démontré dans les exemples, l'extrait de la composition pharmaceutique selon l'invention agit comme agoniste des récepteurs muscariniques, en particulier les récepteurs Ml et M3, et permet la restauration de la fonction endothéliale altérée et stimule le tonus veineux.
Ainsi, à partir du moment où les patients particuliers sélectionnés selon le profil de surexpression des récepteurs muscariniques, en particulier les récepteurs Ml et/ou M3, présentent une meilleure réponse du fait de l'affinité de l'extrait de Ruscus pour ces récepteurs muscariniques surexprimés, l'effet dudit extrait de Ruscus est potentialisé chez ces patients-là qui sont donc plus susceptibles d'être réceptifs à un traitement de l'insuffisance veineuse par la composition pharmaceutique contenant un extrait de Ruscus selon 1 ' invention .
Le choix des patients présentant une surexpression des récepteurs muscariniques, en particulier Ml et M3, en particulier au niveau des tissus veineux, constitue une sélection bien précise parmi tous les patients susceptibles d'être traités.
Il est effet particulièrement surprenant, et c'est bien là que réside l'invention selon la présente demande, d'envisager que l'extrait de Ruscus de la composition selon l'invention pouvait se liait aux récepteurs muscariniques, pouvait entraîner une réponse fonctionnelle accrue et il n'était donc pas évident d'aller sélectionner les patients ayant le profil génétique tel qu' indiqué dans la présente demande en tant que patients particulièrement réceptifs au traitement de l'insuffisance veineuse par une composition selon la présente invention.
Les résultats obtenus à ce jour, quand bien même ils ne constituent peut-être pas une preuve définitive de l'effet thérapeutique de la composition selon l'invention, en particulier sur la population sélectionnée, ils représentent malgré tout une chance raisonnable de succès du traitement de l'insuffisance veineuse chez les patients dont les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine ou au carbachol, altérée et plus particulièrement encore chez les patients présentant une surexpression des récepteurs muscariniques, en particulier Ml et M3.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 : Mesure d' affinité pour les récepteurs muscariniques
Protocole :
Des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant de façon stable deux sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl et hM3) sont achetées (Perkin Elmer) . Ces différentes membranes sont incubées deux heures dans 20 mM de tampon HEPES (pH 7,4) en présence de 0,2 nM du ligand [3H]N- méthyl-scopolamine en compétition avec l'extrait de Ruscus. La liaison non-spécifique est déterminée en présence de 10 μΜ d'atropine (antagoniste non sélectif des récepteurs muscariniques) .
L'extrait de Ruscus testé est préparé selon le brevet EP
0112770.
Résultats
L'extrait de Ruscus se lie aux récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3 avec des affinités respectives de 61,9 yg/ml et 96,1 yg/ml .
Exemple 2 : couplage fonctionnel des récepteurs muscariniques à la réponse calcigue
Protocole :
Les cellules de l'exemple 1 sont transfectées transitoirement par électroporation (250 mV, 250 yF) avec 10 yg de plasmides contenant les différents sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl, hM3 et hM5) . Ce sont les trois sous-types qui sont couplés à une protéine Gq, M2 et M4 étant couplés à une protéine Gi . Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits. Quarante-huit heures après la transfection, le milieu de culture cellulaire est remplacé par 200 μΐ par puits d'un milieu contenant un indicateur de fluorescence, le Fluo-4. Après deux heures d'incubation dans une enceinte à 37°C, 5% CO2, les plaques 96 puits sont transférées dans un lecteur à fluorescence (ycell, Hamamatsu) . L'appareil transfère 20 μΐ de la microplaque contenant les composés à tester sur les cellules et la lecture de la fluorescence s'effectue chaque seconde durant 3 minutes. La valeur maximale du pic de fluorescence pour chaque concentration testée est utilisée pour déterminer la puissance et l'efficacité du composé. Chaque valeur représente la moyenne de 3 puits, la fluorescence est exprimée en unité arbitraire (Figure 1) .
Produits testés :
- Le carbachol, c'est un agoniste des récepteurs muscariniques , avec une affinité semblable à 1 ' acétylcholine ;
- Un extrait de Ruscus (identique à celui de l'exemple 1) ;
- La Diosmine, un veinotonique, de la famille de flavonoïdes .
- L'atropine, un antagoniste non-sélectif des récepteurs muscariniques .
Résultats
Une forte augmentation de la réponse calcique est mesurée après la distribution du carbachol sur les cellules CHO-K1 exprimant transitoirement soit le récepteur humain muscarinique hMl, hM3 ou hM5 (Figure 1) . Cette réponse est concentration-dépendante. En revanche, la distribution de la diosmine n'induit pas d'augmentation calcique et ce, quelle que soit la concentration testée. La distribution de l'extrait de Ruscus induit une augmentation de la réponse calcique en fonction de la concentration distribuée (Figure 1) . Cette augmentation calcique est retrouvée et mesurée pour les trois sous-types de récepteurs considérés avec des valeurs d'EC5o de 12,5 ± 1,0 yg/ml pour le sous-type hMl, 31,3 ± 2,1 yg/ml pour le sous-type hM3 et 67,8 ± 15,7 yg/ml pour le sous-type hM5. Cette augmentation de la réponse calcique est antagonisée par la pré-incubation de 1 μΜ d'atropine, quel que soit le sous- type de récepteur muscarinique considérée (Figure 1) . Exemple 3 : couplage fonctionnel des récepteurs muscariniques à la réponse du gène rapporteur AP-1
Protocole :
Les cellules de l'exemple 1 sont transfectées transitoirement avec la Lipofectamine Plus selon les recommandations du fournisseur avec 3 yg de plasmides contenant les différents sous-types de récepteurs muscariniques humains (hMl, hM3 et hM5) et 10 yg de plasmides contenant le gène rapporteur AP-1 luciferase. Vingt-quatre heures après la transfection les cellules sont réensemencées dans des plaques 96 puits opaques à la densité, de 20000 cellules par puits. Vingt-quatre heures après, le milieu de culture cellulaire est remplacé par de l'Opti-MEM 1 sans rouge de phénol et mis en présence des composés à tester pour huit heures à 37 °C dans un volume final de 50 μΐ . L'activité luciférase est évaluée avec le kit BriteLite Luciferase selon les instructions du fournisseur. Cinquante μΐ du réactif reconstitué BriteLite sont ajoutés par puits, après cinq minutes d'incubation dans le noir la luminescence est mesurée à l'aide d'un compteur du type TopCount .
Produits testés :
Identiques à ceux de l'exemple 2.
Résultats :
Une forte augmentation de l'activité luciférase est mesurée après la distribution d'un agoniste muscarinique, le carbachol sur les cellules CHO-K1 exprimant transitoirement le gène rapporteur API et soit le récepteur humain muscarinique hMl, hM3 ou hM5 (Figure 2) . Cette réponse est concentration- dépendante. En revanche, la distribution de la diosmine n'induit pas d'augmentation de l'activité luciférase quelle que soit la concentration testée. La distribution de l'extrait de Ruscus induit une augmentation de l'activité luciférase en fonction de la concentration distribuée (Figure 2) . Cette augmentation est mesurée pour les deux-sous types de récepteurs considérés avec des valeurs d'EC5o de 64,8 ± 15,2 yg/ml pour le sous-type hMl et 149,5 ± 14,7 yg/ml pour le sous-type hM3. Cette augmentation de la réponse calcique est antagonisée par la pré-distribution de 1 μΜ d'atropine, antagoniste non-sélectif des récepteurs muscariniques , quel que soit le sous-type de récepteur muscarinique considéré (Figure 2) . Une légère augmentation de l'activité luciférase est mesurée pour le sous-type de récepteur muscarinique hM5, mais elle n'est pas concentration-dépendante.
Exemple 4 : mesure de la perméabilité veineuse sur deux modèles de hamster
Protocole :
Ces études sont effectuées sur la poche de joue de hamsters mâles (Mesocricetus auratus) âgés de 7 à 10 semaines (Bouskela et al., J. cardiovasc. Pharmacol. 24, 281-285, 1994). Les animaux sont traités par voie orale deux fois par jour durant deux semaines avec différentes doses de l'extrait de Ruscus, de diosmine ou de leur placebo (18 animaux par condition) . Le jour de l'expérience, les animaux sont anesthésiés par une injection intra-péritonéale de 0,1-0,2 ml de pentobarbital sodique et maintenus avec de 1 ' D-chloralose (100 mg/kg) administré par la voie fémorale. Pour les expériences, les poches de joue sont disséquées selon la méthode de Duling (Duling, Microvascular Res. 5, 423-429, 1973) modifiée par Svensjô (Svensjô et al., Uppsala J. Med. Sci. 83, 71-79, 1978) . Brièvement, la poche de la joue est retournée et disposée sur une platine de microscope. Une zone d' approximativement 1 cm2 est préparée pour la microscopie de la perméabilité des macromolécules. La poche de la joue est continuellement superfusée avec 5 ml/min avec un tampon HEPES/HC03-. Le pH est maintenu à 7,4 en bullant la solution avec 5% de CO2 et 95% de N2. Trente minutes après cette préparation, une solution de FITC-dextran dans du glucose, marqueur macromoléculaire, est injectée par voie intraveineuse à la dose de 25 mg/100 g. La perméabilité microvasculaire aux macromolécules est quantifiée en comptant le nombre de sites d' extravasation, c'est-à-dire de fuite, du plasma fluorescent, visualisé par le traceur fluorescent dans les veinules post¬ capillaires. Les observations sont effectuées à l'aide d'un microscope Leitz Ortholux avec un objectif 3.5x et un filtre d'excitation de longueur d'onde 490 nm.
- modèle de perméabilité macromoléculaire à l'histamine
La mesure du nombre de sites de « fuite » est effectuée en scannant la zone d'observation avec différents intervalles standardisés, 5 minutes après la dernière application topique d'histamine (2 applications séparées par un intervalle de 35 minutes et une concentration finale de 2 x 10~6 M) . Les sites de « fuite » sont considérés si leur diamètre est supérieur à 100 μΜ. Le nombre de sites de « fuite » est rapporté par centimètre carré. Dans le cas du blocage de l'effet du Ruscus, l'atropine à 0,1 ou 1 μΜ est appliquée au préalable à 1 ' histamine .
- modèle de perméabilité macromoléculaire à l'ischémie
Une ischémie locale de la poche de joue est produite pendant 30 minutes au moyen d'un ballonnet gonflable autour du cou de la poche retournée. Lors de la reperfusion, la perméabilité macromoléculaire est augmentée (Bouskela et al., Br. J. Pharmacol. 122, 1611-1616, 1997).
Résultats :
- modèle de perméabilité macromoléculaire induite par 1 ' histamine
L'extrait de Ruscus donné par voie orale induit une diminution dose-dépendante de la perméabilité au niveau de la joue de hamster induite par l'histamine en application topique (Figure 3a) . Cette perméabilité est mesurée en fuites/cm2 avec 6 animaux par groupe. Cette diminution est complètement abolie en présence d'atropine, quelle que soit la dose d'extrait de Ruscus considérée (Figure 3b) .
- modèle de perméabilité macromoléculaire induite par une ischémie .
Dans ce modèle d'ischémie, la perméabilité est également mesurée en fuites par cm2 avec 6 animaux par groupe. L'extrait de Ruscus donné par voie orale induit également une baisse de la perméabilité au niveau de la joue de hamster, même si le nombre de « fuites » par cm2 est moins important que dans le modèle de perméabilité induite par histamine. Cette diminution est également dose-dépendante (Figure 4a) . La baisse de perméabilité est également réversée en présence d'atropine, de façon dose-dépendante (Figure 4b) . Il convient de noter que cette réversion est plus difficile à obtenir en présence de fortes doses d'extrait de Ruscus.
Exemple 5 : expression des récepteurs muscariniques de veines saphènes issues de patients
Cette étude est réalisée à partir de prélèvements de veines saphènes issus de 5 patients atteints d'insuffisance veineuse. Protocole :
Les prélèvements sont conservés dans 5 mL de RNAlater.
Extraction ARN
Des fragments de 1 cm sont ouverts longitudinalement et nettoyés du sang, ils sont découpés en plus petits morceaux (2 mm) dans du RNAlater. Ils sont ensuite transférés dans des tubes à billes Precellys 24 CK28R, remplis de 800 ylde RNAlater et de béta-mercaptoéthanol à 1%. Le broyage sur Precellys 24 est effectué à 6500 tours/min à 10 °C. Une extraction manuelle est ensuite effectuée avec du RNeasy fibrous tissue mini kit après traitement à la protéinase K et centrifugation afin d'éliminer les débris. L'extraction sur 900 μΐ de surnageant est pratiquée selon le protocole Qiagen avec digestion DNase sur colonne, élution dans 30 μΐ d'eau. La quantification est réalisée sur spectrophotomètre et les ARN sont analysés sur Bioanalyser.
La reverse transcription est effectuée à l'aide du kit Qiagen iscript selon les instructions du fabricant.
Protocole qPCR
La PCR en temps réel quantitative est réalisée sur le ADNc obtenu après reverse transcription de 500 ng d'ARN total, pour chaque échantillon. Les amorces choisies pour amplifier un fragment du gène d' intérêt sont préalablement testées sur des dilutions de ADNc de 10 en 10 pour vérifier leur efficacité.
Préparation de la plaque PCR
La réaction de qPCR se fait dans une plaque 96 puits adaptée au Thermocycler C1000 équipé du « CFX real-time System » dans un volume réactionnel final de 15 μΐ par puits :
- 5 μΐ de ADNc dilué
10 μΐ du mélange réactionnel suivant : du Mix Biorad (qui contient une polymérase et colorant des acides nucléique fluorescents), de l'eau et les amorces.
Des contrôles négatifs sont réalisés sans ADNc pour chaque couple d'amorces. La plaque est couverte ave un adhésif transparent Biorad et centrifugée à 1000 rpm pendant 1 minute pour rassembler les réactifs au fond des puits.
Conditions de la réaction qPCR
La plaque est ensuite placée dans le Themocycler et un protocole adapté et optimisé est appliqué, 1 cycle de 45 secondes à 98°C (activation de l'enzyme), 40 cycles de 2 secondes à 95°C (dénaturation ADN) suivis de 5 secondes à 62°C (hybridation des oligos et extension du brin complémentaire) puis croissance de température de 70°C à 90°C en incrémentant de 0,5°C (courbe de fusion) . Analyse des données
Les données sont sous forme d'unités de fluorescence en fonction des cycles de températures. Elles sont analysées par le logiciel « CFX manager » qui calcule l'expression des gènes d'intérêt normalisée par l'expression de gènes de référence choisis pour leur stabilité. Les courbes de fusion permettent de vérifier la spécificité des amplicons (température de fusion spécifique à une longueur d'amplicon) . Les amplicons sont séquencés sur séquenceur ABI 310 pour vérifier que la séquence correspond bien à celle du gène d'intérêt.
L'expression des 5 sous-types de récepteurs muscariniques hMl à hM5 a donc été mesurée sur 5 cDNA de 5 veines saphènes VS1 à VS5. En parallèle il a été également mesuré l'expression de 2 gènes de référence : Cyclophilin (PPIA = Peptidylpropyl isomerase A) et PO (RPLPO = Ribosomal protein large PO) .
Résultats
Les 5 sous-types de récepteurs sont exprimés dans les veines saphènes pathologiques étudiées. Le sous-type hM3 semble être le plus exprimé. Les inventeurs se sont ensuite focalisés aux sous-types hMl et hM3, sous-types les plus intéressants dans l'activité du ruscus.
La figure 5 représente la quantité relative (normilsée par rapport à la moyenne des deux gènes de référence) d'ARNm pour les sous-types hMl et hM3. En moyenne dans les 5 veines saphènes pathologiques le sous-type hM3 est au moins 2 fois plus exprimé que le sous-type hMl.
Les inventeurs ont alors mesuré l'expression des sous-types hMl et hM3 pour chaque patient pris individuellement. De façon tout à fait inattendue, les inventeurs ont constaté que l'expression de ces sous-types est variable en fonction du patient considéré. La figure 6 résume très bien ce résultat en montrant que le patient 4 exprime beaucoup plus de récepteurs muscariniques des sous-types Ml et dans une moindre mesure M3 que les autres patients. Des résultats préliminaires laissent à penser que le patient 4 présente une meilleure réponse au traitement de son insuffisance veineuse avec la composition selon l'invention. Cependant, à ce jour, le recul nécessaire est insuffisant pour trancher cette conclusion de manière ferme et définitive mais n'en est pas moins riche d'enseignement quant à l'effet thérapeutique de l'extrait sur ce type de patient.

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont la ou les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine ou au carbachol, altérée, et en ce que les patients présentent une surexpression des récepteurs muscariniques , notamment des récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3.
2. Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une insuffisance veineuse chronique des membres inférieures .
3. Extrait de Ruscus aculeatus L. pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse, selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'insuffisance veineuse chronique des membres inférieures provient de maladies variqueuses.
4. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif un extrait de Ruscus aculeatus L. et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament dans le traitement de l'insuffisance veineuse chez des patients dont la ou les veines atteintes présentent une réponse fonctionnelle vasodilatatrice à 1 ' acétylcholine ou au carbachol, altérée et en ce que les patients présentent une surexpression des récepteurs muscariniques, notamment des récepteurs muscariniques de sous-type Ml et M3.
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