WO2016129061A1 - 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents

生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム Download PDF

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秀樹 郷田
健作 高梨
幸祐 権田
憲明 大内
みか 渡邉
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コニカミノルタ株式会社
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    • G06T2207/30242—Counting objects in image

Definitions

  • the present invention relates to a biological substance quantification method, a pathological diagnosis support system, and a program using luminance information of a fluorescent substance.
  • an average luminance value per phosphor particle is calculated by analyzing a luminance distribution peak of a fluorescent emission luminescent spot from a tissue specimen stained with a phosphor that can bind to a biological substance.
  • a method has been proposed in which the number of bright spots in a tissue specimen is measured to increase the quantitative accuracy of the expression level of a biological substance.
  • pathological diagnosis for example, comparison of diagnostic results before and after treatment in the same patient, for example, not only specimens that have simultaneously quantified biological substances, but also quantitative results between various specimens with different operators, measurement systems, and staining conditions It is desirable to be able to compare and evaluate.
  • a main object of the present invention is to provide a biological material quantification method and program capable of accurately quantifying the amount of a specific biological material in a specimen by correcting quantification errors caused by differences in operators and measurement systems. It is in.
  • the invention of the biological material quantification method comprises: In the biological material quantification method for quantifying the expression level of the biological material in a specimen stained with a staining reagent capable of staining a specific biological material using a fluorescent material, A fluorescence image input step of inputting a fluorescence image representing the expression of the biological material in the specimen as a fluorescence bright spot; A fluorescence quantification step of calculating an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescent luminescent spot from the fluorescence image; In a standard specimen in which the expression level of the biological material is measured in advance, a standard fluorescent image representing the expression of the biological substance based on staining under the same conditions as the staining of the specimen is represented by the same conditions as in the fluorescence image input step Standard fluorescence image input process to be input in A standard fluorescence quantification step of calculating an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescent luminescent spot from the standard fluorescence image under the same conditions as the fluorescence quant
  • the invention according to claim 2 is the biological material quantification method according to claim 1,
  • the correlation calculation step create a calibration curve indicating the evaluation value of the fluorescence bright spot of the standard fluorescence image with respect to the expression level of the biological material in the standard specimen
  • the conversion step the evaluation value of the fluorescent luminescent spot of the fluorescent image is converted into the expression level of the biological material in the specimen based on the calibration curve.
  • the invention according to claim 3 is the biological material quantification method according to claim 1 or 2
  • the standard specimen is a cultured cell cultured on a base material.
  • the invention according to claim 4 is the biological material quantification method according to any one of claims 1 to 3,
  • the biological material is a protein.
  • the invention according to claim 5 is the biological material quantification method according to any one of claims 1 to 4,
  • the staining reagent includes fluorescent particles in which a plurality of the fluorescent substances are integrated.
  • a pathological diagnosis support system for quantifying the expression level of the biological material in a specimen stained with a staining reagent capable of staining a specific biological material using a fluorescent material A fluorescence image input means for inputting a fluorescence image representing the expression of the biological material in the specimen as a fluorescence bright spot; Fluorescence quantification means for calculating an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescent luminescent spot from the fluorescence image;
  • a standard fluorescence image representing the expression of the biological substance based on staining under the same conditions as the staining of the specimen is expressed by the same condition as the fluorescence image input means
  • the invention of the program according to claim 7 is: A computer for quantifying the expression level of the biological material in a specimen stained with a staining reagent capable of staining a specific biological material using a fluorescent material; Fluorescence image input means for inputting a fluorescence image representing the expression of the biological material in the specimen as a fluorescent luminescent spot, Fluorescence quantification means for calculating an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescent luminescent spot from the fluorescence image, In a standard specimen in which the expression level of the biological material is measured in advance, a standard fluorescence image representing the expression of the biological substance based on staining under the same conditions as the staining of the specimen is expressed by the same condition as the fluorescence image input means Standard fluorescence image input means to input with, A standard fluorescence quantification means for calculating an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescent luminescent spot from the standard fluorescence image under the same conditions as the fluorescence quantification means, Correlation calculating means for calculating the correlation between the expression
  • the amount of a specific biological substance in a specimen can be accurately quantified.
  • FIG. 5 S4 It is a figure which shows an example of a bright field image. It is a figure which shows the image (cell image) from which the cell area
  • FIG. 1 shows an example of the overall configuration of a pathological diagnosis support system 100 using the biological material quantification method of the present invention.
  • the pathological diagnosis support system 100 includes a specimen to be observed (hereinafter referred to as “target specimen”) stained with a predetermined staining reagent, and a specimen (hereinafter referred to as “standard specimen”) in which a specific biological substance concentration is quantified in advance. And a feature amount that quantitatively expresses the expression of a specific biological substance in the target specimen by analyzing the acquired microscope image.
  • the pathological diagnosis support system 100 is configured by connecting a microscope image acquisition apparatus 1A and an image processing apparatus 2A so as to be able to transmit and receive data via an interface such as a cable 3A.
  • the connection method between the microscope image acquisition device 1A and the image processing device 2A is not particularly limited.
  • the microscope image acquisition device 1A and the image processing device 2A may be connected via a LAN (Local Area Network) or may be configured to be connected wirelessly.
  • LAN Local Area Network
  • the microscope image acquisition apparatus 1A is a known optical microscope with a camera, and acquires a microscope image of a specimen on a slide placed on a slide fixing stage and transmits it to the image processing apparatus 2A.
  • the microscope image acquisition apparatus 1A includes an irradiation unit, an imaging unit, an imaging unit, a communication I / F, and the like.
  • the irradiation means is composed of a light source, a filter, and the like, and irradiates the specimen on the slide placed on the slide fixing stage with light.
  • the imaging means is composed of an eyepiece lens, an objective lens, and the like, and images transmitted light, reflected light, or fluorescence emitted from the specimen on the slide by the irradiated light.
  • the imaging means is a microscope-installed camera that includes a CCD (Charge Coupled Device) sensor and the like, captures an image formed on the imaging surface by the imaging means, and generates digital image data of the microscope image.
  • the communication I / F transmits image data of the generated microscope image to the image processing apparatus 2A.
  • the microscope image acquisition apparatus 1A includes a bright field unit that combines an irradiation unit and an imaging unit suitable for bright field observation, and a fluorescence unit that combines an irradiation unit and an imaging unit suitable for fluorescence observation. It is possible to switch between bright field / fluorescence by switching units.
  • the microscope image acquisition device 1A is not limited to a microscope with a camera.
  • a virtual microscope slide creation device for example, a special table that acquires a microscope image of the entire specimen by scanning a slide on a microscope slide fixing stage. 2002-514319
  • the virtual microscope slide creation device it is possible to acquire image data that allows the entire specimen image on the slide to be viewed at once on the display unit.
  • the image processing apparatus 2A calculates the expression distribution of a specific biological material in the target specimen by analyzing the microscope image transmitted from the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • FIG. 2 shows a functional configuration example of the image processing apparatus 2A.
  • the image processing apparatus 2 ⁇ / b> A includes a control unit 21, an operation unit 22, a display unit 23, a communication I / F 24, a storage unit 25, and the like, and each unit is connected via a bus 26. Yes.
  • the control unit 21 includes a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), and the like.
  • the control unit 21 executes various processes in cooperation with various programs stored in the storage unit 25, and performs image processing 2A. Overall control of the operation.
  • the control unit 21 executes image processing (see steps S4 to S6 in FIG. 5) in cooperation with a program stored in the storage unit 25, and performs a fluorescence determination process, a standard fluorescence determination process, and a correlation calculation process. And a function as means for executing the conversion step.
  • the operation unit 22 includes a keyboard having character input keys, numeric input keys, various function keys, and the like, and a pointing device such as a mouse, and a key pressing signal pressed by the keyboard and an operation signal by the mouse. Are output to the control unit 21 as an input signal.
  • the display unit 23 includes, for example, a monitor such as a CRT (Cathode Ray Tube) or an LCD (Liquid Crystal Display), and displays various screens in accordance with display signal instructions input from the control unit 21.
  • a monitor such as a CRT (Cathode Ray Tube) or an LCD (Liquid Crystal Display)
  • LCD Liquid Crystal Display
  • the communication I / F 24 is an interface for transmitting and receiving data to and from external devices such as the microscope image acquisition device 1A.
  • the communication I / F 24 functions as means for executing a standard fluorescence image input process and a fluorescence image input process.
  • the storage unit 25 includes, for example, an HDD (Hard Disk Drive), a semiconductor nonvolatile memory, or the like. As described above, the storage unit 25 stores various programs, various data, and the like.
  • the image processing apparatus 2A may include a LAN adapter, a router, and the like and be connected to an external device via a communication network such as a LAN.
  • the image processing apparatus 2A in the present embodiment preferably performs analysis using the bright field image and the fluorescence image transmitted from the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • the bright field image is a microscopic image obtained by enlarging and photographing a specimen stained with H (hematoxylin) staining reagent and HE (hematoxylin-eosin) staining reagent in a bright field in the microscope image acquisition apparatus 1A. And it is a cell form image showing the form of the cell in the said specimen.
  • Hematoxylin is a blue-violet pigment that stains cell nuclei, bone tissue, part of cartilage tissue, serous components, etc. (basophilic tissue, etc.).
  • Eosin is a red to pink pigment that stains the cytoplasm, connective tissue of soft tissues, red blood cells, fibrin, endocrine granules, etc. (eosinophilic tissues, etc.).
  • FIG. 3 shows an example of a bright field image obtained by photographing a specimen that has been subjected to HE staining.
  • a fluorescent image is obtained by using a microscope image acquisition apparatus 1A for a specimen stained with a staining reagent containing a fluorescent substance bound with a biological substance recognition site that specifically binds and / or reacts with a specific biological substance. It is a microscope image obtained by irradiating excitation light of a wavelength to emit a fluorescent material (fluorescence) and enlarging and photographing this fluorescence. That is, the fluorescence that appears in the fluorescence image indicates the expression of a specific biological material corresponding to the biological material recognition site in the specimen.
  • FIG. 4 shows an example of the fluorescence image.
  • fluorescent substance examples include fluorescent organic dyes and quantum dots (semiconductor particles). When excited by ultraviolet to near infrared light having a wavelength in the range of 200 to 700 nm, it preferably emits visible to near infrared light having a wavelength in the range of 400 to 1100 nm.
  • fluorescent organic dyes fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecules, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecules, cascade dye molecules, coumarin dyes Examples thereof include dye molecules, eosin dye molecules, NBD dye molecules, pyrene dye molecules, Texas Red dye molecules, and cyanine dye molecules.
  • quantum dots containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or group IV elements as components ("II-VI group quantum dots”, "III-V group quantum dots”, " Or “Group IV quantum dots”). You may use individually or what mixed multiple types.
  • CdSe CdS, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge, but are not limited thereto.
  • a fluorescent substance-containing nanoparticle in which a plurality of fluorescent substances are integrated can be used as a fluorescent substance used as a staining reagent for obtaining a fluorescent image.
  • the fluorescent particles are those in which a fluorescent substance is dispersed inside the nanoparticles, and the fluorescent substance and the nanoparticles themselves may or may not be chemically bonded.
  • the material constituting the nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene, polylactic acid, silica, and melamine.
  • the quantum dot which used the quantum dot as the core and provided the shell on it can also be used as a fluorescent particle.
  • CdSe / ZnS when the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS.
  • CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , Ge / ZnS, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • quantum dots those subjected to surface treatment with an organic polymer or the like may be used as necessary.
  • examples thereof include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen), CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • the fluorescent particles used in the present embodiment can be produced by a known method.
  • the particles of the fluorescent dye are combined with the raw material monomer to synthesize the particles. Any method may be used, such as a method of introducing a fluorescent dye onto a resin and introducing it.
  • polystyrene nanoparticles encapsulating a fluorescent organic dye are described in a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982) or in US Pat. No. 5,326,692 (1992). It can be produced by using an impregnation method of fluorescent organic dye into polystyrene nanoparticles.
  • polymer nanoparticles encapsulating quantum dots can be produced by using the method of impregnating quantum nanoparticles into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology, Vol. 19, page 631 (2001).
  • the average particle diameter of the fluorescent particles used in the present embodiment is not particularly limited, but those having a large particle diameter are difficult to accurately measure because the luminance is easily saturated when a plurality of particles are close to each other. Smaller diameters have a lower integrated luminance value and the fluorescent particle signal is buried in the background noise (camera noise and cell autofluorescence).
  • the average particle size is preferably 40 to 280 nm.
  • the average particle diameter is obtained by measuring the cross-sectional area of a particle from an electron micrograph taken using a scanning electron microscope (SEM) and taking the diameter of the circle when each measured value is the area of the circle as the particle diameter. In the present application, the particle size of 1000 particles was measured, and the arithmetic average was taken as the average particle size.
  • the biological material recognition site is a site that specifically binds and / or reacts with the target biological material.
  • the target biological substance is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the target biological substance exists, but typically, protein (peptide), nucleic acid (oligonucleotide, polynucleotide), antibody, etc. Is mentioned. Accordingly, substances that bind to the target biological substance include antibodies that recognize the protein as an antigen, other proteins that specifically bind to the protein, and nucleic acids having a base sequence that hybridizes to the nucleic acid. Is mentioned.
  • an anti-HER2 antibody that specifically binds to HER2 that is a protein expressed on the cell surface a Ki67 antibody that specifically binds to Ki67 protein that is a marker of cell proliferation expressed in the cell nucleus, and an estrogen that is expressed in the cell nucleus
  • examples thereof include an anti-ER antibody that specifically binds to a receptor (ER), an anti-actin antibody that specifically binds to actin that forms a cytoskeleton, and the like.
  • anti-HER2 antibody, anti-ER antibody, or anti-Ki67 antibody bound to fluorescent particles can be used for breast cancer medication selection and is preferred.
  • antigens examples include M. actin, MS actin, SM actin, ACTH, Alk-1, ⁇ 1-antichymotrypsin, ⁇ 1-antitrypsin, AFP, bcl-2, bcl-6, ⁇ -catenin, BCA 225, CA19-9, CA125 , Calcitonin, calretinin, CD1a, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD15, CD20, CD21, CD23, CD30, CD31, CD34, CD43, CD45, CD45R, CD56, CD57, CD61, CD68, CD79a, "CD99, MIC2 ", CD138, chromogranin, c-KIT, c-MET, collagen type IV, Cox-2, cyclin D1, keratin, cytokeratin (high molecular weight), pankeratin, pankeratin
  • examples of the specific nucleic acid gene that has been pointed out to be associated with a disease can include the following, and probes that recognize each specific nucleic acid gene are available as BAC probes: Can be created based on general knowledge. Specific examples of specific nucleic acid genes are as follows. HER2, TOP2A, HER3, EGFR, P53, MET, etc. are mentioned as genes related to cancer growth and molecular target drug response. Furthermore, the following genes are known as various cancer-related genes. Can be mentioned.
  • Tyrosine kinase-related genes include ALK, FLT3, AXL, FLT4 (VEGFR3, DDR1, FMS (CSF1R), DDR2, EGFR (ERBB1), HER4 (ERBB4), EML4-ALK, IGF1R, EPHA1, INSR, EPHA2, IRR (INSRR) ), EPHA3, KIT, EPHA4, LTK, EPHA5, MER (MERTK), EPHA6, MET, EPHA7, MUSK, EPHA8, NPM1-ALK, EPHB1, PDGFR ⁇ (PDGFRA), EPHB2, PDGFR ⁇ (PDGFRB), EPHEP3, T RON (MST1R), FGFR1, ROS (ROS1), FGFR2, TIE2 (TEK), FGFR3, TRKA (NTRK1), FGFR4, TRKB (NT RK2), FLT1 (VEGFR1), TRKC (NTRK3), and breast cancer-related genes are ATM, BRCA1, BRCA2, BRCA3, CC
  • Cancer-related genes include APC, MSH6, AXIN2, MYH, BMPR1A, p53, DCC, PMS2, KRAS2 (or Ki-ras), PTEN, MLH1, and SMA.
  • MSH2, STK11, MSH6 Lung cancer-related genes include ALK, PTEN, CCND1, RASSF1A, CDKN2A, RB1, EGFR, RET, EML4, ROS1, KRAS2, TP53, MYC.
  • genes include Axin1, MALAT1, b-catenin, p16 INK4A, c-ERBB-2, p53, CTNNB1, RB1, Cyclin D1, SMAD2, EGFR, SMAD4, IGFR2, TCF1, and KRAS.
  • Related genes include Alpha, PRCC, ASPSCR1, PSF, CLTC, TFE3, p54nrb / NONO, and TFEB As thyroid cancer-related genes, AKAP10, NTRK1, and AKA 9, RET, BRAF, TFG, ELE1, TPM3, H4 / D10S170, TPR and the like.
  • Examples of ovarian cancer-related genes include AKT2, MDM2, BCL2, MYC, BRCA1, NCOA4, CDKN2A, p53, ERBB2, PIK3CA, GATA4, RB, HRAS, RET, KRAS, and RNASET2.
  • Examples of prostate cancer-related genes include AR, KLK3, BRCA2, MYC, CDKN1B, NKX3.1, EZH2, p53, GSTP1, and PTEN.
  • Examples of bone tumor-related genes include CDH11, COL12A1, CNBP, OMD, COL1A1, THRAP3, COL4A5, and USP6.
  • the mode of binding between the biological substance recognition site and the fluorescent particles is not particularly limited, and examples thereof include covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding, coordination bonding, physical adsorption, and chemical adsorption.
  • a bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferred from the viewpoint of bond stability.
  • an organic molecule that connects between the biological substance recognition site and the fluorescent particle.
  • a polyethylene glycol chain can be used, and SM (PEG) 12 manufactured by Thermo Scientific can be used.
  • a silane coupling agent that is a compound widely used for bonding an inorganic substance and an organic substance can be used.
  • This silane coupling agent is a compound having an alkoxysilyl group that gives a silanol group by hydrolysis at one end of the molecule and a functional group such as a carboxyl group, an amino group, an epoxy group, an aldehyde group at the other end, Bonding with an inorganic substance through an oxygen atom of the silanol group.
  • silane coupling agent having a polyethylene glycol chain (for example, PEG-silane no. SIM6492.7 manufactured by Gelest), etc. Is mentioned.
  • silane coupling agent you may use 2 or more types together.
  • the obtained fluorescent organic dye-containing nanoparticles are dispersed in pure water, aminopropyltriethoxysilane is added, and the mixture is reacted at room temperature for 12 hours.
  • fluorescent organic dye-containing nanoparticles whose surface is modified with an aminopropyl group can be obtained by centrifugation or filtration.
  • the antibody by reacting an amino group with a carboxyl group in the antibody, the antibody can be bound to the fluorescent organic dye-containing nanoparticles via an amide bond.
  • a condensing agent such as EDC (1-Ethyl-3- [3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride: Pierce (registered trademark) may be used.
  • a linker compound having a site capable of directly binding to the fluorescent organic dye-encapsulated nanoparticles modified with an organic molecule and a site capable of binding to the molecular target substance can be used.
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate: manufactured by Pierce
  • antibody-bound fluorescent organic dye-encapsulated nanoparticles can be produced by binding the amino group of fluorescent organic dye-encapsulated nanoparticles modified with aminopropyltriethoxysilane to the mercapto group in the antibody.
  • the same procedure can be applied regardless of whether the fluorescent substance is a fluorescent organic dye or a quantum dot. That is, by impregnating a polystyrene nanoparticle having a functional group such as an amino group with a fluorescent organic dye or a quantum dot, a fluorescent substance-containing polystyrene nanoparticle having a functional group can be obtained, and thereafter EDC or sulfo-SMCC is used. In this way, antibody-bound fluorescent substance-encapsulated polystyrene nanoparticles can be produced.
  • a method for staining a tissue sample will be described, but a method for preparing a sample to which the staining method described below can be applied is not particularly limited, and a sample prepared by a known method can be used. Further, the application of the quantification method of the present invention is not limited to tissue specimens embedded in paraffin, but can also be applied to specimens such as cells fixed on a substrate.
  • the paraffin-embedded tissue specimen is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
  • the tissue specimen is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Further, if necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • the tissue specimen is immersed in a container containing water to remove ethanol.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Moreover, you may exchange water in the middle of immersion as needed.
  • the activation process of the target biological substance is performed according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer, etc. Can be used.
  • As the heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the temperature can be 50-130 ° C. and the time can be 5-30 minutes.
  • the tissue specimen after the activation treatment is immersed in a container containing PBS (Phosphate Buffered Saline) and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • a PBS dispersion of fluorescent particles combined with biological material recognition sites is placed on a tissue specimen and allowed to react with the target biological material.
  • staining corresponding to various biological materials becomes possible.
  • a PBS dispersion of the respective fluorescent particles may be mixed in advance, or may be separately placed on a tissue specimen sequentially.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less. It is preferable to drop a known blocking agent such as BSA-containing PBS before staining with fluorescent particles.
  • the stained tissue specimen is immersed in a container containing PBS to remove unreacted fluorescent particles.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion. Place the cover glass on the tissue specimen and enclose it. A commercially available encapsulant may be used as necessary.
  • HE dyeing is performed before enclosure with a cover glass.
  • a microscope image (fluorescence image) is acquired for the stained tissue specimen using the microscope image acquisition device 1A.
  • an excitation light source and a fluorescence detection optical filter corresponding to the absorption maximum wavelength and fluorescence wavelength of the fluorescent material used for the staining reagent are selected.
  • tissue stained using a staining reagent containing fluorescent particles bound to a biological material recognition site that recognizes a specific biological material hereinafter referred to as HER2 protein in breast cancer tissue, hereinafter referred to as a specific protein.
  • the sample will be described as an example of the case where a standard sample is a plurality of types of cultured cells cultured on a substrate such as a slide glass that is commercially available.
  • a standard sample is a plurality of types of cultured cells cultured on a substrate such as a slide glass that is commercially available.
  • the present invention is not limited to this. This includes specimens that can bind fluorescent particles, such as biotin and antigen whose concentration conditions are known, to which biological substance recognition sites are bound.
  • the operator quantifies the specific protein concentration from the cultured cells used as the standard specimen in the present embodiment (step S1).
  • the quantification of the specific protein concentration can be performed by any known method such as ELISA, flow cytometry, Western blot, etc., and the specific protein concentration per cell can be calculated.
  • specific protein concentration can be quantified from cells dissolved in a predetermined solution, and according to flow cytometry, laser is applied to cells dispersed in a predetermined solution. By performing light scattering and fluorescence measurement using light, it is possible to detect and quantify biomolecules per cell.
  • the operator selects, as a standard specimen, cultured cells of the same lot that have the same quality as the cultured cells whose specific protein concentration has been quantified.
  • the number of types of standard samples to be selected is arbitrary, but in order to create a calibration curve based on the measurement results of the standard samples and obtain a highly accurate quantitative result, the difference in the specific protein concentration quantified in advance in step S1 is large. It is preferable to use a plurality of types of standard specimens.
  • step S2 the operator prepares a formalin-fixed and paraffin-embedded section of the target specimen and the standard specimen (step S2), and adds fluorescent particles to which the HE staining reagent and the biological material recognition site that recognizes the specific protein are bound.
  • the target specimen and the standard specimen are each stained under the same conditions using two kinds of staining reagents, ie, staining reagents used as fluorescent labeling materials (step S3).
  • Staining under the same conditions means, for example, that one operator performs staining using the same lot of staining reagent, and that the time, temperature and humidity required for each step in staining are substantially constant. It is preferable that one operator sequentially performs the staining operation of the target specimen and the standard specimen in parallel using the same lot of the staining reagent, because the staining conditions can be easily made the same.
  • the fluorescence image and the bright field image are acquired from each of the target specimen and the standard specimen according to the following procedures (a1) to (a5) and input to the image processing apparatus 2A for image analysis. Processing is performed (step S4). Image acquisition and image analysis processing from the target sample and the standard sample are performed under the same conditions.
  • A1 The operator places the target specimen and the standard specimen stained with the HE staining reagent and the staining reagent containing fluorescent particles on the slide, and places the slide on the slide fixing stage of the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • A2 Set to the bright field unit, adjust the imaging magnification and focus, and place the observation target area on the tissue in the field of view.
  • A3 Shooting is performed by the imaging unit to generate bright field image data, and the image data is transmitted to the image processing apparatus 2A.
  • A4) Change the unit to a fluorescent unit.
  • A5) Shooting is performed by the imaging means without changing the field of view and the shooting magnification to generate image data of a fluorescent image, and the image data is transmitted to the image processing apparatus 2A.
  • performing image acquisition and image analysis processing from the target specimen and the standard specimen under the same conditions specifically refers to image acquisition conditions (for example, exposure time, magnification, Fluorescence image and bright-field image with the same white balance, etc.) are acquired, and cell images and bright spot images are extracted with the same threshold and noise processing conditions set in each step shown in FIG. Indicates to do.
  • image acquisition conditions for example, exposure time, magnification, Fluorescence image and bright-field image with the same white balance, etc.
  • Step S4 image analysis processing is executed based on the bright field image and the fluorescence image input from the microscope image acquisition apparatus 1A, and an evaluation value obtained by quantitatively evaluating the fluorescence of the fluorescent bright spot per cell is measured.
  • fluorescent particles are used as a fluorescent labeling material, and the number of fluorescent particles is used as an evaluation value.
  • an integrated value of fluorescent luminance may be used as an evaluation value.
  • FIG. 6 shows a detailed flow of the image analysis process in step S4.
  • the image analysis process shown in FIG. 6 is executed in cooperation with the control unit 21 and a program stored in the storage unit 25.
  • a bright field image is input from the microscope image acquisition apparatus 1A through the communication I / F 24 (step S401)
  • a cell region is extracted from the bright field image (steps S402 to S405).
  • the bright field image is converted into a monochrome image (step S402).
  • FIG. 7A shows an example of a bright field image.
  • binarization processing is performed on the monochrome image using a predetermined threshold (step S403).
  • noise processing is performed (step S404).
  • the noise process can be performed by performing a closing process on the binarized image.
  • the closing process is a process in which the contraction process is performed the same number of times after the expansion process is performed.
  • the expansion process is a process of replacing a target pixel with white when at least one pixel in the range of n ⁇ n pixels (n is an integer of 2 or more) from the target pixel is white.
  • the contraction process is a process of replacing a target pixel with black when at least one pixel in the range of n ⁇ n pixels from the target pixel contains black.
  • FIG. 7B shows an example of an image after noise processing. As shown in FIG. 7B, after the noise processing, an image (cell image) from which the cell region is extracted is generated.
  • the labeling process is a process for identifying an object in an image by assigning the same label (number) to connected pixels. By the labeling process, each cell can be identified from the image after the noise process and a label can be applied.
  • step S406 fluorescence image input process or standard fluorescence image input process
  • step S407 fluorescence determination process or standard fluorescence determination process
  • a color component corresponding to the emission wavelength of the fluorescent bright spot is extracted from the fluorescent image as shown in FIG. 8A (step S407).
  • step S407 for example, when the emission wavelength of the fluorescent particles is 615 nm, only the fluorescent bright spot having the wavelength component is extracted as an image.
  • a binarization process is performed on the extracted image using a predetermined threshold value, and a bright spot image from which a bright spot area is extracted is generated (step S408).
  • FIG. 8B shows an example of the bright spot image. Note that noise elimination processing such as cell autofluorescence and other unnecessary signal components may be performed before binarization processing, and a low-pass filter such as a Gaussian filter or a high-pass filter such as a second derivative is preferably used.
  • step S410 a labeling process is performed, and a label is assigned to each of the extracted bright spot regions.
  • step S410 the number of fluorescent particles per each extracted bright spot region is calculated.
  • the method for calculating the number of fluorescent particles is arbitrary. For example, the number of fluorescent particles is calculated based on the integrated value of luminance in each bright spot region.
  • step S410 addition processing of the cell image (FIG. 7B) and the image from which the bright spot area is extracted (FIG. 8B) is performed (step S411), and the distribution of the bright spot area on the cell is the image processing apparatus.
  • the number is displayed on the display unit 23 of 2A, and the number of fluorescent particles per cell area is calculated (step S412).
  • step S42 After completion of the process of step S412, the process returns to the process of FIG. 5, and the specific protein concentration of each standard specimen measured in step S1 and the number of fluorescent particles per cell of the standard specimen measured in step S4 are respectively shown on the horizontal axis and A distribution chart showing the correlation by plotting on the vertical axis is created, and a calibration curve based on the distribution chart is created (step S5: correlation calculation step). Next, based on the calibration curve created in step S5, the number of fluorescent particles per cell of the target sample calculated in step S4 is converted into a specific protein concentration (step S6: conversion step).
  • the target specimen to be observed and the standard specimen whose specific protein concentration has been measured in advance are prepared by the processing of steps S1 to S2, and the tissue specimen is prepared by the processing of steps S3 to S4.
  • staining and image analysis processing are performed on the standard specimen under the same conditions, and the number of fluorescent particles in the target specimen is converted into a specific protein concentration by the processing in steps S5 to S6.
  • the number of fluorescent particles in the target specimen is converted into the specific protein concentration based on the measurement result of the standard specimen measured under the same conditions. Even when at least one of them is different, the quantitative results of specific proteins can be compared and evaluated.
  • the specific protein amount may be quantified without creating a calibration curve in step S6.
  • the specific protein amount is calculated on the assumption that the ratio between the number of fluorescent particles per cell and the specific protein amount in the standard sample matches the ratio between the fluorescent particle number per cell and the specific protein amount in the target sample. be able to.
  • the specific protein can be quantified even with only one type of standard sample, and the quantification work is facilitated.
  • it is preferable to create a calibration curve based on a plurality of standard samples.
  • the calibration curve when the antigen concentration is plotted on the horizontal axis and the evaluation value of the staining level is plotted on the vertical axis is a sigmoid curve when the antigen concentration (horizontal axis) is displayed in logarithm. It has been. Therefore, in the biological material quantification method of the present invention, the calibration curve created in step S6 in FIG. 5 is preferably one in which the distribution of the evaluation value of antigen concentration and fluorescence approximates a sigmoid curve. Furthermore, it is preferable to make a calibration curve by linearly approximating only a portion having a large slope in the created sigmoid curve. The method for selecting the range for linear approximation is arbitrary, but, for example, only a range of specific protein concentrations where the correlation coefficient of the approximate straight line is a predetermined value or more may be used as the calibration curve.
  • cultured cell specimens used as standard specimens in this embodiment can be easily obtained in large quantities, a large number of samples can be used to reduce the variation in correlation between specific protein concentrations and the number of fluorescent particles. Therefore, it is suitable as a standard specimen used in the present invention.
  • the fluorescent substance used for the staining reagent is described as an example of fluorescent particles in which a plurality of fluorescent substances are accumulated.
  • a fluorescent substance in which a biological substance recognition site is bound to one molecule of the fluorescent substance is used as the staining reagent. It may be used.
  • fluorescent particles have a high fluorescence luminance per particle, so that they are not easily affected by noise caused by the shooting environment such as room ambient light and the performance of the image acquisition device. Not only the value but also the number of fluorescent particles can be measured and quantified.
  • the fluorescent particles hardly cause fading, the fluorescence luminance per particle is not easily affected by the time required for image acquisition (for example, the exposure time of excitation light) and the storage state of the stained specimen. Therefore, when fluorescent particles are used as a staining reagent, there is less error in the fluorescence evaluation value than when a fluorescent material that does not constitute fluorescent particles is used as a staining reagent. There is an advantage that a quantitative result can be obtained. From the above viewpoint, in the present invention, it is preferable to use fluorescent particles as a staining reagent.
  • the number of fluorescent particles per cell is measured in step S5.
  • the number of fluorescent particles per cell nucleus may be measured, or the measurement target.
  • the number of fluorescent particles per area of the image may be measured.
  • each color component is extracted using a filter work or the like in step S507, and the processing of steps S508 to S509 is executed for each extracted color component (wavelength component).
  • the cell image and the color component are extracted. What is necessary is just to add with the fluorescent particle image produced for every.
  • the fluorescent particles may be directly bound to a biological substance recognition site that binds to a specific protein as in the above embodiment, but indirectly through another substance as in the known indirect method in immunostaining. May be combined.
  • the specific antibody after reacting a tissue sample with a primary antibody having a specific protein as an antigen, the specific antibody may be stained by reacting a secondary antibody having the primary antibody as an antigen with fluorescent particles bound thereto.
  • a fluorescent particle modified with streptavidin is reacted with streptavidin.
  • a specific protein may be stained by utilizing the fact that biotin specifically binds to form a complex.
  • an HDD or a semiconductor non-volatile memory is used as a computer-readable medium of the program according to the present invention, but the present invention is not limited to this example.
  • a portable recording medium such as a CD-ROM can be applied.
  • a carrier wave carrier wave is also applied as a medium for providing program data according to the present invention via a communication line.
  • This solution was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer, and then 0.65 g of melamine resin raw material Nicalak MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) was added to this solution.
  • the mixture was centrifuged at 20000 G for 15 minutes in a centrifuge (Kubota Micro Cooling Centrifuge 3740), and after removing the supernatant, ultrapure water was added and ultrasonically irradiated to redisperse. Centrifugation, supernatant removal, and washing by redispersion in ultrapure water were repeated 5 times.
  • the obtained melamine particles were positively charged because the melamine resin itself contains many amino groups in the skeleton.
  • the charge of the resin particles was evaluated by analyzing resin components by NMR, IR, etc. and measuring zeta potential.
  • the obtained nanoparticles 1 were observed with a scanning electron microscope (SEM; Model S-800, manufactured by Hitachi (registered trademark)). As a result, the average particle size was 150 nm and the coefficient of variation was 12%.
  • Step (1) 1 mg of the fluorescent particles 1 was dispersed in 5 mL of pure water. Next, 100 ⁇ L of aminopropyltriethoxysilane aqueous dispersion (LS-3150, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was added and stirred at room temperature for 12 hours. Step (2): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Step (3): Ethanol was added to disperse the sediment, followed by centrifugation again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure. When the FT-IR measurement was performed on the resulting amino group-modified fluorescent particles, absorption derived from the amino group could be observed, confirming that the amino group was modified.
  • Step (2) The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • Step (3) Ethanol was added to disperse the sediment, followed by centrifugation again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the
  • Step (4) The amino group-modified fluorescent particles obtained in step (3) were adjusted to 3 nM using PBS containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • Step (6) The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • Step (7) PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. The washing
  • Step (8) When 100 ⁇ g of anti-Ki67 antibody was dissolved in 100 ⁇ L of PBS, 1 M dithiothreitol (DTT) was added and reacted for 30 minutes.
  • Step (10) Using the fluorescent particles as a starting material, the particle dispersion obtained in step (7) and the reduced anti-Ki67 antibody solution obtained in step (9) were mixed in PBS and allowed to react for 1 hour. .
  • Step (11) 4 ⁇ L of 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction.
  • A-1) Preparation of Target Specimen and Standard Specimen Three spots (a, b, c) were selected from the breast cancer tissue array as target specimens, and fixed, dehydrated, embedded and sliced sections were used.
  • the expression level of Ki67 protein in five types of commercially available cell lines (CRL1500, NDA-MB175, COLO201, Hela, NDA-MB231) was measured using ELISA kit manufactured by Invitrogen (Human HER2 (Total) kit, No. KHO0701), and a cultured cell line of the same lot as the above five types of cultured cell lines was used as a standard specimen.
  • Step (1) The target specimen and the standard specimen were immersed in a container containing xylene for 30 minutes. The xylene was changed three times during the process.
  • Step (2) The target specimen and the standard specimen were immersed in a container containing ethanol for 30 minutes. The ethanol was changed three times during the process.
  • Step (3) The target specimen and the standard specimen were immersed in a container containing water for 30 minutes. The water was changed three times along the way.
  • Step (4) The target specimen and the standard specimen were immersed in a 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 30 minutes.
  • A-3) Acquisition of microscope image Microscope images (bright field image and fluorescence image) were acquired for the target specimen and the standard specimen.
  • an upright microscope Axio Imager M2 manufactured by Carl Zeiss was used, and the objective lens was set to 20 times.
  • excitation light having a wavelength of 580 nm is irradiated with an exposure time of 200 ms to form an image of fluorescence having a wavelength of 610 nm emitted from a tissue section, and a microscope image (image) is captured by a microscope installation camera (monochrome). Data).
  • the camera has a pixel size of 6.4 ⁇ m ⁇ 6.4 ⁇ m, a vertical pixel count of 1040, and a horizontal pixel count of 1388 (imaging area 8.9 mm ⁇ 6.7 mm). Note that the fluorescence images of the target specimen and the standard specimen were acquired by the same operator using the same apparatus under the same conditions almost at the same time.
  • (A-4) Calculation of the number of fluorescent particles per cell
  • the image analysis processing of FIG. 6 is executed on the microscope image of the target specimen and the standard specimen acquired in (A-3), and 1 cell is used as the fluorescence evaluation value.
  • the number of fluorescent particles per unit was calculated.
  • a binarized image is created based on preset upper and lower thresholds, and the bright spot measurement software “G-count” manufactured by J.A. was used to count the number of fluorescent particles. Thereafter, the bright field image acquired in (A-3) and the fluorescence image were superimposed, the number of bright spots in the cell region was calculated, and the number of fluorescent particles per cell in the target specimen and the standard specimen was calculated.
  • the number of fluorescent particles per cell in the target specimen (the number of fluorescent particles / cell) is referred to as Comparative Example 1.
  • A-5 Quantification of expression level of Ki67 protein per cell As shown in FIG. 9, the expression level of Ki67 protein measured in advance from a cultured cell line of the same lot as the standard sample is plotted on the horizontal axis (A-4 A distribution map with the vertical axis representing the number of fluorescent particles per cell in the standard sample calculated in (1) was created, and the created distribution was linearly approximated to create a calibration curve as shown by the dotted line in FIG. Next, using the calibration curve, the number of fluorescent particles per cell in the target specimen was converted to Ki67 protein concentration (ng / ml) per cell in the target specimen, and Example 1 was obtained.
  • Ki67 protein concentration ng / ml
  • the above (A) was used except that a staining reagent diluted with a fluorescent particle concentration of 0.06 nM was used.
  • the number of fluorescent particles per cell in the target specimen and the standard specimen was quantified.
  • the number of fluorescent particles per cell in the target specimen (the number of fluorescent particles / cell) is Comparative Example 2, and the number of fluorescent particles per cell in the target specimen is the Ki67 protein concentration per cell in the target specimen (ng / ml).
  • Example 2 was converted to.
  • As the target specimen among the sections prepared from the three spots (ac) of the breast cancer tissue array described in (A-1) above, for staining and quantification of Ki67 protein concentration in (A) Sections adjacent to each of the three sections used were used.
  • FIG. 9 shows a calibration curve created in the quantitative steps of (A) and (B).
  • the slope of the calibration curve is that the concentration of the fluorescent particles is 0.02 nm. While the time was about 0.69, when the fluorescent particle concentration was 0.06 nm, it was about 1.85, and there was a difference of about three times in the slope.
  • the quantitative results of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 1.
  • the exposure time at the time of acquiring the fluorescent image was about 1 ⁇ 2 times. Even in this case, the quantitative result is 0.85 to 1.08 times, and by performing correction based on the calibration curve using the method of the present invention, the difference in the quantitative result due to the difference in exposure time during fluorescent image acquisition is reduced. did.
  • the present invention is characterized in that a specific biological substance in a tissue specimen can be accurately quantified, and can be particularly suitably used for generating highly accurate pathological diagnosis information.

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Abstract

　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像の蛍光の評価値を算出する蛍光定量工程と、予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像の蛍光の評価値を前記蛍光定量工程と同一条件で算出する標準蛍光定量工程と、前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光の評価値の相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光の評価値を前記生体物質量に換算する工程を有することを特徴とする。

Description

生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム
　本発明は、蛍光物質の輝度情報を用いた生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラムに関する。
　近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質の定量が求められている。特定の生体物質の存在を確認する方法として、当該生体物質に特異的に結合可能な蛍光物質を用いた細胞染色に基づいて組織分析を行う方法が知られている。
　特許文献１では、生体物質に結合可能な蛍光体を用いて染色された組織標本から、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析することで蛍光体一粒子当たりの平均輝度値を算出して、組織標本における輝点数を計測することにより、生体物質の発現量の定量精度を高める方法が提案されている。
特開２０１３－５７６３１号公報
　しかし、組織標本を染色して生体物質量を定量する際には、例えば、染色工程における染色条件（例えば、反応時間、溶媒濃度、温度等）のばらつき、操作者や計測システム（例えば、顕微鏡やカメラ等の計測機器）の違いによって、定量結果に誤差が生じやすいことが一般的に知られている。
　特許文献１に記載の従来手法においても、複数の標本における生体物質の定量結果を比較して解析する場合には、操作者や計測システム等の違いによって、解析結果のばらつきが生じやすいという問題点があった。
　病理診断においては、例えば同一患者における治療前後の診断結果を比較するなど、同時に生体物質の定量を行った標本に限らず、操作者、計測システム、及び染色条件が異なる様々な標本間の定量結果を比較して評価できることが望まれる。
　本発明の主な目的は、操作者や計測システムの違いによって発生する定量の誤差を補正することにより、標本における特定の生体物質の量を正確に定量できる生体物質定量方法及びプログラムを提供することにある。
　上記課題を解決するため、請求項１に記載の生体物質定量方法の発明は、
　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量工程と、
　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力工程と同一条件で入力する標準蛍光画像入力工程と、
　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量工程と同一条件で算出する標準蛍光定量工程と、
　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出工程と、
　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算工程と、
　を有することを特徴とする。
　請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の生体物質定量方法において、
　前記相関関係算出工程において、前記標準標本における前記生体物質の発現量に対する前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値を示す検量線を作成し、
　前記換算工程において、前記検量線に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算することを特徴とする。
　請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の生体物質定量方法において、
　前記標準標本が基材上に培養された培養細胞であることを特徴とする。
　請求項４に記載の発明は、請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
　前記生体物質がタンパク質であることを特徴とする。
　請求項５に記載の発明は、請求項１～４の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
　前記染色試薬が前記蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を含むことを特徴とする。
　請求項６に記載の病理診断支援システムの発明は、
　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量する病理診断支援システムであって、
　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量手段と、
　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力手段と同一条件で入力する標準蛍光画像入力手段と、
　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量手段と同一条件で算出する標準蛍光定量手段と、
　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出手段と、
　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算手段と、
　を備えることを特徴とする。
　請求項７に記載のプログラムの発明は、
　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量するコンピュータを、
　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量手段、
　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力手段と同一条件で入力する標準蛍光画像入力手段、
　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量手段と同一条件で算出する標準蛍光定量手段、
　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出手段、
　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算手段、
　として機能させることを特徴とする。
　本発明によれば、標本内の特定の生体物質の量を正確に定量することができる。
本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。 図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。 明視野画像の一例を示す図である。 蛍光画像の一例を示す図である。 本発明の病理診断支援システムにおける生体物質定量の工程を示すフローチャートである。 図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。 明視野画像の一例を示す図である。 図７Ａの明視野画像から細胞領域が抽出された画像（細胞画像）を示す図である。 蛍光画像の一例を示す図である。 図８Ａの蛍光画像から輝点領域が抽出された画像（輝点画像）を示す図である。 染色試薬の濃度が異なる場合の検量線の例を示す図である。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜病理診断支援システム１００の構成＞
　図１に、本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された、観察対象の標本（以後、「対象標本」と呼ぶ）、及び予め特定の生体物質濃度を定量した標本（以後、「標準標本」と呼ぶ）の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、対象標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
　図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local　Area　Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
　顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の標本の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
　顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge　Coupled　Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
　なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして標本全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の標本全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
　画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、対象標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
　図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
　制御部２１は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像処理（図５のステップＳ４～Ｓ６参照）を実行し、蛍光定量工程、標準蛍光定量工程、相関関係算出工程、及び換算工程を実行する手段としての機能を実現する。
　操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
　表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode　Ray　Tube）やＬＣＤ（Liquid　Crystal　Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。
　通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、標準蛍光画像入力工程及び蛍光画像入力工程を実行する手段として機能する。
　記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
　その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
　本実施の形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
　明視野画像は、Ｈ（ヘマトキシリン）染色試薬、ＨＥ（ヘマトキシリン－エオジン）染色試薬を用いて染色された標本を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤～ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
　蛍光画像は、例えば、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を含む染色試薬を用いて染色された標本に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、標本における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。
＜蛍光画像の取得＞
　ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬及び染色試薬による標本の染色方法も含めて詳細に説明する。
〔蛍光物質〕
　蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００～７００ｎｍの範囲内の波長の紫外～近赤外光により励起されたときに、４００～１１００ｎｍの範囲内の波長の可視～近赤外光の発光を示すことが好ましい。
　蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa　Fluor（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Texas　Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
　具体的には、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、及びAlexa　Fluor　350、Alexa　Fluor　405、Alexa　Fluor　430、Alexa　Fluor　488、Alexa　Fluor　500、Alexa　Fluor　514、Alexa　Fluor　532、Alexa　Fluor　546、Alexa　Fluor　555、Alexa　Fluor　568、Alexa　Fluor　594、Alexa　Fluor　610、Alexa　Fluor　633、Alexa　Fluor　635、Alexa　Fluor　647、Alexa　Fluor　660、Alexa　Fluor　680、Alexa　Fluor　700、Alexa　Fluor　750、BODIPY　FL、BODIPY　TMR、BODIPY　493／503、BODIPY　530／550、BODIPY　558／568、BODIPY　564／570、BODIPY　576／589、BODIPY　581／591、BODIPY　630／650、BODIPY　650／665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　量子ドットとしては、II－VI族化合物、III－V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II－VI族量子ドット」、「III－V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
　本実施の形態において、蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質は、蛍光物質が複数集積された蛍光物質内包ナノ粒子（以下、蛍光粒子と呼ぶ）を用いることができる。蛍光粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。
　また、量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを蛍光粒子として用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
　本実施の形態で用いられる蛍光粒子は、公知の方法により作製することが可能であり、ナノ粒子への蛍光色素の内包には、原料であるモノマーに蛍光色素の分子を結合させて粒子を合成する方法、樹脂に蛍光色素を吸着させて導入する方法などいかなる方法を用いても構わない。
　例えば、蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
　また、例えば、量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
　本実施の形態で用いられる蛍光粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒子径が大きいものは、複数の粒子が近接している時に輝度が飽和しやすいため正確に計測しにくく、また、粒子径が小さいものは輝度積算値が低く蛍光粒子の信号がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれてしまうことなどから、平均粒径は４０～２８０ｎｍが好適である。
　平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影した電子顕微鏡写真から粒子の断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径とする。本願においては、１０００個の粒子の粒径を計測し、その算術平均を平均粒径とした。
〔生体物質認識部位と蛍光粒子との結合〕
　本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に発現するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に発現する細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７タンパク質に特異的に結合するＫｉ６７抗体、細胞核に発現するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体、等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＥＲ抗体又は抗Ｋｉ６７抗体を蛍光粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
　特定抗原としては以下を例示することができ、各抗原を認識する抗体はさまざまな抗体メーカーから入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。例示としてM.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA　225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99、MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン　タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン　5/6、サイトケラチン　7、サイトケラチン　8、サイトケラチン8/18、サイトケラチン　14、サイトケラチン　19、サイトケラチン　20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン　A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc抗原、HBs抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV-I、HSV-II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパL鎖、Ki67、ラムダL鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27(Kip1)、p53、p53、P63、PAX5、PLAP、ニューモシスティスカリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal　Cell　Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70が挙げられる。
　目的とする生体物質が核酸の場合、病気との関連が指摘されている特定核酸遺伝子としては以下を例示することができ、各特定核酸遺伝子を認識するプローブは、BACプローブとして入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。具体的な特定核酸遺伝子の例示は以下の通り。癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴなどが挙げられ、さらに、各種癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１－ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２（ｏｒ　Ｋｉ－ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６　ＩＮＫ４Ａ、ｃ－ＥＲＢＢ－２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥＴ、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。
　生体物質認識部位と蛍光粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
　また、生体物質認識部位と蛍光粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Thermo　Scientific社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。
　例えば、蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Gelest社製PEG-silane　no．SIM6492.7）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
　蛍光有機色素内包ナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包ナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包ナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、EDC（1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide　Hydrochloride：Pierce（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。
　必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCC（Sulfosuccinimidyl　４［N-maleimidomethyl］-cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包ナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包ナノ粒子ができる。
　蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDC又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
〔染色方法〕
　以下、組織標本の染色方法について述べるが、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
　また、本発明の定量方法の適用はパラフィン包埋された組織標本に限定されるものではなく、基板上に固定した細胞等の標本にも適用可能である。
　１）脱パラフィン工程
　パラフィン包埋された組織標本を、キシレンを入れた容器に浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　２）賦活化処理
　公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％　尿素、０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０－１３０℃、時間は５－３０分で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳ（Phosphate　Buffered　Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の組織標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　３）生体物質認識部位が結合された蛍光粒子を用いた染色
　生体物質認識部位が結合された蛍光粒子のＰＢＳ分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光粒子のＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　蛍光粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
　なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にＨＥ染色を行う。
〔蛍光画像の取得〕
　染色した組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
＜病理診断支援システム１００の動作＞
　以下、病理診断支援システム１００を用いて生体物質の定量（上記説明した染色、画像の取得及び解析を含む）を行う動作について、図５のフローチャートを用いて説明する。ここでは、特定の生体物質（ここでは、乳癌組織におけるＨＥＲ２タンパク質とする。以下、特定タンパク質と呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を対象標本とし、市販されているスライドガラス等の基材上に培養された複数種類の培養細胞を標準標本とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではなく、生体物質の濃度条件が把握されたビオチンや抗原など、生体物質認識部位が結合した蛍光粒子の結合可能な標本を含む。
　まず、操作者は、本実施の形態において標準標本として用いる培養細胞から、特定タンパク質濃度を定量する（ステップＳ１）。特定タンパク質濃度の定量は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット等、周知の任意の方法により行うことができ、１細胞当たりの特定タンパク質濃度が算出可能である。なお、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによれば、所定の溶液中に溶解した細胞から特定タンパク質濃度を定量可能であり、また、フローサイトメトリーによれば、所定の溶液中に分散させた細胞に対してレーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、１細胞当たりの生体分子の検出や定量が可能である。
　操作者は特定タンパク質濃度を定量した培養細胞と均一な品質である同一ロットの培養細胞を標準標本として選択する。選択する標準標本の種類数は任意であるが、標準標本の計測結果に基づく検量線を作成して精度の高い定量結果を得るために、ステップＳ１において予め定量された特定タンパク質濃度の差が大きな、複数種類の標準標本を用いることが好ましい。
　続いて、操作者は、対象標本及び標準標本を、ホルマリン固定及びパラフィン包埋した切片を準備（ステップＳ２）し、ＨＥ染色試薬と、特定タンパク質を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を蛍光標識材料とした染色試薬の、２種の染色試薬を用いて、対象標本及び標準標本をそれぞれ同一条件で染色する（ステップＳ３）。
　同一条件で染色するとは、例えば、一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて染色を行い、かつ、染色における各工程の所要時間及び温度及び湿度がほぼ一定であることを示す。一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて、対象標本及び標準標本の染色作業を並行して順次行うこととすれば、染色条件を容易に同一にすることができるため好ましい。
　その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、下記（ａ１）～（ａ５）の手順により、対象標本及び標準標本のそれぞれから、蛍光画像及び明視野画像を取得して画像処理装置２Ａに入力し、画像解析処理を行う（ステップＳ４）。対象標本及び標準標本からの画像取得及び画像解析処理は、それぞれ同一条件で行うものとする。
（ａ１）操作者は、ＨＥ染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された対象標本及び標準標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
　なお、対象標本及び標準標本からの画像取得及び画像解析処理を同一条件で行うとは、具体的には、同一の顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、画像取得条件（例えば、露光時間、倍率、ホワイトバランス、等）を同一に設定した蛍光画像及び明視野画像を取得し、図６に示される各工程で設定される閾値やノイズ処理条件を同一に設定して細胞画像及び輝点画像を抽出することを示す。
　画像処理装置２Ａにおいて、顕微鏡画像取得装置１Ａから入力された明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行され、１細胞当たりの蛍光輝点の蛍光を定量的に評価した評価値が計測される（ステップＳ４）。本実施の形態では、蛍光粒子を蛍光標識材料として用いて、蛍光粒子数を評価値とするが、例えば、蛍光輝度の積算値を評価値としても良い。
　図６に、ステップＳ４における画像解析処理の詳細フローを示す。図６に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
　まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ４０１）、明視野画像から細胞領域の抽出が行われる（ステップＳ４０２～ステップＳ４０５）。
　細胞領域の抽出においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる（ステップＳ４０２）。図７Ａに、明視野画像の一例を示す。
　次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて二値化処理が施される（ステップＳ４０３）。
　次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ４０４）。ノイズ処理は、具体的には、二値化処理された画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７Ｂに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図７Ｂに示すように、ノイズ処理後には、細胞領域が抽出された画像（細胞画像）が生成される。
　次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ４０５）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞を識別してラベルを付与することができる。
　一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ４０６：蛍光画像入力工程又は標準蛍光画像入力工程）、蛍光画像から蛍光粒子が存在する領域を示す輝点領域が抽出され、輝点領域内の蛍光粒子数が算出される（ステップＳ４０７～ステップＳ４１０：蛍光定量工程又は標準蛍光定量工程）。
　まず、図８Ａに示されるような蛍光画像から蛍光輝点の発光波長に応じた色成分が抽出される（ステップＳ４０７）。
　ステップＳ４０７では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が６１５ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。次いで、抽出された画像に予め定められた閾値を用いて二値化処理が施され、輝点領域が抽出された輝点画像が生成される（ステップＳ４０８）。図８Ｂに、輝点画像の一例を示す。
　なお、二値化処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
　次いで、ラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ４０９）。
　次いで、抽出された各輝点領域当たりの蛍光粒子数が算出される（ステップＳ４１０）。蛍光粒子数の算出方法は任意であり、例えば、各輝点領域内の輝度の積算値に基づいて蛍光粒子数を算出する。
　ステップＳ４１０の処理の終了後、細胞画像（図７Ｂ）と輝点領域が抽出された画像（図８Ｂ）の加算処理が行われ（ステップＳ４１１）、細胞上における輝点領域の分布が画像処理装置２Ａの表示部２３に表示されて、細胞領域当たりの蛍光粒子数が算出される（ステップＳ４１２）。
　ステップＳ４１２の処理の終了後、図５の処理に戻り、ステップＳ１で測定された各標準標本の特定タンパク質濃度及びステップＳ４で計測された標準標本の１細胞当たりの蛍光粒子数をそれぞれ横軸及び縦軸にプロットして相関関係を示した分布図を作成し、当該分布図に基づく検量線が作成される（ステップＳ５：相関関係算出工程）。
　次いで、ステップＳ５で作成された検量線に基づいて、ステップＳ４で算出された対象標本の１細胞当たりの蛍光粒子数が特定タンパク質濃度に換算される（ステップＳ６：換算工程）。
　以上の本実施の形態によれば、ステップＳ１～Ｓ２の処理により、観察対象である対象標本及び予め特定タンパク質濃度が測定された標準標本が準備され、ステップＳ３～ステップＳ４の処理により、組織標本及び標準標本に対して同一条件で染色及び画像解析処理を行い、ステップＳ５～Ｓ６の処理により、対象標本における蛍光粒子数が特定タンパク質濃度に換算されるようになっている。このように、同一条件で計測された標準標本の計測結果に基づいて、対象標本における蛍光粒子数が特定タンパク質濃度に換算されることにより、操作者又は病理診断支援システム１００の構成、及び測定条件のうち少なくとも１つが異なる場合であっても、特定タンパク質の定量結果を比較して評価することができる。
　なお、本実施の形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
　例えば、ステップＳ６において検量線を作成することなく特定タンパク質量を定量しても良い。例えば、標準標本における１細胞当たりの蛍光粒子数と特定タンパク質量の比と、対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数と特定タンパク質量の比とが一致すると仮定して、特定タンパク質量を算出することができる。これにより、標準標本が１種類のみでも特定タンパク質が定量可能であり、定量作業が容易となる。但し、特定タンパク質の定量の精度を考慮すると、複数の標準標本に基づいた検量線を作成することが好ましい。
　一般的に、免疫染色において、抗原濃度を横軸、染色レベルの評価値を縦軸にプロットした場合の検量線は、抗原濃度（横軸）を対数で表示すると、シグモイド曲線となることが知られている。従って、本発明の生体物質定量方法において、図５のステップＳ６で作成する検量線としては、抗原濃度と蛍光の評価値の分布をシグモイド曲線に近似したものが好ましい。さらに、作成したシグモイド曲線の中で、傾きが大きい部分のみを直線近似して検量線とすることが好ましい。直線近似する範囲の選択方法は任意であるが、例えば、近似直線の相関係数が所定の値以上となる特定タンパク質濃度の範囲のみを検量線として用いても良い。
　また、本実施の形態において標準標本として用いた培養細胞の標本は、均質のものを多量に得やすいことから、多くのサンプルを用いて特定タンパク質濃度及び蛍光粒子数の相関のばらつきを減らして正確な定量結果を得ることができるため、本発明で用いる標準標本として好適である。
　また、本実施の形態において、染色試薬に用いられる蛍光物質は、蛍光物質が複数集積した蛍光粒子を例として説明したが、蛍光物質１分子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬に用いても良い。
　しかし、蛍光粒子は、一粒子当たりの蛍光輝度が大きいため、部屋の環境光等の撮影環境に起因するノイズや、画像取得装置の性能の影響を受けにくく、また、蛍光画像から、蛍光の輝度値だけでなく蛍光粒子の数を計測して定量可能である。また、蛍光粒子は褪色を起こしにくいため、１粒子当たりの蛍光輝度は、画像の取得に要した時間（例えば、励起光の露光時間）や染色した標本の保存状態の影響を受けにくい。従って、蛍光粒子を染色試薬として用いた場合は、蛍光粒子を構成していない蛍光物質を染色試薬として用いた場合と比較して、蛍光の評価値の誤差がより少ないため、精度の高い生体物質定量結果を得ることができるという利点がある。以上のような観点から、本発明においては、蛍光粒子を染色試薬として用いることが好ましい。
　また、本実施の形態では、ステップＳ５において、１細胞当たりの蛍光粒子数を計測することとしたが、例えば、１細胞核当たりの蛍光粒子数を計測しても良いし、また、計測対象とする画像の面積当たりの蛍光粒子数を計測することとしても良い。
　また、本実施の形態では、１種の特定タンパク質のみを対象としたが、複数の特定タンパク質に対し、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光物質を用いてもよい。
　かかる場合、ステップＳ５０７においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分（波長成分）ごとにステップＳ５０８～Ｓ５０９の処理を実行し、ステップＳ５１１において、細胞画像と色成分毎に作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。
　また、蛍光粒子は、特定タンパクに結合する生体物質認識部位に、上記実施形態のように直接結合されても良いが、免疫染色における公知の間接法のように、別の物質を介して間接的に結合されても良い。例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体を反応させた後、一次抗体を抗原とする二次抗体に蛍光粒子を結合したものを反応させて特定タンパクを染色しても良い。また、例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体及び、一次抗体を抗原とするビオチン化二次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光粒子を反応させて、ストレプトアビジンとビオチンが特異的に結合して複合体を形成することを利用して、特定タンパクを染色しても良い。
　また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
　その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
　以下の確認実験１及び２は、組織標本内のＫｉ６７タンパク質の染色において、染色条件（染色試薬の濃度）及び画像取得条件（励起光（蛍光）の露光時間）を意図的に変えた場合の、従来の方法による定量結果（比較例）及び、比較例の定量結果を本発明の方法により補正した定量結果（実施例）を示す。
＜確認実験１＞
（Ａ）蛍光粒子濃度が０．０２ｎＭの染色試薬を用いた定量
（Ａ－０）染色試薬の作製
［蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製］
　蛍光色素として赤色発光色素であるSulfo　Rhodamine　１０１（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
　さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
　具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。
　得られたナノ粒子１を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ－８００型）で観察したところ、平均粒径は１５０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
［蛍光粒子への抗体の結合］
　下記工程（１）～（１２）の方法により、蛍光粒子に対して抗Ｋｉ６７抗体を結合させた。
　工程（１）：１ｍｇの蛍光粒子１を純水５ｍＬに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（ＬＳ－３１５０、信越化学工業社製）１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
　工程（２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたアミノ基修飾した蛍光粒子のＦＴ－ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
　工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾した蛍光粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した。
　工程（５）：工程（４）で調整した溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol」ester）を混合し、１時間反応させた。
　工程（６）：反応混合液を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させた。
　工程（８）：抗Ｋｉ６７抗体１００μｇを１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液を得た。
　工程（１０）：蛍光粒子を出発原料として工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１１）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光粒子を得た。
（Ａ－１）対象標本及び標準標本の準備
　対象標本として、乳癌組織アレイから３つのスポット（ａ、ｂ、ｃ）を選択し、固定、脱水、包埋、薄切した切片を用いた。
　標準標本としては、市販の５種類の培養細胞株（ＣＲＬ１５００、ＮＤＡ－ＭＢ１７５、ＣＯＬＯ２０１、Ｈｅｌａ、ＮＤＡ－ＭＢ２３１）のＫｉ６７タンパク質の発現量を、インビトロジェン社製のＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ　ＨＥＲ２（Ｔｏｔａｌ）ｋｉｔ，Ｎｏ．ＫＨＯ０７０１）を用いて測定し、上記の５種類の培養細胞株と同一ロットの培養細胞株を標準標本とした。
（Ａ－２）蛍光粒子を用いた組織染色
　続いて、対象標本及び標準標本を、下記工程（１）～（１１）の工程によって免疫染色した。なお、対象標本及び標準標本の免疫染色は、同一の操作者が並行して作業することにより、ほぼ同時に、同一条件で行った。
　工程（１）：キシレンを入れた容器に対象標本及び標準標本を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
　工程（２）：エタノールを入れた容器に対象標本及び標準標本を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
　工程（３）：水を入れた容器に対象標本及び標準標本を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
　工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対象標本及び標準標本を３０分浸漬させた。
　工程（５）：１２１度で１０分オートクレーブ処理を行った。
　工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の対象標本及び標準標本を３０分浸漬させた。
　工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを対象標本及び標準標本に載せて、１時間放置した。
　工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで蛍光粒子濃度０．０２ｎＭに希釈した染色試薬を、それぞれ対象標本及び標準標本に載せて３時間放置した。
　工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の対象標本及び標準標本をそれぞれ３０分浸漬させた。
　工程（１０）：４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン染色を行った。
　工程（１１）：Merck　Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
（Ａ－３）顕微鏡画像の取得
　対象標本及び標準標本について、顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を取得した。
　顕微鏡として、カールツアイス社製正立顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｉｍａｇｅｒ　Ｍ２を用い、対物レンズを２０倍に設定した。蛍光画像の取得にあたっては、５８０ｎｍの波長を有する励起光を露光時間２００ｍｓで照射して、組織切片から発せられる６１０ｎｍの波長を有する蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ（モノクロ）により顕微鏡画像（画像データ）を取得した。上記カメラは画素サイズ６．４μｍ×６．４μｍ、縦画素数１０４０個、横画素数１３８８個（撮像領域８．９ｍｍ×６．７ｍｍ）を有している。
　なお、対象標本及び標準標本の蛍光画像は、同一の操作者が同一の装置を用いて、ほぼ同時に、同一条件で取得した。
（Ａ－４）１細胞当たりの蛍光粒子数の算出
　（Ａ－３）で取得した対象標本及び標準標本の顕微鏡画像に、図６の画像解析処理を実行し、蛍光の評価値として、１細胞当たりの蛍光粒子数を算出した。蛍光粒子数の算出は、予め設定された上限閾値および下限閾値に基づいて２値化画像を作成し、作成された２値化画像から、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフト「Ｇ－ｃｏｕｎｔ」を用いて蛍光粒子数を計測した。その後、（Ａ－３）で取得した明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせ、細胞領域内の輝点数を算出して、対象標本及び標準標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を算出した。対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数（蛍光粒子数／細胞）を、比較例１とする。
（Ａ－５）１細胞当たりのＫｉ６７タンパク質発現量の定量
　図９に示されるように、標準標本と同一ロットの培養細胞株から予め計測されたＫｉ６７タンパク質の発現量を横軸、（Ａ－４）で算出した標準標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を縦軸とした分布図を作成し、作成した分布を線形近似して、図９において点線で示されるような検量線を作成した。次いで、当該検量線を用いて、対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を、対象標本における１細胞当たりのＫｉ６７タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）に換算して実施例１とした。
（Ｂ）蛍光粒子濃度が０．０６ｎＭの染色試薬を用いた定量
　上記（Ａ－２）の工程（８）において、蛍光粒子濃度を０．０６ｎＭに希釈した染色試薬を用いた他は上記（Ａ）と同じ工程によって、対象標本及び標準標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を定量した。対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数（蛍光粒子数／細胞）を、比較例２とし、対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を対象標本における１細胞当たりのＫｉ６７タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）に換算したものを実施例２とした。
　なお、対象標本としては、上記（Ａ－１）に記載されている乳癌組織アレイの３つのスポット（ａ～ｃ）から作成された切片のうち、（Ａ）で染色及びＫｉ６７タンパク質濃度の定量に用いた３つの切片にそれぞれ隣接した切片を用いた。
（Ｃ）染色試薬濃度を変えた場合の定量結果の比較
　図９に、上記（Ａ）及び（Ｂ）の定量工程において作成された検量線を示す。５種類の標準標本において、ＥＬＩＳＡ法によって定量されたＫｉ６７タンパク質濃度に対する蛍光画像から算出された蛍光粒子数を線形近似して検量線とすると、検量線の傾きは、蛍光粒子濃度が０．０２ｎｍの時は約０．６９であったのに対し、蛍光粒子濃度が０．０６ｎｍの時は約１．８５であり、傾きに約３倍の差があった。
　実施例１、２及び比較例１、２の定量結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　検量線を用いた補正を行わない従来の定量方法によって１細胞当たりの蛍光粒子数を定量結果として算出した比較例１及び２によれば、ａ～ｃのいずれのスポットにおいても、染色試薬中の蛍光粒子濃度が約３倍になると、定量結果は約２．４～３．１倍の差が生じた。
　一方、本発明の方法によって、図９の検量線を用いて蛍光粒子数をタンパク質濃度に換算した実施例１及び２によれば、蛍光粒子濃度が約３倍になった場合でも、定量結果は０．７７～０．９４倍であり、本発明の方法で検量線に基づく補正を行うことにより、染色試薬の濃度差に伴う定量結果の差が減少した。
＜確認実験２＞
（Ｄ）蛍光画像取得時の露光時間が１００ｍｓの場合の定量
　上記（Ａ－１）（Ａ－２）で準備及び染色した標本を用いて、上記（Ａ－３）において、励起光の露光時間を１００ｍｓにした他は上記（Ａ－３）～（Ａ－５）と同じ工程によって、対象標本及び標準標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を定量した。対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数（蛍光粒子数／細胞）を、比較例３とし、対象標本における１細胞当たりの蛍光粒子数を対象標本における１細胞当たりのＫｉ６７タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）に換算したものを実施例３とした。
　実施例１と３、及び比較例１と３における定量結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　検量線を用いた補正を行わない従来の定量方法によって１細胞当たりの蛍光粒子数を算出した比較例１及び３によれば、ａ～ｃのいずれのスポットにおいても、蛍光画像取得時の露光時間が約１／２倍になると、定量結果は約０．５～０．５７倍となった。
　一方、本発明の方法によって、確認実験１と同様に検量線を用いて蛍光粒子数をタンパク質濃度に換算した実施例１及び３によれば、蛍光画像取得時の露光時間が約１／２倍になった場合でも、定量結果は０．８５～１．０８倍であり、本発明の方法で検量線に基づく補正を行うことにより、蛍光画像取得時の露光時間差に伴う定量結果の差が減少した。
　本発明は、組織標本内の特定の生体物質を正確に定量できることを特徴とし、高精度な病理診断情報の生成に特に好適に利用することができる。
　１Ａ　　顕微鏡画像取得装置
　２Ａ　　画像処理装置
　３Ａ　　ケーブル
　２１　　制御部（蛍光定量手段、標準蛍光定量手段、相関関係算出手段、換算手段）
　２２　　操作部
　２３　　表示部
　２４　　通信Ｉ／Ｆ（蛍光画像入力手段、標準蛍光画像入力手段）
　２５　　記憶部
　２６　　バス
　１００　病理診断支援システム

Claims (7)

  1. 　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
    　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
    　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量工程と、
    　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力工程と同一条件で入力する標準蛍光画像入力工程と、
    　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量工程と同一条件で算出する標準蛍光定量工程と、
    　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出工程と、
    　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算工程と、
    　を有することを特徴とする生体物質定量方法。
  2. 　前記相関関係算出工程において、前記標準標本における前記生体物質の発現量に対する前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値を示す検量線を作成し、
    　前記換算工程において、前記検量線に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算することを特徴とする請求項１に記載の生体物質定量方法。
  3. 　前記標準標本が基材上に培養された培養細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体物質定量方法。
  4. 　前記生体物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１～３の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  5. 　前記染色試薬が前記蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を含むことを特徴とする請求項１～４の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  6. 　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量する病理診断支援システムであって、
    　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
    　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量手段と、
    　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力手段と同一条件で入力する標準蛍光画像入力手段と、
    　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量手段と同一条件で算出する標準蛍光定量手段と、
    　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出手段と、
    　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算手段と、
    　を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
  7. 　蛍光物質を用いて特定の生体物質を染色可能な染色試薬により染色された標本における前記生体物質の発現量を定量するコンピュータを、
    　前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
    　前記蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を算出する蛍光定量手段、
    　予め前記生体物質の発現量が計測された標準標本において、前記標本の染色と同一条件の染色に基づく前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す標準蛍光画像を、前記蛍光画像入力手段と同一条件で入力する標準蛍光画像入力手段、
    　前記標準蛍光画像から前記蛍光輝点を定量的に評価した評価値を前記蛍光定量手段と同一条件で算出する標準蛍光定量手段、
    　前記標準標本における前記生体物質の発現量及び前記標準蛍光画像の蛍光輝点の評価値の相関関係を算出する相関関係算出手段、
    　前記相関関係に基づいて、前記蛍光画像の蛍光輝点の評価値を前記標本における前記生体物質の発現量に換算する換算手段、
    　として機能させることを特徴とするプログラム。
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