WO2016114341A1 - 多能性細胞識別化合物 - Google Patents

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    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a compound used for selectively removing pluripotent cells from a cell sample containing pluripotent stem cells and cells differentiated from the pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells such as human embryonic stem (ES) cells (Non-patent document 1) and induced pluripotent stem (iPS) cells (Non-patent document 2) proliferate indefinitely and differentiate into various cell types. Therefore, it is expected as a material for regenerative medicine.
  • ES human embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • Non-patent document 2 proliferate indefinitely and differentiate into various cell types. Therefore, it is expected as a material for regenerative medicine.
  • safety concerns have been raised by the occurrence of teratomas in animal models when transplanted with cell samples containing small amounts of undifferentiated cells. It is therefore necessary to remove such undifferentiated cells, ie cells that retain pluripotency.
  • Non-patent Document 3 For such detection of human pluripotent stem cells, antibodies against SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen 4) have been widely used (Non-patent Document 3).
  • SSEA-4 stage-specific embryonic antigen 4
  • the inventors of the present invention have conducted intensive research on compounds that selectively cause pluripotent cells to die, and as a result, the polyphenylalanine derivative can selectively kill only pluripotent stem cells. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • a method for removing pluripotent cells comprising a step of contacting a compound represented by a target cell population.
  • the method according to [1] wherein the compound is a compound represented by the formula (I), wherein R 1 is a naphthyl group and m is 1.
  • a kit for removing pluripotent cells containing the represented compound [6] The kit according to [5], wherein the compound is a compound represented by formula (I), wherein R 1 is a naphthyl group and m is 1. [7] The kit according to [6], wherein the compound is a compound represented by formula (I), wherein n is 3.
  • the polyphenylalanine derivative since the polyphenylalanine derivative has an action of killing pluripotent cells, it can be applied to removing pluripotent cells contained from the target cell group.
  • Figure 1 shows that D-3 was contacted with 201B7 or cardiomyocyte for 1 hour (1h) or 2 hours (2h) and then cultured in Stemfit (upper left figure) and StemPro (upper right figure) for 1 day. It is a graph which shows the survival rate of a cell.
  • the normal cell line NHDF Normal human dermal fibroblasts
  • HS-5 normal human marrow stroma cell
  • the vertical axis represents the cell viability calculated from the result of the same experiment conducted without contacting D-3 as 100%.
  • FIG. 2 is a graph showing the survival rate of cells cultured for 1 day in Stemfit (upper figure) and DMEM (lower figure) after contacting D-3 with 1231A3 for 1 hour (1 h) or 2 hours (2 h).
  • the vertical axis represents the cell viability calculated from the result of the same experiment conducted without contacting D-3 as 100%.
  • Figure 3 shows that after contacting phosphatase inhibitor and D-3 (inhibitor ⁇ + D-3), phosphatase inhibitor (inhibitor), and D-3 for 1 hour (1h) to 201B7 (top) or 1231A3 (bottom) It is a graph which shows the survival rate of the cell cultured for 1 day.
  • FIG. 4 shows a histogram after staining each cell with TRA-1-60 antibody (upper figure) or SSEA-4 antibody (lower figure).
  • the figure on the left shows the result of cells cultured for 1 day after contact with D-3 (201B7d16) for 1 hour (1h) after inducing differentiation of 201B7, and the center figure shows the cells after differentiation induction of 201B7 (201B7d16). ) And the right figure shows the result of 201B7.
  • the numbers indicate the content of TRA-1-60 positive cells (upper figure) or SSEA-4 positive cells (lower figure).
  • FIG 5 shows a dot plot of the results of FACS measurement after staining each cell with TRA-1-60 antibody.
  • the upper figure is the result of cells cultured for 23 hours after contacting naturally differentiated 201B7 (201B7 is cultured with Stemfit without bFGF for 16 days) with D-3, and the lower figure is the result of spontaneously differentiated 201B7 (201B7d16) It is.
  • the figure on the right side of the lower figure shows the result of staining the cells after inducing differentiation of 201B7 with IgG as isotype control.
  • the numbers indicate the content of TRA-1-60 positive cells (upper right diagram, upper left diagram, lower left diagram) or false positive cell content (lower right diagram).
  • Figure 6 shows cells mixed with 201B7 and 201B7 after induction of differentiation (201B7d16) after contact with D-3, 24 hours (24h), 8 hours (8h), 4 hours (4h), 2 hours (2h) ), Or cells cultured for 1 hour (1 h), or cells mixed with 201B7 and 201B7d16 (control) are stained with TRA-1-60 antibody, and a histogram of the results of FACS measurement is shown. In the figure, the numbers indicate the content of TRA-1-60 positive cells.
  • Fig. 7 shows 24 hours (24h), 8 hours (8h), 4 hours (4h), and 2 hours (2h) after contacting cells mixed with 1231A3 and 1231A3 after induction of differentiation (1231A3d18) with D-3.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the anti-iPS cell effect of a diphenylalanine-based phosphor D peptide.
  • D-1 has two phenylalanines and D3 has three phenylalanines.
  • D-7 further has glycine as a linker between naphthyl group and triphenylalanine as compared to D-3.
  • FIG. 10 is a graph showing the mortality when three iPS cell lines (201B7, 1231A, and 1383D7) were treated with different concentrations of D-3 for 1 to 4 hours. The top two panels compare the toxicity to 201B7 with different cell concentrations and different colony sizes.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the anti-iPS cell effect of a diphenylalanine-based phosphor D peptide.
  • D-1 has two phenylalanines and D3 has three phenylalanines.
  • D-7 further has glycine as a linker between naph
  • FIG. 11 is a graph showing that 201B7 can be removed at a stage close to confluence by iterative processing using D-3.
  • the graph shows the survival rate of 201B7 after each day treatment with D-3 compared to a control with daily media change.
  • 201B7 was seeded at different concentrations to form small colonies, large colonies, and near confluent stages.
  • NHDF cells were used as a control and treated with the same D-3 every day.
  • FIG. 12 shows normal skin fibroblasts (NHDF), human primary hepatocytes, human primary renal proximal tubular epithelial cells, spontaneously differentiated 201B7, 201B7-derived neurons, and 201B7, where D-3 is a non-iPS sputum cell It is a graph which shows that there is almost no toxicity with respect to the derived cardiac muscle cell.
  • FIG. 13 shows that D-3 is also toxic to human ES cells (khES1).
  • FIG. 14 is a graph comparing the toxicity of D-3 and commercially available anti-iPS cell substance rBC2LCN-PE23 to 201B7, showing that D-3 is more potent than rBC2LCN-PE23.
  • FIG. 15 shows that the toxicity of D-3 is related to the amount of P-ALP mRNA introduced into the cells (ALPP in Fig. 15 represents the same as P-ALP).
  • FIG. 16 shows that iPS cells mixed in differentiated cell groups were successfully removed by using D-3. 201B7-derived cardiomyocytes expressing 201B7 and MHY6-EGFP were analyzed by flow cytometry after culturing with 400 ⁇ D-3 for 1 hour or without such culturing. Untreated 201B7 and untreated cardiomyocytes were used as controls.
  • FIG. 17 shows that a small amount of differentiated cells was successfully purified from a cell group containing a large amount of iPS cells and a small amount of differentiated cells by repeated treatment with D-3.
  • FIG. 18 shows that the remaining iPS cells were successfully removed from the 201B7 differentiation-resistant clones that had been naturally differentiated for 15 days using D-3.
  • FIG. 19 shows that by using D-3, the remaining iPS cells were successfully removed from the co-culture of iPS cells and differentiated cells.
  • staining indicating the presence of iPS cells is visible
  • the lower left, lower right showing samples that have been treated with D-3, as well as the upper without iPS cells.
  • the presence of iPS cells cannot be confirmed.
  • the present invention is directed to formula (I): (Wherein R 1 is an aryl group or a heteroaryl group, m is an integer of 1 to 6, and n is an integer of 2 or more) or formula (II): Wherein R 1 is an aryl group or a heteroaryl group, R 2 is an alanine residue or a glycine residue, m is an integer of 1 to 6, and n is an integer of 2 or more.
  • a method for removing pluripotent cells, or a kit for removing pluripotent cells containing the polyphenylalanine derivative, comprising the step of contacting the represented polyphenylalanine derivative with a target cell population.
  • the aryl group means a monovalent 6-carbon monocyclic, 10-carbon bicyclic, or 14-carbon tricyclic aromatic ring system.
  • Examples of the aryl group include, but are not limited to, a phenyl group, a naphthyl group, and an anthracenyl group.
  • a heteroaryl group is a monovalent aromatic 5- to 8-membered monocyclic system or 8- to 12-membered bicyclic system having one or more heteroatoms (such as O, N, S, or Se). Or an 11-14 membered tricyclic system.
  • the heteroaryl group include a pyridyl group, a furyl group, an imidazolyl group, a benzimidazolyl group, a pyrimidinyl group, a thienyl group, a quinolinyl group, an indolyl group, and a thiazolyl group.
  • an aryl group as used herein includes both substituted and unsubstituted moieties.
  • substituted refers to one or more substituents, which can be the same or different, each replacing a hydrogen atom.
  • substituents include halogen groups (eg, F, Cl, Br, I), hydroxyl groups, amino groups, cyano groups, nitro groups, mercapto groups, alkoxycarbonyl groups, acyloxy groups, amide groups, carboxy groups, alkanes.
  • Cycloalkyl groups, cycloalkenyl groups, heterocycloalkyl groups, heterocycloalkenyl groups, aryl groups, and heteroaryl groups can be fused together.
  • the substituent can be a protecting group during the synthesis process.
  • protecting group refers to a group or moiety used to protect or mask functionality that causes unwanted reactions during process steps. The protecting group prevents the reaction in the process but can then be removed to reveal the original functionality. Examples of protecting groups include trimethylsilyl group (TES), tert-butyloxycarbonyl group (tBoc), benzyloxycarbonyl group (CBZ), 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc). Not exclusively.
  • a preferred polyphenylalanine derivative is represented by the formula (III) in which R 1 in the formula (I) is a naphthyl group and m is 1. It is a compound represented by these.
  • a more preferable polyphenylalanine derivative is a compound in which n in the formula (III) is 3.
  • the alanine residue, glycine residue, phenylalanine residue and O-phospho-D-tyrosine contained in the polyphenylalanine derivative of the present invention may be D-form or L-form and are not easily decomposed. In view of the above, the D form is preferred.
  • the polyphenylalanine derivative of the present invention can be synthesized by appropriately using an amino acid or a carboxylic acid by a known solid phase peptide synthesis method.
  • pluripotent cells have the property of being capable of differentiating into all cells present in a living body, and are alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1 A cell that is positive for at least one marker gene of the group consisting of -60 and TRA-1-81.
  • Pluripotent cells include pluripotent stem cells.
  • the target cell population is not particularly limited as long as it is a cell population that may contain pluripotent cells, and examples thereof include a cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • a pluripotent stem cell has pluripotency that can be differentiated into all cells present in a living body, and also has a proliferation ability.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (“ntES cells”), germ stem cells (“GS cells”), embryonic germ cells (“EG cells”), and induced pluripotent stem (iPS) cells, but are not limited to these.
  • Examples of preferred pluripotent stem cells include ES cells, ntES cells, and iPS cells.
  • Embryonic stem cells ES cells are stem cells established from the inner cell mass of early embryos (for example, blastocysts) of mammals such as humans and mice, and have pluripotency and proliferation ability by self-replication. .
  • ES cells are embryonic stem cells derived from the inner cell mass of blastocysts, which are embryos after the 8-cell stage and morula stage of fertilized eggs, the ability to differentiate into any cell that constitutes an adult, so-called differentiation It has pluripotency and proliferation ability by self-replication.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (M. J. Evans and M. H. Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were established in primates such as humans and monkeys. (J. A. Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; J. A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; and J. A. Thomson and V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast that is a feeder cell. Further, maintenance of cells by subculture can be performed using a medium supplemented with substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • human ES cells use DMEM / F-12 medium supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / ml bFGF at 37 ° C. It can be maintained in a 5% CO2 wet atmosphere.
  • ES cells need to be passaged every 3 to 4 days. At this time, passage is performed, for example, 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. It can be performed using collagenase IV.
  • ES cells can be selected using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • the expression of gene markers such as OCT-3 / 4, NANOG, etc. can be detected by Real-Time PCR, or cell surface antigens SSEA-3, SSEA-4, TRA-1 -60, TRA-1-81 can be detected by immunostaining (Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444: 481-485).
  • Germ stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various lineages, and have the property of producing chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts, for example (M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003)). Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012). Germ stem cells can self-replicate in a medium containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and can be obtained by repeated passage under the same culture conditions as ES cells. (Masatake Takebayashi et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), pages 41-46, Yodosha (Tokyo, Japan)).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells. In the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor Can be established by culturing primordial germ cells in (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
  • iPS Artificial pluripotent stem cells introduce a specific nuclear reprogramming substance into a somatic cell in the form of DNA or protein, or contain the nuclear reprogramming substance by the drug. It is an artificial stem cell derived from a somatic cell that has almost the same characteristics as ES cells, such as pluripotency of differentiation and proliferation ability by self-replication, which can be produced by increasing the expression of sex mRNA and protein ( K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917- 1920; M.
  • the nuclear reprogramming substance is not particularly limited as long as it is a gene specifically expressed in ES cells, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, or a gene product thereof.
  • Nucleotide sequences of mouse and human cDNA of each nuclear reprogramming substance and amino acid sequence information of the protein encoded by the cDNA can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666.
  • mouse and human cDNA and amino acid sequence information of L-Myc, Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg, and Glis1 can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively.
  • a person skilled in the art can prepare a desired nuclear reprogramming substance by a conventional method based on the cDNA sequence or amino acid sequence information.
  • nuclear reprogramming substances may be introduced into somatic cells in the form of proteins, for example, by lipofection, binding to cell membrane permeable peptides, microinjection, or in the form of DNA, for example, You may introduce
  • retrovirus vectors As viral vectors, retrovirus vectors, lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009) and the like.
  • artificial chromosome vectors include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • Vectors can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites, and the like.
  • the promoter used include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV- A TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter or the like is used.
  • EF1 ⁇ promoter CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • selectable marker sequences such as drug resistance genes (for example, kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene; green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase ( GUS), FLAG and other reporter gene sequences;
  • the above vector contains a LoxP sequence before and after the gene or promoter encoding the nuclear reprogramming substance and the gene encoding the nuclear reprogramming substance that binds to it. You may have.
  • transposons include, for example, piggyBac, a transposon derived from lepidopterous insects (Kaji, KaK. Et al., (2009), Nature, 458: 771-775; Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770; WO 2010/012077).
  • vectors can be replicated without chromosomal integration and exist in episomes so that they can be the origin of lymphotropic herpesvirus (lymphotrophic ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ herpes virus), BK virus or bovine papillomavirus (Bovine papillomavirus) It may contain a sequence related to the replication. Examples include EBNA-1 and oriP sequences, or Large T and SV40ori sequences (WO 2009/115295, WO 2009/157201, and WO 2009/149233).
  • an expression vector for polycistronic expression may be used.
  • the gene coding sequence may be linked by an IRES or foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A coding region (Science, 322: 949-953, 2008 and WO 2009/092042 2009/152529).
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • MC1293, M344 small molecule inhibitors
  • siRNA and shRNA against HDAC eg, HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 (OriGene) etc.
  • DNA methyltransferase inhibitors eg 5'-azacytidine
  • G9a histone Methyltransferase inhibitors eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology), etc.) ) Nucleic acid expression inhibitors etc.
  • L -channel calcium agonist eg Bayk8644
  • p53 inhibitors eg siRNA and shRNA against p53
  • Wnt Signaling activator eg soluble Wnt3a
  • growth factors such as LIF or bFGF, ALK5 inhibitor (eg SB431542) (Nat.
  • Drugs used to increase the expression of the nuclear reprogramming endogenous protein include 6-bromoindirubin-3′-oxime, indirubin-5-nitro-3′-oxime, valproic acid, 2- (3- ( 6-methylpyridin-2-yl) -1H-pyrazol-4-yl) -1,5-naphthyridine, 1- (4-methylphenyl) -2- (4,5,6,7-tetrahydro-2-imino -3 (2H) -benzothiazolyl) ethanone, HBr (pifthrin-alpha), prostaglandin J2, prostaglandin E2, etc. are exemplified (WO 2010/068955).
  • a medium for inducing iPS cells for example, (1) DMEM, DMEM / F12 or DME medium containing 10 to 15% FBS (in addition to these mediums, LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine) , (2) ES cell medium containing bFGF or SCF, for example, mouse ES cell medium (for example, TX-WES medium, Thrombo X) ) Or primate ES cell culture medium (for example, primate (human & monkey) ES cell culture medium (Reprocell, Kyoto, Japan), mTeSR-1), and the like.
  • a somatic cell and a nuclear reprogramming substance are brought into contact with each other in a DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Culture for ⁇ 7 days then re-spread cells onto feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and bFGF-containing primate ES cells approximately 10 days after contact between somatic cells and nuclear reprogramming substance
  • the cells can be cultured in a working medium to generate ES cell-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • the cells may be cultured under conditions of an oxygen concentration as low as 5-10%.
  • somatic cells can be used on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.) in 10% FBS-containing DMEM medium (including LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained), and ES-like colonies can be formed after about 25 to about 30 days or more from the culture.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS-containing DMEM medium including LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.
  • the medium is replaced with a fresh medium once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • a marker gene-expressing cell When a gene containing a drug resistance gene is used as a marker gene, a marker gene-expressing cell can be selected by culturing in a medium (selective medium) containing the corresponding drug.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • the marker gene-expressing cells can be obtained by observing with a fluorescence microscope, by adding a luminescent substrate in the case of a luminescent enzyme gene, and by adding a chromogenic substrate in the case of a chromogenic enzyme gene. Can be detected.
  • a “somatic cell” may be any cell other than a germ cell derived from a mammal (eg, human, mouse, monkey, pig, rat, etc.), for example, keratinized epithelial cell (Eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, adrenal medullary cells), cells for metabolism and storage (Eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelial cells (eg, vascular endothelial cells) in the inner chain, and ciliated cells that are capable of transporting (Eg, airway epithelial cells), extracellular matrix secreting cells (eg, fibroblasts), contractile cells (eg, smooth muscle cells), blood and immune system cells (e
  • the degree of cell differentiation and the age of the animal from which the cells are collected there is no particular limitation on the degree of cell differentiation and the age of the animal from which the cells are collected. This can be applied to both undifferentiated progenitor cells (including somatic stem cells) and finally differentiated mature cells. It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the mammal individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • E Cloned embryo-derived ES cells obtained by nuclear transfer nt ES cells are cloned embryo-derived ES cells produced by nuclear transfer technology and have almost the same characteristics as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007) , Nature, 450: 497-502).
  • an ES cell established from an inner cell mass of a clonal embryo-derived blastocyst obtained by substituting the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell is an nt ES (nuclear transfer ES) cell.
  • nt ES nuclear transfer ES
  • a combination of nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used ( Wakayama Seika et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), pages 47-52).
  • reprogramming can be performed by injecting a somatic cell nucleus into an enucleated unfertilized egg of a mammal and culturing it for several hours.
  • (F) Fusion stem cell A stem cell that has the same pluripotency as a fused ES cell by fusing a somatic cell and an egg or ES cell, and also has a gene unique to the somatic cell (Tada M et al. al. Curr Biol. 11: 1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26; 309 (5739): 1369-73).
  • differentiation induction from pluripotent stem cells is not only induced to differentiate into specific organ cells and their precursor cells, but also includes a wide range of cell types such as endoderm cells, mesoderm cells, and ectoderm cells. Including inducing differentiation into a cell population comprising.
  • organ cells include cells contained in skin, blood vessels, cornea, kidney, heart, liver, umbilical cord, intestine, nerve, lung, placenta, pancreas, brain, extremities, and retina. It is not limited. Any differentiation induction method obvious to those skilled in the art can be used.
  • Examples include the method for inducing differentiation into neural stem cells described in JP-A-2002-291469 or WO2011 / 019092, the method for inducing differentiation into pancreatic stem-like cells described in JP-A-2004-121165, and JP 2003-505006 And the method for inducing differentiation into hematopoietic cells described in the above, and the method for inducing differentiation into cardiomyocytes described in WO2014 / 185358. Furthermore, examples of the differentiation induction method by formation of embryoid bodies include the methods described in JP-T-2003-523766.
  • the polyphenylalanine derivative of the present invention can be removed by adding to a culture solution of a target cell population to induce cell death of pluripotent cells contained in the target cell population.
  • the contact time between the target cell population and the polyphenylalanine derivative is not particularly limited, and examples thereof include 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours.
  • the concentration of the polyphenylalanine derivative in the culture solution is not particularly limited, but examples thereof include 100 ⁇ M to 1 mM, more preferably 200 ⁇ M, 300 ⁇ M, or 400 ⁇ M.
  • Human iPS cells (MYH6-EIP4-201B7) were prepared by introducing an EGFP cassette (MYH6-EIP4) operably linked to the MYH6 promoter into the 201B7.
  • the MYH6-EIP4-introduced iPS cell line was prepared by introducing a vector operably linked to the EGFP cassette downstream of MYH (myosin heavy chain) -promoter into 201B7 using the PiggyBac transposon system.
  • ⁇ Cardiomyocyte cell line> The myocardial cell line was treated with CTK solution (ReproCELL) for 2 minutes after removing MYH6-EIP4-201B7, then treated with Accumax (Innovative Cell Technologies) for 5 minutes, and then dissociated into single cells by pipetting. .
  • Cells are collected by centrifugation and transferred to a low adhesion 6 well dish (Corning), 2 mM L-Glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid (sigma), 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M monothioglycerol (MTG) and 2 ng EBs were formed by culturing in 1.5 ml / well STEMPRO 34 (Invitrogen) supplemented with / mL BMP4 (R & D) at 37 ° C. under 5% oxygen condition.
  • STEMPRO 34 Invitrogen
  • the obtained EB was washed with IMDM (Invitrogen), and 1% L-Glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid, 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M MTG, 10 ng / mL VEGF and 1 ⁇ M IWP-3 were added.
  • STEMPRO 34 was added to the dish and cultured at 37 ° C. under 5% oxygen for 4 days.
  • the medium was changed to STEMPRO 34 supplemented with 1% L-Glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid, 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M MTG, 10 ng / mL VEGF and 5 ng / mL bFGF for 4 days, 37
  • the cells were cultured at 5 ° C. and 5% oxygen. At this time, the medium was replaced once every two days with the same conditions. Subsequently, the cells were cultured for 8 days while changing to a medium with the same conditions once every two days at normal oxygen concentration, and EGFP-positive cells were isolated using FACS using EGFP as a substitute for MYH-6 as an index. Used as a cardiomyocyte cell line.
  • D-1 and D-3 were prepared by a solid-phase peptide synthesis method described in Ottinger, E.A., et al., Biochemistry, 32, 1993. Specifically, 2-chlorotrityl chloride resin, N-Fmoc-protected amino acids, and 2-Naphthaleneacetic acid were converted to N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) and O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium- It was synthesized by activation with hexafluoro-phosphate (HBTU).
  • DIPEA N-diisopropylethylamine
  • HBTU hexafluoro-phosphate
  • O-phospho-D-tyrosine is synthesized by reacting D-tyrosine and phosphorus pentoxide overnight in the presence of phosphoric acid according to the method described in Alewood, P. F., et al., Synthesis, 30-31 1983. did. N-Fmoc-O-phospho-D-tyrosine dissolves O-phospho-D-tyrosine and Fmoc-OSu in a 1: 1 mixture of water and CH3CN, and adds Et3N to adjust the pH to 8 ⁇ Obtained by adjusting to 9 and reacting for 30 minutes (Ottinger, EA, et al., Biochemistry, 32, 1993).
  • 201B7 cells were seeded on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor on a 24 well plate coated with laminin to give 2 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) (day 0). After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit, and the culture was continued for 24 hours. Alternatively, 1 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) cardiomyocyte cell line was seeded and cultured in StemPro (Life Technologies) for 1 day. Subsequently, 0 ⁇ M, 200 ⁇ M, 300 ⁇ M, or 400 ⁇ M of D-3 was added to the culture solution, and cultured for 1 hour or 2 hours.
  • the medium was replaced with a medium containing no D-3, and after culturing for 1 day, cell death was evaluated by WST-1 assay, and the cell viability was calculated as compared with the case where 0 ⁇ M D-3 was added. As a result, it was confirmed that 201B7 caused cell death when 300 ⁇ M or more of D-3 was added to the culture medium and cultured for 1 hour or longer (FIG. 1). On the other hand, the cardiomyocyte cell line was not found to be cytotoxic by D-3. These results suggest that D-3 causes cell death specifically in pluripotent stem cells.
  • D-3 0 ⁇ M, 200 ⁇ M, 300 ⁇ M, or 400 ⁇ M D-3 was added to NHDF (normal human dermal fibroblasts) or HS5 (normal human medullary matrix cells) and cultured for 1 hour or 2 hours. The medium was replaced with a medium containing no D-3, and after culturing for 1 day, cell death was evaluated by the WST-1 assay. As a result, no cytotoxicity due to D-3 was found for any of the cells.
  • NHDF normal human dermal fibroblasts
  • HS5 normal human medullary matrix cells
  • 1231A3 cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor on a 24 well plate coated with laminin (day 0). After 24 hours, the cells were cultured in Stemfit or DMEM (Life Technologies) for 1 day. 0 ⁇ M, 200 ⁇ M, 300 ⁇ M or 400 ⁇ M D-1 or 0 ⁇ M, 200 ⁇ M, 300 ⁇ M or 400 ⁇ M D-3 was added to the culture and cultured for 1 hour or 2 hours. Subsequently, the medium was replaced with a medium that did not contain D-1 and D-3.
  • the WST-1 assay was used to compare with cells without addition of D-1 or D-3 (0 ⁇ M). Each cell viability was calculated. As a result, it was confirmed that D-3 was not affected by the medium and exhibited toxicity to pluripotent stem cells (FIG. 2).
  • 201B7 or 1231A3 cells were seeded on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24 well plate so as to be 2 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) (day 0). After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit, and the culture was continued for 24 hours. Subsequently, 0 ⁇ M or 400 ⁇ M of D-3 and a phosphatase inhibitor (a mixture of 5 mM L-phenylalanine (Wakken Pharmaceutical Co., Ltd.) and 2 mM L-homoarginine (Wakken Pharmaceutical Co., Ltd.)) were added to the culture solution, Incubated for 1 or 2 hours.
  • 201B7 was cultured in Stemfit without bFGF for 16 days, and the cells were naturally differentiated. Subsequently, the cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor and not containing bFGF on a laminin-coated 24 well plate (day 0). ) After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit without the addition of bFGF, and the culture was continued for 24 hours. Subsequently, 0 ⁇ M or 400 ⁇ M D-3 was added to the culture and cultured for 1 hour.
  • TRA-1-60 BD Pharmingen
  • SSEA4 BD Pharmingen
  • Viable cells that were not stained with 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) were evaluated for the content of TRA-1-60 or SSEA4-positive cells using FACS.
  • a positive control that did not differentiate 201B7 was used.
  • TRA-1-60 or SSEA4-positive cells were removed or reduced by adding D-3 and culturing (FIG. 4).
  • 201B7 was cultured for 16 days in Stemfit without addition of bFGF, and the cells were naturally differentiated. Subsequently, the cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 / well (24 well plate) on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor and not containing bFGF on a laminin-coated 24 well plate (day 0). ) After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit without the addition of bFGF, and the culture was continued for 24 hours. Subsequently, 0 ⁇ M (control) or 400 ⁇ M D-3 was added to the culture and cultured for 1 hour.
  • the medium was replaced with a medium containing no D-3, and after culturing for 23 hours, the cells were separated and collected, and stained with an antibody against TRA-1-60. Viable cells that were not stained with 7-ADD were evaluated for the content of TRA-1-60 positive cells using FACS. At this time, a few non-specific positive cells were detected by staining with IgM, ⁇ isotype (BD Pharmingen) as a negative control. As a result, as described above, it was confirmed that TRA-1-60 positive cells were removed or reduced by adding D-3 and culturing (FIG. 5).
  • 201B7 was cultured in Stemfit without bFGF for 16 days, and the cells were naturally differentiated. 0.7 ⁇ 10 5 201B7 and 0.7 ⁇ 10 5 spontaneously differentiated 201B7 were mixed and seeded on a laminin-coated 6-well plate containing Rock inhibitor and no bFGF added (day 0). After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit without the addition of bFGF, and the culture was continued for 24 hours. Subsequently, the cells were cultured for 1 hour in Stemfit not containing bFGF supplemented with 400 ⁇ M D-3. The medium was replaced with a medium containing no D-3, and further cultured for 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, or 24 hours.
  • the cultured cells were separately collected and stained with an antibody against TRA-1-60. Viable cells that were not stained with 7-ADD were evaluated for the content of TRA-1-60 positive cells using FACS. As positive controls, cells immediately after mixing of cells induced to differentiate by culturing 201B7 and 201B7 in Stemfit not containing bFGF for 16 days were used. As a result, it was confirmed that cell damage occurred 1 hour after contact with D-3, and cell death of pluripotent stem cells occurred over time (FIG. 6).
  • 1231A3 was cultured for 16 days in Stemfit without the addition of bFGF, and the cells were naturally differentiated.
  • 0.5 ⁇ 10 5 of 1231A3 and 0.7 ⁇ 10 5 of spontaneously differentiated 201B7 were mixed and seeded on a laminin-coated 6-well plate containing Rock inhibitor without stem bFGF (Ajinomoto) (day 0).
  • the medium was replaced with only Stemfit without the addition of bFGF, and the culture was continued for 24 hours. Subsequently, the cells were cultured for 1 hour in Stemfit not containing bFGF supplemented with 400 ⁇ M D-3.
  • the medium was replaced with a medium containing no D-3, and further cultured for 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, or 24 hours.
  • the cultured cells were separately collected and stained with an antibody against TRA-1-60.
  • Viable cells that were not stained with 7-ADD were evaluated for the content of TRA-1-60 positive cells using FACS.
  • As positive controls cells immediately after mixing of cells induced to differentiate by culturing 1231A3 and 1231A3 in Stemfit not containing bFGF for 18 days were used. As a result, it was confirmed that cytotoxicity occurred after contact with D-3 and cell death of pluripotent stem cells occurred over time (Fig. 7).
  • 201B7 was cultured in Stemfit without addition of bFGF for 16 days to naturally differentiate the cells.
  • 201B7 and spontaneously differentiated 201B7 were mixed at 2: 8 or 3: 7, and seeded on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor ⁇ and without bFGF on 6-well plates coated with laminin (day 0).
  • the medium was replaced with only Stemfit without the addition of bFGF and culture was continued for 24 hours.
  • the cells were cultured for 1 hour in Stemfit without bFGF supplemented with 0 ⁇ M, 300 ⁇ M or 400 ⁇ M D-3.
  • the medium was replaced with a medium containing no D-3, and further cultured for 23 hours.
  • the cultured cells were separately collected and stained with an antibody against TRA-1-60. Viable cells that were not stained with 7-ADD were evaluated for the content of TRA-1-60 positive cells using FACS. As a result, it was confirmed that cell death occurred selectively on TRA-1-60 positive cells by contact with D-3 (FIG. 8).
  • 201B7 was seeded on Stemfit containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24-well plate so that the concentration was 2.6 ⁇ 10 4 cell / cm 2 . After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit and the culture was continued. After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing D-1, D-3, and D-7 molecules at different concentrations, or Stemfit as a control. After 2 hours of culture, the medium was replaced with Stemfit only. The next day, cells were harvested with 100 ⁇ L Accumax. Next, 300 ⁇ L of Stemfit was added to stop the Accumax reaction. The number of viable cells in 100 ⁇ L of each sample was measured using flow cytometry. Prior to analysis to discriminate dead cells, 7-AAD was added to each sample. As a result, it was shown that 201B7 can be killed not only by D-3 but also by using D-1 and D-7 (FIG. 9).
  • Example 8 Three types of iPS cell lines (201B7, 1231A, 1383D7) were seeded on Stemfit containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24-well plate so as to be 2.6 ⁇ 10 4 cell / cm 2 . 201B7 was also seeded at 5.3 ⁇ 10 4 / cm 2 to prepare a sample in which a large colony was generated. Human iPS cells (1383D7) were used after culturing those provided by Dr. Asuka Morimi, Kyoto University. After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit and the culture was continued. After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing different concentrations of D-3 or Stemfit as a control.
  • 201B7 cells should be 2.6 x 10 4 cell / cm 2 , 5.3 x 10 4 cell / cm 2 , 10.5 x 10 4 cell / cm 2 on Stemfit containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24 well plate. Sowing (day 0). After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit and the culture was continued. After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing D-3 at a concentration of 400 ⁇ M. After 2 hours of culture, the medium was replaced with Stemfit only. Each cell was treated with D3 once (only day 2), twice (day 2 and day 3), and three times (day 2-4).
  • NHDF Normal skin fibroblasts
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Human primary hepatocytes and hepatocyte medium were purchased from Cosmo Bio.
  • Human primary renal proximal tubular epithelial cells and REGMTM BulletKit medium were purchased from Lonza.
  • Spontaneous differentiation 201B7 was prepared by culturing 201B7 in Stemfit without bFGF for 2 weeks.
  • 201B7-derived neurons were prepared according to the method described in the aforementioned paper Nakagawa, et al. Sci Rep. 4: 3594, 2014.
  • 201B7-derived cardiomyocytes were prepared by the method described above. All cells were maintained at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • Each cell was seed
  • the medium was replaced with a medium containing different concentrations of D-3 molecules or only as a control medium.
  • the medium was replaced with medium alone.
  • cells were harvested with 100 ⁇ L Accumax.
  • 300 ⁇ L of Stemfit was added to stop the Accumax reaction.
  • the number of viable cells in 100 ⁇ L of each sample was measured using flow cytometry. Prior to analysis to discriminate dead cells, 7-AAD was added to each sample. As a result, it was shown that D-3 is hardly toxic to various cells that are not iPS cells (FIG. 12).
  • khES1 was cultured and used from Dr. Yoshinori Yoshida of Kyoto University.
  • the toxicity of D-3 to khES1 was examined in the same manner as in Example 8 except that khES1 was seeded so as to give 5.3 ⁇ 10 4 cell / cm 2 .
  • D-3 is also toxic to human ES cells (khES1) (FIG. 13).
  • the iPS cell line (201B7) was seeded on Stemfit containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24-well plate so as to be 5.3 ⁇ 10 4 cell / cm 2 . After 24 hours, the medium was replaced with only Stemfit and the culture was continued. After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing 400 ⁇ M D-3, Stemfit containing 10 ⁇ g / mL rBC2LCN-PE23, or Stemfit as a control. After 1 hour or 2 hours of culture for D-3 and after 2 hours or 24 hours of culture for rBC2LCN-PE23, the medium was replaced with Stemfit alone. The next day, cells were harvested with 100 ⁇ L Accumax.
  • D-3 has higher efficacy than rBC2LCN-PE23, which is a commercially available anti-iPS cell substance (FIG. 14).
  • D-3 not only has a high iPS cell removal effect, but also enables a reduction in the treatment time for removal.
  • D-3 which is a short peptide molecule, is excellent in that it can be easily synthesized economically with a large volume.
  • 293FT was purchased from invitrogen. 293FT was seeded at 5.3 ⁇ 10 4 cell / cm 2 in DMEM medium (10% FBS, 1% non essential amino acids) on a 24-well plate. Twenty-four hours later, 293FT was transfected with different concentrations of wild-type placental alkaline phosphatase mRNA (P-ALP mRNA) using Stemfect reagent according to standard protocols. After 4 hours, the medium was changed to culture medium only. As a control, 293FT without D-3 treatment was used in which only the medium was exchanged at the same timing as that treated. After 24 hours, the medium was replaced with one containing D-3 at different concentrations, and the control was replaced with medium alone.
  • P-ALP mRNA wild-type placental alkaline phosphatase mRNA
  • 201B7-derived cardiomyocytes expressing 201B7 and MHY6-EGFP have a cell number ratio of 1: 9, and a total of 5.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a laminin-coated 24-well plate. Seed Stemfit containing After 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing a suspension of 201B7-derived cardiomyocytes expressing MHY6-EGFP. After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing D-3 at a concentration of 400 ⁇ M, and the control was replaced with Stemfit-only medium. After 1 hour of culture, the medium was replaced with Stemfit only. The next day, cells were harvested with 100 ⁇ L Accumax.
  • 201B7-derived cardiomyocytes expressing 201B7 and MHY6-EGFP have a cell number ratio of 7: 3, and a total of 5.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a rock inhibitor-coated 24-well plate.
  • Seed Stemfit containing (day 0). After 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing a suspension of 201B7-derived cardiomyocytes expressing MHY6-EGFP (day 1). After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing D-3 at a concentration of 400 ⁇ M, and the control was replaced with Stemfit-only medium. After 2 hours of culture, the medium was replaced with Stemfit only.
  • Example 16 Spontaneous differentiation of 201B7 was used and cultured in Stemfit without bFGF to induce spontaneous differentiation.
  • cells were seeded on Stemfit containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24 well plate so that the concentration was 5.3 ⁇ 10 4 cell / cm 2 (day 0).
  • the medium was changed to Stemfit.
  • the medium was replaced with Stemfit containing 400 ⁇ M D-3 or Stemfit as a control.
  • the medium was replaced with Stemfit only. Each cell was treated once (day 2 only), twice (day 2 and day 3), and three times (day 2-4).
  • Example 17 5 x 10 4 naturally differentiated 201B7 and 50, 20 and 0 201B7 were mixed and seeded on Stemfit (Ajinomoto) containing Rock inhibitor on a laminin-coated 24-well plate (day 0). After 24 hours, the medium was changed to Stemfit (day 1). After another 24 hours, the medium was replaced with Stemfit containing D-3 at 400 ⁇ M or Stemfit as a control (day 2). After 2 hours of culture, the medium was replaced with Stemfit only. The cells were then cultured for an additional 7 days on Stemfit. By ALP staining, 201B7 colony was stained reddish purple. As a result, it was shown that the remaining iPS cells could be removed from the co-culture of iPS cells and differentiated cells by using D-3 (FIG. 19).

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Abstract

　多能性細胞を含有する可能性がある細胞集団より、当該多能性細胞を除去させる 化合物を提供することが本発明の課題である。ポリフェニルアラニン誘導体を対象細胞集団と接触させることにより上記課題を解決する。

Description

多能性細胞識別化合物
　本発明は、多能性幹細胞と当該多能性幹細胞から分化した細胞とを含む細胞試料から、多能性細胞を選択的に除去するために使用する化合物に関する。
　ヒト胚性幹（ES）細胞（非特許文献１）および人工多能性幹（iPS）細胞（非特許文献２）などの多能性幹細胞は、無限に増殖し、種々の細胞型へと分化する細胞であることから再生医療のための材料として期待されている。しかし、少量の未分化な細胞を含む細胞試料を移植した際に、動物モデルにおいて奇形腫が発生したことにより、安全性に対する懸念が提起されている。従って、このような未分化な細胞すなわち多能性を保持している細胞を除去することが必要である。
　このような、ヒト多能性幹細胞の検出のため、SSEA-4（stage-specific　embryonic　antigen　4）に対する抗体が広く使用されてきた（非特許文献３）。このSSEA-4を指標として、多能性細胞を細胞集団から除去するためには、当該SSEA-4に対する抗体を使用して、フローサイトメーター等を用いてソーティングを行う必要がある。このとき抗体を使用することから、移植材料に抗体の混入が懸念されることから、他の方法によって選択的に多能性細胞を除去する方法が望まれている。
Thomson, J. A. et al. Science 1998, 282, 1145-1147 Takahashi, K. et al. Cell 2007, 131, 861-872 Shevinsky,  L. H. et al. Cell 1982, 30, 697-705
　多能性細胞を選択的に細胞死に至らしめる化合物について、本願発明者らは鋭意研究を行い、その結果、ポリフェニルアラニン誘導体が多能性幹細胞のみを選択的に細胞死させることが可能であることを発見し、本発明を完成させるに至った。
　本発明は以下の特徴を有する。
［1］式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）、または、式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、R2は、アラニン残基またはグリシン残基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）で表される化合物と対象細胞集団とを接触させる工程を含む、多能性細胞を除去する方法。
［2］前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、R1がナフチル基であり、mが1である、［1］に記載の方法。
［3］前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、nが3である、［2］に記載の方法。
［4］前記対象細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団である［1］から［3］のいずれか1項に記載の方法。
［5］式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）、または、式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、R2は、アラニン残基またはグリシン残基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）で表される化合物を含む多能性細胞を除去するためのキット。
［6］前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、R1がナフチル基であり、mが1である、［5］に記載のキット。
［7］前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、nが3である、［6］に記載のキット。
　本発明によれば、ポリフェニルアラニン誘導体は、多能性細胞を細胞死させる作用を有することから、対象細胞群から含有される多能性細胞を除去することへの適用が可能となる。
図1は、201B7または心筋細胞株（cardiomyocyte）へD-3を1時間（1h）または2時間（2h）接触後、Stemfit（上左図）およびStemPro（上右図）中で1日間培養した細胞の生存率を示すグラフである。また、正常細胞株であるNHDF (Normal human dermal fibroblasts) （下左図）または、HS-5(normal human marrow stroma cell) （下右図）へ D-3を1時間（1h）または2時間（2h）接触後、DMEM中で1日間培養した細胞の生存率を示すグラフである。D-3を接触させずに同様の実験を行った結果を100%として算出した値を細胞生存率として縦軸に示す。 図2は、1231A3へD-3を1時間（1h）または2時間（2h）接触後、Stemfit（上図）およびDMEM（下図）中で1日間培養した細胞の生存率を示すグラフである。D-3を接触させずに同様の実験を行った結果を100%として算出した値を細胞生存率として縦軸に示す。 図3は、201B7（上図）または1231A3（下図）へフォスファターゼ阻害剤およびD-3（inhibitor + D-3）、フォスファターゼ阻害剤（inhibitor）、およびD-3を1時間（1h）接触後、1日間培養した細胞の生存率を示すグラフである。薬剤を接触させずに同様の実験を行った結果を100%として算出した値を細胞生存率として縦軸に示す。 図4は、各細胞をTRA-1-60抗体（上図）またはSSEA-4抗体（下図）で染色した後のヒストグラムを示す。左図は、201B7を分化誘導後の細胞（201B7d16）をD-3と1時間（1h）接触後、1日間培養した細胞の結果であり、中央図は、201B7を分化誘導後の細胞（201B7d16）の結果であり、右図は、201B7の結果である。図中、数字は、TRA-1-60陽性細胞（上図）またはSSEA-4陽性細胞（下図）の含有率を示す。 図5は、各細胞をTRA-1-60抗体で染色しFACS測定した結果のドットプロットを示す。上図は、自然分化201B7（201B7をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する）をD-3と接触後、23時間培養した細胞の結果であり、下図は、自然分化201B7（201B7d16）の結果である。下図の右側の図は、201B7を分化誘導後の細胞をisotype controlであるIgGにより染色した結果を示す。図中、数字は、TRA-1-60陽性細胞の含有率（右上図、左上図、左下図）または偽陽性細胞の含有率（右下図）を示す。 図6は、201B7および201B7を分化誘導後の細胞（201B7d16）を混合した細胞をD-3と接触後、24時間（24h）、8時間（8h）、4時間（4h）、2時間（2h）、または1時間（1h）培養した細胞、もしくは、201B7および201B7d16を混合した細胞（control）をTRA-1-60抗体で染色しFACS測定した結果のヒストグラムを示す。図中、数字は、TRA-1-60陽性細胞の含有率を示す。 図7は、1231A3および1231A3を分化誘導後の細胞（1231A3d18）を混合した細胞をD-3と接触後、24時間（24h）、8時間（8h）、4時間（4h）、2時間（2h）、または1時間（1h）培養した細胞、もしくは、201B7および1231A3d18を混合した細胞（control）をTRA-1-60抗体で染色しFACS測定した結果のヒストグラムを示す。図中、数字は、TRA-1-60陽性細胞の含有率を示す。 図8は、201B7および201B7を分化誘導後の細胞（201B7d16）を2：8（上図）または3：7（下図）で混合した細胞を400μM（左図）または300μM（中央図）のD-3と接触またはD-3と非接触（contorol）した細胞（右図）をTRA-1-60抗体で染色しFACS測定した結果のドットプロットを示す。図中、数字は、TRA-1-60陽性細胞の含有率を示す。 図９は、ジフェニルアラニンベースのホスホルDペプチドの抗iPS細胞効果を評価した結果を示すグラフである。D-1は二つのフェニルアラニンを、D3は三つのフェニルアラニンを持つ。D-7は、D-3に対し、さらにナフチル基とトリフェニルアラニンの間に、リンカーとなるグリシンを持つ。 図１０は、異なる濃度のD-3で、３種のiPS細胞株（201B7、1231A、1383D7）を、1～4時間処理した際の致死率を示すグラフである。上の2枚のパネルは、細胞の濃度が異なり、コロニーの大きさが異なる201B7に対する毒性を比較したものである。 図１１は、D-3による繰り返し処理により、コンフルエントに近い段階における201B7を除去することができることを示すグラフである。グラフは、D-3による各日の処理後の201B7の、毎日培地を交換したコントロールと比較した生存率を示す。201B7は異なる濃度で播種し、小コロニー、大コロニー、コンフルエントに近い段階を形成させた。NHDF細胞は、コントロールとして用い、毎日同様のD-3処理をした。 図１２は、D-3が非iPS 細胞である、正常皮膚繊維芽細胞(NHDF)、ヒト初代肝細胞、ヒト初代腎臓近位尿細管上皮細胞、自然分化201B7、201B7由来の神経細胞、及び201B7由来の心筋細胞に対しては、毒性がほとんどないことを示すグラフである。 図１３は、D-3がヒトES細胞（khES1）に対しても毒性があることを示す。 図１４は、D-3及び、市販の抗iPS細胞物質である rBC2LCN-PE23の201B7に対する毒性を比較するグラフであり、D-3がrBC2LCN-PE23よりも効能が高いことを示す。 図１５は、D-3の毒性が、細胞に導入したP-ALP mRNA の量と関連することを示す（図１５中のALPPは、P-ALPと同じものを表す）。 図１６は、D-3を用いることにより、分化細胞群に混在するiPS細胞を除去することに成功したことを示す。201B7及びMHY6-EGFP を発現する201B7由来の心筋細胞を、400 μM のD-3による１時間の培養後、あるいはそのような培養せずにフローサイトメトリー分析した。未処理の201B7及び未処理の心筋細胞をコントロールとして用いた。 図１７は、D-3による繰り返し処理により、多量のiPS細胞と少量の分化細胞を含む細胞群から、少量の分化細胞を精製することに成功したことを示す。 図１８は、15日間自然に分化させた201B7の分化抵抗性クローンから、D-3 を用いて残存iPS細胞を除去することに成功したことを示す。 図１９は、D-3を用いることで、iPS細胞と分化細胞との共培養から、残存したiPS細胞を除去することに成功したことを示し、D-3処理をしておらず、iPS細胞を含有する試料を示す上左、上中央のパネルでは、iPS細胞の存在を示す染色が視認でき、D-3処理を実施した試料を示す下左、下右、並びにiPS細胞を入れていない上右のパネルでは、iPS細胞の存在が確認できない。
　本発明は、式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）、または、式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、R2は、アラニン残基またはグリシン残基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）で表されるポリフェニルアラニン誘導体と対象細胞集団とを接触させる工程を含む、多能性細胞を除去する方法、または、当該ポリフェニルアラニン誘導体を含む多能性細胞を除去するためのキットを提供する。
　本発明において、アリール基とは、一価の6-炭素単環式、10-炭素二環式、14-炭素三環式芳香族環系を指す。アリール基の例には、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基が含まれるが、これらに限らない。
本発明において、ヘテロアリール基とは、1個以上のヘテロ原子（O、N、S、またはSeなど）を有する、一価の芳香族5～8員単環系、8～12員二環系、または11～14員三環系を指す。ヘテロアリール基の例には、ピリジル基、フリル基、イミダゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ピリミジニル基、チエニル基、キノリニル基、インドリル基、チアゾリル基が含まれる。
　別段の記載がない限り、本明細書でいうアリール基は、置換若しくは非置換両方の部分を含む。用語「置換」とは、1つ以上の置換基（同じまたは異なるものとできる）を指し、それぞれが水素原子を置換する。置換基の例には、ハロゲン基（例：F、Cl、Br、I）、ヒドロキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、メルカプト基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミド基、カルボキシ基、アルカンスルホニル基、アルキルカルボニル基、カルバミド基、カルバミル基、カルボキシル基、チオウレイド基、チオシアナート基、スルホンアミド基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルオキシ基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、ヘテロシクリルアルキル基が含まれるが、これらに限らず、そのうち、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルオキシ基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロアリールオキシ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、オキソ基（O＝）、チオキソ基（S＝）、チオ基、シリル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシルアミノ基、アミノアシル基、アミノチオアシル基（aminothioacyl）、アミジノ基、チオウレイド基、チオシアナート基、スルホンアミド基、グアニジン基、ウレイド基、アシル基、チオアシル基、カルバミル基（-C（O）NH2）、カルボキシル基（-COOH）、カルボン酸エステル、そのうちアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルオキシカルボニル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクリル基、ヘテロシクリル基がさらに置換され得る。またシクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基は相互に縮環され得る。置換基は合成の過程において保護基とすることができる。ここで言う「保護基」とは、プロセス工程中に不要な反応をする官能性を保護または遮蔽するために用いられる基または部分を指す。
保護基はその工程で反応を防止するが、その後取り除いて本来の官能性を現すことができる。保護基の例には、トリメチルシリル基（TES）、tert-ブチルオキシカルボニル基（tBoc）、ベンジルオキシカルボニル基（CBZ）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）が含まれるが、これらに限らない。
　本発明において、好ましいポリフェニルアラニン誘導体は、式（I）中のR1がナフチル基であり、mは1である、式（III）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で表される化合物である。
　本発明において、さらに好ましいポリフェニルアラニン誘導体は、式（III）中のnが、3である化合物である。
　本発明のポリフェニルアラニン誘導体に含有される、アラニン残基、グリシン残基、フェニルアラニン残基およびO-フォスフォ-D-チロシンは、D体であってもL体であっても良く、分解され難いとの観点から、好ましくはD体である。
　本発明のポリフェニルアラニン誘導体は、事態公知の固相ペプチド合成法によって、アミノ酸またはカルボン酸を適宜用いて合成することが可能である。
　本発明において、多能性細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である性質を有し、アルカリホスファターゼ、Oct-3／4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60およびTRA-1-81から成る群の少なくとも一つのマーカー遺伝子が陽性である細胞である。多能性細胞には、多能性幹細胞が含有される。
　本発明において、対象細胞集団は、多能性細胞を含有するおそれのある細胞集団であれば、特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞から分化誘導した細胞集団が挙げられる。
　本発明において、多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ。該多能性幹細胞の例としては、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（「ntES細胞」）、生殖幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、および人工多能性幹（iPS）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい前記多能性幹細胞の例として、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞が挙げられる。
　（A）胚性幹細胞
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚期後の胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M. J. Evans and M. H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J. A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147；J. A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848；J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259；および J. A. Thomson and V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊をフィーダー細胞である線維芽細胞の上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（LIF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えば、H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279；およびH. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585などに記載されている。
　ヒトES細胞は、例えば0．1mM　2-メルカプトエタノール、0．1mM　非必須アミノ酸、2mM　L-グルタミン酸、20％　KSR及び4ng／ml　bFGFを補充したDMEM／F-12培地を使用し、37℃、5％　CO2湿潤雰囲気下で維持することができる。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM　CaCl2及び20％　KSRを含有するPBS中の0．25％　トリプシン及び0．1mg／ml　コラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3／4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3／4、NANOG、などの遺伝子マーカーの発現をReal-Time　PCR法で検出したり、細胞表面抗原であるSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81を免疫染色法にて検出することで行うことができる（Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485）。
　ヒトES細胞株である例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（B）生殖幹細胞
　生殖幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できる性質をもつ（M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616；K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012）。生殖幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（GDNF）を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（2008），実験医学，26巻，5号（増刊），41～46頁，羊土社（東京、日本））。
（C）胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847；J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551）。
（D）人工多能性幹細胞
　人工多能性幹（iPS）細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676；K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872；J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920；M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106；WO 2007/069666；およびWO 2010/068955）。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3／4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、L-Myc、N-Myc、TERT、SV40　Large　T　antigen、HPV16　E6、HPV16　E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Esrrb、Esrrg、およびGlis1が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
　上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBIアクセッション番号を参照することにより得られる。また、L-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg、およびGlis1のマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列の情報については、それぞれ下記NCBIアクセッション番号を参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
 
遺伝子名　　　　マウス　　　　　　　　　ヒト
L-Myc　　　NM＿008506　　　　　NM＿001033081
Lin28　　　NM＿145833　　　　　NM＿024674
Lin28b　　 NM＿001031772　　   NM＿001004317
Esrrb　　　NM＿011934　　　　　NM＿004452
Esrrg　　　NM＿011935　　　　　NM＿001438
Glis1　　　NM＿147221　　　　　NM＿147193
　これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターの使用、リポフェクション、リポソームの使用、またはマイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006；Cell, 131, pp.861-872, 2007；Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV　LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列；緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーターの遺伝子配列；などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775；Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770；WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、BKウイルスまたは牛乳頭腫ウイルス（Bovine papillomavirus）の起点とそれらの複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriP配列、またはLarge　TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201、およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/092042 2009/152529）。
　核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)）、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1　siRNA　Smartpool（登録商標）（Millipore）、HuSH　29mer　shRNA　Constructs　against　HDAC1（OriGene）等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)）、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294（Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)）等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a　siRNA（human）（Santa　Cruz　Biotechnology）等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel　calcium　agonist（例えばBayk8644）（Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）（Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)）、Wnt　Signaling　activator（例えばsoluble　Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤（例えば、SB431542）（Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)）、mitogen-activated　protein　kinase　signalling阻害剤、glycogen　synthase　kinase-3阻害剤（PLoS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)）、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA（R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009)）、等を使用することができる。
　核初期化物質の内在性のタンパク質の発現上昇に使用する薬剤としては、6-ブロモインジルビン-3’-オキシム、インジルビン-5-ニトロ-3’-オキシム、バルプロ酸、2-（3-（6-メチルピリジン-2-イル）-1H-ピラゾール-4-イル）-1，5-ナフチリジン、1-（4-メチルフェニル）-2-（4，5，6，7-テトラヒドロ-2-イミノ-3（2H）-ベンゾチアゾリル）エタノン　HBr（ピフィスリン-アルファ）、プロスタグランジンJ2およびプロスタグランジンE2等が例示される（WO 2010/068955）。
　iPS細胞誘導のための培地としては、例えば（1）10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM／F12またはDME培地（これらの培地にはさらに、LIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（2）bFGFまたはSCFを含有するES細胞用培地、例えばマウスES細胞用培地（例えばTX-WES培地、トロンボX社）または霊長類ES細胞用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ES細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、mTeSR-1）、などが含まれる。
　培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM／F12培地中で体細胞と核初期化物質（DNAまたはタンパク質）を接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞用培地で培養し、該接触から約30～約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
　あるいは、その代替培養法として、体細胞は、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上で10％FBS含有DMEM培地（これにはさらに、LIF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、培養から約25～約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。　本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
（E）　核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
　nt　ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743；S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936；J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt　ES（nuclear　transfer　ES）細胞である。nt　ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（2008），実験医学，26巻，5号（増刊），47～52頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
（F）融合幹細胞
　体細胞と卵子もしくはES細胞とを融合させることにより、融合させたES細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である（Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001；Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73）。
　本発明において、多能性幹細胞から分化誘導するとは、特定の臓器細胞およびその前駆細胞へ分化を誘導されるのみでなく、内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞等の広範な細胞型を含む細胞集団へと分化を誘導されることを包含する。臓器細胞の例としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、および網膜等に含まれる細胞が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に自明の任意の分化誘導法を用いることができる。例としては、特開2002-291469またはWO2011/019092に記載される神経幹細胞への分化誘導法、特開2004-121165に記載される膵幹様細胞への分化誘導法、および特表2003-505006に記載される造血細胞への分化誘導法、WO2014/185358に記載される心筋細胞への分化誘導法が挙げられる。さらに、胚様体の形成による分化誘導法の例として、特表2003-523766等に記載される方法等が挙げられる。
　本発明のポリフェニルアラニン誘導体は、対象細胞集団の培養液へ添加することによって、当該対象細胞集団に含有される多能性細胞の細胞死を誘導することによって、除去することができる。対象細胞集団とポリフェニルアラニン誘導体の接触の時間は、特に限定されないが、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、24時間が例示される。また、ポリフェニルアラニン誘導体の培養液中の濃度は、特に限定されないが、100μMから1mM、より好ましくは、200μM、300μM、または400μMが例示される。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
＜iPS細胞＞
　ヒトiPS細胞（201B7）は、京都大学の山中教授（Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007）より供与されたものを、Nakagawa, et al. Sci Rep. 4:3594, 2014に記載の方法で培養した。
　ヒトiPS細胞（1231A3）は、京都大学の中川講師より供与されたものを、Nakagawa, et al. Sci Rep. 4:3594, 2014に記載の方法で培養した。
　ヒトiPS細胞（MYH6-EIP4-201B7）は、前記201B7へMYH6プロモーターに作動可能に結合したEGFPのカセット（MYH6-EIP4）を導入して作製した。MYH6-EIP4導入iPS細胞株の作製は、PiggyBacトランスポゾンシステムを用いて、MYH(myosin heavy chain)-promoterの下流にEGFPカセットを作動可能に連結したベクターを201B7に導入することにより行われた。
＜心筋細胞株＞
　心筋細胞株は、MYH6-EIP4-201B7をCTK solution（ReproCELL）で2分処理後、溶液を除去し、続いてAccumax（Innovative Cell Technologies）で5分処理後、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。遠心分離により細胞を回収し、低接着6 wellディッシュ（Corning）へ移し、2mM L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid（sigma）、4×10-4M monothioglycerol (MTG)および2ng/mL BMP4（R&D）を添加した1.5 ml/well STEMPRO 34（Invitrogen）中、37℃、5%酸素条件下にて培養して、EBを形成させた。翌日、1% L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG 、18ng/mL BMP4、10ng/mL bFGFおよび12ng/mL Activin Aを添加したSTEMPRO 34を等量、EBの培養を行っている6 wellプレート中に加え、37℃、5%酸素条件にて3日間培養した。得られたEBをIMDM（Invitrogen）にて洗浄し、1%L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG 、10ng/mL VEGFおよび1μM IWP-3を添加したSTEMPRO 34をディッシュに加えて、37℃、5%酸素条件下で、4日間培養した。培地を、1% L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG 、10ng/mL VEGFおよび5ng/mL bFGFを添加したSTEMPRO 34に交換し、4日間、37℃、5％酸素条件下で培養した。この時、2 日に1度同じ条件の培地に交換した。続いて、通常の酸素濃度にて、2 日に1度同じ条件の培地に交換しながら8日間培養し、MYH-6を代替するEGFPを指標として、FACSを用いてEGFP陽性細胞を単離して、心筋細胞株として用いた。
＜D-1およびD-3＞
　化合物D-1は下記の式（IV）（式中、n=2）の構造式、および化合物D-3は下記の式（IV）（式中、n=3）の構造式を有するものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
　D-1およびD-3は、Ottinger, E.A., et al.,Biochemistry, 32, 1993に記載の固相ペプチド合成法により作製した。詳細には、2-chlorotrityl chloride resin、N-Fmoc-protected amino acidsおよび2-Naphthaleneacetic acidをN,N-diisopropylethylamine (DIPEA)およびO-benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium- hexafluoro-phosphate (HBTU)を用いて活性化することで合成した。O-phospho-D-tyrosineは、Alewood, P. F., et al., Synthesis, 30-31 1983に記載の方法に従って、D-tyrosineおよびphosphorus pentoxideをリン酸存在下で一昼夜反応させることで合成した。 N-Fmoc-O-phospho-D-tyrosineは、水とCH3CNを1:1で混合した溶媒中にて、O-phospho-D-tyrosineおよびFmoc-OSuを溶解させ、Et3Nを加えpHを8~9に調整し、30分間反応することで得られた (Ottinger, E.A., et al., Biochemistry, 32, 1993)。
　201B7細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfit（味の素）に、2 x 104/well（24 wellプレート）となるように播種した(day 0) 。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。または1 x 104/well（24 wellプレート）の心筋細胞株を播種し、 StemPro（Life Technologies）中で1日間培養した。続いて、0μM、200μM、300μMまたは400μMのD-3を培養液に添加し、1時間または2時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、1日間培養後、WST-1アッセイにより細胞死を評価し、0μMのD-3を添加した場合と比較して細胞生存率を算出した。その結果、300μM以上のD-3を培養液に添加し、1時間以上培養した場合、201B7は細胞死を引き起こすことが確認された（図1）。一方、心筋細胞株は、D-3による細胞障害性は見出せなかった。
以上より、D-3は、多能性幹細胞に特異的に細胞死を引き起こすことが示唆された。同様に、NHDF (正常ヒト真皮線維芽細胞) またはHS5 (正常ヒト髄基質細胞)へ0μM、200μM、300μMまたは400μMのD-3を培養液に添加し、1時間または2時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、1日間培養後、WST-1アッセイにより細胞死を評価し、0μMのD-3を添加した場合と比較して細胞生存率を算出した。その結果、いずれの細胞に対してもD-3による細胞障害性は見いだせなかった。
　1231A3細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfit（味の素）に、2 x 104/well（24 wellプレート）となるように播種した(day 0) 。24時間後、StemfitまたはDMEM（Life Technologies）中で1日間培養した。0μM、200μM、300μMまたは400μMのD-1もしくは0μM、200μM、300μMまたは400μMのD-3を培養液に添加し、1時間または2時間培養した。続いて、D-1およびD-3を含まない培地へ交換し、1日間培養後、WST-1アッセイにより、D-1またはD-3を添加しなかった場合（0μM）の細胞と比較して各細胞生存率を算出した。その結果、D-3は、培地の影響を受けず、多能性幹細胞への毒性を発揮することが確認された（図2）。
　201B7または1231A3細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfit（味の素）に、2 x 104/well（24 wellプレート）となるように播種した(day 0) 。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、0μMまたは400μMのD-3、およびフォスファターゼ阻害剤（5mM L-フェニルアラニン（和研薬株式会社）および2mM L-ホモアルギニン（和研薬株式会社）の混合物）を培養液に添加し、1時間または2時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、1日間培養後、WST-1アッセイにより細胞死を評価し、D-3およびフォスファターゼ阻害剤を添加しなかった場合と比較して細胞生存率を算出した。その結果、フォスファターゼ阻害剤によりD-3の細胞障害性が抑制されることから、D-3による細胞死には、フォスファターゼが介在することが示唆された（図3）。
　201B7をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する、細胞を自然分化させた。続いて、細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有する、bFGF を添加しないStemfit（味の素）に、2 x 104/well（24 wellプレート）となるように播種した(day 0) 。24時間後、培地を、bFGF を添加しないStemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、0μMまたは400μMのD-3を培養液に添加し、1時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、1日間培養後、細胞を分離回収し、TRA-1-60 (BD Pharmingen)またはSSEA4 (BD Pharmingen)に対する抗体により染色した。7-Amino-ActinomycinD（7-AAD）によって染色されなかった生細胞についてFACSを用いて、TRA-1-60またはSSEA4陽性細胞の含有率を評価した。なお、陽性対照として、201B7を分化させないものを用いた。その結果、D-3を添加して培養することで、TRA-1-60またはSSEA4陽性細胞を除去または低減させることが確認された（図4）。
　同様に、201B7をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する、細胞を自然分化させた。続いて、細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有する、bFGF を添加しないStemfit（味の素）に、2 x 104/well（24 wellプレート）となるように播種した(day 0) 。24時間後、培地を、bFGF を添加しないStemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、0μM（対照）または400μMのD-3を培養液に添加し、1時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、23時間培養後、細胞を分離回収し、TRA-1-60に対する抗体により染色した。7-ADDによって染色されなかった生細胞についてFACSを用いて、TRA-1-60陽性細胞の含有率を評価した。なお、このとき陰性対照としてIgM, κ isotype (BD Pharmingen)による染色により非特異的な陽性細胞をわずかながら検出した。その結果、上記と同様に、D-3を添加して培養することで、TRA-1-60陽性細胞を除去または低減させることが確認された（図5）。
　201B7をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する、細胞を自然分化させた。0.7 x 105の201B7および0.7 x 105の自然分化の201B7を混合し、ラミニン被覆した6wellプレート上の、Rock inhibitor を含有する、bFGF を添加しないStemfit（味の素）に播種した(day 0) 。24時間後、培地を、bFGF を添加しないStemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、400μMのD-3を添加したbFGFを含有しないStemfit中で1時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、さらに、1時間、2時間、4時間、8時間または24時間培養した。培養後の細胞をそれぞれ分離回収し、TRA-1-60に対する抗体により染色した。7-ADDによって染色されなかった生細胞についてFACSを用いて、TRA-1-60陽性細胞の含有率を評価した。なお、陽性対照として、201B7および201B7をbFGFを含有しないStemfit中で16日間培養することで分化誘導した細胞の混合直後の細胞を用いた。その結果、D-3との接触1時間後より細胞障害が起こり、時間経過とともに多能性幹細胞の細胞死が起きることが確認された（図6）。
　同様に、1231A3をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する、細胞を自然分化させた。0.5 x 105の1231A3および0.7 x 105の自然分化の201B7を混合し、ラミニン被覆した6wellプレート上の、Rock inhibitor を含有する、bFGF を添加しないStemfit（味の素）に播種した(day 0) 。24時間後、培地を、bFGF を添加しないStemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、400μMのD-3を添加したbFGFを含有しないStemfit中で1時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、さらに、1時間、2時間、4時間、8時間または24時間培養した。培養後の細胞をそれぞれ分離回収し、TRA-1-60に対する抗体により染色した。7-ADDによって染色されなかった生細胞についてFACSを用いて、TRA-1-60陽性細胞の含有率を評価した。なお、陽性対照として、1231A3および1231A3をbFGFを含有しないStemfit中で18日間培養することで分化誘導した細胞の混合直後の細胞を用いた。その結果、D-3に接触後より細胞障害性が起こり、時間経過とともに多能性幹細胞の細胞死が起きることが確認された（図7）。
　同様に、201B7をbFGF を添加しないStemfitで１６日培養する、細胞を自然分化させた。201B7および自然分化の201B7を2：8または3：7で混合し、ラミニン被覆した6wellプレート上の、Rock inhibitor を含有する、bFGF を添加しないStemfit（味の素）に播種した(day 0) 。24時間後、培地を、bFGF を添加しないStemfitのみのものに取り換え、24時間培養を続けた。続いて、0μM 、300μMまたは400μMのD-3を添加したbFGFを含有しないStemfit中で1時間培養した。D-3を含まない培地へ交換し、さらに、23時間培養した。培養後の細胞をそれぞれ分離回収し、TRA-1-60に対する抗体により染色した。7-ADDによって染色されなかった生細胞についてFACSを用いて、TRA-1-60陽性細胞の含有率を評価した。その結果、D-3との接触によりTRA-1-60陽性細胞選択的に細胞死が起きていることが確認された（図8）。
　［実施例７］
　201B7は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに、2.6 x 104 cell/cm2となるように播種した。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、培養を続けた。さらに24時間後、培地を、D-1、D-3、D-7の各分子を異なる濃度で含むStemfit、あるいはコントロールとしてのStemfitに取り換えた。2時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。翌日、細胞を100 μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100 μL中の生細胞の数をフローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3のみならず、D-1及びD-7を用いた場合でも、201B7を細胞死させることができることが示された（図９）。
　［実施例８］
　ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに、３種のiPS細胞株（201B7、1231A、1383D7）は2.6 x 104 cell/cm2 となるように播種した。201B7については、他に5.3x104/cm2となるように播種し、大きなコロニーを生成させたサンプルも作製した。なお、ヒトiPS細胞（1383D7）は、京都大学　森実 飛鳥博士より供与されたものを培養して用いた。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、培養を続けた。さらに24時間後、培地を、D-3を異なる濃度で含むStemfit、あるいはコントロールとしてのStemfitに取り換えた。１～４時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。翌日、細胞を100 μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100uL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3を加えることで、201B7、1231A、1383D7のいずれのiPS細胞株も、細胞死させることが可能であることが示された（図10）。また、同一の細胞株については、高濃度での播種により大きなコロニーを形成した201B7よりも、低濃度で播種した201B7に対し、D-3による細胞死の効率がより高いことがわかった。これは、高濃度播種の場合はD-3と細胞が接触しない領域が生じるため、D-3と細胞との接触面積による影響が強いと考えられる。
　［実施例９］
　201B7細胞は、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに、2.6 x 104 cell/cm2、5.3 x 104 cell/cm2、10.5 x 104 cell/cm2となるように播種した(day 0) 。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、培養を続けた。さらに24時間後、培地を、D-3を400 μMの濃度で含むStemfitに取り換えた。２時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。それぞれの細胞は、D3により一度（day 2のみ）、二度（day 2 及び day 3）、三度（day 2-4）にわたって処理した。次いで、day5に、細胞を100 μL のAccumaxを用いて採取し、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。NHDFは、24wellプレート上の、FGM fibroblast培地に、5.3 x 104cell/cm2となるように播種した。細胞は、 day 2-4に、FGM fibroblast培地中の400 μMの D-3で 2時間インキュベーションすることにより処理した。次いで、day5に、細胞を上記201B7細胞と同様の方法により採取し、Accumax反応を停止し、各サンプルの100μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて同様に測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3による繰り返し処理により、コンフルエントに近い段階における201B7であっても高精度に除去できることがわかった（図１１）。
　［実施例１０］
　正常皮膚繊維芽細胞(NHDF)は、ATCC（American Type Culture Collection）から購入した。ヒト初代肝細胞及び肝細胞培地はコスモバイオから購入した。ヒト初代腎臓近位尿細管上皮細胞及びREGMTM BulletKit培地は、Lonzaから購入した。自然分化201B7は、201B7をbFGF を添加しないStemfitで２週間培養することにより調製した。201B7由来の神経細胞は、前出の論文Nakagawa, et al. Sci Rep. 4:3594, 2014に記載の方法に従って調製した。201B7由来の心筋細胞は、先に示した方法により調製した。すべての細胞は、37 oC, 5% CO2で維持した。各細胞は、24wellプレート上のそれぞれの培地に、5.3 x 104 cell/cm2となるように播種した。24時間後、培地を、D-3分子を異なる濃度で含む培地、あるいはコントロールとしての培地のみに取り換えた。１～４時間の培養後に、培地のみのものに取り換えた。翌日、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100 μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3がiPS 細胞ではない各種の細胞に対しては、毒性がほとんどないことが示された（図１２）。
　［実施例１１］
　khES1は、京都大学の吉田善紀博士より供与されたものを培養して用いた。khES1を、5.3 x 104 cell/cm2となるように播種した以外は、実施例８に示す方法と同様にして、D-3のkhES1に対する毒性を調べた。その結果、D-3がヒトES細胞（khES1）に対しても毒性であることが示された（図１３）。
　［実施例１２］
　ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに、iPS細胞株（201B7）は5.3 x 104 cell/cm2 となるように播種した。24時間後、培地を、Stemfitのみのものに取り換え、培養を続けた。さらに24時間後、培地を、D-3を400 μMで含むStemfit、rBC2LCN-PE23 を 10μg/mLで含むStemfit、あるいはコントロールとしてのStemfitに取り換えた。D-3については１時間または２時間の培養後に、rBC2LCN-PE23については２時間または２４時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。翌日、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3が、市販の抗iPS細胞物質である rBC2LCN-PE23よりも効能が高いことが示された（図１４）。D-3は、iPS細胞の除去効果が高いだけでなく、除去のための処理時間の短縮も可能とする。短いペプチド分子であるD-3は、経済的に、大容量で容易に合成できる点においても優れている。
　［実施例１３］
　293FT は、invitrogenから購入した。24 wellプレート上のDMEM 培地 (10% FBS, 1% non essential amino acids)に、293FTを5.3 x 104cell/cm2となるように播種した。24時間後、標準的なプロトコルに従って、Stemfect試薬を用い、異なる濃度の野生型胎盤型アルカリフォスファタ-ゼのmRNA （P-ALP mRNA）で293FT をトランスフェクトした。４時間後、培地を培養培地のみに交換した。コントロールとしては、293FT をD-3処理をすることなく、処理したものと同じタイミングで培地交換のみを行ったものを用いた。２４時間後、培地を、D-3を異なる濃度で含むものに取り換え、コントロールについては培地だけのものに取り換えた。１時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。 翌日、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数をフローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。その結果、D-3の毒性が、P-ALP mRNA のトランスフェクション量と関連することが示された（図１５）。
　［実施例１４］
　201B7及びMHY6-EGFP を発現する201B7由来の心筋細胞は、細胞数比が1：9となり、合計で、5.3 x 104cell/cm2となるように、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに播種した。24時間後、培地を、MHY6-EGFP を発現する201B7由来の心筋細胞の懸濁液を含有するStemfitに交換した。さらに24時間後、培地を、D-3 を 400 μMの濃度で含むStemfitと交換し、コントロールについてはStemfitのみの培地と交換した。１時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。 翌日、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、400 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。201B7を判別するために、Alexa 647 fluorophoreを備えるTra-1-60抗体を用いた。また、分化後20日もしくは21日の心筋細胞はEGFP陽性細胞を選択することにより選別した。その結果、D-3を用いることにより、分化細胞群からiPS細胞を除去することができることが示された（図１６）。
　［実施例１５］
　201B7及びMHY6-EGFP を発現する201B7由来の心筋細胞は、細胞数比が７：３となり、合計で、5.3 x 104 cell/cm2となるように、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに播種した(day 0)。24時間後、培地を、MHY6-EGFP を発現する201B7由来の心筋細胞の懸濁液を含有するStemfitに交換した (day 1) 。 さらに24時間後、培地を、D-3 を 400 μMの濃度で含むStemfitと交換し、コントロールについてはStemfitのみの培地と交換した。2時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。細胞は一度（day 2のみ）、二度（day 2 及び day 3）、または三度（day 2-4）にわたってD-3で処理した。翌日、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取した。次いで、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。201B7を判別するために、Alexa 647 fluorophoreを備えるTra-1-60抗体を用いた。また、分化後20日もしくは21日の心筋細胞はEGFP陽性細胞を選択することにより選別した。その結果、D-3により、多量のiPS細胞と少量の分化細胞を含む細胞群から、少量の分化細胞を精製することに成功したことが示された（図１７）。
　［実施例１６］
　201B7の自然分化に対する抵抗性クローンを用いて、bFGFを含まないStemfitで培養して、自然分化を誘導した。day 15に、5.3 x 104 cell/cm2となるように、ラミニン被覆した24wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfitに細胞を播種した(day 0)。24時間後、培地をStemfitに交換した。さらに24時間後、培地を、D-3を400 μMで含むStemfit、あるいはコントロールとしてのStemfitに取り換えた。２時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。それぞれの細胞は、一度（day 2のみ）、二度（day 2 及び day 3）、三度（day 2-4）にわたって処理した。次いで、day5に、細胞を100μL のAccumaxを用いて採取し、300 μLの Stemfitを加え、Accumax反応を停止した。各サンプルの100μL中の生細胞の数をフローサイトメトリーを用いて測定した。死細胞を判別するための分析の前に、各サンプルに7-AADを加えた。201B7を判別するために、Alexa 647 fluorophoreを備えるTra-1-60抗体を用いた。その結果、D-3 により、15日間自然分化を誘導した場合の分化抵抗性(differentiation deficient)を示す201B7由来iPS細胞由来細胞集団から、残存するiPS細胞を除去することができたことが示された（図１８）。
　［実施例１７］
　5 x 104個の自然分化させた201B7と、５0個、20個、0個の201B7を混合し、ラミニン被覆した24 wellプレート上の、Rock inhibitor を含有するStemfit（味の素）に播種した(day 0) 。24時間後、培地をStemfitに交換した (day 1)。さらに24時間後、培地を、D-3を400 μMで含むStemfit、あるいはコントロールとしてのStemfitに取り換えた (day 2)。２時間の培養後に、培地をStemfitのみのものに取り換えた。そして、細胞をStemfitでさらに７日間培養した。ALP染色により、 201B7 コロニーを赤紫色に染色した。 その結果、D-3を用いることで、iPS細胞と分化細胞との共培養から、残存したiPS細胞を除去することができたことが示された（図１９）。

Claims (7)

  1. 　式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）、または、式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、R2は、アラニン残基またはグリシン残基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）で表される化合物と対象細胞集団とを接触させる工程を含む、多能性細胞を除去する方法。
  2. 　前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、R1がカルボニル基であり、R2が、ナフチル基であり、mは1である、請求項1に記載の方法。
  3. 　前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、nは3である、請求項2に記載の方法。
  4. 　前記対象細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団である請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      
    （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）、または、式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、R1はアリール基またはヘテロアリール基であり、R2は、アラニン残基またはグリシン残基であり、mは1から6の整数であり、nは2以上の整数である）で表される化合物を含む、多能性細胞を除去するためのキット。
  6. 　前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、R1がナフチル基であり、mが1である、請求項5に記載のキット。
  7. 　前記化合物が、式（I）で表される化合物であって、式中、nが3である、請求項6に記載のキット。 
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