WO2016093687A1 - Proceso para generar derivados isogénicos de maíz con propiedades mejoradas, mediante la sobreexpresión genética - Google Patents

Proceso para generar derivados isogénicos de maíz con propiedades mejoradas, mediante la sobreexpresión genética Download PDF

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WO2016093687A1
WO2016093687A1 PCT/MX2015/000155 MX2015000155W WO2016093687A1 WO 2016093687 A1 WO2016093687 A1 WO 2016093687A1 MX 2015000155 W MX2015000155 W MX 2015000155W WO 2016093687 A1 WO2016093687 A1 WO 2016093687A1
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overexpression
corn
isogenic
gene
plants
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PCT/MX2015/000155
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Inventor
Estela SÁNCHEZ QUINTANAR
Erika Victoria ALMERAYA DEL VALLE
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Universidad Nacional Autónoma de México
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention is related to the principles and techniques used in obtaining derivatives of plant varieties with improved properties, and more particularly, the invention provides processes for obtaining derivatives of any variety of corn with improved properties, such as being resistant to adverse environmental conditions, such as drought and high temperatures, at the same time
  • the methods of the invention for obtaining said derivatives of any variety of maize result in an isogenic maize line, that is, plants that contain the same genetic constitution as the original variety, but which are characterized in that they overexpress some particular genes associated with osmoprotection, thermotolerance and protection of photosynthetic ⁇ s activity.
  • the objective of this invention is the use of molecular strategies for obtaining derivatives of any existing variety of corn, with improved properties, due to overexpression of a particular gene, without changing the genetic constitution of the variety of corn used
  • the present invention seeks to help reduce the risks associated with climate change, as it describes a method for generating corn plants with improved characteristics, resistant to adverse weather conditions, which overexpress one or more endogenous genes of corn, with known activities of osmoprotection, thermoresistance and activation of photosynthesis and, therefore, do not show changes in the genetic constitution of the variety of corn with which it works.
  • the procedure is based on physically introducing by means of particle bombardment in corn totipotential cells, the genetic units of the same plant, which encode the genes in question for overexpression.
  • the method offers the advantage of producing a derivative resistant to adverse weather conditions, from a variety of corn that is currently grown. Therefore, being only a product of the modification of the corn's own DNA, the resulting plants are not subject to any of the regulations for the use and management of transgenic plants.
  • the importance of the generation of crops adaptable to environments with higher temperatures and lower availability of water that conserve their productive capacity is highlighted, through the generation of improved corn in terms of its ability to adapt to environmental conditions adverse effects, by overexpression of one or several genes, but which essentially has the same genetic (isogenic) constitution as that of any variety that is already grown commercially.
  • the present invention provides a viable option for the generation of derivatives of a variety of corn by means of the genetic overexpression that results in corn plants resistant to adverse environmental conditions, with the novelty that obtaining them requires less time and with the Outstanding feature that it's not about GM corn.
  • a transgene is a gene that has been introduced into the genome of an organism through genetic engineering.
  • transgenic is used to describe genetically modified organisms (plants, animals or microorganisms), the transgenic plant is one in which a gene from another species has been introduced, using genetic engineering methods that pass the barriers between species ; Sometimes the word Transgene is used to refer to "genetically modified" organisms.
  • the present invention relates to a process for obtaining an isogenic corn line, that is, plants that contain the same genetic constitution as the original variety, but which are characterized in that they overexpress some genes, in this case they are genes associated with osmoprotection. , thermo tolerance and protection of photosynthetic activity, particularly it is described to obtain isogenic lines of corn that overexpress the Rubisco activase (Rca) protein gene: Ribulose 1.5 bisphosphate carboxylase oxygenase.
  • the joint overexpression of corn genes with known activity of both osmoprotection, thermotolerance and maintenance of the photosynthetic process constitute a mechanism of risk reduction, against adverse weather conditions, in the production of corn.
  • the Rubisco activase (Rca) protein (Ribulose 1.5, bisphosphate carboxylase oxygenaseactivase) is required for the functioning of the enzyme Rubisco (Re) (Ribulose 1.5, bisphosphate carboxylase oxygenase).
  • the enzyme Re present in all plants is essential for photosynthesis, is very abundant in nature, but inefficient. We have detected that its activity is in varied levels, being that the corn plants with greater activity of Re show greater productivity. In turn, the increase in Re activity is related to the increase in the molecular chaperone content Rca, which fulfills the function of dissociating Re molecules that interfere with its catalytic activity. We have found that Rca doubles in plants that have doubled their productivity, as it is the protein that makes Re work in optimal conditions. (Morales et al., 1999).
  • Cysenic Genetically modified organism with genes of the same species or with genes from sexually compatible species. This term indicates that genes are used with their own regulatory regions as they are; promoter, terminator, introns, and flanking sequences, all with sequential orientation or configuration, naturally found in the genome (Schouten et al., in 2006).
  • cisgenesis The set of genes exploited by cisgenesis is identical to the pool of genes available for traditional breeding and therefore, exogenous genes, such as selection marker genes and transformation vector components, used during modification, must be absent or should be eliminated from the first generation of cisgenic transformants or their progeny. Since its publication, cisgenic technology has been limited to the use of complete gene sequences, however, some developments based on the use of an organism's own sequences included the use of fragments of different genes or regulatory regions, which although they originate from the same species or compatible species, are not complete genes, as established by the original definition of a cisgenic organism.
  • Intragenic Category of a genetically modified organism, based on the phylogenetic distance between the donor or source of DNA and the recipient. The term Intragenic applied to cultures, supposes the shortest phylogenetic distance, between the source and the receptor of DNA, compared with traditionally improved cultures, because the source of DNA comes from the same species or sexually compatible species.
  • the intragenic concept was not limited to the use of complete gene sequences, that is, that in the intragenic organisms it is allowed, the use of novel combinations of sequences, as well as diverse orientations thereof, whenever they come of the same organism or compatible species (Nielsen KM, 2003).
  • Isogenic Group of individuals with the same chromosomal constitution, regardless of their homozygous or heterozygous condition. (FAO Glossary of Biotechnology for Food and Agriculture).
  • Isoogenic Line According to the FAO Biotechnology for Food and Agriculture glossary, the term isogenic is used to describe a group of individuals with the same chromosomal constitution, regardless of their homozygous or heterozygous condition.
  • GMO Genetically Modified Organism
  • a genetically modified organism is any living organism, with the exception of human beings, which has acquired a novel genetic combination, generated through the specific use of modern biotechnology techniques, understood under Article 3, Section VI of the same Law, as modern biotechnology techniques, refer to the application of in vitro deoxyribonucleic acid techniques (DNA and RNA) recombinant and direct injection of nucleic acid into cells or organelles, or the fusion of cells beyond the taxonomic family, which overcomes the natural physiological barriers of reproduction or recombination and which are not techniques used in Traditional reproduction and selection.
  • DNA and RNA in vitro deoxyribonucleic acid techniques
  • a genetically modified organism means an organism in which the genetic material has been altered in a way that does not occur naturally through natural fertilization and / or recombination.
  • GMO and transgenic are used interchangeably as if it were the same concept, however, this is wrong because although all transgenic organisms are genetically modified organisms, not all genetically modified organisms are transgenic.
  • DNA mutations can be induced by irradiation, causing novel combinations of DNA that give rise to a genetically modified organism, but which is not considered transgenic since it does not carry any transgene.
  • Transaen Isolated genetic sequence that is used to transform an organism. Transgenes have the peculiarity that they come from species other than the receptor of said gene. OBJECTS OF THE INVENTION
  • a further object of the present invention is to provide a variety of corn resistant to adverse weather conditions, it is sought to reduce the costs associated with the loss of production or the increasing importation of this cereal.
  • Another object of the present invention is a process to generate isogenic corn derivatives with improved properties that allow to reduce costs related to the implementation of cultivation systems that try to maintain the ideal environment in terms of temperature and humidity for corn growth .
  • a further object of the present invention is to provide a process for producing an isogenic derivative with improved resistance to adverse environmental conditions, obtained from commercial varieties of corn, with the outstanding feature that genetic improvement is achieved without incurring insertion of heterologous DNA, (isogenic or autogenic corn), because a gene from the same plant is used, which is only being overexpressed.
  • Figure 1 is a graph depicting the isogenic construction for overexpressing Rca. It exclusively includes corn DNA sequences. The pairs of oligonucleotides used for the identification of the isogenic plants carrying said construction are indicated.
  • Figure 2 shows the identification of isogenic plant. PCR products amplified with oligonucleotides designed to check the insertion of the isogenic construct.
  • Figure 3 is a table showing plant height, leaf area, ear length, ear diameter, and grain yield in corn plants with different Rubisco activasa content.
  • the type of corn specifies that Zo is an original variety of corn, while Z 23 indicates that it is the same variety, subjected to 23 cycles of agronomic improvement to obtain greater grain yield, which also promoted increased content from Rubisco activasa. Data taken from Morales et al. 1999.
  • Figure 4 is a graph showing the overexpression of Rca in an isogenic corn plant. Different dilutions of total protein extracts were analyzed, obtained from 1 cm 2 of the immediate leaf superior to the fruit of an isogenic line and control plants sown with seed of the parental variety of the isogenic line. The results show that the Rca overexpressing isogenic plant has a greater amount of Rca in the crude protein extracts.
  • Figure 5 is a graph showing the speed of photosynthesis in corn plants expressing contrasting amounts of Rca, during the grain filling period.
  • Photosynthesis was measured in situ with a gas exchange analyzer (IRGA) in the immediate leaf superior to the fruit, during different days of the grain filling period (8, 16, 40, 48, and 56 days after pollination) in three types of corn (Z 0 , Z 10 , Z23).
  • IRGA gas exchange analyzer
  • the speed of photosynthesis is expressed by sheet.
  • Zo is an original variety of corn, while Z 10 and Z 23 are the same variety but subject to 10 and 23 cycles of agronomic improvement respectively, to obtain greater grain yield, which also promoted the gradual increase of the Rubisco activasa content. Data taken from Morales et al. 1999.
  • the invention described herein has as its main purpose, to reduce the vulnerability of corn cultivation to the predicted climatic conditions during climate change associated with global warming and water scarcity due to natural climate variability. By having a variety of corn resistant to adverse weather conditions, it is sought to reduce the costs associated with the loss of production or the increasing importation of this cereal. It also seeks to reduce costs related to the implementation of cultivation systems that deal with to maintain the ideal environment in terms of temperature and humidity for the growth of corn.
  • the objective of the invention is to provide a method for obtaining varieties of corn whose productivity characteristics contribute to ensuring access to corn to populations that require it in the near future, also benefiting their economy.
  • the present invention provides a viable and non-controversial alternative in maize improvement systems, without resorting to the planting of transgenic corn.
  • the invention relates to the application of a process for producing an isogenic derivative with improved resistance to adverse environmental conditions, obtained from commercial varieties of corn, with the outstanding feature that genetic improvement is achieved without incurring insertion of heterologous DNA, which is why we call it isogenic or autogenic corn, because we use a gene from the same plant, which is only being overexpressed as described below.
  • Cysgenesis and Intragenesis are also related and are used around the world to describe the genetic modification of an organism, which does not compromise the integrity of its DNA, that is, it is not obtained through a mixture of DNAs from different sources.
  • a fragment of the plant's own DNA is introduced, which is used to overexpress or repress the expression of a specific gene (Rommens, 2004, Conner et al., 2007, Schouten et al., 2008 , Joshi et al., 2011).
  • the mechanism to achieve this type of modification depends on the physiological characteristics, propagation and growth time of the plant to be improved.
  • cisgenic plants by bombarding two linear DNA sequences, one with the desired gene and another with a selection marker gene that can be of different origin to the plant, only to allow the screening of successful events of DNA transfer Then by directed segregation of the descending plants, those new plants, now called cisgenic, are sought, which only inherited the desired gene without the marker gene (Romano et al., 2003, Yao et al., 2006).
  • the function of the marker is selected is that when expressed in the transformed cell, it confers a positive selective advantage allowing this cell to survive and divide in the presence of a selective agent as long as the division or multiplication of cells (or organisms) is inhibited not transformed
  • an isogenic corn plant differs from cisgenic modifications because the physical insertion is of a combination of linear units of DNA, not including different fragments of the plant's DMA and regardless of marker genes, by which, the search for successful transformation events, is performed by analyzing in each regenerated plant, the unit of inserted DNA.
  • the modification, autogenic or isogenic that is described is an approximation that takes the desired agronomic characteristics from conventional improvement and, through the genetic engineering learned from transgenic techniques, modifies the expression of plant genes, to obtain, at the end, a plant without DNA of other species.
  • the method described here offers the advantage of obtaining a derivative of a commercial variety of corn, using the genetic resources of the plant itself, both for the identification process and for the final obtaining of the improved plants.
  • the process refers to the procedure to obtain the joint overexpression of specific genes that provide the plant with tolerance towards adverse environmental conditions.
  • the method includes the detection and characterization of maize genes that are decisively involved in the processes of both photosynthesis and drought resistance and thermal stress tolerance.
  • Rubisco activase (Rca) protein isolated from Zea mays L
  • Rubisco (Re) the catalytic activity of the enzyme Rubisco (Re)
  • Re the catalytic activity of the enzyme Rubisco
  • Rca is essential to carry out photosynthesis; Corn varieties that overexpress Rca have higher growth and are more productive.
  • Other research has also demonstrated the importance of Rca in the ability of Nicotiana tabaecum plants to assimilate CO 2 and to activate the phytosynthetic rate, (Arvidsson I. Et al. 1995). The positive effect that Rca has on the plant has also been reported. C 4 photosynthesis at high temperatures, (Hendrickson L. Et al. 2008).
  • genes of corn whose orthologs in other plants, protect the cells from water stress.
  • These genes such as those belonging to the LEA family (Battaglia et al. 2008) and dehydrins, in addition to providing osmoprotection to plant cells, can also be used as effective systems for selecting transformed, drought-resistant plants.
  • These two proteins have been identified by our working group, as key proteins, present in corn plants previously selected for their tolerance to drought conditions.
  • Biobalistics or particle bombardment unlike other methods, consists of the acceleration of spherical and inert micro particles, of gold or tungsten, which carry the DNA that you want to insert. Acceleration is achieved by gas propulsion, which causes the particles with DNA to be fired at the target cells. This is done inside a vacuum chamber that allows you to precisely direct each shot. This allows the particles that carry the DNA to break the cell wall of the plant tissues and thus deposit the desired DNA molecules near the nucleus. (Klein et al., 1987).
  • DNA that promotes the expression of a specific corn protein which as already described above, was chosen because it confers advantages of adaptation towards adverse weather conditions. At the same time that these phenotypic advantages are used to distinguish transformed plants from those that are not.
  • the ZmRca protein (Zea mays, ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase, activated) was overexpressed to favor the photosynthetic process, while in order to benefit drought resistance, overexpression of the ZmLEA4 proteins (Zea) was chosen mays, late embryogenesis abundant protein 4) and a corn dehydride, in addition to the overexpression of the ZmFes1 gene (Zea mays factor exchange 1 of HSP 70) to increase the tolerance of corn to caloric stress.
  • Rca protein In the case of the Rca protein, it is known that in maize there are two genes called ZmRcal and ZmRca2, both have identical nucleotide sequence in the coding region, thereby originating the same polypeptide of approximately 381 amino acids and molecular mass around 43 kDa. The appearance of another smaller isoform (41 kDa) is explained in terms of a post-translational regulation mechanism in which a protease that cuts the 43 kDa polypeptide into its N-amino terminal region has been implicated.
  • the two genes that encode Rca in corn distinguish each other, because they have in their region 3 'UTR different number of motifs similar to elements called DST, which are related to the rapid degradation rate of the mRNA that contains them; specifically, in the case of corn, the DST elements seem to respond to a circadian type regulation (Ayala et al., 2004).
  • the Rca protein coding sequence without its 3'UTR region was used to avoid the destabilizing effect of the DST elements.
  • the general strategy for the modification of the genetic expression that we carried out during the development of the invention was carried out in the following stages: Design of the expression cassette, introduction of DMA in corn, induction, proliferation and regeneration of embryogenic calluses of corn, transplanting and acclimatization of plants, identification of improved corn, characterization of improved corn.
  • Nucleotide sequences of interest are isolated from plasmids, after cloning them, as they serve as vehicles for large-scale cloning of said sequences.
  • the isolation is carried out through the use of restriction enzymes to subsequently facilitate the binding of said sequences to each other by the action of a ligase enzyme. Obtained by this route, the overexpression cassette is subcloned into another plasmid for replication. Again, restriction enzymes are used to obtain the complete cassette, and this is separated from the rest of the plasmid, by fractionation in agarose gels, where it is subsequently purified and concentrated in sufficient quantity for biobalistic transformation.
  • the promoter nucleotide sequence is understood as the DNA sequence naturally present in the corn genome, which It contains the binding regions for RNA polymerase and for the protein factors that initiate the process of transcription of a gene.
  • promoter sequences chosen is preferably the promoter of the small subunit of the enzyme Rubisco [SEQ ID NO: 1] and the promoter of the ubiquitin protein 1 [SEQ ID NO: 2 ⁇ . Both from corn DNA.
  • the terminator is a DNA sequence of the corn genome, which contains the signals necessary to stop the activity of RNA polymerase, thereby ending the transcription process.
  • terminator sequences chosen is preferably the terminator of the small subunit of the enzyme Rubisco [SEQ ID NO: 3] (Sequence Y00322.1 of Gene Bank).
  • the Rca overexpression cassette [SEQ ID NO: 6] was achieved by joining the corn Rca coding sequence [SEQ ID NO: 4], under the control of the Rubisco small subunit promoter [SEQ ID NO: 1] and the terminator of the Rubisco small subunit [SEQ ID NO: 3].
  • the expression cassette is illustrated in Figure 1. This DNA structure penetrates the cells that receive it by bombardment, and incorporates the genetic material to its genome enabling the generation of genetically modified plants in terms of Rca expression.
  • Overexpression cassettes containing the chosen corn DNA construct are incorporated into the genomic DNA of the cells, bombarding 0.3 to 0.5 g of embryogenic corn corns. This is achieved, the physical introduction of 0.5 to 1 mg of tungsten or gold microparticles, 0.4 to 1 nm in diameter, which carry 0.3 to 0.1 ng of the overexpression cassette.
  • the introduction of the microparticles is driven by bombardment with a Helium pressure of 650-900 psi, in an atmosphere of 20-28 in Hg of vacuum, inside a biobalistic chamber, from a distance of 6 to 13 cm.
  • embryogenic calluses are incubated for a week at room temperature in dark conditions to minimize the effect of stress caused by the biobalistic process in the cells. Immediately of the recovery period that follows the bombing, the calluses are subcultured every 10 to 20 days in different culture media to proliferate the material, and until the regeneration of the entire plants is achieved. Induction, proliferation and regeneration of corn embryogenic calluses: To achieve the overexpression of the proteins indicated above, adequate corn cells are required, which can regenerate a new plant, these cells are called embryogenic calluses and have the ability to generate whole plants. Induction of the formation of embryogenic corns of corn, type II, is done by extracting immature zygotic embryos, harvested when they are 1 to 2 cm long, which usually occurs 11 to 18 days after the onset of flowering period of adult plants.
  • the ability to generate embryogenic calluses depends on the genotype used (Armstrong, 1994). In the case of obtaining improved maize tolerant to drought and / or high temperatures, the use of native varieties is preferred, which have the ability to generate viable, friable embryogenic calli, with high proliferation rate and high regeneration potential; as is the case of the Tuxpe ⁇ o breed, which has been tested for such effects (Vargas et al., 2012).
  • Immature zygotic embryos are placed in N6I induction culture medium with subcuits every 10 to 20 days, until promoting the formation of embryogenic callus (Garrocho et al., 2012) .
  • the proliferation of bombarded embryogenic calli is carried out by culturing them in medium of N6P proliferation culture, for 30 to 120 days, with subcuits every 15 to 25 days.
  • the regeneration of the plants is obtained with periodic subcultures for 15 to 25 days, in which the concentration of growth factors present in the culture medium is gradually decreased from 100% to 0%.
  • the regenerated plants are kept in MS culture medium, enriched with factors that favor the rooting of the plants. In this case, subcultures to new sterile containers are made periodically every 25 - 45 days.
  • Transplantation and acclimatization of plants The obtained seedlings are transferred to a sufficiently moist organic substrate contained in containers of 0.5 to 1L capacity with holes in the bases.
  • the container and the plant are covered with materials that allow the passage of light but that can create an airtight environment, which will decrease as the plant adapts to the environmental conditions.
  • the containers, with plants, already covered, are kept in greenhouse conditions with temperatures between 25 ° to 35 ° C and with light-dark photoperiods.
  • the Rca sequence was taken from the sequence reported in GenBank: AF084478.3.
  • the nucleotide sequence of Rca that was bombarded was specifically the cDNA comprising the leader sequence that directs the entry of the protein into the chloroplast and the entire coding region from the N 'end to the C end, not including the non-translatable regions.
  • Plants obtained from Rca overexpressors following this procedure have a higher Rca content, due to the effective insertion of the overexpression cassette.
  • Such such as corn with a higher Rca protein content obtained by conventional agronomic techniques (Morales ef a /., 1999).
  • Plants transformed in this way have the advantage of being a genetically modified organism in the short term, which does not resort to the insertion of transgenes, because the white protein is specific to the genome of the same corn and also because the biobalistic technique allows insertion only the cassettes of the sequences of interest, avoiding the complete structures of the vectors.
  • the bombed construction consists of a plant transformation vector that contains the genetic sequence encoding the Rubisco activase (Rca) protein that may be under the direction of the small subunit of Rubisco promoter.
  • the plants obtained are evaluated to determine the degree of purity of their DNA, comparing it with native corn plants, that is, they have not been improved.
  • the DNA sequence analysis shows that obtaining improved seeds in terms of their ability to adapt to heat stress and / or drought that maintain their seed production is carried out without the introduction of transgenic elements.
  • Figure 1 shows the pairs of oligonucleotides used for the identification of the isogenic plants carrying said construction or cassette amplified by the PCR.
  • Figure 2 shows the results of the PCR amplification of said pairs of oligonucleotides.
  • the PCR amplification was carried out in each of the isogenic plants produced in the laboratory to demonstrate that it was possible to insert a construct based exclusively on DNA sequences, regardless of marker genes from another species.
  • Drought and / or high temperature tolerant corn has the advantage of being an improved organism, obtained without the insertion of transgenes, because the white proteins are specific to the genome of the same corn, avoiding the insertion of complete vector structures with DNA of other organisms.
  • the biobalistic technique allows only the cassettes of the sequences of interest to be inserted.
  • ZmFesI [SEQ ID NO: 7] which is encoded in the genomic DNA of corn, using the method of the invention, that is, by entering the SEQ. ID NO: 7 previously contained in the expression cassette of the invention, which implies its expression under the promoter of the small subunit of Rubisco SEQ ID NO: 1, and the terminator of the small subunit of Rubisco [SEQ ID NO: 3] or using other regulatory regions with similar activities to promote and finalize the transcription process, with the essential characteristic that they come from the corn genome.
  • sequence SEQ ID NO: 7 is reported in the NCBI database, with the access number: NP_001146403.1 and is the result of massive sequencing of corn cDNA under various developmental conditions.
  • dehydrins are involved in complex processes of response to various types of stress (Layton et al., 2010). Our research team determined that this protein is related to the tolerance of the plant towards conditions of drying stress.
  • the dehydrin protein studied was identified by interaction with labeled antibodies in corn plants subjected to dehydration and by alignment and sequencing of the corresponding peptide.
  • another embodiment of the invention relates to the method for overexpressing the dehydrin protein gene that is encoded in the corn genomic DNA, using the method of the invention, that is, by introducing the nucleotide sequence encoding the dehydrin previously contained in the overexpression cassette of the invention, which implies its expression under the promoter of the Small subunit of Rubisco SEQ ID No: 1 or the Corn Ubiquitin promoter SEQ ID No 2 :, and the termination of the small subunit of Rubisco SEQ ID NO: 3 or using other regulatory regions with similar activities to promote and finalize the transcription process, with the essential characteristic that they come from the corn genome.
  • This cassette is incorporated into the genomic DNA of the cells of the embryogenic corns of corn, bombing from 0.3 to 0.5 g of said corns to obtain the introduction of 0.5 to 1 mg of tungsten or gold microparticles, 0.4 to 1 Dm in diameter, which carry 0.3 to 0.1 ng of the overexpression cassette.
  • the introduction of the microparticles is driven by bombardment with a Helium pressure of 650-900 psi, in an atmosphere of 20-28 in Hg of vacuum, within a biobalistic chamber, from a distance of 6 to 13 cm.
  • the present invention provides the means to increase the productivity of corn crops in two or three years, a short period when compared with agricultural cycles that take more than 20 years to double the yield of plantations, for example, by an agricultural method, manual selection was possible, of plants that had higher productivity over 23 years and with this, the number of tons of corn per hectare and the weight per ear of each plant were doubled (Morales et al., 1999).
  • One of the embodiments of the invention relates to the propagation of the most productive plants from somatic embryogenesis, since it is possible to generate embryogenic calli from isogenic plants, facilitating their use on a large scale.
  • Another embodiment of the invention is the process proposed here, it offers the advantage of obtaining an improved variety of corn in terms of its ability to adapt to adverse environmental conditions.
  • the present invention has direct application in the generation of edible crops, whose level of production must be ensured even under adverse environmental conditions, such as those foreseen with the impending climate change.
  • the use of this technology, in crops of food interest, is based on the fact that the plants obtained are free of transgenes, which is favorable because it eliminates any risk related to the use of transgenic organisms.
  • the procedure described here can be applied to different cultures, provided there is the ability to generate totipotential cells in vitro, to ensure the insertion of transcriptional units of DNA from the plant itself.
  • a further embodiment of the invention refers to its applicability to different cultures, because the genes of osmoprotection, thermotolerance and maintenance of photosynthetic activity, are genes widely distributed in plants.
  • the current databases allow searching the nucleotide sequences of these genes, in order to clone them to build transcriptional units composed of a promoter of preference from the same plant.
  • the generation of sogenic corn plants means that the plant obtained through this process maintains the integrity and purity of its DNA with respect to the parental variety, similar to corn crops improved by conventional agricultural techniques, that is, the method described here generates plants that carry only genetic material typical of corn. To verify this, DNA samples from sogenic plants were analyzed in national reference laboratories.
  • Cisgenic plants are similar to raditionally bred plants.

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Abstract

Se describe un proceso para obtener derivados isogénicos de cualquier variedad de maíz con propiedades mejoradas, tales como ser resistente a condiciones ambientales adversas, como sequía y altas temperaturas, al mismo tiempo que presentan mayor crecimiento y producción de grano. El proceso de la invención para obtener dichos derivados de cualquier variedad de maíz dan como resultado una linea de maíz isogénica, es decir, plantas que contienen la misma constitución genética que la variedad original, pero que se caracterizan porque sobreexpresan algunos genes en particular asociados con osmoprotección, termotolerancia y protección de la actividad fotosintética. La presenete invención tiene como característica sobresaliente el mejoramiento genético sin incurrir en la inserción de DNA heterólogo, (maíz isogénico o autogénico), porque se usa un gen de la misma planta, que sólo se está sobreexpresando.

Description

1
PROCESO PARA GENERAR DERIVADOS ISOGÉNICOS DE MAÍZ CON PROPIEDADES MEJORADAS, MEDIANTE LA SOBREEXPRESIÓN GENÉTICA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
5 La presente invención está relacionada con los principios y técnicas utilizadas en la obtención de derivados de variedades vegetales con propiedades mejoradas, y más particularmente, la invención proporciona los procesos para obtener derivados de cualquier variedad de maíz con propiedades mejoradas, tales como ser resistente a condiciones ambientales adversas, como sequía y altas temperaturas, al mismo tiempo
10 que presentan mayor crecimiento y producción de grano. Los métodos de la invención para obtener dichos derivados de cualquier variedad de maíz dan como resultado una línea de maíz isogénica, es decir, plantas que contienen la misma constitución genética que la variedad original, pero que se caracterizan porque sobreexpresan algunos genes en particular asociados con osmoprotección, termotolerancia y protección de la actividad ís fotosintética.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Actualmente existe información científica, técnica y socioeconómica disponible para entender los riesgos asociados ai cambio climático provocado por las actividades 20 humanas.
La naturaleza y la gravedad de los impactos debidos a cambios climáticos, no dependen sólo de los propios fenómenos, sino también de la exposición y la propensión o predisposición a los mismos. De ahí la importancia para diseñar, aplicar y evaluar 25 estrategias destinadas a reducir dichos riesgos. En éste sentido es necesario llevar a cabo un proceso de ajuste al clima real o proyectado y a sus efectos sobre el funcionamiento de los sistemas de cultivo. Se sabe que el cambio climático es un fenómeno actual que se incrementará en el futuro cercano y la tendencia prevista para México indica un aumento en la temperatura y una disminución en los volúmenes de precipitación pluvial. En términos generales, este panorama se traduce como menor disponibilidad de agua para las plantas, daño por altas temperaturas, ciclos más cortos de cultivo, y reducción de áreas con condiciones óptimas para cultivos. Por ello, una de las principales recomendaciones para la agricultura mexicana es desarrollar estrategias de adaptación para estas nuevas condiciones climáticas.
La transformación de los sistemas biológicos, representa un mecanismo viable para acelerar la adaptación de los sistemas agrícolas a las condiciones climatológicas previstas para el futuro cercano. En éste sentido, existen estrategias tradicionales para la selección de variedades vegetales de interés agrícola con propiedades mejoradas. Sin embargo para la obtención de variedades vegetales con propiedades mejoradas mediante los métodos tradicionales, es necesario trabajar durante décadas en la selección de dichas variedades y contar con grandes extensiones de terreno para hacer la siembra de distintas cruzas.
El análisis molecular de algunas variedades mejoradas de maíz seleccionadas por métodos tradicionales han demostrado que las propiedades mejoradas de los cultivos seleccionados se deben a la sobreexpresión de algunos genes en especifico, como es el caso de la proteína Rubisco activasa, la cual, se sobreexpresa en variedades de maíz seleccionadas para tener mayor crecimiento y producción incrementada. Por tanto, el objetivo de esta invención es el uso de estrategias moleculares para la obtención de derivados de cualquier variedad existente de maíz, con propiedades mejoradas, debidas a la sobreexpresión de un determinado gen, sin que se cambie la constitución genética de la variedad de maíz utilizada.
Por consiguiente, la presente invención busca contribuir a aminorar los riesgos asociados al cambio climático, pues describe un procedimiento para generar plantas de maíz con características mejoradas, resistente a condiciones climatológicas adversas, que sobreexpresan uno o varios genes endógenos del maíz, con actividades conocidas de osmoprotección, termoresistencia y activación de la fotosíntesis y que, por tanto no presentan cambios en la constitución genética de la variedad de maíz con la que se trabaja.
El procedimiento se basa en introducir físicamente mediante bombardeo de partículas en células totipotenciales de maiz, las unidades genéticas de la misma planta, que codifican los genes en cuestión para su sobreexpresión. Si bien, la adaptación del maíz, hacia las condiciones climáticas cambiantes sucede habitualmente, éste puede ser un proceso extremadamente lento, pues requiere de la selección y siembra consecutiva de individuos con las características deseadas.
El método ofrece la ventaja de producir un derivado resistente a condiciones climatológicas adversas, de una variedad de maíz que ya se cultiva actualmente. Por ello, al sólo ser producto de la modificación del propio DNA del maíz, las plantas resultantes no están sujetas a ninguna de las reglamentaciones para el uso y manejo de plantas transgénicas. Con todo lo anterior, se destaca la importancia de la generación de cultivos adaptables a ambientes con mayor temperatura y menor disponibilidad de agua que conserven su capacidad productiva, a través de la generación de un maíz mejorado en cuanto a su capacidad de adaptación a condiciones ambientales adversas, mediante la sobreexpresión de uno o varios genes, pero que esencialmente, cuenta con la misma constitución genética (isogénico), que la de cualquier variedad que ya se cultiva a nivel comercial.
Bajo el pronóstico de las nuevas condiciones climatológicas que imperarán en0 México (Informe especial 2012, IPCC), es necesario acelerar éste proceso de adaptabilidad en cultivos indispensables para la economía del país. En éste sentido, la presente invención aporta una opción viable para la generación de derivados de una variedad de maíz mediante la sobreexpresión genética que resulta en plantas de maíz resistentes a condiciones ambientales adversas, con la novedad de que su obtención requiere menor tiempo y con la característica sobresaliente de que no se trata de maíz transgénico. Un transgene es un gene que se ha introducido dentro del genoma de un organismo mediante ingeniería genética. El adjetivo "transgénico" se usa para describir a organismos genéticamente modificados (plantas, animales o microorganismos), la planta transgénica es aquella en la que se ha introducido un gene de otra especie, utilizando métodos de ingeniería genética que pasan las barreras entre las especies; en ocasiones la palabra Transgene se usa para referirse a organismos "genéticamente modificados".
La presente invención se refiere a un proceso para obtener una línea de maíz isogénica, es decir, plantas que contienen la misma constitución genética que la variedad original, pero que se caracterizan porque sobreexpresan algunos genes, en este caso se trata de genes asociados con osmoprotección, termo tolerancia y protección de la actividad fotosintética, particularmente se describe la obtención de líneas isogénicas de maíz que sobreexpresan al gene de la proteína Rubisco activasa (Rca): Ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa oxigenasa. La sobreexpresión conjunta de genes de maíz con actividad conocida tanto de osmoprotección, termotolerancia y mantenimiento del proceso fotosintético, constituyen un mecanismo de disminución de riesgo, frente a condiciones climatológicas adversas, en la producción de maíz. La proteína Rubisco activasa (Rca) (Ribulosa 1,5, bifosfato carboxilasa oxigenasaactivasa) se requiere para el funcionamiento de la enzima Rubisco (Re) (Ribulosa 1,5, bifosfato carboxilasa oxigenasa). (Portis et al. 2007). La enzima Re, presente en todas las plantas es fundamental para realizar la fotosíntesis, es muy abundante en la naturaleza, pero ineficiente. Hemos detectado que su actividad se encuentra en niveles variados, siendo que las plantas de maíz con mayor actividad de Re muestran mayor productividad. A su vez, el incremento de la actividad de Re se relaciona con el aumento del contenido de la chaperona molecular Rca, la cual cumple la función de disociar de Re las moléculas que interfieren con su actividad catalítica. Hemos encontrado que Rca se duplica en las plantas que han doblado su productividad, pues es la proteína que hace funcionar a la Re en condiciones óptimas. (Morales et al., 1999).
La capacidad de Rca para promover el mejoramiento de la fijación de CO2 ha sido documentada en diferentes trabajos, tanto para plantas mono como dicotiledóneas (Mate et al 1993; Morales et al., 1999, Von Caemmerer et al, 2005; DeRidder et al, 2007). La sobreexpresión transgénica de la proteína Rca en diversas plantas, ha sido propuesta como una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos (Solicitud de Patente WO2008074891, sin embargo, la obtención de maíz transgénico mejorado por ésta vía, es una estrategia cuestionable en México por ser considerado el país centro de origen del maíz.
En éste sentido, la sobreexpresión de genes específicos provenientes del propio maíz, tal como aquí se describe, constituye una ventaja importante respecto a la generación de maíces transgénicos, porque mientras éstos últimos siguen siendo objeto de múltiples controversias relacionadas a los riesgos potenciales asociados a su cultivo y consumo, las líneas isogénicas mejoradas no presentan éstos problemas, pues en esencia contienen los mismos componentes de DNA, comparados con variedades de maíces nativos, cultivados y consumidos actualmente. Para la presente invención hacemos algunas precisiones en la definición de la siguiente terminología:
Cisaénico: Organismo genéticamente modificado con genes de su misma especie o con genes provenientes de especies sexualmente compatibles. Éste término indica que los genes se usan con sus propias regiones regulatorías como son; promotor, terminador, intrones, y secuencias flanqueantes, todos con la orientación secuencial o configuración, naturalmente encontrada en el genoma (Schouten et al., en 2006).
El conjunto de genes explotados por la cisgenesis, es idéntico al acervo de genes disponibles para el mejoramiento tradicional y por lo tanto, los genes exógenos, tales como, genes marcadores de selección y componentes de vectores de transformación, usados durante la modificación, deben estar ausentes o deben ser eliminados de la primera generación de transformantes cisgénicas o de su progenie. Desde su publicación, la tecnología cisgénica se limitó al uso de secuencias génicas completas, sin embargo, algunos desarrollos basados en el uso de secuencias propias de un organismo, incluyeron el uso de fragmentos de distintos genes o de regiones regulatorias, que aunque son originarios de la misma especie o especies compatibles, no son genes completos, tal como lo estableció la definición original de un organismo cisgénico.
Como consecuencia el uso de la denotación cisgénico comenzó a usarse indistintamente junto con ei término intragénesis, aun cuando originalmente se definieron como conceptos distintos. A falta de consenso en el uso de dichos términos, nosotros nos apegamos estrictamente a las definiciones originalmente publicadas en la literatura científica. Intragénico: Categoría de un organismo genéticamente modificado, basada en la distancia filogenética que existe entre el donador o fuente de DNA y el receptor. El término Intragénico aplicado a cultivos, supone la distancia filogenética más corta, entre la fuente y el receptor de DNA, comparados con cultivos mejorados tradicionalmente, porque la fuente de DNA proviene de la misma especie o especies sexualmente compatibles. A diferencia del término cisgenesis, el concepto intragénico no se limitó al uso de secuencias génicas completas, esto es, que en los organismos intragénicos se permite, el uso de combinaciones novedosas de secuencias, así como de orientaciones diversas de las mismas, siempre que provengan del mismo organismo o especies compatibles (Nielsen KM, 2003). Isogénico: Grupo de individuos con la misma constitución cromosómica, con independencia de su condición homocigótica o heterocigótica. (Glosario de Biotecnología para la Agricultura y la Alimentación de la FAO). Línea isooénica: De acuerdo con el glosario de Biotecnología para la Agricultura y la Alimentación de la FAO, el término isogénico, se usa para describir un grupo de individuos con la misma constitución cromosómica, con independencia de su condición homocigótica o heterocigótica. Para los fines de ésta patente, se entiende como línea isogénica, a aquellas plantas que se obtienen luego de sobreexpresar genes naturalmente presentes en variedades de maíz, mejoradas por técnicas agronómicas convencionales. Por lo cual, se entiende que las líneas sobreexpresantes así obtenidas, son isogénicas respecto a las variedades de maíz que les dieron origen, porque contienen la misma composición genética que éstas últimas.
Organismo Genéticamente Modificado (GMO): De acuerdo con la Ley Mexicana de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados, Artículo 3, Fracciones XXII y XXIII, un organismo genéticamente modificado (OGM), es cualquier organismo vivo, con excepción de los seres humanos, que ha adquirido una combinación genética novedosa, generada a través del uso especifico de técnicas de biotecnología moderna, entendiéndose dentro del Artículo 3, Fracción VI de la misma Ley, que las técnicas de biotecnología moderna, se refieren a la aplicación de técnicas in vitro de ácido desoxirribonucleico (ADN y ARN) recombinante y la inyección directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la familia taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección tradicional. De acuerdo con la Autoridad de Seguridad Alimentaria Europea (EFSA, European Food Safety Authority), organismo genéticamente modificado significa un organismo en el que el material genético ha sido alterado en una forma que no ocurre naturalmente a través de fertilización y / o recombinación natural. (Artículo 2 de la Legislación de la Unión Europea (2001/18/EG).
Para cada caso en particular, se pueden encontrar controversias al considerar si un organismo ha sido genéticamente modificado en una forma que no ocurre de forma "natural"; el hecho es que las plantas cultivadas pocas veces se asemejan a sus parientes silvestres, y esto es un ejemplo de la inducción humana en las modificaciones genéticas, y aun asf las plantas así cultivadas no se consideran genéticamente modificadas. Comúnmente se usan indistintamente los términos OGM y transgénico como si se tratase del mismo concepto, sin embargo, esto es erróneo porque aunque todos los organismos transgénicos son organismos genéticamente modificados, no todos los organismos genéticamente modificados son transgénicos. Por ejemplo, se pueden inducir mutaciones de DNA mediante irradiación, provocando combinaciones novedosas de DNA que dan origen a un organismo genéticamente modificado, pero que no es considerado transgénico puesto que no porta ningún transgen.
Transaen: Secuencia genética aislada que se usa para transformar un organismo. Los transgenes tienen la particularidad de que provienen de especies diferentes al receptor de dicho gen. OBJETOS DE LA INVENCIÓN
Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención el proveer un proceso para disminuir la vulnerabilidad del cultivo del maíz frente a las condiciones climatológicas previstas durante el cambio climático asociado al calentamiento global y a la escasez de agua por la variabilidad natural del clima..
Un objeto más de la presente invención es el proveer una variedad de maíz resistente a condiciones climatológicas adversas, se busca disminuir los costos asociados a la pérdida de producción o por la importación creciente de este cereal.
Otro objeto más de la presente invención es un proceso para generar derivados isogénicos de maíz con propiedades mejoradas que permita disminuir los costos relacionados a la implementación de sistemas de cultivo que tratan de mantener el ambiente idóneo en cuanto a temperatura y humedad para el crecimiento del maíz.
Es todavía un objeto más de la presente invención proveer un procedimiento para obtener variedades de maíz proporcionando una alternativa viable y no controversial en los sistemas de mejoramiento del maíz, sin recurrir a la siembra de maíz transgénico.
Un objeto adicional de la presente invención es proveer un proceso para producir un derivado isogénico con características mejoradas de resistencia a condiciones ambientales adversas, obtenida a partir de variedades comerciales de maíz, con la característica sobresaliente de que el mejoramiento genético se logra sin incurrir en la inserción de DNA heterólogo, (maíz isogénico o autogénico), porque se usa un gen de la misma planta, que sólo se está sobreexpresando. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de una modalidad particularmente preferida de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales: La figura 1 es un gráfico que representa la construcción isogénica para sobreexpresar Rca. Incluye exclusivamente secuencias de DNA de maíz. Se señalan los pares de oligonucleótidos usados para la identificación de las plantas isogénicas portadoras de dicha construcción. La figura 2 presenta la identificación de planta isogénica. Productos de PCR amplificados con oligonucleótidos diseñados para comprobar la inserción de la construcción isogénica.
La figura 3 es una tabla que muestra la altura de plantas, Área foliar, Longitud de mazorca, Diámetro de mazorca, y Rendimiento de grano en plantas de maíz con diferente contenido de Rubisco activasa. El tipo de maíz especifica que Zo es una variedad original de maíz, mientras que Z23 indica que es la misma variedad, sometida a 23 ciclos de mejoramiento agronómico para obtener mayor rendimiento de grano, con lo cual, también se promovió el incremento del contenido de Rubisco activasa. Datos tomados de Morales et al. 1999. La figura 4 es una gráfica que presenta la sobreexpresión de Rca en una planta isogénica de maíz. Se analizaron diferentes diluciones de extractos de proteína total, obtenidos a partir de 1 cm2 de la hoja inmediata superior al fruto de una línea isogénica y de plantas control sembradas con semilla de la variedad parental de la línea isogénica. Los resultados muestran que la planta isogénica sobreexpresante de Rca tiene mayor cantidad de Rca en los extractos crudos de proteínas.
La figura 5 es una gráfica que presenta la velocidad de fotosíntesis en plantas de maíz que expresan cantidades contrastantes de Rca, durante el período de llenado de grano. La fotosíntesis se midió in situ con un analizador de intercambio gaseoso (IRGA) en la hoja inmediata superior ai fruto, durante diferentes días del periodo de llenado de grano (8, 16, 40, 48, y 56 días después de la polinización) en tres tipos de maíz (Z0, Z10, Z23). La velocidad de fotosíntesis está expresada por hoja. Zo es una variedad original de maíz, mientras que Z10y Z23 son la misma variedad pero sometida a 10 y 23 ciclos de mejoramiento agronómico respectivamente, para obtener mayor rendimiento de grano, con lo cual, también se promovió el incremento gradual, del contenido de Rubisco activasa. Datos tomados de Morales et al. 1999.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención aquí descrita tiene como propósito principal, disminuir la vulnerabilidad del cultivo del maíz frente a las condiciones climatológicas previstas durante el cambio climático asociado al calentamiento global y a la escasez de agua por la variabilidad natural del clima. Al contar con una variedad de maíz resistente a condiciones climatológicas adversas, se busca disminuir los costos asociados a la pérdida de producción o por la importación creciente de este cereal. También se busca disminuir los costos relacionados a la implementación de sistemas de cultivo que tratan de mantener ei ambiente idóneo en cuanto a temperatura y humedad para el crecimiento del maíz.
El objetivo de la invención es proveer de un procedimiento para obtener variedades de maíz cuyas características de productividad contribuyen a asegurar el acceso al maíz a las poblaciones que lo requieran en el futuro cercano, beneficiando también su economía. La presente invención proporciona una alternativa viable y no controversial en los sistemas de mejoramiento del maíz, sin recurrir a la siembra de maíz transgénico.
La invención se refiere a la aplicación de un proceso para producir un derivado isogénico con características mejoradas de resistencia a condiciones ambientales adversas, obtenida a partir de variedades comerciales de maíz, con la característica sobresaliente de que el mejoramiento genético se logra sin incurrir en la inserción de DNA heterólogo, razón por la cual le llamamos maíz isogénico o autogénico, porque usamos un gen de la misma planta, que sólo se está sobreexpresando como se describe más adelante.
Los términos Cisgénesis e Intragénesis también están relacionados y son usados alrededor del mundo para describir la modificación genética de un organismo, que no compromete la integridad de su DNA, es decir que no se obtiene a través de una mezcla de DNAs de diferentes fuentes. En las plantas cisgénicas se introduce un fragmento de DNA propio de la planta, que es usado para sobreexpresar o para reprimir la expresión de un gen específico de la misma (Rommens, 2004, Conner et al., 2007, Schouten et al., 2008, Joshi et al., 2011). El mecanismo para lograr éste tipo de modificaciones, depende de las características fisiológicas, de propagación y tiempo de crecimiento de la planta por mejorar. El más usado ha sido mediante la inserción de plásmidos que se combinan con el genoma de la planta y en los que queda insertada la unidad de DNA deseada, originaría de la misma planta o plantas relacionadas (Rommens etal., 2005). En algunos de éstos casos, aún resulta controversial que pequeños fragmentos de DNA, principalmente de origen bacteriano, son detectables por técnicas moleculares convencionales como PCR o southernblot, en las nuevas plantas mejoradas (Baeksted Holme et al., 2013).
En otros casos se ha logrado la obtención de plantas cisgénicas bombardeando dos secuencias lineales de DNA, una con el gen deseado y otra con un gen marcador de selección que puede ser de origen diferente a la planta, sólo para permitir el escrutinio de eventos exitosos de transferencia de DNA. Luego por segregación dirigida de las plantas descendientes, se buscan aquellas nuevas plantas, ahora denominadas cisgénicas, que sólo heredaron al gen deseado sin el gen marcador (Romano et al., 2003, Yao et al., 2006). La función del marcador se selección es que al expresarse en la célula transformada, le confiere una ventaja selectiva positiva permitiendo que esta célula sobreviva y se divida en presencia de un agente selectivo en tanto que se inhibe la división o multiplicación de células (u organismos) no transformados.
Ésta nueva generación de plantas modificadas genéticamente, ha comenzado ya a producir una gran cantidad de solicitudes de patentes, para diferentes universidades o compañías, en cultivos de interés comercial como papa, manzana y cebada, con la finalidad de proteger la propiedad intelectual de los nuevos desarrollos. Así mismo, existen diferentes estudios, algunos de ellos confidenciales, en otros cultivos como alfalfa, álamos o fresa entre otros, que rápidamente incrementarán el número de patentes (Baeksted Holme et al., 2013).
En éste sentido, la producción de una planta de maíz isogénica, se diferencia de las modificaciones cisgénicas porque la inserción física, es de una combinación de unidades lineales de DNA, sin incluir fragmentos diferentes del DMA de la planta y prescindiendo de genes marcadores, por lo cual, la búsqueda de eventos exitosos de transformación, se realiza analizando en cada planta regenerada, la unidad de DNA insertada. La modificación, autogénica o isogénica que se describe, es una aproximación que toma del mejoramiento convencional las características agronómicas deseadas y mediante la ingeniería genética aprendida de las técnicas transgénicas, modifica la expresión de genes de la planta, para obtener al final, una planta sin DNA de otras especies.
El método aquí descrito ofrece la ventaja de lograr un derivado de una variedad comercial de maíz, usando los recursos genéticos de la propia planta, tanto para el proceso de identificación como para la obtención final de las plantas mejoradas. El proceso, se refiere al procedimiento para obtener la sobreexpresión conjunta de genes específicos que proporcionan a la planta tolerancia hacia las condiciones ambientales adversas.
El método incluye la detección y caracterización de los genes de maíz que participan de forma determinante en los procesos tanto de fotosíntesis como de resistencia a la sequía y de tolerancia al estrés térmico. Nuestro equipo de investigación reportó el papel que tiene la proteína Rubisco activasa (Rca) (aislada de Zea mays L), como limitante de la actividad catalítica de la enzima Rubisco (Re), (Sanchez-de-Jimenez Et al. 1995) la cual a su vez, como ya hemos mencionado, es fundamental para realizar la fotosíntesis; las variedades de maíz que sobreexpresan Rca tienen mayor crecimiento y son más productivas. Otras investigaciones también han demostrado la importancia de la Rca en la capacidad de plantas Nicotiana tabaecum para asimilar CO2 y para activar la tasa fontosintética, (Arvidsson I. Et al. 1995).También se ha reportado el efecto positivo que tiene Rca en la fotosíntesis C4a temperaturas altas, (Hendrickson L. Et al. 2008).
Respecto a los mecanismos moleculares que se llevan a cabo durante la exposición de las plantas a períodos de sequía, se conoce que existen genes de maíz, cuyos ortólogos en otras plantas, protegen a las células del estrés hídrico. Estos genes, como los pertenecientes a la familia LEA (Battaglia et al. 2008) y las dehidrinas, además de brindar osmoprotección a las células vegetales, también pueden ser usados como sistemas efectivos de selección de plantas transformadas, resistentes a la sequía. Estas dos proteínas se han identificado por nuestro grupo de trabajo, como proteínas clave, presentes en plantas de maíz previamente seleccionadas por su tolerancia a condiciones de sequía.
Por otra parte, se conoce que la proteína FeslA fue identificada por primera vez en la planta Arabidopsis thaliana, como un componente substancial que se expresa, durante la vía de respuesta a estrés por calor. En maíz (Zea mays) no se han reportado ortólogos de esta proteína por lo que nuestro grupo de investigación se dio a la tarea de identificar y caracterizar a éste ortólogo con la finalidad de sobreexpresarlo. Se encontró que el aumento de la expresión del gen Z/nFesI , está relacionado con la aclimatación de plantas de maíz sometidas a tratamientos de estrés térmico. Con todo lo anterior, se destaca la inventiva del proceso aquí expuesto, la cual consiste en sobreexpresar de forma integral genes originarios de maíz participantes en actividades de osmoprotección, termotolerancia y promoción de la fotosíntesis. Esta sobreexpresión se lleva a cabo mediante la técnica de bombardeo de partículas y mediante la selección de las plantas sobreexpresantes haciendo uso de las características de mejoría que los mismos genes ofrecen, evitando con ello la inserción de DNA extraño al maíz.
La biobalística o bombardeo de partículas, a diferencia de otros métodos, consiste en la aceleración de micro partículas esféricas e inertes, de oro o tungsteno, las cuales transportan el DNA que se desea insertar. La aceleración se logra mediante propulsión gaseosa, la cual provoca que las partículas con DNA salgan disparadas hacia las células blanco. Ésto se realiza dentro de una cámara de vacío que permite dirigir de forma precisa, cada disparo. Con ello se logra que las partículas que portan el DNA rompan la pared celular de los tejidos vegetales y de ésta forma depositan en la cercanía del núcleo, las moléculas de DNA deseadas. (Klein et al., 1987).
Las células transformadas de éste modo son indistinguibles de aquellas que no han sido transformadas, por ello, habitualmente se dispara la secuencia de interés junto con alguna otra secuencia de DNA que codifica para que la planta transformada desarrolle una característica fenotípica que la diferencie de las plantas no transformadas. Generalmente se usan genes que confieren resistencia a herbicidas o antibióticos. En el procedimiento que aquí se describe se usa únicamente la secuencia de
DNA que promueve la expresión de una proteína de maíz específica, que como ya se describió anteriormente, fue elegida por que confiere ventajas de adaptación hacia las condiciones climatológicas adversas. Al mismo tiempo que se usan éstas ventajas fenotípicas para distinguir las plantas transformadas, de aquellas que no lo son.
Por una parte se sobreexpresó a la proteína ZmRca (Zea mays, ribulose 1,5 - bisphosphate carboxylase / oxygenase, activase) para favorecer el proceso fotosintético, mientras que para beneficiar la resistencia a la sequía se eligió la sobreexpresión de las proteínas ZmLEA4 (Zea mays, late embryogenesis abundant protein 4) y una dehidrína de maíz, adicionalmente a la sobreexpresión del gen ZmFes1 (Zea mays factor exchange 1 of HSP 70) para incrementar la tolerancia del maíz hacia el estrés calórico.
En el caso de la proteína Rca, se conoce que en maíz existen dos genes llamados ZmRcal y ZmRca2, ambos tienen idéntica secuencia de nucleótidos en la región codificadora, originando con ello el mismo polipéptido de aproximadamente 381 aminoácidos y masa molecular alrededor de 43 kDa. La aparición de otra isoforma más pequeña (41 kDa) se explica en términos de un mecanismo de regulación post- traduccional en el que se ha implicado a una proteasa que corta al polipéptido de 43 kDa en su región N-amino terminal. Los dos genes que codifican Rca en maíz, se distinguen entre sí, porque tienen en su región 3' UTR diferente número de motivos similares a elementos llamados DST, los cuales están relacionados con la rápida velocidad de degradación del mRNA que los contiene; específicamente, en el caso del maíz, los elementos DST parecen responder a una regulación de tipo circadiano (Ayala et al., 2004).
Para lograr la sobreexpresión de Rca, se utilizó la secuencia codificante de la proteína Rca sin su región 3'UTR para evitar el efecto desestabilizante de los elementos DST. La estrategia general para la modificación de la expresión genética que llevamos a cabo durante el desarrollo de la invención se llevó a cabo en las siguientes etapas: Diseño del cassete de expresión, introducción de DMA en maíz, inducción, proliferación y regeneración de callos embriogénicos de maíz, transplante y aclimatación de plantas, identificación del maíz mejorado, caracterización del maíz mejorado.
Diseño del cassete de expresión: La sobre-expresión de un gen se entiende como el incremento en la producción del RNA mensajero que codifica para una proteína específica. Para la obtención del maíz mejorado con tolerancia a sequía y/o altas temperaturas, conservando su capacidad productiva, la sobre-expresión se consigue uniendo la secuencia del gen de maíz en cuestión, con secuencias nucleotídicas promotoras y terminadoras del proceso de transcripción, procedentes del DNA de maíz.
Éste procedimiento se realiza usando herramientas de ingeniería genética convencional. Se aislan las secuencias nucleotídicas de interés (genes o regiones regulatorias) a partir de plásmidos, previa clonación en éstos, pues nos sirven de vehículos para la clonación a gran escala de dichas secuencias. El aislamiento se realiza mediante el uso de enzimas de restricción para posteriormente, facilitar la unión de dichas secuencias entre sí mediante la acción de una enzima ligasa. Obtenido por ésta vía, el cassette de sobreexpresión es subclonado en otro plásmido para su replicación. Nuevamente se usan enzimas de restricción para obtener el cassette completo, y éste es separado del resto del plásmido, mediante el fraccionamiento en geles de agarosa, de donde es subsecuentemente purificado y concentrado en cantidad suficiente para la transformación por biobalística.
Para los fines de ésta invención, se entiende como secuencia nucleotídica promotora, a la secuencia de DNA naturalmente presente en el genoma del maíz, que contiene las regiones de unión para la RNA polimerasa y para los factores proteicos que dan inicio al proceso de transcripción de un gen.
Entre las secuencias promotoras elegidas se encuentra de preferencia, el promotor de la subunidad pequeña de la enzima Rubisco [SEQ ID NO: 1] y el promotor de la proteína ubiquitina 1[SEQ ID NO: 2\. Ambas provenientes del DNA de maíz.
Para los fines de ésta invención, el terminador es una secuencia de DNA del genoma del maíz, que contiene las señales necesarias para detener la actividad de la RNA polimerasa, finalizando con ello el proceso de transcripción.
Entre las secuencias terminadoras elegidas se encuentra de preferencia, el terminador de la subunidad pequeña de la enzima Rubisco [SEQ ID NO: 3] (Secuencia Y00322.1 del Gene Bank).
La secuencia nucleotídica de Rubisco activasa, en el DNA de maíz, fue anotada en la base de datos Gene Bank con el Número de acceso: AF305876.3 [SEQ ID NO: 4] por nuestro grupo de investigación (Ayala et al., 2004). La secuencia empleada para lograr su sobreexpresión, codifica para la proteína Rca [SEQ ID NO: 5] y contiene la secuencia líder que dirige la entrada de la proteína Rca al cloroplasto y la región codificante completa desde el extremo N' hasta el extremo C, sin las regiones no traducibles (UTR), a fin de evitar señales responsivas al ciclo circadiano, que confieren inestabilidad a los mRNAs de Rubisco activasa y que se encuentran en las secuencias 3' UTR (Ayala et al., 2004). La unión de las secuencias del gen que codifica la proteína deseada, el promotor y el terminador, constituyen un cassette de sobreexpresión homólogo al genoma de maíz. Como ejemplo, el cassette de sobreexpresión de Rca [SEQ ID NO: 6] se logró uniendo la secuencia codificante de Rca de maíz [SEQ ID NO: 4], bajo el control del promotor de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID NO: 1] y el terminador de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID NO: 3].EI cassete de expresión se ilustra en la figura 1. Esta estructura de DNA, penetra a las células que la reciben por bombardeo, e incorporan el material genético a su genoma posibilitando la generación de plantas modificadas genéticamente en cuanto a la expresión de Rca.
Introducción de DNA en maíz: Los cassettes de sobreexpresión que contienen la construcción elegida del DNA de maíz, se incorporan al DNA genómico de las células, bombardeando de 0.3 a 0.5 g de callos embriogénicos de maíz. Así se logra, la introducción física de 0.5 a 1 mg de micropartículas de tungsteno u oro, de 0.4 a 1 nm de diámetro, las cuales portan de 0.3 a 0.1 ng del cassette de sobreexpresión. La introducción de las micropartículas se impulsa por bombardeo con una presión de Helio de 650 - 900 psi, en una atmósfera de 20 - 28 in Hg de vacío, dentro de una cámara de biobalística, desde una distancia de 6 a 13 cm.
Después del bombardeo, los callos embriogénicos se incuban durante una semana a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad para minimizar el efecto de estrés que ocasiona el proceso de biobalística en las células. Inmediatamente del período de recuperación que sigue al bombardeo, los callos son subcultivados cada 10 a 20 días en diferentes medios de cultivo para proliferar el material, y hasta alcanzar la regeneración de las plantas completas. Inducción, proliferación y regeneración de callos embriogénicos de maiz: Para lograr la sobre-expresión de las proteínas señaladas anteriormente, se requiere de células de maíz adecuadas, que puedan regenerar una nueva planta, esas células se llaman callos embriogénicos y tienen la capacidad de generar plantas completas. La inducción de la formación de callos embriogénicos de maíz, tipo II, se realiza mediante la extracción de embriones cigóticos inmaduros, cosechados cuando éstos tienen una longitud de 1 a 2 cm, lo cual sucede habitualmente a los 11 a 18 días después del inicio del período de floración de plantas adultas.
La capacidad de generar callos embriogénicos depende del genotipo usado (Armstrong, 1994). En el caso de la obtención del maíz mejorado tolerante a sequía y/o altas temperaturas, se prefiere el uso de variedades autóctonas, que posean la capacidad de generar callos embriogénicos viables, friables, con alta tasa de proliferación y elevado potencial de regeneración; como es el caso de la raza Tuxpeño, la cual ha sido probada para tales efectos (Vargas et al., 2012).
Los embriones cigóticos inmaduros se colocan en medio de cultivo de inducción N6I con subcuitivos cada 10 a 20 días, hasta promover la formación del callo embriogénico (Garrocho et al., 2012).La proliferación de los callos embriogénicos bombardeados, se realiza cultivándolos en medio de cultivo de proliferación N6P, durante 30 a 120 días, con subcuitivos cada 15 a 25 días. La regeneración de las plantas se obtiene con subcultivos periódicos de 15 a 25 días, en los cuales se disminuye paulatinamente del 100% al 0%, la concentración de los factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo. Finalmente, las plantas regeneradas se mantienen en medio de cultivo MS, enriquecido con factores que favorecen el enraizamiento de las plantas. En éste caso los subcultivos a nuevos contenedores estériles, se realizan periódicamente cada 25 - 45 días.
Transplante y aclimatación de plantas: Las plántulas obtenidas se traspasan a sustrato orgánico suficientemente húmedo contenido en envases de 0.5 a 1L de capacidad con agujeros en las bases.
El envase y la planta se cubren con materiales que permitan el paso de la luz pero que puedan crear un ambiente hermético, el cual irá disminuyendo según vaya adaptándose la planta a las condiciones ambientales. Los envases, con plantas, ya cubiertos, son mantenidos en condiciones de invernadero con temperaturas entre 25° a 35 ° C y con fotoperiodos de luz - oscuridad.
Identificación del maíz mejorado: La funcionalidad y ventaja de cada cassette de sobreexpresión insertado en la planta de maíz, se acredita sometiendo las plantas a estrés por calor y/o sequía, y se comprueba la generación y viabilidad de la semilla.
Recapitulando lo anterior, una vez obtenido el cassette de sobre-expresión, el proceso de la invención para obtener plantas sobreexpresantes de Rca se describe paso a paso:
1. Inducir la formación de callo embríogénico a partir de maíz costeño cosechado a los 14-18 días después del inicio de la etapa de floración, 2. propagar el callo embriogénico en medio de cultivo adecuado,
3. separar 0.3 g de callo embriogénico para cada evento de transformación,
4. colocar el callo dentro de la cámara en la que se llevará a cabo el bombardeo de la construcción genética,
5. disparar la construcción genética sobre el material genético,
6. dejar en condiciones de oscuridad al callo bombardeado, durante una semana, para su recuperación ,
7. continuar la propagación del callo embriogénico sin presencia de agentes de selección, durante seis semanas.
8. inducir la regeneración de plántulas, disminuyendo paulatinamente el porcentaje de auxinas del medio de cultivo sin presencia del agente de selección, durante siete semanas.
9. mantener plántulas en medio de crecimiento hasta que la parte aérea de la plántula y su raíz, estén suficientemente desarrolladas, con la finalidad de cambiar las plántulas del medio de cultivo a un sustrato de tierra (seis a ocho semanas),
10. mantener las plantas de maíz hasta alcanzar la edad adulta de formación de fruto,
11. caracterizar las plantas obtenidas, así como sus frutos.
En uno de nuestros experimentos, La secuencia Rca fue tomada a partir de la secuencia reportada en GenBank: AF084478.3. La secuencia nucleotídica de Rca que se bombardeó fue específicamente el cDNA que comprende la secuencia líder que dirige la entrada de la proteína al cloroplasto y la región codificante completa desde el extremo N' hasta el extremo C, sin incluir las regiones no traducibles. Las plantas obtenidas sobreexpresantes de Rca siguiendo éste procedimiento presentan mayor contenido de Rca, debido a la inserción efectiva del cassette de sobreexpresión. Tal como los maíces con mayor contenido de proteína Rca, obtenidos mediante técnicas agronómicas convencionales (Morales ef a/., 1999).
Las plantas transformadas de este modo tienen la ventaja de ser un organismo genéticamente modificado a corto plazo, que no recurre a la inserción de transgenes, debido a que la proteína blanco es específica del genoma del mismo maíz y también porque la técnica de biobalística permite insertar sólo los cassettes de las secuencias de interés, evitando las estructuras completas de los vectores. La construcción bombardeada consta de un vector de transformación de plantas que contiene la secuencia genética codificante de la proteína Rubisco activasa (Rca) que puede estar bajo la dirección del promotor de la subunidad pequeña de rubisco.
Las plantas obtenidas, son evaluadas para determinar el grado de pureza de su DNA, comparándolo con plantas de maíz nativo, es decir que no han sido mejoradas. Los análisis de las secuencias de DNA muestran que la obtención de semillas mejoradas en cuanto a su capacidad de adaptación a estrés por calor y/o sequía que mantienen su producción de semilla, se realiza sin la introducción de elementos transgénicos.
La presencia de los cassettes de sobreexpresión, se comprueba con reacciones PCR, tal como es bien conocido en el ámbito de investigación del área de biología molecular. En la figura 1 se señalan los pares de oligonucleótidos usados para la identificación de las plantas isogénicas portadoras de dicha construcción o cassette amplificados por el PCR. En la figura 2 se presentan los resultados de la amplificación por PCR de dichos pares de oligonucleótidos, con lo cual se demostró la presencia en las plantas tratadas con la construcción del cassette de sobreexprestón de Rca, compuesto de secuencias de DNA propias del maíz. La amplificación por PCR la realizamos en cada una de las plantas isogénicas producidas en el laboratorio para demostrar que fue posible la inserción de una construcción basada exclusivamente en secuencias de DNA, prescindiendo de genes marcadores provenientes de otra especie.
Caracterización del maíz mejorado:
El maíz tolerante a sequía y/o altas temperaturas, tiene la ventaja de ser un organismo mejorado, obtenido sin la inserción de transgenes, debido a que las proteínas blanco son específicas del genoma del mismo maíz, evitando la inserción de estructuras completas de vectores con DNA de otros organismos. Además la técnica de biobalística permite insertar sólo los cassettes de las secuencias de interés.
Para lograr la obtención de maíz isogénico de la invención, requerimos previamente la caracterización a priori de los genes específicos que elegimos para el mejoramiento. En éste sentido, nuestro grupo de investigación ha demostrado que plantas con mayor contenido celular de la proteína Rca, poseen características de crecimiento superiores a plantas control con niveles menores de Rca. Esto se evidenció con el registro de diferentes parámetros de crecimiento tomados durante el desarrollo de maíces mejorados por técnicas agronómicas convencionales (Morales era/., 1999).
Con el sistema de mejoramiento agronómico, se encontró que el desarrollo de las hojas, en plantas con mayor contenido de Rca (Z23), fue mejor que plantas con niveles más bajos de Rca (Zo), lo cual aumentó las posibilidades de incrementar la capacidad fotosintética de la planta; esto se ilustra en la figura 3, con datos de longitud de hoja y rendimiento recolectados en un experimento en ei que se analizó una muestra de 300 plantas por cada tipo de planta, de entre un total de 2000 maíces sembrados bajo irrigación, en un diseño experimental de bloques al azar. En la figura 5 se muestra cómo las plantas seleccionadas para tener mayor rendimiento de la semilla (Z23) incrementan su capacidad fotosintética como secuela del aumento de Rca. Éste parámetro fue determinado en la hoja inmediata al fruto durante la etapa de floración del maíz, mediante el uso de un equipo que analiza el intercambio gaseoso de la hoja in vivo, conocido como IRGA (Li-Cor 6200, Lincoln, Nebraska).
Todas las determinaciones fueron promediadas por el número de muestras analizadas y se realizaron análisis de varianza y comparación de medias, mediante el software. Con éstos resultados se demostró que la acumulación de Rca brinda beneficios durante el desarrollo del maíz y fueron importantes como punto de partida para la invención que aquí se describe. En concordancia, el incremento de la expresión de Rubisco activasa por el método isogénico aquí descrito, mostró un incremento del 40% (Figura 4), lo cual es equivalente al aumento de expresión de Rubisco activasa mediante la selección agronómica convencional realizada durante 15 ciclos agrícolas (Morales et al., 1999). Éste resultado representa una ventaja notable en la disminución del tiempo requerido para el mejoramiento, lo cual también implica una disminución de los costos para la producción de semillas mejoradas. Una modalidad de la invención se refiere al método para sobreexpresar al gen
ZmFesI [SEQ ID NO: 7] que está codificado en el DNA genómico de maíz, utilizando el método de la invención, es decir, introduciendo la SEQ. ID NO: 7 previamente contenida en el cassette de expresión de la invención, que implica su expresión bajo el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco SEQ ID NO: 1, y el terminador de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID NO: 3] o bien usando otras regiones regulatorias con actividades similares para promover y finalizar el proceso de transcripción, con la característica indispensable de que provengan del genoma de maíz.
La secuencia SEQ ID NO: 7 está reportada en la base de datos del NCBI, con el número de acceso: NP_001146403.1 y es el resultado de la secuenciación masiva de cDNA de maíz en diversas condiciones de desarrollo.
Durante el desarrollo de la invención consideramos la posibilidad de sobreexpresar una proteína perteneciente a la familia de proteínas llamadas dehidrinas, mediante mejoramiento isogénico del maíz de acuerdo con el proceso de la presente invención. Las dehidrinas están involucradas en procesos complejos de respuesta a diversos tipos de estrés (Layton et al., 2010). Nuestro equipo de investigación determinó que esta proteína está relacionada con la tolerancia de la planta hacia condiciones de estrés por desecación.
La proteína dehidrina estudiada se identificó mediante la interacción con anticuerpos marcados en plantas de maíz sometidas a deshidratación y por alineamiento y secuenciación del péptido correspondiente.
De acuerdo con lo anterior, otra modalidad de la invención se refiere al método para sobreexpresar al gen de la proteína dehidrina que está codificado en el DNA genómico de maíz, utilizando el método de la invención, es decir, introduciendo la secuencia nucleotídica que codifica la dehidrina previamente contenida en el cassette de sobre- expresión de la invención, que implica su expresión bajo el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco SEQ ID No: 1 ó el promotor de Ubiquitina de maíz SEQ ID No 2:, y el terminado de la subunidad pequeña de Rubisco SEQ ID NO: 3 o bien usando otras regiones regulatorías con actividades similares para promover y finalizar el proceso de transcripción, con la característica indispensable de que provengan del genoma de maíz.
Este cassette se incorpora al DNA genómico de las células de los callos embriogénicos del maíz, bombardeando de 0.3 a 0.5 g de dichos callos para obtener la introducción de 0.5 a 1 mg de micropartículas de tungsteno u oro, de 0.4 a 1 Dm de diámetro, las cuales portan de 0.3 a 0.1 ng del cassette de sobreexpresión. La introducción de las micropartículas se impulsa por bombardeo con una presión de Helio de 650 - 900 psi, en una atmósfera de 20 - 28 in Hg de vacio, dentro de una cámara de biobalística, desde una distancia de 6 a 13 cm. La presente invención aporta los medios para aumentar la productividad de cultivos de maíz en dos o tres años, período breve si se compara con ciclos agrícolas que tardan más de 20 años en duplicar el rendimiento de los plantíos, por ejemplo, mediante un método agrícola, fue posible la selección manual, de plantas que tuvieron mayor productividad a lo largo de 23 años y con ello se logró duplicar el número de toneladas de maíz por hectárea y el peso por mazorca de cada planta (Morales et al., 1999). En nuestro laboratorio hemos logrado eliminar la necesidad de realizar este largo proceso para así proveer de los medios para mejorar la productividad de este vegetal y para mantenerla, ya que las variedades obtenidas tienen un fenotipo estable, por lo que los niveles de producción obtenidos serán también permanentes. Una de las modalidades de la invención se refiere a la propagación de las plantas más productivas a partir de la embriogénesis somática, ya que se posibilita la generación de callos embriogénicos a partir de plantas isogénicas, facilitando su uso a gran escala. Otra modalidad de la invención es el proceso aquf propuesto, éste ofrece la ventaja de posibilitar la obtención de una variedad de maíz mejorada en cuanto a sus capacidades de adaptación a las condiciones ambientales adversas.
La presente invención tiene aplicación directa en la generación de cultivos comestibles, cuyo nivel de producción debe asegurarse aún bajo condiciones ambientales adversas, como las previstas con el inminente cambio climático. El uso de esta tecnología, en cultivos de interés alimentario se basa, en que las plantas obtenidas son libres de transgenes, lo cual es favorable porque elimina cualquier riesgo relacionado con el uso de los organismos transgénicos.
Siguiendo el procedimiento descrito, se obtiene una variedad mejorada de maíz que puede ser usada en zonas semiáridas en las que actualmente se registran pérdidas en la producción de maíz, asociadas a la falta de agua.
El procedimiento aquí descrito, puede ser aplicado a diferentes cultivos, siempre que exista la capacidad de generar células totipotenciales in vitro, para asegurar la inserción de unidades transcripcionales de DNA proveniente de la propia planta.
Una modalidad más de la invención se refiere a su aplicabilidad a diferentes cultivos, debido a que los genes de osmoprotección, termotolerancia y mantenimiento de la actividad fotosintética, son genes ampliamente distribuidos en las plantas. Las bases de datos actuales, permiten hacer búsquedas de las secuencias nucleotídicas de éstos genes, con la finalidad de clonarlos para construir unidades transcripcionales compuestas por un promotor de preferencia proveniente de la misma planta. La generación de plantas ¡sogénicas de maíz, significa que la planta obtenida mediante éste proceso mantiene la integridad y pureza de su DNA respecto a la variedad parental, de forma similar a los cultivos de maíz mejorados por técnicas agrícolas convencionales, es decir que el método aquí descrito genera plantas que portan sólo material genético propio del maíz. Para comprobarlo, se analizaron muestras de DNA de plantas ¡sogénicas en laboratorios nacionales de referencia. Se anexa copia del resultado oficial (Centro Nacional de Referencia en Detección de Organismos Genéticamente Modificados, CNRDOGM del SENASICA, SAGARPA) Las conclusiones de dichos análisis comprueban que el desarrollo utilizado generó plantas mejoradas de maíz que no portan secuencias transgénicas.
Por lo anterior, será evidente para cualquier experto en la materia que las modalidades de la presente invención, son únicamente ilustrativas más no limitativas de la presente invención, ya que son posibles numerosos cambios de consideración en sus detalles, pero sin apartarse del alcance de la invención.
Aun cuando se han ilustrado y descrito ciertas modalidades de la invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a la misma, pero tales modificaciones no representarían un alejamiento del verdadero alcance de la invención. Por lo tanto, la presente invención no deberá considerarse como restringida excepto por lo establecido en el estado de la técnica, así como por el alcance de las reivindicaciones anexas.
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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
REIVINDICACIONES 1.- Un método para obtener plantas isogénicas de la planta Zea maye con propiedades mejoradas, tales como resistencia a condiciones ambientales adversas de sequía o temperatura y que presentan mayor crecimiento y producción de grano, mediante la sobreexpresión del gen o los genes responsables de dichas actividades; el cual comprende:
a) Obtener un cassette de sobreexpresión caracterizado porque contiene una secuencia promotora de la transcripción, una secuencia codificante del cDNA de dicho gen de resistencia y/o aumento de la capacidad fotosintética y un terminador de la transcripción, todos provenientes del genoma del maíz. b) Introducir el cassette del paso a) a células totipotenciales de la planta mediante técnicas físicas de envío de DNA, incluyendo el bombardeo de partículas.
c) Comprobar la inserción del cassette del paso a) en el genoma de las células de maíz.
d) Cultivar el callo transformado para proliferar el material y procurar la regeneración de plantas completas
e) Comprobar la sobre-expresión de los genes mencionados en la planta isogéntca completa obtenida en (d)
f) Comprobar la permanencia de la sobre-expresión en las plantas isogénicas obtenidas en (d)
2.- Un método para obtener plantas isogénicas de plantas de Zea mays resistentes a condiciones ambientales adversas de temperatura que sobre-expresan un gen de resistencia a dicha condición adversa, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque comprende:
a) Obtener un cassette de sobreexpresión caracterizado porque contiene unidos los siguientes elementos:
i. Una secuencia regulatoría promotora de la transcripción, proveniente del genoma de maíz, de preferencia la secuencia promotora de la transcripción de la proteína ubiquitina 1 [SEQ ID No: 2],
ii. La secuencia codificante del gen de resistencia a la temperatura, de preferencia aquella que codifica para la proteína ZmFeslA [SEQ ID NO: 7]
iii. Una secuencia regulatoría terminadora, proveniente del genoma de maíz., depreferencia el terminador de la subunidad pequeña de
Rubisco [SEQ ID NO: 3].
b) Introducir el cassette del paso (a) en células totipotenciales de la planta a través de técnicas físicas de envío de DNA, incluyendo el bombardeo de partículas, mediante los siguientes pasos:
i. obtener de 0.3 a 0.5 g de callos embriogénicos de maíz para introducir de 0.5 a 1 ~]g de micropartículas de tungsteno u oro, de 0.4 a 1□m de diámetro, las cuales portan de 0.3 a 0.1 üg del cassette de sobreexpresión.
ii. Introducir las micropartículas a las células impulsándolas por bombardeo con una presión de Helio de 650 - 900 psi, en una atmósfera de 20 - 28 in Hg de vacío, dentro de una cámara de biobalística, desde una distancia de 6 a 13 cm. c) Cultivar el callo con las células tratadas para proliferar el material d) Inducir la regeneración de la planta isogénica a partir del callo embriogénico obtenido en (b), con subcultivos periódicos de 15 a 25 días, en los cuales se disminuye paulatinamente del 100% al 0%, la concentración de los factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo, manteniendo las plántulas regeneradas en medio de cultivo MS enriquecido con factores que favorezcan el enraizamiento, con subcultivos periódicos cada 25 - 45 días, hasta transplantar las plántulas obtenidas a sustrato orgánico suficientemente húmedo.
e) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (d) la presencia del o los cassettes de sobreexpresión mediante técnicas de biología molecular convencionales
f) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (e) la sobreexpresión del gen blanco mediante técnicas de biología molecular convencionales g) Inducir la sobre-expresión en las plantas isogénicas obtenidas en (e) bajo condiciones de estrés ambiental por aumento de temperatura.
h) Comprobar la permanencia de la sobre-expresión del gen ZmFeslA [SEQ ID NO: 7] u otro gene con actividad equivalente en las plantas isogénicas resistentes a temperatura obtenidas en (e).
3.- Un método para obtener plantas isogénicas de plantas de Zea mays resistentes a condiciones ambientales adversas de sequía que sobre-expresan a un gen de resistencia a dicha condición adversa, de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque comprende:
a) Obtener un cassette de sobreexpresión caracterizado porque contiene unidos los siguientes elementos: i. Una secuencia regulatoria con actividad promotora, proveniente del genoma de maíz, de preferencia.
a. la secuencia promotora de la transcripción, de la proteína ubiquitina 1 [SEQ ID No: 2] b. la secuencia promotora de la subunidad pequeña de la enzima Rubisco [SEQ ID No 1]. ii. La secuencia codificante del gen de resistencia a sequía, depreferencia aquel que codifica para la proteina dehidrina de maíz
iii. Una secuencia regulatoria con actividad terminadora, proveniente del genoma de maíz, de preferencia el terminador de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID No: 3].
Introducir el cassette del paso (a) en células totipotenciales de la planta a través de técnicas físicas de envío de DNA, incluyendo el bombardeo de partículas mediante los siguientes pasos:
i. obtener de 0.3 a 0.5 g de callos embriogénicos de maíz para introducir de 0.5 a 1 üg de micropartículas de tungsteno u oro, de 0.4 a 1 üm de diámetro, las cuales portan de 0.3 a 0.1 ng del cassette de sobreexpresión.
ii. Introducir las micropartículas a las células impulsándolas por bombardeo con una presión de Helio de 650 - 900 psi, en una atmósfera de 20 - 28 in Hg de vacío, dentro de una cámara de biobalística, desde una distancia de 6 a 13 cm.
Cultivar el callo con las células tratadas para proliferar el material
Inducir la regeneración de la planta isogénica a partir del callo embriogénico obtenido en (b), con subcultivos periódicos de 15 a 25 días, en los cuales se disminuye paulatinamente del 100% al 0%, la concentración de los factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo, manteniendo las plántulas regeneradas en medio de cultivo MS enriquecido con factores que favorezcan el enraizamiento; con subcultivos periódicos cada 25 - 45 días, hasta transplantar las plántulas obtenidas a sustrato orgánico suficientemente húmedo.
e) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (d) la presencia del o los cassettes de sobreexpresión mediante técnicas de biología molecular convencionales
f) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (e) la sobreexpresión del gen blanco mediante técnicas de biología molecular convencionales g) Inducir la sobre-expresión en las plantas isogénicas obtenidas en (e) bajo condiciones de estrés ambiental por sequía.
h) Comprobar la permanencia de la sobre-expresión del gen dehidrina u otro gene con actividad equivalente en las plantas isogénicas resistentes a sequía obtenidas en (e).
4.- Un método para obtener plantas isogénicas de plantas de Zea mays resistentes a condiciones ambientales adversas que presentan mayor crecimeitno y producción de grano al tener una fotosíntesis incrementada, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:
a) Obtener un cassette de sobreexpresión con la secuencia [SEQ ID No: 6] caracterizado porque contiene unidos los siguientes elementos: i. Una secuencia regulatoria con actividad promotora de la transcripción proveniente del genoma de maíz, de preferencia la secuencia promotora de la transcripción de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID No: 1], ii. Una secuencia que incrementa la fotosíntesis, de preferencia la secuencia codificante de Rca de maíz [SEQ ID No: 4]
iii. Una secuencia terminadora proveniente del genoma de maíz, de preferencia el terminador de la subunidad pequeña de Rubisco [SEQ ID No: 3] b) Incorporar el cassette del paso (a) en células totipotenciales de la planta mediante técnicas físicas de envío de DNA, incluyendo el bombardeo de partículas, mediante los siguientes pasos:
i. obtener de 0.3 a 0.5 g de callos embriogénicos de maíz para introducir de 0.5 a 1 ng de micropartículas de tungsteno u oro, de 0.4 a 1 Gm de diámetro, las cuales portan de 0.3 a 0.1 rg del cassette de sobreexpresión.
ii. Introducir las micropartículas a las células impulsándolas por bombardeo con una presión de Helio de 650 - 900 psi, en una atmósfera de 20 - 28 in Hg de vacío, dentro de una cámara de biobalística, desde una distancia de 6 a 13 cm. c) Cultivar el callo con las células tratadas para proliferar el material d) Inducir la regeneración de la planta isogénica a partir del callo embriogénico obtenido en (b), con subcultivos periódicos de 15 a 25 días, en los cuales se disminuye paulatinamente del 100% al 0%, la concentración de los factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo, manteniendo las plántulas regeneradas en medio de cultivo MS enriquecido con factores que favorezcan el enraizamiento con subcultivos periódicos cada 25 - 45 días, hasta transplantar las plántulas obtenidas a sustrato orgánico suficientemente húmedo. e) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (d) la presencia de los cassettes de sobreexpresión mediante técnicas de biología molecular convencionales
f) Identificar en las plantas isogénicas obtenidas en (e) la sobreexpresión mediante técnicas de biología molecular convencionales
g) Inducir la sobre-expresión del gen Rca en las plantas isogénicas obtenidas en (e) en condiciones de estrés ambiental.
h) Comprobar la permanencia de la sobre-expresión del gen ZmRca en las plantas isogénicas mejoradas obtenidas en (e).
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