WO2016092203A1 - Procédé de préparation d'une composition de traitement de plante, composition obtenue et ses utilisations - Google Patents

Procédé de préparation d'une composition de traitement de plante, composition obtenue et ses utilisations Download PDF

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WO2016092203A1
WO2016092203A1 PCT/FR2015/053376 FR2015053376W WO2016092203A1 WO 2016092203 A1 WO2016092203 A1 WO 2016092203A1 FR 2015053376 W FR2015053376 W FR 2015053376W WO 2016092203 A1 WO2016092203 A1 WO 2016092203A1
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WO
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seeds
emulsion
composition
plant
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Application number
PCT/FR2015/053376
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English (en)
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Faouzi ATTIA
Zéphirin Mouloungui
Eric LACROUX
Bernard Dumas
Elodie BELMAS
Original Assignee
Agronutrition
Institut National Polytechnique De Toulouse
Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Université Paul Sabatier Toulouse Iii
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Publication date
Application filed by Agronutrition, Institut National Polytechnique De Toulouse, Institut National De La Recherche Agronomique, Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.), Université Paul Sabatier Toulouse Iii filed Critical Agronutrition
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    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing liquids as carriers, diluents or solvents
    • A01N25/04—Dispersions, emulsions, suspoemulsions, suspension concentrates or gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
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    • Y02P20/141—Feedstock
    • Y02P20/145—Feedstock the feedstock being materials of biological origin

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of a composition intended for a treatment - in particular phytopharmaceutical and / or nutritional treatment of plants, a plant treatment composition obtained by such a method and any use of such a composition for the treatment of plants.
  • the invention therefore relates to a process for preparing a composition for plant protection and / or nutritional use in application to plants, a composition obtained by such a method and all the uses of such a composition, in particular the uses of such a composition.
  • the invention relates in particular to a process for the preparation of a composition comprising at least one active substance on plants, a composition comprising at least one active substance on plants obtained by such a method and the uses of such a composition for promoting the protection and growth of plants.
  • the invention relates to a process for preparing a treatment composition and a treatment composition adapted to be applied in contact with plants.
  • the invention is directed to a composition that allows said active substance to pass through external protective covers of the plant and to reach internal tissues of the plant.
  • the invention is particularly directed to a process for preparing a treatment composition and a treatment composition adapted to be applied in contact with plant stems, and / or plant leaves, and / or plant flowers, and or of plant fruits, and / or plant roots, and / or plant seeds.
  • the invention therefore relates to such a composition for the transport, application and vectorization of at least one active substance in contact with plants.
  • the invention aims in particular at a process for preparing a composition intended for a stimulation treatment of the natural defenses of plants, a composition for a stimulation treatment of the natural defenses of plants obtained by such a method and any use of such a composition in the treatment of stimulation of the natural defenses of plants.
  • WO 98/53698 discloses a composition formulated from native oleosomes ("OU bodies") derived from seeds and its use in agrochemistry. This composition consists essentially of triglycerides This composition is obtained by washing with water for removing cellular contaminants from said composition, including water-soluble contaminants and contaminants forming a colloidal dispersion in water.
  • composition forming a triglyceride emulsion is in fact not stable over time and is therefore not compatible with use on an industrial scale, in particular for use in agriculture. It requires the addition of additives for its stabilization. Such a composition is therefore complex in its manufacture.
  • the invention aims to remedy this drawback by proposing a process for preparing a composition intended for a plant treatment which is compatible with an implementation on an industrial scale.
  • the invention relates to a process for preparing such a composition which is stable in time and at ambient temperature.
  • the invention also relates to a process for the preparation of such a composition comprising an emulsion which is "biobased", that is to say obtained from natural resources - especially plant resources - inexpensive and renewable.
  • the invention also relates to a process for preparing such a composition which does not require a specific step of adding agents for stabilizing said composition.
  • the invention also provides a process for preparing a plant treatment composition which is simplified.
  • the invention also relates to a composition intended for a treatment - in particular phytopharmaceutical and / or nutritional - of plants obtainable by a process according to the invention, and which has the same advantages, in particular: - which has a low cost and can be applied economically on a large scale on plants, and;
  • the invention aims to overcome all of these disadvantages.
  • the invention relates to a process for the preparation of a composition intended for a plant treatment, characterized in that it comprises the following steps consisting in carrying out:
  • the invention therefore relates to a process for preparing a composition for a plant treatment in which a fatty acid emulsion is prepared (steps i.), Ii.) And iii.)) And is incorporated in said emulsion of at least one active substance on plants.
  • the fatty acid emulsion makes it possible to potentiate the effects of the active substance when applied to plants.
  • the fatty acid emulsion is obtained by enzymatic hydrolysis in situ of the ground oleaginous seed triglycerides, separation and collection of said fatty acid emulsion.
  • plant protection product is a composition (irrespective of its form and purpose, in particular including a liquid, a suspension, dispersion, emulsion, preparation, product or active substance) having the function:
  • adjuvant denotes any composition which is at least substantially free of active substance, in particular with phytopharmaceutical and / or nutritional properties, but which, in association with an active substance, improves the physical and chemical properties thereof and / or biological, while limiting the effects and harmful impacts on fauna and flora;
  • oilseeds means seeds of oleaginous plants comprising at least one fatty substance capable of being extracted from the seeds, such as, for example, rapeseeds, sunflower seeds, soya beans, flax seeds, , pastel seeds, camelina seeds and crambe seeds, and;
  • enzymatic hydrolysis in situ means an enzymatic hydrolysis of a raw material obtained by grinding oleaginous seeds in an aqueous medium, said material comprising all the components of the oleaginous seeds in the form of a solid in the divided state dispersed in the aqueous medium, and;
  • lipase means the common sense, that is to say, an essentially water-soluble enzyme of class EC 3.1.1 of the classification of enzymes and catalyzing the conversion of triglycerides to glycerol and fatty acids free.
  • oleaginous seeds are chosen which are capable of forming an emulsion by the effect of grinding and hydrolysis. enzymatic by the lipase and a treatment composition comprising said emulsion and at least one active substance, said emulsion and said treatment composition being adapted for application in contact with plants.
  • the oleaginous seeds are selected from the group consisting of rapeseeds, sunflower seeds, soya beans, linseeds, pastel seeds, camelina seeds, cranberry seeds. , nut seeds (or nuts), such as hazelnut kernel, walnut kernel, cashew nut kernel, pistachio kernel and peanut kernel.
  • a preliminary step is carried out for dehulling the oleaginous seeds, eliminating the pericarp and preparing the kernel.
  • step i.) Is carried out for grinding oleaginous seeds in an aqueous grinding medium so as to obtain a heterogeneous liquid / solid medium formed from particles of a dispersed solid state material. in the aqueous grinding medium, the particles forming the solid material in the divided state having an average size of less than 500 ⁇ .
  • the inventors have observed that the grinding of oleaginous seeds making it possible to obtain a solid material in the divided state having particles of average size less than 500 ⁇ advantageously makes it possible to promote the subsequent hydrolysis of triglycerides by at least one lipase.
  • a total hydrolysis of at least 90%, in particular of the order of 95%, of oleaginous seed triglycerides is thus obtained.
  • the grinding step i.) can be carried out in the bowl of a knife mill.
  • the oleaginous seed suspension is thus subjected to such a knife mill for a time of between 1 min and 10 min.
  • the aqueous grinding medium referred to in step i.) Is chosen from the group consisting of buffered aqueous solutions - in particular phosphate buffers or Tris buffers at a pH of approximately pH 7.
  • aqueous saline solutions for example aqueous 0.1 M NaCl solutions, and water.
  • the oleaginous seeds are brought into contact with the aqueous milling medium, the ratio of the oleaginous seed mass, based on the sum of the masses of the seeds and the aqueous milling medium being of less than 0.2, in particular less than 0, , 15, preferably between 0.10 and 0.15-;
  • such a value of less than 0.2 makes it possible, on the one hand, to grind the seeds efficiently in the aqueous grinding medium by optimizing the viscosity of the aqueous grinding medium and, on the other hand, to obtain a subsequent hydrolysis of the triglycerides. which is effective.
  • step ii.) The enzymatic hydrolysis of the triglycerides of the oleaginous seeds is carried out by adding at least one lipase to the seed mill obtained in step i.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out in an aqueous medium and under suitable conditions to form an emulsion comprising fatty acids released into the aqueous medium by the effect of the enzymatic hydrolysis of the triglycerides.
  • the conditions of enzymatic hydrolysis are adapted in aqueous medium so as to form a mixture having a homogeneous appearance on a macroscopic scale, but which is heterogeneous on a microscopic scale, the lipid phase being stably dispersed in the aqueous phase under the phase form of the "water / oil / water” type and / or of the "oil / water / oil” type.
  • the enzymatic hydrolysis of the triglycerides of the oleaginous seeds is carried out in the presence of at least one lipase by placing in contact with said at least one lipase with the oleaginous seed mill in an aqueous medium obtained in step i.).
  • said at least one lipase is brought into contact with the ground material after step i).
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature chosen to allow a substantially optimal activity of the lipase.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature of between 15 ° C. and 55 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature of between 15 ° C. and 55 ° C. and for a duration of between 15 minutes and 5 hours.
  • the enzymatic hydrolysis in aqueous medium referred to in step ii.) Is carried out in a high-pressure homogenizer.
  • High pressure homogenization of a reaction mixture formed from the ground material comprising at least one lipase by compression of this reaction mixture at a pressure greater than atmospheric pressure (that is to say at a pressure greater than atmospheric pressure) followed by a sudden expansion at atmospheric pressure of the mixture thus formed.
  • the compression is carried out up to a pressure of between 2.5 MPa and 100 MPa, in particular between 10 MPa and 50 MPa, preferably of the order of 15 MPa.
  • the high pressure homogenization of the reaction mixture is carried out at a temperature selected to allow optimal lipase activity.
  • the high pressure homogenization of the reaction mixture is carried out at a temperature of between 15 ° C. and 55 ° C.
  • the enzymatic hydrolysis of step ii.) Is carried out at a temperature of between 15 ° C. and 55 ° C. and for a duration of between 15 minutes and 5 hours.
  • High pressure homogenization and enzymatic hydrolysis can be carried out at room temperature, that is, without heating or cooling the reaction mixture.
  • at least two successive compression / expansion cycles are carried out for homogenization at high pressure.
  • This homogenization can be carried out at high pressure in a chamber of a high-pressure homogenizer equipped with a constant-flow introduction pump of the reaction mixture into the chamber and equipped with a leakage valve by which the said reaction mixture undergoes a depression at the outlet of said enclosure. It is therefore possible to homogenize the reaction mixture continuously in a high-pressure homogenizer.
  • the inventors have observed, quite surprisingly, that the said at least one lipase retains in the reaction mixture and under pressure homogenization a high activity of hydrolysis of the triglycerides of the oleaginous seeds.
  • At least one lipase in the form of an aqueous solution is added to the ground material obtained in step i) at least once or in several times.
  • to form said reaction mixture is added to the ground material obtained in step i.) At least one lipase in the solid state - at once or in several times-.
  • At least one lipase chosen from the group of lipases produced by a plant and lipases produced by a microorganism-notably a microorganism chosen from the group formed by microorganisms of the genus Rhizopus is used.
  • microorganisms of the genus Mucor microorganisms of the genus Alcaligenes, microorganisms of the genus Candida -particularly of the Candida rugosa species, microorganisms of the genus Aspergillus, microorganisms of the genus Pseudomonas, microorganisms of the genus Humicola, microorganisms of the genus Thermomyces, microorganisms of the genus Penicillium and microorganisms of the genus Geotrichum, in particular of the species Geotrichum candidum- and the isoforms of these lipases.
  • At least one lipase of Candida rugosa is used.
  • at least one lipase of Candida rugosa is used in a proportion of 100 to 500 lipase units, in particular in the proportion of 150 to 400 lipase units, preferably of the order of 300 lipase units per gram of oleaginous seed (UL /boy Wut).
  • 100 units of lipase (UL) per gram of oleaginous seeds are used to release about 75% of the total fatty acids of the glycerides from the oleaginous seeds.
  • 166 units of lipase (UL) per gram of oilseeds are used to release in the order of 90% of the total fatty acids from the glycerides of the oleaginous seeds.
  • 333 units of lipase (UL) are used per gram of oleaginous seeds in order to release about 95% of the total fatty acids from the glycerides of the oleaginous seeds.
  • Lipase unit is defined as the amount of lipase necessary to release 10 "6 moles of fatty acid from glyceride, for a period of 1 minute and under optimum conditions of activity of the enzyme (temperature, pH and concentration of glycerides).
  • a hydrolyzate comprising fatty acids derived from the hydrolysis of the triglycerides of the seeds.
  • the hydrolyzate is a mixture of a fatty acid emulsion, a solid residue and an aqueous phase rich in water-soluble seed compounds.
  • the separation referred to in step iii.) Of the solid residue, of the aqueous phase and of said emulsion is carried out by centrifugation. Fractionation of the hydrolyzate comprising the lipase is thus carried out by centrifugation.
  • the centrifugation conditions are adapted to allow sedimentation of the solid residue (pellet), separation of the aqueous intermediate phase and the upper phase (supernatant) formed of ⁇ fatty acid emulsion.
  • Such a separation is carried out by centrifugation, for example at an acceleration of between 1000 and 10000 g, in particular of the order of 7500 g.
  • a centrifugation is carried out for a period of between 1 min and 10 min.
  • the inventors have found that the emulsion obtained in step iii.) And the treatment composition according to the invention exhibit unexpected antioxidant properties and the preservation of said emulsion and of said treatment composition.
  • a process according to the invention forms an emulsion and a plant treatment composition which are stable over time.
  • Oleosins are polypeptides formed of a sequence of about 180 amino acids, comprising a central hydrophobic domain consisting of about 75 hydrophobic amino acids, free of basic amino acid and acidic amino acid, said central hydrophobic domain being limited at one end with an L-lysine residue and at the other end with two L-arginine residues.
  • the action of the lipase releases at least 90%, in particular of the order of 95%, of the total amount of triglyceride fatty acids that can be released by hydrolysis. enzymatic total triglycerides.
  • the emulsion is a complex emulsion of the "water / oil / water” type and of the "oil / water / oil” type having lipid droplets of uniform size and whose average size is between 1 ⁇ and 1.8 ⁇ .
  • Such a complex emulsion exhibits increased stability over the stability of an oil / water type emulsion formed from native oleaginous oliosomes.
  • steps L), ii.) And iii.) Of the process according to the invention makes it possible to form an emulsion in which the average size of the lipid droplets is substantially the same as the average size of the lipid droplets. native oleosomes from the starting oilseeds.
  • the mixture referred to in step iv.) Of at least one active substance and the emulsion is produced by homogenization at high pressure, that is to say at a pressure greater than atmospheric pressure.
  • the plant treatment composition is formed by high pressure homogenization of the mixture of the emulsion and at least one active substance.
  • the high pressure homogenization referred to in step iv.) Is carried out by compressing the mixture -formed of the emulsion and at least one active substance-at a pressure greater than atmospheric pressure (i.e. say at a pressure above atmospheric pressure) followed by a sudden expansion at atmospheric pressure of the mixture thus formed.
  • the compression is carried out up to a pressure of between 2.5 MPa and 100 MPa, in particular between 10 MPa and 50 MPa, preferably of the order of 15 MPa.
  • At least two successive cycles of compression / expansion of the mixture comprising the emulsion and at least one active substance are carried out.
  • the high pressure homogenization referred to in step iv.) Is carried out at a temperature which substantially preserves the structure of the emulsion and of the treatment composition.
  • the high pressure homogenization referred to in step iv) is continued for a time sufficient to obtain the treatment composition.
  • step iv.) Continuously in a high-pressure homogenizer.
  • At least one active substance is chosen from plants in the group formed of substances having a beneficial activity for plants by applying to said plants the composition according to the invention, that is to say in mixture with the emulsion.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a plant treatment composition comprising an emulsion mixed with at least one active substance on plants.
  • a plant treatment composition which is stable over time and which allows the application of said active substance to plants, the maintenance of said active substance on the surface and in contact with the plants and / or the crossing by said active substance of the outer protective layer of the plants (for example, the cuticle).
  • At least one phytopharmaceutical substance is chosen from the group consisting of fungicidal substances, fungistatic substances, bactericidal substances, bacteriostatic substances, insecticidal substances, acaricidal substances, herbicidal substances, parasiticidal substances, nematicidal and rodenticidal substances, taupicidal substances, corrosive substances, corvicidal substances, molluscicidal substances, repellent substances of birds and game.
  • At least one phytopharmaceutical substance is chosen from the group formed by stimulating substances of natural plant defenses.
  • At least one phytopharmaceutical substance is chosen from the group formed by polypeptides with stimulating activity of natural plant defenses-notably degradation of cellulose stimulating activity of natural plant defenses, for example cellulases with stimulating activity of natural plant defenses and polysaccharides with stimulating activity of natural plant defenses-especially fragments of chitin, chitosan, laminarin and of low molecular weight pectins.
  • At least one active substance with activating activity of the natural defenses of plants is a cellulase of class EC 3.2.1.4 of the classification of enzymes.
  • At least one active substance with activating activity of the natural defenses of plants is a cellulase of a fungus, in particular a fungus of the genus Trichoderma (for example of the species Trichoderma reesei or of the species Trichoderma harzianum).
  • At least one cellulase with activating activity of the natural defenses of plants is mixed with the emulsion so as to form the plant treatment composition.
  • At least one cellulase is chosen from the group consisting of cellulases which are compatible with said emulsion, that is to say which retain in said emulsion at least substantially a stimulating activity of natural plant defenses.
  • step iv. The stimulating activity cellulase of the natural defenses of plants is mixed with said emulsion so as to form the phytosanitary composition, said cellulase being chosen to be compatible with said acid emulsion. bold and with carrying out said step iv.).
  • a phytosanitary composition obtained by a process according to the invention allows, not only to preserve the structure and the stimulatory properties of the natural defenses of plants of each cellulase, but also improves the vectorization of said cellulase in particular by application of said phytosanitary composition on aerial parts of plants.
  • a cellulase-notably Trichoderma-cellulase formulated in a fatty acid emulsion obtained by in situ hydrolysis of seed triglycerides of an oleaginous plant according to the invention has a catalytic activity of degradation of the cellulose equivalent or even greater than the catalytic activity of degradation of the cellulose of a cellulase composition free of such an emulsion.
  • Such a fatty acid emulsion obtained by in situ hydrolysis of oleaginous seed triglycerides constitutes an adjuvant of a cellulase as an active substance.
  • the inventors assume that such an adjuvant makes it possible to stabilize the cellulase in the phytosanitary composition, but also makes it possible to increase the contact time of said composition comprising the cellulase with the plant, in particular with the aerial parts of the plant, and promotes action of said cellulase on the plant.
  • compositions obtained by a method according to the invention make it possible to stimulate the expression of genes coding for plant resistance proteins.
  • the treatment composition according to the invention comprising emulsion and cellulase has a stimulating activity of the natural defenses of the plants which is improved compared to a phytosanitary composition comprising Bion® as a stimulant of natural defenses. Plant.
  • At least one active substance is chosen from the group consisting of active substances on seed germination, substances for controlling the growth of plants, substances for controlling the development of plants, stimulating substances of photosynthesis, fertilizing agents and plant nutrients.
  • at least one active substance is a plant nutrient based on nitrogen (N), phosphorus-based (P), potassium-based (K), iron-based (Fe) or based on trace elements.
  • an emulsion according to the invention comprising at least one plant nutrient is prepared so as to overcome a nutritional deficiency of plants in macroelement (for example in nitrogen, in phosphorus, in potassium), in meso-element (eg calcium, sulfur, magnesium) or trace element (eg manganese, copper, iron, boron, molybdenum, zinc, nickel, selenium, silicon or sodium ).
  • macroelement for example in nitrogen, in phosphorus, in potassium
  • meso-element eg calcium, sulfur, magnesium
  • trace element eg manganese, copper, iron, boron, molybdenum, zinc, nickel, selenium, silicon or sodium .
  • a composition according to the invention comprising a solid in the divided state comprising at least one plant nutrient selected from the group consisting of nitrogen (N), phosphorus (P) and potassium (K). , calcium (Ca), magnesium (Mg), sulfur (S), iron (Fe), copper (Cu), sodium (Na), zinc (Zn), boron (B), molybdenum (Mo), silicon (Si), selenium (Se), nickel (Ni), manganese (Mn), for example manganese carbonate (MnCO 3 ) and / or manganese sulphate (MnSO 4 ) and / or magnesium hydroxide (Mg (OH) 2 ) and / or zinc oxide (ZnO) and / or calcium oxide (CaO) and / or an iron chelate -particularly a EDTA chelate or a chelate of EDDHA (ethylene-diamine-N, N'-bis-2-hydroxyphenyl acetic acid) and iron- and
  • a treatment composition is formed which is stable over time.
  • stable composition over time means a composition whose components do not sediment during prolonged storage without agitation for a period of at least one month.
  • the treatment composition is able to prevent any bacterial or fungal development in the treatment composition.
  • the treatment composition is stable over time.
  • the inventors have observed that such a plant treatment composition is stable with respect to microbial contamination for a period of at least one year at a temperature of the order of 5 ° C.
  • the invention therefore relates to any use in agriculture of an emulsion obtained by a process comprising at least steps L), ii.) And iii.
  • the invention also extends to a composition -particularly a plant protection and / or nutritional plant treatment composition -comprising a fatty acid emulsion resulting from an enzymatic in situ hydrolysis of triglycerides of a milled oleaginous seed by less a lipase, characterized in that it also comprises at least one active substance chosen from the group consisting of plant protection substances, fertilizing agents and plant nutrients.
  • the invention extends in particular to a composition -particularly to a phytopharmaceutical and / or plant nutritional treatment composition obtained by a process according to the invention.
  • At least one active substance is a cellulase of a fungus, in particular a fungus of the genus Trichoderma (for example of the species Trichoderma reesei or of the species Trichoderma harzianum).
  • At least one lipase is a lipase of a microorganism of the Candida genus -particularly of the species Candida rugosa.
  • the treatment composition comprises at least one -particularly each of the constituents of the oleaginous seeds and chosen from:
  • At least one phospholipid of the oleaginous seeds in particular at least one phospholipid selected from the group consisting of phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines, phosphatidylinositols, phosphatidic acids and / or phosphatidylserines; glycerol;
  • the treatment composition comprises at least one -particularly each of the constituents of oleaginous seeds selected from the group consisting of ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol and ⁇ -tocotrienol.
  • the invention also extends to all uses of a composition according to the invention in a plant treatment.
  • the invention extends to a method of treatment - in particular phytopharmaceutical, fertilization and / or nutritional plant - in which is applied to said plants an effective amount of composition according to the invention.
  • the invention also extends to a method of treatment - in particular phytopharmaceutical, fertilization and / or nutritional - of plants in which is applied to said plants a composition obtained by a method according to the invention.
  • the invention also extends to the use in agriculture of a composition according to the invention in application to plants, that is to say a composition comprising at least one active substance and an emulsion of fatty acids obtained by enzymatic hydrolysis in situ of a mill of oleaginous seeds.
  • composition according to the invention is applied in contact with seeds and / or seeds and / or plant roots.
  • the composition according to the invention is applied in contact with at least one aerial part of the plants - in particular on at least part of the foliage of the plants.
  • a composition according to the invention is particularly suitable for being applied to aerial parts of plants-for example, on flowers, on fruits, on the leaves, on the stems of plants in culture- without, however, causing burning of the aerial parts of the plants.
  • a composition according to the invention is applied by nebulization (spray).
  • a composition according to the invention can be used in application to vegetable plants, on ornamental plants in culture, on horticultural crops, on plants grown in the open field, on plants grown in a greenhouse or on plants grown in culture. Aboveground.
  • a composition according to the invention can also be used in application to a market gardening, to an industrial culture or to a large crop.
  • a composition according to the invention can also be used in application to fruit trees, on ornamental trees and shrubs, on vegetable plants, on cereals -including wheat, rapeseed, flax, linseed, flax, barley, sorghum, on various floral crops or on aromatic plants.
  • the invention is generally directed to the use, in plants, of a fatty acid emulsion as agent for vectorization of an active substance, said emulsion being obtained by a process in which the following steps are carried out: :
  • enzymatic hydrolysis of triglycerides of the oilseed crush obtained in step i.) said enzymatic hydrolysis being obtained by the action of at least one lipase in an aqueous medium and under conditions suitable for forming an emulsion comprising fatty acids released into the aqueous medium by the effect of said enzymatic hydrolysis, then;
  • the invention also extends to a plant treatment method in which a composition according to the invention is applied to plants.
  • a composition according to the invention is applied to the aerial parts of plants.
  • the invention also relates to a process for preparing a treatment composition, a treatment composition and its uses. characterized in combination by all or some of the features mentioned above or hereafter.
  • FIG. 1 is a graphical representation in histogram of the protective effect of the enzymatic activity of the cellulase conferred by an emulsion according to the invention.
  • FIG. 2 is a graphical representation in histogram illustrating the adjuvant effect of an emulsion according to the invention.
  • a rapeseed seed suspension (100 g) is prepared in 800 g of water and this suspension is placed in the bowl of a "Warring blender" food processor. This suspension is subjected to grinding for 5 minutes. 10 g of a Candida rugosa lipase solution (10 mg / ml) are then added to 90 g of the ground material obtained above. The mixture obtained comprises 10% of solid matter derived from rapeseeds and an amount of Candida rugosa lipase corresponding to 300 units of lipase per gram of solids derived from rapeseeds.
  • the mixture consisting of the solid material derived from rapeseeds, lipase and water is then homogenized under pressure in a Lab 1000 homogenizer (APV, Evreux, France), a first homogenization step being carried out at room temperature. a pressure of 15 MPa and a second homogenization step being carried out at a pressure of 0.2 MPa. After centrifugation of the homogenate obtained at the outlet of the homogenization, an upper phase formed of ⁇ emulsion of fatty acids derived from rapeseeds is obtained.
  • API Lab 1000 homogenizer
  • a rapeseed seed suspension (150 g) is prepared in 850 g (850 ml) of water and this suspension is placed in the bowl of a Warring blender. This suspension is subjected to grinding during 5 min.
  • An enzyme solution "Lipolyve CC" (industrial preparation from Candida rugosa yeast in freeze-dried form at 30 units / mg) is added at the rate of 300 units of lipase per gram of solid matter derived from rapeseeds.
  • the mass proportion of seeds in the mixture is of the order of 13.5%.
  • the mixture consisting of the solid material derived from rapeseeds, lipase and water is then homogenized under pressure of 35 MPa in a Lab 1000 homogenizer (APV, Evreux, France).
  • the homogenate containing the enzyme is placed at 37 ° C with stirring for 2 hours and then stored at 4 ° C.
  • the homogenate is then subjected to a phase separation step by centrifugation for 5 min at 7500 g.
  • the upper phase formed of the fatty acid emulsion is recovered.
  • the pellet resuspended in the aqueous phase is subjected to at least one centrifugation step for 5 min at 7500 g and an upper phase formed of the fatty acid emulsion is recovered again.
  • the various emulsions thus collected are collected and mixed. 75 grams of fatty acid emulsion are thus collected obtained from 1000 grams of rapeseed seed suspension in water, including 150 grams of rapeseeds.
  • the enzymatic activity of cellulases excreted by Trichoderma reesei formulated in the presence (B) or absence (A) of fatty acid emulsion according to the invention is compared.
  • the catalytic activity of cellulase (A cellulase), expressed in moles of transformed substrate per second, was measured using a KCellG3 megazyme detection kit.
  • the results obtained are presented in FIG. 1 and show that the fatty acid emulsion (B, hatched histogram) has no inhibitory effect on the activity of cellulase compared with cellulase (A, solid histogram) alone and thus allows its conservation and its application on plants without loss of activity of cellulase.
  • Transgenic Arabidopsis thaliana plants (PR-1 :: GUS) were prepared in which the gene coding for ⁇ -glucuronidase was cloned downstream of the regulatory sequences of the PR-1 gene ("Pathogesis regulation 1").
  • Such transgenic model Arabidopsis thaliana plants (PR-1 :: GUS) are cultivated in pots for 3 weeks and are then treated by nebulization with:
  • a phytosanitary composition according to the invention comprising cellulase formulated with an aqueous emulsion of fatty acids obtained by in situ enzymatic hydrolysis of triglycerides of an oilseed seed meal.
  • compositions (F) and (G) comprise cellulase at a rate of 3 g / L. 48 hours after application of one of the compositions (D), (E), (F) or (G), the plants are collected and placed in "Eppendorf" tubes of 2 ml. presence of glass beads 2 mm in diameter and frozen in liquid nitrogen. Each of the compositions (D), (E), (F) or (G) is milled and stored at -80 ° C.
  • Extraction of the proteins from each sample is carried out, in which 100 ⁇ l of sodium phosphate buffer (0.25 M, pH 7) comprising 1% Triton XI 00 and ⁇ -mercaptoethanol are added to each "Eppendorf" tube. at a concentration of 10 mM. Each tube is homogenized on "vortex", then centrifuged for 30 min at 13000 rpm at 4 ° C. 25 ⁇ L of each of the supernatant protein-containing phases are collected and placed in one well of a multiwell plate (96 wells). 125 ⁇ L ⁇ of sodium phosphate buffer (0.25 M, pH 7) and 50 ⁇ M are added to each well. MUG substrate (4-methylumbelliferyl-p-D-glucuronide) of ⁇ -glucuronidase.
  • MUG substrate 4-methylumbelliferyl-p-D-glucuronide
  • the level of activation of PR - 1 promoter sequences is evaluated by evaluating the amount of ⁇ - glucuronidase produced by Arabidospis thaliana plants in each of the conditions studied. This level of activation is evaluated by measuring the fluorescence emitted by hydrolysis of the MUG substrate in a Berthold Tristar LB 941 plate reader at an excitation wavelength of 355 nm and at an emission wavelength. at 450 nm. A measurement of the fluorescence emitted in each well is made every 5 minutes for 150 minutes.
  • the phytosanitary composition formed of cellulase and of the fatty acid emulsion (G) resulting from the in situ enzymatic hydrolysis of oleaginous seed triglycerides has a level of expression of the ⁇ -glucuronidase gene equivalent to the level of gene expression.
  • ⁇ -glucuronidase induced by Bion® while the solution (F) containing only the cellulase and without the emulsion does not cause induction of the ⁇ -glucuronidase gene.
  • Spray treatment of a first batch of 5-week-old Arabidopsis thaliana plants with an emulsion according to the invention and, for comparison, a second batch of 5-week-old Arabidopsis thaliana plants are carried out. with an aqueous composition which is emulsion-free according to the invention.
  • the emulsions according to the invention are obtained by in situ enzymatic hydrolysis of the triglycerides of a rapeseed oilseed meal and then dilution to 1% (by volume) and furthermore comprise a compound elicitor of the natural defenses of plants selected from the cellulase of Trichoderma, chitin fragments, chitosan (deacetylated chitin fragments), laminarin (Sigma-Aldrich) or oligopectin.
  • the same eliciting compounds are prepared in water. The characteristics of the eliciting compounds are given in Table 1 below.
  • the treatment composition is nebulized on 5-week-old Arabidopsis thaliana plants at a rate of 1 ml of composition per plant. Plants thus treated are placed in a climatic chamber for a period of 1, 6 or 24 hours. At 1 hour, 6 hours and 24 hours after nebulization, the specific RNAs of four known markers of activation of natural plant defenses were quantified: CYP71A12 (Cytochrome P450 from Arabidopsis), PAD3 (PhytoAlexin Deficient 3 mutation from cytochrome P450). Arabidopsis), PDF1.2 and PR1 transcribed by treated Arabidopsis thaliana plants.
  • RNA extraction is performed in which three plants corresponding to the same treatment and to the same duration of contact (lh, 6h or 24h) are collected in a tube. In each tube are added glass beads having an average diameter of 2 mm. The tubes are then immersed in a bath of liquid nitrogen. The plants thus frozen are ground by stirring (vibro ball mill). The total RNA is then extracted using the "SV Total RNA Isolation System" kit (Promega). The RNA extracts corresponding to each of the conditions (duration of contact, adjuvant composition and elicitor) are obtained at the rate of 1 g of RNA in 10 ⁇ l of nuclease-free water.
  • an RT-PCR reagent medium comprising:
  • AD Ne synthesis of AD Ne is carried out according to the following program:
  • the solutions comprising the cDNAs are deposited in triplicate in wells of a qPCR 384 plate.
  • the oligonucleotide primers corresponding to the selected markers are added to the cDNAs, at the rate of ⁇ L ⁇ at a concentration of ⁇ , as well as 5 ⁇ L ⁇ of SYBR reagent. Green (Applied Biosystems).
  • Green Applied Biosystems
  • the quantitative PCR mixture is prepared separately. Quantitative PCR is performed on the Applied Biosystems ABI 7900HT system according to a temperature profile: 2 minutes at 50 ° C .;
  • the measurements are analyzed by the SDS2.3 software. The results are expressed in log 2 of the ratio of the concentrations obtained in the test and in the control (water). A ratio greater than 2 (that is, a Log 2 > 1) indicates that gene expression is induced. A ratio less than 0.5 (ie, a Log 2 ⁇ -1) indicates that gene expression is repressed.
  • An adjuvanted composition with an emulsion according to the invention allows a stimulation of the natural defenses of plants which is increased compared to the non-adjuvanted composition.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser : i.) un broyage de graines oléagineuses et/ou d'amandes oléagineuses de fruits à coque dans un milieu de broyage aqueux, puis; ii.) une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyat de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras dans le milieu aqueux par effet de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis; iii.) une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis; iv.) un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques et des nutriments de plantes. L'invention concerne aussi une composition susceptible d'être obtenue par un tel procédé et ses utilisations en agriculture.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D'UNE COMPOSITION DE TRAITEMENT DE PLANTE, COMPOSITION OBTENUE ET SES UTILISATIONS
L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement -notamment phytopharmaceutique et/ou nutritionnel- de plantes, une composition de traitement de plantes obtenue par un tel procédé et toute utilisation d'une telle composition pour le traitement de plantes. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition à usage phytopharmaceutique et/ou nutritionnel en application sur des plantes, une composition obtenue par un tel procédé et toutes les utilisations d'une telle composition, notamment les utilisations d'une telle composition dans un traitement phytopharmaceutique et/ou nutritionnel en application au contact de plantes.
L'invention concerne en particulier un procédé de préparation d'une composition comprenant au moins une substance active sur des plantes, une composition comprenant au moins une substance active sur des plantes obtenue par un tel procédé et les utilisations d'une telle composition pour favoriser la protection et la croissance de plantes.
L'invention vise un procédé de préparation d'une composition de traitement et une composition de traitement adaptée pour pouvoir être appliquée au contact de plantes. L'invention vise en particulier une composition qui permette à ladite substance active de franchir des enveloppes externes protectrices de la plante et d'atteindre des tissus internes de la plante.
L'invention vise en particulier un procédé de préparation d'une composition de traitement et une composition de traitement adaptée pour pouvoir être appliquée au contact de tiges de plantes, et/ou de feuilles de plantes, et/ou de fleurs de plantes, et/ou de fruits de plantes, et/ou de racines de plantes, et/ou de graines de plantes.
L'invention vise donc une telle composition pour le transport, l'application et la vectorisation d'au moins une substance active au contact de plantes.
L'invention vise en particulier un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de stimulation des défenses naturelles de plantes, une composition pour un traitement de stimulation des défenses naturelles de plantes obtenue par un tel procédé et toute utilisation d'une telle composition dans le traitement de stimulation des défenses naturelles de plantes.
On connaît de WO 98/53698 une composition formulée à partir d'oléosomes ('OU bodies") natifs issus de graines et son utilisation en agrochimie. Une telle composition est constituée essentiellement de triglycérides. Cette composition est obtenue par lavage à l'eau visant à éliminer les contaminants cellulaires de ladite composition, notamment les contaminants hydrosolubles et les contaminants formant une dispersion colloïdale dans l'eau.
Une telle composition formant une émulsion de triglycérides n'est en réalité pas stable dans le temps et n'est donc pas compatible avec une utilisation à l'échelle industrielle, en particulier pour une utilisation en agriculture. Elle nécessite l'adjonction d'additifs pour sa stabilisation. Une telle composition est donc complexe dans sa fabrication.
L'invention vise à remédier à cet inconvénient en proposant un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plantes qui soit compatible avec une mise en œuvre à l'échelle industrielle. En particulier, l'invention vise un procédé de préparation d'une telle composition qui soit stable dans le temps et à température ambiante.
L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une telle composition comprenant une émulsion qui est "biosourcée", c'est-à-dire obtenue à partir de ressources naturelles -notamment de ressources végétales- peu onéreuses et renouvelables.
L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une telle composition qui ne nécessite pas d'étape spécifique d'adjonction d'agents de stabilisation de ladite composition. L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une composition de traitement de plantes qui soit simplifié.
L'invention vise aussi une composition destinée à un traitement -notamment phytopharmaceutique et/ou nutritionnel- de plantes susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention, et qui présente les mêmes avantages, en particulier : - qui présente un faible coût de revient et peut être appliquée de façon économique à grande échelle sur des plantes, et ;
- qui permette de réduire les doses de substance active à appliquer sur une culture de plantes et qui contribue à la préservation de l'environnement.
L'invention vise à pallier l'ensemble de ces inconvénients.
Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser :
i. ) un broyage de graines oléagineuses dans un milieu de broyage aqueux (permettant d'obtenir un broyât de graines oléagineuses), puis ;
ii. ) une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyât de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras dans le milieu aqueux par effet de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis ;
iii. ) une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis ;
iv. ) un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques et des nutriments de plantes.
L'invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante dans lequel on prépare (étapes i.), ii.) et iii.)) une émulsion d'acides gras et on incorpore dans ladite émulsion d'acides gras au moins une substance active sur des plantes. Dans le procédé selon l'invention, Γ émulsion d'acide gras permet de potentialiser les effets de la substance active en application sur des plantes. L'émulsion d'acides gras est obtenue par hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines oléagineuses broyées, séparation et collecte de ladite émulsion d'acides gras.
Dans tout le texte :
- on qualifie de "phytopharmaceutique" une composition (quelles que soient sa forme et sa destination, en particulier y compris un liquide, une suspension, une dispersion, une émulsion, une préparation, un produit ou une substance active) ayant pour fonction :
o de protéger des végétaux (avant leur récolte) et/ou des produits végétaux (après leur récolte) contre des organismes nuisibles et/ou de prévenir l'action de tels organismes nuisibles, et/ou ;
o d'exercer une action sur les processus vitaux des végétaux (par exemple, réguler la croissance de végétaux), et/ou ;
o d'assurer la conservation de produits végétaux, et/ou ;
o de détruire des végétaux indésirables ou adventices, et/ou ; o de détruire des parties de végétaux, et/ou de freiner et/ou de prévenir une croissance indésirable de végétaux.
- on désigne par "adjuvant" toute composition qui est au moins sensiblement dépourvue en elle-même de substance active -notamment à propriété phytopharmaceutique et/ou nutritionnelle-, mais qui, en association avec une substance active, en améliore les propriétés physiques, chimiques et/ou biologiques, tout en en limitant les effets et les impacts néfastes sur la faune et sur la flore ;
- on entend par "graines oléagineuses" des graines de plantes oléagineuses comprenant au moins un corps gras susceptible d'être extrait des graines, telles que par exemple des graines de colza, des graines de tournesol, des graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline et des graines de crambe, et ;
- on entend par "hydrolyse enzymatique in situ" une hydrolyse enzymatique d'une matière brute obtenue par broyage de graines oléagineuses dans un milieu aqueux, ladite matière comprenant tous les composants des graines oléagineuses sous la forme d'un solide à l'état divisé dispersé dans le milieu aqueux, et ;
- le terme "lipase" s'entend au sens commun, c'est-à-dire d'une enzyme essentiellement hydrosoluble de la classe EC 3.1.1 de la classification des enzymes et catalysant la transformation de triglycérides en glycérol et en acides gras libres.
Dans un procédé selon l'invention, on choisit des graines oléagineuses aptes à former une émulsion par effet d'un broyage et d'une hydrolyse enzymatique par la lipase et une composition de traitement comprenant ladite émulsion et au moins une substance active, ladite émulsion et ladite composition de traitement étant adaptées pour une application au contact de plantes.
Avantageusement et selon l'invention, on choisit les graines oléagineuses dans le groupe formé des graines de colza, des graines de tournesol, des graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline, des graines de crambe, des graines de fruits à coques (ou fruits à écale), telles que notamment l'amande de noisette, l'amande de noix, l'amande de noix de cajou, l'amande de pistache et l'amande d'arachide.
Avantageusement, dans un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention, avant le broyage, on réalise une étape préalable de décorticage des graines oléagineuses, d'élimination du péricarpe et de préparation de l'amande.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'étape i.) de broyage de graines oléagineuses dans un milieu de broyage aqueux de façon à obtenir un milieu hétérogène liquide/solide formé de particules d'une matière solide à l'état divisé dispersées dans le milieu de broyage aqueux, les particules formant la matière solide à l'état divisé présentant une taille moyenne inférieure à 500 μπι.
Les inventeurs ont observé que le broyage de graines oléagineuses permettant l'obtention d'une matière solide à l'état divisé présentant des particules de taille moyenne inférieure à 500 μπι permet avantageusement de favoriser l'hydrolyse subséquente de triglycérides par au moins une lipase. En particulier, une hydrolyse totale d'au moins 90 %, notamment de l'ordre de 95 %, des triglycérides de graines oléagineuses est ainsi obtenue.
Il est possible de réaliser l'étape i.) de broyage par toute méthode de broyage de graines oléagineuses connue en elle-même.
Avantageusement et selon l'invention, on peut réaliser l'étape i.) de broyage dans la cuve d'un broyeur à couteau. On soumet ainsi la suspension de graines oléagineuses dans un tel broyeur à couteau pendant une durée comprise entre 1 min et 10 min. Avantageusement, on peut réaliser l'étape i.) de broyage dans la cuve d'un broyeur à couteau ou mixer par exemple de marque Waring® ("Waring blender").
Avantageusement et selon l'invention, le milieu de broyage aqueux visé à l'étape i.) est choisi dans le groupe formé des solutions aqueuses tamponnées -notamment des tampons phosphate ou des tampons Tris à un pH sensiblement de l'ordre de pH 7-, des solutions aqueuses salines -par exemple des solutions aqueuses NaCl 0,1 M - et de l'eau.
Avantageusement, et selon l'invention dans un procédé selon l'invention, lors de l'étape i.) de broyage :
- on met en contact les graines oléagineuses et le milieu de broyage aqueux, le rapport de la masse de graines oléagineuses rapportée sur la somme des masses des graines et du milieu de broyage aqueux étant de valeur inférieure à 0,2 -notamment inférieure à 0,15, de préférence comprise entre 0,10 et 0,15- ;
- puis on soumet le mélange obtenu au broyage proprement dit.
En effet, une telle valeur inférieure à 0,2 permet d'une part un broyage efficace des graines dans le milieu de broyage aqueux en optimisant la viscosité du milieu de broyage aqueux et permet d'autre part d'obtenir une hydrolyse ultérieure des triglycérides qui est efficace.
Avantageusement et selon l'invention, à l'étape ii.) on réalise l'hydrolyse enzymatique des triglycérides des graines oléagineuses par ajout d'au moins une lipase au broyât de graines obtenu à l'étape i.). On réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour former une émulsion comprenant des acides gras libérés dans le milieu aqueux par effet de l'hydrolyse enzymatique des triglycérides. On adapte les conditions d'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux de façon à former un mélange présentant un aspect homogène à l'échelle macroscopique, mais qui est hétérogène à l'échelle microscopique, la phase lipidique étant dispersée de façon stable dans la phase aqueuse sous la forme de phases du type "eau/huile/eau" et/ou du type "huile/eau/huile".
Avantageusement, on réalise l'hydrolyse enzymatique des triglycérides des graines oléagineuses en présence d'au moins une lipase par mise en contact de ladite au moins une lipase avec le broyât de graines oléagineuses dans un milieu aqueux obtenu à l'étape i.). Avantageusement, on met ladite au moins une lipase en contact avec le broyât postérieurement à l'étape i.).
Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température choisie pour permettre une activité sensiblement optimale de la lipase. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température comprise entre 15°C et 55°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température comprise entre 15°C et 55°C et pendant une durée comprise entre 15 min et 5 heures.
Avantageusement et selon l'invention, on peut aussi réaliser l'hydrolyse enzymatique à température ambiante, c'est à dire sans procéder à aucun chauffage ni refroidissement.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux visée à l'étape ii.) dans un homogénéisateur à haute pression. On réalise donc une homogénéisation à haute pression d'un mélange réactionnel formé à partir du broyât comprenant au moins une lipase par compression de ce mélange réactionnel à une pression supérieure à la pression atmosphérique (c'est-à-dire à une pression supérieure à la pression atmosphérique) suivie d'une détente brutale à pression atmosphérique du mélange ainsi formé. En particulier, on réalise la compression jusqu'à une pression comprise entre 2,5 MPa et 100 MPa -notamment comprise entre 10 MPa et 50 MPa, de préférence de l'ordre de 15 MPa. On réalise l'homogénéisation à haute pression du mélange réactionnel à une température choisie pour permettre une activité optimale de la lipase.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'homogénéisation à haute pression du mélange réactionnel à une température comprise entre 15°C et 55°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique de l'étape ii.) à une température comprise entre 15°C et 55°C et pendant une durée comprise entre 15 min et 5 heures.
On peut réaliser l'homogénéisation à haute pression et l'hydrolyse enzymatique à température ambiante, c'est à dire sans procéder à un chauffage ou à un refroidissement du mélange réactionnel. Avantageusement et selon l'invention, pour l'homogénéisation à haute pression, il est procédé à au moins deux cycles successifs de compression/détente.
On peut réaliser cette homogénéisation à haute pression dans une enceinte d'un homogénéisateur à haute pression munie d'une pompe d'introduction à débit constant du mélange réactionnel dans l'enceinte et équipée d'une vanne de fuite par laquelle ledit du mélange réactionnel subit une dépression en sortie de ladite enceinte. On peut donc réaliser l'homogénéisation du mélange réactionnel en continu dans un homogénéisateur à haute pression.
Les inventeurs ont observé de façon totalement surprenante que ladite au moins une lipase conserve dans le mélange réactionnel et sous homogénéisation sous pression une activité élevée d'hydrolyse des triglycérides des graines oléagineuses.
Avantageusement et dans un mode de réalisation de l'invention, on ajoute au broyât obtenu à l'étape i.) au moins une lipase sous forme d'une solution aqueuse -en une seule fois ou en plusieurs fois-.
Avantageusement et dans un autre mode de réalisation de l'invention, pour former ledit mélange réactionnel on ajoute au broyât obtenu à l'étape i.) au moins une lipase à l'état solide -en une seule fois ou en plusieurs fois-.
Il est aussi possible d'ajouter -en une seule fois ou en plusieurs fois- au moins une lipase -en solution et/ou à l'état solide- au broyât avant la fin ou après la fin de l'étape i.).
Avantageusement et selon l'invention, on utilise au moins une lipase choisie dans le groupe des lipases produites par un végétal et des lipases produites par un micro-organisme -notamment un micro-organisme choisi dans le groupe formé des micro-organismes du genre Rhizopus, des micro-organismes du genre Mucor, des micro-organismes du genre Alcaligenes, des micro-organismes du genre Candida -notamment de l'espèce Candida rugosa-, des micro-organismes du genre Aspergillus, des micro-organismes du genre Pseudomonas, des microorganismes du genre Humicola, des micro-organismes du genre Thermomyces, des micro-organismes du genre Pénicillium et des micro-organismes du genre Geotrichum, notamment de l'espèce Geotrichum candidum- et des isoformes de ces lipases.
Avantageusement et selon l'invention, on utilise au moins une lipase de Candida rugosa. Avantageusement, on utilise au moins une lipase de Candida rugosa à raison de 100 à 500 unités de lipase, notamment à raison de 150 à 400 unités de lipase, de préférence de l'ordre de 300 unités de lipase par gramme de graine oléagineuses (UL/g). Avantageusement, on utilise 100 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 75 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses. Avantageusement, on utilise 166 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 90 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses. Avantageusement, on utilise 333 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 95 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses.
On entend par unité de lipase, la quantité de lipase nécessaire pour libérer 10"6 moles d'acide gras à partir de glycéride, pendant une durée de 1 minute et dans les conditions optimales d'activité de l'enzyme (température, pH et concentration de glycérides).
On obtient un hydrolysat comprenant des acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides des graines. L'hydrolysat est formé d'un mélange d'une émulsion d'acides gras, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse riche en composés hydrosolubles de graines.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise la séparation visée à l'étape iii.) du résidu solide, de la phase aqueuse et de ladite émulsion, par centrifugation. On réalise donc un fractionnement de l'hydrolysat comprenant la lipase par centrifugation. On adapte les conditions de centrifugation pour permettre une sédimentation du résidu solide (culot), la séparation de la phase aqueuse intermédiaire et de la phase supérieure (surnageant) formée de Γ émulsion d'acides gras.
On réalise une telle séparation par centrifugation, par exemple sous une accélération comprise entre 1000 et 10000 g, notamment de l'ordre de 7500 g. Par exemple, on réalise une telle centrifugation pendant une durée comprise entre 1 min et 10 min.
À l'issue des étapes L), ii.) et iii.) d'un procédé selon l'invention, on obtient une émulsion dissociée du résidu solide et de la phase aqueuse et comprenant de l'eau, des acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de graines, des phospholipides constitutifs des membranes cellulaires des graines (par exemple de la phosphatidylcholine, de la phosphatidyléthanolamine, du phosphatidylinositol, de l'acide phosphatidique et de la phosphatidylsérine), des sphingolipides, des protéines hydrophobes constitutives des oléosomes des graines -notamment des oléosines de poids moléculaire moyen compris entre 30 kDa et 35 kDa, notamment de l'ordre de 35 kDa- et des constituants des graines présents en faible quantité tels que par exemple de la vitamine E (oc-tocophérol, β-tocophérol, γ-tocophérol, δ-tocophérol, oc-tocotriénol, β-tocotriénol, γ-tocotriénol et δ-tocotriénol) et des stérols de plantes.
Les inventeurs ont constaté que Γ émulsion obtenue à l'étape iii.) et la composition de traitement selon l'invention présentent des propriétés inattendues antioxydantes et de conservation de ladite émulsion et de ladite composition de traitement.
On forme par un procédé selon l'invention, une émulsion et une composition de traitement de plantes qui sont stables dans le temps.
Les oléosines sont des polypeptides formés d'une séquence d'environ 180 acides aminés, comprenant un domaine hydrophobe central constitué d'environ 75 acides aminés hydrophobes, exempt d'acide aminé basique et d'acide aminé acide, ledit domaine hydrophobe central étant limité à une extrémité par un résidu L-lysine et à l'autre extrémité par deux résidus L-arginine.
Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on constate que l'action de la lipase libère au moins 90 % -notamment de l'ordre de 95 %- de la quantité totale des acides gras de triglycérides susceptibles de pouvoir être libérés par hydrolyse enzymatique totale des triglycérides.
Avantageusement et selon l'invention, Γ émulsion est une émulsion complexe du type "eau/huile/eau" et du type " huile/eau/huile" présentant des gouttelettes lipidiques de taille homogène et dont la taille moyenne est comprise entre 1 μπι et 1,8 μπι. Une telle émulsion complexe présente une stabilité augmentée par rapport à la stabilité d'une émulsion du type huile/eau formée à partir des oléosomes natifs de graines oléagineuses. De façon totalement surprenante, les inventeurs ont observé que les étapes L), ii.) et iii.) du procédé selon l'invention permet de former une émulsion dans laquelle la taille moyenne des gouttelettes lipidiques est sensiblement la même que la taille moyenne des oléosomes natifs des graines oléagineuses de départ.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise le mélange visé à l'étape iv.) d'au moins une substance active et de l'émulsion par homogénéisation à haute pression, c'est-à-dire à une pression supérieure à la pression atmosphérique. On forme la composition de traitement de plantes par homogénéisation à haute pression du mélange formé de l'émulsion et d'au moins une substance active.
On réalise l'homogénéisation à haute pression visée à l'étape iv.) par compression du mélange -formé de l'émulsion et d'au moins une substance active- à une pression supérieure à la pression atmosphérique (c'est-à-dire à une pression supérieure à la pression atmosphérique) suivie d'une détente brutale à pression atmosphérique du mélange ainsi formé. En particulier, on réalise la compression jusqu'à une pression comprise entre 2,5 MPa et 100 MPa -notamment comprise entre 10 MPa et 50 MPa, de préférence de l'ordre de 15 MPa.
Avantageusement, on réalise au moins deux cycles successifs de compression/détente du mélange comprenant l'émulsion et au moins une substance active.
Avantageusement, on réalise l'homogénéisation à haute pression visée à l'étape iv.) à une température qui préserve sensiblement la structure de l'émulsion et de la composition de traitement. On poursuit l'homogénéisation à haute pression visée à l'étape iv.) pendant une durée suffisante pour obtenir la composition de traitement.
Avantageusement et selon l'invention, on peut aussi réaliser le mélange de l'étape iv.) en continu dans un homogénéisateur à haute pression. On réalise l'homogénéisation à haute pression par compression de l'émulsion d'acides gras comprenant au moins une substance active dans une enceinte d'un homogénéisateur à haute pression munie d'une pompe d'introduction à débit constant de l'émulsion dans l'enceinte et équipée d'une vanne de fuite par laquelle ladite émulsion subit une dépression en sortie de ladite enceinte.
Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins une substance active sur des plantes dans le groupe formé des substances présentant une activité bénéfique pour des plantes par application sur lesdites plantes de la composition selon l'invention, c'est-à-dire en mélange avec l'émulsion.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une composition de traitement de plantes comprenant une émulsion en mélange avec au moins une substance active sur des plantes. Un tel procédé permet d'obtenir une composition de traitement de plantes qui est stable dans le temps et qui permet l'application de ladite substance active sur des plantes, le maintien de ladite substance active en surface et au contact des végétaux et/ou le franchissement par ladite substance active de la couche protectrice externe des végétaux (par exemple, de la cuticule).
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances fongicides, des substances fongistatiques, des substances bactéricides, des substances bactériostatiques, des substances insecticides, des substances acaricides, des substances herbicides, des substances parasiticides, des substances nématicides et des substances rodenticides, des substances taupicides, des substances corvifuges, des substances corvicides, des substances molluscicides, des substances répulsives des oiseaux et du gibier.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances stimulatrices des défenses naturelles de plante.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des polypeptides à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante -notamment des enzymes de dégradation de la cellulose à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante, par exemple des cellulases à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante- et des polysaccharides à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante -notamment de fragments de chitine, de chitosan, de laminarine et de pectines de faible poids moléculaire-.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes est une cellulase de la classe EC 3.2.1.4 de la classification des enzymes.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes est une cellulase d'un champignon, notamment d'un champignon du genre Trichoderma (par exemple de l'espèce Trichoderma reesei ou de l'espèce Trichoderma harzianum).
Avantageusement et selon l'invention, on mélange au moins une cellulase à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes avec l'émulsion de façon à former la composition de traitement de plante.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une cellulase est choisie dans le groupe formé des cellulases qui sont compatibles avec ladite émulsion, c'est-à-dire qui conservent dans ladite émulsion au moins sensiblement une activité stimulatrice des défenses naturelles de plante. Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins une cellulase qui conserve au moins sensiblement son activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes lors de l'étape iv.) et ultérieurement à ladite étape iv.), en particulier lors de l'application de la composition de traitement sur des plantes.
Avantageusement et selon l'invention, à l'étape iv.) on mélange la cellulase à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes avec ladite émulsion de façon à former la composition phytosanitaire, ladite cellulase étant choisie pour être compatible avec ladite émulsion d'acides gras et avec la réalisation de ladite étape iv.).
Les inventeurs ont observé que, de façon totalement inattendue, une composition phytosanitaire obtenue par un procédé selon l'invention permet, non seulement de préserver la structure et les propriétés stimulatrices des défenses naturelles de plantes de chaque cellulase, mais permet aussi d'améliorer la vectorisation de ladite cellulase en particulier par application de ladite composition phytosanitaire sur des parties aériennes de plantes.
Ils ont en particulier démontré qu'une cellulase -notamment la cellulase de Trichoderma- formulée dans une émulsion d'acides gras obtenue par hydrolyse in situ des triglycérides de graines d'une plante oléagineuse selon l'invention présente une activité catalytique de dégradation de la cellulose équivalente voire supérieure à l'activité catalytique de dégradation de la cellulose d'une composition de cellulase exempte d'une telle émulsion.
Ils ont en outre démontré qu'une telle émulsion d'acides gras obtenue par hydrolyse in situ des triglycérides de graines oléagineuses constitue un adjuvant d'une cellulase à titre de substance active. Les inventeurs supposent qu'un tel adjuvant permet de stabiliser la cellulase dans la composition phytosanitaire, mais permet aussi d'augmenter le temps de contact de ladite composition comprenant la cellulase avec la plante -notamment avec les parties aériennes de la plante- et favorise l'action de ladite cellulase sur la plante.
Ils ont démontré qu'une telle composition obtenue par un procédé selon l'invention permet de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines de résistance de plantes.
Ils ont en particulier montré que la composition de traitement selon l'invention comprenant Γ émulsion et de la cellulase présente une activité stimulatrice des défenses naturelles des plantes qui est améliorée par rapport à une composition phytosanitaire comprenant du Bion® à titre de stimulant des défenses naturelles des plantes.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active est choisie dans le groupe formé des substances actives sur la germination de semences, des substances de contrôle de la croissance de plantes, des substances de contrôle du développement de plantes, des substances stimulatrices de la photosynthèse, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active est un nutriment de plantes à base d'azote (N), à base de phosphore (P), à base de potassium (K), à base de fer (Fe) ou à base d Oligoéléments. Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on prépare une émulsion selon l'invention comprenant au moins un nutriment de plantes de façon à pallier une carence nutritionnelle de plantes en macroélément (par exemple en azote, en phosphore, en potassium), en méso-élément (par exemple en calcium, en soufre, en magnésium) ou en oligoélément (par exemple en manganèse, en cuivre, en fer, en bore, en molybdène, en zinc, en nickel, en sélénium, en silicium ou en sodium). On prépare une émulsion selon l'invention permettant une libération d'au moins un nutriment à travers la cuticule de plantes.
Avantageusement, on prépare une composition selon l'invention comprenant un solide à l'état divisé comprenant au moins un élément nutritif des végétaux choisi dans le groupe formé de l'azote (N), du phosphore (P), du potassium (K), du calcium (Ca), du magnésium (Mg), du soufre (S), du fer (Fe), du cuivre (Cu), du sodium (Na), du zinc (Zn), du bore (B), du molybdène (Mo), du silicium (Si), du sélénium (Se), du nickel (Ni), du manganèse (Mn), par exemple du carbonate de manganèse (MnCO3) et/ou du sulfate de manganèse (MnSO4) et/ou de l'hydroxyde de magnésium (Mg(OH)2) et/ou de l'oxyde de zinc (ZnO) et/ou de l'oxyde de calcium (CaO) et/ou un chélate de fer -notamment un chélate d'EDTA ou un chélate d'EDDHA (acide éthylène-diamine-N,N'-bis-2-hydroxyphényl acétique) et de fer- et/ou un chélate de cuivre -notamment un chélate d'EDTA et de cuivre- et/ou un chélate de zinc -notamment un chélate d'EDTA et de zinc- et/ou du sulfate de fer et/ou du sulfate de cuivre et/ou du sulfate de zinc et/ou du pentoxyde de phosphore (P2O5).
Avantageusement et par un procédé selon l'invention, on forme une composition de traitement qui est stable dans le temps. Par composition stable dans le temps, on entend une composition dont les composants ne sédimentent pas lors d'un stockage prolongé sans agitation pendant une durée d'au moins un mois. En particulier, la composition de traitement est apte à empêcher tout développement bactérien ou fongique dans la composition de traitement. Â cet égard, la composition de traitement est donc stable dans le temps. Les inventeurs ont observé qu'une telle composition de traitement de plantes est stable vis-à-vis de la contamination microbienne pendant une durée d'au moins un an à température de l'ordre de 5°C.
L'invention concerne donc toute utilisation en agriculture d'une émulsion obtenue par un procédé comprenant au moins les étapes L), ii.) et iii.).
L'invention s'étend aussi à une composition -notamment une composition de traitement phytopharmaceutique et/ou nutritionnel de plante - comprenant une émulsion d'acides gras issue d'une hydrolyse enzymatique in situ de triglycérides d'un broyât de graines oléagineuses par au moins une lipase, caractérisée en ce qu'elle comprend aussi au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes.
L'invention s'étend en particulier à une composition -notamment à une composition de traitement phytopharmaceutique et/ou nutritionnel de plante- obtenue par un procédé selon l'invention.
Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active est une cellulase d'un champignon, notamment d'un champignon du genre Trichoderma (par exemple de l'espèce Trichoderma reesei ou de l'espèce Trichoderma harzianum).
Avantageusement et selon l'invention, au moins une lipase est une lipase d'un micro-organisme du genre Candida -notamment de l'espèce Candida rugosa.
Avantageusement et selon l'invention, la composition de traitement comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants des graines oléagineuses et choisi parmi :
- au moins un phospholipide des graines oléagineuses -notamment au moins un phospholipide choisi dans le groupe formé des phosphatidylcholines, des phosphatidyléthanolamines, des phosphatidylinositols, des acides phosphatidiques et/ou des phosphatidylsérines ; - du glycérol ;
- au moins une oléosine, et ;
- au moins une lipase, et ;
- au moins un constituant mineur issus des graines et choisi dans le groupe formé de la vitamine E ( -tocophérol, β-tocophérol, γ-tocophérol, δ-tocophérol) et des stérols de plantes.
Avantageusement et selon un mode de réalisation de l'invention, la composition de traitement comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants de graines oléagineuses choisi dans le groupe formé de Γ -tocotriénol, du β- tocotriénol, du γ- tocotriénol et du δ-tocotriénol.
L'invention s'étend aussi à toutes les utilisations d'une composition selon l'invention dans un traitement de plantes.
L'invention s'étend à un procédé de traitement -notamment phytopharmaceutique, de fertilisation et/ou nutritionnel- de plantes dans lequel on applique sur lesdites plantes une quantité efficace de composition selon l'invention. L'invention s'étend aussi à un procédé de traitement -notamment phytopharmaceutique, de fertilisation et/ou nutritionnel- de plantes dans lequel on applique sur lesdites plantes une composition obtenue par un procédé selon l'invention.
L'invention s'étend également à l'utilisation en agriculture d'une composition selon l'invention en application sur des plantes, c'est-à-dire une composition comprenant au moins une substance active et une émulsion d'acides gras obtenus par hydrolyse enzymatique in situ d'un broyât de graines oléagineuses.
Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention au contact de semences et/ou de graines et/ou de racines de plantes.
Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention au contact d'au moins une partie aérienne des végétaux -notamment sur au moins une partie du feuillage des végétaux-. Une composition selon l'invention est en particulier adaptée pour pouvoir être appliquée sur des parties aériennes de végétaux -par exemple, sur les fleurs, sur les fruits, sur les feuilles, sur les tiges de plantes en culture- sans toutefois provoquer de brûlure des parties aériennes des végétaux. Par exemple, on applique une composition selon l'invention par nébulisation (au pulvérisateur).
On peut utiliser une composition selon l'invention en application sur des plantes potagères, sur des plantes ornementales en culture, sur des cultures horticoles, sur des plantes en culture en plein champ, sur des plantes en culture sous serre ou sur des plantes en culture hors sol. On peut aussi utiliser une composition selon l'invention en application sur une culture maraîchère, sur une culture industrielle ou sur une grande culture. On peut aussi utiliser une composition selon l'invention en application sur des arbres fruitiers, sur des arbres et arbustes d'ornementation, sur des plantes potagères, sur des céréales -notamment du blé, du colza, du lin, du lin oléagineux, du lin textile, de l'orge, du sorgho-, sur des cultures florales diverses ou sur des plantes aromatiques.
L'invention vise de façon générale l'utilisation en application sur des plantes d'une émulsion d'acides gras à titre d'agent de vectorisation d'une substance active, ladite émulsion étant obtenue par un procédé dans lequel on réalise les étapes suivantes :
i. ) broyage de graines oléagineuses, puis ;
ii. ) hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyât de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour former une émulsion comprenant des acides gras libérés dans le milieu aqueux par effet de ladite hydrolyse enzymatique, puis ;
iii. ) séparation de ladite émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse.
L'invention s'étend également à un procédé de traitement de plantes dans lequel on applique une composition selon l'invention sur des plantes. Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention sur les parties aériennes de plantes.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition de traitement, une composition de traitement et ses utilisations caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquelles :
- la figure 1 est une représentation graphique en histogramme de l'effet protecteur de l'activité enzymatique de la cellulase conféré par une émulsion selon l'invention, et
- la figure 2 est une représentation graphique en histogramme illustrant l'effet adjuvant d'une émulsion selon l'invention.
EXEMPLE 1 - Emulsion d'acides gras
On prépare une suspension de graines de colza (100 g) dans 800 g d'eau et on place cette suspension dans le bol d'un robot ménager de type "Warring blender". On soumet cette suspension à un broyage pendant 5 min. On ajoute ensuite 10 g d'une solution de lipase de Candida rugosa (10 mg/mL) à 90 g du broyât obtenu ci-dessus. Le mélange obtenu comprend 10 % de matière solide issue des graines de colza et une quantité de lipase de Candida rugosa correspondant à 300 unités de lipase par gramme de matière solide issue de graines de colza.
On soumet ensuite le mélange constitué de la matière solide issue des graines de colza, de la lipase et d'eau à une homogénéisation sous pression dans un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France), une première étape d'homogénéisation étant réalisée à une pression de 15 MPa et une deuxième étape d'homogénéisation étant réalisée à une pression de 0,2 MPa. On obtient après centrifugation de l'homogénat obtenu en sortie de l'homogénéisation, une phase supérieure formée de Γ émulsion d'acides gras issus de graines de colza.
EXEMPLE 2 - Emulsion d'acides gras
On prépare une suspension de graines de colza (150 g) dans 850 g (850 mL) d'eau et on place cette suspension dans le bol d'un robot ménager de type "Warring blender". On soumet cette suspension à un broyage pendant 5 min. On ajoute une solution enzymatique "Lipolyve CC" (préparation industrielle à partir de la levure Candida rugosa sous forme lyophilisée à 30 unités/mg) à raison de 300 unités de lipase par gramme de matière solide issue de graines de colza. La proportion massique de graines dans le mélange est de l'ordre de 13,5 %.
On soumet ensuite le mélange constitué de la matière solide issue des graines de colza, de la lipase et d'eau à une homogénéisation sous pression de 35 MPa dans un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France). L'homogénat contenant l'enzyme est placé à 37°C sous agitation pendant 2 heures puis conservé à 4°C. On soumet ensuite l'homogénat à une étape de séparation de phases par centrifugation pendant 5 min à 7500 g. On récupère la phase supérieure formée de l'émulsion d'acides gras. On soumet le culot remis en suspension dans la phase aqueuse à au moins une étape de centrifugation pendant 5 min à 7500 g et on récupère à nouveau une phase supérieure formée de l'émulsion d'acides gras. On collecte et on mélange les différentes émulsions ainsi collectées. 75 grammes d'émulsion d'acides gras sont ainsi collectés obtenus à partir de 1000 grammes de suspension de graines de colza dans l'eau dont 150 grammes de graines de colza.
Les caractéristiques de l'émulsion d'acides gras obtenue par lipolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines de colza sont les suivantes :
- elle présente une masse volumique de 0,943 g/mL (± 0,004 g/mL) ;
- elle comprend un taux de matière sèche (déterminée par assèchement thermique à 103°C pendant 6 heures) est de 67,5 g (± 0,6) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ;
- elle présente une proportion d'eau de 32,5 g (± 0,6) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ;
- elle présente une teneur en huile (déterminée par extraction des corps gras de la matière sèche avec du cyclohexane) de 58,3 g (± 1,3) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ;
- elle présente un taux de protéines (déterminé selon la méthode de "Kjeldahl" de dosage de l'azote minéral) de 7,24 g (± 0,47) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ; - elle présente un taux de phospholipides (déterminé selon la norme NF-T 60227 de dosage vanado-molybdique du phosphore minéral) de 3,8 g (± 0,1) de phospholipide pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras.
EXEMPLE 3 - Maintien de l'activité enzymatique de la cellulase en présence d'une émulsion d'acides gras selon l'invention
On compare l'activité enzymatique des cellulases excrétées par le Trichoderma reesei formulées en présence (B) ou en absence (A) d'émulsion d'acides gras selon l'invention. On mesure l'activité catalytique de la cellulase (A cellulase), exprimée en mole de substrat transformé par seconde, en utilisant un kit de détection Mégazyme KCellG3. Les résultats obtenus sont présentés en figure 1 et montrent que Γ émulsion d'acide gras (B, histogramme hachuré) ne présente pas d'effet inhibiteur de l'activité de la cellulase par rapport à la cellulase (A, histogramme plein) seule et permet donc sa conservation et son application sur des plantes sans perte d'activité de la cellulase.
EXEMPLE 4 - Stimulation des défenses naturelles de plantes.
On prépare des plants d'Arabidopsis thaliana transgéniques (PR-1::GUS) dans lesquels le gène codant pour la β-glucuronidase a été cloné en aval des séquences régulatrices du gène PR-1 ("Pathogesis régulation 1"). De tels plants d'Arabidopsis thaliana transgéniques modèles (PR-1::GUS) sont cultivés en pots pendant 3 semaines puis sont traités par nébulisation avec :
- (D) de l'eau à titre de contrôle, ou
- (E) du Bion® (Syngenta Agro SAS, Guyancourt, France) à titre de stimulant des défenses naturelles de plantes contrôle, ou ;
- (F) de la cellulase seule, ou ;
- (G) une composition phytosanitaire selon l'invention comprenant de la cellulase formulée avec une émulsion aqueuse d'acides gras obtenue par hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides d'un broyât de graines de plante oléagineuse.
Les compositions (F) et (G) comprennent de la cellulase à raison de 3 g/L. 48 heures après application de l'une des compositions (D), (E), (F) ou (G), les plants sont collectés et placés dans des tubes "Eppendorf" de 2 mL en présence de billes de verre de 2 mm de diamètre puis congelés dans l'azote liquide. Chacune des compositions (D), (E), (F) ou (G) est broyée et conservée à -80°C.
On réalise une extraction des protéines de chaque échantillon, dans laquelle on ajoute dans chaque tube "Eppendorf" 100 μL· de tampon phosphate sodique (0,25 M, pH 7) comprenant 1 % de Triton XI 00 et du β-mercapto-éthanol à une concentration de 10 mM. Chaque tube est homogénéisé sur "vortex", puis on centrifuge pendant 30 min à 13000 rpm à 4°C. On collecte et on place 25 μL· de chacune des phases surnageantes contenant les protéines dans un puits d'une plaque multi-puits (96 puits). On ajoute dans chaque puits, 125 μL· de tampon phosphate sodique (0,25 M, pH 7) et 50 μΐ. de substrat MUG (4-méthylumbelliféryl-p-D- glucuronide) de la β-glucuronidase.
On évalue le niveau d' activation des séquences promotrices de PR-1 en évaluant la quantité de β-glucuronidase produite par les plants d' Arabidospis thaliana dans chacune des conditions étudiées. On évalue ce niveau d' activation par la mesure de la fluorescence émise par hydrolyse du substrat MUG dans un lecteur de plaque Tristar LB 941 Berthold à une longueur d'onde d'excitation de 355 nm et à une longueur d'onde d'émission à 450 nm. On réalise une mesure de la fluorescence émise dans chacun des puits toutes les 5 minutes pendant 150 minutes.
En parallèle, on dose la quantité de protéine présente dans chacun des échantillons sur une fraction aliquote de 5 μL· d'échantillon. On réalise ce dosage selon la méthode de Bradford. Les résultats sont donnés en figure 2 dans laquelle l'ordonnée représente l'activité catalytique de la β-glucuronidase rapporté à la quantité de protéine de l'échantillon.
La composition phytosanitaire formée de cellulase et de l'émulsion d'acides gras (G) issus de l'hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines oléagineuses présente un niveau d'expression du gène β-glucuronidase équivalent au niveau d'expression du gène β-glucuronidase induit par le Bion® alors que la solution (F) ne contenant que la cellulase et sans l'émulsion ne provoque pas d'induction du gène β-glucuronidase. EXEMPLE 5 - Etude comparative
On réalise un traitement par pulvérisation d'un premier lot de plants d' Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines avec une émulsion selon l'invention et, à titre de comparaison, d'un deuxième lot de plants d' Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines avec une composition aqueuse qui est exempte d'émulsion selon l'invention.
Les émulsions selon l'invention sont obtenues par hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides d'un broyât de graines oléagineuses de colza puis dilution à 1 % (en volume) et comprennent en outre un composé éliciteur des défenses naturelles de plantes choisi parmi la cellulase de Trichoderma, des fragments de chitine, du chitosan (fragments de chitine déacétylés), de la laminarine (Sigma- Aldrich) ou de Γ oligopectine. À titre de comparaison, les mêmes composés éliciteurs sont préparés dans l'eau. Les caractéristiques des composés éliciteurs sont données au tableau 1 ci-après.
Figure imgf000024_0001
Tableau 1
À t0, on nébulise la composition de traitement sur des plants d' Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines à raison de 1 mL de composition par plant. On place les plants ainsi traités dans une enceinte climatique pendant une durée de 1, 6 ou 24 heures. À 1 heure, 6 heures et 24 heures après nébulisation, on quantifie les ARN spécifiques de quatre marqueurs connus d'activation des défenses naturelles des plantes : CYP71A12 (Cytochrome P450 d' Arabidopsis), PAD3 (mutation PhytoAlexin Déficient 3 du cytochrome P450 d' Arabidopsis), PDF1.2 et PR1 transcrits par les plants d' Arabidopsis thaliana traités. Pour ce faire, on réalise une extraction de TARN total lors de laquelle on collecte dans un tube trois plants correspondant à un même traitement et à une même durée de contact (lh, 6h ou 24h). Dans chaque tube, sont ajoutées des billes de verre présentant un diamètre moyen de 2 mm. Les tubes sont ensuite plongés dans un bain d'azote liquide. Les plants ainsi congelés sont broyés par agitation (Vibro broyeur à billes). On réalise ensuite l'extraction de l'ARN total au moyen du kit "SV Total RNA Isolation System" (Promega). On obtient les extraits d'ARN correspondant à chacune des conditions (durée de contact, composition adjuvante et éliciteur) à raison de ^g d'ARN dans 10 μΐ d'eau exempte de nucléase.
Pour chaque condition, on prépare un milieu réactif RT-PCR comprenant :
- 2 μL· de tampon RT 10X ;
- 0,8 de mélange de dNTP 25X (100 mM) ;
- 2 d'amorce "RT random primers" 10X ;
- 1
Figure imgf000025_0001
de multiscribe ;
- 1 μL d'inhibiteur de RNAse ;
- 3,2 μL· d'eau exempte de nucléase.
Dans chaque tube contenant ί0μL· de solution d'ARN (1 μg), on ajoute ί0μL· de milieu réactif RT-PCR. La synthèse d' AD Ne est réalisée selon le programme suivant :
- 10 min à 25°C, puis
- 5 min à 37°C, puis
- 5 min à 85°C.
Les solutions comprenant les ADNc sont déposées en triple dans des puits d'une plaque qPCR 384. Les amorces oligonucléotidiques correspondant aux marqueurs sélectionnés sont ajoutées aux ADNc, à raison de μL· à une concentration de ΙμΜ, ainsi que 5 μL· de réactif SYBR Green (Applied Biosystems). Pour chaque couple d'amorces le mélange de PCR quantitative est préparé séparément. La PCR quantitative est réalisée sur le système ABI 7900HT Applied Biosystems selon un profil de température : - 2 minutes à 50°C ;
- 10 minutes à 95°C ;
- 40 cycles de 15 secondes à 95°C puis 1 minute à 60°C.
Les mesures sont analysées par le logiciel SDS2.3. Les résultats sont exprimés en log2 du rapport des concentrations obtenues dans l'essai et dans le contrôle (eau). Un rapport supérieur à 2 (c'est-à-dire un Log2 > 1) indique que l'expression du gène est induite. Un rapport inférieur à 0,5 (c'est-à-dire un Log2 < -1) indique que l'expression du gène est réprimée.
Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par la cellulase de Trichoderma sont donnés au tableau 2 ci- après.
Figure imgf000026_0001
Tableau 2
Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par des fragments de chitine (DP 7-9) sont donnés au tableau 3 ci-après.
adjuvant de la chitine
Marqueur temps de contact, h
Eau Emulsion
1 1,47 0,50
CYP71A12
6 -0,54 3,36 24 -1,20 2,07
6 1,65 2,54
PAD3
24 -0,22 2,36
PR1 24 0,26 2,17
Tableau 3
Les résultats concernant Γ activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par la laminarine sont donnés au tableau 4 ci- après.
Figure imgf000027_0001
Tableau 4
Les résultats concernant Γ activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par le chitosan sont donnés au tableau 5 ci-après.
adjuvant du chitosan
Marqueur temps de contact, h
Eau Emulsion
1 -2,22 1,24
CYP71A12 6 0,43 1,80
24 -0,53 0,26
1 -2,20 1,24
PAD3
6 1,29 2,71 1 -2,20 0,63
PR1 6 -1,49 1,54
24 -0,47 1,97
Tableau 5
Les résultats concernant Γ activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par Γ oligopectine (DP69) sont donnés au tableau 6 ci-après.
Figure imgf000028_0001
Tableau 6
Une composition adjuvantée par une émulsion selon l'invention permet une stimulation des défenses naturelles de plantes qui est augmentée par rapport à la composition non adjuvantée.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser :
i. ) un broyage de graines oléagineuses dans un milieu de broyage aqueux, puis ;
ii. ) une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyât de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras par effet de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis ;
iii. ) une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis ;
iv. ) un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes.
21 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise le mélange visé à l'étape iv.) d'au moins une substance active et de Γ émulsion d'acides gras par homogénéisation à haute pression.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux visée à l'étape ii.) dans un homogénéisateur à haute pression.
4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on réalise la séparation visée à l'étape iii.) du résidu solide, de la phase aqueuse et de ladite émulsion par centrifugation.
5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise au moins une lipase choisie dans le groupe des lipases produites par un végétal, des lipases produites par un micro-organisme et des isoformes de ces lipases.
6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on choisit les graines oléagineuses dans le groupe formé des graines de colza, des graines de tournesol, des graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline, des graines de crambe, des graines de fruits à coques.
Il Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de broyage aqueux visé à l'étape i.) est choisi dans le groupe formé des solutions aqueuses tamponnées, des solutions aqueuses salines et de l'eau.
8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lors de l'étape i.) de broyage :
- on met en contact les graines oléagineuses et le milieu de broyage aqueux, le rapport de la masse de graines oléagineuses rapportée sur la somme des masses des graines et du milieu de broyage aqueux étant de valeur inférieure à 0,2 ;
- puis on soumet le mélange obtenu au broyage proprement dit.
91 Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance active dans le groupe formé des substances actives sur la germination de semences, des substances de contrôle de la croissance de plantes, des substances de contrôle du développement de plantes et des substances stimulatrices de la photosynthèse.
10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances fongicides, des substances fongistatiques, des substances bactéricides, des substances bactériostatiques, des substances insecticides, des substances acaricides, des substances herbicides, des substances parasiticides, des substances nématicides et des substances rodenticides, des substances taupicides, des substances corvifuges, des substances corvicides, des substances molluscicides, des substances répulsives des oiseaux et du gibier.
11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance phytopharmaceutique dans le groupe formé des substances stimulatrices des défenses naturelles de plante.
12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance phytopharmaceutique dans le groupe formé des enzymes de dégradation de la cellulose à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante et des polysaccharides à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante.
13/ Composition comprenant une émulsion d'acides gras issue d'une hydrolyse enzymatique in situ de triglycérides d'un broyât de graines oléagineuses par au moins une lipase,
caractérisée en ce qu'elle comprend aussi au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes.
14/ Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants des graines oléagineuses et choisi dans le groupe formé :
- au moins un phospholipide des graines oléagineuses ;
- du glycérol ;
- au moins une oléosine, et ;
- au moins une lipase, et ;
- au moins un constituant mineur issu des graines et choisi dans le groupe formé de la vitamine E et des stérols de plantes.
15/ Procédé de traitement de plante dans lequel on applique sur lesdites plantes une quantité efficace de composition selon l'une des revendications 13 ou 14.
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