FR3029738A1 - Procede de preparation d'une composition de traitement de plante, composition obtenue et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser : i. un broyage de graines oléagineuses et/ou d'amandes oléagineuses de fruits à coque dans un milieu de broyage aqueux, puis ; ii. une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyat de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras dans le milieu aqueux par effet de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis ; iii. une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis ; iv. un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques et des nutriments de plantes. L'invention concerne aussi une composition obtenue par un tel procédé et ses utilisations en agriculture.
Description
1 PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D'UNE COMPOSITION DE TRAITEMENT DE PLANTE, COMPOSITION OBTENUE ET SES UTILISATIONS L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement -notamment phytopharmaceutique et/ou 5 nutritionnel- de plantes, une composition de traitement de plantes obtenue par un tel procédé et toute utilisation d'une telle composition pour le traitement de plantes. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition à usage phytopharmaceutique et/ou nutritionnel en application sur des plantes, une composition obtenue par un tel procédé et toutes les utilisations d'une telle 10 composition, notamment les utilisations d'une telle composition dans un traitement phytopharmaceutique et/ou nutritionnel en application au contact de plantes. L'invention concerne en particulier un procédé de préparation d'une composition comprenant au moins une substance active sur des plantes, une composition comprenant au moins une substance active sur des plantes obtenue par 15 un tel procédé et les utilisations d'une telle composition pour favoriser la protection et la croissance de plantes. L'invention vise un procédé de préparation d'une composition de traitement et une composition de traitement adaptée pour pouvoir être appliquée au contact de plantes. L'invention vise en particulier une composition qui permette 20 à ladite substance active de franchir des enveloppes externes protectrices de la plante et d'atteindre des tissus internes de la plante. L'invention vise en particulier un procédé de préparation d'une composition de traitement et une composition de traitement adaptée pour pouvoir être appliquée au contact de tiges de plantes, et/ou de feuilles de plantes, 25 et/ou de fleurs de plantes, et/ou de fruits de plantes, et/ou de racines de plantes, et/ou de graines de plantes. L'invention vise donc une telle composition pour le transport, l'application et la vectorisation d'au moins une substance active au contact de plantes. 30 L'invention vise en particulier un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de stimulation des défenses naturelles de 3029738 2 plantes, une composition pour un traitement de stimulation des défenses naturelles de plantes obtenue par un tel procédé et toute utilisation d'une telle composition dans le traitement de stimulation des défenses naturelles de plantes. On connait de WO 98/53698 une composition formulée à partir d' oléosomes ("oil bodies") natifs issus de graines et son utilisation en agrochimie. Une telle composition est constituée essentiellement de triglycérides. Cette composition est obtenue par lavage à l'eau visant à éliminer les contaminants cellulaires de ladite composition, notamment les contaminants hydrosolubles et les contaminants formant une dispersion colloïdale dans l'eau.
Une telle composition formant une émulsion de triglycérides n'est en réalité pas stable dans le temps et n'est donc pas compatible avec une utilisation à l'échelle industrielle, en particulier pour une utilisation en agriculture. Elle nécessite l'adjonction d'additifs pour sa stabilisation. Une telle composition est donc complexe dans sa fabrication.
L'invention vise à remédier à cet inconvénient en proposant un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plantes qui soit compatible avec une mise en oeuvre à l'échelle industrielle. En particulier, l'invention vise un procédé de préparation d'une telle composition qui soit stable dans le temps et à température ambiante.
L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une telle composition comprenant une émulsion qui est "biosourcée", c'est-à-dire obtenue à partir de ressources naturelles -notamment de ressources végétales- peu onéreuses et renouvelables. L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une telle 25 composition qui ne nécessite pas d'étape spécifique d'adjonction d'agents de stabilisation de ladite composition. L'invention vise aussi un procédé de préparation d'une composition de traitement de plantes qui soit simplifié. L'invention vise aussi une composition destinée à un traitement -notamment phytopharmaceutique et/ou nutritionnel- de plantes 30 susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention, et qui présente les mêmes avantages, en particulier : 3029738 3 - qui présente un faible coût de revient et peut être appliquée de façon économique à grande échelle sur des plantes, et ; - qui permette de réduire les doses de substance active à appliquer sur une culture de plantes et qui contribue à la préservation de l'environnement.
5 L'invention vise à pallier l'ensemble de ces inconvénients. Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser : i.) un broyage de graines oléagineuses dans un milieu de 10 broyage aqueux (permettant d'obtenir un broyat de graines oléagineuses), puis ; ii.) une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyat de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras dans le milieu aqueux par effet 15 de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis ; iii.) une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis ; iv.) un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques 20 et des nutriments de plantes. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante dans lequel on prépare (étapes i.), ii.) et iii.)) une émulsion d'acides gras et on incorpore dans ladite émulsion d'acides gras au moins une substance active sur des plantes. Dans le procédé selon l'invention, l'émulsion d'acide gras permet de potentialiser les effets de la substance active en application sur des plantes. L'émulsion d'acides gras est obtenue par hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines oléagineuses broyées, séparation et collecte de ladite émulsion d'acides gras. Dans tout le texte : - on qualifie de "phytopharmaceutique" une composition (quelles que soient sa forme et sa destination, en particulier y compris un liquide, une 3029738 4 suspension, une dispersion, une émulsion, une préparation, un produit ou une substance active) ayant pour fonction : o de protéger des végétaux (avant leur récolte) et/ou des produits végétaux (après leur récolte) contre des organismes nuisibles et/ou de prévenir 5 l'action de tels organismes nuisibles, et/ou ; o d'exercer une action sur les processus vitaux des végétaux (par exemple, réguler la croissance de végétaux), et/ou ; o d'assurer la conservation de produits végétaux, et/ou ; o de détruire des végétaux indésirables ou adventices, et/ou ; 10 o de détruire des parties de végétaux, et/ou de freiner et/ou de prévenir une croissance indésirable de végétaux. - on désigne par "adjuvant" toute composition qui est au moins sensiblement dépourvue en elle-même de substance active -notamment à propriété phytopharmaceutique et/ou nutritionnelle-, mais qui, en association avec une 15 substance active, en améliore les propriétés physiques, chimiques et/ou biologiques, tout en en limitant les effets et les impacts néfastes sur la faune et sur la flore ; - on entend par "graines oléagineuses" des graines de plantes oléagineuses comprenant au moins un corps gras susceptible d'être extrait des graines, telles que par exemple des graines de colza, des graines de tournesol, des 20 graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline et des graines de crambe, et ; - on entend par "hydrolyse enzymatique in situ" une hydrolyse enzymatique d'une matière brute obtenue par broyage de graines oléagineuses dans un milieu aqueux, ladite matière comprenant tous les composants des graines 25 oléagineuses sous la forme d'un solide à l'état divisé dispersé dans le milieu aqueux, et ; - le terme "lipase" s'entend au sens commun, c'est-à-dire d'une enzyme essentiellement hydrosoluble de la classe EC 3.1.1 de la classification des enzymes et catalysant la transformation de triglycérides en glycérol et en acides gras libres.
30 Dans un procédé selon l'invention, on choisit des graines oléagineuses aptes à former une émulsion par effet d'un broyage et d'une hydrolyse 3029738 5 enzymatique par la lipase et une composition de traitement comprenant ladite émulsion et au moins une substance active, ladite émulsion et ladite composition de traitement étant adaptées pour une application au contact de plantes. Avantageusement et selon l'invention, on choisit les graines 5 oléagineuses dans le groupe formé des graines de colza, des graines de tournesol, des graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline, des graines de crambe, des graines de fruits à coques (ou fruits à écale), telles que notamment l'amande de noisette, l'amande de noix, l'amande de noix de cajou, l'amande de pistache et l'amande d'arachide.
10 Avantageusement, dans un mode particulier de réalisation d'un procédé selon l'invention, avant le broyage, on réalise une étape préalable de décorticage des graines oléagineuses, d'élimination du péricarpe et de préparation de l'amande. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'étape i.) de 15 broyage de graines oléagineuses dans un milieu de broyage aqueux de façon à obtenir un milieu hétérogène liquide/solide formé de particules d'une matière solide à l'état divisé dispersées dans le milieu de broyage aqueux, les particules formant la matière solide à l'état divisé présentant une taille moyenne inférieure à 500 ium. Les inventeurs ont observé que le broyage de graines 20 oléagineuses permettant l'obtention d'une matière solide à l'état divisé présentant des particules de taille moyenne inférieure à 500 ium permet avantageusement de favoriser l'hydrolyse subséquente de triglycérides par au moins une lipase. En particulier, une hydrolyse totale d'au moins 90 %, notamment de l'ordre de 95 %, des triglycérides de graines oléagineuses est ainsi obtenue.
25 Il est possible de réaliser l'étape i.) de broyage par toute méthode de broyage de graines oléagineuses connue en elle-même. Avantageusement et selon l'invention, on peut réaliser l'étape i.) de broyage dans la cuve d'un broyeur à couteau. On soumet ainsi la suspension de graines oléagineuses dans un tel broyeur à couteau pendant une durée 30 comprise entre 1 min et 10 min. Avantageusement, on peut réaliser l'étape i.) de 3029738 6 broyage dans la cuve d'un broyeur à couteau ou mixer par exemple de marque Waring® ("Waring blender"). Avantageusement et selon l'invention, le milieu de broyage aqueux visé à l'étape i.) est choisi dans le groupe formé des solutions aqueuses 5 tamponnées -notamment des tampons phosphate ou des tampons Tris à un pH sensiblement de l'ordre de pH 7-, des solutions aqueuses salines -par exemple des solutions aqueuses NaC1 0,1 M - et de l'eau. Avantageusement, et selon l'invention dans un procédé selon l'invention, lors de l'étape i.) de broyage : 10 - on met en contact les graines oléagineuses et le milieu de broyage aqueux, le rapport de la masse de graines oléagineuses rapportée sur la somme des masses des graines et du milieu de broyage aqueux étant de valeur inférieure à 0,2 -notamment inférieure à 0,15, de préférence comprise entre 0,10 et 0,15- ; - puis on soumet le mélange obtenu au broyage proprement dit.
15 En effet, une telle valeur inférieure à 0,2 permet d'une part un broyage efficace des graines dans le milieu de broyage aqueux en optimisant la viscosité du milieu de broyage aqueux et permet d'autre part d'obtenir une hydrolyse ultérieure des triglycérides qui est efficace. Avantageusement et selon l'invention, à l'étape ii.) on réalise 20 l'hydrolyse enzymatique des triglycérides des graines oléagineuses par ajout d'au moins une lipase au broyat de graines obtenu à l'étape i.). On réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour former une émulsion comprenant des acides gras libérés dans le milieu aqueux par effet de l'hydrolyse enzymatique des triglycérides. On adapte les conditions d'hydrolyse 25 enzymatique en milieu aqueux de façon à former un mélange présentant un aspect homogène à l'échelle macroscopique, mais qui est hétérogène à l'échelle microscopique, la phase lipidique étant dispersée de façon stable dans la phase aqueuse sous la forme de gouttelettes grasses. Avantageusement, on réalise l'hydrolyse enzymatique des 30 triglycérides des graines oléagineuses en présence d'au moins une lipase par mise en contact de ladite au moins une lipase avec le broyat de graines oléagineuses dans 3029738 7 un milieu aqueux obtenu à l'étape i.). Avantageusement, on met ladite au moins une lipase en contact avec le broyat postérieurement à l'étape i.). Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température choisie pour permettre une activité sensiblement 5 optimale de la lipase. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température comprise entre 15°C et 55°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique à une température comprise entre 15°C et 55°C et pendant une durée comprise entre 15 min et 5 heures. Avantageusement et selon l'invention, on peut aussi réaliser 10 l'hydrolyse enzymatique à température ambiante, c'est à dire sans procéder à aucun chauffage ni refroidissement. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux visée à l'étape ii.) dans un homogénéisateur à haute pression. On réalise donc une homogénéisation à haute pression d'un mélange 15 réactionnel formé à partir du broyat comprenant au moins une lipase par compression de ce mélange réactionnel à une pression supérieure à la pression atmosphérique (c'est-à-dire à une pression supérieure à la pression atmosphérique) suivie d'une détente brutale à pression atmosphérique du mélange ainsi formé. En particulier, on réalise la compression jusqu'à une pression comprise entre 2,5 MPa 20 et 100 MPa -notamment comprise entre 10 MPa et 50 MPa, de préférence de l'ordre de 15 MPa. On réalise l'homogénéisation à haute pression du mélange réactionnel à une température choisie pour permettre une activité optimale de la lipase. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'homogénéisation à haute pression du mélange réactionnel à une température 25 comprise entre 15°C et 55°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'hydrolyse enzymatique de l'étape ii.) à une température comprise entre 15°C et 55°C et pendant une durée comprise entre 15 min et 5 heures. On peut réaliser l'homogénéisation à haute pression et l'hydrolyse enzymatique à température ambiante, c'est à dire sans procéder à un 30 chauffage ou à un refroidissement du mélange réactionnel.
3029738 8 Avantageusement et selon l'invention, pour l'homogénéisation à haute pression, il est procédé à au moins deux cycles successifs de compression/détente. On peut réaliser cette homogénéisation à haute pression dans 5 une enceinte d'un homogénéisateur à haute pression munie d'une pompe d'introduction à débit constant du mélange réactionnel dans l'enceinte et équipée d'une vanne de fuite par laquelle ledit du mélange réactionnel subit une dépression en sortie de ladite enceinte. On peut donc réaliser l'homogénéisation du mélange réactionnel en continu dans un homogénéisateur à haute pression.
10 Les inventeurs ont observé de façon totalement surprenante que ladite au moins une lipase conserve dans le mélange réactionnel et sous homogénéisation sous pression une activité élevée d'hydrolyse des triglycérides des graines oléagineuses. Avantageusement et dans un mode de réalisation de 15 l'invention, on ajoute au broyat obtenu à l'étape i.) au moins une lipase sous forme d'une solution aqueuse -en une seule fois ou en plusieurs fois-. Avantageusement et dans un autre mode de réalisation de l'invention, pour former ledit mélange réactionnel on ajoute au broyat obtenu à l'étape i.) au moins une lipase à l'état solide -en une seule fois ou en plusieurs fois-.
20 Il est aussi possible d'ajouter -en une seule fois ou en plusieurs fois- au moins une lipase -en solution et/ou à l'état solide- au broyat avant la fin ou après la fin de l'étape i.). Avantageusement et selon l'invention, on utilise au moins une lipase choisie dans le groupe des lipases produites par un végétal et des lipases 25 produites par un micro-organisme -notamment un micro-organisme choisi dans le groupe formé des micro-organismes du genre Rhizopus, des micro-organismes du genre Mucor, des micro-organismes du genre Alcaligenes, des micro-organismes du genre Candida -notamment de l'espèce Candida rugosa-, des micro-organismes du genre Aspergillus, des micro-organismes du genre Pseudomonas, des micro- 30 organismes du genre Humicola, des micro-organismes du genre Thermomyces, des micro-organismes du genre Penicillium et des micro-organismes du genre 3029738 9 Geotrichum, notamment de l'espèce Geotrichum candidum- et des isoformes de ces lipases. Avantageusement et selon l'invention, on utilise au moins une lipase de Candida rugosa. Avantageusement, on utilise au moins une lipase de 5 Candida rugosa à raison de 100 à 500 unités de lipase, notamment à raison de 150 à 400 unités de lipase, de préférence de l'ordre de 300 unités de lipase par gramme de graine oléagineuses (UL/g). Avantageusement, on utilise 100 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 75 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses. Avantageusement, on utilise 10 166 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 90 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses. Avantageusement, on utilise 333 unités de lipase (UL) par gramme de graines oléagineuses pour libérer de l'ordre de 95 % des acides gras totaux des glycérides des graines oléagineuses.
15 On entend par unité de lipase, la quantité de lipase nécessaire pour libérer 10-6 moles d'acide gras à partir de glycéride, pendant une durée de 1 minute et dans les conditions optimales d'activité de l'enzyme (température, pH et concentration de glycérides). On obtient un hydrolysat comprenant des acides gras issus de 20 l'hydrolyse des triglycérides des graines. L'hydrolysat est formé d'un mélange d'une émulsion d'acides gras, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse riche en composés hydrosolubles de graines. Avantageusement et selon l'invention, on réalise la séparation visée à l'étape iii.) du résidu solide, de la phase aqueuse et de ladite émulsion, par 25 centrifugation. On réalise donc un fractionnement de l'hydrolysat comprenant la lipase par centrifugation. On adapte les conditions de centrifugation pour permettre une sédimentation du résidu solide (culot), la séparation de la phase aqueuse intermédiaire et de la phase supérieure (surnageant) formée de l'émulsion d'acides gras.
30 On réalise une telle séparation par centrifugation, par exemple sous une accélération comprise entre 1000 et 10000 g, notamment de l'ordre de 3029738 10 7500 g. Par exemple, on réalise une telle centrifugation pendant une durée comprise entre 1 min et 10 min. À l'issue des étapes i.), ii.) et iii.) d'un procédé selon l'invention, on obtient une émulsion dissociée du résidu solide et de la phase 5 aqueuse et comprenant de l'eau, des acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de graines, des phospholipides constitutifs des membranes cellulaires des graines (par exemple de la phosphatidylcholine, de la phosphatidyléthanolamine, du phosphatidylinositol, de l'acide phosphatidique et de la phosphatidylsérine), des sphingolipides, des protéines hydrophobes constitutives 10 des oléosomes des graines -notamment des oléosines de poids moléculaire moyen compris entre 30 kDa et 35 kDa, notamment de l'ordre de 35 kDa- et des constituants des graines présents en faible quantité tels que par exemple de la vitamine E (a-tocophérol, (3-tocophérol, y-tocophérol, 8-tocophérol, a-tocotriénol, 13-tocotriénol, y-tocotriénol et 8-tocotriénol) et des stérols de plantes.
15 Les inventeurs ont constaté que l'émulsion obtenue à l'étape iii.) et la composition de traitement selon l'invention présentent des propriétés inattendues antioxydantes et de conservation de ladite émulsion et de ladite composition de traitement. On forme par un procédé selon l'invention, une émulsion et 20 une composition de traitement de plantes qui sont stables dans le temps. Les oléosines sont des polypeptides formés d'une séquence d'environ 180 acides aminés, comprenant un domaine hydrophobe central constitué d'environ 75 acides aminés hydrophobes, exempt d'acide aminé basique et d'acide aminé acide, ledit domaine hydrophobe central étant limité à une extrémité par un 25 résidu L-lysine et à l'autre extrémité par deux résidus L-arginine. Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on constate que l'action de la lipase libère au moins 90 % -notamment de l'ordre de 95 %- de la quantité totale des acides gras de triglycérides susceptibles de pouvoir être libérés par hydrolyse enzymatique totale des triglycérides.
30 Avantageusement et selon l'invention, l'émulsion est une émulsion complexe de type "eau/huile/eau" présentant des gouttelettes lipidiques de 3029738 11 taille homogène et dont la taille moyenne est comprise entre 1 ium et 1,8 ium. De façon totalement surprenante, les inventeurs ont observé que les étapes i.), ii.) et iii.) du procédé selon l'invention permet de former une émulsion dans laquelle la taille moyenne des gouttelettes lipidiques est sensiblement la même que la taille moyenne 5 des oléosomes natifs des graines oléagineuses de départ. Avantageusement et selon l'invention, on réalise le mélange visé à l'étape iv.) d'au moins une substance active et de l'émulsion par homogénéisation à haute pression, c'est-à-dire à une pression supérieure à la pression atmosphérique. On forme la composition de traitement de plantes par 10 homogénéisation à haute pression du mélange formé de l'émulsion et d'au moins une substance active. On réalise l'homogénéisation à haute pression visée à l'étape iv.) par compression du mélange -formé de l'émulsion et d'au moins une substance active- à une pression supérieure à la pression atmosphérique (c'est-à-dire 15 à une pression supérieure à la pression atmosphérique) suivie d'une détente brutale à pression atmosphérique du mélange ainsi formé. En particulier, on réalise la compression jusqu'à une pression comprise entre 2,5 MPa et 100 MPa -notamment comprise entre 10 MPa et 50 MPa, de préférence de l'ordre de 15 MPa. Avantageusement, on réalise au moins deux cycles successifs 20 de compression/détente du mélange comprenant l'émulsion et au moins une substance active. Avantageusement, on réalise l'homogénéisation à haute pression visée à l'étape iv.) à une température qui préserve sensiblement la structure de l'émulsion et de la composition de traitement. On poursuit l'homogénéisation à 25 haute pression visée à l'étape iv.) pendant une durée suffisante pour obtenir la composition de traitement. Avantageusement et selon l'invention, on peut aussi réaliser le mélange de l'étape iv.) en continu dans un homogénéisateur à haute pression. On réalise l'homogénéisation à haute pression par compression de l'émulsion d'acides 30 gras comprenant au moins une substance active dans une enceinte d'un homogénéisateur à haute pression munie d'une pompe d'introduction à débit 3029738 12 constant de l'émulsion dans l'enceinte et équipée d'une vanne de fuite par laquelle ladite émulsion subit une dépression en sortie de ladite enceinte. Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins une substance active sur des plantes dans le groupe formé des substances présentant 5 une activité bénéfique pour des plantes par application sur lesdites plantes de la composition selon l'invention, c'est-à-dire en mélange avec l'émulsion. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une composition de traitement de plantes comprenant une émulsion en mélange avec au moins une substance active sur des plantes. Un tel procédé permet d'obtenir une 10 composition de traitement de plantes qui est stable dans le temps et qui permet l'application de ladite substance active sur des plantes, le maintien de ladite substance active en surface et au contact des végétaux et/ou le franchissement par ladite substance active de la couche protectrice externe des végétaux (par exemple, de la cuticule).
15 Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances fongicides, des substances fongistatiques, des substances bactéricides, des substances bactériostatiques, des substances insecticides, des substances acaricides, des substances herbicides, des substances parasiticides, des substances nématicides 20 et des substances rodenticides, des substances taupicides, des substances corvifuges, des substances corvicides, des substances molluscicides, des substances répulsives des oiseaux et du gibier. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances 25 stimulatrices des défenses naturelles de plante. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des polypeptides à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante -notamment des enzymes de dégradation de la cellulose à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante, 30 par exemple des cellulases à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante-et des polysaccharides à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante 3029738 13 -notamment de fragments de chitine, de chitosan, de laminarine et de pectines de faible poids moléculaire-. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes est une 5 cellulase de la classe EC 3.2.1.4 de la classification des enzymes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes est une cellulase d'un champignon, notamment d'un champignon du genre Trichoderma (par exemple de l'espèce Trichoderma reesei ou de l'espèce Trichoderma 10 harzianum). Avantageusement et selon l'invention, on mélange au moins une cellulase à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes avec l'émulsion de façon à former la composition de traitement de plante. Avantageusement et selon l'invention, au moins une cellulase 15 est choisie dans le groupe formé des cellulases qui sont compatibles avec ladite émulsion, c'est-à-dire qui conservent dans ladite émulsion au moins sensiblement une activité stimulatrice des défenses naturelles de plante. Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins une cellulase qui conserve au moins sensiblement son activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes lors de 20 l'étape iv.) et ultérieurement à ladite étape iv.), en particulier lors de l'application de la composition de traitement sur des plantes. Avantageusement et selon l'invention, à l'étape iv.) on mélange la cellulase à activité stimulatrice des défenses naturelles de plantes avec ladite émulsion de façon à former la composition phytosanitaire, ladite cellulase 25 étant choisie pour être compatible avec ladite émulsion d'acides gras et avec la réalisation de ladite étape iv.). Les inventeurs ont observé que, de façon totalement inattendue, une composition phytosanitaire obtenue par un procédé selon l'invention permet, non seulement de préserver la structure et les propriétés stimulatrices des 30 défenses naturelles de plantes de chaque cellulase, mais permet aussi d'améliorer la 3029738 14 vectorisation de ladite cellulase en particulier par application de ladite composition phytosanitaire sur des parties aériennes de plantes. Ils ont en particulier démontré qu'une cellulase -notamment la cellulase de Trichoderma- formulée dans une émulsion d'acides gras obtenue par 5 hydrolyse in situ des triglycérides de graines d'une plante oléagineuse selon l'invention présente une activité catalytique de dégradation de la cellulose équivalente voire supérieure à l'activité catalytique de dégradation de la cellulose d'une composition de cellulase exempte d'une telle émulsion. Ils ont en outre démontré qu'une telle émulsion d'acides gras 10 obtenue par hydrolyse in situ des triglycérides de graines oléagineuses constitue un adjuvant d'une cellulase à titre de substance active. Les inventeurs supposent qu'un tel adjuvant permet de stabiliser la cellulase dans la composition phytosanitaire, mais permet aussi d'augmenter le temps de contact de ladite composition comprenant la cellulase avec la plante -notamment avec les parties aériennes de la 15 plante- et favorise l'action de ladite cellulase sur la plante. Ils ont démontré qu'une telle composition obtenue par un procédé selon l'invention permet de stimuler l'expression des gènes codant pour des protéines de résistance de plantes. Ils ont en particulier montré que la composition de traitement 20 selon l'invention comprenant l'émulsion et de la cellulase présente une activité stimulatrice des défenses naturelles des plantes qui est améliorée par rapport à une composition phytosanitaire comprenant du Bion® à titre de stimulant des défenses naturelles des plantes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une 25 substance active est choisie dans le groupe formé des substances actives sur la germination de semences, des substances de contrôle de la croissance de plantes, des substances de contrôle du développement de plantes, des substances stimulatrices de la photosynthèse, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes.
30 Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active est un nutriment de plantes à base d'azote (N), à base de phosphore 3029738 15 (P), à base de potassium (K), à base de fer (Fe) ou à base d'oligoéléments. Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on prépare une émulsion selon l'invention comprenant au moins un nutriment de plantes de façon à pallier une carence nutritionnelle de plantes en macroélément (par exemple en azote, en 5 phosphore, en potassium), en méso-élément (par exemple en calcium, en soufre, en magnésium) ou en oligoélément (par exemple en manganèse, en cuivre, en fer, en bore, en molybdène, en zinc, en nickel, en sélénium, en silicium ou en sodium). On prépare une émulsion selon l'invention permettant une libération d'au moins un nutriment à travers la cuticule de plantes.
10 Avantageusement, on prépare une composition selon l'invention comprenant un solide à l'état divisé comprenant au moins un élément nutritif des végétaux choisi dans le groupe formé de l'azote (N), du phosphore (P), du potassium (K), du calcium (Ca), du magnésium (Mg), du soufre (S), du fer (Fe), du cuivre (Cu), du sodium (Na), du zinc (Zn), du bore (B), du molybdène (Mo), du 15 silicium (Si), du sélénium (Se), du nickel (Ni), du manganèse (Mn), par exemple du carbonate de manganèse (MnCO3) et/ou du sulfate de manganèse (MnSO4) et/ou de l'hydroxyde de magnésium (Mg(OH)2) et/ou de l'oxyde de zinc (ZnO) et/ou de l'oxyde de calcium (CaO) et/ou un chélate de fer -notamment un chélate d'EDTA ou un chélate d'EDDHA (acide éthylène-diamine-N,N'-bis-2-hydroxyphényl 20 acétique) et de fer- et/ou un chélate de cuivre -notamment un chélate d'EDTA et de cuivre- et/ou un chélate de zinc -notamment un chélate d'EDTA et de zinc- et/ou du sulfate de fer et/ou du sulfate de cuivre et/ou du sulfate de zinc et/ou du pentoxyde de phosphore (P2O5). Avantageusement et par un procédé selon l'invention, on 25 forme une composition de traitement qui est stable dans le temps. Par composition stable dans le temps, on entend une composition dont les composants ne sédimentent pas lors d'un stockage prolongé sans agitation pendant une durée d'au moins un mois. L'invention concerne donc toute utilisation en agriculture 30 d'une émulsion obtenue par un procédé comprenant au moins les étapes i.), ii.) et iii.).
3029738 16 L'invention s'étend aussi à une composition -notamment une composition de traitement phytopharmaceutique et/ou nutritionnel de plante-comprenant une émulsion d'acides gras issue d'une hydrolyse enzymatique in situ de triglycérides d'un broyat de graines oléagineuses par au moins une lipase, 5 caractérisée en ce qu'elle comprend aussi au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes. L'invention s'étend en particulier à une composition -notamment à une composition de traitement phytopharmaceutique et/ou 10 nutritionnel de plante- obtenue par un procédé selon l'invention. Avantageusement et selon l'invention, au moins une substance active est une cellulase d'un champignon, notamment d'un champignon du genre Trichoderma (par exemple de l'espèce Trichoderma reesei ou de l'espèce Trichoderma harzianum).
15 Avantageusement et selon l'invention, au moins une lipase est une lipase d'un micro-organisme du genre Candida -notamment de l'espèce Candida rugosa. Avantageusement et selon l'invention, la composition de traitement comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants des 20 graines oléagineuses et choisi parmi : - au moins un phospholipide des graines oléagineuses -notamment au moins un phospholipide choisi dans le groupe formé des phosphatidylcholines, des phosphatidyléthanolamines, des phosphatidylinositols, des acides phosphatidiques et/ou des phosphatidylsérines ; 25 - du glycérol ; au moins une oléosine, et ; au moins une lipase, et ; au moins un constituant mineur issus des graines et choisi dans le groupe formé de la vitamine E (a-tocophérol, (3-tocophérol, y-tocophérol, 30 8-tocophérol) et des stérols de plantes.
3029738 17 Avantageusement et selon un mode de réalisation de l'invention, la composition de traitement comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants de graines oléagineuses choisi dans le groupe formé de l' a-tocotriénol, du 13- tocotriénol, du y- tocotriénol et du 8-tocotriénol.
5 L'invention s'étend aussi à toutes les utilisations d'une composition selon l'invention dans un traitement de plantes. L'invention s'étend à un procédé de traitement -notamment phytopharmaceutique, de fertilisation et/ou nutritionnel- de plantes dans lequel on applique sur lesdites plantes une quantité efficace de composition selon l'invention.
10 L'invention s'étend aussi à un procédé de traitement -notamment phytopharmaceutique, de fertilisation et/ou nutritionnel- de plantes dans lequel on applique sur lesdites plantes une composition obtenue par un procédé selon l'invention. L'invention s'étend également à l'utilisation en agriculture 15 d'une composition selon l'invention en application sur des plantes, c'est-à-dire une composition comprenant au moins une substance active et une émulsion d'acides gras obtenus par hydrolyse enzymatique in situ d'un broyat de graines oléagineuses. Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention au contact de semences et/ou de graines et/ou de 20 racines de plantes. Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention au contact d'au moins une partie aérienne des végétaux -notamment sur au moins une partie du feuillage des végétaux-. Une composition selon l'invention est en particulier adaptée pour pouvoir être appliquée 25 sur des parties aériennes de végétaux -par exemple, sur les fleurs, sur les fruits, sur les feuilles, sur les tiges de plantes en culture- sans toutefois provoquer de brûlure des parties aériennes des végétaux. Par exemple, on applique une composition selon l'invention par nébulisation (au pulvérisateur). On peut utiliser une composition selon l'invention en 30 application sur des plantes potagères, sur des plantes ornementales en culture, sur des cultures horticoles, sur des plantes en culture en plein champ, sur des plantes en 3029738 18 culture sous serre ou sur des plantes en culture hors sol. On peut aussi utiliser une composition selon l'invention en application sur une culture maraîchère, sur une culture industrielle ou sur une grande culture. On peut aussi utiliser une composition selon l'invention en application sur des arbres fruitiers, sur des arbres et arbustes 5 d'ornementation, sur des plantes potagères, sur des céréales -notamment du blé, du colza, du lin, du lin oléagineux, du lin textile, de l'orge, du sorgho-, sur des cultures florales diverses ou sur des plantes aromatiques. L'invention vise de façon générale l'utilisation en application sur des plantes d'une émulsion d'acides gras à titre d'agent de vectorisation d'une 10 substance active, ladite émulsion étant obtenue par un procédé dans lequel on réalise les étapes suivantes : i.) broyage de graines oléagineuses, puis ; ii.) hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyat de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant 15 obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour former une émulsion comprenant des acides gras libérés dans le milieu aqueux par effet de ladite hydrolyse enzymatique, puis ; iii.) séparation de ladite émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse.
20 L'invention s'étend également à un procédé de traitement de plantes dans lequel on applique une composition selon l'invention sur des plantes. Avantageusement et selon l'invention, on applique la composition selon l'invention sur les parties aériennes de plantes. L'invention concerne également un procédé de préparation 25 d'une composition de traitement, une composition de traitement et ses utilisations caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées 30 représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquelles : 3029738 19 - la figure 1 est une représentation graphique en histogramme de l'effet protecteur de l'activité enzymatique de la cellulase conféré par une émulsion selon l'invention, et - la figure 2 est une représentation graphique en histogramme illustrant 5 l'effet adjuvant d'une émulsion selon l'invention. EXEMPLE 1 - Emulsion d'acides gras On prépare une suspension de graines de colza (100 g) dans 800 g d'eau et on place cette suspension dans le bol d'un robot ménager de type "Warring blender". On soumet cette suspension à un broyage pendant 5 min. On 10 ajoute ensuite 10 g d'une solution de lipase de Candida rugosa (10 mg/mL) à 90 g du broyat obtenu ci-dessus. Le mélange obtenu comprend 10 % de matière solide issue des graines de colza et une quantité de lipase de Candida rugosa correspondant à 300 unités de lipase par gramme de matière solide issue de graines de colza.
15 On soumet ensuite le mélange constitué de la matière solide issue des graines de colza, de la lipase et d'eau à une homogénéisation sous pression dans un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France), une première étape d'homogénéisation étant réalisée à une pression de 15 MPa et une deuxième étape d'homogénéisation étant réalisée à une pression de 0,2 MPa. On obtient après 20 centrifugation de l'homogénat obtenu en sortie de l'homogénéisation, une phase supérieure formée de l'émulsion d'acides gras issus de graines de colza. EXEMPLE 2 - Emulsion d'acides gras On prépare une suspension de graines de colza (150 g) dans 850 g (850 mL) d'eau et on place cette suspension dans le bol d'un robot ménager 25 de type "Warring blender". On soumet cette suspension à un broyage pendant 5 min. On ajoute une solution enzymatique "Lipolyve CC" (préparation industrielle à partir de la levure Candida rugosa sous forme lyophilisée à 30 unités/mg) à raison de 300 unités de lipase par gramme de matière solide issue de graines de colza. La proportion massique de graines dans le mélange est de l'ordre de 13,5 %.
30 On soumet ensuite le mélange constitué de la matière solide issue des graines de colza, de la lipase et d'eau à une homogénéisation sous pression 3029738 20 de 35 MPa dans un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France). L'homogénat contenant l'enzyme est placé à 37°C sous agitation pendant 2 heures puis conservé à 4°C. On soumet ensuite l'homogénat à une étape de séparation de phases par centrifugation pendant 5 min à 7500 g. On récupère la phase supérieure 5 formée de l'émulsion d'acides gras. On soumet le culot remis en suspension dans la phase aqueuse à au moins une étape de centrifugation pendant 5 min à 7500 g et on récupère à nouveau une phase supérieure formée de l'émulsion d'acides gras. On collecte et on mélange les différentes émulsions ainsi collectées. 75 grammes d'émulsion d'acides gras sont ainsi collectés obtenus à partir de 1000 grammes de 10 suspension de graines de colza dans l'eau dont 150 grammes de graines de colza. Les caractéristiques de l'émulsion d'acides gras obtenue par lipolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines de colza sont les suivantes : - elle présente une masse volumique de 0,943 g/mL (± 0,004 g/mL) ; - elle comprend un taux de matière sèche (déterminée par assèchement 15 thermique à 103°C pendant 6 heures) est de 67,5 g (± 0,6) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ; - elle présente une proportion d'eau de 32,5 g (± 0,6) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ; - elle présente une teneur en huile (déterminée par extraction des corps 20 gras de la matière sèche avec du cyclohexane) de 58,3 g (± 1,3) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ; - elle présente un taux de protéines (déterminé selon la méthode de "Kjeldahl" de dosage de l'azote minéral) de 7,24 g (± 0,47) pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras ; 25 - elle présente un taux de phospholipides (déterminé selon la norme NF-T 60227 de dosage vanado-molybdique du phosphore minéral) de 3,8 g (± 0,1) de phospholipide pour 100 grammes d'émulsion d'acides gras. EXEMPLE 3 - Maintien de l'activité enzymatique de la 30 cellulase en présence d'une émulsion d'acides gras selon l'invention On compare l'activité enzymatique des cellulases excrétées par le Trichoderma reesei formulées en présence (B) ou en absence (A) d'émulsion 3029738 21 d'acides gras selon l'invention. On mesure l'activité catalytique de la cellulase (A cellulase), exprimée en mole de substrat transformé par seconde, en utilisant un kit de détection Mégazyme KCe11G3. Les résultats obtenus sont présentés en figure 1 et montrent que l'émulsion d'acide gras (B, histogramme hachuré) ne présente pas 5 d'effet inhibiteur de l'activité de la cellulase par rapport à la cellulase (A, histogramme plein) seule et permet donc sa conservation et son application sur des plantes sans perte d'activité de la cellulase. EXEMPLE 4 - Stimulation des défenses naturelles de plantes. On prépare des plants d'Arabidopsis thaliana transgéniques 10 (PR-1::GUS) dans lesquels le gène codant pour la 13-glucuronidase a été cloné en aval des séquences régulatrices du gène PR-1 ("Pathogesis regulation 1"). De tels plants d'Arabidopsis thaliana transgéniques modèles (PR-1::GUS) sont cultivés en pots pendant 3 semaines puis sont traités par nébulisation avec : - (D) de l'eau à titre de contrôle, ou 15 - (E) du Bion® (Syngenta Agro SAS, Guyancourt, France) à titre de stimulant des défenses naturelles de plantes contrôle, ou ; - (F) de la cellulase seule, ou ; - (G) une composition phytosanitaire selon l'invention comprenant de la cellulase formulée avec une émulsion aqueuse d'acides gras obtenue par hydrolyse 20 enzymatique in situ des triglycérides d'un broyat de graines de plante oléagineuse. Les compositions (F) et (G) comprennent de la cellulase à raison de 3 g/L. 48 heures après application de l'une des compositions (D), (E), (F) ou (G), les plants sont collectés et placés dans des tubes "Eppendorf" de 2 mL en présence de billes de verre de 2 mm de diamètre puis congelés dans l'azote liquide.
25 Chacune des compositions (D), (E), (F) ou (G) est broyée et conservée à -80°C. On réalise une extraction des protéines de chaque échantillon, dans laquelle on ajoute dans chaque tube "Eppendorf" 100 it.11_, de tampon phosphate sodique (0,25 M, pH 7) comprenant 1 % de Triton X100 et du 13-mercapto-éthanol à une concentration de 10 mM. Chaque tube est homogénéisé sur "vortex", puis on 30 centrifuge pendant 30 min à 13000 rpm à 4°C. On collecte et on place 25 it.11_, de chacune des phases surnageantes contenant les protéines dans un puits d'une plaque 3029738 22 multi-puits (96 puits). On ajoute dans chaque puits, 125 ILEL de tampon phosphate sodique (0,25 M, pH 7) et 50 ILEL de substrat MUG (4-méthylumbelliféryl-f3-Dglucuronide) de la 13-glucuronidase. On évalue le niveau d'activation des séquences promotrices 5 de PR-1 en évaluant la quantité de 13-glucuronidase produite par les plants d'Arabidospis thaliana dans chacune des conditions étudiées. On évalue ce niveau d'activation par la mesure de la fluorescence émise par hydrolyse du substrat MUG dans un lecteur de plaque Tristar LB 941 Berthold à une longueur d'onde d'excitation de 355 nm et à une longueur d'onde d'émission à 450 nm. On réalise 10 une mesure de la fluorescence émise dans chacun des puits toutes les 5 minutes pendant 150 minutes. En parallèle, on dose la quantité de protéine présente dans chacun des échantillons sur une fraction aliquote de 5 ILEL d'échantillon. On réalise ce dosage selon la méthode de Bradford. Les résultats sont donnés en figure 2 dans 15 laquelle l'ordonnée représente l'activité catalytique de la 13-glucuronidase rapporté à la quantité de protéine de l'échantillon. La composition phytosanitaire formée de cellulase et de l'émulsion d'acides gras (G) issus de l'hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides de graines oléagineuses présente un niveau d'expression du gène 20 13-glucuronidase équivalent au niveau d'expression du gène 13-glucuronidase induit par le Bion® alors que la solution (F) ne contenant que la cellulase et sans l'émulsion ne provoque pas d'induction du gène 13-glucuronidase. EXEMPLE 5 - Etude comparative On réalise un traitement par pulvérisation d'un premier lot de 25 plants d'Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines avec une émulsion selon l'invention et, à titre de comparaison, d'un deuxième lot de plants d'Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines avec une composition aqueuse qui est exempte d'émulsion selon l'invention. Les émulsions selon l'invention sont obtenues par hydrolyse 30 enzymatique in situ des triglycérides d'un broyat de graines oléagineuses de colza puis dilution à 1 % (en volume) et comprennent en outre un composé éliciteur des 3029738 23 défenses naturelles de plantes choisi parmi la cellulase de Trichoderma, des fragments de chitine, du chitosan (fragments de chitine déacétylés), de la laminarine (Sigma-Aldrich) ou de l'oligopectine. À titre de comparaison, les mêmes composés éliciteurs sont préparés dans l'eau. Les caractéristiques des composés éliciteurs sont 5 données au tableau 1 ci-après. Eliciteur Concentration Degré de mg / mL polymérisation Cellulase de Trichoderma 3 / Chitine 1 7 - 9 Chitosan 1 / Laminarine 1 / Oligopectine 1 69 Tableau 1 À to, on nébulise la composition de traitement sur des plants d'Arabidopsis thaliana âgés de 5 semaines à raison de 1 mL de composition par 10 plant. On place les plants ainsi traités dans une enceinte climatique pendant une durée de 1, 6 ou 24 heures. À 1 heure, 6 heures et 24 heures après nébulisation, on quantifie les ARN spécifiques de quatre marqueurs connus d'activation des défenses naturelles des plantes : CYP71Al2 (Cytochrome P450 d'Arabidopsis), PAD3 (mutation PhytoAlexin Deficient 3 du cytochrome P450 d'Arabidopsis), 15 PDF1.2 et PR1 transcrits par les plants d'Arabidopsis thaliana traités. Pour ce faire, on réalise une extraction de l'ARN total lors de laquelle on collecte dans un tube trois plants correspondant à un même traitement et à une même durée de contact (1h, 6h ou 24h). Dans chaque tube, sont ajoutées des billes de verre présentant un diamètre moyen de 2 mm. Les tubes sont ensuite 20 plongés dans un bain d'azote liquide. Les plants ainsi congelés sont broyés par agitation (Vibro broyeur à billes). On réalise ensuite l'extraction de l'ARN total au moyen du kit "SV Total RNA Isolation System" (Promega). On obtient les extraits d'ARN correspondant à chacune des conditions (durée de contact, composition 3029738 24 adjuvante et éliciteur) à raison de 1µg d'ARN dans 10 lui d'eau exempte de nucléase. Pour chaque condition, on prépare un milieu réactif RT-PCR comprenant : 5 - 2 ILEL de tampon RT 10X ; - 0,8 ILEL de mélange de dNTP 25X (100 mM) ; - 2 ILEL d'amorce "RT random primers" 10X ; - 1 ILEL de multiscribe ; - 1 ILEL d'inhibiteur de RNAse ; 10 - 3,2 ILEL d'eau exempte de nucléase. Dans chaque tube contenant 10ILIL de solution d'ARN (1 itig), on ajoute 10ILIL de milieu réactif RT-PCR. La synthèse d'ADNc est réalisée selon le programme suivant : 10 min à 25°C, puis 15 5 min à 37°C, puis 5 min à 85°C. Les solutions comprenant les ADNc sont déposées en triple dans des puits d'une plaque qPCR 384. Les amorces oligonucléotidiques correspondant aux marqueurs sélectionnés sont ajoutées aux ADNc, à raison de 3ILIL 20 à une concentration de litiM, ainsi que 5 ILEL de réactif SYBR Green (Applied Biosystems). Pour chaque couple d'amorces le mélange de PCR quantitative est préparé séparément. La PCR quantitative est réalisée sur le système ABI 7900HT Applied Biosystems selon un profil de température : - 2 minutes à 50°C ; 25 - 10 minutes à 95°C ; - 40 cycles de 15 secondes à 95°C puis 1 minute à 60°C. Les mesures sont analysées par le logiciel SDS2.3. Les résultats sont exprimés en log2 du rapport des concentrations obtenues dans l'essai et dans le contrôle (eau). Un rapport supérieur à 2 (c'est-à-dire un Loge > 1) indique 30 que l'expression du gène est induite. Un rapport inférieur à 0,5 (c'est-à-dire un Loge < -1) indique que l'expression du gène est réprimée.
3029738 25 Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par la cellulase de Trichoderma sont donnés au tableau 2 ci-après. Marqueur temps de contact, h adjuvant de la cellulase Eau Emulsion CYP71Al2 1 0,03 3,07 6 -1,26 2,74 24 -2,84 1,99 PAD3 1 -0,26 3,06 6 2,41 4,35 24 -1,57 1,30 PR1 1 -0,87 -1,43 6 -0,75 3,84 24 -3,28 3,85 5 Tableau 2 Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par des fragments de chitine (DP 7-9) sont donnés au tableau 3 ci-après. Marqueur temps de contact, h adjuvant de la chitine Eau Emulsion CYP71Al2 1 1,47 0,50 6 -0,54 3,36 24 -1,20 2,07 PAD3 6 1,65 2,54 24 -0,22 2,36 PR1 24 0,26 2,17 Tableau 3 10 Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par la laminarine sont donnés au tableau 4 ci-après.
3029738 26 Marqueur temps de contact, h adjuvant de la laminarine Eau Emulsion CYP71Al2 1 1,52 2,85 6 -0,54 2,35 24 1,20 2,27 PAD3 1 -0,25 3,17 6 1,08 2,35 24 -1,52 0,54 PR1 1 -0,42 -1,50 6 -1,46 1,55 24 -0,81 3,12 Tableau 4 Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par le chitosan sont donnés au tableau 5 5 ci-après. Marqueur temps de contact, h adjuvant du chitosan Eau Emulsion CYP71Al2 1 -2,22 1,24 6 0,43 1,80 24 -0,53 0,26 PAD3 1 -2,20 1,24 6 1,29 2,71 PR1 1 -2,20 0,63 6 -1,49 1,54 24 -0,47 1,97 Tableau 5 Les résultats concernant l'activation de l'expression de marqueurs de défenses naturelles de plantes par l'oligopectine (DP69) sont donnés au tableau 6 ci-après.
10 3029738 27 Marqueur temps de contact, h adjuvant du chitosan Eau Emulsion CYP71Al2 1 1,39 1,91 6 0,39 5,45 24 -0,68 4,49 PAD3 1 -1,81 2,89 6 -0,44 4,84 PR1 6 -0,92 1,78 24 -1,45 2,61 Tableau 6 Une composition adjuvantée par une émulsion selon l'invention permet une stimulation des défenses naturelles de plantes qui est augmentée par rapport à la composition non adjuvantée. 5
Claims (5)
- REVENDICATIONS1/ Procédé de préparation d'une composition destinée à un traitement de plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à réaliser i.) un broyage de graines oléagineuses dans un milieu de broyage aqueux, puis ; ii.) une hydrolyse enzymatique de triglycérides du broyat de graines oléagineuses obtenu à l'étape i.), ladite hydrolyse enzymatique étant 10 obtenue par action d'au moins une lipase en milieu aqueux et dans des conditions adaptées pour permettre une libération d'acides gras par effet de ladite hydrolyse enzymatique des triglycérides et former un hydrolysat, puis ; iii.) une séparation, à partir de l'hydrolysat, d'une émulsion, d'un résidu solide et d'une phase aqueuse, puis ; 15 iv.) un mélange de ladite émulsion avec au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes.
- 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réalise le mélange visé à l'étape iv.) d'au moins une substance active et de 20 l'émulsion d'acides gras par homogénéisation à haute pression.
- 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'hydrolyse enzymatique en milieu aqueux visée à l'étape ii.) dans un homogénéisateur à haute pression.
- 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé 25 en ce qu'on réalise la séparation visée à l'étape iii.) du résidu solide, de la phase aqueuse et de ladite émulsion par centrifugation.
- 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise au moins une lipase choisie dans le groupe des lipases produites par un végétal, des lipases produites par un micro-organisme et des isoformes de ces 30 lipases. 3029738 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on choisit les graines oléagineuses dans le groupe formé des graines de colza, des graines de tournesol, des graines de soja, des graines de lin, des graines de pastel, des graines de cameline, des graines de crambe, des graines de fruits à coques. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de broyage aqueux visé à l'étape i.) est choisi dans le groupe formé des solutions aqueuses tamponnées, des solutions aqueuses salines et de l'eau. 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lors de l'étape i.) de broyage on met en contact les graines oléagineuses et le milieu de broyage aqueux, le rapport de la masse de graines oléagineuses rapportée sur la somme des masses des graines et du milieu de broyage aqueux étant de valeur inférieure à 0,2 ; puis on soumet le mélange obtenu au broyage proprement dit. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance active dans le groupe formé des substances actives sur la germination de semences, des substances de contrôle de la croissance de plantes, des substances de contrôle du développement de plantes et des substances stimulatrices de la photosynthèse. 10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu' au moins une substance phytopharmaceutique est choisie dans le groupe formé des substances fongicides, des substances fongistatiques, des substances bactéricides, des substances . bactériostatiques, des substances insecticides, des substances acaricides, des substances herbicides, des substances parasiticides, des substances nématicides et des substances rodenticides, des substances taupicides, des substances corvifuges, des substances corvicides, des substances molluscicides, des substances répulsives des oiseaux et du gibier. 11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, 30 caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance phytopharmaceutique dans le groupe formé des substances stimulatrices des défenses naturelles de plante. 3029738 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on choisit au moins une substance phytopharmaceutique dans le groupe formé des enzymes de dégradation de la cellulose à activité stimulatrice des défenses naturelles de plante et des polysaccharides à activité stimulatrice des défenses 5 naturelles de plante. 13/ Composition obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 12 et comprenant une émulsion d'acides gras issue d'une hydrolyse enzymatique in situ de triglycérides d'un broyat de graines oléagineuses par au moins une lipase, 10 caractérisée en ce qu'elle comprend aussi au moins une substance active choisie dans le groupe formé des substances phytopharmaceutiques, des agents de fertilisation et des nutriments de plantes. 14/ Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'un -notamment chacun- des constituants des graines 15 oléagineuses et choisi dans le groupe formé : - au moins un phospholipide des graines oléagineuses ; - du glycérol ; - au moins une oléosine, et ; - au moins une lipase, et.; 20 - au moins un constituant mineur issu des graines et choisi dans le groupe formé de la vitamine E et des stérols de plantes. 15/ Procédé de traitement de plante dans lequel on applique sur lesdites plantes une quantité efficace de composition selon l'une des revendications 13 ou 14. 25
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