FR2919304A1 - "procede de production de spores et de metabolites provenant de microorganismes d'origine fongique et leurs utilisations" - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide « FMS »), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température.La présente invention a également pour objet l'utilisation des spores ainsi obtenues et/ou de leurs métabolites dans les domaines de l'agronomie, de la chimie et/ou de la pharmacie.
Description
PROCEDE DE PRODUCTION DE SPORES ET DE METABOLITES PROVENANT DE
MICROORGANISMES D'ORIGINE FONGIQUE ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de production en milieu solide de spores et de métabolites provenant de microorganismes d'origine fongique et l'utilisation des spores et métabolites ainsi obtenus dans des domaines tels que l'agriculture, l'environnement, l'agronomie, l'agro-alimentaire, la chimie et/ou la pharmacie.
Les spores des rnicroorganismes d'origine fongique représentent à la fois la forme de résistance et la forme de reproduction de ces microorganismes. Différentes techniques sont connues à ce jour pour la production de spores de microorganismes d'origine fongique. La plus ancienne, qui est également la plus artisanale, consiste à cultiver le micro-organisme à la surface d'un milieu gélosé soit en boîte de Pétri, soit en fioles de Roux. Cette technique pose des problèmes de récolte des spores et de manipulation d'un nombre important de fioles lorsque la quantité désirée de spores est importante.
Dans une autre technique, la production de spores est réalisée en plateaux et fait appel à la culture du microorganisme sur des substrats végétaux tels que son de blé, paille et divers produits ou résidus amylacés disposés en couche de quelques centimètres d'épaisseur et placés dans des étuves d'incubation. Des dispositifs automatiques complexes de chargement et de déchargement des plateaux ont été proposés. Toutefois, il reste que le produit obtenu est constitué non pas de spores pures, mais d'un mélange de spores, de mycélium du microorganisme et des résidus végétaux. D'autre part, le maintien des conditions aseptiques est délicat. La récolte des spores, la contamination ambiante et la variabilité de l'organisme sont des inconvénients majeurs.
La production de spores de microorganismes d'origine fongique dans des cultures liquides, en utilisant des fermentateurs stérilisables, a également été décrite. Cependant, ce mode de production n'est possible que dans des conditions particulières et avec un nombre limité de champignons. En outre, la suspension recueillie contient non seulement les spores, mais également une quantité importante de métabolites et tous les débris cellulaires qui peuvent être gênants. Enfin, le maintien des conditions d'aération efficace du milieu liquide pendant de longues périodes d'incubation entraîne des dépenses d'énergie coûteuses.
Les procédés de fermentations en milieu solide ( FMS ) ont aussi été proposés pour la production de spores de champignons. Généralement la culture du champignon est réalisée sur un substrat solide jouant à la fois le rôle de source carbonée, d'inducteur et de support de croissance. Ceci entraîne une limitation des possibilités de production d'enzymes et de métabolites par les champignons étant donné la nature des substrats solides agricoles essentiellement amylacés ou cellulosiques (cossettes de betterave, riz, soja, graines de céréales, son de céréales, pailles de céréales, tubercules amylacés et divers autres substrats lignocellulosiques). De ce fait un grand nombre d'enzymes ou de métabolites inductibles ne peuvent pas être obtenus par fermentation en milieu solide (FMS).
Par ailleurs, la récupération de métabolites produits par les microorganismes en milieu solide pose un problème délicat de séparation des fractions solides et liquides, ce qui conduit à pratiquer un ou plusieurs lavages successifs et à récupérer ces substances dans des solutions relativement diluées. En outre, il est souvent très difficile de séparer le mycélium produit du substrat/support initialement présent dans le bioréacteur.
Les fermentations aussi bien en milieu solide qu'en milieu liquide aboutissent à l'obtention de solutions diluées, ce qui entraîne un coût global de production 25 élevée.
De plus, les procédés de production de spores de microorganismes d'origine fongique dans des fermenteurs liquides ou en milieu solide sont effectués dans des conditions d'humidité élevée. Les spores étant récoltées à la fin de ces procédés par 30 centrifugation, il s'avère nécessaire d'éliminer des volumes importants du jus de fermentation. Par ailleurs, l'humidité de la biomasse obtenue représente un risque de germination des spores. Pour sécher cette biomasse, on utilise de l'air sec à une température de 40 ou 50 C. Or, les spores de moisissures sont très sensibles à la chaleur, et une exposition prolongée à 40 C cause une mortalité importante des spores.
Aucun des procédés de production de spores existants à ce jour, ne permet d'obtenir une grande quantité de spores qui soient à la fois viables, sèches et facilement conservables pendant plusieurs mois.
L'invention a pour but de surmonter au moins en partie ces différents inconvénients avec un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de fermentation en milieu solide ( FMS ) qui ne contamine pas l'environnement.
La présente invention a pour objet un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide FMS ), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress hydrique déclenché par une aération avec de l'air sec à une température allant de 15 à 30 C, de préférence de 18 C à 29 C, et plus préférentiellement encore à une température de 25 C.
Selon l'invention;, le stress hydrique est avantageusement appliqué à un moment précis du procédé c'est-à-dire juste au moment où le microorganisme met en place son système de reproduction asexuée pour faire face à des conditions extérieures défavorables (manque d'eau, manque de nutriments).
De manière avantageuse, l'application du stress hydrique sur le support solide imprégné du milieu de culture permet : - la stimulation de la phase de production des spores desdits microorganismes, - le maintien de la phase de production des spores pendant plusieurs jours, - le séchage des spores sans altérer leur viabilité, - la non contamination du milieu de culture par d'autres micro-organismes.
Plus longtemps le stress extérieur efficace est maintenu, plus le microorganisme construira des structures de reproduction asexuée, et par 10 conséquent des spores.
Le procédé de la présente invention comporte plus particulièrement les étapes suivantes : (a) pré-conditionnement du support solide qui implique successivement le 15 broyage dudit support en particules, l'humidification dudit support avec une solution aqueuse nutritive pouvant contenir certains éléments du milieu de culture, lesdits éléments du milieu de culture pouvant supporter un traitement par stérilisation, et enfin la stérilisation du support ainsi humidifié, (b) l'imprégnation du support ainsi pré-conditionné avec un milieu de culture 20 liquide comprenant, outre ladite suspension de spores des microorganismes d'origine fongique, un ou plusieurs substrats carbonés solubles, un ou plusieurs agents de croissance, l'humidité du mélange ainsi obtenu ayant une valeur allant de 50 à 85%, (c) la fermentation du mélange ainsi obtenu (FMS) dans des conditions de 25 température, d'humidité et d'aération optimales pour la croissance des microorganismes, la germination de leurs spores et le démarrage de la phase de production desdites spores.
Dans l'étape (a) de pré-conditionnement ci-dessus décrite, le support est 30 broyé en particules ayant un diamètre de préférence de 1 à 5 mm, et humidifié avec une solution aqueuse nutritive contenant par exemple des sels minéraux. La stérilisation du support ainsi humidifié est de préférence effectuée par un traitement thermique.
Dans l'étape (b) d'imprégnation du support, la quantité d'eau utilisée dans le milieu de culture liquide est équivalente à environ 3 à 5 fois le poids du support. L'imprégnation du support pré-conditionné avec le milieu de culture liquide est effectuée dans un mélangeur permettant d'assurer une répartition et une homogénéisation du mélange à fermenter satisfaisantes.
L'étape (c) de fermentation est effectuée dans un incubateur, qui sera par exemple une colonne de réaction, un incubateur agité ou statique équipé d'un dispositif d'analyse des effluents gazeux permettant de suivre la croissance des microorganismes, leur respiration, les étapes morphologiques en particulier la germination des spores au début de la FMS et ensuite le démarrage de la phase de production des spores.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention le support solide d'origine naturelle ou synthétique : - présente une capacité de rétention d'eau permettant une absorption d'eau de 3 à 5 fois son propre poids, - présente une porosité globale apparente d'environ 60% après imprégnation avec le milieu de culture, - présente une résistance à la stérilisation.
De façon avantageuse, le choix du support solide n'est pas lié à la nature du substrat carboné. Ainsi, il pourra être choisi en fonction de critères spécifiques tels que définis ci-dessus (capacité de rétention d'eau, porosité, résistance à la stérilisation ...).
La capacité d'absorption de l'eau doit pouvoir être effectuée sans drainage sensible.
La porosité d'environ 60% du support permet de faciliter la circulation de l'air sec et ainsi d'évaporer l'eau et de maintenir efficacement le stress hydrique.
Le support solide absorbant utilisé dans le procédé de l'invention est pratiquement non fermentable, ce qui signifie qu'après la fermentation avec le microorganisme, le support conserve pratiquement ses propriétés mécaniques. En particulier, il conserve une grande partie de sa porosité initiale.
A titre d'exemple de support solide d'origine naturelle, on pourra citer la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre et/ou leurs mélanges. A titre d'exemple de support solide d'origine synthétique on pourra citer une mousse de polymère telle que la mousse de polyuréthanne.
Le procédé de culture en milieu solide de l'invention permet notamment de diversifier la nature des :substrats carbonés utilisables, d'augmenter la quantité d'eau libre, d'apporter des inducteurs spécifiques et de maintenir des conditions favorables pendant l'étape de production des spores. En outre, le déclenchement du stress hydrique après le démarrage de la phase de production des spores permet de façon avantageuse de stimuler la production desdites spores, de maintenir leur production et de les obtenir sous forme sèche sans contamination par le milieu de culture.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le substrat carboné compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant Iles sucres simples, les polysaccharides, les protéines, les acides aminés, les lipides, les acides gras, les hydrocarbures, les substrats naturels amylacés, les sons de blé et/ou leurs mélanges.
Un tel substrat constitue une substance soluble dont on peut moduler la concentration.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, le support solide est de la bagasse de canne à sucre et le substrat carboné est du son de blé.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le support solide est utilisé dans des proportions allant de 60 à 80% par rapport au substrat carboné et le substrat carboné est utilisé dans des proportions allant de 40 à 20% par rapport au support solide.
A titre d'exemples d'agents de croissance présents dans le milieu de culture, on pourra citer des extraits de levure, des vitamines, des acides aminés, des oligo-éléments, des précurseurs de métabolites et/ou leurs mélanges.
Le procédé de l'invention est encore caractérisé en ce que la suspension de spores comprise dans le milieu de culture comprend d'environ 2 à 4. 107 spores par gramme de matière sèche totale du microorganisme d'origine fongique.
Les microorganismes d'origine fongique mis en oeuvre selon le présent procédé sont des champignons filamenteux. Il s'agit en particulier de nématophages ou d'entomopathogènes. Ces champignons sont utilisés en lutte biologique comme agents de contrôle de population des maladies et/ou de leurs vecteurs.
Les champignons filamenteux sont avantageusement choisis dans le groupe comprenant les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Geotrichum, Paecilomyces, Metarhizium, Trichoderma, Gibberella, Fusarium, Venticillium et Mucor.
A titre indicatif, les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus et Geotrichum seront plus particulièrement utilisés dans le domaine de l'agroalimentaire, les champignons du genre Geotrichum étant utilisés en lutte biologique contre les moisissures et protégeant les fruits et les céréales après la récolte.
Les genres Paecilomyces et Metarhizium sont utilisés dans le domaine de l'agronomie comme biopesticides, respectivement contre les nématodes et contre les insectes migrateurs comme les criquets.
Le genre Trichod'erma est utilisé dans le domaine de la biotechnologie de l'environnement, le recyclage de biomasses cellulosiques ou la production de métabolites secondaires.
Le genre Gibberella est utilisé dans le domaine de la pharmacie car il permet de produire une phytohormone : la gibbérelline.
Il est également envisageable d'utiliser dans le procédé de l'invention une association de champignons et de levures, bactéries ou actinomycètes. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec déclenchant le stress hydrique lors de la phase de production des spores est précédée par une aération avec de l'air humide, ladite aération avec de l'air humide étant effectuée au départ de la FMS afin de favoriser la croissance des microorganismes d'origine fongique.
L'aération avec de l'air humide permet plus particulièrement, au début de la FMS, la germination des spores des microorganismes, puis enfin le démarrage de la phase de production des spores. Une fois la phase de production commencée, l'aération avec de l'air humide pourra être substituée par une aération avec de l'air sec, et ceci dans des conditions permettant d'obtenir le nombre le plus élevé de spores. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, l'aération avec de l'air sec est effectuée avec un débit allant de 50 à 200 mI/min/colonne d'air sec, et de préférence de 50 à 100 ml/min/colonne d'air sec, correspondant à 50 à 20 renouvellements à l'heure du volume utile du bioréacteur FMS. L'originalité du procédé de l'invention consiste à utiliser des volumes variables d'air sec qui permettent d'une part de maintenir le stress hydrique permanent comme moyen de stimulation de la phase de production des spores, tout en évitant un dessèchement rapide du milieu de culture qui provoquerait l'arrêt de croissance des microorganismes, et d'autre part de maintenir tout au long du procédé la production continue et massive de spores. Des rendements de production de spores de l'ordre d'environ 1010 spores par gramme de matière sèche de support sont ainsi obtenus.
Le débit d'air sec permet à la fin du procédé d'obtenir un produit fermenté sec contenant la biomasse du champignon essentiellement sous forme de spores, en particulier de conidiospores.
Le produit final fermenté contenant les conidiospores comporte moins de 3% d'humidité. Il peut être conservé pendant plusieurs mois sans perte de viabilité.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé est plus particulièrement caractérisé en ce que : - le microorganisme' d'origine fongique est un champignon filamenteux et est de préférence Aspergillus piger et/ou, - le support solide est de la bagasse de canne à sucre et/ou, - le substrat carboné est du son de blé et/ou, - le mélange (support solide / substrat carboné), à savoir (bagasse de canne à sucre/son de blé) est utilisé dans les proportions (70 / 30%).
Dans de telles conditions, la substitution de l'aération en air humide par de l'aération en air sec est effectuée à un débit de 100 ml/min/colonne d'air sec après trois jours entiers de FMS.
L'aération en air humide est effectuée à un débit allant de 20 à 40 ml/min/colonne d'air hurnide, et de préférence à un débit de 30 ml/min/colonne d'air humide. Dans les conditions susmentionnées, on pourra ainsi obtenir de grandes quantités de spores allant jusqu'à 1,168.1010 spores par gramme de matière sèche de support après une durée totale de FMS d'à peine 6 jours.
Les spores obtenues selon le procédé de l'invention le sont en quantité importante et sont non seulement sèches, mais sont également viables et facilement conservables pendant plusieurs mois.
Outre la production quantitativement et qualitativement satisfaisante de spores de microorganismes d'origine fongique, le procédé de l'invention présente d'autres avantages. Un de ces avantages est que le procédé de production de spores en FMS ne contamine pas l'environnement dans lequel il est effectué.30 En effet, le procédé de FMS de l'invention est plus particulièrement effectué dans un bioréacteur statique fermé à double paroi intérieure. Grâce à une aération avec de l'air sec, on favorise l'évaporation de l'eau. Il n'y a donc pas d'effluents liquides à traiter à la fin du procédé, étant donné que l'eau a été éliminée sous forme de vapeur grâce à une aération avec de l'air sec et à faible débit, évitant ainsi des turbulences et la mise en suspension dans l'air des spores produites. Par ailleurs, rappelons que le stress hydrique s'exerce avec de l'air sec et froid (15 à 30 C) ce qui permet d'éviter la destruction de spores par la température élevée.
Il n'y a donc pas de contaminations car, l'activité de l'eau étant faible, on empêchera, au cours du stress hydrique, la croissance de contaminants (essentiellement bactéries et levures) en FMS. A la fin du procédé, le produit obtenu est sec ce qui évite de traiter des effluents liquides contaminés provenant du bioréacteur. Le produit est obtenu dans son emballage prêt à être stocké pour une longue période de temps.
Un autre avantage du procédé de l'invention est qu'il favorise la production de métabolites primaires et/ou secondaires, et de préférence secondaires. En effet, en maintenant des conditions favorables pour la sporulation, on favorise la production de métabolites secondaires étant donnée que cette dernière est directement liée à la sporulation des champignons filamenteux. La production des métabolites secondaires est directement proportionnelle à la quantité de spores produites. Ainsi, plus il y aura de spores produites sous l'effet d'un stress hydrique, plus il y aura de métabolites produits au cours du procédé de l'invention. De ce fait, la sporulation favorise la production de métabolites en général.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé est encore caractérisé en ce qu'il comprend, à l'issue de la FMS, une étape de récupération de métabolites primaires et/ou secondaires produits par les spores, tels que des enzymes (pectinase, cellulase), des exoenzymes, des acides nucléiques, des mycotoxines, des lactones, des alcaloïdes, des stéroïdes, des gibbérellines, des ergotamines, des antibiotiques (pénicilline) et/ou leurs mélanges.
La présente invention a également pour objet les spores de microorganismes d'origine fongique et/ou leurs métabolites susceptibles d'être obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation de spores de microorganismes- d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le domaine de l'agronomie et/ou de l'agroalimentaire.
Plus particulièrernent, dans le domaine de l'agronomie, les spores des champignons filamenteux sont utilisées brutes pour élaborer des bio-pesticides contre les insectes, les nématodes, les champignons phytopathogènes.
A titre d'exemple, l'utilisation des spores des champignons filamenteux comme moyen naturel de lutte (lutte biologique) contre l'invasion des criquets sur le continent africain mais également européen est une alternative extrêmement intéressante à l'utilisation des pesticides traditionnellement utilisés dans l'agriculture. En effet, les champignons parasitent naturellement ces animaux au moment de leur alimentation et empêchent ainsi leur prolifération.
Les spores des champignons filamenteux peuvent également être utilisées brutes pour élaborer des herbicides contre les mauvaises herbes.
L'invention concerne donc également une méthode de lutte biologique caractérisée en ce qu'on utilise une quantité efficace en tant que bio-pesticide et/ou en tant qu'herbicide, de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites.
Un autre exemple dans le domaine de l'agronomie réside dans l'utilisation 30 desdites spores comme ferment starter-inoculum pour démarrer des procédés de production de phytohormones (gibbérellines) en FMS.
Dans le domaine de l'agro-alimentaire, les spores de certaines moisissures utiles peuvent ainsi être utilisées : - comme agents aromatisants lors du maltage (Geotrichum notatum) contre des moisissures productrices de mycotoxines pour la production de la bière ; - comme inoculum-starter du caillé de lait (Pen/ci/hum roqueforti, Penicilium camemberti ...) pour l'élaboration de fromages à pâte molle ; - comme inoculum pour l'élaboration des aliments fermentés contenant des moisissures nobles.
Mais l'usage le plus important en agro-alimentaire est l'utilisation des spores de champignons filamenteux pour démarrer différentes FMS, pour la valorisation des sous produits agricoles, la production de métabolites primaires et secondaires (enzymes, acides organiiques, arômes etc.).
L'invention a encore pour objet l'utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le domaine de la chimie.
On citera plus particulièrement le domaine de la biocatalyse, où les spores des champignons filamenteux peuvent être utilisées telles quelles dans des milieux non conventionnels ou peuvent être micro-encapsulées pour des utilisations en chimie fine.
Un autre objet de I"invention réside dans l'utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le domaine de la pharmacie.
Les spores des champignons filamenteux sont plus particulièrement utilisés comme starter pour la production de métabolites secondaires (mycotoxines, antibiotiques) par l'industrie pharmaceutique. Les exemples ci-après illustrent l'invention, ils ne la limitent en aucune façon. Ces exemples permettent de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.30 Il y est fait référence à la figure 1 qui représente l'évolution de l'humidité d'un substrat bagasse/son de blé 70/30 %, à 30 C pour différents débits d'air et à la figure 2 donnant les résultats de l'application d'un stress hydrique (indice de sporulation (108) en fonction du temps (h). EXEMPLE 1 : Etude du séchage du mélange (support solide / substrat carboné) non inoculé
Avant d'étudier les effets de l'aération avec de l'air sec sur la production de 10 spores d'Aspergillus niger sur le mélange (bagasse de canne à sucre /son de blé) dans les proportions (70 / 30 %), il est important de connaître les cinétiques du séchage pour ce mélange en fonction de différents débits d'airs secs sur des colonnes de taille identique.
15 Différentes valeurs de débits d'air sec (0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 et 10 I/min/colonne) sont donc testées pour respectivement 5 colonnes (N 11, 12, 13, 14 et 15) de taille identique, à savoir une colonne de 4 cm de diamètre et de 20 cm de hauteur. Les débits en air sec sont respectivement de 2, 4, 10, 20 et 40 fois le renouvellement d'air du volume potentiel pour les 5 colonnes de taille identique utilisées (N 11, 12, 20 13, 14 et 15).
La figure 1 représente les courbes cinétiques d'évolution de l'humidité du mélange non inoculé support / substrat (bagasse de canne à sucre 70 % / son de blé 30 %) à 30 C pour les différents débits d'air sec (col. N 11 : 0,5 I/min/col), (col N 12 25 : 1 I/min/col), (col. 13 : 2, 5 I/min/col) ; (col N 14 : 5 I/min/col), (col. 15 : 10 I/min/col) pendant 44 heures.
Conclusion : On observe (voir figure 1) qu'au fur et à mesure que le débit en air sec 30 diminue, le séchage prend plus de temps. Au bout de 44 heures maximum, le produit sec est obtenu pour le débit 2 fois le volume utile de la colonne (colonne 11). La même expérience a été réalisée avec des dimensions différentes de colonnes. Il a ainsi été démontré que la porosité du substrat et la fluidité de l'air à travers la matrice solide n'est pas affectée par le changement d'échelle.5 EXEMPLE 2 : Effet du stress hydrique exercé à partir de 30 heures, de 3 jours et de 5 jours de FMS.
Les Inventeurs de la présente invention ont pu remarquer que la substitution de l'aération humide par de l'aération à sec à partir de 30 heures, de 3 jours ou de 5 jours de FMS est généralement très favorable pour la production massive de spores d'Aspergillus piger (A. niger) incubé à 30 C sur bagasse de canne à sucre / son de blé (70/30 %).
En effet, tous les indices de sporulation obtenus après l'application du séchage, à n'importe quel débit, sont supérieurs à ceux obtenus en air humide (voir tableau 1 ci-dessous). L'indice de sporulation (Is) représente le nombre de spores produites par gramme de support de matière sèche.
L'aération en air humide effectuée au début du procédé de fermentation en milieu solide est réalisée un débit de 30 ml/min/colonne.
La substitution de l'aération en air humide par de l'aération à sec à un débit de 0,05 I/min/colonne à partir de 3 jours entiers ou à partir de 30 h de FMS augmente significativement l'indice de sporulation avec un facteur d'environ 14 fois pour le premier et de 10 fois pour le deuxième.
Cependant, à partir de 3 jours la durée totale de la FMS est de 10 jours et 16 h alors qu'à partir de 30 h la durée totale de FMS est d'environ 10 jours (9 jours et 22 h). Lorsque l'aération est à 0,1 I/min/colonne à partir de 3 jours, l'indice de sporulation est augmenté de 14 fois avec un indice de sporulation de 11,68 x 109 contrairement à l'aération à sec à partir de 30 h où l'indice de sporulation est de 7,58 x 108 (2 fois) au bout de 6 jours (5 jours et 22 h) et 4 jours et demi (4 jours et 10 h) respectivement.
L'aération à sec permet non seulement la production importante de spores d'A. piger mais permet aussi de raccourcir la durée totale de FMS et d'éviter le phénomène de la regermination des spores produites parréduction de l'activité de l'eau. La disponibilité de l'eau est un paramètre primordial pour la germination des spores chez les champignons filamenteux notamment Aspergillus piger.
En conclusion, l'aération en air sec à un débit de 100 ml/min/colonne après 3 jours de FMS à aération humide semble la meilleure procédure afin de produire d'importantes quantités de spores (1,168 x 1010) après à peine 6 jours (5 jours et 10 22 h) de FMS.
Tableau 1 : Production de spores avant et après séchage à différents débits en air sec lors de la culture d'A. piger en FMS à 30 C pour un volume utile de 100 ml. Séchage Débits d'air Durée Is avant Is après Humidité Humidité sec totale de séchage séchage initiale finale (I/min/col) FMS (*10$) (*10$) (%) (%) 2 5 j et 4 h 4,57 5,29 76,36 5,79 1 5 j et 8 h 4,7 7,8 76,36 6,32 A partir de 5 0,4 6 j et 1 h 5,96 8,96 76, 36 6,09 jours entiers (5 j et 22 h) d'aération en 0,2 6 j et 16 h 8,25 11,32 76,25 5,96 air humide (5 j et 40 h) 0,1 8 j et 4 h 10,41 12,6 76,25 6,03 0,05 12 j et 20 h 10,1 10,18 76,43 6,48 A partir de 3 0,1 5 j et 22 h 8, 26 116,8 76,25 6,32 jours entiers d'aération en 0,05 10 j et 16 h 10,95 152, 2 76,43 5,96 air humide A partir de 30 0,1 4 j et 10 h 4,22 7,58 77,02 6,12 heures d'aération en 0,05 9 h et 22 h 10,58 112,6 76,59 6,01 air humide Ce tableau est illustré par la figure 2 dans laquelle ls= indice de sporulation et SHy = stress hydrique ; L'étude de la viabilité des spores d'Aspergillus pigera également été effectuée par les Inventeurs afin de déterminer si les spores produites au terme de la FMS avant et après séchage sont viables ou non (voir tableau 2 ci-dessous).
Tableau 2 : Viabilité des spores d' A. piger avant et après séchage à un débit de 100 ml/min/colonne après 3 jours d'aération humide et après 6 jours au total de FMS. Dilution 10-' 10 10"3 10-4 10-5 10-6 10-' 10-8 10-9 1010 10-" Croissance + + + + + + + + - - - avant séchage Croissance + + + + + + + + + + - après séchage Conclusion du tableau 2 : Les spores d'A. piger sont viables aussi bien avant et après application du séchage à partir de 3 jours de FMS à aération forcée humide. Par conséquent, le séchage n'affecte pas négativement la viabilité des spores d'A. piger.
Conclusion générale L'aération forcée en air humide est généralement fort recommandée lors du processus de la fermentation en milieu solide vu qu'il permet d'apporter de l'oxygène et de l'eau nécessaires à la croissance du champignon filamenteux concerné.
Cependant, elle influence négativement la sporulation et par la suite la production de spores. La phase de la sporulation est induite généralement par différents facteurs notamment le manque de nutriments, la présence de métabolites secondaires et aussi par la faible activité de l'eau. Dans la présente invention, l'aération en air sec a été adoptée afin de baisser l'activité de l'eau ou la teneur en eau (humidité) et de stimuler par la suite la sporulation du champignon concerné.
10 L'application à un moment précis de la FMS de l'aération en air sec permet d'augmenter significativement l'indice de sporulation et évite la germination des spores. Le choix du moment de l'aération en air sec est crucial. Il permet de calculer la productivité du processus en fonction des deux variables principales : le temps nécessaire pour avoir un produit sec fermenté et un bon indice de sporulation.
15 L'étude a montré que l'aération à 100 ml/min/col en air sec après 3 jours de FMS en air humide permet d'avoir un produit final après une durée totale de 6 jours de FMS avec un indice de sporulation allant jusqu'à 1.168 x 1010 et une viabilité très élevée.5
Claims (16)
1. Procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide FMS ), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress hydrique déclenché par une aération avec de l'air sec à une température allant de 15 à 30 C.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (a) pré-conditionnement du support solide qui implique successivement le broyage dudit support en particules, l'humidification dudit support avec une solution aqueuse nutritive pouvant contenir certains éléments du milieu de culture, lesdits éléments du milieu de culture pouvant supporter un traitement par stérilisation, et enfin la stérilisation du support ainsi humidifié, (b) l'imprégnation du support ainsi pré-conditionné avec un milieu de culture liquide comprenant, outre ladite suspension de spores des microorganismes d'origine fongique, un ou plusieurs substrats carbonés solubles, un ou plusieurs agents de croissance, l'humidité du mélange ainsi obtenu ayant une valeur allant de 50 à 85%, (c) la fermentation du mélange ainsi obtenu (FMS) dans des conditions de température, d'humidité et d'aération optimales pour la croissance des microorganismes, la germination de leurs spores et le démarrage de la phase de production desdites spores.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support solide d'origine naturelle ou synthétique :- présente une capacité de rétention d'eau permettant une absorption d'eau de 3 à 5 fois son propre poids, - présente une porosité globale apparente d'environ 60% après imprégnation avec le milieu de culture, - présente une résistance à la stérilisation.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'un support solide d'origine naturelle est avantageusement choisi dans le groupe comprenant la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre et/ou leurs mélanges, et en ce qu'un support solide d'origine synthétique est par exemple une mousse de polymère.
6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat carboné compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant les sucres simples, les polysaccharides, les protéines, les acides aminés, les lipides, les acides gras, les hydrocarbures, les substrats naturels amylacés, les sons de blé et/ou leurs mélanges.
7. Procédé selon les revendications 5 et 6, caractérisé en ce que le support solide est de la bagasse de canne à sucre et le substrat carboné est du son de blé.
8. Procédé selon les revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le support solide est utilisé dans des proportions allant de 60 à 80% par rapport au substrat carboné et en ce que le substrat carboné est utilisé dans des proportions allant de 40 à 20% par rapport au support solide.
9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent de croissance compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant les extraits de levure, les vitamines, les acides aminés, les oligo- éléments, les précurseurs de métabolites et/ou leurs mélanges.
10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la suspension de spores comprise dans le milieu de culture comprend d'environ 2à 4. 107 spores par gramme de matière sèche totale du microorganisme d'origine fongique.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les microorganismes d'origine fongique sont des champignons filamenteux, en particulier des champignons nématophages ou entomopathogènes.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les champignons filamenteux sont avantageusement choisis dans le groupe comprenant les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Geotrichum, Paecilomyces, Metarbizium, Trichoderma, Giberella, Fusarium, Venticillium et Mucor.
13. Procédé selon les revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec déclenchant le stress hydrique lors de la phase de production des spores est précédée par une aération avec de l'air humide, ladite aération avec de l'air humide étant effectuée au départ de la FMS afin de favoriser la croissance des microorganismes.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec est effectuée avec un débit allant de 50 à 200 ml/min/colonne d'air sec, et de préférence de 50 à 100 ml/min/colonne d'air sec.
15.Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 11, caractérisé en ce que : - le microorganisme d'origine fongique est un champignon filamenteux et est de préférence Aspergillus Niger et/ou, - le support solide est de la bagasse de canne à sucre et/ou, - le substrat carboné est du son de blé et/ou, le mélange (support solide / substrat carboné), à savoir (bagasse de canne à sucre/son de blé) est utilisé dans les proportions (70130%).
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec est effectuée à un débit de 100 ml/min/colonne d'air sec, après trois jours entiers de FMS effectuée avec une aération avec de l'air humide.17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend, à l'issue de la FMS, une étape de récupération de métabolites primaires et/ou secondaires produits par les spores, tels que des enzymes (pectinase, cellulase), des exoenzymes, des acides nucléiques, des micotoxines, des lactones, des alcaloïdes, des stéroïdes, des gibbérellines, des ergotamines, des antibiotiques (pénicilline) et/ou leurs mélanges. 18. Utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une application dans le domaine de l'agronomie et/ou de l'agroalimentaire. 19. Utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une application dans le domaine de la chimie. 20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17.
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