WO2016089181A1 - 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

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WO2016089181A1
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adjuvant
seq
binding molecule
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장신재
이수영
임병필
김판겸
박상태
안정선
박은비
금선주
송만기
최정아
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(주)셀트리온
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant composition comprising at least one influenza virus neutralizing binding molecule and a vaccine composition comprising the same, more specifically, the use as an adjuvant to increase the efficacy of a vaccine by enhancing an immune response induced by the vaccine. It relates to an adjuvant composition comprising at least one human monoclonal antibody having neutralizing activity against influenza virus, and a vaccine composition comprising the same.
  • Influenza virus is a disease caused by infection of the respiratory tract, which is common in winter, and is highly infectious and spreads easily to all age groups, especially those who are vulnerable (Treanor J, 2004, N Engl J). Med . 350 (3): 218-20).
  • Enveloped virus belonging to the Orthomyxoviridae an influenza virus whose genome contains eight-segment negative-sense and single-strand RNA (ribonucleic acid) Influenza A virus is divided into several subtypes according to the major surface proteins HA (hemagglutinin) and NA (neuraminidase). To date, 17 HA and 10 NA are known (Cheung TK and Poon LL 2007, Ann NY Acad Sci. 1102: 1-25; Tong S, et al.
  • Influenza viruses can infect birds, pigs, and humans depending on their type, and due to their genome consisting of RNA fragments, strains of viruses continue to develop due to combinations and mutations of various genes (Treanor J, 2004. N Engl J Med). 350 (3): 218-20). Because of this persistent mutation, it is difficult to obtain permanent immunity, so the most effective preventive method is to inoculate a vaccine against an influenza virus, which is expected to spread every year, to form a yearly immunity for a particular type. will be.
  • influenza virus vaccine given annually is a trivalent or tetravalent vaccine, in which H1 and H3 subtypes of influenza A are mixed with one or two types of influenza B type HA.
  • vaccines for various infectious diseases are added with a substance to increase immunogenicity, which is called an adjuvant.
  • adjuvants approved for human use include MF59 with aluminum and oil-in-water emulsions consisting of aluminum hydroxide and aluminum phosphate, and AS04 with MPL and aluminum hydroxide, which are AS03 and TLR4 agonists. (Rappuoli R, 2011. Nature Reviews Immunology 11 , 11 (12): 865-72)
  • the antibody against influenza A virus which the applicant has previously applied for, has shown neutralizing efficacy against various influenza subtypes.
  • the antibody disclosed in Korean Patent Application No. 10-2011-0020061 is mainly derived from phylogenetic group 1 (H1, H2, H5, H9, etc.), the antibody disclosed in Korean Patent Application No. 10-2012-0107512 mainly showed neutralizing efficacy to phylogeny group 2 (H3, H7, etc.).
  • a cocktail formulation that can prevent and cure both viruses belonging to Group 1 and Group 2, which are likely to be epidemic by mixing and administering two or more antibodies at the same time.
  • the present inventors have completed the present invention by finding a new use of the previously developed antibody as an adjuvant by confirming that the effect of the vaccine can be increased by administering the influenza virus neutralizing antibody developed by the present inventor together with the vaccine.
  • an object of the present invention is to provide an adjuvant composition comprising at least one influenza virus neutralizing binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition comprising the adjuvant composition and the target antigen.
  • Another object of the present invention is to provide a preparation method comprising the adjuvant composition and the target antigen.
  • Another object of the present invention is to provide a method of increasing the immune response to a target antigen by administering the adjuvant composition to a host.
  • Another object of the present invention is to provide a method of immunizing by administering the vaccine composition to a host.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing an immunological product from an immunized host by administering the vaccine composition to a host.
  • the present invention provides an adjuvant composition comprising at least one influenza virus neutralizing binding molecule.
  • the binding molecule may bind to an epitope in the stem region of the hemagglutinin (HA) protein of influenza A virus.
  • HA hemagglutinin
  • the epitope of the binding molecule is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • It may include an adjuvant composition characterized in that at least one epitope selected from the group consisting of.
  • the epitope of the binding molecule may comprise amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292 and 318 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope of the binding molecule may comprise amino acid residues at positions 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 and 53 of the HA2 polypeptide.
  • the epitope of the binding molecule comprises amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 18, 19, 20, 21 of the HA2 polypeptide And amino acid residues of 41, 42, 45, 48, 49, 52 and 53.
  • the epitope of the binding molecule may comprise amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope of the binding molecule may comprise positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 amino acid residues of the HA2 polypeptide.
  • the epitope of the binding molecule comprises an amino acid residue at the position of the HA1 polypeptide and / or HA2 polypeptide of an HA first monomer and HA1 of a second monomer adjacent to the first monomer. It may further comprise position 25, 32 and 33 amino acid residues of the polypeptide.
  • the epitope of the binding molecule comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 of the HA2 polypeptide. Amino acid residues.
  • the epitope of the binding molecule comprises an amino acid residue at the position of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of an HA first monomer, and of the HA1 polypeptide of a second monomer adjacent to the first monomer. And may further comprise position 25, 32 and 33 amino acid residues.
  • the epitope of the binding molecule comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, Amino acid residues of 58 and 99;
  • the epitope of the binding molecule comprises an amino acid residue at the position of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of an HA first monomer, and of the HA1 polypeptide of a second monomer adjacent to the first monomer. Position 25, 27, 32, and 33 amino acid residues.
  • the epitope of the binding molecule comprises amino acid residues at positions 54, 55, 278, 291 and 318 of the HA1 polypeptide, and positions 19, 20, 21, 38, 39, 41, Amino acid residues of 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57 and 60.
  • the epitope of the binding molecule comprises an amino acid residue at the position of the HA1 polypeptide and an HA2 polypeptide of an HA first monomer, and HA1 of an HA second monomer adjacent to the HA first monomer. Amino acid residues at positions 25, 32, 33, 310, 311, and 312 of the polypeptide.
  • Amino acid position numbering of the epitopes is based on H3 HA numbering system.
  • the binding molecule In one embodiment of the invention, the binding molecule
  • a light chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 3, and a CDR1 region of SEQ ID NO: 4, a CDR2 region of SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6
  • a binding molecule comprising a heavy chain variable region comprising a CDR3 region region;
  • Binding molecule comprising a heavy chain variable region comprising a CDR3 region
  • At least one binding molecule selected from the group consisting of.
  • the CDRs of the variable regions were determined by conventional methods according to a system devised by Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5 th ), National Institutes of Health, Bethesda, MD). (1991)].
  • the CDR numbering used in the present invention used the Kabat method, but other binding molecules including CDRs determined according to other methods such as IMGT method, Chothia method and AbM method are also included in the present invention.
  • the binding molecule In one embodiment of the invention, the binding molecule
  • a binding molecule comprising a light chain comprising the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 13 and a heavy chain comprising the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 14;
  • a binding molecule comprising a light chain comprising the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 15 and a heavy chain comprising the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 16
  • At least one binding molecule selected from the group consisting of.
  • the binding molecule comprises a binding molecule that binds to the Fc receptor on the cell surface.
  • the present invention also provides a vaccine composition comprising the adjuvant composition and the target antigen.
  • the target antigen may be a viral antigen, but is not limited thereto.
  • the viral antigen is an influenza virus antigen.
  • the influenza virus antigens include influenza A virus or influenza B virus antigens.
  • the influenza virus antigen may be hemagglutinin (HA) or neuraminidase (NA), but is not limited thereto.
  • the vaccine composition may be included in the weight ratio of the antigen and the adjuvant composition 1: 0.02 to 1: 200, preferably 1: 0.2 to 1:20 It is not limited to this.
  • the weight ratio of antigen to adjuvant composition can be reduced or increased to modulate immunogenic activity.
  • the present invention provides a vaccine composition to which an additional adjuvant composition is added in addition to the adjuvant composition.
  • additional adjuvant compositions include, but are not limited to, Alum, metabolizable oils (eg squalene), tocols (eg alpha-tocopherol), sterols (eg cholesterol), saponins (Eg QS21), a ligand of Toll like receptor (eg poly (I: C), oligonucleotides with CpG motifs and / or LPS derivatives (eg 3D-MPL)).
  • the present invention also provides a method for preparing a vaccine composition comprising the adjuvant composition and a target antigen.
  • the vaccine composition may be, but is not limited to, an influenza virus vaccine composition.
  • the present invention also provides a method for enhancing the immune response to a target antigen by administering the adjuvant composition to a host.
  • the vaccine composition may be, but is not limited to, an influenza virus vaccine composition.
  • the immune response may be a method characterized by being induced by a cell having an Fc receptor on the cell surface, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for preventing a virus-derived disease comprising administering to a subject a vaccine composition comprising the adjuvant composition in an effective amount.
  • the virus-derived disease may be an influenza virus-derived disease.
  • the present invention also provides a method of immunizing by administering the vaccine composition to a host.
  • the immunological product may be a T cell, a B cell, or an antibody.
  • the immunological product may also be other types of cells having Fc receptors on the cell surface, such as B cells, such as neutrophils, macrophages, natural killer cells or dendritic cells.
  • the "influenza A virus” described in the present invention is an enveloped virus belonging to the Orthomyxoviridae, which is negative-polar and single-stranded in eight segments.
  • RNA ribonucleic acid
  • A, B and C groups a genome of RNA (ribonucleic acid) as a genome, and is classified into A, B and C groups, and is divided into several subtypes according to major surface proteins HA (hemaggutinin) and NA (neuraminidase). To date, 17 HAs and 10 NAs are known.
  • H1 subtypes described herein include H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9 and H1N10.
  • H2 subtypes described herein include H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9 and H2N10.
  • H5 subtypes described herein include H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9 and H5N10.
  • H9 subtypes described in the present invention include H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 and H9N10.
  • H3 subtypes described in the present invention include H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9 and H3N10.
  • H7 subtypes described in the present invention include H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9 and H7N10.
  • Hemagglutinin (hereinafter referred to as” HA )” described in the present invention refers to the envelope glycoprotein of influenza virus. HA mediates influenza virus adsorption and penetration into host cells. There are 17 subtypes reported so far.
  • NA neuroaminidase
  • the term “neuraminidase (hereinafter referred to as” NA ”) described in the present invention refers to the envelope glycoprotein of influenza virus. NA plays an important role when influenza virus proliferates and then spreads. Ten subtypes have been reported so far.
  • the "influenza vaccine” described in the present invention is the best way to prevent seasonal or pandemic influenza, and is largely divided into live and inactivated vaccines.
  • Live vaccines have been developed and used live attenuated vaccines.
  • Inactivated vaccines are whole virus vaccines using whole viruses incubated in embryonated eggs or cell cultures and inactivated with formalin, split vaccines in which viral envelopes are crushed with ethers, etc. And subunit vaccines with purified NA components.
  • a vaccine containing one type of influenza B group together with H1 and H3 subtypes of influenza A group is said to be a trivalent vaccine and a vaccine containing two types of influenza B group is called a tetravalent vaccine.
  • the "influenza vaccine” described in the present invention includes both trivalent and tetravalent seasonal, live and inactivated vaccines of pandemic.
  • a “binding molecule” described herein binds to an intact immunoglobulin, a fusion protein or antigen having an Fc portion of an immunoglobulin, including a monoclonal antibody such as a chimeric, humanized or human monoclonal antibody.
  • Enzymes, receptors which are capable of binding to variable domains or substrates comprising immunoglobulin fragments that compete with intact immunoglobulins for binding to monomeric HA or trimer HA of an immunoglobulin, such as influenza A virus It means protein. Regardless of the structure, the antigen-binding fragment binds to the same antigen recognized by intact immunoglobulins.
  • An antigen-binding fragment comprises two or more continuations of the amino acid sequence of a binding molecule, at least 20 contiguous amino acid residues, at least 25 contiguous amino acid residues, at least 30 contiguous amino acid residues, at least 35 contiguous amino acid residues, at least 40 contiguous amino acid residues.
  • At least 50 contiguous amino acid residues at least 60 contiguous amino acid residues, at least 70 contiguous amino acid residues, at least 80 contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, Peptides or polypeptides comprising an amino acid sequence of at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues.
  • Antigen-binding fragments described herein are in particular Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (scFv), 2 Bivalent single-chain antibodies, single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of immunoglobulin sufficient to bind a particular antigen to the polypeptide, and the like It includes.
  • the fragments may be produced synthetically or by enzymatic or chemical digestion of complete immunoglobulins or may be produced genetically by recombinant DNA techniques. Production methods are well known in the art.
  • adjuvant refers to a substance or composition that is added to a vaccine or pharmaceutically active ingredients to increase and / or affect an immune response. Representatively means a carrier or auxiliary agent and / or other pharmaceutically active substance or composition for immunogen. Typically, the term “adjuvant” should be interpreted in a broad sense and capable of enhancing the immunogenicity of antigens incorporated into or administered with the adjuvant. It means a wide range of materials or strategies. Adjuvant may also be divided into, but not limited to, an immune potentiator, an antigen delivery system, or a combination thereof.
  • immunological product refers to a protective immune mediator or cell, etc. arising from a host immunized by administration of an antigen and / or adjuvant composition, eg, activated T cells, B cells or It may mean an antibody, but is not limited thereto.
  • an antigen and / or adjuvant composition eg, activated T cells, B cells or It may mean an antibody, but is not limited thereto.
  • the term "pharmaceutically acceptable excipient” means an inert material that is combined into an active molecule, such as a drug, agent, or binding molecule, to produce an acceptable or convenient dosage form.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are nontoxic or are excipients that are acceptable to the recipient for their intended use, at least in the doses and concentrations in which the toxicity is used, and with other components of the formulation including drugs, preparations or binding powders. It is compatible.
  • an effective amount refers to the amount of the binding molecule of the present invention that is effective in increasing the effectiveness of the vaccine when administered in combination with a vaccine of influenza A virus.
  • composition comprising at least one influenza virus neutralizing binding molecule of the present invention has been found to increase the effectiveness of the vaccine, it can be used as an adjuvant to increase the immune response upon administration of the vaccine and to prevent disease caused by viruses. Very useful.
  • FIG. 1 shows H1N1 vaccine composition intramuscularly in mice twice weekly (see Table 1), and serum was taken 13, 17 and 27 days after the first intramuscular injection to be specific for H1N1 influenza virus in serum.
  • the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • FIG. 2 shows intramuscular injection of H1N1 vaccine composition into mice twice weekly (see Table 3), serum was collected 28 days after the first intramuscular injection, and specific antibody titers against H1N1 HA protein and H1N1 influenza virus in serum This is the result confirmed by ELISA.
  • Figure 3 is inoculated with H1N1 influenza virus 10MLD 50 in the immunized mouse, and confirmed the survival rate and weight change of the immunized mouse.
  • FIG. 4 shows H1N1 vaccine composition intramuscularly in mice twice weekly (see Table 5), and serum was collected 13, 20 and 27 days after the first intramuscular injection to be specific for H1N1 influenza virus in serum.
  • the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • FIG. 6 shows that the H1N1 vaccine composition was intramuscularly injected into mice twice every two weeks (see Table 7), and serum was collected 13, 20, and 27 days after the first intramuscular injection to be specific for H1N1 influenza virus in serum.
  • the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • Figure 7 is inoculated with H1N1 influenza virus 10MLD 50 in the immunized mouse, it is the result of confirming the survival rate and weight change of the immunized mouse.
  • FIG. 8 shows intramuscular injection of H3N2 vaccine composition into mice twice weekly (see Table 9), serum was taken 13 and 27 days after the first intramuscular injection to determine specific antibody titers against H3N2 influenza virus in serum. The result confirmed by ELISA.
  • FIG. 10 shows H1N1 vaccine composition intramuscularly injected to mice twice every two weeks (see Table 11), and serum was taken 13, 20 and 27 days after the first intramuscular injection to be specific for H1N1 influenza virus in serum.
  • the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • FIG. 12 shows the ratio of B cells to immune cells in the furrow lymph nodes at 1, 3 and 7 days after the second intramuscular injection of the H1N1 vaccine composition into the mouse twice at intervals of 2 weeks (see Table 14). The result is confirmed.
  • FIG. 13 shows H1N1 vaccine composition intramuscularly in mice twice weekly (see Table 15), and 4 weeks after the second intramuscular injection, H1N1 virus was inoculated with B cells in the spleen and body lymph nodes 1 and 3 days later. This is the result of checking the ratio of.
  • FIG. 14 shows H1N1 vaccine composition intramuscularly in mice twice weekly (see Table 16), and serum was taken 13, 20, and 27 days after the first intramuscular injection to be specific for H1N1 influenza virus in serum.
  • the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • H1N1 vaccine composition After the intramuscular injection of H1N1 vaccine composition into the mouse twice at intervals of 2 weeks as shown in Table 1 above, the immune response induced in each experimental group was confirmed. Serum was collected from each experimental group 13, 17 and 27 days after the first intramuscular injection, and the titer of the antibody was confirmed by ELISA.
  • hemaglutinin inhibition assay As shown in Table 2 below, the effectiveness of the vaccine was evaluated by a hemaglutinin inhibition assay (HI assay, hemaglutinin inhibition assay) to confirm whether the therapeutic antibodies, CT120 antibody and CT149 antibody, as an adjuvant of the influenza virus vaccine.
  • Serum was obtained from mice 13, 17 and 27 days after the administration of the vaccine and the adjuvant, and the antibody titers were able to inhibit the aggregation reaction between influenza virus and chicken erythrocytes.
  • CT120 or CT149 When combined with influenza virus vaccine, CT120 or CT149 confirmed a similar or better immunogenic potency effect than Alum, an adjuvant. This confirmed that CT120 and CT149 were effective as an adjuvant of influenza virus vaccines.
  • Example 2 H1N1 The vaccine as an antigen CT120 and CT149 Determination of Antigen Concentration to Determine the Effect of Adjuvant
  • H1N1 vaccine (cell based) was administered alone from 0.01ug to 1ug or with Alum adjuvant, and then antibody titers were confirmed by ELISA and neutralizing antibody titers via HI. Standard is a trivalent vaccine on the market which was run for comparison.
  • Group 11 Standard 0.3 ug - i.m. 5
  • Group 12 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 5
  • Group 13 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 5
  • Group 14 H1N1 vaccine 0.01 ug - i.m. 5
  • Group 15 H1N1 vaccine 0.01 ug Alum i.m. 5
  • Group 16 Standard 0.03 ug - i.m. 5
  • H1N1 vaccine composition After the intramuscular injection of H1N1 vaccine composition into the mouse twice at intervals of 2 weeks as shown in Table 3 above, the immune response induced in each experimental group was confirmed. Serum was collected from each experimental group 28 days after the first intramuscular injection, the antibody titers of HA protein and virus in serum were confirmed by ELISA, and the neutralizing antibody titers were confirmed by HI assay.
  • the titer of the antibody was confirmed to increase in proportion to the amount of the administered antigen, and when the Alum adjuvant was added, it was confirmed that the antibody titer was generally higher. In addition, there was no significant difference in antibody titer against HA protein and antibody titer against H1N1 virus.
  • the protective immune effect against influenza virus was higher in the experimental group with the adjuvant compared to the experimental group administered with the antigen alone at all concentrations.
  • the test group administered with the antigen alone was 80% of the 0.1ug test group. Survival rate was shown, and the experimental group administered with the adjuvant showed 100% survival rate.
  • the 0.05ug experimental group showed 60% survival rate in the experimental group administered with antigen alone, and the experimental group administered with the adjuvant showed 100% survival rate.
  • the HI titer was different in the 0.1ug experimental group, but the difference in the protective immune effect was small according to the presence or absence of an adjuvant.
  • the final antigen concentration was determined to be 0.05 ug, which shows a large difference depending on the presence or absence of adjuvant. Animal experiments were conducted to confirm the effect of the adjuvant using this.
  • Example 3 H1N1 The vaccine as an antigen CT120 and CT149 The effect of adjuvant
  • the mouse form antibody was prepared by replacing the constant region of the Fc region with the IgG1 or IgG2a region of the mouse in human IgG1 form CT120, CT149.
  • CT120 and CT120 were selected through the preliminary experiments (not prepared herein), the concentration showing the effect as an adjuvant.
  • H1N1 vaccine cell based
  • various concentrations of therapeutic antibodies were mixed with various concentrations of therapeutic antibodies and reacted at 37 ° C. for 1 hour
  • the mice were injected intramuscularly twice every two weeks as shown in Table 5 below, and then 13 days from the first intramuscular injection.
  • serum was collected from each experimental group to confirm antibody titer of H1N1 virus through serum ELISA and neutralizing antibody titer by HI assay.
  • the antibody titer against H1N1 virus was generally higher in the experimental group using the mouse form CT120 (mIgG2a) as an adjuvant than the experimental group using the CT120 as an adjuvant.
  • CT120 mouse form CT120
  • the antibody titer was generally higher than the experimental group using Alum as an adjuvant, and the antibody titer was sharply increased in serum (D20 in FIG. 5) taken after the first 3 weeks of immunity. It was confirmed.
  • the HI titer was increased up to 4 times according to the concentration in the experimental group using CT120 (mIgG2a) as an adjuvant as compared to the experimental group using the CT120 as an adjuvant.
  • CT120 (mIgG2a) has a higher effect as an adjuvant than CT120, it was confirmed that the best effect when administered at a concentration of 0.5ug.
  • the adjuvant effect of the CT149 was generally weak, and the antibody titer similar to the experimental group using the Alum adjuvant was shown in the experimental group using 0.5 ug of CT149 (mIgG2a).
  • HI titer was not significantly increased in the experimental group using CT149 or CT149 (mIgG2a) as an adjuvant, and similar to the results of antibody titers measured by ELISA, 0.5 ug of CT149 (mIgG2a) was used.
  • the experimental group (Group 10) showed the same HI titer as the experimental group (Group 11) using Alum adjuvant.
  • CT120 (mIgG2a) showed the highest adjuvant effect against H1N1 vaccine. Among them, the most effective result was 0.5ug. In the case of CT149 (mIgG2a), an adjuvant effect was seen using 0.5ug, but it was lower than CT120 (mIgG2a).
  • Example 4 H3N2 The vaccine as an antigen CT120 and CT149 The effect of adjuvant
  • H3N2 vaccine (cell based) was produced using another influenza virus strain, Philippines / 2/82 (H3N2). Afterwards, animal experiments were conducted to confirm the adjuvant effects of CT120 and CT149 on the H3N2 vaccine.
  • H3N2 vaccine was administered alone from 0.01ug to 1ug or with Alum adjuvant, and then antibody titer was confirmed by ELISA and neutralizing antibody titer was confirmed by HI.
  • the mouse adapted Philippines / 2/82 (H3N2) virus was infected to confirm the change in survival rate and weight.
  • H3N2 vaccine 0.05 ug - i.m. 5
  • Group 11 H3N2 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 5
  • Group 12 H3N2 vaccine 0.01 ug - i.m. 5
  • Group 13 H3N2 vaccine 0.01 ug Alum i.m. 5
  • H3N2 vaccine composition After the intramuscular injection of H3N2 vaccine composition into the mouse twice at intervals of 2 weeks as shown in Table 9 above, the immune response induced in each experimental group was confirmed. Two weeks after each intramuscular injection, serum was collected from each experimental group, and antibody titers against H3N2 virus in serum were confirmed by ELISA, and neutralizing antibody titers were confirmed by HI assay.
  • the titer of the antibody was increased in proportion to the amount of the administered antigen, and when the Alum adjuvant was added together, the titer of the antibody was generally higher.
  • HI titer was higher in the experimental group to which the Alum was added as compared to the experimental group to which only the antigen was added.
  • HI titers could not be identified in the experimental groups (groups 12 and 10) in which 0.01ug and 0.05ug of antigen were added, but the HI titers were 160 and 640 in the experimental groups in which Alum, an adjuvant, was added. It confirmed that it rises.
  • H3N2 vaccine composition the difference in HI titer and survival rate according to the presence or absence of an adjuvant was shown at the antigen concentration (0.05ug) used in the H1N1 experiment performed in Example 3. Therefore, an animal experiment confirming the effect of the adjuvant of the therapeutic antibodies CT120 and CT149 using the H3N2 antigen concentration 0.05ug determined therefrom was carried out in the same manner as in Example 3, and the adjuvant of CT120 and CT149 using the H3N2 vaccine as an antigen. The effect as was confirmed.
  • the hypothesis that the therapeutic antibody exhibits an adjuvant effect against the flu vaccine is that the immune response to the flu vaccine can be more efficiently generated by binding the Fc portion of the antibody to the Fc receptor present in immune cells.
  • CT120 (mIgG2a) administration group As shown in Table 11, in the case of CT120 (mIgG2a) administration group, the experiment was conducted at 0.1ug and 0.5ug, concentrations showed the best effect as an adjuvant of the H1N1 vaccine in Example 3, CT120 (mIgG2a) F (ab ' 2)
  • the amount of CT120 (mIgG2a) F (ab ') 2 is equal to the molar ratio between the group receiving the same amount as CT120 (mIgG2a) and the vaccine substance at 0.5ug, 0.1ug of CT120 (mIgG2a).
  • mice After reacting the H1N1 vaccine with various concentrations of CT120 (mIgG2a) or CT120 (mIgG2a) F (ab ') 2 for 1 hour at 37 ° C, the mice were injected intramuscularly twice every two weeks as shown in Table 11 above. , The immune response induced in each experimental group was confirmed. Serum was collected from each experimental group 13, 20, and 27 days after the first intramuscular injection to identify antibody titers against H1N1 virus through serum ELISA and neutralizing antibody titers against H1N1 virus through HI.
  • the antibody titer was relatively low when CT120 (mIgG2a) F (ab ') 2 was added, but the difference in antibody titer did not show a significant difference in all experimental groups.
  • Group Ag Adjuvant Survival rate (%) Group 1 PBS - 0% Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20% Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) F (ab ') 2 0.5 ug 0% Group 4 PBS CT 120 ( mIgG2a 0.5 ug 0% Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80% Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a 0.5 ug 100% Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 90% Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F (ab ') 2 0.5 ug 50% Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F (ab ') 2 0.3 ug 30% Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG
  • CT120 (mIgG2a) F The experimental group (groups 8 to 11) to which ab ') 2 was added as an adjuvant showed a similar survival rate to the experimental group to which the antigen was administered alone (group 2).
  • Example 5 it was confirmed that the Fc portion of the flu antibody plays an important role in the role of an adjuvant. Based on this, animal experiments were conducted to discover cells whose immune response is changed by binding to the Fc region among the immune cells expressing the Fc receptor. The amount of antibody was selected in Example 3 0.5ug of CT120 (mIgG2a) of the mouse form showing the best effect as an adjuvant of the H1N1 vaccine.
  • mice After mixing the H1N1 vaccine and the adjuvant and reacted for 1 hour at 37 °C, as shown in Table 14 above, the mouse was injected into the muscle twice every two weeks. After that, one day, three days, and seven days later, each mouse was isolated from the spleen and the furrow lymph nodes, and various immune cell numbers and ratios were identified.
  • CT120 adjuvant enhances the immune response of B cells through the Fc region.
  • CT120 F (ab ') 2 group the difference of the control group with the PBS-administered mouse was not found. Therefore, the importance of the Fc region was confirmed once more. From this, CT120 immunoadjuvant was found to enhance immunogenicity of H1N1 vaccine substance by a mechanism different from that of Alum, a commercially available adjuvant.
  • Example 6-1 it was confirmed that the CT120 adjuvant enhances B cell immunity. Based on this, animal experiments were conducted to determine whether CT120 immunoadjuvant could be involved in B cell defense immunity even in the presence of virus.
  • B cells increased about 10% compared to the PBS control group in the experimental group administered with H1N1 vaccine and CT120.
  • the experimental group administered with Alum in the vaccine also increased significantly compared to the PBS control group, but the percentage of B cells did not increase significantly compared to the experimental group containing CT120.
  • the other groups contained B-1 cells (CD19 + B220-), immature B cells, the experimental group injected with CT120 in the H1N1 vaccine showed more mature B-2 cells (CD19). Only + B220 +). In the case of lymph nodes, the proportion of B cells did not increase rapidly as seen in the spleen, but it was confirmed that the increase was significant in three replicates.
  • CT120 was confirmed to be effective as an adjuvant of the flu vaccine, and then the experiment was conducted to compare this effect with the effect of the adjuvant currently used in the flu vaccine.
  • the adjuvant used in the current seasonal flu vaccine is MF59, which is used for Novadis Fluad.
  • AddaVax TM InvivoGen, Catalog # vac-adx-10) having the same composition as MF59 was used.
  • Example 3 0.5ug and 0.1ug of CT120 (mIgG2a) of a mouse form showing the best effect as an adjuvant of the H1N1 vaccine were selected.
  • Addvax 100% means the amount of adjuvant to enter the HA content of 45ug of seasonal flu vaccine.
  • H1N1 vaccine was mixed with CT120 (mIgG2a) or Addvax having the same composition as commercialized adjuvant and reacted at 37 ° C for 1 hour, the mice were injected intramuscularly twice every two weeks as shown in Table 16 above. Immune response induced in the experimental group was confirmed. Serum was collected from each experimental group 13, 20, and 27 days after the first intramuscular injection to identify antibody titers against H1N1 virus through serum ELISA and neutralizing antibody titers against H1N1 virus through HI.
  • Group Ag Adjuvant HI titer Group 1 PBS - N.D.
  • Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20
  • H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 160
  • H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a 0.5 ug 160
  • H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 80
  • Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 100% 160
  • Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 10% 20
  • the Addvax 100% test group (Group 8) showed HI titer similar to the experimental groups (Groups 6 and 7) in which 0.5ug and 0.1ug of CT120 (mIgG2a) was administered.
  • The% administration groups (groups 10 and 9) had no similar or HI titer as the experimental group (group 2) administered with the H1N1 vaccine alone.
  • Group Ag Adjuvant Survival rate (%) Group 1 PBS - 0 Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20 Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) Fab 0.5 ug 0 Group 4 PBS Addvax 100% 0 Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80 Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a 0.5 ug 100 Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 90 Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 100% 90 Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 10% 60 Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax One% 0

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Abstract

본 발명은 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물은 백신의 효과를 증대시키는 것을 확인하였으므로, 백신 투여 시 면역 반응을 증가시키는 애주번트(adjuvant)로서 사용할 수 있으며, 바이러스로 인한 질환의 예방에 매우 유용하다.

Description

1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물
본 발명은 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 백신에 의해서 유도되는 면역 반응을 증대시켜서 백신의 효능을 증가시키는 애주번트로서의 용도를 갖는, 인플루엔자 바이러스에 대하여 중화 활성을 가지는 1 이상의 인간 단일클론 항체를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함한 백신 조성물에 관한 것이다..
독감은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)가 호흡기에 감염되며 나타나는 질병으로 겨울철에 흔하게 나타나며, 감염성이 매우 높아 전 연령층을 대상으로 쉽게 전파되는데 특히 노약자층이 취약한 것으로 알려져 있다(Treanor J, 2004, N Engl J Med . 350(3):218-20). 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지는 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C 그룹으로 분류되며 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)의 경우 주요 표면 단백질인 HA(hemagglutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 17 종의 HA와 10 종의 NA가 알려져 있다(Cheung TK and Poon LL 2007, Ann N Y Acad Sci. 1102:1-25; Tong S, et al. 2012, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:4269-4274). 인플루엔자 바이러스는 종류에 따라 조류, 돼지 및 사람에 감염될 수 있다는 특성과 RNA 분절로 되어 있는 유전체로 인하여 다양한 유전자의 조합과 돌연변이로 계속해서 변종 바이러스가 발생한다(Treanor J, 2004. N Engl J Med. 350(3):218-20). 이런 지속적인 변이로 인하여 영구적인 면역력을 얻기가 힘들므로 현재 가장 효과적이라고 생각되는 예방법은 매년 유행할 것으로 예측되는 인플루엔자 바이러스에 대한 백신(vaccine)을 접종하여 특정 타입(type)에 맞는 면역력을 매년 형성시키는 것이다.
현재 매년 접종하고 있는 인플루엔자 바이러스 백신은 3가 혹은 4가 백신으로 influenza A의 H1과 H3 subtype의 HA와 1종류 혹은 2종류의 influenza B type의 HA를 섞어 사용하고 있다.
인플루엔자 바이러스 백신을 포함한 여러 감염성 질환의 백신에 면역원성을 증가시키기 위한 물질을 첨가는 경우가 있는데, 이를 애주번트(adjuvant)라고 한다. 사람에게 사용이 승인된 애주번트(adjuvant)는 aluminium hydroxide와 aluminium phosphate로 구성되어 있는 Alum 과 Oil-in-water emulsions을 가지는 MF59, AS03과 TLR4 agonist인 MPL와 aluminium hydroxide로 구성된 AS04가 있다. (Rappuoli R, 2011. Nature Reviews Immunology 11, 11(12):865-72)
위에 언급된 물질 이외에도 항체를 항원과 함께 투여함으로 인해서 면역 반응을 증대시키는 보고들이 있으며, 항체를 애주번트(adjuvant)로 사용하고자 하는 시도들이 수행되고 있다.
기존에 본 출원인이 특허출원한 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체는 다양한 인플루엔자의 subtype에 대하여 중화 효능을 보였으며, 특히 대한민국 특허출원 제10-2011-0020061호에 개시된 항체는 주로 계통발생 그룹 1(H1, H2, H5, H9 등)에, 대한민국 특허출원 제10-2012-0107512호에 개시된 항체는 주로 계통발생 그룹 2 (H3, H7 등)에 중화 효능을 나타내었다. 이에 두 종류 이상의 항체를 섞어 동시에 투여함으로써 유행할 가능성이 있는 그룹 1과 그룹 2에 속한 바이러스에 대하여 모두 예방과 치료 효과를 보일 수 있는 칵테일 제제를 개발하였고, 대한민국 특허출원 제 10-2014-0036601호에 개시하였다.
본 발명자는 백신 투여 시에 본 발명자가 기 개발한 인플루엔자 바이러스 중화 항체를 함께 투여함으로써 백신의 효과를 증대할 수 있음을 확인하여 기 개발 항체의 애주번트로서의 새로운 용도를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트(adjuvant) 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 애주번트 조성물을 숙주에 투여하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 백신 조성물을 숙주에 투여하여 면역화하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 백신 조성물을 숙주에 투여하여 면역화된 숙주로부터 면역학적 산물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트(adjuvant) 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는
i) HA1 폴리펩티드의 위치 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312 및 318 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는 에피토프; 및
ii) HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60 및 99로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는 에피토프
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프임을 특징으로 하는 애주번트 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 318의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 318의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및/또는 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58 및 99의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 27, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 54, 55, 278, 291 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57 및 60의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 33, 310, 311, 및 312의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 에피토프의 아미노산 위치 넘버링(numbering)은 H3 HA 넘버링(H3 numbering system)에 기초한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 결합 분자; 및
ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 결합 분자
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 결합 분자이다.
본 발명에 있어서, 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합 분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는
i) 서열번호 13의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 분자; 및
ii) 서열번호 15의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 16의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 분자
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 결합 분자는 세포 표면의 Fc 수용체에 결합되는 결합 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 표적 항원은 바이러스 항원일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 항원이다. 상기 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 항원을 포함한다. 상기 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티닌(HA) 또는 뉴라미니다제(NA)일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로서, 상기 백신 조성물은 항원과 상기 애주번트 조성물의 중량비가 1:0.02 내지 1:200으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:20으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항원과 애주번트 조성물의 중량비는 면역원성 활성 조절을 위해 감소 또는 증가될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로서, 상기 애주번트 조성물 외에 추가적인 애주번트 조성물이 첨가된 백신 조성물을 제공한다. 상기 추가적인 애주번트 조성물은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 알럼(Alum), 대사가능한 오일(예를 들어, 스쿠알렌), 토콜(예를 들어, 알파-토코페롤), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), 사포닌(예를 들어, QS21), Toll like receptor의 라이간드(예를 들어, poly(I:C), CpG 모티프를 가지는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 LPS 유도체(예를 들어, 3D-MPL)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 애주번트 조성물을 숙주에 투여하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 방법을 제공한다. 상기 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로서, 상기 면역 반응은 Fc 수용체를 세포 표면에 가지는 세포에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 대상에 상기 애쥬번트 조성물을 포함한 백신 조성물을 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 유래 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 바이러스 유래 질환은 인플루엔자 바이러스 유래 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 숙주에 투여하여 면역화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 상기 백신 조성물을 숙주에 투여하여 면역화하는 단계; 및
b) 상기 면역화된 숙주로부터 면역학적 산물을 수득하는 단계
를 포함하는 면역학적 산물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로서, 상기 면역학적 산물이 T 세포, B 세포, 또는 항체일 수 있다. 또한 상기 면역학적 산물은 B 세포와 같이 Fc 수용체를 세포 표면에 가지는 다른 종류의 세포, 예컨대 호중구, 대식세포, 자연살해세포 또는 수지상 세포일 수 있다
이하 본 발명에서 사용된 용어를 다음과 같이 정의한다.
본 발명에 기재된 "인플루엔자 바이러스(influenza A virus)"는 오르쏘믹소바이러스 (Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지고, A, B 및 C 그룹으로 분류되며, 주요 표면 단백질인 HA(hemaggutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 17종의 HA와 10종의 NA가 알려져 있다.
본 발명에 기재된 "H1 서브타입"에는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9 및 H1N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H2 서브타입"에는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9 및 H2N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H5 서브타입"에는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9 및 H5N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H9 서브타입"에는 H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 및 H9N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H3 서브타입"에는 H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9 및 H3N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H7 서브타입"에는 H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9 및 H7N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "헤마글루티닌(hemagglutinin, 이하 "HA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피(envelope) 당단백질을 나타낸다. HA는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 흡착하여 침투하는 것을 매개한다. 현재까지 17 종류의 서브타입이 보고되어 있다.
본 발명에 기재된 "뉴라미니다제(neuraminidase, 이하 "NA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피(eveolope) 당단백질을 나타낸다. NA는 인플루엔자 바이러스가 증식한 뒤 확산할 때 중요하게 역할을 한다. 현재까지 10 종류의 서브타입이 보고되고 있다.
본 발명에 기재된 "인플루엔자 백신(influenza vaccine)"은 계절 또는 판데믹(pandemic) 인플루엔자를 예방하는 가장 좋은 방법으로, 크게 생백신과 비활성화백신으로 나누어진다. 생백신은 약독화 생백신(live attenuated vaccine)이 개발되어 사용되고 있다. 비활성화백신은 부화란 혹은 세포배양에서 배양한 바이러스를 정제하여 포르말린 등으로 비활성화시킨 바이러스 전체를 사용하는 전바이러스 백신(whole virus vaccine), 에테르 등으로 바이러스 외피를 분쇄시킨 분할 백신(split vaccine), HA와 NA 성분을 정제한 아단위 백신(subunit vaccine)등이 있다. 인플루엔자 A 그룹의 H1과 H3 subtype과 함께 인플루엔자 B 그룹을 한 종류 포함하는 백신은 3가 백신, 두 종류의 인플루엔자 B 그룹을 포함하는 백신은 4가 백신이라고 한다.
본 발명에 기재된 “인플루엔자 백신”은 3가, 4가의 계절성, 판데믹의 생백신과 비활성화백신을 모두 포함한다.
본 발명에 기재된 “결합 분자”는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 이뮤노글로블린의 Fc 부분의 가지는 융합 단백질 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로블린, 예를 들면 인플루엔자 A 바이러스의 단량체 HA 또는 삼량체 HA와의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인 또는 기질과 결합 가능한 효소, 수용체, 단백질을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 기재된 “항원-결합 단편”은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 기재된 “애주번트(Adjuvant)”는 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 및/또는 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말하는 것이다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "애주번트(adjuvant)"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트(adjuvant)에 통합되거나 상기 애주번트(adjuvant)와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트(adjuvant)는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다.
본 발명에 기재된 “면역학적 산물”은 항원 및/또는 애주번트 조성물의 투여에 의해 면역화된 숙주로부터 발생하는 방어 면역 매개 물질 또는 세포 등을 의미하며, 예를 들어, 활성화된 T세포, B세포 또는 항체 등을 의미할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 기재된 "약제학적으로 허용가능한 부형제"라는 용어는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에 기재된 “유효한 양”이라는 용어는 인플루엔자 A 바이러스의 백신과 함께 투여 시에, 백신의 효과를 증대시키는 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본 발명에서는 기 특허출원(대한민국 특허출원 제10-2011-0020061호, 대한민국 특허출원 제10-2012-0107512, 대한민국 특허출원 제10-2014-0036601호)된 항체들이 인플루엔자 백신 접종 시에, 면역반응을 증가시킴을 mouse 실험에서 확인함으로써 기 개발 항체들이 애주번트로서의 새로운 용도를 가짐을 확인하였다. 본 출원인이 기출원한 대한민국 특허출원 제10-2011-0020061호, 대한민국 특허출원 제10-2012-0107512호 및 대한민국 특허출원 제10-2014-0036601호는 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
본 발명의 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물은 백신의 효과를 증대시키는 것을 확인하였으므로, 백신 투여 시 면역 반응을 증가시키는 애주번트(adjuvant)로서 사용할 수 있으며, 바이러스로 인한 질환의 예방에 매우 유용하다.
도 1은 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 1 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 17일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 2는 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 3 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 28일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 HA 단백질과 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 3은 면역화된 mouse에 H1N1 influenza virus를 10MLD50로 접종한 뒤, 면역화된 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 5 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 5은 면역화된 mouse에 H1N1 influenza virus를 10MLD50로 접종한 뒤, 면역화된 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 7 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 7은 면역화된 mouse에 H1N1 influenza virus를 10MLD50로 접종한 뒤, 면역화된 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 H3N2 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 9 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H3N2 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 9은 면역화된 mouse에 H3N2 influenza virus를 10MLD50로 접종한 뒤, 면역화된 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 11 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 11은 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 14 참조), 두 번째 근육 주사 1일, 3일, 7일 후에 비장 내 면역 세포 중 B 세포가 차지하는 비율을 확인한 결과이다.
도 12은 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 14 참조), 두 번째 근육 주사 1일, 3일, 7일 후에 샅고랑림프절 내 면역 세포 중 B 세포가 차지하는 비율을 확인한 결과이다.
도 13는 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 15 참조), 두 번째 근육 주사로부터 4주 후에 H1N1 virus를 접종하여 1일, 3일 뒤 비장과 체내 림프절 내 B 세포의 비율을 확인한 결과이다.
도 14는 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하고(표 16 참조), 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 혈청을 채취하여 혈청 내 H1N1 influenza virus에 대한 특이 항체 역가를 ELISA로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 인플루엔자 바이러스 중화 항체의 백신 애주번트 효과 확인
1-1. ELISA 실험
하기의 표 1과 같이 치료용 항체인 CT120 항체와 CT149 항체가 인플루엔자 바이러스 백신의 애주번트로서의 효과가 있는지를 확인하기 위하여 동물 실험을 수행하였다. 하기의 표 1과 마찬가지로 H1N1 split 백신 0.2ug를 단독으로 투여하거나, 대표적으로 사용하는 애주번트(adjuvant)인 Alum(1mg) 면역보조제와 같이 투여하거나, CT120 항체(0.5ug, 1ug, 5ug, 10ug) 또는 CT149 항체(0.5ug, 1ug, 5ug, 10ug)를 면역보조제로 함께 투여한 후 mouse에서 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 역가를 확인하였다.
Group Antigen Adjuvant Route Mouse #
Group1 PBS - i.m. 4
Group2 PBS CT 120 10 ug i.m. 4
Group3 PBS CT 149 10 ug i.m. 4
Group4 H1N1 split vaccine 0.2 ug - i.m. 4
Group5 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT 120 10 ug i.m. 4
Group6 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT 120 5 ug i.m. 4
Group7 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT120 1 ug i.m. 4
Group8 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT120 0.5 ug i.m. 4
Group9 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 10 ug i.m. 4
Group10 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 5 ug i.m. 4
Group11 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 1 ug i.m. 4
Group12 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 0.5 ug i.m. 4
Group13 H1N1 split vaccine 0.2 ug Alum i.m. 4
상기의 표 1과 같이 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 각각의 실험군에서 유도되는 면역 반응을 확인하였다. 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 17일, 27일 후에 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여, 항체의 역가를 ELISA를 통해서 확인하였다.
도 1의 결과와 같이, 백신만을 투여한 그룹에 비해서 CT120, CT149, 또는 Alum을 백신과 함께 투여한 그룹이 전체적으로 투여한 백신에 해당하는 바이러스를 감지할 수 있는 항체 생성이 많음을 확인할 수 있었다. 백신과 애주번트 투여 후 27일 후 항체의 양을 비교하였을 때, CT120 5ug 또는 CT149 10ug을 투여한 그룹은 Alum를 투여한 그룹과 비슷한 항체 생성을 보였으며, CT149 1ug 또는 0.5ug을 투여한 그룹은 Alum를 투여한 그룹과 비교하여 더 많은 항체가 생성됨을 확인하였다.
1-2. 혈구응집반응실험(HI assay, hemaglutinin inhibition assay)
하기의 표 2와 같이 치료용 항체인 CT120 항체와 CT149 항체가 인플루엔자 바이러스 백신의 애주번트로서의 효과가 있는지를 확인하기 위하여 혈구응집반응실험(HI assay, hemaglutinin inhibition assay)을 통해서 백신의 유효성을 평가하였다. 백신과 애주번트 투여 후 13일, 17일, 27일 후에 mouse로부터 혈청을 얻어, 인플루엔자 바이러스와 치킨 적혈구의 응집 반응을 억제할 수 있는 항체 역가를 확인하였다.
Group Antigen Adjuvant HI titer
Day 13 Day 17 Day 27
Group1 PBS - N.D. N.D. N.D.
Group2 PBS CT 120 10 ug N.D. N.D. N.D.
Group3 PBS CT 149 10 ug N.D. N.D. N.D.
Group4 H1N1 split vaccine 0.2 ug - N.D. N.D. 40
Group5 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT 120 10 ug N.D. N.D. 40
Group6 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT 120 5 ug N.D. N.D. 80
Group7 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT120 1 ug N.D. N.D. 40
Group8 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT120 0.5 ug N.D. N.D. 40
Group9 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 10 ug N.D. N.D. 80
Group10 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 5 ug N.D. N.D. 40
Group11 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 1 ug N.D. 40 160
Group12 H1N1 split vaccine 0.2 ug CT149 0.5 ug N.D. N.D. 160
Group13 H1N1 split vaccine 0.2 ug Alum N.D. 20 80
도 1의 결과와 동일하게, 백신과 애주번트 투여 후 27일 후 항체의 양을 비교하였을 때, CT120 5ug, CT149 10ug을 투여한 그룹(그룹 6 및 9)은 Alum를 투여한 그룹(그룹 13)과 비슷한 HI titer를 보였으며, CT149 1ug, 0.5ug을 투여한 그룹(그룹 11 및 12)은 Alum를 투여한 그룹과 비교하여 더 많은 HI titer를 보였다.
CT120 혹은 CT149를 인플루엔자 바이러스 백신 투여 시 함께 투여해주면, 애주번트인 Alum과 비슷한 혹은 더 좋은 면역원성 증강 효과를 확인하였다. 이로써, CT120 및 CT149가 인플루엔자 바이러스 백신의 애주번트로서 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 2: H1N1 백신을 항원으로 하여 CT120 과 CT149 의 면역보조제 효과를 확인하기 위한 항원 농도 결정
2-1. 항체 생성 결과
하기의 표 3과 같이, 치료용 항체의 면역보조제 효과를 검증하기에 앞서 적절한 항원 농도 결정을 위한 동물 실험을 앞서 수행하였다. H1N1 백신(cell based)을 0.01ug에서 1ug까지 단독으로 투여하거나 Alum 면역보조제와 같이 투여한 후 ELISA를 통해 항체 역가를 확인하고 HI를 통해 중화 항체 역가를 확인하였다. Standard는 판매되고 있는 3가 백신으로 실험 결과의 비교를 위해 진행하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 5
Group 2 H1N1 vaccine 1 ug - i.m. 5
Group 3 H1N1 vaccine 1 ug Alum i.m. 5
Group 4 Standard 3 ug - i.m. 5
Group 5 H1N1 vaccine 0.5 ug - i.m. 5
Group 6 H1N1 vaccine 0.5 ug Alum i.m. 5
Group 7 H1N1 vaccine 0.2 ug - i.m. 5
Group 8 H1N1 vaccine 0.2 ug Alum i.m. 5
Group 9 H1N1 vaccine 0.1 ug - i.m. 5
Group 10 H1N1 vaccine 0.1 ug Alum i.m. 5
Group 11 Standard 0.3 ug - i.m. 5
Group 12 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 5
Group 13 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 5
Group 14 H1N1 vaccine 0.01 ug - i.m. 5
Group 15 H1N1 vaccine 0.01 ug Alum i.m. 5
Group 16 Standard 0.03 ug - i.m. 5
상기의 표 3과 같이 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 각각의 실험군에서 유도되는 면역 반응을 확인하였다. 첫 번째 근육 주사로부터 28일 후에 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여, 혈청 내 HA 단백질과 virus에 대한 항체 역가를 ELISA를 통해서 확인하고, 중화 항체 역가를 HI assay를 통해 확인하였다.
도 2의 결과와 같이, 항체의 역가는 투여된 항원의 양에 대체적으로 비례하여 증가되는 것을 확인할 수 있었고, Alum 면역보조제를 같이 넣어준 경우에 대체적으로 항체 역가가 더 높게 나오는 것을 확인하였다. 또한 HA 단백질에 대한 항체 역가와 H1N1 virus에 대한 항체 역가의 차이는 크게 나타나지 않았다.
Group HI titer
Group 1 PBS N.D.
Group 2 H1N1 1 ug 160
Group 3 H1N1 1 ug + alum 1280
Group 4 Standard 3 ug 80
Group 5 H1N1 0.5 ug 160
Group 6 H1N1 0.5 ug + alum 320
Group 7 H1N1 0.2 ug 80
Group 8 H1N1 0.2 ug + alum 160
Group 9 H1N1 0.1 ug 20
Group 10 H1N1 0.1 ug + alum 160
Group 11 Standard 0.3 ug N.D.
Group 12 H1N1 0.05 ug 20
Group 13 H1N1 0.05 ug + alum 80
Group 14 H1N1 0.01 ug N.D.
Group 15 H1N1 0.01 ug + alum N.D.
Group 16 Standard 0.03 ug N.D.
상기의 표 4의 결과와 같이, 항원만을 넣어준 실험군에 비해 Alum을 같이 넣어준 실험군에서의 HI titer가 증가되는 결과를 확인하였다. 또한, 항원 농도 0.1ug 실험군(그룹 9 및 10)과 항원 농도 0.05ug 실험군(그룹 12 및 13)에서는 항원만을 넣었을 때에 비해 면역보조제인 Alum을 넣어주었을 때의 HI titer가 각각 8배, 4배 상승하여, 면역보조제의 유무에 따라서 백신 효과의 차이를 명확하게 확인할 수 있었다.
2-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인하였다.
도 3의 결과와 같이, 모든 농도에서 항원 단독으로 투여한 실험군에 비해 면역보조제가 있는 실험군에서 인플루엔자 바이러스에 대한 방어면역 효과가 높은 것을 확인하였다. 또한, HI titer 결과에서 면역보조제의 유무에 따라서 백신 효과의 차이가 많이 보였던, 두 가지 항원 농도(0.1ug과 0.05ug)의 실험군 결과에서는 0.1ug 실험군의 경우 항원 단독으로 투여한 실험군이 80%의 생존율을 보였고, 면역보조제와 같이 투여한 실험군에서는 100%의 생존율을 나타내었다. 반면, 0.05ug 실험군의 경우 항원 단독으로 투여한 실험군의 경우 60%의 생존율을 보였고, 면역보조제와 같이 투여한 실험군에서는 100%의 생존율을 나타내었다.
2-3. 소결
HI titer 결과와 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역 효과를 종합적으로 판단하였을 때, 0.1ug 실험군의 경우 HI titer는 차이가 나지만 방어 면역 효과에서 면역보조제의 유무에 따른 차이가 적어 HI titer와 방어 면역에서의 면역보조제 유무에 따른 차이가 크게 나타나는 0.05ug을 최종 항원 농도로 결정하였다. 이를 이용하여 면역보조제 효과를 확인하는 동물 실험을 진행하였다.
실시예 3: H1N1 백신을 항원으로 하여 CT120 과 CT149 의 면역보조제 효과 확인
3-1. H1N1 백신을 항원으로 하여 CT120의 면역보조제 효과 확인
3-1-1. 항체 생성 결과
항원 농도를 결정하기 위한 동물 실험 결과(실시예 2)로부터 결정된 항원농도 0.05ug을 이용하여, 치료용 항체인 CT120과 CT149의 면역보조제 효과를 검증하는 동물실험을 진행하였다. 다만 mouse 실험에서는 CT120과 CT149 항체의 mouse form인 CT120(mIgG2a)와 CT149(mIgG2a)의 면역보조제 효과가 CT120이나 CT149보다 더 효율적으로 나타날 수 있을 것이라 예상되어, CT120 및 CT149 및 이의 mouse form을 모두 이용하여 동물 실험 진행하였다.
상기 mouse form 항체는 human IgG1 form인 CT120, CT149에서 Fc region의 constant region을 mouse의 IgG1 혹은 IgG2a region으로 교체하여 제작되었다.
CT120 및 CT120(mIgG2a)의 양은 예비 실험(본 명세서에는 작성되어 있지 않음)을 통해서 면역보조제로서의 효과를 보인 농도를 선택하였다.
H1N1 백신(cell based)을 다양한 농도의 치료용 항체와 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 하기의 표 5와 같이 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여 혈청 내 ELISA를 통한 H1N1 virus에 대한 항체 역가와 HI assay를 통한 중화 항체 역가를 확인하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 10
Group 2 PBS CT 120 0.5 ug i.m. 10
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 4 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 10
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.05 ug i.m. 10
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.1 ug i.m. 10
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.5 ug i.m. 10
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.05 ug i.m. 10
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug i.m. 10
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 11 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 10
Group 12 Standard 0.15 ug - i.m. 10
도 4의 결과와 같이, H1N1 virus에 대한 항체 역가는 mouse form인 CT120(mIgG2a)를 면역보조제로 사용한 실험군에서 CT120을 면역보조제로 사용한 실험군에 비하여 전반적으로 높게 나타났다. 또한 CT120(mIgG2a)를 사용한 실험군의 경우, Alum을 면역보조제로 사용한 실험군보다도 전반적으로 항체 역가가 높게 나타났으며, 첫 번째 면역 3주 후에 채취한 혈청(도 5의 D20)에서 항체 역가가 급격히 높아지는 것을 확인하였다.
Ag Adjuvant HI titer
G1 PBS - N.D.
G2 PBS CT 120 0.5 ug N.D.
G3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug N.D.
G4 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20
G5 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.05 ug 40
G6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.1 ug 20
G7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 0.5 ug 20
G8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.05 ug 40
G9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 80
G10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug 160
G11 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80
G12 Standard 0.15 ug - N.D.
상기 표 6의 결과와 같이, 전반적으로 CT120을 면역보조제로 사용한 실험군에 비해 CT120(mIgG2a)를 면역보조제로 사용한 실험군에서 농도에 따라 최대 4배까지 HI titer가 높아졌다. 항체 역가에서 가장 높게 나왔던 CT120(mIgG2a) 0.5ug을 사용한 실험군(그룹 10)은 HI titer에서도 전 실험군 중에 가장 높은 HI titer인 160을 나타냈다.
3-1-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인하였다.
도 5의 결과와 같이, CT120(mIgG2a)을 면역보조제로 사용하였을 때, CT120을 면역보조제로 사용한 실험군이나 항원 단독으로 사용한 실험군에 비하여 생존율이 높았으며, 몸무게 변화 또한 가장 적은 폭으로 나타났다. 특히, 항체 역가와 HI titer에서 가장 높게 나온 CT120(mIgG2a) 0.5ug을 면역보조제로 사용한 실험군에서는 100%의 생존율을 보였으며, 이는 Alum을 면역보조제로 사용한 실험군에 비해서도 생존율이 30% 증가한 것이다.
이와 같은 결과를 통해, CT120(mIgG2a)가 CT120에 비하여 면역보조제로서의 효과가 더 높은 것을 확인하였으며, 0.5ug의 농도로 투여하였을 때에 효과가 가장 좋은 것을 확인하였다.
3-2. H1N1 백신 항원으로 하여 CT149의 면역보조제 효과 확인
3-2-1. 항체 생성 결과
하기의 표 7과 같이 CT149에 대한 예비 실험(본 명세서에는 작성되지 않음)에서 면역보조제로서의 효과를 보인 농도를 선정하여, 상기 실시예 3-1-1과 동일한 실험을 진행하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 10
Group 2 PBS CT 149 0.5 ug i.m. 10
Group 3 PBS CT 149 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 4 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 10
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.01 ug i.m. 10
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.05 ug i.m. 10
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.5 ug i.m. 10
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.01 ug i.m. 10
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.05 ug i.m. 10
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 11 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 10
Group 12 Standard 0.15 ug - i.m. 10
도 6의 결과와 같이, CT120과는 달리 CT149의 면역보조제 효과는 전반적으로 약하게 나타났으며, CT149(mIgG2a) 0.5ug을 사용한 실험군에서 Alum 면역보조제를 사용한 실험군과 비슷한 항체 역가를 보임을 확인하였다.
Ag Adjuvant HI titer
G1 PBS - N.D.
G2 PBS CT 149 0.5 ug N.D.
G3 PBS CT 149 ( mIgG2a ) 0.5 ug N.D.
G4 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20
G5 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.01 ug 20
G6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.05 ug 40
G7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 0.5 ug 20
G8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.01 ug 20
G9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.05 ug 40
G10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 149 ( mIgG2a ) 0.5 ug 80
G11 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80
G12 Standard 0.15 ug - N.D.
상기 표 8의 결과와 같이, CT149나 CT149(mIgG2a)를 면역보조제로 사용한 실험군에서 HI titer가 크게 높아지지 않았으며, ELISA로 측정한 항체 역가의 결과와 유사하게, CT149(mIgG2a) 0.5ug을 사용한 실험군(그룹 10)에서 Alum 면역보조제를 사용한 실험군(그룹 11)과 동일한 HI titer를 나타냈다.
3-2-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인하였다.
도 7의 결과와 같이, CT149(mIgG2a) 0.5ug을 면역보조제로 사용한 실험군에서 Alum보다 10% 높은 생존율인 80%의 생존율을 보였다. 몸무게 변화 폭도 Alum과 비교하여 크게 나아지지 않았다.
3-3. 소결
이와 같은 결과들을 종합해 본 결과, CT120(mIgG2a)가 H1N1 백신에 대해서는 가장 높은 면역보조제 효과를 나타내었으며 그 중에서도 0.5ug을 사용하였을 때, 효과가 가장 높게 나타났다. CT149(mIgG2a)의 경우, 0.5ug을 사용했을 때 면역보조제 효과가 보였으나 CT120(mIgG2a)에 비해서는 낮게 나타났다.
실시예 4: H3N2 백신을 항원으로 하여 CT120 과 CT149 의 면역보조제 효과 확인
H1N1 백신에 대한 CT120과 CT149의 면역보조제로서의 효과를 실시예 1 내지 3을 통하여 확인한 데 이어, 또 다른 influenza virus strain인 Philippines/2/82(H3N2)를 이용하여 H3N2 백신(cell based)을 생산한 후, 이를 이용하여 H3N2 백신에 대한 CT120과 CT149의 면역보조제 효과를 확인하기 위한 동물 실험을 진행하였다.
4-1. 항체 생성 결과
하기의 표 9와 같이, 치료용 항체의 면역보조제 효과를 검증하기에 앞서 적절한 항원 농도 결정을 위한 동물 실험을 진행하였다. H3N2 백신을 0.01ug에서 1ug까지 단독으로 투여하거나 Alum 면역보조제와 같이 투여한 후 ELISA를 통해 항체 역가를 확인하고 HI를 통해 중화 항체 역가를 확인하였다. 또한, 방어 면역 효과를 확인하기 위하여 mouse adapted Philippines/2/82(H3N2) virus를 감염시켜 생존율 및 몸무게의 변화 양상도 확인하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 5
Group 2 H3N2 vaccine 1 ug - i.m. 5
Group 3 H3N2 vaccine 1 ug Alum i.m. 5
Group 4 H3N2 vaccine 0.5 ug - i.m. 5
Group 5 H3N2 vaccine 0.5 ug Alum i.m. 5
Group 6 H3N2 vaccine 0.2 ug - i.m. 5
Group 7 H3N2 vaccine 0.2 ug Alum i.m. 5
Group 8 H3N2 vaccine 0.1 ug - i.m. 5
Group 9 H3N2 vaccine 0.1 ug Alum i.m. 5
Group 10 H3N2 vaccine 0.05 ug - i.m. 5
Group 11 H3N2 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 5
Group 12 H3N2 vaccine 0.01 ug - i.m. 5
Group 13 H3N2 vaccine 0.01 ug Alum i.m. 5
상기의 표 9와 같이 H3N2 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 각각의 실험군에서 유도되는 면역 반응을 확인하였다. 각 근육 주사 2주 후, 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여 혈청 내 H3N2 virus에 대한 항체 역가를 ELISA를 통해서 확인하고, 중화 항체 역가를 HI assay를 통해 확인하였다.
도 8의 결과와 같이, 항체의 역가는 투여된 항원의 양에 비례하여 증가되는 것을 확인할 수 있었고, Alum 면역보조제를 같이 넣어준 경우에 대체적으로 항체 역가가 더 높게 나오는 것을 확인하였다.
Group Ag Adjuvant HI titer
Group 1 PBS - N.D.
Group 2 H3N2 vaccine 1 ug - 160
Group 3 H3N2 vaccine 1 ug Alum 320
Group 4 H3N2 vaccine 0.5 ug - 160
Group 5 H3N2 vaccine 0.5 ug Alum 320
Group 6 H3N2 vaccine 0.2 ug - 80
Group 7 H3N2 vaccine 0.2 ug Alum 640
Group 8 H3N2 vaccine 0.1 ug - 80
Group 9 H3N2 vaccine 0.1 ug Alum 320
Group 10 H3N2 vaccine 0.05 ug - N.D.
Group 11 H3N2 vaccine 0.05 ug Alum 640
Group 12 H3N2 vaccine 0.01 ug - N.D.
Group 13 H3N2 vaccine 0.01 ug Alum 160
상기의 표 10의 결과와 같이 항원만을 넣어준 실험군에 비해 Alum을 같이 넣어준 실험군에서의 HI titer가 높은 것을 확인하였다. 또한, 항원 0.01ug와 0.05ug을 넣어준 실험군(그룹 12 및 10)에서는 HI titer를 확인할 수 없었지만, 면역보조제인 Alum을 함께 넣어준 실험군(그룹 13 및 11)에서는 HI titer가 각각 160, 640으로 상승하는 것을 확인하였다.
4-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 A/Philippines/2/82 H3N2 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율과 몸무게 변화를 확인하였다.
도 9의 결과와 같이, 저용량의 항원, 즉 항원 0.01ug와 항원 0.05ug를 단독 투여한 실험군을 제외한 실험군에서 면역반응 효과가 높은 것을 확인하였다.
4-3. 소결
H3N2 백신 조성물의 경우도, 실시예 3에서 수행한 H1N1 실험에서 사용한 항원 농도(0.05ug)에서 면역보조제의 유무에 따른 HI titer와 생존율의 차이를 나타내었다. 따라서 이로부터 결정된 H3N2 항원농도 0.05ug을 이용하여 치료용 항체인 CT120과 CT149의 면역보조제 효과를 확인하는 동물 실험을 실시예 3과 동일한 방법으로 진행함으로써 H3N2 백신을 항원으로 한 CT120 및 CT149의 면역보조제로서의 효과를 확인하였다.
실시예 5: 독감 백신의 면역보조제 역할에 대한 기작 연구
상기 실시예 1 내지 4의 실험으로부터 치료용 독감 항체가 독감 백신의 효과를 증진시키는 면역보조제로서의 역할을 한다는 결과를 얻었다. 따라서 이와 같은 면역보조제 효과를 발생시키는 기작을 연구하기 위한 동물 실험을 진행하였다.
치료용 항체가 독감 백신에 대한 면역보조제 효과를 보이는 기작에 대한 가설은 항체의 Fc 부분이 면역 세포에 존재하는 Fc 수용체에 binding함으로써 독감 백신에 대한 면역 반응이 더 효율적으로 일어날 수 있다는 것이다.
상기 가설을 증명하기 위해서, 실시예 3에서 면역보조제로서의 효과를 가장 뚜렷하게 보인 CT120(mIgG2a) 0.1ug와 0.5ug의 항체 농도를 선정하여, 온전한 형태의 CT120(mIgG2a)과 Fc 부분이 제거된 CT120(mIgG2a) F(ab')2을 표 11과 같이 다양한 양으로 0.05ug의 H1N1 백신과 반응시켜 mouse에 근육 주사한 후, 유도되는 면역 반응을 확인하였다.
5-1. 항체 생성 결과
하기의 표 11과 같이, CT120(mIgG2a) 투여군의 경우 실시예 3에서 H1N1 백신의 면역보조제로서 가장 좋은 효과를 보인 농도인 0.1ug과 0.5ug로 실험을 진행하였고, CT120(mIgG2a) F(ab')2 투여군의 경우 CT120(mIgG2a)과 동일한 양을 투여하는 그룹과 CT120(mIgG2a) 0.5ug, 0.1ug일 때의 백신 물질과의 molar ratio와 동일하도록 CT120(mIgG2a) F(ab')2의 양을 계산하여 투여하는 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 10
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 10
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug i.m. 10
Group 4 PBS CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 10
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug i.m. 10
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug i.m. 10
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.3 ug i.m. 10
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.1 ug i.m. 10
Group 11 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.06 ug i.m. 10
H1N1 백신을 다양한 농도의 CT120(mIgG2a) 혹은 CT120(mIgG2a) F(ab')2를 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기의 표 11과 같이 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 각각의 실험군에서 유도되는 면역 반응을 확인하였다. 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여 혈청 내 ELISA를 통한 H1N1 virus에 대한 항체 역가와 HI를 통한 H1N1 virus에 대한 중화 항체 역가를 확인하였다.
도 10의 결과와 같이, 항체의 역가는 CT120(mIgG2a) F(ab')2를 넣어준 경우에 상대적으로 낮게 나타나긴 했지만, 항체 역가의 차이는 모든 실험군에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다.
Group Ag Adjuvant Route HI titer
Group 1 PBS - i.m. N.D.
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 20
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug i.m. N.D.
Group 4 PBS CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. N.D.
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 160
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 160
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug i.m. 80
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug i.m. 40
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.3 ug i.m. 20
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.1 ug i.m. 20
Group 11 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.06 ug i.m. 40
상기의 표 12의 결과와 같이, CT120(mIgG2a) F(ab')2를 면역보조제로 사용한 모든 실험군(그룹 8 내지 11)에서의 HI titer는 면역보조제 없이 H1N1 백신을 단독으로 투여한 실험군(그룹 2)에서 나타나는 HI titer와 유사한 값을 나타냈다. 그에 비해, 온전한 모양의 CT120(mIgG2a)를 면역보조제로 사용한 실험군(그룹 6 및 7)은 HI titer가 각각 160과 80으로 H1N1 백신을 단독으로 투여한 실험군(그룹 2)에 비해서 HI titer가 8배, 4배 증가하였다.
5-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율을 확인하였다.
Group Ag Adjuvant Survival rate(%)
Group 1 PBS - 0%
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20%
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug 0%
Group 4 PBS CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug 0%
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80%
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug 100%
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 90%
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug 50%
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.3 ug 30%
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.1 ug 30%
Group 11 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.06 ug 30%
상기의 표 13의 결과와 같이, 온전한 모양의 CT120(mIgG2a)을 면역보조제로 넣어준 실험군(그룹 6 및 7)은 실시예 3에서와 같이 높은 생존율을 확인하였음에 비하여, CT120(mIgG2a) F(ab')2를 면역보조제로 넣어준 실험군(그룹 8 내지 11)은 항원을 단독으로 투여한 실험군(그룹 2)과 비슷한 생존율을 보이는 것을 확인하였다.
5-3. 소결
이와 같은 결과를 통해 항체의 Fc 부분이 독감 백신의 면역보조제로 역할을 하는데 중요하게 작용한다는 것을 확인하였다.
실시예 6: 독감 백신의 면역보조제의 타겟 면역 세포 발굴
6-1. 타겟 면역 세포 확인 결과
실시예 5에서 독감 항체의 Fc 부분이 면역보조제로서의 역할에 중요하게 작용함을 확인하였다. 이를 토대로, Fc 수용체를 발현하는 면역 세포 중 Fc 부위와 결합함에 따라 면역 반응이 달라지는 세포를 발굴하고자 동물 실험을 진행하였다. 항체의 양은 실시예 3을 통해서 H1N1 백신의 면역보조제로서 가장 좋은 효과를 보인 mouse form의 CT120(mIgG2a) 0.5ug을 선정하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse#
Group1 PBS - i.m 3
Group2 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m 3
Group3 - CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m 3
Group4 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m 3
Group5 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m 3
Group6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) F(ab')2 0.5 ug i.m 3
H1N1 백신과 면역보조제를 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기의 표 14와 같이, mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사하였다. 그로부터 1일, 3일, 7일 후에 각각의 mouse에서 비장과 샅고랑림프절을 분리하여 다양한 면역 세포 수와 비율을 확인하였다.
도 11 및 12의 결과와 같이, H1N1 백신과 CT120(mIgG2a)를 넣어준 경우, 두 번의 근육 주사 후 1일이 지난 시점에서 비장과 샅고랑림프절 모두에서 B 세포가 다른 투여군에 비해 약 2배 이상 증가되었음을 확인하였다. 3일과 7일에서는 비교적 유사한 정도의 세포 비율이 보였다.
이와 같은 결과를 통해, CT120 면역보조제는 Fc 부위를 통해 B 세포의 면역 반응을 증진시키는 것을 확인하였다. CT120 F(ab')2을 투여한 그룹의 경우, 대조군인 PBS를 투여한 mouse와 차이점을 발견할 수 없었기 때문에 Fc 부위의 중요성을 한 번 더 확인할 수 있었다. 이로부터 CT120 면역보조제는 상업화된 면역보조제인 Alum과는 상이한 기작으로 H1N1 백신 물질의 면역원성을 높이는 것을 알 수 있었다.
6-2. B 세포 방어 면역 결과
상기 실시예 6-1에서 CT120 면역보조제가 B 세포 면역을 증진시키는 것을 확인하였다. 이를 토대로, virus를 접종한 상태에서도 CT120 면역보조제가 B 세포 방어 면역에 관여할 수 있는지 확인하는 동물 실험을 진행하였다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse#
Group1 PBS - i.m 3
Group2 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m 3
Group3 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m 3
Group4 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m 3
상기의 표 15와 같이 H1N1 백신 조성물을 mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사 후, 4주 뒤에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하였다. 바이러스 감염으로부터 1일, 3일이 경과하였을 때, 각각의 mouse에서 비장과 체내 림프절을 분리하여 전체 세포 내에서 B 세포가 차지하는 비율을 유세포분석기로 확인하였다.
도 13의 결과와 같이 바이러스 감염 후 1일 째 비장을 분석한 결과, H1N1 백신과 CT120을 함께 투여한 실험군에서 PBS 대조군 대비 약 10% 정도 증가된 B 세포를 확인할 수 있었다. 백신에 Alum을 함께 투여한 실험군도 PBS 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였으나 CT120을 넣은 실험군보다 B 세포의 비율이 크게 증가하지 않았다. 또한, 다른 군들은 미성숙한 B 세포의 형태인 B-1 세포 (CD19 + B220-)가 존재하고 있지만 H1N1 백신에 CT120을 주사한 실험군은 B-1 세포에서 더 성숙한 형태의 B-2 세포 (CD19+B220+)만 존재하고 있다. 림프절의 경우, 비장에서 보이는 현상과 같이 B 세포의 비율이 급격하게 증가하지는 않았지만, 3회 반복 실험에서 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다.
6-3. 소결
이와 같은 결과를 통해, CT120을 면역보조제로 사용하게 되면 더 성숙한 형태의 B 세포가 빠르게 형성되는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 상업화 면역보조제와 CT120의 효과 비교
상기 실시예를 통해서 CT120가 독감 백신의 면역보조제로서 효과가 있음을 확인한 데 이어 이러한 효과를 현재 독감 백신에 사용되는 면역보조제의 효과와 비교하는 실험을 진행하였다. 현재 시판 중인 계절성 독감 백신에서 사용하는 면역보조제는 노바티스의 Fluad에 사용되는 MF59이다. 하기 비교 실험에서는 MF59와 동일한 조성을 가지고 있는 AddaVax ™ (InvivoGen, Catalog # vac-adx-10)를 사용하였다.
7-1. 항체 생성 결과
실시예 3에서 H1N1 백신의 면역보조제로서 가장 좋은 효과를 보인 mouse form의 CT120(mIgG2a) 0.5ug, 0.1ug을 선정하여 실험을 진행하였다. 하기 표 16에서 Addvax 100%는 계절성 독감 백신의 HA 함량 45ug에 들어가는 면역보조제의 양을 의미한다.
Group Ag Adjuvant Route Mouse #
Group 1 PBS - i.m. 10
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - i.m. 10
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) Fab 0.5 ug i.m. 10
Group 4 PBS Addvax 100% i.m. 10
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum i.m. 10
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug i.m. 10
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug i.m. 10
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 100% i.m. 10
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 10% i.m. 10
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 1% i.m. 10
H1N1 백신을 CT120(mIgG2a) 혹은 상업화된 면역보조제와 동일한 조성을 가진 Addvax와 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기의 표 16과 같이, mouse에 2주 간격으로 두 번 근육 주사한 후, 각각의 실험군에서 유도되는 면역 반응을 확인하였다. 첫 번째 근육 주사로부터 13일, 20일, 27일 후에 각각의 실험군에서 혈청을 채취하여 혈청 내 ELISA를 통한 H1N1 virus에 대한 항체 역가와 HI를 통한 H1N1 virus에 대한 중화 항체 역가를 확인하였다.
도 14의 결과와 같이, Addavax 100%를 투여한 실험군만이 CT120(mIgG2a)를 0.5ug, 0.1ug 투여한 실험군과 유사한 항체 역가를 나타내었고, Addavax 10%, 1%를 투여한 경우는 항체 역가가 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
Group Ag Adjuvant HI titer
Group 1 PBS - N.D.
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) Fab 0.5 ug N.D.
Group 4 PBS Addvax 100% N.D.
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 160
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug 160
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 80
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 100% 160
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 10% 20
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 1% N.D.
상기의 표 17의 결과와 같이, Addvax 100% 투여 실험군(그룹 8)은 CT120(mIgG2a)를 0.5ug, 0.1ug 투여한 실험군(그룹 6 및 7)과 유사한 HI titer를 보였지만, Addvax 1%, 10% 투여 실험군(그룹 10 및 9)은 H1N1 백신을 단독으로 투여한 실험군(그룹 2)과 유사 혹은 HI titer이 측정되지 않았다.
7-2. 방어 면역 결과
인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역을 확인하기 위해, 두 번째 면역 4주 후에 10MLD50의 CA/04/09 H1N1 virus를 면역화된 mouse 비강에 접종하여 감염시키고, 이후 15일 동안 상기 mouse의 생존율을 확인하였다.
Group Ag Adjuvant Survival rate(%)
Group 1 PBS - 0
Group 2 H1N1 vaccine 0.05 ug - 20
Group 3 PBS CT 120 ( mIgG2a ) Fab 0.5 ug 0
Group 4 PBS Addvax 100% 0
Group 5 H1N1 vaccine 0.05 ug Alum 80
Group 6 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.5 ug 100
Group 7 H1N1 vaccine 0.05 ug CT 120 ( mIgG2a ) 0.1 ug 90
Group 8 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 100% 90
Group 9 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 10% 60
Group 10 H1N1 vaccine 0.05 ug Addvax 1% 0
상기의 표 18의 결과와 같이, Addavax 100% 투여한 실험군(그룹 8)이 CT120(mIgG2a)를 0.5ug, 0.1ug 투여한 실험군(그룹 6 및 7)과 유사한 생존율을 보이는 것을 확인하였으며, Addvax 1%, 10% 투여 실험군(그룹 10 및 9)은 생존율이 감소되는 것을 확인하였다.
7-3. 소결
이러한 결과를 통해, H1N1 백신에 CT120(mIgG2a)을 0.5ug, 0.1ug로 투여하였을 때에 나타나는 면역보조제로서의 효과가 상업화 독감 백신 HA 45ug에 들어가는 함량(Addavax 100%)의 면역보조제를 투여하였을 때 나타나는 면역보조제의 효과와 유사한 것을 확인하였다. 또한 실시예 4에서, CT149(mIgG2a) 0.5ug을 면역 보조제로 사용하였을 경우에도 CT120(mIgG2a) 0.1ug과 0.5ug으로 투여한 것과 유사한 결과를 얻었기에 CT149(mIgG2a)도 CT120(mIgG2a)의 결과와 유사한 효과를 기대할 수 있다.

Claims (11)

1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트(adjuvant) 조성물.
제1항에 있어서,
상기 결합 분자는 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 애주번트 조성물.
제1항에 있어서,
상기 결합 분자의 에피토프는
i) HA1 폴리펩티드의 위치 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312 및 318 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는 에피토프; 및
ii) HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60 및 99로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기(residue)를 포함하는 에피토프
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프임을 특징으로 하는 애주번트 조성물.
제1항에 있어서,
상기 1 이상의 결합 분자는
i) 카밧 방법(Kabat method)에 따라, 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 결합 분자; 및
ii) 카밧 방법(Kabat method)에 따라, 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 결합 분자
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 결합 분자임을 특징으로 하는 애주번트 조성물.
제1항에 있어서,
상기 1 이상의 결합 분자는
i) 서열번호 13의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 분자; 및
ii) 서열번호 15의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 16의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 분자
로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 결합 분자임을 특징으로 하는 애주번트 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 백신 조성물.
제6항에 있어서,
상기 표적 항원은 인플루엔자 바이러스 항원임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 항원과 애주번트 조성물의 중량비가 1:0.02 내지 1:200임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 애주번트 조성물 및 표적 항원을 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 숙주에 투여하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 방법.
a) 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 숙주에 투여하여 면역화하는 단계; 및
b) 상기 면역화된 숙주로부터 면역학적 산물을 수득하는 단계
를 포함하며, 상기 면역학적 산물이 상기 백신 조성물에 포함되는 표적 항원에 대한 T 세포, B 세포 또는 항체인 면역학적 산물을 제조하는 방법
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