WO2021145720A1 - 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물 - Google Patents

바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물 Download PDF

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정미숙
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    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an antigen composition for the prevention or treatment of viral infectious diseases comprising influenza virus recombinant hemagglutinin monomeric protein multiple mutant protein as an active ingredient.
  • the present invention relates to an antigen composition for preventing or treating viral infectious diseases comprising a scaffold-based fusion protein.
  • influenza virus hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • mini-HA using a hemagglutinin protein having a highly conserved epitope demonstrated its versatility by showing viral efficacy in an experiment performed with an H1 subtype protein as an antigen (Impagliazzo A et al., Science 349.6254 (2015): 1301-1306).
  • influenza virus recombinant hemagglutinin 5-fold or 8-fold mutation and disulfide bond mutation monomer protein which has excellent preventive and therapeutic effects on various viruses including influenza virus, as an active ingredient.
  • An antigenic composition is provided.
  • the present invention aims to develop a universal vaccine that can be widely used against various subtypes and variants.
  • at least one fusion protein comprising a scaffold fragment and a recombinant antigen protein bound to the scaffold fragment.
  • An object of the present invention is to provide an antigen composition for preventing or treating viral infections, including.
  • the present inventors have developed the recombinant hemagglutinin. Through the cell-based expression of the nin monomer protein and the results of animal experiments using mice, it was confirmed that it has an excellent antiviral effect against influenza virus, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides an antigen composition for the prevention or treatment of viral infectious diseases comprising, as an active ingredient, the influenza virus recombinant hemagglutinin 5-fold or 8-fold mutation and disulfide bond mutation monomer protein represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 provides
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 1 is a monomer protein in which the H1 subtype influenza virus recombinant hemagglutinin protein has five mutations and two disulfide bonds are mutated;
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 2 is a recombinant hemagglutinin protein 8-fold mutant protein of influenza B virus;
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 3 is characterized in that it is a monomer protein in which five-fold mutation and one disulfide bond are mutated in H3 subtype influenza virus recombinant hemagglutinin protein.
  • the present invention provides an antigen composition for preventing or treating a viral infection comprising at least one fusion protein comprising a scaffold fragment and a recombinant antigen protein bound to the scaffold fragment.
  • the antigen composition for the prevention or treatment of viral infectious diseases according to the present invention is very excellent in the preventive effect of inhibiting the proliferation and replication of viruses having various subtypes and mutations, and recyclability and safety are recognized by using a recombinant protein, the pharmaceutical field It can be widely used in various industries such as , life science, etc.
  • 1A shows the primary structure of influenza virus hemagglutinin and the tertiary structure of the monomer (top).
  • the head region (blue) and stem region (orange) of the H1 hemagglutinin structure are indicated, and the L73S, I77S, L80S, F88E, and V91W mutant amino acid positions are indicated in the primary and tertiary structural models, respectively.
  • inset shows the interface between the monomers viewed from the top of the 3-fold axis of the trimer.
  • H1 subtype hemagglutinin among the five mutations, L73S increased the expression rate more than 5-fold (middle), and accordingly, B and H3 hemagglutinin were respectively B/Florida/4/2006 (FL04) virus hemagglutinin.
  • Virus hemagglutinin is V73S, I77S, L80S, V84W, L91W Five mutations were made (below).
  • disulfide bond mutations were performed on V20C-E105C/M320C-H111C for H1 hemagglutinin and M320C-T111C for H3 hemagglutinin, respectively.
  • a monomer protein containing a 5-fold or 8-fold mutation and a disulfide bond mutation in H1, H3, and B hemagglutinin (H1 hemagglutinin monomer 5-fold mutation/2 disulfide bond mutant protein is SEQ ID NO: 1)
  • H1 hemagglutinin monomer 5-fold mutation/2 disulfide bond mutant protein is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of B hemagglutinin monomer 8-mutant protein is shown in SEQ ID NO: 2
  • H3 hemagglutinin monomer 5-fold mutant/one disulfide bond mutant protein is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Variant amino acid residues are indicated in red.
  • 1C shows the characteristics of changing from a trimer to a monomer through hemagglutinin mutation (top, left).
  • the disulfide bond mutated amino acid position was shown through the structure of H1 hemagglutinin (top, right).
  • the mutation site is shown for each hemagglutinin through H1, H3, and B type hemagglutinin gene cloning design (below).
  • the hemagglutinin gene derived from each mutant H1, H3, and B virus was fused with a foldon, respectively, and the GP67 signal sequence and His-tag were used for each construct for easy purification.
  • Figure 2A shows the results of chromatographic purification and denaturation electrophoresis (top) and gel filtration chromatography-multi-angle light scattering (size exclusion chromatography-multi angle) of a monomer containing H1 subtype hemagglutinin five-fold mutation and disulfide bond mutation; The result of measuring the exact molecular size of the hemagglutinin mutant protein through light scattering (below) is shown.
  • the expression of the disulfide bond mutant monomer was improved in the case of the mutant protein in which two disulfide bonds were formed, and the molecular weight of the final monomer (H1 HA_5m_2DS) was 70.1 kDa.
  • Figure 2B shows the results of chromatographic purification and denaturation electrophoresis (top), gel filtration chromatography-hemagglutinin through multi-angle light scattering of a monomer containing H3 subtype hemagglutinin five-fold mutation and one disulfide bond mutation. The results of measuring the exact molecular size of the mutant protein (below) are shown. The final monomer (H3 HA_5m_DS) had a molecular weight of 85.0 kDa.
  • 2C shows the results of chromatographic purification and denaturation electrophoresis (top) of a monomer containing type B hemagglutinin 8-fold mutation, and the precise molecule of the hemagglutinin mutant protein through gel filtration chromatography-multi-angle light scattering. The result of measuring the size (below) is shown.
  • the final monomer (B HA_8m) had a molecular weight of 62.5 kDa.
  • Figure 3A is a measurement of the stability of the monomer when the disulfide bond mutation in addition to the H1 (top), H3 (bottom) subtype hemagglutinin five-fold mutation using differential scanning fluorimetry (DSF), It shows the result of the transformation transition temperature (Tm).
  • DSF differential scanning fluorimetry
  • Tm transformation transition temperature
  • Figure 3B shows the results of measuring the exact molecular size of seasonal influenza virus and novel influenza virus hemagglutinin wild type trimer, double mutant monomer and quintuple mutant monomer through gel filtration chromatography-multi-angle light scattering. .
  • the molecular weights of the hemagglutinin wild-type trimer and double and quintuple mutant monomers were 205.9, 67.2 and 70.1 kDa, respectively.
  • the molecular weight difference between the monomers is due to the difference in hemagglutinin protein from seasonal influenza A/Thailand/CU44/2006 (CU44) and A/California/07/2009 (CA09).
  • Figure 3C shows the transition temperature of seasonal influenza virus CU44 and novel influenza virus CA09 hemagglutinin wild type trimer, double mutant monomer and quintuple mutant monomer.
  • the transition temperature is different.
  • the monomer has a difference of about 10 degrees in seasonal influenza, and in the case of swine flu, there is a difference of about 2 degrees in stability between the trimer and the monomer.
  • the 5-fold mutation monomer was 2 degrees higher, indicating stability due to the 5-fold mutation.
  • mice 4 shows a schedule for each day of mouse animal experiments using monomers containing H1, H3 subtypes and B-type hemagglutinin 5-fold or 8-fold mutations and disulfide bond mutations. Eight mice were used in each group, and antigenic material was administered twice at 2-week intervals, and blood was collected at 0, 2, 4, and 5 weeks after antigen administration priming, and viral infection was administered intranasal. The total duration of the experiment was 42 days.
  • Group 1 naive mice
  • Group 2 PBS buffer + adjuvant
  • Group 3 Monomer containing H1 hemagglutinin five-fold mutation and two disulfide bond mutations + adjuvant
  • Group 4 Commercially produced by SK Bioscience Cell cultured influenza trivalent vaccine
  • group 5 A mutant monomer mixture containing H1, H3, B hemagglutinin 5-fold or 8-fold mutation and disulfide bond mutation + adjuvant.
  • FIG. 5 shows the results of a mouse animal experiment using H1 hemagglutinin mutated monomers, H1, H3, B hemagglutinin mutated monomer mixtures, and the like.
  • Daily weight change (top) and survival rate (bottom) were shown in mice infected with PR8 (H1N1) virus, and each group is the same as the group listed in FIG. 4 .
  • FIG. 6 shows the virus concentration in lung tissue as a result of a mouse animal experiment using H1 hemagglutinin mutant monomer, H1, H3, B hemagglutinin mutant monomer mixture, and the like.
  • PR8 H1N1
  • mice were sacrificed and then virus titer (Pfu/ml) was measured from lung tissue.
  • Each group is the same as the group listed in FIG. 4 .
  • FIG. 7 shows the results of plaque reduction neutralization analysis using mouse serum in animal experiments.
  • the results of the lysate reduction and neutralization experiment using serum collected from mice in each group are shown.
  • a PR8 virus-diluted mouse serum sample was added to the MDCK cells, and each group is identical to the group listed in FIG. 4 .
  • the number of plaques was measured by staining with crystal violet.
  • Figure 8A shows the antibody titer, which is the result of ELISA analysis using mouse serum in an animal experiment.
  • H1 HA_5m_2DS (top) and H1 HA CU44 trimer (bottom) were used as immobilized antigens, and serum collected from mice of each group was used.
  • the results of ELISA experiments are shown using After antigen administration (prime-boost), an ELISA experiment was performed using serum collected from mice, and each group is the same as the group listed in FIG. 4 .
  • the absorbance of the secondary antibody-horseradish peroxidase reaction was measured at a wavelength of 450 nm by ELISA assay using a microplate.
  • FIG. 8B shows the antibody titer, which is the result of ELISA analysis using mouse serum in an animal experiment.
  • As the immobilized antigen H3 subtype hemagglutinin (top) and B type hemagglutinin (bottom) were used.
  • the results of ELISA experiments using serum collected from mice are shown.
  • An ELISA experiment was performed using serum collected from mice after antigen administration (prime-boost), and each group is the same as the group listed in FIG. 4 .
  • the absorbance of the secondary antibody-horseradish peroxidase reaction was measured at a wavelength of 450 nm by ELISA assay using a microplate.
  • Figure 8C shows the hemagglutinin antibody titer (top) using mouse serum in an animal experiment using mini-HA representing the hemagglutinin stem region.
  • mini-HA is a trimeric trimer consisting only of a stem region (Impagliazzo A et al., 2015. Science 349: 1301-1306), purification results, denaturation electrophoresis results (middle) and a known stem-specific antibody (C179) Concentration-dependent activity was confirmed when using as a control (below). Therefore, only the stem-specific antibody can react in the serum, and the specific antibody was detected by ELISA using serum collected from mice after antigen administration (prime-boost). Each group is identical to the group listed in FIG. 4 .
  • FIG. 9 is a schematic diagram illustrating the principle of exposing a plurality of recombinant antigen proteins to the outside around a cyclic scaffold formed by self-assembly of scaffold fragments included in a plurality of fusion proteins according to the present invention.
  • Figure 10A shows the head region (blue) and stem region (orange) of the trimer, monomer relationship (top left), H1 HA monomer structure, L73S, I77S, L80S, F88E, L73S, I77S, L80S, F88E, using the seasonal mutant influenza virus HA tertiary structure model. V91W variant amino acid positions are indicated (top right). H1 HA, B HA, and H3 HA mutant proteins are HA derived from viruses A/California/07/2009 (CA09), B/Florida/4/2006 (FL04), A/Gyeongnam/684/2006 (H3N2) (Gy684), respectively.
  • H1 HA and H3 HA have V29C/E105C, M320C/H111C 2, M320C/T111C 1 disulfide bond forming mutations, respectively, and PCNA1, PCNA2, PCNA3 mutations showing the relative positions in the primary structure of the protein. A schematic diagram is shown.
  • H1 HA, B HA, and H3 HA mutant genes were bound to the PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm N-terminals, respectively, and these were respectively combined with H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3. It was named HA-PCNA3dm. It was prepared as a fused construct by attaching an SGG linker between each HA and PCNA, and for easy purification, the GP67 signal sequence and His-tag were used for each construct.
  • Figure 10B shows (red) the mutation amino acid residues of the H1 HA, B HA, and H3 HA monomer mutant proteins in the entire amino acid sequence.
  • Figure 10C is a table showing the assembly improvement mutation residues of PCNA1, PCNA2, and PCNA3, which are PCNA subunits (scaffold fragments) (top), and PCNA1-PCNA2, PCNA2-PCNA3 Structural model of the mutation residues at the interface on the PCNA tertiary structure. (middle), and each mutation amino acid residue is indicated in red in each subunit amino acid sequence of the PCNA (bottom).
  • 11A is the result of performing final size-exclusion chromatography (SEC) in the chromatographic purification step after bacterial expression of PCNA wild type subunits PCNA1, PCNA2, PCNA3 and mutant subunits PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm ( stomach).
  • SEC final size-exclusion chromatography
  • the denaturing SDS-PAGE results show the relative molecular weight of the highly purified PCNA subunit (below).
  • the results before (BF) and after (AF) syringe filtering are shown to check the aggregation of PCNA subunit wild type and mutant proteins.
  • FIG. 11B shows the results of final size-exclusion chromatography (SEC) in the chromatographic purification step after bacterial expression of PCNA wild type subunits PCNA1, PCNA2, PCNA3 and mutant subunits PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm (top) .
  • SEC final size-exclusion chromatography
  • 11C is a comparison of the assembly binding constant K D between the PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm mutant subunits with the PCNA protein wild type subunit assembly binding constant.
  • Bio-layer interferometer (BLI) Blitz system (ForteBio, Menlo Park, CA, USA) was used.
  • PCNA1dm-PCNA2dm to the reaction and PCNA3dm-PCNA2dm reaction rate constant for the reaction k a, k d, and binding constants K D compared to the wild typ-protein coupled reaction was determined in the concentration range 50-1000 nM. It was confirmed that the binding of PCNA mutant was improved 3-6 times compared to the wild type.
  • Figure 12A is a fusion protein H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm in which H1, B, H3 HA mutant monomers for animal experiments bound to PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm, respectively, size exclusion chromatography and denaturation electrophoresis SDS-PAGE results, and shows the results of denatured and non-denatured electrophoresis (Fig. 12A below) of high-purity purified PCNA subunits (top, inset).
  • the final assembled and purified PCNAdm subunit was in the range of 28-40 kDa, and the PCNAdm3HA complex showed a molecular weight of 100-130 kDa bound to HA, respectively.
  • PCNAdm-3HA H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm, and H1 HA, B HA, H3 HA monomer in denatured and non-denatured electrophoresis experiments of antigens used in animal experiments, the results of analysis are shown. giving (below). In addition to the relative molecular weight of the antigens used, purity and high concentration were confirmed.
  • 12B is a fusion protein, H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm in which H1, B, and H3 HA mutant monomers are bound to PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm, respectively.
  • the molecular weights of the H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, and H3 HA-PCNA3dm fusion proteins were measured to be 103.8, 89.9, and 133.2 kDa, respectively, and the final assembled PCNAdm-3HA was confirmed to have a molecular weight of 326.3 kDa (top, left).
  • Denaturing electrophoresis (SDS-PAGE) results showed the relative molecular weights of the H1 HA-PCNA1dm and PCNAdm-3HA complex (top, right), and showed the relative molecular weight of the H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm and PCNAdm-3HA antigens.
  • the scattering results of the SEC-MALS experiments are shown (below).
  • FIG. 12C shows the results of observation of PCNAdm-3HA using a transmission electron microscope (TEM) negative staining (top) and 2D averaging (bottom). Some of the assembled PCNAdm-3HA observations are shown, and PCNAdm-3HA heterotrimers with a particle size of 20-30 nm are shown.
  • TEM transmission electron microscope
  • Figure 13A shows the schedule (scheme) of the PR8 H1N1 virus challenge mouse animal experiment per day belonging to influenza virus group 1 using HA monomers and scaffold multiantigens.
  • Eight mice were used in each group (5 mice in the control naive group), the antigen material was administered twice at an interval of 2 weeks, and blood was collected at 0 weeks, 2 weeks, 4 weeks, and 4 weeks + 4 days after antigen priming, respectively.
  • PR8 H1N1 subtype virus infection was administered intranasal. The total duration of the experiment was 42 days, and each group was as follows.
  • group 1 naive mice
  • group 2 PBS buffer + adjuvant
  • group 3 PCNA1dm-PCNA2dm-PCNA3dm assembled + adjuvant
  • group 4 H1 HA monomer + adjuvant
  • group 5 H1 HA-PCNA1dm + adjuvant
  • Group 6 Commercial SK Bioscience.
  • Trivalent vaccine group 7: H1 HA, H3 HA, B HA trimer mixture + adjuvant
  • group 8 H1 HA, H3 HA, B HA mutant mixture + adjuvant
  • group 9 PCNAdm-3HA + adjuvant.
  • FIG. 13B shows the results of a mouse animal experiment using the H1 HA monomer, H1 HA-PCNA1dm, and the multiantigen PCNAdm-3HA protein fused with H1, B, and H3 HA.
  • the daily weight change (top) and survival rate (bottom) are shown in mice infected with PR8 (H1N1) virus.
  • PR8 H1N1
  • a commercial trivalent vaccine purchased from SK Bioscience was used as a positive control, and a reduction in mouse body weight of 20% or more was determined as termination of survival, and each group was the same as in FIG. 13A.
  • FIG. 13C shows the results of mouse animal experiments using the H1 HA monomer, H1 HA-PCNA1dm, and the multiantigen PCNAdm-3HA protein fused with H1, B, and H3 HA.
  • the lung Virus titer in tissue expressed as log PFU/ml (above).
  • the presence or absence of antibody formation in the blood collected 4 days after virus infection from the time of antigen inoculation showed the results of calculating plaque reduction neutralization titer (PRNT) by infecting MDCK cells after 1 hour reaction with H1N1, H3N2, and B viruses, respectively (middle, under).
  • PRNT plaque reduction neutralization titer
  • FIG. 13D shows an ELISA experiment using serum collected from mice, and shows the antibody titers using H1 HA, H3 HA, B HA trimer, monomer, and stem region mini HA as antigens, respectively. After 200 ng of HA antigen was coated on an ELISA microplate overnight at 4°C, serum collected by primary antibody binding was serially diluted and bound at 37°C for 1 hour. By ELISA assay using microplate, the absorbance of the secondary antibody-horseradish peroxidase reaction was measured at a wavelength of 450 nm. The groups were the same as in Figure 13A.
  • 14A shows a scheme for each day of passive immunization animal experiment using immune serum induced with HA monomer and scaffold multiantigen.
  • the antigen material was administered twice at 2-week intervals, and 4 days after boosting the antigen administration, blood was collected and serum was separated.
  • the 7-week-old mice were divided into 6 groups (7 mice in each group, 5 mice in the control native group), and the separated serum was intraperitoneal injection into the mice in each group.
  • the PR8 H1N1 subtype virus was intranasal to infect the survival rate. shows the measurement results.
  • the total duration of the experiment was 42 days, and each group was as follows.
  • Group 1 naive mice
  • Group 2 PBS buffer + adjuvant
  • Group 4 H1 HA monomer + adjuvant
  • Group 5 H1 HA-PCNA1 + adjuvant
  • Group 6 SK Bioscience commercial trivalent vaccine
  • Group 9 PCNAdm-3HA + adjuvant.
  • the group number was the same as that of the group in FIG. 13A.
  • FIG. 14B shows the results of a passive immunization animal experiment using an immune serum induced with the H1 HA monomer, H1 HA-PCNA1dm, and the multiantigen PCNAdm-3HA fused with H1, B, and H3 HA.
  • the immune effect in mice infected with PR8 (H1N1) virus is expressed as daily body weight change (top) and survival rate (bottom).
  • the SK Bioscience trivalent vaccine group was used as a positive control, and a reduction in mouse body weight of 20% or more was determined as the termination of survival rate.
  • FIG. 14C shows the results of passive immunization animal experiments using immune serum induced with the H1 HA monomer, H1 HA-PCNA1dm and the multiantigen PCNAdm-3HA protein fused with H1, B, and H3 HA.
  • Virus titer in log PFU/ml above.
  • the presence or absence of antibody formation in the blood collected 4 days after virus infection from the time of antigen inoculation showed the results of calculating plaque reduction neutralization titer (PRNT) by infecting MDCK cells after 1 hour reaction with H1N1, H3N2, and B viruses, respectively (middle, under).
  • PRNT plaque reduction neutralization titer
  • Figure 14D shows the H1 HA, H3 HA, B HA trimer and monomer or the serum obtained from the mouse to which the serum IP has been transferred through ELISA assay in order to determine whether antibodies are formed in the mouse serum inoculated with the influenza virus HA antigen.
  • Antibody titers are shown by using mini HA as antigens, respectively. After 200 ng of each antigen was coated on an ELISA microplate overnight at 4°C, serum collected by primary antibody binding was serially diluted and bound at 37°C for 1 hour. By ELISA assay using microplate, the absorbance of the secondary antibody-horseradish peroxidase reaction was measured at a wavelength of 450 nm. The groups were the same as in Figure 14A.
  • Figure 15A shows the schedule for each day of the X47 H3N2 subtype challenge mouse animal experiment belonging to influenza virus group 2 using HA monomer and scaffold multiantigen.
  • Eight mice were used in each group (5 mice in the control naive group), the antigen material was administered twice at an interval of 2 weeks, and blood was collected at 0 weeks, 2 weeks, 4 weeks, and 4 days after challenge, respectively, after antigen administration priming. Infection was administered intranasal. The total duration of the experiment was 42 days, and each group was as follows.
  • Group 1 naive mice
  • group 2 PBS buffer + adjuvant
  • group 3 inactivated H3 X47 + adjuvant
  • group 4 commercial SK Bioscience trivalent vaccine + adjuvant
  • group 5 PCNA1dm-PCNA2dm-PCNA3dm assembled + adjuvant Bunt
  • group 6 H3 HA monomer + adjuvant
  • group 7 H3 HA-PCNA3dm + adjuvant
  • group 8 H1 HA, H3 HA, B HA mutant mixture + adjuvant
  • group 9 PCNAdm-3HA + adjuvant .
  • 15B shows the results of an X47 H3N2 subtype challenge mouse animal experiment belonging to influenza virus group 2 using the H3 HA monomer, H3 HA-PCNA3dm, and the multiantigen PCNAdm-3HA protein fused with H1, B, and H3 HA.
  • Daily body weight change (top) and survival rate (bottom) of mice infected with X47 (H3N2) virus are shown.
  • a trivalent vaccine purchased from SK Bioscience was used as a positive control, and a reduction in mouse body weight of 20% or more was determined as termination of survival.
  • 15C shows the results of a mouse animal experiment using the H3 HA monomer, H3 HA-PCNA3dm, and the polyantigen PCNAdm-3HA protein fused with H1, B, and H3 HA.
  • the virus titer was obtained from the lung tissue. (PFU/ml) measurement result (above).
  • An ELISA experiment was performed using serum collected from 4 dpi mice, and antibody titers were shown using H1, H3, B HA monomer, trimer, and mini HA as antigens, respectively (below). After 200 ng of each antigen was coated on an ELISA microplate overnight at 4°C, serum collected by primary antibody binding was serially diluted and bound at 37°C for 1 hour. By ELISA assay using microplate, the absorbance of the secondary antibody-horseradish peroxidase reaction was measured at a wavelength of 450 nm.
  • hemagglutinin protein plays the most important role in influenza virus invasion into host cells through the mechanism of membrane fusion.
  • hemagglutinin protein has the characteristic of maintaining overall trimeric stability through the role of capping the instability of the innate stem region.
  • universal vaccines have been developed in the direction of inducing stem-specific antibodies by stably exposing unstable stem regions.
  • a stable monomer antigen capable of exposing the conserved region from a different viewpoint has been developed, and thus, if the structural advantage of exposing the interface region better than the trimer is utilized, the immune activity can be greatly improved. was confirmed.
  • amino acid residue mutations in the H1 subtype, H3 subtype, and B type hemagglutinin protein are as follows: H1 HA: L73S, I77S, L80S , F88E, V91W fivefold mutation, H3 HA: V73S, I77S, L80S, V84W, L91W fivefold mutation, B HA: L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W octal mutation monomer, respectively was prepared, and disulfide bond mutations were performed on V20C-E105C/M320C-H111C for H1 HA and M320C-T111C for H3 HA, respectively.
  • H1 HA monomer 5-fold mutation and two disulfide bond mutant proteins are shown in SEQ ID NO: 1
  • the B HA monomer 8-fold mutant protein is shown in SEQ ID NO: 2
  • H3 HA monomer 5-fold mutation and one disulfide bond mutant protein are sequenced It is represented by number 3, and the monomer properties thereof were confirmed.
  • the present invention relates to an antigen composition for the prevention or treatment of viral infectious diseases comprising, as an active ingredient, an influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant protein represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 1 is a monomer protein in which the H1 subtype influenza virus recombinant hemagglutinin protein has five mutations and two disulfide bonds are mutated;
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 2 is a recombinant hemagglutinin protein 8-fold mutant protein of influenza B virus;
  • the multiple mutant protein represented by SEQ ID NO: 3 may be characterized as a monomer protein in which five-fold mutation and one disulfide bond of H3 subtype influenza virus recombinant hemagglutinin protein are mutated.
  • the virus can be any virus that infects humans and animals, for example, Orthomyxoviridae including influenza virus, Transmissible gastroenritis virus, Porcine Epidemic Diarrhea (PED) virus, SARS, Coronavirus including MERS and SARS-CoV-2, Zicavirus, Flavivirus including Bovine Viral Diarhhea (BVD) virus ), Calicivirus including norovirus, respiratory syncytial virus (RSV), Porcine Respiratory Reproductive Syndrome (PRRS) virus, porcine circovirus type 2 circovirus type 2; PCV2) Virus, Rotavirus, Parvovirus, Picornavirus, Pestivirus, Rhabdovirus, Birnavirus, Retrovirus ( Retovirus) and herpesvirus (Herpesvirus) may be selected from the group consisting of.
  • Orthomyxoviridae including influenza virus, Transmissible gastroenritis virus, Porcine Epidemic Diarrhea (PED) virus, SARS, Coronavirus including MERS and SARS-Co
  • 'prevention' or 'treatment' refers to alleviation or amelioration of disease symptoms, reduction of disease range, delay or alleviation of disease progression, amelioration, alleviation or stabilization of disease state, partial or complete recovery, prolongation of survival and other It is used in the meaning of including all beneficial treatment results and the like.
  • composition' is considered to include any product made directly or indirectly by combining the specific ingredients, in addition to the product including the specific ingredients.
  • the antigen composition according to the present invention can be applied in all known forms, such as pharmaceutical compositions administered to vertebrates, preferably mammals, including humans, food compositions, and conventional prophylactic and therapeutic antiviral agents.
  • the antigen composition comprising each or a mixture of influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant proteins represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 as an active ingredient has a preventive effect against various viruses. It was confirmed, and in particular, it was revealed that it has excellent virus prevention efficacy against influenza viruses belonging to orthomyxoviridae.
  • mutant monomer exhibited comparable or improved immune activity to a PBS buffer solution or commercial SK Chem influenza trivalent vaccine used as a comparison group, and high purity in solution
  • immunogenic activity of mutated monomers seems to be directly related to the content of these recombinant proteins in the sample.
  • influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant protein may be characterized in that it exhibits a preventive or therapeutic effect on animal and human influenza by inhibiting the proliferation and replication of orthomyxoviruses.
  • the orthomyxovirus may be characterized as an influenza virus, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an orsomyxovirus targeting an animal comprising each or a mixture of influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant proteins represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 as an active ingredient ( orthomyxovirus) provides a pharmaceutical composition for preventing or treating infectious diseases.
  • Influenza hemagglutinin monomer can be easily mutated using the Bac-to-bac system, and it is easy to express using insect cells sf9 and hi5 cells, and after purification to a purity of 90% or more using column chromatography It is a purified protein antigen that is easy to characterize.
  • Antigen protein mutation can be achieved by introducing (transfection) the bacmid into which the target gene is accurately inserted through a selection process in bacteria, preferably in a Bac-to-bac system. More preferably, the antigenic protein can be made by other genetic engineering methods.
  • the hemagglutinin protein is more preferably a protein expressed in other cells including animals and bacteria in addition to sf9 and hi5 insect cells.
  • hemagglutininin protein When purifying the hemagglutinin protein, it is easy to characterize after purification to a purity of 90% or more using a Ni-NTA affinity column, a Mono Q ion exchange column, and a superdex gel filtration 200HR column chromatography. It can be made from hemagglutinin antigen. In performing the purification process, other purification methods may be used to purify a protein with high purity.
  • it can be prepared by purification in an active form using trypsin, and other degrading enzymes other than trypsin can be used.
  • trypsin a degrading enzymes other than trypsin
  • residues, etc. remaining in the extract may be removed or stabilized.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating orthomyxovirus infection disease is each of the influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant protein represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 or their It may be included in a form bound to a mixture or scaffold molecule, and in addition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent according to a conventional method used in the art depending on the formulation, method of use, and purpose of use. In addition, it may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the composition may be administered orally or parenterally according to a conventional method, for example, in the case of oral administration, it may be provided in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and the like. It can be prepared in any form commonly known, such as in the form of a pharmaceutical composition administered to animals including birds, preferably humans, and animals including birds.
  • a preferred dosage may be an amount suitable for the treatment or prevention of the subject and/or disease, which may include the age, sex, general health and weight of the subject, the type and severity of the disease, the type of dosage form, and the content contained in the composition. It can be adjusted and appropriately selected according to various factors including the type and content of other ingredients, the secretion rate of the composition, the route and duration of administration, etc., but preferably 50 to 100 mg per day based on an adult (70 kg) will be administered. can
  • orthomyxovirus infection comprising each of the influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant protein represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 or a mixture thereof as an active ingredient
  • a food composition for preventing or ameliorating a disease is provided.
  • the food composition of the present invention may be in any herbal form suitable for administration to the body of animals, including the human body, in any form conventional for oral administration, for example, food or feed, additives and adjuvants of food or feed, fortified food or feed. , in solid form such as tablets, pills, granules, capsules and effervescent formulations, or in liquid form such as solutions, suspensions, emulsions, beverages and the like. In addition, it may contain nutrients, vitamins, electrolytes, and the like, and these components may be used independently or in combination.
  • the orthomyxovirus infection is caused by a virus, antibiotics are ineffective unless it is a secondary infection problem such as a bacterial disease. Accordingly, the present inventors can effectively prevent infection by providing a composition comprising the recombinant antigen protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antigen composition for preventing or treating a viral infection comprising at least one fusion protein comprising a scaffold fragment and a recombinant antigen protein bound to the scaffold fragment.
  • the fusion proteins 100, 200, 300 are a plurality of different from each other, and in the plurality of the fusion proteins, each of the scaffold fragments 110, 210, 310 is self-assembled to form a cyclic scaffold, and the It may be characterized in that the recombinant antigen proteins (120, 220, 320) are exposed to the outside around the cyclic scaffold (see FIG. 9).
  • the fusion protein may be characterized in that the scaffold fragment and the recombinant antigen protein are a plurality of different from each other.
  • the first fusion protein 100 which is any one of the plurality of fusion proteins, is the first scaffold fragment 110 represented by SEQ ID NO: 4 (referred to as PCNA1dm in the following examples) and the first scaffold fragment. It may be characterized in that it comprises a first recombinant antigen protein 120 (referred to as an H1 HA monomer multiple mutant protein in the following examples) which is bound and represented by SEQ ID NO: 1 (see FIG. 9).
  • the second fusion protein 200 which is any one of the plurality of fusion proteins, is a second scaffold fragment 210 represented by SEQ ID NO: 5 (referred to as PCNA2dm in the following examples) and the second scaffold fragment. It may be characterized in that it comprises a second recombinant antigen protein 220 represented by SEQ ID NO: 2 (referred to as a B HA monomer multiple mutant protein in the following examples) (refer to FIG. 9).
  • the third fusion protein 300 which is any one of the plurality of fusion proteins, is a third scaffold fragment 310 represented by SEQ ID NO: 6 (referred to as PCNA3dm in the following examples) and the third scaffold fragment. It may be characterized in that it comprises a third recombinant antigen protein 320 (referred to as an H3 HA monomer multiple mutant protein in the following examples) which is bound and represented by SEQ ID NO: 3 (see FIG. 9).
  • the first fusion protein 100 which is any one of the plurality of fusion proteins, binds to the first scaffold fragment 110 and the first scaffold fragment represented by SEQ ID NO: 4, and the first fusion protein 100 represented by SEQ ID NO: 1
  • the second fusion protein 200 which includes one recombinant antigen protein 120, and is any one of the plurality of fusion proteins, is the second scaffold fragment 210 and the second scaffold fragment represented by SEQ ID NO: 5.
  • the third fusion protein 300 which is any one of the plurality of fusion proteins, is a third scaffold fragment 310 which is bound and includes the second recombinant antigen protein 220 represented by SEQ ID NO: 2, and is represented by SEQ ID NO: 6 ) and a third recombinant antigen protein 320 which is bound to the third scaffold fragment and represented by SEQ ID NO: 3 (see FIG. 9).
  • the scaffold fragment may be characterized in that it is PCNA (proliferating cell nuclear antigen).
  • the recombinant antigen protein may be an influenza virus recombinant hemagglutinin protein monomer multiple mutant protein.
  • the virus can be any virus that infects humans and animals, for example, Orthomyxoviridae including influenza virus, Transmissible gastroenritis virus, Porcine Epidemic Diarrhea (PED) virus, SARS, Coronavirus including MERS and SARS-CoV-2, Zicavirus, Flavivirus including Bovine Viral Diarhhea (BVD) virus ), Calicivirus including norovirus, respiratory syncytial virus (RSV), Porcine Respiratory Reproductive Syndrome (PRRS) virus, porcine circovirus type 2 circovirus type 2; PCV2) Virus, Rotavirus, Parvovirus, Picornavirus, Pestivirus, Rhabdovirus, Birnavirus, Retrovirus ( Retovirus) and herpesvirus (Herpesvirus) may be selected from the group consisting of.
  • Orthomyxoviridae including influenza virus, Transmissible gastroenritis virus, Porcine Epidemic Diarrhea (PED) virus, SARS, Coronavirus including MERS and SARS-Co
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent according to a conventional method used in the art depending on the formulation, method of use, and purpose of use, as well as being administered as an individual therapeutic agent or It may be administered in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the composition may be administered orally or parenterally according to a conventional method, for example, in the case of oral administration, it may be provided in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and the like. It can be prepared in any form commonly known, such as in the form of a pharmaceutical composition administered to animals including birds, preferably humans, and animals including birds.
  • the composition may comprise .001 wt% to 99.9 wt%, preferably 0.1 wt% to 99 wt%, more preferably 1 wt% to 50 wt% of the fusion protein based on the total weight of the composition.
  • a preferred dosage may be an amount suitable for the treatment or prevention of the subject and/or disease, which may include the age, sex, general health and weight of the subject, the type and severity of the disease, the type of dosage form, and the content contained in the composition. It can be adjusted and appropriately selected according to various factors including the type and content of other ingredients, the secretion rate of the composition, the route and duration of administration, etc., but preferably 50 to 100 mg per day based on an adult (70 kg) will be administered. can
  • the present invention also provides a food composition for preventing or ameliorating a viral infection comprising at least one fusion protein comprising a scaffold fragment and a recombinant antigen protein bound to the scaffold fragment.
  • the food composition of the present invention may be in any herbal form suitable for administration to the body of animals, including the human body, in any form conventional for oral administration, for example, food or feed, additives and adjuvants of food or feed, fortified food or feed. , in solid form such as tablets, pills, granules, capsules and effervescent formulations, or in liquid form such as solutions, suspensions, emulsions, beverages and the like. In addition, it may contain nutrients, vitamins, electrolytes, and the like, and these components may be used independently or in combination.
  • the present invention relates to a composition of SCAFFOLD-BASED MULTIVALENT ANTIGENS in which a stable mutant monomer of a viral recombinant surface fusion protein (RECOMBINANT VIRUS SURFACE PROTEIN MUTANT MONOMERS) is bound to a scaffold molecule. More specifically, by including a complex multiantigen (refer to FIG.
  • PCNA PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN
  • the multi-antigen composition of the present invention is based on two base technologies.
  • H1 HA L73S, I77S, L80S, F88E
  • B HA L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W
  • H3 HA V73S, I77S, L80S, V84W, L91W; each represented by SEQ ID NOs: 1 to 3
  • characterization was performed These mutant proteins were identified as monomers (Example below).
  • the scaffold protein to be dealt with in the present invention is Sulfolobus It is a proliferating cell nuclear antigen (PCNA) derived from solfataricus (Dionne et al., 2003) and can bind various viral protein antigens to the N- or C-terminal of the scaffold protein. It can bind up to 6 different antigens, and although it depends on the size of the antigen, when the HA antigen is fused, it has a nanoparticle size, that is, 30-40 nm. It has been shown to significantly improve immune activity. S.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • PCNA protein consists of PCNA1, PCNA2, and PCNA3 subunits (subunit, scaffold fragment), and after dimer is made by PCNA1 and PCNA2, PCNA3 is assembled to make a heterotrimer (Dionne) et al., 2003).
  • PCNA heterotrimer in solution is well assembled even when PCNA1, PCNA2, and PCNA3 are mixed at the same time (data not shown), and the assembly of three PCNA-HA antigen fusion proteins is Pseudomonas
  • putida cytochrome P450 monooxygenase, ferredoxin, and ferredoxin reductase they were fused to PCNA3, PCNA2, and PCNA1, respectively, and then assembled to confirm the function of the protein electron transport complex (Hirakawa and Nagamune, 2010).
  • linker length between the enzyme and PCNA (10, 16, and 3 amino acids, respectively) to focus on the electron transfer function, it is interpreted as considering the flexibility of the fusion complex protein.
  • the present inventors fused the stable HA monomer mutant proteins of recombinant H1, H3 subtype and B type into scaffold PCNA protein mutant subunits PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm, respectively, and then fused them to H1 HA-PCNA1dm, B HA- Named PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm (corresponding to each fusion protein, integrated and abbreviated as HA-PCNAdm), assembled, and then separated the assembled multiantigens using size exclusion chromatography, and then the final PCNAdm-3HA named it.
  • Influenza virus invades the host cell through the membrane fusion mechanism, and an important role in this case is the structural change according to the pH of the HA protein.
  • HA protein has the property of maintaining stability of the innate stem region necessary for structural change with the head region and trimer properties.
  • Conventional universal vaccine research has been developed in the direction of inducing an antibody that specifically binds to a highly conserved stem region by stably exposing an unstable stem region. Therefore, the present invention has developed a stable monomer antigen capable of exposing a conserved site from a different viewpoint than the conventional one, and by utilizing a fusion protein (HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA) that is bound to a scaffold PCNA capable of multi-antigen binding. , could improve immune activity.
  • the antigen composition comprising the fusion protein (HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA) according to the present invention as an active ingredient has excellent virus prevention efficacy against influenza viruses belonging to orthomyxoviridae.
  • the HA-PCNAdm and PCNAdm-3HA antigen compositions combined with various recombinant HA monomers show improved immune activity than the PBS buffer solution used as a control group in animal experiments or SK Bioscience's commercial influenza trivalent vaccine, and are present in solution.
  • the immunological activity of HA-PCNAdm and PCNAdm-3HA protein antigens bound with high-purity recombinant HA monomers is directly related to the content of these recombinant protein antigens in the sample.
  • the HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA multiantigen is characterized in that it exhibits a preventive or therapeutic effect on animal and human influenza by inhibiting the proliferation and replication of orsomyxovirus, wherein the orsomyxovirus is an influenza virus It may be characterized as being, but is not limited thereto.
  • influenza virus most viruses such as coronavirus, human pneumovirus, and paramyxovirus have a trimer-type surface protein very similar to HA, and surprisingly, the structural change from prefusion to postfusion required for host entry is also very similar. the fact that it depends on Therefore, it is possible to develop a PCNA scaffold-based multi-antigen by preparing a monomer form of the surface proteins of various viruses.
  • Influenza virus-derived HA monomer variant protein, a fusion protein in which PCNA is fused to the variant protein (HA-PCNAdm), and a fusion protein formed by self-assembly of PCNA (PCNAdm-3HA) can be prepared using a Bac-to-bac system. It can be easily expressed using insect cells sf9 and High Five cells.
  • the antigen proteins can be made by selecting the bacmid into which the target gene is accurately inserted through a selection process in bacteria in a Bac-to-bac system and then infecting the cells. In addition, it can be made by other genetic engineering methods, and it can be expressed by introducing (transfection) genes into other cells including animals, plants and bacteria in addition to sf9 and High Five insect cells.
  • the HA monomer, each HA-PCNAdm, and PCNAdm-3HA protein antigen were purified to a purity of 90% or more using Ni-NTA affinity column, Mono Q ion exchange column, and superdex gel filtration 200HR column chromatography, and then characterization was performed. It is easy and can be made from HA antigen proteins derived from various influenza viruses that will occur in the future.
  • other purification methods may be used to purify a protein with high purity. In particular, it can be prepared by performing purification in an active form of HA using trypsin, and other degrading enzymes other than trypsin can be used. By performing the purification process, residues, etc. remaining in the extract may be removed or stabilized.
  • Antibiotics are ineffective unless the viral infection is a secondary infection problem such as a bacterial disease. Accordingly, the present inventors can effectively prevent infection by providing a composition comprising HA-PCNAdm and PCNAdm-3HA proteins fused with the recombinant HA monomer as active ingredients.
  • Example 1 derived from influenza virus hemagglutinin Design and manufacture of monomers and mixtures thereof
  • the present inventors have identified the tertiary structure of 2009 pandemic influenza A/Korea/01/2009 (KR01) HA and HA-Fab complex, and the revealed structure is not a conventional trimeric structure, but of a monomer showing a monomer-monomer interaction.
  • the structure is shown (Cho KJ et al., 2013. J Gen Virol, 64, 1712-1722; Cho KJ et al., 2014. PLoS One. 9, e89803). Since the 2009 pandemic virus hemagglutinin protein showed a structure in which the head region was relaxed from the stem region as a monomeric form, as well as a much more flexible structure, the present inventors developed hemagglutinin hemagglutinin protein.
  • Influenza universal vaccine development is an effort to expose regions with high amino acid conservation, such as hemagglutinin (mini-HA) without a head region, chimeric HA, and nanoparticles consisting only of stem regions on molecular scaffolds, as epitope.
  • regions with high amino acid conservation such as hemagglutinin (mini-HA) without a head region, chimeric HA, and nanoparticles consisting only of stem regions on molecular scaffolds, as epitope.
  • Antibodies that recognize the hemagglutinin trimer interface have been found (Watanabe A. et al., 2019. Cell 177: 1124-1135; Bangaru S. et al., Cell 177: 1139-1152; Bajic G. et al. ., Cell Host & Microbe 25: 1-9), the fact that these antibodies show very versatile protection indicates their importance as a highly conserved epitope of the interface.
  • Hemagglutinin has a stabilized form as a trimer, but amino acid mutation is required to make it a monomer.
  • the present inventors consider that the trimer-monomer transformation should be generally applied to various viruses, and the monomer-monomer interaction inside the trimer from the seasonal mutant A/Thailand/CU44/2006 (CU44) HA gene, which is a trimer structure.
  • Six amino acid residues involved in (monomer-monomer interaction) were selected and their charges or sizes were changed.
  • mutations in two amino acid residues (F88E, V91W) inhibited trimer formation, thereby successfully forming a monomer. Formation was confirmed (Seok JH et al., 2017. Sci. Rep. 7: 7540). However, since this result only induces dissociation of the trimer by destabilizing the trimer, the resulting monomer had very low stability.
  • hemagglutininin protein monomers are located at the interface between the monomers and the monomers.
  • the amino acid residues exposed to the outside were analyzed based on the structure. Protein solubility and stability were improved by changing externally exposed hydrophobic amino acid residues to water-soluble residues.
  • H1 subtype hemagglutinin protein A mutant protein was prepared with (A/California/04/2009(H1N1) (CA09) H1 HA: L73S, I77S, L80S, F88E, V91W) ( FIG. 1A ).
  • the L73S mutation significantly improved the expression rate because the expression was increased 5-10 times compared to the conventional wild type protein, and two disulfide bond mutations were performed: V20C-E105C and M320C-H111C.
  • the existing double mutant protein was derived from the CU44 virus in 2006, but since the CA09 virus changed from a pandemic mutant to a seasonal mutant after the 2009 H1N1 influenza pandemic, CA09 was targeted as H1 HA in the present invention.
  • mutant proteins having 5-fold and 8-fold mutations, respectively were prepared: A/Gyeongnam/684/2006(H3N2) (Gy684): V73S, I77S, L80S, V84W, L91W)
  • mutant proteins were prepared by disulfide bond mutations in V20C-E105C/M320C-H111C for H1 HA and M320C-T111C for H3 HA.
  • the amino acid sequences of these influenza virus recombinant H1 HA, H3 HA, and B HA protein mutant monomers are shown in FIGS. 1A, 1B and 1C.
  • a his-tag (6xHis-tag) at the 5' site and a foldon domain at the 3' site are attached together with a thrombin cleavage site for each construct, thereby forming a transfer vector
  • the Bac-to-bac system was designed to select the bacmid into which the correct target gene was inserted through the selection process in bacteria (FIG. 1C). This is because the foldon domain is cut off due to proteolytic cleavage when the mutant protein is expressed and purified and treated with thrombin, so that it is converted from a trimer to a monomer and promotes stability.
  • Influenza virus recombinant hemagglutinin mutant monomers were expressed using insect cells sf9 and a Bac-to-bac system using High Five. Viral proteins in Insect cells were set under conditions for expressing proteins with optimal yield and solubility through small-scale experiments, and viral protein cloning was performed in pFastBac vector, and recombinant bacmid DNA was produced in DH10Bac. Recombinant bacmid DNA was transfected into sf9 cells with Cellfectin to produce virus after 2-3 days of culture, and then the virus was step-amplified in sf9 cells and stored in a refrigerator.
  • MOI multiplicity of infection
  • the expressed CA09, Gy684, and FL04 HA mutant monomers were each purified in three consecutive steps using the AKTA BASIC chromatography system. Purification was performed to a purity of 90% or more using Ni-NTA affinity column, Mono Q ion exchange column, and superdex 200HR gel filtration column chromatography (FIGS. 2A, 2B, 2C).
  • mini-HA consisting of only the stem region (#4900 construct-stem HA; Impagliazzo A et al., 2015. Science 349: 1301-1306) Protein nucleotide sequences were synthesized and then expressed using insect cells sf9 and High Five. Continuous purification was performed with the AKTA BASIC chromatography system, and binding of the C179 stem region antibody as a control was confirmed in a concentration-dependent manner (FIG. 8C, middle, bottom).
  • Example 2 Influenza mutant virus hemagglutinin monomer properties
  • the selected mutation in the rutinine protein contributes to the dissociation of the trimer and the stability of the monomer.
  • the denaturation transition temperature indicating the stability of the H1 hemagglutinin mutant monomer was 4 degrees higher than the previously reported double mutant protein (Seok JH et al. 2017. Sci. Rep. 7: 7540). As it was confirmed to be higher than that, it is judged that it contributed to improving the stability as well as the expression rate of the monomer ( FIGS. 3A and 3B ). However, the fact that the transition temperature is still lower than that of the trimer suggests that more mutations may be required to access the monomer because the hemagglutinin protein has stable properties as the original trimer. In addition, it was confirmed that there was no significant difference in the viral hemagglutinin protein protomer for each season.
  • the monomeric hemagglutinin protein does not need to be bound by trimer symmetry when preparing a scaffold protein such as VLP compared to a trimer, and if it does not cause problems with solubility and protein aggregation, Since it can be stably present as a fusion protein in the present invention, it has the advantage of being easily introduced into nanoparticles.
  • the monomer is considered a useful material for the development of a universal vaccine that can overcome the low vaccine effect caused by various subtypes of the virus.
  • mice According to the mouse animal experiment date schedule (scheme), hemagglutinin-mutated monomers were subcutaneously injected into 8-week-old BALB/c mice at 2-week intervals, and then sold from the Center for Disease Control and Prevention.
  • the received PR8 virus (mouse adapted A/PuertoRico/8/34 virus: PR8 ) was infected with 5 LD 50 (5 ⁇ 10 2 PFU/mouse) to evaluate vaccine efficacy ( FIG. 4 ).
  • Mice used for animal experiments were operated in a total of 5 groups, and PBS buffer and SAS adjuvant were performed as a control group, and each group was as follows.
  • Group 1 native mice
  • group 2 PBS buffer + adjuvant
  • group 3 H1 (CA09) hemagglutinin mutant monomer + adjuvant
  • group 4 commercial SK Chem. Trivalent vaccine
  • group 5 mixture of H1, H3, B hemagglutinin mutant monomers + adjuvant.
  • the Sigma adjuvant system S6322 purchased from Sigma-Aldrich was used as the adjuvant.
  • Vaccine efficacy was evaluated by measuring changes in body weight and survival rates in mice infected with PR8 virus.
  • mice in the H1, H3, and B hemagglutinin-mutated monomer mixture group showed survival rates very similar to those of the naive mice group (Fig. 5).
  • the mouse group vaccinated with the commercial SK Chem trivalent vaccine and the hemagglutinin mutant monomer group were next to the mutant monomer mixture group in terms of survival ( FIG. 7 ).
  • the mouse group not given the hemagglutinin antigen was observed to lose 20% or more in body weight over 6-7 days. A reduction in body weight of 20% or more indicates the end of an ethical and humane experiment in animal testing.
  • the hemagglutinin-mutated monomer mixture group, the commercial SK Chem trivalent vaccine mouse group, and the hemagglutinin-mutated monomer group all showed a 10-15% decrease in weight change from the initial 6-8 days, but after 7-8 days While the survival rate was increased while overcoming it, group 1 of mice not given the antigen showed a weight change of 20% or more, and the survival rate was significantly decreased. Therefore, it was found that the hemagglutinin mutation monomer mixture group, the commercial SK Chem trivalent vaccine mouse group, and the hemagglutinin mutation monomer group were superior in the order of weight change and survival rate change.
  • the mixture group of rutinine mutant monomers showed 100% survival rate
  • the mouse group vaccinated with commercial SK Chem trivalent vaccine showed 80% survival rate
  • the hemagglutinin mutant monomer group showed 40% survival rate
  • the immune activity of the antigen is noteworthy.
  • the mutant protein according to the present invention, and a mixture group thereof showed an increase in weight gain and survival rate comparable to or superior to that of the commercial SK Chem trivalent vaccine group mice, confirming that the technical value was high.
  • Virus concentration (titer) was calculated.
  • the lung tissue was homogenized using a tissue homogenizer, and then centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes (4,000 ⁇ g ) to obtain a supernatant. 500 ⁇ l of the lung tissue supernatant diluted 1:10 was added to MDCK cells and infected for 3 hours.
  • the lung tissue supernatant was removed, the cells were washed 3 times with PBS, and Eagle's medium (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Düsseldorf, Germany) supplemented with 1 ⁇ g/ml TPCK-treated trypsin and 1% agarose was added. Incubated for 72 hours at 37° C. and 5% carbon dioxide incubator. After incubation, a plaque reduction assay was performed by staining with 0.5% (v/v) crystal violet, and the results were measured.
  • Eagle's medium Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Düsseldorf, Germany
  • the PR8 virus was added at a ratio of 9:1 (v/v) to the diluted mouse serum sample and reacted for 60 minutes. did it The reacted virus-diluted mouse serum sample was added to the MDCK cells and incubated at 37° C. and 5% carbon dioxide for 60 minutes.
  • the virus-diluted mouse serum sample was removed, the cells were washed 3 times with PBS, and Eagle's medium (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Düsseldorf) supplemented with 1 ⁇ g/ml TPCK-treated trypsin and 1% agarose (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Düsseldorf) , Germany) and incubated for 72 hours at 37°C in a 5% carbon dioxide incubator. After incubation, the number of plaques was measured by staining with 0.5% (v/v) crystal violet.
  • the antibody titer to the H1 hemagglutinin monomer was higher in the hemagglutinin mutated monomer group, and the antibody titer to the H1 hemagglutinin trimer was the mixture group of hemagglutinin mutant monomers, and commercial SK Chem 3 valency Both the vaccine mouse group and the hemagglutinin mutant monomer group showed a significant increase ( FIG. 8A ).
  • the H3 and B hemagglutinin antibody titers were high in both the hemagglutinin-mutated monomer mixture group, the commercial SK Chem trivalent vaccine mouse group, and the hemagglutinin-mutated monomer group ( FIG. 8B ).
  • the mixture group of hemagglutinin-modified monomers showed a very high value in the B-type hemagglutinin antibody titer, which was superior to the commercial SK Chem trivalent vaccine mouse group or hemagglutinin-mutated monomer group.
  • mini-HA (# 4900 construct-stem HA) was used. Instead of the hemagglutinin antigen derived from each mutant in the microplate, mini-HA containing only the stem region was immobilized, and then binding was induced according to the interaction of the antibody with the antigen in the serum. Serum from each group was used for the primary antigen-antibody reaction, and a secondary antibody conjugated with horseradish peroxidation effect was used. After adding TMB to develop color at room temperature, the reaction was stopped and absorbance was measured at 450 nm wavelength through a microplate reader.
  • the stem region-specific antibody titer showed significant antibody titers in the mixture group of hemagglutinin-mutated monomers, the commercial SK Chem trivalent vaccine mouse group, and the hemagglutinin-mutated monomer group (Fig. 8C), either the monomer alone or the mixed antigen group.
  • the stem-specific antibody titer showed comparable results to that of the commercial SK Chem trivalent vaccine group. If the stability of the hemagglutinin monomer is the same as that of the trimer, it is judged that more improved results can be obtained.
  • Example 4 Influenza virus-derived HA monomer mutant protein and PCNA fused HA- PCNAdm , PCNAdm - 3HA Preparation of antigenic proteins
  • HA and HA-Fab complex tertiary structure showed that HA was not a trimer but a monomer showing a monomer-monomer interaction (Cho et al. , 2013; 2014).
  • HA protein has been suggested as a molecular mechanism of a pandemic virus that facilitates membrane fusion by exhibiting a relaxed or flexible structure in the head region as a monomeric form (Cho et al., 2013; 2014).
  • HA trimer the interface between the monomers is hidden inside, whereas in the monomer, the interface with high conservation is exposed.
  • the trimer Since some of the monomer-monomer interface of the trimer acts as an epitope, it has been believed that the trimer is necessary for its antigenic role. However, since the HA monomer represents most of the antigenic determinants of the trimer, there is no significant difference from that of the trimer in antibody recognition (the dissociation constant K D indicating the antibody binding force is not significantly different) and the substrate specificity is the same. The antigen-antibody reaction having a portion of the interface of the trimer as an epitope does not show a significant difference even if there is no interface (Magadan et al., 2013; Cho et al., 2013).
  • Influenza virus HA is relatively unstable in its monomeric structure compared to its trimer.
  • H1 HA has 5 mutations (A/California/04/2009(H1N1): L73S, I77S, L80S, F88E, V91W)
  • H3 HA has 5 mutations (A/Gyeongnam/684/2006(H3N2): V73S, I77S, L80S, V84W, L91W)
  • B HA has 8 mutations (B/Florida/4/2006: L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W)
  • V29C/E105C, M320C/H111C 2 M320C/T111C 1 disulfide bond having a mutation capable of forming a stable form
  • a monomeric mutant protein was designed (FIGS.
  • Each HA mutant protein is a Bac-to inserted into a transfer vector by attaching a his-tag (6xHis-tag) to the 5' site, a foldon domain to the 3' site, and a thrombin cleavage site for each construct.
  • -bac system was designed, and through the selection process, the bacmid into which the correct target gene was inserted was selected. This is to promote stability before the foldon domain is cut by proteolytic cleavage after protein purification in insect cells (FIG. 10A, below).
  • PCNA wild type subunits PCNA1, PCNA2, PCNA3 and mutant subunits PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm were expressed and purified in E. coli bacterial cells to obtain high-purity protein subunits ( FIGS. 11A and 11B ).
  • BKI Bio-layer interferometer
  • the H1 subtype CA09 HA, B type FL04 HA, and H3 subtype Gy684 HA monomer mutant protein genes were bound to PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm, respectively.
  • the H1, B, and H3 virus-derived HA gene contains 5-8 mutations, and a GP67 signal sequence was placed in the 5' region to be expressed outside the cell, and it was bound to PCNA1dm, PCNA2dm, and PCNA3dm N-terminal, respectively (Fig. 10A, 10B). It was prepared as a fused construct by attaching an SGG linker between each HA gene and PCNA, and His-tag was used for each construct for easy purification.
  • recombinant bacmid DNA was produced in DH10Bac.
  • transfection of sf9 cells with Cellfectin the virus was produced after 2-3 days of culture, and then amplified and stored in a refrigerator.
  • H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, and H3 HA-PCNA3dm proteins were each purified by AKTA BASIC chromatography system. It was purified to a purity of 90% or more using Ni-NTA affinity, Mono Q ion exchange, and superdex 200HR size exclusion chromatography (FIG. 12A, top).
  • H1 HA-PCNA1dm and B HA-PCNA2dm proteins were first incubated, and then the H3 HA-PCNA3dm protein was incubated to induce assembly to prepare a fusion multiantigen PCNAdm-3HA protein (Fig. 12A, bottom).
  • a mini HA (#4900 construct-stem HA) protein consisting of only the stem region was synthesized with the reported nucleotide sequence, and then insect cells sf9 and High Five were used. was expressed using the AKTA BASIC chromatography system, followed by continuous purification (data not shown).
  • H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, and H3 HA-PCNA3dm recombinant complex proteins were measured using size exclusion chromatography-multi-angle light scattering (SEC-MALS), respectively.
  • SEC-MALS size exclusion chromatography-multi-angle light scattering
  • the molecular weight of PCNAdm-3HA formed by assembly of each of the H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, and H3 HA-PCNA3dm complex proteins was 326.3 kDa.
  • the size of the PCNAdm-3HA heterotrimer showed an average particle shape of 20-30 nm, indicating good assembly. 12C), it is judged that the mutant HA with improved stability was fused to the PCNAdm heterotrimer.
  • Example 6 Multiantigen PCNAdm - 3HA Animal test using antigen: group 1 PR8 ( H1N1 ) virus challenge
  • HA monomer, HA-PCNAdm antigen, and multi-antigen PCNAdm-3HA were inoculated into 5-week-old BALB/c mice by subcutaneous injection at 2-week intervals, and then the Korea Centers for Disease Control and Prevention virus After the PR8 virus (mouse adapted A/PuertoRico/8/34 virus: PR8) received from the distribution center was infected with 5 LD 50 (5 ⁇ 10 2 PFU/mouse), the vaccine efficacy was evaluated ( FIG. 13A ).
  • the animal test groups are as follows.
  • Group 1 naive mice
  • group 2 PBS buffer + adjuvant
  • group 3 PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + adjuvant
  • group 4 H1 HA monomer + adjuvant
  • group 5 H1 HA-PCNA1dm + adjuvant
  • Group 6 Commercial SK bioscience trivalent vaccine
  • Group 7 H1 HA, H3 HA, B HA mutant mixture + adjuvant
  • Group 8 H1 HA, H3 HA, B HA trimer mixture + adjuvant
  • Group 9 Multiple Antigen PCNAdm-3HA + adjuvant.
  • As the adjuvant a Sigma adjuvant system (S6322, SAS) purchased from Sigma-Aldrich was used.
  • Vaccine efficacy was evaluated by measuring changes in body weight and survival rates in mice infected with PR8 virus. In this animal experiment, a weight loss of 20% or more was determined as an ethical and humane end of animal experimentation.
  • Virus titer in the lungs after virus infection was calculated by sacrificing 3 animals per group on the 4th day after infection, extracting the virus from the lung tissue in PBS buffer, and then infecting MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells to calculate the virus concentration (titer). . After homogenizing the lung tissue, centrifugation (4,000 ⁇ g ) was performed at 4 ° C. for 5 minutes to obtain a supernatant. 500 ⁇ l of the supernatant was added to MDCK cells at a 1:10 ratio and infected for 3 hours.
  • the PR8 virus-infected experimental group showed an average virus reduction of 0.2-0.4log PFU/ml in the trimer, monomer antigen, and PCNA multi-antigen mouse group compared to the control group not given the antigen (Fig. 13C, top).
  • the lung titer decreased by 0.2-0.4log PFU/ml in the H1 HA-PCNA1dm, H1, H3, B HA trimer, monomer mixture, and multi-antigen PCNAdm-3HA groups.
  • SK Bioscience TIV mice showed a relatively small amount of decrease in the group with 0.09 log PFU/ml virus reduction.
  • the H1 HA antibody titer was high in the H1 HA-PCNA1dm group and the PCNAdm-3HA multiantigen group, and the H1, H3, and B HA trimer group also showed high values in the antibody titer to the H1 HA trimer antigen ( FIG. 13D ).
  • the B HA antibody titer was high in the H1, H3, B HA trimer, monomer group, and PCNAdm-3HA multi-antigen group, and the SK Bioscience trivalent vaccine group also showed a high antibody titer to the B HA trimer.
  • the antibody titer against H3 HA was higher in H1, H3, B HA trimer mixture and PCNAdm-3HA multiantigen group.
  • Mini HA (#4900 construct-stem HA) was used to measure the antibody titer specific to the stem region using mouse serum. After immobilizing Mini HA, the serum of each group was used for antigen-antibody reaction, secondary antibody and TMB were added to develop color at room temperature, and absorbance was measured at 450 nm wavelength. The stem region-specific antibody titers were the highest in the PCNAdm-3HA multi-antigen group and the H1 HA-PCNA1dm group, showing superiority ( FIG. 13D , lower right).
  • HA monomer, HA-PCNAdm complex, multi-antigen PCNAdm-3HA, etc. were inoculated into 5-week-old BALB/c mice by subcutaneous injection at 2-week intervals, and after 13 days, blood was collected and serum was separated. Separated serum was intraperitoneal injection into pre-adapted 7-week-old mice, and one day later, PR8 H1N1 subtype virus was intranasal (FIG. 14A).
  • the group is as follows.
  • Group 1 naive mice
  • Group 2 PBS buffer + adjuvant
  • Group 4 H1 HA monomer + adjuvant
  • Group 5 H1 HA-PCNA1 + adjuvant
  • Group 6 SK Bioscience commercial trivalent vaccine
  • Group 9 PCNAdm-3HA + adjuvant.
  • the group number was the same as that of the PR8 animal test group, and the vaccine efficacy was evaluated by measuring changes in mouse weight and survival rate.
  • the PCNAdm-3HA multi-antigen group and the H1 HA-PCNA1dm group had the lowest weight change and the highest survival rate, followed by the SK Bioscience trivalent vaccine group and the H1 HA monomer group ( 14B).
  • Lung tissue virus concentration was decreased by 1.9 and 1.4log PFU/ml in the PCNAdm-3HA multiantigen group and H1 HA-PCNA1dm group, respectively, and 0.2-0.6log PFU/ml in the SK Bioscience trivalent vaccine group and H1 HA monomer group. (Fig. 14C, top).
  • the results of the lysing plaque test showed that the PCNAdm-3HA multi-antigen group and the H1 HA-PCNA1dm group showed the highest neutralization antibody titers against H1, H3, and B HA antigens. (FIG. 14C, middle, bottom).
  • the PCNAdm-3HA multi-antigen group had the highest antibody titer against H1 HA, B HA, H3 HA, and mini HA ( FIG. 14D ).
  • the H1 HA antigen the H1 HA-PCNA1dm group, the SK Bioscience trivalent vaccine group, and the H1 HA monomer group followed.
  • the mini HA the PCNAdm-3HA multiantigen group, the H1 HA-PCNA1dm group, and the H1 HA monomer group were high. , This result suggests that the monomer is very effective in inducing stem-specific antibodies.
  • Example 8 polyantigen PCNAdm - 3HA Animal test using antigen: Group 2 X47 ( H3N2 ) virus challenge
  • mice were group 1: naive mice, group 2: PBS buffer + adjuvant, group 3: inactivated H3 X47 + adjuvant, group 4: SK Bioscience commercial trivalent vaccine, group 5: PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + adjuvant, group 6: H3 HA monomer + adjuvant, group 7: H3 HA-PCNA3dm + adjuvant, group 8: H1 HA, H3 HA, B HA mutant mixture + adjuvant, group 9: polyantigen PCNAdm-3HA + It was an adjuvant.
  • group 1 naive mice
  • group 2 PBS buffer + adjuvant
  • group 3 inactivated H3 X47 + adjuvant
  • group 4 SK Bioscience commercial trivalent vaccine
  • group 5 PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + adjuvant
  • group 6 H3 HA monomer + adjuvant
  • group 7 H3 HA-PCNA3dm + adjuvant
  • group 8 H1 HA, H3
  • the inactivated X47 virus group showed the smallest weight change and high survival rate, and the PCNAdm-3HA multi-antigen group and the H3 HA monomer group also showed small body weight change and high survival rate ( FIG. 15B ).
  • the H3 HA-PCNA3dm group followed, and the SK Bioscience commercial trivalent vaccine group had little effect.
  • the body weight decreased by 15% and was overcome after 7 days, whereas the SK Bioscience group showed a weight change of 20% or more on the 6th day, resulting in a significant survival rate. decreased.
  • X47 (H3N2) virus is a mouse-adapted virus produced by a reassortant of A/Victorial/3/75 (H3N2) and A/PR/8/34 (H1N1) viruses that were propagated in fertilized eggs.
  • the SK Bioscience vaccine having the seasonal virus H3 HA epitope since 2010 or PCNAdm-3HA multiantigen and H3 having the H3 HA epitope derived from the A/Gyeongnam/684/2006 virus HA monomer antigens are considered to be the cause of decreased immune activity. Nevertheless, it is noteworthy that the PCNAdm-3HA group and the H3 HA-PCNA3dm monomer group had a significantly higher survival rate compared to the commercial SK Bioscience trivalent vaccine group, and the stem-specific antibody was highly induced.
  • the virus was extracted from the lung tissue on the 4th day after infection, the virus was infected with Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, and the virus titer was calculated by a plaque reduction assay.
  • the inactivated X47 virus group showed about 2 log virus reduction compared to the control PBS buffer group, and the PCNAdm-3HA multiantigen group, H3 HA monomer and H3 HA-PCNA3dm group showed 1.2-1.5 log virus reduction. shown (Fig. 15C, top). After that, the monomer mixture group showed a difference of 0.8 log.
  • the commercial SK Bioscience trivalent vaccine group did not show a decrease in virus titer, and was the same as the control PBS buffer group.
  • the PCNAdm-3HA polyantigen, H3 HA monomer, H3 HA-PCNA3dm and H1, H3, B HA monomer mixture groups showed relatively high antibody titers, whereas the SK Bioscience commercial vaccine group showed relatively high antibody titers. It showed a low antibody titer to the H3 HA trimer antigen (FIG. 15C, bottom).
  • a noteworthy point is the low antibody titer of the inactivated X47 virus group. The reason for the low antibody titer compared to the survival rate is that the antigen used in the ELISA was recently H3 HA antigen derived from the influenza virus strain, not the 1970s.
  • the high survival rate of H3 HA monomer and PCNAdm-3HA antigen is considered a very meaningful result in that the X47 epitope represents a large epitope difference from the used H3 HA antigen. More importantly, the antibody titer against the mino HA antigen was the highest in the PCNAdm-3HA multi-antigen group. This is significantly consistent with the results of the PR8 (H1N1) animal experiment, showing that the PCNAdm-3HA multi-antigen group has a very high efficacy in inducing stem-specific antibodies.
  • the HA monomer, HA-PCNAdm and PCNAdm-3HA multiantigen used in the present invention has comparable or superior immune activity to the conventional trivalent vaccine commercialized for virus reduction and serum induced antibody titer.
  • the antigen composition of the present invention is usefully applicable to group 1 and 2 virus infection.
  • first fusion protein 110 first scaffold moiety
  • first recombinant antigen protein 200 second fusion protein
  • second scaffold fragment 220 second recombinant antigen protein
  • the antigen composition for the prevention or treatment of viral infectious diseases according to the present invention is very excellent in the preventive effect of inhibiting the proliferation and replication of viruses having various subtypes and mutations, and recyclability and safety are recognized by using a recombinant protein, the pharmaceutical field It can be widely used in various industries such as , life science, etc.

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체(recombinant hemagglutinin monomeric protein) 다중 변이단백질을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스캐폴드 기반의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물은 다양한 변이를 갖는 바이러스의 증식 및 복제를 저해하는 예방 효과가 매우 우수하고, 재조합 단백질을 이용함으로써 재활용성 및 안전성이 인정되는바, 의약 분야, 생명과학 분야 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물
본 발명은 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체(recombinant hemagglutinin monomeric protein) 다중 변이단백질을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스캐폴드 기반의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다.
인간을 비롯한 동물에 특정 질병 혹은 병원체에 대한 면역을 부여하는 백신의 개발은 대상 바이러스에 존재하는 다양한 아형으로 인한 한계점이 존재한다. 예를 들어, 독감은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)의 감염에 의한 호흡기 질병으로 매년 전 세계 10-20% 인구에서 발생한다. 이중 약 200만 명의 사상자와 미국에서만 매년 약 120 억불의 경제적 손실이 발생한다. 인플루엔자 바이러스는 생물학적 특성상 다양한 아형(subtype)이 존재한다. 이는 바이러스의 면역원성을 결정하는 두가지 단백질 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA)과 뉴라미니다아제 (Neuraminidase: NA) 단백질의 다양성에 기인하는데, 일 예로 A형 인플루엔자에 대해서 HA 16종, NA 9종이 존재하고 또 이들의 변이가 빈번히 발생한다. 따라서, 독감백신을 개발하기 위해서는 그 해에 유행할 것으로 예상되는 균주를 미리 예측하고 이를 이용하여 백신을 제작해야 한다. 따라서 유행 균주에 맞춰 백신을 매년 반복적으로 제작해야 할 뿐 아니라 실제 유행하는 균주가 백신 제작시 사용한 균주와 일치하지 않거나, 변이가 큰 새로운 균주가 유행할 경우 기존의 백신은 효과가 현저히 낮다는 문제점을 갖고 있다.
이를 해결하기 위한 방법으로 인플루엔자 바이러스 표면 단백질에 존재하는 아미노산 잔기의 보존성이 높은 부위를 이용하는 인플루엔자 바이러스의 범용성 백신의 개발이 연구되고 있다. 예를 들어, 높은 보존성의 항원결정기를 갖는 헤마글루티닌 단백질을 이용한 “mini-HA"가 H1 아형 단백질을 항원으로 수행한 실험에서 바이러스 효능을 나타냄으로써 범용성을 증명하였다(Impagliazzo A et al., Science 349.6254 (2015): 1301-1306).
그럼에도 불구하고, 다양한 변이체에 대해서 광범위한 범용성 백신으로 활용될 수 있는 새로운 백신의 개발이 여전히 요구되고 있으며, 특히 안전성이 보장되고, 대량생산이 가능하며 제조가 용이한 융합 단백질을 이용한 바이러스 백신 조성물의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.
본 발명에서는 부작용 또는 독성 등의 우려가 없으며 인플루엔자 바이러스를 비롯한 다양한 바이러스에 대한 예방 및 치료 효과가 뛰어난 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 5중 혹은 8중 변이 및 disulfide bond 변이 단량체 단백질을 유효성분으로 포함하는 항원 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에서는 다양한 아형 및 변이체에 대해 광범위하게 활용될 수 있는 범용성 백신을 개발하고자 하며, 이를 위해, 스캐폴드 분체 및 상기 스캐폴드 분체에 결합되는 재조합 항원 단백질을 포함하는 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공하고자 한다.
인플루엔자 바이러스 항원을 이용한 유니버설 백신 개발이 대부분 아미노산 보존성이 높은 (highly conserved) 단백질 부위를 인식하는 항체의 유도효과를 증진시키는 타겟을 갖고 있기 때문에, 기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 상기 재조합 헤마글루티닌 단량체 단백질의 세포기반 발현 및 마우스를 이용한 동물실험 결과를 통해서, 인플루엔자 바이러스에 뛰어난 항바이러스 예방효과를 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 5중 혹은 8중 변이 및 disulfide bond 변이 단량체 단백질을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공한다.
이때, 서열번호 1로 표시되는 다중 변이단백질은 H1 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 2개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질이고; 서열번호 2로 표시되는 다중 변이단백질은 B형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 8중 변이 단량체 단백질이며; 서열번호 3으로 표시되는 다중 변이단백질은 H3 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 1개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 스캐폴드 분체 및 상기 스캐폴드 분체에 결합되는 재조합 항원 단백질을 포함하는 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물은 다양한 아형 및 변이를 갖는 바이러스의 증식 및 복제를 저해하는 예방 효과가 매우 우수하고, 재조합 단백질을 이용함으로써 재활용성 및 안전성이 인정되는바, 의약 분야, 생명과학 분야 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1A는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 1차 구조와 단량체 3차 구조 모델을 나타낸 것이다 (위). H1 헤마글루티닌 구조의 헤드 부위 (푸른색)와 스템 부위 (오렌지색)을 표시하였으며, L73S, I77S, L80S, F88E, V91W 변이 아미노산 위치를 1차 및 3차 구조 모델에 각각 표시하였다. 그림에서 inset은 삼량체를 3-fold axis 위에서 내려본 단량체 사이의 interface를 나타낸 것이다. H1 subtype 헤마글루티닌의 경우 5개의 변이 중에서 L73S는 발현율을 5배 이상 증가시켰으며 (가운데), 이에 따라 B와 H3 헤마글루티닌은 각각 B/Florida/4/2006 (FL04) 바이러스 헤마글루티닌 L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W 8개 변이를, A/Gyeongnam/684/2006(H3N2) (Gy684) 바이러스 헤마글루티닌은 V73S, I77S, L80S, V84W, L91W 5개 변이를 제조하였다 (아래). 또한, H1 헤마글루티닌은 V20C-E105C/M320C-H111C를, H3 헤마글루티닌은 M320C-T111C를 각각 disulfide bond mutation을 수행하였다.
도 1B에서는 H1, H3, B 헤마글루티닌에서 5중 혹은 8중 변이 및 disulfide bond 변이를 포함하는 단량체 단백질 (H1 헤마글루티닌 단량체 5중 변이/2개 disulfide bond 변이단백질은 서열번호 1로 표시, B 헤마글루티닌 단량체 8중 변이단백질은 서열번호 2로 표시, H3 헤마글루티닌 단량체 5중 변이/1개 disulfide bond 변이 단백질은 서열번호 3으로 표시)의 아미노산 서열을 나타내었다. 변이 아미노산 잔기는 빨간색으로 표시하였다.
도 1C는 헤마글루티닌 변이를 통해서 삼량체에서 단량체로 변하는 특성을 나타낸 것이다 (위, 왼쪽). Disulfide bond 변이 아미노산 위치를 H1 헤마글루티닌의 구조를 통해 나타내었다 (위, 오른쪽). 헤마글루티닌 변이에 따른 단량체 최종 산물로 H1, H3, B형 헤마글루티닌 유전자 cloning 디자인을 통해서 mutation site를 각각의 헤마글루티닌 마다 나타낸 것이다 (아래). 각 변이주 H1, H3, B형 바이러스 유래의 헤마글루티닌 유전자를 각각 foldon과 융합된 construct를 만들었으며, 수월한 정제를 위해서 GP67 signal 서열 및 His-tag을 각 construct 마다 활용한 것이다.
도 2A는 H1 아형 헤마글루티닌 5중 변이와 disulfide bond 변이를 포함하는 단량체의 크로마토크래피의 정제 결과와 변성 전기영동 결과 (위)와 젤여과 크로마토그래피-다각도광산란 (size exclusion chromatography-multi angle light scattering)을 통해서 헤마글루티닌 변이단백질의 정확한 분자 크기를 측정한 결과 (아래)를 나타낸 것이다. Disulfide bond 변이 단량체는 2개의 disulfide bond를 형성한 변이단백질의 경우 발현이 개선되었고, 최종 단량체 (H1 HA_5m_2DS) 분자량은 70.1 kDa을 나타내었다.
도 2B는 H3 아형 헤마글루티닌 5중 변이와 1개의 disulfide bond 변이를 포함하는 단량체의 크로마토크래피 정제 결과와 변성 전기영동 결과 (위), 젤여과 크로마토그래피-다각도광산란을 통해서 헤마글루티닌 변이단백질의 정확한 분자 크기를 측정한 결과 (아래)를 나타낸 것이다. 최종 단량체 (H3 HA_5m_DS) 분자량은 85.0 kDa을 나타내었다.
도 2C는 B형 헤마글루티닌 8중 변이를 포함하는 단량체의 크로마토크래피의 정제 결과와 변성 전기영동 결과 (위), 젤여과 크로마토그래피-다각도광산란을 통해서 헤마글루티닌 변이단백질의 정확한 분자 크기를 측정한 결과 (아래)를 나타낸 것이다. 최종 단량체 (B HA_8m) 분자량은 62.5 kDa을 나타내었다.
도 3A는 시차주사형광법 (differential scanning fluorimetry: DSF)을 활용하여 H1 (위), H3 (아래) 아형 헤마글루티닌 5중 변이에 더해서 disulfide bond mutation을 수행하였을 때 단량체의 안정성을 측정한 것으로, 변성 전이온도 (transition temperature: Tm) 결과를 나타낸 것이다. 전기영동 결과 H1, H3 헤마글루티닌 항원 최종 단량체는 5중 단백질에 비해서 disulfide bond mutation을 수행하였을 때, 전이온도가 4도 이상 높은 것으로 나타나서, 단량체의 안정성이 향상되었음을 확인하였다.
도 3B는 계절 인플루엔자 바이러스와 신종 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 wild type 삼량체와 2중 변이 단량체 및 5중 변이 단량체의 특성을 젤여과 크로마토그래피-다각도광산란을 통해서 정확한 분자 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 헤마글루티닌 wild type 삼량체와 2중 및 5중 변이 단량체 분자량은 각각 205.9, 67.2 70.1 kDa을 나타내었다. 단량체 간의 분자량 차이는 계절 인플루엔자 A/Thailand/CU44/2006 (CU44)와 A/California/07/2009 (CA09) 유래 헤마글루티닌 단백질의 차이에 기인한다.
도 3C는 계절 인플루엔자 바이러스 CU44와 신종 인플루엔자 바이러스 CA09 헤마글루티닌 wild type 삼량체와 2중 변이 단량체 및 5중 변이 단량체의 전이온도를 나타낸 것이다. H1 아형 바이러스 헤마글루티닌의 경우 전이온도는 서로 다른 점을 보여주고 있고. 삼량체에 비해서 단량체는 계절 인플루엔자의 경우 약 10도 차이가 나며, 신종 인플루엔자의 경우는 삼량체와 단량체 안정성이 약 2도 차이가 있다. 특히 지난 연구결과인 2중 변이 단량체에 비해서 5중 변이 단량체가 2도 더 높은 것을 보임으로써 5중 변이에 의한 안정성을 나타내고 있다.
도 4는 H1, H3 아형 및 B형 헤마글루티닌 5중 혹은 8중 변이 및 disulfide bond 변이를 포함하는 단량체를 이용한 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 8마리 마우스를 사용하였으며, 항원소재를 각각 2주 간격으로 2회 투여하였고, 항원투여 priming 후 0주, 2주, 4주, 5주후 각각 채혈하였으며, 바이러스 감염은 intranasal로 투여하였다. 총 실험기간은 42일이었다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: H1 헤마글루티닌 5중 변이와 2개 disulfide bond 변이를 포함하는 단량체 + 에주번트, 그룹 4: 상업용 SK 바이오사이언스에서 제조된 세포배양 인플루엔자 3가 백신, 그룹 5: H1, H3, B 헤마글루티닌 5중 혹은 8중 변이 및 disulfide bond 변이를 포함하는 변이 단량체 혼합물 + 에주번트.
도 5는 H1 헤마글루티닌 변이 단량체, H1, H3, B 헤마글루티닌 변이 단량체 혼합물 등을 이용한 마우스 동물실험 결과를 나타낸 것이다. PR8 (H1N1) 바이러스 감염된 마우스에서 일자별 체중변화 (위) 및 생존율 (아래)을 나타내었으며, 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다.
도 6은 H1 헤마글루티닌 변이 단량체, H1, H3, B 헤마글루티닌 변이 단량체 혼합물 등을 이용한 마우스 동물실험 결과, 폐 조직에서의 바이러스 농도를 나타낸 것이다. PR8 (H1N1) 바이러스 감염 이후 4일째 마우스를 sacrifice 한 다음 폐 조직으로부터 바이러스 titer (Pfu/ml)를 측정하여 나타내었으며, 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다.
도 7은 동물실험에서 마우스 혈청을 이용한 용균반 감소 중화 (plaque reduction neutralization) 분석결과를 나타낸 것이다. 각 그룹의 마우스로부터 채혈한 serum을 활용하여 용균반 감소 중화 실험결과를 나타낸 것이다. PR8 바이러스-희석된 마우스 혈청 시료를 MDCK 세포에 첨가하였으며, 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다. 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용균반 수를 측정하였다.
도 8A는 동물실험에서 마우스 혈청을 이용한 ELISA 분석결과인 항체가를 나타낸 것이다, Immobilized 항원으로는 H1 HA_5m_2DS (위)와 H1 HA CU44 trimer (아래)를 사용하였으며, 각 그룹의 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험결과를 나타낸 것이다. 항원 투여 (prime-boost) 후 마우스로부터 채혈한 serum을 이용해서 ELISA 실험을 수행하였으며, 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 (secondary antibody-horseradish peroxidase) 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 8B는 동물실험에서 마우스 혈청을 이용한 ELISA 분석결과인 항체가를 나타낸 것이다, Immobilized 항원으로는 H3 아형 헤마글루티닌 (위)와 B형 헤마글루티닌 (아래)를 사용하였으며, 각 그룹의 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험결과를 나타낸 것이다. 항원 투여 (prime-boost) 후 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험을 수행하였으며, 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 (secondary antibody-horseradish peroxidase) 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 8C는 헤마글루티닌 스템 부위를 나타내는 mini-HA를 사용하여 동물실험에서 마우스 혈청을 이용한 헤마글루티닌 항체가 (위)를 나타낸 것이다. Immobilized 항원으로 mini-HA는 스템 부위로만 이루어진 삼량체 trimer로서 (Impagliazzo A et al., 2015. Science 349: 1301-1306), 정제 결과, 변성 전기영동 결과 (가운데) 및 알려진 스템 특이 항체 (C179)를 control로 했을 떄 농도의존적 활성을 확인하였다 (아래). 따라서 혈청 내에 스템 특이 항체만이 반응할 수 있으며, 항원 투여 (prime-boost) 후 마우스로부터 채혈한 혈청을 이용해서 ELISA 실험으로 특이항체를 검출하였다. 각 그룹은 도 4에 나열된 그룹과 동일하다.
도 9는 본 발명에 따른 다수의 융합 단백질에 포함된 스캐폴드 분체가 자가 조립되어 형성된 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 다수의 재조합 항원 단백질이 노출되는 원리를 나타낸 모식도이다.
도 10A는 계절 변이주 인플루엔자 바이러스 HA 3차 구조 모델을 활용하여 삼량체, 단량체 관계 (위 왼쪽), H1 HA 단량체 구조의 head region (파란색)과 stem region (주황색), L73S, I77S, L80S, F88E, V91W 변이 아미노산 위치를 표시한 것이다(위 오른쪽). H1 HA, B HA, H3 HA 변이단백질은 각각 A/California/07/2009 (CA09), B/Florida/4/2006 (FL04), A/Gyeongnam/684/2006(H3N2) (Gy684) 바이러스 유래 HA로서 L73S, I77S, L80S, F88E, V91W 5개 변이, L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W 8개 변이, V73S, I77S, L80S, V84W, L91W 5개 변이를 갖고 있다 (아래). 또한 H1 HA와 H3 HA에 각각 V29C/E105C, M320C/H111C 2개, M320C/T111C 1개 disulfide bond 형성 변이를 갖고 있고, PCNA1, PCNA2, PCNA3 mutation 변이를 갖는 단백질 1차 구조내 상대적 위치를 표시한 schematic diagram을 나타내었다. 각 HA 변이유전자를 foldon과 융합된 construct를 만들었으며, PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm N-terminal에 H1 HA, B HA, H3 HA 변이 유전자를 각각 결합시켰고 이들을 각각 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 이라 명명하였다. 각 HA와 PCNA 간에는 SGG linker를 붙여서 융합된 construct로 제조되었으며, 수월한 정제를 위해서 GP67 signal 서열, His-tag을 각 construct 마다 활용하였다.
도 10B는 H1 HA, B HA, H3 HA 단량체 변이단백질의 mutation 아미노산 잔기를 전체 아미노산 서열에 표시(빨간색)한 것이다.
도 10C는 PCNA 서브유닛(스캐폴드 분체)인 PCNA1, PCNA2, PCNA3의 assembly 개선 mutation 잔기를 표로 나타내었고 (위), PCNA 3차 구조상에서 PCNA1-PCNA2, PCNA2-PCNA3 인터페이스에서의 mutation 잔기를 구조모델에 표시하였고 (가운데), 각 mutation 아미노산 잔기를 PCNA 각 서브유닛 아미노산 서열에서 빨간색으로 표시하였다 (아래).
도 11A는 PCNA wild type 서브유닛 PCNA1, PCNA2, PCNA3 및 mutant 서브유닛 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm을 박테리아 발현 후 크로마토 그래피 정제단계에서 최종 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography: SEC)를 수행한 결과이다 (위). 변성 SDS-PAGE 결과에서 고순도로 정제된 PCNA 서브유닛의 상대적 분자량을 보여주고 있다 (아래). PCNA 서브유닛 wild type과 mutant 단백질의 aggregation을 체크하기 위해서 syringe filtering을 하기 전 (BF)과 후 (AF) 결과를 나타내었다.
도 11B는 PCNA wild type 서브유닛 PCNA1, PCNA2, PCNA3 및 mutant 서브유닛 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm을 박테리아 발현 후 크로마토 그래피 정제단계에서 최종 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography: SEC) 수행결과이다 (위). 각 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm은 SEC에서 elution volume이 약 13 ml이며, 변성 전기영동 (SDS-PAGE) 결과 정제가 완료된 PCNA wild type과 mutant 단백질 서브유닛은 28-40 kDa 범위의 동일한 크기를 보여주었다 (아래).
도 11C는 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm 변이 서브유닛 간의 assembly 결합상수 K D를 PCNA 단백질 wild type 서브유닛 assembly 결합상수와 비교한 것이다. PCNA1-PCNA2 및 PCNA2-PCNA3 wild type과 mutant 사이의 결합상수를 측정하기 위해서 Bio-layer interferometer (BLI) Blitz system (ForteBio, Menlo Park, CA, U.S.A.)를 활용하였다. PCNA1dm-PCNA2dm 반응 및 PCNA3dm-PCNA2dm 반응에 대한 반응속도 상수 k a, k d 및 결합상수 K D를 wild typ 단백질 결합반응과 비교하여 50-1000 nM 농도범위에서 측정하였다. PCNA mutant의 결합이 wild type에 비해서 3-6배 개선되었음을 확인하였다.
도 12A는 동물실험을 위한 H1, B, H3 HA 변이 단량체를 각각 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm에 결합한 퓨전단백질 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 정제 및 assemble된 결과를 크기배제 크로마토그래피와 변성 전기영동 SDS-PAGE 결과로 보여주며, 고순도 정제된 PCNA 서브유닛 (위, inset)의 변성 및 비변성 전기영동 (도 12A 아래) 결과를 나타낸 것이다. 최종 assemble 되어 정제가 완료된 PCNAdm 서브유닛은 28-40 kDa 범위에 있으며, PCNAdm3HA complex는 각각 HA와 결합된 100-130 kDa 분자량을 보였다. 동물실험에 사용된 항원들의 변성 및 비변성 전기영동 실험에서 각각 PCNAdm-3HA, H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 외에 H1 HA, B HA, H3 HA monomer를 분석한 결과를 보여주고 있다 (아래). 사용된 항원들의 상대적 분자량 외에도 순도와 고농도를 확인하였다.
도 12B는 H1, B, H3 HA 변이 단량체를 각각 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm에 결합한 퓨전단백질, H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm을 최종 정제하고, 이들의 분자량을 크기배제 크로마토그래피-다각도광산란 (SEC-MALS) 장치를 활용하여 측정한 것이다. H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 퓨전단백질 분자량은 각각 103.8, 89.9, 133.2 kDa으로 측정되었고, 최종 assembled PCNAdm-3HA는 분자량 326.3 kDa으로 확인되었다 (위, 왼쪽). 변성 전기영동 (SDS-PAGE) 결과 H1 HA-PCNA1dm과 PCNAdm-3HA complex의 상대적 분자량을 보여주었으며 (위, 오른쪽), H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 및 PCNAdm-3HA 항원에 대한 SEC-MALS 실험 scattering 결과를 나타내었다 (아래).
도 12C는 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM) negative staining (위)과 2D averaging (아래)을 활용해서 PCNAdm-3HA를 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 일부 assemble 된 PCNAdm-3HA 관찰결과를 나타내며, 20-30 nm 입자 크기의 PCNAdm-3HA 헤테로 삼량체 모양을 보여주었다.
도 13A는 HA 단량체 및 스캐폴드 다중항원 등을 이용하여 인플루엔자 바이러스 그룹 1에 속하는 PR8 H1N1 바이러스 challenge 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 8마리 마우스를 사용하였으며 (control naive 그룹은 5마리), 항원소재를 2주 간격으로 2회 투여하였고, 항원 priming 후 0주, 2주, 4주, 4주+4일후 각각 채혈하였으며, PR8 H1N1 아형 바이러스 감염은 intranasal로 투여하였다. 총 실험 기간은 42일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: PCNA1dm-PCNA2dm-PCNA3dm assembled + 에주번트, 그룹 4: H1 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 5: H1 HA-PCNA1dm + 에주번트, 그룹 6: 상업용 SK Bioscience. 3가 백신, 그룹 7: H1 HA, H3 HA, B HA trimer 혼합물 + 에주번토, 그룹 8: H1 HA, H3 HA, B HA 변이단량체 혼합물 + 에주번트, 그룹 9: PCNAdm-3HA + 에주번트.
도 13B는 H1 HA 단량체, H1 HA-PCNA1dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질 등을 이용한 마우스 동물실험 결과를 나타내었다. PR8 (H1N1) 바이러스 감염된 마우스에서 일자별 체중변화 (위) 및 생존율 (아래)을 나타낸 것이다. Positive control로 SK Bioscience에서 구입한 상용 3가 백신을 이용하였고, 마우스 체중 20% 이상 감소를 생존율 종료로 결정하였으며, 각 그룹은 도 13A와 동일하였다.
도 13C는 H1 HA 단량체, H1 HA-PCNA1dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질 등을 이용한 마우스 동물실험 결과, PR8 (H1N1) 바이러스 감염 이후 4일째 마우스를 sacrifice 한 다음 폐 조직에서의 바이러스 titer를 log PFU/ml로 나타낸 것이다 (위). 항원 접종 시기부터 바이러스 감염 4일 후 채취한 혈액 내 항체 형성 유무는 각각 H1N1, H3N2, B 바이러스와 1시간 반응 후, MDCK세포에 감염시켜서 plaque reduction neutralization titer (PRNT) 산출 결과를 보여주었다 (가운데, 아래).
도 13D는 마우스로부터 채혈한 serum을 이용해서 ELISA 실험을 수행하였으며, H1 HA, H3 HA, B HA trimer, monomer 및 stem region mini HA를 각각 antigen으로 활용하여 항체가를 나타낸 것이다. ELISA microplate에 HA 항원 200 ng을 4도에서 overnight coating 한 후, 1차 항체 결합으로 채혈한 serum을 serially dilution하여 37 ℃에서 1시간 결합하였다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그룹은 도 13A와 동일하였다.
도 14A는 HA 단량체 및 스캐폴드 다중항원 등으로 유도된 면역 혈청을 이용한 passive immunization 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 5주령 마우스를 1주일간 적응한 다음, 항원소재를 2주 간격 2회 투여하였고, 항원투여 boosting 4일 후 채혈하여 혈청을 분리하였다. 7주령 마우스를 6개 그룹으로 나누어 (각 그룹당 7마리, control native 그룹은 5마리), 분리된 혈청을 각 그룹 마우스에 intraperitoneal 주사를 시행하였고, 1일 후 PR8 H1N1 아형 바이러스를 intranasal로 감염시켜 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 총 실험 기간은 42일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 4: H1 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 5: H1 HA-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: SK Bioscience 상용 3가 백신, 그룹 9: PCNAdm-3HA + 에주번트. 그룹 번호는 도 13A 그룹과 동일한 번호를 사용하였다.
도 14B는 H1 HA 단량체, H1 HA-PCNA1dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 등으로 유도된 면역 혈청을 이용한 passive immunization 동물실험 결과를 나타내었다. PR8 (H1N1) 바이러스 감염된 마우스에서 면역 효과를 일자별 체중변화 (위) 및 생존율 (아래)로 나타낸 것이다. Positive control로 SK Bioscience 3가 백신 그룹을 활용하였고, 마우스 체중 20%이상 감소를 생존율 종료로 결정하였다.
도 14C는 H1 HA 단량체, H1 HA-PCNA1dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질 등으로 유도된 면역 혈청을 이용한 passive immunization 동물실험 결과, 4일째 마우스를 sacrifice 한 다음 폐 조직에서의 바이러스 titer를 log PFU/ml로 나타낸 것이다 (위). 항원 접종 시기부터 바이러스 감염 4일 후 채취한 혈액 내 항체 형성 유무는 각각 H1N1, H3N2, B 바이러스와 1시간 반응 후, MDCK세포에 감염시켜서 plaque reduction neutralization titer (PRNT) 산출 결과를 보여주었다 (가운데, 아래).
도 14D는 인플루엔자 바이러스 HA 항원이 접종된 mouse 혈청을 투여받은 mouse 에서 항체 형성 여부를 확인하기 위하여, serum IP transfer 시킨 mouse 에서 얻은 혈청을 ELISA assay 를 통해 H1 HA, H3 HA, B HA trimer와 monomer 혹은 mini HA 를 각각 antigen으로 활용하여 항체가를 나타낸 것이다. ELISA microplate에 각 항원 200 ng을 4 ℃에서 overnight coating한 후, 1차 항체 결합으로 채혈한 serum을 serially dilution하여 37 ℃에서 1시간 결합하였다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그룹은 도 14A와 동일하였다.
도 15A는 HA 단량체 및 스캐폴드 다중항원을 이용하여 인플루엔자 바이러스 그룹 2에 속하는 X47 H3N2 아형 challenge 마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)을 나타낸 것이다. 각 그룹당 8마리 마우스를 사용하였으며 (control naive 그룹은 5마리), 항원소재를 2주 간격으로 2회 투여하였고, 항원투여 priming 후 0주, 2주, 4주, challenge 4일후 각각 채혈하였으며, 바이러스 감염은 intranasal로 투여하였다. 총 실험 기간은 42일이었으며 각 그룹은 아래와 같다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: inactivated H3 X47 + 에주번트, 그룹 4: 상업용 SK Bioscience 3가 백신 + 에주번트, 그룹 5: PCNA1dm-PCNA2dm-PCNA3dm assembled + 에주번트, 그룹 6: H3 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 7: H3 HA-PCNA3dm + 에주번트, 그룹 8: H1 HA, H3 HA, B HA 변이단량체 혼합물 + 에주번트, 그룹 9: PCNAdm-3HA + 에주번트.
도 15B는 H3 HA 단량체, H3 HA-PCNA3dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질 등을 이용하여, 인플루엔자 바이러스 그룹 2에 속하는 X47 H3N2 아형 challenge 마우스 동물실험 결과를 나타내었다. X47 (H3N2) 바이러스에 감염된 마우스의 일자별 체중변화 (위) 및 생존율 (아래)을 나타낸 것이다. Positive control로 SK Bioscience에서 구입한 3가 백신을 이용하였고, 마우스 체중 20%이상 감소를 생존율 종료로 결정하였다.
도 15C는 H3 HA 단량체, H3 HA-PCNA3dm 및 H1, B, H3 HA가 fusion된 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질 등을 이용한 마우스 동물실험 결과, 바이러스 감염 이후 4일째 마우스를 sacrifice 한 다음 폐 조직으로부터 바이러스 titer (PFU/ml)를 측정한 결과 (위). 4 dpi 마우스로부터 채혈한 serum을 이용해서 ELISA 실험을 수행하였으며, H1, H3, B HA monomer, trimer 및 mini HA를 각각 antigen으로 활용하여 항체가를 나타낸 것이다 (아래). ELISA microplate에 각 항원 200 ng을 4 ℃에서 overnight coating한 후, 1차 항체 결합으로 채혈한 serum을 serially dilution하여 37 ℃에서 1시간 결합하였다. Microplate를 이용한 ELISA assay로 2차항체-양고추냉이과산화효소 반응을 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
인플루엔자 바이러스는 막융합이라는 기작을 통해서 숙주 세포에 침입하는데 가장 중요한 역할이 헤마글루티닌 단백질의 구조적 변화이다. 특히 헤마글루티닌 단백질은 태생적인 스템 부위의 불안정성을 헤드 부위가 capping 역할을 통해서 전체적인 삼량체 안정성을 유지하는 특성을 갖고 있다. 지난 10여 년간 유니버설 백신은 불안정한 스템 부위를 안정하게 노출시켜 stem 특이항체를 유도하는 방향으로 전개되어 왔다. 본 발명에서는 기존과는 다른 시각에서 conserved 부위를 노출할 수 있는 안정적인 단량체 항원을 개발하였고, 이에 따라 삼량체보다 인터페이스 부위를 잘 노출시킬 수 있는 구조적 장점을 활용할 경우 면역 활성을 크게 향상시킬 수 있다는 점을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에서는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단량체 (monomer)를 안정화시키기 위해서, H1 아형, H3 아형, B형 헤마글루티닌 단백질에 아미노산 잔기 mutation은 다음과 같다: H1 HA: L73S, I77S, L80S, F88E, V91W 5중 변이를, H3 HA: V73S, I77S, L80S, V84W, L91W 5중 변이를, B HA: L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W 8중 변이 단량체를 각각 제조하였으며, H1 HA는 V20C-E105C/M320C-H111C를, H3 HA는 M320C-T111C를 각각 disulfide bond mutation을 수행하였다. 최종 H1 HA 단량체 5중 변이 및 2개 disulfide bond 변이 단백질은 서열번호 1로 표시, B HA 단량체 8중 변이단백질은 서열번호 2로 표시, H3 HA 단량체 5중 변이 및 1개 disulfide bond 변이 단백질은 서열번호 3으로 표시되며, 이들의 단량체 특성을 확인하였다.
다음으로, 상기 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물을 이용하여 세포기반 발현 및 마우스를 통한 동물실험을 수행하였으며, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 상용화된 종래 인플루엔자 3가 백신에 필적하는 면역활성이 있음을 확인하였고, 특히 종래 인플루엔자 3가 백신에서는 노출이 어려운 단량체-단량체 인터페이스 부위에 특이적인 항체를 유도할 가능성이 높은 단량체를 기반으로 한 구조적 장점을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물에 관한 것이다.
이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 다중 변이단백질은 H1 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 2개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질이고; 상기 서열번호 2로 표시되는 다중 변이단백질은 B형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 8중 변이 단량체 단백질이며; 상기 서열번호 3으로 표시되는 다중 변이단백질은 H3 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 1개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 바이러스는 인체 및 동물을 감염시키는 바이러스라면 모두 가능하며, 예를 들어 인플루엔자바이러스를 포함하는 오소믹소바이러스(Orthomyxoviridae), 돼지전염성위장염(Transmissible gastroenritis virus), 돼지 유행성설사(Porcine Epidemic Diarrhea; PED) 바이러스, 사스, 메르스 및 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스(Coronavirus), 지카바이러스(Zicavirus), 소바이러스설사(Bovine Viral Diarhhea; BVD) 바이러스를 포함하는 플라비바이러스(Flavivirus), 노로바이러스(norovirus)를 포함하는 캘리시바이러스(Calicivirus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 돼지 호흡기 생식기 증후군(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome; PRRS) 바이러스, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2; PCV2) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 파보바이러스(Parvovirus), 피코르나바이러스(Picornavirus), 페스티바이러스(Pestivirus), 랩도바이러스(Rhabdovirus), 버나바이러스(Birnavirus), 레트로바이러스(Retovirus) 및 허피스바이러스(Herpesvirus)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서에서, '예방'또는'치료'는 질환 증상의 경감 또는 개선, 질환 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, '조성물'은 특정 성분을 포함하는 산물 외에, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 항원 조성물은 척추동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에 투여되는 의약 조성물의 형태이거나 식품 조성물, 통상의 예방 및 치료용 항바이러스제 등 통상적으로 알려진 모든 형태로의 적용이 가능하다.
본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항원 조성물이 다양한 바이러스에 대한 예방 효능을 가짐을 확인하였으며, 특히 오소믹소비리대 ( orthomyxoviridae)에 속하는 인플루엔자 바이러스에 대해 우수한 바이러스 예방 효능을 가짐을 밝혔다.
구체적으로 하기 실시예에서는 동물실험을 통해 변이 단량체가 비교군으로 사용된 PBS 완충용액 혹은 상용 SK Chem 인플루엔자 3가 백신에 필적하거나 더 개선된 면역활성을 나타냄을 확인하였으며, 용액상으로 존재하는 높은 순도의 변이 단량체 면역활성은 시료 내 이들 재조합 단백질의 함량과 직접적인 관계가 있는 것으로 보인다.
본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질은 오소믹소바이러스의 증식 및 복제를 저해함으로써 동물 및 인체 인플루엔자에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 오소믹소바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 동물을 대상으로 하는 오소믹소바이러스 (orthomyxovirus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
인플루엔자 헤마글루티닌 단량체는 Bac-to-bac 시스템을 이용하여 쉽게 변이를 줄 수 있고, 곤충세포 sf9과 hi5 세포를 이용한 발현이 용이하며, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제한 후 특성 분석이 용이한 정제된 단백질 항원이다. 항원 단백질 변이는 바람직하게는 Bac-to-bac 시스템으로 박테리아에서 선별과정을 거쳐 정확히 타겟 유전자가 삽입된 bacmid를 세포에 도입 (transfection)하여 이루어질 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 항원 단백질은 여타의 유전자 공학적 방법으로 만들 수 있다.
상기 헤마글루티닌 단백질은 보다 바람직하게는 sf9과 hi5 곤충 세포 외에 동물 및 박테리아를 포함하는 기타 세포에서 발현된 단백질일 수 있다.
상기 헤마글루티닌 단백질 정제시 Ni-NTA affinity 컬럼, Mono Q ion exchange 컬럼과 superdex gel filtration 200HR 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제한 후 특성 분석이 용이하며, 다양한 인플루엔자 바이러스에서 유래된 헤마글루티닌 항원으로 만들 수 있다. 상기 정제과정을 수행함에 있어서 기타 정제방법을 이용하여 순도 높은 단백질을 정제할 수 있다.
특히 트립신 분해효소 (trypsin)을 이용하여 활성형 (active form)으로 정제하여 제조할 수 있으며, 트립신이 아닌 다른 분해 효소를 이용할 수 있다. 상기 정제과정을 수행함으로써 추출액 등에 남아 있는 잔사 등을 제거하거나 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 오소믹소바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물 또는 스캐폴드 분자에 결합한 형태로 포함할 수 있으며, 이외에도 제형, 사용 방법 및 사용 목적에 따라 당 분야에 사용되는 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함할 수 있을 뿐만 아니라, 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 조성물은 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예컨대 경구 투여시에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 제공될 수 있다. 조류를 포함하는 동물, 바람직하게는 인간, 조류를 포함하는 동물에 투여되는 의약 조성물의 형태 등 통상적으로 알려진 모든 형태로 제조될 수 있다.
상기 오소믹소바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물 또는 다른 성분이 첨가된 혼합물로 제공되는 경우, 조성물 총 중량에 대하여 상기 재조합 항원 단백질(다중 변이 단량체 또는 이들의 혼합물)을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절 및 적절하게 선택될 수 있으나, 바람직하게는 성인(70 kg) 기준 1일 50 내지 100 mg이 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 구현예에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질 각각 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 오소믹소바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기에 적합한 임의의 생약 형태, 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태, 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료 등과 같은 액체 형태일 수 있다. 아울러, 영양제, 비타민, 전해질 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 오소믹소바이러스 감염질환은 바이러스에 의해 초래되기 때문에 박테리아성 질환과 같은 2차 감염 문제가 아니라면 항생제는 효과가 없다. 이에 본 발명자들이 상기 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공함으로써 감염을 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명은 또한, 스캐폴드 분체 및 상기 스캐폴드 분체에 결합되는 재조합 항원 단백질을 포함하는 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물을 제공한다.
이때, 상기 융합 단백질(100, 200, 300)은 서로 다른 다수개이고, 다수개의 상기 융합 단백질은 각각의 상기 스캐폴드 분체(110, 210, 310)가 자가 조립되어 고리형 스캐폴드를 형성하고, 상기 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 상기 재조합 항원 단백질(120, 220, 320)이 노출되는 것을 특징으로 할 수 있다(도 9 참고).
또한, 상기 융합 단백질은 상기 스캐폴드 분체 및 상기 재조합 항원 단백질이 서로 상이한 다수개인 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제1 융합 단백질(100)은 서열번호 4로 표시되는 제1 스캐폴드 분체(110)(하기 실시예에서 PCNA1dm으로 칭함) 및 상기 제1 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 1로 표시되는 제1 재조합 항원 단백질(120)(하기 실시예에서 H1 HA 단량체 다중 변이 단백질로 칭함)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 9 참고).
또한, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제2 융합 단백질(200)은 서열번호 5로 표시되는 제2 스캐폴드 분체(210)(하기 실시예에서 PCNA2dm으로 칭함) 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 2로 표시되는 제2 재조합 항원 단백질(220)(하기 실시예에서 B HA 단량체 다중 변이 단백질로 칭함)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 9 참고).
또한, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제3 융합 단백질(300)은 서열번호 6로 표시되는 제3 스캐폴드 분체(310)(하기 실시예에서 PCNA3dm으로 칭함) 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 3으로 표시되는 제3 재조합 항원 단백질(320)(하기 실시예에서 H3 HA 단량체 다중 변이 단백질로 칭함)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 9 참고).
또한, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제1 융합 단백질(100)은 서열번호 4로 표시되는 제1 스캐폴드 분체(110) 및 상기 제1 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 1로 표시되는 제1 재조합 항원 단백질(120)을 포함하고, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제2 융합 단백질(200)은 서열번호 5로 표시되는 제2 스캐폴드 분체(210) 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 2로 표시되는 제2 재조합 항원 단백질(220)을 포함하고, 다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제3 융합 단백질(300)은 서열번호 6로 표시되는 제3 스캐폴드 분체(310) 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 3으로 표시되는 제3 재조합 항원 단백질(320)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 9 참고).
본 발명에 따르면, 상기 스캐폴드 분체는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 항원 단백질은 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 바이러스는 인체 및 동물을 감염시키는 바이러스라면 모두 가능하며, 예를 들어 인플루엔자바이러스를 포함하는 오소믹소바이러스(Orthomyxoviridae), 돼지전염성위장염(Transmissible gastroenritis virus), 돼지 유행성설사(Porcine Epidemic Diarrhea; PED) 바이러스, 사스, 메르스 및 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스(Coronavirus), 지카바이러스(Zicavirus), 소바이러스설사(Bovine Viral Diarhhea; BVD) 바이러스를 포함하는 플라비바이러스(Flavivirus), 노로바이러스(norovirus)를 포함하는 캘리시바이러스(Calicivirus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 돼지 호흡기 생식기 증후군(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome; PRRS) 바이러스, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2; PCV2) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 파보바이러스(Parvovirus), 피코르나바이러스(Picornavirus), 페스티바이러스(Pestivirus), 랩도바이러스(Rhabdovirus), 버나바이러스(Birnavirus), 레트로바이러스(Retovirus) 및 허피스바이러스(Herpesvirus)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형, 사용 방법 및 사용 목적에 따라 당 분야에 사용되는 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함할 수 있을 뿐만 아니라, 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 조성물은 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예컨대 경구 투여시에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 제공될 수 있다. 조류를 포함하는 동물, 바람직하게는 인간, 조류를 포함하는 동물에 투여되는 의약 조성물의 형태 등 통상적으로 알려진 모든 형태로 제조될 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 융합 단백질을 .001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절 및 적절하게 선택될 수 있으나, 바람직하게는 성인(70 kg) 기준 1일 50 내지 100 mg이 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 스캐폴드 분체 및 상기 스캐폴드 분체에 결합되는 재조합 항원 단백질을 포함하는 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기에 적합한 임의의 생약 형태, 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태, 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료 등과 같은 액체 형태일 수 있다. 아울러, 영양제, 비타민, 전해질 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 바이러스 재조합 표면 퓨전단백질의 안정한 변이단량체 (RECOMBINANT VIRUS SURFACE PROTEIN MUTANT MONOMERS)가 스캐폴드 분자에 결합된 형태의 다중항원 (SCAFFOLD-BASED MULTIVALENT ANTIGENS) 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인플루엔자 바이러스 표면단백질 헤마글루티닌의 안정한 재조합 변이단량체를 스캐폴드 분자 PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)에 결합시켜 만든 complex 다중항원(도 9 참고)을 유효성분으로 포함함으로써, 다양한 바이러스 변이주가 야기하는 질병에 예방 또는 치료 효과가 있는 범용성 또는 유니버설 항원 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 다중 항원 조성물은 두 가지 기반 기술에 근거하고 있다. 첫째, 재조합 HA 단백질 삼량체 (trimer) 항원에 비해서 단량체 (monomer) 모노항원의 면역활성이 시판되는 상용백신에 비교할 만하거나 특정 항체반응 유도에 장점을 갖는다는 점이다. 둘째, 단백질 제조면에서 단량체 변이단백질은 스캐폴드에 융합할 때 삼량체 응집 문제가 없고, assemble 되었을 때 안정성, 수용성 등 특성이 개선된다. 셋째, 안정한 단량체 변이단백질 제조에는 시간과 노력이 필요하지만, 단량체의 안정성이 이루어지면 결과적으로 보존성이 높은 부위 (highly conserved region) 항원결정기 노출이 더욱 쉽기 때문에 범용성 항원으로 가치가 높아지게 된다. 본 발명에서 인플루엔자 바이러스 HA 단량체 (monomer)를 안정화시키기 위하여, H1 아형 HA, B형 HA, H3아형 HA 단백질에 각각 5개 혹은 8개 아미노산 잔기를 mutation 하였고 (H1 HA: L73S, I77S, L80S, F88E, V91W; B HA: L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W; H3 HA: V73S, I77S, L80S, V84W, L91W; 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시), 특성분석을 수행하여 이들 변이단백질이 단량체로 확인되었다 (아래 실시예).
본 발명에서 다루려는 스캐폴드 단백질은 Sulfolobus solfataricus 유래의 proliferating cell nuclear antigen (PCNA)이며 (Dionne et al., 2003), 스캐폴드 단백질의 N- 혹은 C-terminal에 다양한 바이러스 단백질 항원을 결합시킬 수 있다. 최대 6가지 다른 항원을 결합시킬 수 있으며, 항원 크기에 따라 다르지만, HA 항원이 융합되었을 경우 나노입자 크기 즉, 30-40 nm에 달하는 특성을 갖고 있기 때문에, 아래 발명의 내용에서 보듯이 동물실험 결과 면역 활성을 크게 개선하는 것으로 나타났다. S. solfataricus PCNA 단백질은 PCNA1, PCNA2, PCNA3 서브유닛(subunit, 스캐폴드 분체)으로 이루어졌고, PCNA1과 PCNA2에 의한 dimer가 만들어진 다음 PCNA3가 assembly되어 헤테로 삼량체 (heterotrimer)를 만드는 것으로 알려져 있다 (Dionne et al., 2003). 용액 상에서 PCNA 헤테로 삼량체는 PCNA1, PCNA2, PCNA3를 동시에 혼합해도 assembly가 잘 이루어지며 (data not shown), 또한 3개의 PCNA-HA 항원 융합단백질의 assembly는 Pseudomonas putida cytochrome P450 monooxygenase, ferredoxin, ferredoxin reductase의 전자전달을 증진시키기 위해서 각각 PCNA3, PCNA2, PCNA1에 퓨전시킨 다음 이들을 assembly 시켜서 단백질 전자전달 complex 기능이 확인된 바 있다 (Hirakawa and Nagamune, 2010). 이때 enzyme과 PCNA 사이의 linker 길이를 길게하여 (각각 10개, 16개, 3개 아미노산 길이) 전자전달 기능에 초점을 맞춤으로써, 퓨전 complex 단백질의 flexibility를 고려한 것으로 해석된다.
선행연구를 통해서 인플루엔자 항원단백질 HA가 결합된 PCNA-HA를 이용하였을 때, H1 HA-PCNA1, B HA-PCNA2 및 H3 HA-PCNA3의 assembly가 in vitro 상에서 잘 이루어지지 않았다. Assembly 결합력을 높이기 위해서, PCNA1, PCNA2, PCNA3가 서로 상호작용하는 interface에 각각 2개의 mutation을 시행하였고 (각각 T112K/Y114K, S172V/A174V, Y73F/S170V), 이들을 각각 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm로 명명(각각 서열번호 4 내지 6으로 표시됨)하였다. PCNA1 과 PCNA2 및 PCNA3과 PCNA2 결합이 wild type 단백질 보다 mutant 단백질 결합이 3-5배 더 강해진 것을 확인하였다 (아래 결과 참조). 이에, 본 발명자들은 재조합 H1, H3 아형 및 B형의 안정한 HA 단량체 변이단백질을 스캐폴드 PCNA 단백질 변이 서브유닛 (subunit) PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm에 각각 fusion 시킨 다음, 이들을 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm라 명명하였고(각각의 융합 단백질에 해당, 통합하여 HA-PCNAdm으로 명영), assemble 시킨 다음, 크기배제 크로마토그래피를 활용해서 assemble 된 다중항원을 분리한 다음, 최종 PCNAdm-3HA라 명명하였다.
인플루엔자 바이러스는 막융합 기작을 통해서 숙주 세포에 침입하는데, 이때 중요한 역할이 HA 단백질의 pH에 따른 구조변화이다. HA 단백질은 구조변화에 필요한 태생적인 stem region의 불안정성을 head region과 삼량체 특성으로 안정성을 유지하는 특성을 갖고 있다. 종래 유니버설 백신 연구는 불안정한 stem region을 안정하게 노출시켜, 보존성이 높은 stem region에 특이적 결합을 하는 항체를 유도하는 방향으로 전개되어 왔다. 따라서 본 발명은 기존과는 다른 시각에서 conserved 부위를 노출할 수 있는 안정적인 단량체 항원을 개발하였고, 이를 다중항원 결합이 가능한 스캐폴드 PCNA에 결합시킨 융합 단백질(HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA)을 활용함으로써, 면역 활성을 향상시킬 수 있었다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 융합 단백질(HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA)을 유효성분으로 포함하는 항원 조성물이 오소믹소비리대 ( orthomyxoviridae)에 속하는 인플루엔자 바이러스에 대해 우수한 바이러스 예방 효능을 갖고 있음을 밝혔다. 다양한 재조합 HA 단량체가 결합된 HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA 항원 조성물은 동물실험에서 비교군으로 사용된 PBS 완충용액 혹은 SK Bioscience 상용 인플루엔자 3가 백신 보다 더 개선된 면역활성을 보여줌으로써, 용액상으로 존재하는 높은 순도의 재조합 HA 단량체가 결합된 HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA 단백질 항원의 면역활성은 시료 내 이들 재조합 단백질 항원의 함량과 직접적인 관계가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HA-PCNAdm, PCNAdm-3HA 다중항원은 오소믹소바이러스의 증식 및 복제를 저해함으로써 동물 및 인체 인플루엔자에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하며, 상기 오소믹소바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 주된 이유로는 인플루엔자 바이러스 외에도 코로나바이러스, 인체 뉴모바이러스, 파라믹소바이러스 등 대부분의 바이러스가 HA와 매우 유사한 trimer 형태의 표면단백질을 갖고 있으며, 놀랍게도 host entry에 필요한 prefusion에서 postfusion으로의 구조적 변화도 매우 유사한 기전에 의존한다는 사실이다. 따라서 다양한 바이러스의 표면단백질의 monomer 형태를 제조함으로써 PCNA 스캐폴드 기반 다중 항원으로 개발이 가능하다.
인플루엔자 바이러스 유래 HA 단량체 변이단백질, 상기 변이단백질에 PCNA가 융합된 융합 단백질(HA-PCNAdm) 및 PCNA의 자가 조립에 의해 형성된 융합 단백질(PCNAdm-3HA)은 Bac-to-bac 시스템을 이용하여 제조할 수 있고, 곤충세포 sf9과 High Five 세포를 이용한 발현이 용이하다. 상기 항원 단백질들은 Bac-to-bac 시스템으로 박테리아에서 선별과정을 거쳐 정확히 타겟 유전자가 삽입된 bacmid를 선별해 세포에 감염 (infection)하여 이루어질 수 있다. 또한 여타의 유전자 공학적 방법으로 만들 수 있으며, sf9과 High Five 곤충 세포 외에 동물, 식물 및 박테리아를 포함하는 기타 세포에 유전자를 도입 (transfection) 하여 발현할 수 있다.
상기 HA 단량체, 각각의 HA-PCNAdm, 및 PCNAdm-3HA 단백질 항원은 Ni-NTA affinity 컬럼, Mono Q ion exchange 컬럼과 superdex gel filtration 200HR 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제한 후 특성 분석이 용이하며, 향후 발생하는 다양한 인플루엔자 바이러스에서 유래된 HA 항원단백질로 만들 수 있다. 상기 정제과정을 수행함에 있어서 기타 정제 방법을 이용하여 순도 높은 단백질을 정제할 수 있다. 특히 트립신 분해효소 (trypsin)를 이용하여 HA 활성형 (active form)으로 정제를 수행하여 제조할 수 있으며, 트립신이 아닌 다른 분해효소를 이용할 수 있다. 상기 정제과정을 수행함으로써 추출액 등에 남아 있는 잔사 등을 제거하거나 안정화시킬 수 있다.
상기 바이러스 감염질환은 박테리아성 질환과 같은 2차 감염 문제가 아니라면 항생제는 효과가 없다. 이에 본 발명자들이 상기 재조합 HA 단량체가 퓨전된 HA-PCNAdm 및 PCNAdm-3HA 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공함으로써 감염을 효과적으로 방지할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 죽, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의되며, 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
실시예 1: 인플루엔자 바이러스 유래 헤마글루티닌 단량체와 이의 혼합물 디자인과 제조
1-1: 구조기반 헤마글루티닌 단량체 단백질 제조
1-1-1: 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단량체
본 발명자들은 2009년 팬데믹 인플루엔자 A/Korea/01/2009 (KR01) HA 및 HA-Fab complex 3차구조를 규명하였으며, 밝혀진 구조는 기존의 삼량체 구조가 아니라 단량체-단량체 상호작용을 보여주는 단량체의 구조를 나타내었다 (Cho KJ et al., 2013. J Gen Virol, 64, 1712-1722; Cho KJ et al., 2014. PLoS One. 9, e89803). 2009년 팬데믹 바이러스 헤마글루티닌 단백질은 단량체 형태로서 헤드 부위가 스템 부위로부터 이완된 구조를 보일 뿐만 아니라, 훨씬 신축성 있는 (flexible) 구조를 보여주었기 때문에, 본 발명자들은 헤마글루티닌 헤마글루티닌 분자의 역할인 막융합 (membrane fusion)을 구조적으로 손쉽게 함으로써 많은 사람을 감염시킬 수 있었던 팬데믹 바이러스의 분자 기전의 하나임을 제시한 바 있다. 헤마글루티닌 삼량체는 acidic pH에서 막융합을 통해 인체 및 동물에 감염을 개시할 때까지 필요한 안정성을 갖도록 진화되어 왔기 때문에, 단량체는 삼량체에 비해 안정성이 매우 낮고, 실제로 단량체 변성 전이온도가 삼량체에 비해서 낮은 것을 확인할 수 있다 (아래).
인플루엔자 유니버설 백신개발이 헤드 부위 없는 헤마글루티닌 (mini-HA), chimeric HA, 분자 스캐폴드에 스템 부위 만으로 이루어진 나노입자 등 아미노산 보존성 (conservation)이 높은 부위를 항원결정기로 노출시키기 위한 노력으로 이루어져 온 점을 고려하였을 때, 단량체가 갖는 특성을 이용한다면 또 다른 범용성 백신으로 가능성이 있으리라 판단되었다. 즉, 단량체-단량체 상호작용을 갖는 단량체 인터페이스가 삼량체 내부에 숨겨져 있는데 반해서, 단량체는 보존성이 높은 인터페이스가 노출되어 있다. 또한 삼량체는 항체 유도를 위한 스템 부위 노출이 어렵고, 이 부위의 면역반응이 immunosubdominant 하지만, 단량체에서는 인터페이스 부위가 노출됨에 따라 항체 accessbility가 비교적 쉬운 장점을 갖고 있다. 헤마글루티닌 삼량체 interface를 인식하는 항체가 발견되었고 (Watanabe A. et al., 2019. Cell 177: 1124-1135; Bangaru S. et al., Cell 177: 1139-1152; Bajic G. et al., Cell Host & Microbe 25: 1-9), 이들 항체가 매우 범용성있는 protection을 보여주는 것은 바로 인터페이스의 보존성 높은 epitope로서 중요성을 나타내는 것이다.
뿐만 아니라 단량체는 삼량체가 갖는 항원결정기의 대부분을 나타내기 때문에, 항체 인식에 삼량체와 큰 차이가 없으며 (항체결합력을 나타내는 해리상수 K D가 큰 차이가 없다), 기질 특이성을 동일하게 보이고 있다. 일부 논문에서 삼량체가 갖는 단량체-단량체 인터페이스의 일부가 항원결정기로 작용하기 때문에, 삼량체가 필요하다고 기술되어 있지만, 실제 삼량체의 인터페이스 일부를 항원결정기로 갖는 항원-항체 반응은 인터페이스가 없다고 하더라도 큰 차이를 보이지 않는다 (Cho KJ et al., 2013. J Gen Virol, 64: 1712-22; magadan JG. et al., 2013. J. Virol. 87: 9742-9753).
1-1-2: 구조기반 헤마글루티닌 단량체 디자인
헤마글루티닌은 삼량체로 안정화된 형태를 갖고 있는데, 이를 단량체로 만들기 위해서는 아미노산 변이가 필요하다. 본 발명자들은 삼량체-단량체 변환이 일반적으로 다양한 바이러스에 적용되어야 한다는 점을 고려하여, 삼량체 구조인 계절 변이주 A/Thailand/CU44/2006 (CU44) HA 유전자로부터 삼량체 내부의 단량체-단량체 상호작용 (monomer-monomer interaction)에 관여하는 아미노산 잔기 6개를 선정하여, 이들의 전하 혹은 크기를 변경하였으며, 이 중에서 아미노산 잔기 2개의 변이 (F88E, V91W)가 삼량체 형성을 저해함으로써, 성공적으로 단량체를 형성함을 확인하였다 (Seok JH et al., 2017. Sci. Rep. 7: 7540). 그러나 이 결과는 단지 삼량체를 불안정하게 함으로써 삼량체의 해리 (dissociation)을 유도하기 때문에, 만들어진 단량체는 안정성이 매우 낮은 특성을 갖고 있었다.
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 삼량체를 해리해서 단량체를 제조한 결과에서 한 걸음 더 나아가 본 발명에서는 단량체를 안정화시키기 위해서 단량체 안정화 변이에 주력하였으며, 이에 따라 헤마글루티닌 단백질 단량체-단량체간 인터페이스에 위치하고 있으면서 단량체가 되었을 때, 외부에 노출되는 아미노산 잔기들을 구조기반으로 분석하였다. 외부에 노출되는 비수용성 (hydrophobic) 아미노산 잔기를 수용성 잔기로 변경하여 단백질 수용성 및 안정성을 개선하였다. 즉, 점 돌연변이 (point mutation) 방법을 활용하여 기존 2개의 아미노산 변이 (F88E, V91W) 외에 다양한 변이들 중에서도 L73S, I77S, L80S 변이를 추가로 수행함으로써 H1 아형의 헤마글루티닌 단백질에 5개의 mutation을 갖는 변이단백질을 제조하였다 (A/California/04/2009(H1N1) (CA09) H1 HA: L73S, I77S, L80S, F88E, V91W) (도 1A). 특히 L73S 변이는 기존의 wild type 단백질 보다 발현이 5-10배 크게 증가하였기 때문에, 발현율에 큰 개선을 가져왔으며, V20C-E105C와 M320C-H111C 2개의 disulfide bond mutation을 수행하였다. 기존 2중 변이단백질은 2006년 CU44 바이러스 유래였지만, 2009년 신종플루 팬데믹 이후 CA09 바이러스가 팬데믹 변이주에서 계절 변이주로 바뀌었기 때문에 본 발명에서는 H1 HA로 CA09을 대상으로 하였다. 뿐만 아니라 H3 HA 및 B형 HA의 경우에도 각각 5중, 8중 변이를 갖는 변이단백질을 제조하였다: A/Gyeongnam/684/2006(H3N2) (Gy684): V73S, I77S, L80S, V84W, L91W) 외에 M320C-T111C 1개의 disulfide bond mutation, B/Florida/4/2006 (FL04) B HA: L73S, I77S, L80S, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W (도 1C). 더 나아가 H1 HA는 V20C-E105C/M320C-H111C를, H3 HA는 M320C-T111C를 각각 disulfide bond mutation을 시켜 변이 단백질을 제조하였다. 이들 인플루엔자 바이러스 재조합 H1 HA, H3 HA, B HA 단백질 변이 단량체의 아미노산 서열을 도 1A, 1B, 1C에 표시하였다.
각 헤마글루티닌 변이단백질은 construct 마다 5' 부위에 히스택 (6xHis-tag), 3' 부위에 폴돈 도메인 (foldon domain)을 트롬빈 (thrombin) cleavage site와 함께 붙임으로써, 전송 벡터 (transfer vector)에 삽입하여 Bac-to-bac 시스템으로 박테리아에서 선별과정을 거쳐 정확한 타겟 유전자가 삽입된 bacmid를 선별하도록 디자인하였다 (도 1C). 이는 변이단백질을 발현 정제하여 트롬빈으로 처리하였을 때 proteolytic cleavage로 인해서 폴돈 도메인이 잘려 나가기 때문에, 삼량체에서 단량체로 변환되고 안정성을 도모한 것이다.
1-2: 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단량체 제조
인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 변이 단량체는 곤충세포 sf9과 High Five를 이용한 Bac-to-bac 시스템을 이용하여 발현하였다. Insect cell에서의 바이러스 단백질은 small scale 실험을 통하여 최적의 수율과 용해도를 갖춘 단백질을 발현시키는 조건을 설정하였으며, pFastBac vector에 바이러스 단백질 cloning을 수행하였고, DH10Bac에서 재조합 bacmid DNA를 생산하였다. Cellfectin으로 sf9 세포에 재조합 bacmid DNA를 transfection하여 2-3일 배양 후 바이러스를 생산한 다음, 바이러스를 sf9 세포에서 단계 증폭하여 냉장 보관하였다. 바이러스를 High Five cell에 감염시켜 P3 baculoviral stock을 이용해 발현이 확인된 construct에 대한 감염다중도 (multiplicity of infection: MOI) (접종 바이러스양/세포수)를 맞춘 뒤, 27도에서 3일 배양한 후 원심분리하여 cell pellet은 제거하고 단백질이 secretion된 상등액을 회수하였다.
Insect cell에서 발현된 상등액을 Centramate Lab Tangential Flow Filtration (TTF) system으로 농축한 후, 발현된 CA09, Gy684, FL04 HA 변이 단량체는 각각 AKTA BASIC chromatography system으로 3단계 연속 정제를 수행하였다. Ni-NTA affinity 컬럼, Mono Q ion exchange 컬럼과 superdex 200HR gel filtration 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제하였다 (도 2A, 2B, 2C).
H1 아형, H3 아형, B형 헤마글루티닌 변이 단량체의 항원-항체 반응에서 헤마글루티닌 헤드 부위가 아닌 스템 부위의 특이성을 분석하기 위해서, 스템 부위 만으로 이루어진 mini-HA (#4900 construct-stem HA; Impagliazzo A et al., 2015. Science 349: 1301-1306) 단백질 뉴클레오타이드 서열을 합성한 다음 곤충세포 sf9과 High Five를 이용하여 발현하였다. AKTA BASIC chromatography system으로 연속 정제를 수행하였고, C179 스템부위 항체를 control로 결합을 농도의존적으로 확인하였다 (도 8C, 가운데, 아래).
실시예 2: 인플루엔자 변이주 바이러스 헤마글루티닌 단량체 특성
2-1: 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 변이 단량체 특성
대량발현 및 정제가 완료된 단백질에 대해서 각 바이러스 헤마글루티닌 변이 단량체의 특성 연구를 수행하였다. 헤마글루티닌 단량체 안정성을 개선하기 위한 CA09, Gy684, FL04 헤마글루티닌 변이 단량체는 각각 정제 후 thrombin cleavage 처리한 다음, 변성 전기영동 (SDS-PAGE)을 통해 특성을 확인하였다 (도 2A, 2B, 2C). 젤여과 크로마토그래피-다각도광산란 방법을 통해서 각 변이주 바이러스 헤마글루티닌 변이단백질의 정확한 분자 크기를 측정하여, 각각 단량체로 존재함을 확인하였으며 (도 2A, 2B, 2C), 이러한 결과는 각 헤마글루티닌 단백질에 선택된 변이가 삼량체의 해리 및 단량체의 안정에 기여함을 나타내는 것이다. 뿐만 아니라 시차주사형광법 결과에 따르면 H1 헤마글루티닌 변이 단량체의 안정성을 나타내는 변성 전이온도가 종래 보고된 2중 변이단백질 (Seok JH et al. 2017. Sci. Rep. 7: 7540)에 비해 4도 이상 높은 것으로 확인됨에 따라, 단량체 발현율 뿐만 아니라 안정성을 개선하는데도 기여한 것으로 판단된다 (도 3A, 3B). 그러나 삼량체에 비해서 전이온도가 아직 낮은 것은 헤마글루티닌 단백질이 원래 삼량체로 안정한 특성을 갖기 때문에, 단량체로 접근하는데는 더 많은 변이가 필요할 수 있다는 점을 제시하고 있다. 또한 계절별 바이러스 헤마글루티닌 단백질 기본 단위체 (protomer)에는 서로 큰 차이가 없음을 확인하였다.
안정한 헤마글루티닌 변이 단량체를 활용함으로써, 삼량체에서 노출되기 어려운 단량체-단량체 간 인터페이스 부위를 부각시키고, 면역활성을 높일 수 있다면 산업적 이용가치가 높다고 판단된다. 즉, 단량체 헤마글루티닌 단백질은 삼량체와 비교하여 VLP와 같은 스캐폴드 단백질 제조시 삼량체 대칭 (symmetry)에 얽매일 필요가 없으며, 이에 따른 용해도 (solubility) 및 단백질 응집 (aggregation) 문제를 야기하지 않으면서 안정적으로 fusion 단백질로 존재할 수 있기 때문에, 나노입자 (nanoparticle)에 쉽게 도입할 수 있다는 장점을 갖는다. 특히 다양한 바이러스 항원을 도입해야 하는 인플루엔자 바이러스 백신 개발에 바이러스의 다양한 아형에 의해서 야기되는 낮은 백신 효과를 극복할 수 있는 범용성 백신개발에 단량체는 유용한 소재라고 판단된다.
특성이 확인된 각각의 재조합 헤마글루티닌 변이 단량체와 이들 단량체 혼합물의 항원으로서 가치를 확인하기 위한 동물실험을 수행하기 위해서, mg 단위의 대량정제가 가능하도록 발현 크기를 확충하였고, 마우스 동물실험으로 인플루엔자 바이러스에 대한 면역활성을 검증하였다.
실시예 3: 재조합 헤마글루티닌 변이 단량체 동물실험
3-1: 헤마글루티닌 변이 단량체 항원기반 동물실험
마우스 동물실험 일자별 계획 (scheme)에 따라, 8주령의 BALB/c 마우스에 헤마글루티닌 변이 단량체 등을 각각 2주 간격으로 피하주사 (subcutaneous injection) 접종한 후, 질병관리본부 바이러스 분양센터로부터 분양 받은 PR8 바이러스 (mouse adapted A/PuertoRico/8/34 virus: PR8)를 5 LD 50 (5 x 10 2 PFU/mouse)로 감염시킨 후 백신 효능을 평가하였다 (도 4). 동물실험에 이용된 마우스는 전체 5 그룹으로 운용하였으며, PBS 완충용액 및 SAS 에주번트를 비교군 (control group)으로 수행하여, 각 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: native 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: H1(CA09) 헤마글루티닌 변이 단량체 + 에주번트, 그룹 4: 상용 SK Chem. 3가 백신, 그룹 5: H1, H3, B 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 + 에주번트. 에주번트는 Sigma-Aldrich에서 구입된 Sigma adjuvant system (S6322)을 사용하였다. PR8 바이러스를 감염시킨 마우스에서의 체중 변화 및 생존율 변화 측정을 통하여 백신 효능을 평가하였다.
체중 및 생존율 변화 연구결과로 볼 때, 주목할 점은 H1, H3, B 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹 마우스가 naive 마우스 그룹과 매우 유사한 생존율을 보였다는 점이다 (도 5). 상용 SK Chem 3가 백신을 접종한 마우스 그룹과 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹이 생존율에 있어서 변이 단량체 혼합물 그룹 다음에 위치하였다 (도 7). 대조군으로 헤마글루티닌 항원을 주지 않은 마우스 그룹은 6-7일 경과하면서 체중이 20% 이상 감소한 것으로 관찰되었다. 체중 20% 이상 감소한 경우 동물실험시 윤리적, 인도적 실험 종료를 나타낸다. 흥미로운 점은 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 모두 체중변화가 초기 6-8일까지 10-15% 감소하였지만 7-8일 이후 극복하면서 생존율을 증가시킨데 비해서, 항원을 주지 않은 마우스 그룹 1은 20% 이상 체중변화를 보여줌으로써 생존율이 유의적으로 감소하였다. 따라서 체중변화 및 생존율 변화에 있어서 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹의 순으로 우수한 것으로 나타났으며, 앞서 기술한 바와 같이 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹은 생존율 100%를 나타냈고, 상용 SK Chem 3가 백신을 접종한 마우스 그룹은 80% 생존율을 보여주었으며, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹은 40% 생존율을 보여줌으로써, 이들 항원의 면역활성은 주목할 만하다. 본 발명에 따른 변이단백질, 이들의 혼합물 그룹은 상용 SK Chem 3가 백신 그룹 마우스에 비견되거나 월등한 몸무게 증가와 생존률의 상승을 나타낸 바, 기술적 가치가 높은 것을 확인하였다.
3-2: 동물실험 마우스 폐 조직에서의 바이러스 분석
바이러스 감염 후 2주 동안 체중변화 및 생존율 변화 증상을 관찰하였고, 감염 3일째 각 그룹당 3마리를 희생시켜서 폐 조직에서 바이러스를 PBS 완충용액에서 추출한 후, MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포에 감염시켜서 바이러스 농도 (titer)를 산출하였다. 자세하게는, 인플루엔자 바이러스 감염 3일된 마우스를 희생시켜 폐 조직을 얻은 후, 폐 조직을 조직 균질기를 이용하여 균질화시킨 후 4℃에서 5분간 원심분리 (4,000 Υ g)하여 상등액을 얻었다. MDCK 세포에 1:10으로 희석시킨 폐 조직 상등액 500 μl를 넣고 3시간 동안 감염시켰다. 감염 후 폐 조직 상등액을 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 3번 washing 하고 1 μg/ml TPCK-treated trypsin과 1% agarose가 첨가된 이글배지 (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Karlsruhe, Germany)를 넣고 37℃ 및 5% 이산화탄소 배양기에서 72시간동안 배양하였다. 배양 후 0.5% (v/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용균반 실험 (plaque reduction assay)을 수행하고 그 결과를 측정하였다.
폐 조직 바이러스 분석 결과, PR8 바이러스를 감염시킨 실험군에서 아무런 항원을 주지 않은 대조군 PBS 완충용액 그룹에 비하여 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹의 순으로 바이러스 감소를 보여주었으며, 특히 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹에서는 2.0log 이상의 차이를 보였다 (도 6). 체중 및 생존율 변화에서 보여준 그룹간 결과는 폐 조직에서의 인플루엔자 바이러스 titer 감소율과 결과와 일치하였다.
3-3: 동물실험 혈청 분석
3-3-1: 용균반 감소 중화 분석 (plaque reduction neutralization assay)
마우스 혈청 시료를 1:10 및 1:40으로 희석하여 에펜도르프 (eppendorf) 튜브에 넣은 후, PR8 바이러스를 희석된 마우스 혈청 시료에 대하여 9:1 (v/v)의 비율로 첨가하여 60분간 반응시켰다. 반응시킨 바이러스-희석된 마우스 혈청 시료를 MDCK 세포에 첨가하여 37℃ 및 5% 이산화탄소 배양기에서 60분간 감염시켰다. 감염 후 바이러스-희석된 마우스 혈청 시료액을 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 3번 washing 하고 1 μg/ml TPCK-treated trypsin과 1% agarose가 첨가된 이글배지 (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Karlsruhe, Germany)를 넣고 5% 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 72시간동안 배양하였다. 배양 후 0.5% (v/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용균반 수를 측정하였다.
용균반 중화 분석 결과, PR8 바이러스를 감염시킨 실험군에서 대조군 PBS 완충용액 그룹에 비하여 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 모두 유의미한 용균반 감소를 보여주었으며, H1N1 바이러스의 경우 상용 SK Chem 3가 백신 그룹이, H3N2 바이러스의 경우 상용 SK Chem 3가 백신 그룹과 변이 단량체의 혼합물 그룹이 큰 감소를 나타냈으며, B 바이러스의 경우 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹이 큰 감소를 나타내었다 (도 7). 실험에 사용된 인플루엔자 바이러스 아형에 따라 차이는 있지만, 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹의 중화감소가 우수한 것으로 나타났다.
3-3-2: 마우스 혈청 항체가 분석
동물실험에서 항원 접종 시기부터 바이러스 감염 후 혈액 내 항체 형성 유무를 측정하기 위해서 안와 채혈하여 ELISA assay로 각 바이러스 항원단백질에 대한 항체가를 측정하였다. Microplate 내에 각 변이주 바이러스 유래 헤마글루티닌 항원을 부동화 (immobilization) 시킨 다음, 혈청내 유도된 항체의 항원과의 상호작용에 따른 결합을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 사용하였다. 혈청내 항원에 따른 항체와의 반응은 TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 100 μl씩을 넣고 상온에서 10분 발색시켰다. 반응을 멈추고 microplate reader (Molecular Devices, SpectraMax 190, Sunnyvale, CA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 분석 결과, H1 헤마글루티닌 단량체에 대한 항체가는 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹이 높았고, H1 헤마글루티닌 삼량체에 대한 항체가는 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 모두 유의미한 증가를 보여주었다 (도 8A). 뿐만 아니라 H3, B 헤마글루티닌 항체가는 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 모두 높았다 (도 8B). 특히 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹은 B형 헤마글루티닌 항체가에서 매우 높은 값을 보여주었으며, 이는 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹 혹은 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 보다 월등한 항체가를 나타냄으로써, 단량체 단독인 그룹에 비해서 B형 헤마글루티닌 항체가가 높은 것은 당연한 결과이며, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹 보다 높은 것은 단량체의 우수한 기술적 가치를 나타내는 결과를 보여준 것이다. 이제까지 항체가를 헤마글루티닌 헤드 부위 특이항체 혹은 혈구응집 (hemagglutination) 저해반응에 의존해서 검사해 왔지만, 최근 스템 부위 특이항체 및 항체의존 세포매개성 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated　cytotoxicity: ADCC) 분석을 통해서 바이러스를 제어하는 분자 기작이 보고됨에 따라 (DiLillo DJ et al., 2014. Nat Med. 20: 143-151) 기존의 헤마글루티닌 헤드 부위 특이부위에만 의존하는 항체가에 우려가 나타나고 있다. 따라서 본 발명에서는 anti-stem 항체가 분석을 통해서 생존율이 우수한 그룹이 보여주는 상관관계를 좀 더 자세히 검사하기로 하였다.
3-3-3: 혈청 anti-stem 항체가 분석
동물실험에서 안와 채혈로 확보된 마우스 혈청을 이용해서 ELISA assay로 각 바이러스 항원단백질에 대한 항체가를 헤드 부위 특이항체가 아닌 스템 부위에 특이적으로 반응하는 항체가를 측정하기 위해서 mini-HA (#4900 construct-stem HA)를 활용하였다. Microplate 내에 각 변이주 유래 헤마글루티닌 항원 대신, 스템 부위만을 함유한 mini-HA를 부동화 시킨 다음, 혈청내 유도된 항체의 항원과의 상호작용에 따른 결합을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효가 결합된 2차항체를 사용하였다. TMB를 넣고 상온에서 발색 시킨 다음, 반응을 멈추고 microplate reader를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
스템 부위 특이 항체가는 헤마글루티닌 변이 단량체의 혼합물 그룹, 상용 SK Chem 3가 백신 마우스 그룹, 헤마글루티닌 변이 단량체 그룹 모두 유의미한 항체가의 우수함을 보였다 (도 8C), 단량체 단독 혹은 혼합항원 그룹의 stem 특이적인 항체가는 상용 SK Chem 3가 백신 그룹과 비견할만한 결과를 보여주었다. 헤마글루티닌 단량체의 안정성이 삼량체의 안정성과 동일하다면 더욱 개선된 결과를 보일 수 있으리라 판단된다.
실시예 4: 인플루엔자 바이러스 유래 HA 단량체 변이단백질과 PCNA가 융합된 HA- PCNAdm , PCNAdm - 3HA 항원 단백질의 제조
4-1: 구조기반 HA 단량체 단백질의 제조
4-1-1: 인플루엔자 바이러스 HA 단량체의 의의
본 발명에 앞서 2009년 팬데믹 인플루엔자 A/Korea/01/2009 (KR01) HA 및 HA-Fab complex 3차구조는 HA가 삼량체가 아니라 단량체-단량체 상호작용을 보여주는 단량체를 보여주었다 (Cho et al., 2013; 2014). HA 단백질은 단량체 형태로서 head region이 이완된 또는 신축성 있는 (flexible) 구조를 나타냄으로써, 막융합 (membrane fusion)을 보다 쉽게 하는 팬데믹 바이러스 분자 기전으로 제시한 바 있다 (Cho et al., 2013; 2014). HA 삼량체는 단량체 간 인터페이스가 내부에 숨겨져 있는데 반해서, 단량체는 보존성이 높은 인터페이스가 노출되어 있다. 삼량체가 갖는 단량체-단량체 인터페이스 일부가 항원결정기로 작용하기 때문에, 항원 역할을 위해서 삼량체가 필요하다고 믿어왔다. 그러나 HA 단량체는 삼량체가 갖는 항원결정기의 대부분을 나타내기 때문에, 항체 인식에 삼량체와 큰 차이가 없으며 (항체결합력을 나타내는 해리상수 K D가 큰 차이가 없다) 기질 특이성을 동일하게 보이고 있다. 실제 삼량체의 인터페이스 일부를 항원결정기로 갖는 항원-항체 반응은 인터페이스가 없다고 하더라도 큰 차이를 보이지 않는다 (Magadan et al., 2013; Cho et al., 2013).
4-1-2: 구조기반 HA 단량체 디자인
인플루엔자 바이러스 HA는 삼량체에 비해서 단량체 구조가 상대적으로 불안정하다. 단량체-단량체간 인터페이스에 위치하면서 외부에 노출되는 아미노산 잔기들을 구조기반으로 분석함으로써, H1 HA는 5개 mutation (A/California/04/2009(H1N1): L73S, I77S, L80S, F88E, V91W), H3 HA는 5개 mutation (A/Gyeongnam/684/2006(H3N2): V73S, I77S, L80S, V84W, L91W), B HA는 8개 mutation (B/Florida/4/2006: L73S, I77S, L80W, V84W, L87S, T91W, L98S, L102W)을 갖고, 이에 더해서 H1 HA와 H3 HA에 각각 V29C/E105C, M320C/H111C 2개, M320C/T111C 1개 disulfide bond를 형성할 수 있는 변이를 갖는 안정한 형태의 단량체 변이단백질을 디자인하였다 (도 10A, 10B).
각 HA 변이단백질들은 construct 마다 5' 부위에 히스택 (6xHis-tag), 3' 부위에 폴돈 도메인 (foldon domain)을 트롬빈 (thrombin) cleavage site를 붙여 전송 벡터 (transfer vector)에 삽입된 Bac-to-bac 시스템으로 디자인하였고, 선별과정을 거쳐 정확한 타겟 유전자가 삽입된 bacmid를 선별하였다. 이는 insect cell에서의 단백질 정제 후 proteolytic cleavage로 폴돈 도메인이 잘려나가기 전, 안정성을 도모한 것이다 (도 10A, 아래).
4-1-3: PCNAdm 제조 및 특성
S. solfataricus 유래의 스캐폴드 PCNA 헤테로삼량체 (heterotrimer)를 형성하는 in vitro 상에서의 각 서브유닛 (subunit) 단백질 PCNA1, PCNA2, PCNA3 assembly를 개선하기 위해서, PCNA1-PCNA2 혹은 PCNA2-PCNA3 결합 interface에 위치하는 아미노산 잔기 mutation을 포함하는 변이단백질을 디자인하였다. PCNA1, PCNA2, PCNA3에 각각 2개의 mutation을 시행하여, T112K/Y114K, S172V/A174V, Y73F/S170V mutant 단백질을 디자인하였다 (도 10C).
PCNA wild type 서브유닛 PCNA1, PCNA2, PCNA3 및 mutant 서브유닛 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm을 E. coli 박테리아 세포에서 발현, 정제하여 고순도의 단백질 서브유닛을 확보하였다 (도 11A, 11B). PCNA assembly를 비교하기 위해서 Bio-layer interferometer (BLI) Blitz system (ForteBio, Menlo Park, CA, U.S.A.)을 활용하여 PCNA1dm-PCNA2dm 및 PCNA2dm-PCNA3dm 결합 반응속도 상수 k a, k d 및 결합상수 K D를 wild typ 단백질 결합반응과 비교하여 50-1,000 nM 농도범위에서 측정하였다 (도 11C). PCNA mutant의 결합이 wild type에 비해서 3-6배 개선되었음을 확인하였다.
4-2: 인플루엔자 바이러스 HA- PCNAdm 항원 및 다중항원 PCNAdm - 3HA 제조
다음 단계로 PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm에 H1 아형 CA09 HA, B형 FL04 HA, H3 아형 Gy684 HA 단량체 변이단백질 유전자를 각각 결합시켰다. H1, B, H3형 바이러스 유래 HA 유전자는 5-8개의 mutation을 포함하고 있으며, 5' 부위에 GP67 signal 서열을 두어 세포 밖으로 발현되도록 하였고, PCNA1dm, PCNA2dm, PCNA3dm N-terminal에 각각 결합시켰다 (도 10A, 10B). 각 HA 유전자와 PCNA 간에는 SGG linker를 붙여서 융합된 construct로 제조되었으며, 수월한 정제를 위해서 His-tag을 각 construct 마다 활용하였다.
단량체 안정성이 개선된 CA09, Gy684, FL04 HA 변이단백질이 각각 fusion 된 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 재조합 단백질은 곤충세포 sf9과 High Five를 이용한 Bac-to-bac 시스템을 이용하여 발현하였다. pFastBac vector에 cloning 한 뒤, DH10Bac에서 재조합 bacmid DNA를 생산하였다. Cellfectin으로 sf9 세포에 transfection하여 2-3일 배양 후 바이러스를 생산한 다음, 증폭하여 냉장 보관하였다. 이를 High Five cell에 감염시켜 P3 baculoviral stock을 이용해 발현이 확인된 construct에 대한 감염다중도 (multiplicity of infection: MOI) (접종 바이러스양/세포수)를 맞춘 뒤, 27 ℃에서 3일 배양한 후 원심분리하여 단백질이 secretion된 상등액을 회수하였다. 재조합 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 단백질은 각각 AKTA BASIC chromatography system으로 정제하였다. Ni-NTA affinity, Mono Q ion exchange 및 superdex 200HR 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 90% 이상의 순도로 정제하였다 (도 12A, 위). 단백질 정제 후, H1 HA-PCNA1dm과 B HA-PCNA2dm 단백질을 먼저 incubation 한 다음, H3 HA-PCNA3dm 단백질을 incubation 하여 assembly를 유도하여 융합 다중항원 PCNAdm-3HA 단백질로 제조하였다 (도 12A, 아래). 항원-항체 반응에서 HA head region이 아닌 stem region의 특이성을 분석하기 위해서, stem region 만으로 이루어진 mini HA (#4900 construct-stem HA) 단백질을 보고된 뉴클레오타이드 서열을 합성한 다음 곤충세포 sf9과 High Five를 이용하여 발현하였고, 각각 AKTA BASIC chromatography system으로 연속 정제를 수행 정제하였다 (data not shown).
실시예 5: 단량체 퓨전 HA- PDNAdm 및 다중항원 PCNAdm - 3HA 특성
5-1: HA- PCNAdm 및 PCNAdm - 3HA 항원 단백질의 특성
발현 정제된 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm 재조합 complex 단백질을 각각 크기배제 크로마토그래피-다각도광산란 (SEC-MALS) 장치를 활용하여 측정한 결과, H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm complex 단백질 분자량은 각각 103.8, 89.9, 133.2 kDa 이었다 (도 12B). 뿐만 아니라, 각 H1 HA-PCNA1dm, B HA-PCNA2dm, H3 HA-PCNA3dm complex 단백질의 assembly가 이루어져서 형성된 PCNAdm-3HA의 분자량은 326.3 kDa 이었다. 투과전자현미경 (transmission electron microscope) negative staining 기반 2D averaging 방법을 이용해서 assembly가 이루어진 PCNAdm-3HA를 관찰하였을 때, PCNAdm-3HA 헤테로삼량체의 크기가 평균 20-30 nm 입자 모양을 보여줌으로써 assembly가 잘 이루어진 것을 제시하였다 (도 12C), 안정성이 개선된 변이단량체 HA가 PCNAdm 헤테로삼량체에 융합된 것으로 판단된다.
5-2: PCNA 스캐폴드 자체의 단회 독성실험
단회 독성실험을 위해서, adaptation 후 8주령의 BALB/c 마우스에 assembled 된 PCNA1-PCNA2-PCNA3 혹은 PCNA1dm-PCDNA2dm-PCNA3dm 단백질을 20-200 μg/350 μl 농도로 근육주사 (intramuscular injection)로 1회 투여하고 체중을 7일간 매일 측정하여 in vivo toxicity를 분석하였다. 단회 독성 실험결과, wild type 과 mutant PCNA 스캐폴드는 20-200 μg/350 μl 농도범위에서 독성이 없음을 확인하였다 (data not shown).
실시예 6: 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원을 이용한 동물실험: 그룹 1 PR8( H1N1 ) 바이러스 challenge
6-1: HA 변이단량체 및 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원기반 동물실험
마우스 동물실험 계획 (scheme)에 따라, 5주령 BALB/c 마우스에 HA 단량체, HA-PCNAdm 항원 및 다중항원 PCNAdm-3HA 등을 2주 간격으로 피하주사 (subcutaneous injection) 접종한 후, 질병관리본부 바이러스 분양센터로부터 분양 받은 PR8 바이러스 (mouse adapted A/PuertoRico/8/34 virus: PR8)를 5 LD 50 (5 x 10 2 PFU/mouse)로 감염시킨 후 백신 효능을 평가하였다 (도 13A). 동물실험 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + 에주번트, 그룹 4: H1 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 5: H1 HA-PCNA1dm + 에주번트, 그룹 6: 상용 SK bioscience 3가 백신, 그룹 7: H1 HA, H3 HA, B HA 변이단량체 혼합물 + 에주번트, 그룹 8: H1 HA, H3 HA, B HA 삼량체 혼합물 + 에주번트, 그룹 9: 다중항원 PCNAdm-3HA + 에주번트. 에주번트는 Sigma-Aldrich에서 구입된 Sigma adjuvant system (S6322, SAS)을 사용하였다. PR8 바이러스를 감염시킨 마우스에서의 체중 변화 및 생존율 변화 측정을 통하여 백신 효능을 평가하였다. 본 동물실험에서는 체중 20% 이상 감소를 동물실험 윤리적, 인도적 실험 종료로 정하였다.
PR8 바이러스를 감염시킨 실험그룹 H1 HA-PCNA1dm, H1, H3, B HA trimer mixture, H1, H3, B HA monomer mixture, PCNAdm-3HA 그룹 마우스는 항원을 주지 않은 마우스 (G2)에 비해서 모두 몸무게가 7-8일 이후 증가하였고, 60% 생존율을 확인하였다 (도 13B). 그러나 H1 HA monomer, SK Bioscience TIV 그룹 마우스는 각 40%, 20%의 생존율을 보였다. 대조군으로 HA 항원없는 PBS 완충용액 그룹 2는 7일이 경과하면서 체중이 25% 이상 감소하였다.
동물실험에서 대부분 그룹의 마우스 체중이 크게 감소된 이유는 마취제 구입에 대한 규제가 엄격해짐에 따라, 새로운 마취제로 변경하였기 때문에 모든 그룹 마우스에 영향을 미친 것으로 판단된다. 그럼에도 불구하고 H1 HA-PCNA1dm, PCNAdm-3HA 다중항원 및 H1 HA, H3 HA, B HA 단량체 혼합물 그룹순으로 상용 SK 백신 그룹에 비해서 상대적으로 우수한 몸무게 증가와 생존률의 상승을 확인하였다.
6-2: 마우스 폐 조직에서의 바이러스 분석
바이러스 감염 후 폐에서 바이러스 titer는 감염 후 4일째 그룹당 3마리를 희생시켜서 폐 조직에서 바이러스를 PBS 완충용액에서 추출한 후, MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포에 감염시켜서 바이러스 농도 (titer)를 산출하였다. 폐 조직을 균질화시킨 후 4 ℃에서 5분간 원심분리 (4,000 Х g)하여 상등액을 얻었다. MDCK 세포에 1:10으로 상등액 500 μl를 넣고 3시간 동안 감염시켰다. 상등액을 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 3번 washing 하고 1 μg/ml TPCK-treated trypsin과 1% agarose가 첨가된 이글배지 (Eagle's medium, DMEM, Gibco BRL, Karlsruhe, Germany)를 넣고 37℃ 및 5% 이산화탄소 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 0.5% (v/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용균반 실험 (plaque reduction assay)을 수행하였다.
Lung titer 분석 결과, PR8 바이러스를 감염시킨 실험군에서 항원을 주지 않은 대조군에 비하여 trimer, monomer 항원 및 PCNA 다중항원 마우스 그룹은 평균 0.2-0.4log PFU/ml 정도의 바이러스 감소를 보였다 (도 13C, 위). 특히 대조군과 비교하였을 때 H1 HA-PCNA1dm, H1, H3, B HA trimer, monomer mixture 및 다중항원 PCNAdm-3HA 그룹에서 약 0.2-0.4log PFU/ml의 lung titer 감소가 나타났다. 그러나 SK Bioscience TIV 마우스는 그룹은 0.09 log PFU/ml 바이러스 감소로 상대적으로 적은 양의 감소를 보였다.
6-3: 동물실험 혈청 분석
6-3-1: 용균반 감소 중화 분석 (plaque reduction neutralization assay)
마우스 혈청 시료를 1:10 및 1:40으로 희석하여 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브에 넣은 후, PR8 (H1N1), Gy684 (H3N2), FL04 (B) 바이러스를 9:1 (v/v)의 비율로 첨가하여 60분간 반응시켰다. 반응시킨 바이러스-혈청 시료를 MDCK 세포에 첨가하여 37℃ 및 5% 이산화탄소 배양기에서 60분간 감염시켰다. 바이러스와 serum을 제거하고 DMEM으로 washing 후 1 μg/ml TPCK trypsin이 함유된 DMEM과 agarose를 1:1로 혼합 첨가하여 72시간 37℃, 5% CO 2 조건에서 incubation 하면서 plaque을 형성시켰으며, plaque은 4% formaldehyde로 fix하여 0.5% crystal violet으로 염색하여 counting 하였다. 중화 분석 결과, PR8 바이러스를 감염시킨 실험군에서 대조군 PBS 완충용액 그룹에 비하여 상용 SK Bioscience 3가 백신 그룹, H1 HA, H3 HA, B HA 단량체 혼합물 그룹, PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 유의미한 용균반 감소를 보여주었다. H1N1, H3N2 바이러스의 경우 상용 SK Bioscience 3가 백신 그룹과 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이, B 바이러스의 경우 단량체 혼합물 그룹과 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 약간의 차이는 있었지만, 높은 neutralization 활성을 나타냈다 (도 13C, 아래).
6-3-2: 마우스 혈청 항체가 분석
Microplate 내에 H1 HA 및 mini HA 항원을 부동화 (immobilization) 시킨 다음, 혈청 항체-항원 상호작용을 유도하였다. 1차 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 양고추냉이과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 2차항체를 사용하였다. 항원-항체 반응은 TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 100 μl씩을 넣고 상온에서 10분 발색시켜, microplate reader (Molecular Devices, SpectraMax 190, Sunnyvale, CA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. H1 HA 항체가는 H1 HA-PCNA1dm 그룹과 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 높았고, H1 HA trimer 항원에 대한 항체가에 있어서 H1, H3, B HA trimer 그룹도 높은 값을 나타냈다 (도 13D). B HA 항체가는 H1, H3, B HA trimer와 monomer 그룹, PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 높았으며, SK Bioscience 3가 백신 그룹도 B HA trimer에 대해서는 높은 항체가를 보여주었다. H3 HA에 대한 항체가는 H1, H3, B HA trimer 혼합물 및 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 높았다. 마우스 혈청을 이용해서 stem region에 특이적으로 반응하는 항체가를 측정하기 위해서 mini HA (#4900 construct-stem HA)를 활용하였다. Mini HA를 부동화 시킨 다음, 항원-항체반응에 각 그룹 혈청을 활용하였고, 2차항체 및 TMB를 넣고 상온에서 발색 시킨 다음, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Stem region 특이 항체가는 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹과 H1 HA-PCNA1dm 그룹이 제일 높아 우수함을 보였다 (도 13D, 아래 오른쪽).
실시예 7: 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원을 이용한 동물실험: passive immunization
7-1: HA 변이단량체 및 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원기반 passive immunization
Passive immunization 동물실험 계획에 따라, 5주령 BALB/c 마우스에 HA 단량체, HA-PCNAdm complex, 다중항원 PCNAdm-3HA 등을 2주 간격으로 피하주사 (subcutaneous injection) 접종한 후, 13일 후 채혈하여 혈청을 분리하였다. 미리 적응시킨 7주령 마우스에 분리된 혈청을 intraperitoneal injection 하였고, 1일 후 PR8 H1N1 아형 바이러스를 intranasal로 감염시켰다 (도 14A). 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 4: H1 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 5: H1 HA-PCNA1 + 에주번트, 그룹 6: SK Bioscience 상용 3가 백신, 그룹 9: PCNAdm-3HA + 에주번트. 그룹 번호는 PR8 동물실험 그룹과 동일한 번호를 사용하였고, 마우스 체중 변화 및 생존율 변화 측정을 통하여 백신 효능을 평가하였다.
항원으로 유도된 면역 혈청을 이용한 passive immunization 결과, PCNAdm-3HA 다중항원 그룹과 H1 HA-PCNA1dm 그룹이 체중변화가 가장 적고 생존율이 가장 높았고, SK Bioscience 3가 백신 그룹과 H1 HA monomer 그룹이 뒤를 이었다 (도 14B). 폐 조직 바이러스 농도는 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹과 H1 HA-PCNA1dm 그룹에서 각각 1.9와 1.4log PFU/ml 감소되었으며, SK Bioscience 3가 백신 그룹과 H1 HA monomer 그룹에서 0.2-0.6log PFU/ml 감소되었다 (도 14C, 위).
7-2: 혈청 분석
채혈된 혈청을 H1N1, H3N2, B 바이러스와 1시간 반응 후 용균반 실험결과, H1, H3, B HA 항원에 대해서 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹과 H1 HA-PCNA1dm 그룹이 가장 높은 neutralization 항체가를 보여주었다 (도 14C, 가운데, 아래). 혈청을 이용한 ELISA 실험결과에서도 H1 HA, B HA, H3 HA, mini HA를 대상으로 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 가장 항체가가 높았다 (도 14D). H1 HA 항원에 대해서 H1 HA-PCNA1dm 그룹, SK Bioscience 3가 백신 그룹 및 H1 HA monomer 그룹이 뒤를 이었고, 특히 mini HA에 대해서 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹, H1 HA-PCNA1dm 그룹, H1 HA monomer 그룹이 높았고, 이는 단량체가 stem 특이항체 유도에 매우 효과적이라는 것을 보여주는 것을 제시하는 결과이다.
실시예 8: 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원을 이용한 동물실험: 그룹 2 X47( H3N2 ) 바이러스 challenge
8-1: 다중항원 PCNAdm - 3HA 항원기반 동물실험
마우스 동물실험 계획은 그룹 1 PR8(H1N1) 바이러스 challenge 실험과 동일하였고, 그룹 2 X47(H3N2) 바이러스로 감염시킨 것과 아래와 같이 그룹 분류만 달랐다 (도 15A). 동물실험 그룹은 그룹 1: naive 마우스, 그룹 2: PBS 완충용액 + 에주번트, 그룹 3: inactivated H3 X47 + 에주번트, 그룹 4: SK Bioscience 상용 3가 백신, 그룹 5: PCNA1-PCNA2-PCNA3 assembled + 에주번트, 그룹 6: H3 HA 단량체 + 에주번트, 그룹 7: H3 HA-PCNA3dm + 에주번트, 그룹 8: H1 HA, H3 HA, B HA 변이단량체 혼합물 + 에주번트, 그룹 9: 다중항원 PCNAdm-3HA + 에주번트 이었다.
동물실험 결과, inactivated X47 바이러스 그룹이 제일 작은 체중변화와 높은 생존율을 보였으며, PCNAdm-3HA 다중항원 그룹과 H3 HA 단량체 그룹 또한 작은 체중 변화 및 높은 생존율을 보였다 (도 15B). H3 HA-PCNA3dm 그룹이 뒤를 이었고, SK Bioscience 상용 3가 백신 그룹은 거의 효과가 없었다. H1 HA 단량체 항원 그룹과 H1, H3, B HA 단량체 혼합물 그룹은 체중이 15%까지 감소하였다가 7일 이후 극복한데 비해서, SK Bioscience 그룹은 6일째 20% 이상 체중변화를 보여줌으로써 생존율이 유의적으로 감소하였다. 그룹 1 PR8 challenge 동물실험에서와 마찬가지로 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹, H3 HA 단량체 그룹이 우수한 것으로 나타난 반면, 상용 SK Bioscience 3가 백신 그룹의 생존율은 control PBS 그룹과 같은 효과를 나타내지 못하였다. X47 (H3N2) 바이러스는 수정란에서 증식되던 A/Victorial/3/75(H3N2)와 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스가 reassortant에 의해서 만들어진 mouse-adapted 바이러스이다. 따라서 70년대 바이러스 HA 항원결정기 epitope을 보유한 점에서, 2010년 이후 계절바이러스 H3 HA epitope을 갖는 SK Bioscience 백신 혹은 A/Gyeongnam/684/2006 바이러스에서 유래된 H3 HA epitope을 갖는 PCNAdm-3HA 다중항원 및 H3 HA 단량체 항원들이 면역활성이 감소된 원인으로 판단된다. 그럼에도 불구하고 PCNAdm-3HA 그룹과 H3 HA-PCNA3dm 단량체 그룹은 상용 SK Bioscience 3가 백신 그룹에 비해 생존율이 월등히 높았고, stem 특이항체가 높게 유도되었다는 점이 주목할 만하다.
8-2: 마우스 폐 조직 바이러스 및 혈청 분석
감염 후 4일째 폐 조직에서 바이러스를 추출한 후, MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포에 감염시켜서 바이러스 농도 (titer)를 용균반 실험 (plaque reduction assay)으로 산출하였다. X47 (H3N2) 실험에서 대조군 PBS 완충용액 그룹에 비하여 inactivated X47 바이러스 그룹이 약 2log 바이러스 감소를 보여주었고, PCNAdm-3HA 다중항원 그룹, H3 HA 단량체 및 H3 HA-PCNA3dm 그룹이 1.2-1.5log 바이러스 감소를 나타내었다 (도 15C, 위). 그 뒤를 단량체 혼합물 그룹이 0.8log 차이를 보였다. 이와는 대조적으로 상용 SK Bioscience 3가 백신 그룹은 바이러스 titer 감소를 보이지 않았으며, control인 PBS 완충용액 그룹과 동일하였다.
혈청 항체가를 ELISA 분석으로 확인한 결과는 PCNAdm-3HA 다중항원, H3 HA 단량체, H3 HA-PCNA3dm 및 H1, H3, B HA 단량체 혼합물 그룹에서 상대적으로 높은 항체가를 보인 반면, SK Bioscience 상용 백신 그룹은 H3 HA trimer 항원에 대해서 낮은 항체가를 보였다 (도 15C, 아래). 주목할 점은 inactivated X47 바이러스 그룹의 낮은 항체가인데, 생존율에 비해서 낮은 항체가를 보이는 것은 ELISA에 사용된 항원이 1970년대가 아닌 최근 인플루엔자 바이러스 strain 유래 H3 HA 항원이었기 때문으로 판단된다. X47의 epitope이 사용된 H3 HA 항원과의 epitope 차이가 크다는 것을 대변한다는 점에서도, H3 HA 단량체 및 PCNAdm-3HA 항원의 생존율이 높은 것은 매우 의미있는 결과로 사료된다. 더욱 중요한 점은 mino HA 항원에 대한 항체가가 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 가장 높은 수치를 보여준 결과이다. 이는 PR8 (H1N1) 동물실험 결과와 유의미하게 일관된 결과로서 PCNAdm-3HA 다중항원 그룹이 stem 특이항체를 유도하는데 매우 효능이 높다는 점을 보여준다. 이제까지 항체가를 HA head region 특이항체 혹은 혈구응집 (hemagglutination) 저해반응에 의존해서 검사해 왔지만, 최근 stem region 특이항체 및 항체의존 세포매개성 세포독성(Antibody-dependent cell-mediated　cytotoxicity: ADCC) 바이러스 제어기작이 발견됨에 따라 stem 특이항체의 중요성이 부각되고 있다. 단량체가 삼량체보다 stem 특이항체를 상대적으로 잘 유도하지만, PCNA와 결합된 단량체 형태, 특히 PCNAdm-3HA 다중항원이 stem 특이적인 항체가를 증대시킨 결과는 주목할 만한 점이다.
결론적으로 본 발명에 사용된 HA 단량체, HA-PCNAdm 및 PCNAdm-3HA 다중항원은 바이러스 감소 및 혈청내 유도된 항체가가 상용화된 종래 인플루엔자 3가 백신에 필적하거나 월등한 면역 활성이 있음을 확인하였는바, 본 발명의 항원 조성물은 그룹 1, 2 바이러스 감염에 유용하게 적용 가능할 것으로 판단된다.
[부호의 설명]
100: 제1 융합 단백질 110: 제1 스캐폴드 분체
120: 제1 재조합 항원 단백질 200: 제2 융합 단백질
210: 제2 스캐폴드 분체 220: 제2 재조합 항원 단백질
300: 제3 융합 단백질 310: 제3 스캐폴드 분체
320: 제3 재조합 항원 단백질
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물은 다양한 아형 및 변이를 갖는 바이러스의 증식 및 복제를 저해하는 예방 효과가 매우 우수하고, 재조합 단백질을 이용함으로써 재활용성 및 안전성이 인정되는바, 의약 분야, 생명과학 분야 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1로 표시되는 다중 변이단백질은 H1 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 2개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질이고;
    서열번호 2로 표시되는 다중 변이단백질은 B형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 8중 변이 단량체 단백질이며;
    서열번호 3으로 표시되는 다중 변이단백질은 H3 아형 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 5중 변이 및 1개의 disulfide bond가 변이된 단량체 단백질인 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질은 오소믹소바이러스의 증식 및 복제를 저해함으로써 동물 및 인체 인플루엔자에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  5. 스캐폴드 분체 및 상기 스캐폴드 분체에 결합되는 재조합 항원 단백질을 포함하는 융합 단백질을 적어도 하나 이상 포함하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서로 다른 다수개이고,
    다수개의 상기 융합 단백질은 각각의 상기 스캐폴드 분체가 자가 조립되어 고리형 스캐폴드를 형성하고,
    상기 고리형 스캐폴드를 중심으로 외측에 상기 재조합 항원 단백질이 노출되는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 상기 스캐폴드 분체 및 상기 재조합 항원 단백질이 서로 상이한 다수개인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제1 융합 단백질은 서열번호 4로 표시되는 제1 스캐폴드 분체 및 상기 제1 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 1로 표시되는 제1 재조합 항원 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제2 융합 단백질은 서열번호 5로 표시되는 제2 스캐폴드 분체 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 2로 표시되는 제2 재조합 항원 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    다수개의 상기 융합 단백질 중 어느 하나인 제3 융합 단백질은 서열번호 6로 표시되는 제3 스캐폴드 분체 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 3으로 표시되는 제3 재조합 항원 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    다수개의 상기 융합 단백질 중 다른 하나인 제2 융합 단백질은 서열번호 5로 표시되는 제2 스캐폴드 분체 및 상기 제2 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 2로 표시되는 제2 재조합 항원 단백질을 포함하고,
    다수개의 상기 융합 단백질 중 또 다른 하나인 제3 융합 단백질은 서열번호 6로 표시되는 제3 스캐폴드 분체 및 상기 제3 스캐폴드 분체에 결합되며 서열번호 3으로 표시되는 제3 재조합 항원 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 스캐폴드 분체는 PCNA인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 재조합 항원 단백질은 인플루엔자 바이러스 재조합 헤마글루티닌 단백질 단량체 다중 변이단백질인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자바이러스를 포함하는 오소믹소바이러스(Orthomyxoviridae), 돼지전염성위장염(Transmissible gastroenritis virus), 돼지 유행성설사(Porcine Epidemic Diarrhea; PED) 바이러스, 사스, 메르스 및 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스(Coronavirus), 지카바이러스(Zicavirus), 소바이러스설사(Bovine Viral Diarhhea; BVD) 바이러스를 포함하는 플라비바이러스(Flavivirus), 노로바이러스(norovirus)를 포함하는 캘리시바이러스(Calicivirus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 돼지 호흡기 생식기 증후군(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome; PRRS) 바이러스, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2; PCV2) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 파보바이러스(Parvovirus), 피코르나바이러스(Picornavirus), 페스티바이러스(Pestivirus), 랩도바이러스(Rhabdovirus), 버나바이러스(Birnavirus), 레트로바이러스(Retovirus) 및 허피스바이러스(Herpesvirus)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
  15. 제5항에 있어서,
    상기 융합 단백질을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염병 예방 또는 치료용 항원 조성물.
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