WO2016078777A1 - Procede pour assembler un systeme securise pour la culture de cellules - Google Patents

Procede pour assembler un systeme securise pour la culture de cellules Download PDF

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WO2016078777A1
WO2016078777A1 PCT/EP2015/025085 EP2015025085W WO2016078777A1 WO 2016078777 A1 WO2016078777 A1 WO 2016078777A1 EP 2015025085 W EP2015025085 W EP 2015025085W WO 2016078777 A1 WO2016078777 A1 WO 2016078777A1
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WO
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culture
transfer
cells
transfer device
multiple coupling
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Application number
PCT/EP2015/025085
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English (en)
Inventor
Nicolas TARDIVEL
Audrey LAMS
Original Assignee
Maco Pharma
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/40—Manifolds; Distribution pieces

Definitions

  • the invention relates to a method for implementing a cell culture system in order to carry out a succession of operations on said cells.
  • the invention is typically applied to cell culture, in particular in the context of cell therapy, that is to say when the cells are intended to be injected into a patient for the purpose of treating it.
  • Cell culture refers to a set of techniques used to grow cells out of their body ("ex-vivo") or their medium of origin, for therapeutic purposes, scientific experimentation or biotechnological production.
  • a first operation consists in seeding the cells. Seeding comprises culturing cells in a culture vessel. This seeding is carried out by introducing into the culture vessel, cells suspended in a culture medium.
  • the resetting operation consists of a change or renewal of the culture medium.
  • the culture medium is removed from the culture vessel and replaced with a fresh culture medium. This operation is used to provide cells in culture with the elements necessary for their maintenance, proliferation, expansion and / or differentiation.
  • the cells are subcultured, i.e. they are concentrated and removed from the culture vessel for recovery or reseeding into other culture vessels.
  • the cell-free supernatant may contain products of interest is recovered.
  • the document EP 1 903 101 A1 proposes a system of pipes, designated transfer system, for performing the medium change of the system step closed, once the connection made between on the one hand the medium bag of fresh culture and transfer system and secondly between the culture vessel and the transfer system.
  • transfer system a system of pipes, designated transfer system, for performing the medium change of the system step closed, once the connection made between on the one hand the medium bag of fresh culture and transfer system and secondly between the culture vessel and the transfer system.
  • these two connections are now performed under laminar flow hood.
  • this system allows to secure only one of the culture operations.
  • US 2014/0335608 discloses a so-called "closed" culture system for seeding cells in a culture vessel and the introduction, sampling and removal of the culture medium.
  • the system of culture comprises firstly a culture vessel pre-connected to a sampling vessel and a cell harvesting vessel and secondly a culture medium container and a container containing the cells to be cultured, these two containers being, at the time of cultivation, connected via aseptic connectors to a tubing connected to the culture vessel.
  • connections should be made in a laminar flow hood.
  • this system is not easily scalable according to the culture protocols to be applied.
  • US 201 1/0281358 A1 discloses a closed system for isolating and collecting cells, such as bone marrow progenitor cells, and then seeding them on a biocompatible three-dimensional matrix or tissue graft.
  • this system is adapted to perform the seeding operation, other subsequent operations to be performed require the opening of the system.
  • WO 87/06952 Also known from WO 87/06952 is a system for carrying out the introduction of a culture medium into a culture vessel in the form of a flexible bag comprising the cells to be cultivated.
  • the various elements of this system can in particular be interconnected by sterile connectors. But, this system requires to adapt all the useful containers to the culture of cells by equipping them with specific sterile connectors. On the other hand, the number of connections to be made for certain operations can be important, making the use of such a system difficult.
  • the invention proposes to secure all cell culture operations by providing a closed system that can be manipulated outside a laminar flow hood, thus facilitating the manipulations required for said operations.
  • the invention also proposes to simplify said operations by providing a single device that can be used regardless of the operation to be performed and whatever the particular protocol followed by the user.
  • the invention relates to a method for implementing a cell culture system for performing a succession of operations on said cells, said culture system comprising an assortment of closed and sterile devices, said assortment of devices comprising :
  • a culture device comprising a culture vessel adapted for culturing cells
  • said transfer device for allowing the movement of fluid towards the culture device or from said culture device, said transfer device comprising at least one empty bag in fluid communication with a primary transfer tubing on which is connect one or more secondary transfer tubings, and
  • a multiple coupling device for connecting the culture device to more than one transfer device, said multi-connection device comprising a plurality of connection tubes, more than one of said connection tubes being intended to be connected to the sterilization device; one of the transfer tubings of said transfer devices, said method comprising the steps of:
  • Figure 1 schematically shows a culture vessel equipped with a closure member provided with a primary connection pipe.
  • Figure 2 schematically shows the closure element of Figure 1, provided with a primary connection pipe.
  • Figures 3 and 4 show schematically each an embodiment of a set of connection pipes.
  • Figure 5 schematically shows a particular embodiment of a multiple splicing device.
  • Figures 6 to 8 each show an embodiment of a transfer device.
  • Figure 9 schematically shows a container necessary for performing a culture operation that can be connected to a sterile transfer device.
  • Figure 10 schematically shows a culture device, a multiple coupling device and a transfer device assembled together.
  • the invention provides a method for implementing a secure culture system to perform certain closed system cell culture operations such as seeding, medium changing and cell transplanting. Another operation is the sampling of the culture medium or of the cell suspension contained in a culture vessel.
  • the cells are, for example, animal cells, in particular human cells intended to be injected to a patient for a therapeutic purpose.
  • the cells are in particular adherent type cells such as mesenchymal stem cells.
  • the human cells are especially non-embryonic cells.
  • the cultivation operations generally require the use of a culture medium which is a biological medium, in particular adapted to the expansion or maintenance of the cells.
  • the culture medium is for example a nutrient medium.
  • the nutrient medium is a synthetic base medium available in the trade, such as Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), CMRL, EMEM, RPMI1640, DMEM / F-10, DMEM / F12.
  • This base medium can be supplemented with various additives commonly used by those skilled in the art.
  • serum or a serum substitute such as platelet lysate, non-essential amino acids, L-glutamine, vitamins, antibiotics, beta-mercaptoethanol, growth factors, cytokines, etc. .
  • the biological medium is a differentiation medium allowing, for example, the differentiation of stem cells into specific cells.
  • the secure culture system comprises a culture device 1 intended for culturing cells, plus a transfer device 2 intended to allow the movement of fluid towards the culture device or from the device for culture and a multiple coupling device 3 for connecting said culture device 1 and one of said transfer devices 2 so as to put in fluid communication said culture device 1 and said transfer device 2.
  • the culture device comprises a culture vessel 4 adapted to the culture of cells.
  • the culture vessel 4 is a flexible container such as a pocket or a rigid container such as a bottle, a multi-stage bottle, for example CellStack TM from Corning or the Cell Factory TM by Thermo Fisher Scientific, or even rotating bottles.
  • the culture vessel 4 comprises at least one primary orifice to allow the introduction of fluid into said culture vessel 4 or the withdrawal of fluid from said vessel 4.
  • the culture vessel 4 is a rigid and transparent container, made for example of a biocompatible polymer material such as polystyrene.
  • the polymeric material can be chemically and / or physically treated to allow cell adhesion.
  • biocompatible materials for making the culture vessel 4 are polypropylene, ethylene vinyl acetate, Teflon®, polycarbonate, polyethylene terephthalate, glycolized polyethylene terephthalate (PETg) or high density polyethylene (HDPE) .
  • the culture vessel 4 is provided with at least one other vent-forming secondary port 5 comprising a liquid impermeable and gas permeable membrane.
  • the membrane advantageously has a porosity of 0.22 ⁇ so as to form a sterile vent and to keep the sterility of the culture device. This vent makes it possible in particular to provide the cultured cells with the oxygen necessary for their survival.
  • At least a part of a multiple coupling device 3 is arranged at the primary orifice of said culture vessel 4.
  • the multiple coupling device 3 makes it possible to connect the culture device 4 to more than one transfer device 2 and comprises a plurality of connecting tubes 7. These connection tubes are closed and able to be connected. connected sterile to other tubings.
  • the multiple coupling device comprises a closing element of the culture vessel, such as a stopper, from which extends a plurality of connecting tubes capable of being connected in a sterile manner to other tubings.
  • a stopper incorporating a plurality of tubings is described in the document US 2014/0103077.
  • the multiple coupling device 3 comprises, on the one hand, a primary connection pipe 6 in fluid communication with the culture vessel 4 and, on the other hand, a set of pipes comprising a plurality of secondary connecting pipes 7, at least one being connected (FIG. 5) or intended to be connected (FIGS. 1 to 4) to said primary connection pipe 6.
  • the multiple coupling device 3 comprises a closing element 8 of the culture vessel 4, such as a plug, from which the primary connection pipe 6 extends.
  • the culture device 1 and the primary connection tubing 6 of the multiple connector are pre-connected for manufacturing, the user then having to connect the primary connection tubing 6 to one of the secondary connection pipes 7 of the assembly of tubings to form a closed subsystem consisting of the culture device 1 and the multiple coupling device 3.
  • the culture device 1 and the multiple coupling device 3 are pre-connected to manufacture so as to form said closed subsystem constituted by the culture device and the multiple coupling device.
  • the culture vessel 4 comprises a neck defining said primary orifice arranged to receive the closure element 8.
  • the neck of the container 4 comprises a thread on its outer surface and the closure element 8 is a plug that can be screwed onto said neck of the container 4.
  • the closure element 8 is permanently placed on the primary orifice of the culture vessel 4, so that a user can not remove it under normal conditions. use.
  • a vent orifice comprising a liquid impermeable and gas permeable membrane is provided on the closure member of said container.
  • the membrane has a porosity of 0.22 ⁇ so as to obtain a sterile vent.
  • an aeration pipe 9 extends from said closure member 8, said aeration pipe 9 comprising at its end a vent 10 comprising a liquid impermeable membrane and permeable to gases.
  • the membrane has a porosity of 0.22 ⁇ to preserve the sterility of the culture device.
  • This vent 10 makes it possible not only to introduce the oxygen necessary for the survival of the cells cultured in the culture vessel 4, but also, and in particular in the case of a rigid culture vessel, to facilitate the fluidic movements towards the container. 4 or the culture vessel 4.
  • the ventilation tube 9 is provided with a selective opening and closing element 1 1 of the fluid communication in said tubing such as a clamp. This clamp, in the closed position, is particularly useful when adding or removing fluid from the culture vessel 4 in order to avoid wetting said membrane of the vent 10, which would lead to subsequently preventing the entry of oxygen in said culture vessel 4.
  • the tubing assembly comprises a plurality of connecting tubings 7, more than one of said connecting tubings being intended to be connected in a sterile manner to a tubing of one of the transfer devices as described below.
  • the set of pipes comprises a first pipe on which is connected at least one multi-channel connector 12, others tubing being connected to each of the other branches of the multi-channel connector 12, so as to obtain an assembly comprising a plurality of connection pipes 7 intended to be connected to other tubules sterilely.
  • the set of pipes comprises at least three, in particular between three and eight pipes 7 can be connected sterilely.
  • the multi-channel connectors 12 are four-way connectors.
  • each connector may comprise between five and eight branches.
  • Each of the pipes 6, 7 of the multiple coupling device 3 is equipped with a selective opening and closing element 13 of the fluid communication in said tubing, such as a clamp.
  • Each of the pipes 6, 7 of the multiple coupling device 3 intended to be connected to another tubular is closed at its free end, that is to say the end which is not connected to any other element.
  • each of the tubes 6, 7 is closed by a stopper or any other small conical or cylindrical part which fits by pressure in the said end of the tubing and which guarantees the closure and therefore the sterility (after sterilization) of the device. multiple connection.
  • Another sterile device of the culture system is the transfer device 2 intended to allow the movement of fluid towards the culture device 1 or from said culture device 1.
  • the fluid is in particular in the form of a liquid such as a culture medium, a cell suspension, supplements or additives for culture medium, reagents necessary for culturing cells, rinsing solutions, etc.
  • said transfer device 2 is intended, via the multiple coupling device 3, to introduce solutions such as fresh culture medium into the culture vessel 4, to supplement fresh culture medium with additives or additives for medium of culture. culturing, introducing reagents such as dissociation reagent, into said culture vessel 4, or collecting the spent culture medium from the culture vessel 4.
  • the transfer device 2 comprises at least one empty bag 14 in fluid communication with a primary transfer tube 15 to which is connected more than one secondary tubing 1 6 transfer.
  • the primary transfer pipe 15 comprises at least one multi-channel connector 17 to which is connected more than one secondary transfer pipe 16, in particular between two and eight secondary transfer pipes.
  • the transfer device 2 comprises a plurality of tubings 15, 1 6 able to be connected to other tubules sterilely.
  • Each of the transfer tubes 15, 16 intended to be connected sterilely to other tubings is closed at its free end, that is to say the end which is not connected to any other element.
  • each of said tubes is closed by a plug or other small conical or cylindrical piece which fits by pressure in said end of the tubing, thus ensuring the sterility of the device (after sterilization).
  • one of the transfer tubes 18 is provided at its end with a filter 19 comprising a sterilizing membrane.
  • the membrane has a porosity of 0.22 ⁇ .
  • Said filter 19 comprises a connector 20, in particular of Luer type, able to connect a container, such as a syringe, equipped with a suitable compatible connector.
  • This tubing 18 equipped with a sterilizing filter 19 may be used for example to connect a syringe filled with a dissociation solution such as trypsin or any other additive solution such as heparin.
  • each of the tubes 15, 16, 18 of the transfer device is equipped with a selective opening and closing element 21 of the fluid communication in said tubing such as a clamp.
  • the transfer device 2 has the advantage of being able to be used to carry out in a secure manner, that is to say by reducing the risk of pathogenic contamination, several culture operations and also to be adapted to the different culture protocols. the end user.
  • the user will be able to sterilely connect the different containers necessary for the execution of a cell culture operation, such as an empty container to collect the cells.
  • a container containing fresh culture medium or any other solution is shown in FIG. 9.
  • the container is in the form of a bag 22 from an orifice of which a tubing 23 extends. This tubing is closed at its other end, in particular by a stopper or any other small conical or cylindrical piece which fits by pressure in said end of the tubing, thus ensuring the sterility of the device (after sterilization).
  • the container 22 comprises fresh culture medium, supplements of culture medium such as platelet lysate, trypsin, etc.
  • the tubing 23 is intended to be connected in a sterile manner to one of the tubings 15, 16 of the transfer device.
  • such containers 22 are pre-connected or integrated manufacturing the transfer device.
  • the sterile connection between the various tubes of the secure culture system is notably performed using a sterile tubular tube connection device such as the TSCD TM device (Terumo Medical Corp.), the TCD TM (Genesis BPL). or the Biowelder TM (Sartorius Stedim).
  • a sterile tubular tube connection device such as the TSCD TM device (Terumo Medical Corp.), the TCD TM (Genesis BPL). or the Biowelder TM (Sartorius Stedim).
  • the tubings intended to be connected sterilely are made of a weldable and sterilizable material.
  • these pipes are made of polyvinyl chloride or other heat-sealable thermoplastic elastomer such as C-Flex TM Saint-Gobain.
  • the culture system devices or parts thereof are closed and sterile, i.e. they have been sterilized by a conventional sterilization method such as steam sterilization or gamma irradiation or gamma irradiation sterilization. 'ethylene.
  • a method according to the invention is now described for implementing a cell culture system as just described in order to carry out a succession of operations on said cells, said culture system comprising an assortment of closed devices. and sterile, said assortment of devices comprising:
  • a culture device 1 comprising a culture vessel 4 suitable for culturing cells
  • transfer device 2 intended to allow the movement of fluid to the culture device 1 or from said culture device, said transfer device 2 comprising at least one empty bag 14 in communication fluidic with a primary transfer line 15 to which is connected one or more secondary tubing 16 transfer, and
  • a multiple connection device 3 for connecting the culture device 1 to more than one transfer device 2, said multiple connection device 2 comprising a plurality of connection tubes 7, more than one of said connection tubes being intended for be connected sterilely to one of the tubing 1 6 transfer of said transfer devices 2.
  • the method comprises the steps of:
  • Each operation to be performed on the cells is chosen in particular from the group consisting of seeding, changing the medium or subculture.
  • the other operation to be performed on the cells may be of the same type or not.
  • the first operation is a medium change operation
  • the next operation is another medium change operation or a dunnage operation.
  • the method comprises, prior to step (b), the step consisting in connecting at least one of the transfer tubes 1 6 of transfer of said transfer device 2, at least one tubing 23 equipping a container 22 necessary for perform the operation to be performed on the cells, for example a container comprising a liquid such as a culture medium, a supplement or additive for culture medium, a buffer solution or a dissociation reagent.
  • the disconnection of the transfer device 2 from said multiple coupling device 3 is achieved by welding and cutting the connection pipe 7 of the multiple coupling device 3 which has been connected to the tubing 1 6 of the device. transfer 2 to step (a).
  • the disconnection is performed by welding cutting the connection pipe 7 as close as possible to the multi-lane connector 12, thus preventing the re-use of the remaining portion of tubing.
  • the method comprises the preliminary step of:
  • a fresh culture medium bag In order to carry out the seeding, in addition to the culture devices 1, the multiple connector 3 and the transfer device 3, a fresh culture medium bag, a container containing a cell suspension and optionally a container containing supplements of culture medium.
  • the bag and each of the containers are equipped with a tubular in fluid communication with the interior volume of said container or said bag.
  • the method comprises the following preliminary steps:
  • the seeding operation comprises the steps of:
  • the culture system comprising the culture device 1 and the multiple coupling device 3 is ready to be used to perform another operation.
  • the method of implementing the system for performing the medium change operation is described below.
  • a fresh culture medium bag and one or more containers containing a complement of medium of culture are required. culture.
  • the bag and each of the containers are provided with a tubular in fluid communication with the interior volume of said container or said bag.
  • the method comprises the preliminary steps of:
  • the medium change operation comprises the steps of:
  • the culture system comprising the culture device 1 and the multiple connector device 3 is ready to be used to perform another operation.
  • a method of implementing the system for carrying out a subcapping operation is described.
  • transplanting that is to say the recovery and concentration of cells, it is necessary, in addition to the culture devices 1, multiple connector 3 and transfer 2, a dissociation solution of cells of trypsin type, a PBS buffer solution, an empty syringe with tubing and an empty cell collection bag.
  • the bags and containers are equipped with tubing in fluid communication with the interior volume of said containers or pockets and a balance
  • the method comprises the following preliminary steps:
  • the transplanting operation consists of:
  • connection pipe 7 which has not already been used to avoid any risk of contamination. If the syringe is not equipped with a tubing, then it is possible to use a transfer system as shown in FIG. 7 which comprises a tubing 18 provided at its end with a filter 19 comprising a sterilizing membrane. The syringe is then connected to the sterilizing filter to securely perform the transplanting operation.
  • the clamp 1 1 on the ventilation tube is in the closed position.
  • the culture device assembled with the multiple coupling device is placed in an incubator at 37 ° C, the clamp 1 1 on the ventilation duct 9 being in the open position.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour mettre en œuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs stériles, ledit assortiment de dispositifs stériles comportant : - un dispositif de culture (1) comprenant un récipient de culture (4) adapté à la culture de cellules, - plus d'un dispositif de transfert (2) destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture (1) ou à partir dudit dispositif de culture (1), ledit dispositif de transfert (2) comprenant au moins une poche vide (14) en communication fluidique avec une tubulure primaire (15) de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires (16) de transfert, et - un dispositif de raccord multiple (3) pour raccorder le dispositif de culture (1) à plus d'un dispositif de transfert (2), ledit dispositif de raccord multiple (3) comprenant une pluralité de tubulures (7) de raccordement, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : (a) connecter stérilement l'une des tubulures de raccordement (7) du dispositif de raccord multiple (3) à l'une des tubulures de transfert (16) du dispositif de transfert (2), (b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver, (c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert (2) dudit dispositif de raccord multiple (3), et (d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert (2) pour réaliser une autre opération sur les cellules.

Description

Procédé pour assembler un système sécurisé pour la culture de cellules
L'invention concerne un procédé pour mettre en œuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules.
L'invention s'applique typiquement à la culture cellulaire, notamment dans le cadre d'une thérapie cellulaire, c'est-à-dire lorsque les cellules sont destinées à être injectées à un patient dans le but de le traiter. La culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but thérapeutique, d'expérimentation scientifique ou de production biotechnologique. Parmi ces techniques, une première opération consiste en l'ensemencement des cellules. L'ensemencement comprend la mise en culture de cellules dans un récipient de culture. Cet ensemencement est réalisé en introduisant dans le récipient de culture, des cellules mises en suspension dans un milieu de culture.
L'opération de renourrissage consiste en un changement ou renouvellement du milieu de culture. Dans ce cas, le milieu de culture est prélevé du récipient de culture et remplacé par un milieu de culture frais. Cette opération est utilisée pour apporter aux cellules en culture les éléments nécessaires à leur maintien, prolifération, expansion et/ou différentiation.
A la fin de la culture, les cellules sont repiquées, c'est-à-dire qu'elles sont concentrées et retirées du récipient de culture pour être récupérées ou réensemencées dans d'autres récipients de culture.
En variante, à la fin de la culture, le surnageant sans cellules pouvant contenir des produits d'intérêt est récupéré.
Ces différentes opérations doivent être réalisées dans des conditions aseptiques afin d'éviter toute contamination bactérienne.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Or, ces différentes opérations nécessitent l'utilisation de récipients variés tels que des seringues, des flacons, des flasques et des poches. De plus, ces récipients sont soit vides soit remplis de solutions variées, telles que des milieux de culture, des compléments de milieu de culture ou des réactifs.
Du fait de la diversité des opérations à effectuer sur les cellules, de la diversité des récipients à utiliser et de la diversité des solutions à utiliser, il n'est pas possible de travailler avec des systèmes fermés, c'est-à-dire des systèmes dans lesquels les différents composants seraient tous pré-connectés de fabrication. En pratique, ces opérations sont par conséquent réalisées en système ouvert, généralement sous hotte à flux laminaire, afin de réduire le risque de contamination des cellules. Ces opérations réalisées sous hotte constituent cependant toujours un risque de contamination du fait des erreurs de manipulations possibles. D'autre part, certains récipients de culture étant relativement encombrants, les manipulations sous hotte ne sont pas toujours aisées. Des solutions ont déjà été proposées afin de sécuriser les opérations de culture cellulaire.
Par exemple, le document EP 1 903 101 A1 propose un système de tubulures, désigné système de transfert, permettant de réaliser l'étape de changement de milieu en système fermé, une fois la connexion réalisée entre d'une part la poche de milieu de culture frais et le système de transfert et d'autre part entre le récipient de culture et le système de transfert. Cependant, ces deux connexions sont aujourd'hui réalisées sous hotte à flux laminaire. D'autre part, ce système ne permet de sécuriser qu'une seule des opérations de culture.
Le document US 2014/0335608 décrit un système de culture dit "clos" permettant l'ensemencement des cellules dans un récipient de culture ainsi que l'introduction, l'échantillonnage et le retrait du milieu de culture. Le système de culture comprend d'un part un récipient de culture pré-connecté à un récipient d'échantillonnage et à un récipient de récolte des cellules et d'autre part un récipient de milieu de culture et un récipient contenant les cellules à cultiver, ces deux récipients étant, au moment de la culture, connectés par l'intermédiaire de connecteurs aseptiques à une tubulure reliée au récipient de culture. Pour garantir la stérilité du système, il convient de réaliser les connections sous hotte à flux laminaire. En outre, ce système n'est pas facilement modulable en fonction des protocoles de culture à appliquer. Le document US 201 1 /0281358 A1 propose un système fermé pour isoler et collecter des cellules, telles que des cellules progénitrices de la moelle osseuse, puis les ensemencer sur une matrice tridimensionnelle biocompatible ou sur un greffon de tissue. Cependant, si ce système est adapté pour réaliser l'opération d'ensemencement, les autres opérations ultérieures à réaliser nécessitent l'ouverture du système.
On connaît également du document WO 87/06952 un système pour réaliser l'introduction d'un milieu de culture dans un récipient de culture sous forme d'une poche souple comprenant les cellules à cultiver. Les différents éléments de ce système peuvent notamment être reliés entre eux par des connecteurs stériles. Mais, ce système nécessite d'adapter tous les récipients utiles à la culture de cellules en les équipant de connecteurs stériles spécifiques. D'autre part, le nombre de connexion à réaliser pour certaines opérations peut être important, rendant complexe l'utilisation d'un tel système.
L'invention propose de sécuriser l'ensemble des opérations de culture cellulaire en fournissant un système fermé pouvant être manipulé en dehors d'une hotte à flux laminaire, facilitant ainsi les manipulations nécessaires auxdites opérations. L'invention propose également de simplifier lesdites opérations en fournissant un dispositif unique pouvant être utilisé quelle que soit l'opération à réaliser et quel que soit le protocole particulier suivi par l'utilisateur. A cet effet, l'invention concerne un procédé pour mettre en œuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant :
- un dispositif de culture comprenant un récipient de culture adapté à la culture de cellules,
- plus d'un dispositif de transfert destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture ou à partir dudit dispositif de culture, ledit dispositif de transfert comprenant au moins une poche vide en communication fluidique avec une tubulure primaire de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires de transfert, et
- un dispositif de raccord multiple pour raccorder le dispositif de culture à plus d'un dispositif de transfert, ledit dispositif de raccord multiple comprenant une pluralité de tubulures de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulures de transfert desdits dispositifs de transfert, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
(a) connecter stérilement l'une des tubulures de raccordement du dispositif de raccord multiple à l'une des tubulures de transfert d'un desdits dispositifs de transfert,
(b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver,
(c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert dudit dispositif de raccord multiple, et
(d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert pour réaliser une autre opération sur les cellules.
D'autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit.
La figure 1 représente de façon schématique un récipient de culture équipé d'un élément de fermeture pourvu d'une tubulure primaire de raccordement.
La figure 2 représente de façon schématique l'élément de fermeture de la figure 1 , pourvu d'une tubulure primaire de raccordement. Les figures 3 et 4 représentent de façon schématique chacune une réalisation d'un ensemble de tubulures de raccordement. La figure 5 représente de façon schématique une réalisation particulière d'un dispositif de raccord multiple.
Les figures 6 à 8 représentent chacune une réalisation d'un dispositif de transfert.
La figure 9 représente de façon schématique un récipient nécessaire à la réalisation d'une opération de culture pouvant être connecté stérilement à un dispositif de transfert. La figure 10 représente de façon schématique un dispositif de culture, un dispositif de raccord multiple et un dispositif de transfert assemblés ensemble.
L'invention fournit un procédé pour mettre en œuvre un système de culture sécurisé afin de réaliser certaines opérations de culture cellulaire en système fermé telles que l'ensemencement, le changement de milieu et le repiquage des cellules. Une autre opération est l'échantillonnage du milieu de culture ou de la suspension cellulaire contenu dans un récipient de culture.
Les cellules sont par exemple des cellules animales, notamment humaines destinées à être injectées à un patient dans un but thérapeutique. Les cellules sont en particulier des cellules du type adhérentes telles que les cellules souches mésenchymateuses. Les cellules humaines sont notamment des cellules non embryonnaires. Les opérations de culture nécessitent généralement l'utilisation d'un milieu de culture qui est un milieu biologique notamment adapté à l'expansion ou le maintien des cellules. Le milieu de culture est par exemple un milieu nutritif. En particulier, le milieu nutritif est un milieu de base synthétique disponible dans le commerce, tel que Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM), Minimal Essential Médium (MEM), CMRL, EMEM, RPMI1640, DMEM/F-10, DMEM/F12.
Ce milieu de base peut être supplémenté avec divers additifs couramment utilisés par l'homme du métier.
Parmi les additifs, on peut citer du sérum ou un substitut de sérum comme du lysat plaquettaire, des acides aminés non essentiels, la L-glutamine, des vitamines, des antibiotiques, le béta-mercaptoéthanol, des facteurs de croissance, des cytokines, etc.
En variante, le milieu biologique est un milieu de différentiation permettant, par exemple, la différentiation de cellules souches en cellules spécifiques.
En relation avec les figures, le système de culture sécurisé comprend un dispositif de culture 1 destiné à la culture de cellules, plus d'un dispositif de transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture ou à partir du dispositif de culture et un dispositif de raccord multiple 3 pour raccorder ledit dispositif de culture 1 et un desdits dispositifs de transfert 2 de sorte à mettre en communication fluidique ledit dispositif de culture 1 et ledit dispositif de transfert 2.
Selon la figure 1 , le dispositif de culture comprend un récipient de culture 4 adapté à la culture de cellules.
Le récipient de culture 4 est un récipient souple tel qu'une poche ou un récipient rigide tel qu'un flacon, un flacon à plusieurs étages, par exemple le CellStack™ de Corning ou le Cell Factory™ de Thermo Fisher Scientific, ou encore des bouteilles tournantes.
En relation avec la figure 1 , le récipient de culture 4 comprend au moins un orifice primaire pour permettre l'introduction de fluide dans ledit récipient 4 de culture ou le retrait de fluide dudit récipient 4. Dans un exemple particulier, le récipient de culture 4 est un récipient rigide et transparent, réalisé par exemple en un matériau polymère biocompatible tel que le polystyrène. Le matériau polymère peut être traité chimiquement et/ou physiquement pour permettre l'adhésion des cellules.
D'autres matériaux biocompatibles pour réaliser le récipient de culture 4 sont le polypropylène, l'éthylène-acétate de vinyl, le Teflon®, le polycarbonate, le polyéthylène téréphtalate, le polyéthylène téréphtalate glycolisé (PETg) ou le polyéthylène haute densité (HDPE).
Sur la figure 1 , le récipient de culture 4 est muni d'un moins un autre orifice secondaire 5 formant un évent et comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz. La membrane possède avantageusement une porosité de 0,22 μηι de sorte à former un évent stérile et à garder la stérilité du dispositif de culture. Cet évent permet notamment de fournir aux cellules cultivées, l'oxygène nécessaire à leur survie.
Au moins une partie d'un dispositif de raccord multiple 3 est arrangé au niveau de l'orifice primaire dudit récipient de culture 4.
En relation avec la figure 5, le dispositif de raccord multiple 3 permet de raccorder le dispositif de culture 4 à plus d'un dispositif de transfert 2 et comprend une pluralité de tubulures de raccordement 7. Ces tubulures de raccordement sont fermées et aptes à être connectées de façon stérile à d'autres tubulures.
Selon une première réalisation (non représentée), le dispositif de raccord multiple comprend un élément de fermeture du récipient de culture, tel qu'un bouchon, à partir duquel s'étend une pluralité de tubulures de raccordement aptes à être connectées de façon stérile à d'autres tubulures. Un exemple de bouchon intégrant une pluralité de tubulures est décrit dans le document US 2014/0103077. Selon une deuxième réalisation et en relation avec les figures 1 à 5, le dispositif de raccord multiple 3 comprend d'une part une tubulure primaire 6 de raccordement en communication fluidique avec le récipient de culture 4 et d'autre part un ensemble de tubulures comprenant une pluralité de tubulures secondaires de raccordement 7, l'une au moins étant connectée (figure 5) ou destinée à être connectée (figures 1 à 4) à ladite tubulure primaire 6 de raccordement. En particulier, et comme représenté sur la figure 5, le dispositif de raccord multiple 3 comprend un élément de fermeture 8 du récipient de culture 4, tel qu'un bouchon, à partir duquel s'étend la tubulure primaire 6 de raccordement.
Avantageusement, le dispositif de culture 1 et la tubulure primaire 6 de raccordement du raccord multiple sont pré connectés de fabrication, l'utilisateur devant ensuite connecter stérilement la tubulure primaire 6 de raccordement à l'une des tubulures secondaires 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures pour former un sous-système fermé constitué du dispositif de culture 1 et du dispositif de raccord multiple 3.
Encore plus avantageusement, le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 sont pré connectés de fabrication de sorte à former ledit sous-système fermé constitué du dispositif de culture et du dispositif de raccord multiple.
Sur la figure 1 , le récipient de culture 4 comprend un col définissant ledit orifice primaire arrangé pour recevoir l'élément de fermeture 8. Par exemple, le col du récipient 4 comprend un filet sur sa surface extérieure et l'élément de fermeture 8 est un bouchon pouvant être vissé sur ledit col du récipient 4.
Pour plus de sécurité et assurer la stérilité du système, l'élément de fermeture 8 est placé de façon définitive sur l'orifice primaire du récipient de culture 4, de sorte qu'un utilisateur ne puisse pas le retirer dans des conditions normales d'utilisation. Selon une variante de réalisation, un orifice formant évent comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz est prévu sur l'élément de fermeture dudit récipient. Avantageusement, la membrane possède une porosité d 0,22 μηι de sorte à obtenir un évent stérile.
Dans une autre variante représentée sur les figures 1 et 2, une tubulure d'aération 9 s'étend à partir dudit élément de fermeture 8, ladite tubulure d'aération 9 comprenant à son extrémité un évent 10 comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz. Avantageusement, la membrane possède une porosité de 0,22 μηι pour préserver la stérilité du dispositif de culture.
Cet évent 10 permet non seulement d'introduire l'oxygène nécessaire à la survie des cellules cultivées dans le récipient de culture 4, mais aussi et en particulier dans le cas d'un récipient de culture rigide, de faciliter les mouvements fluidiques vers le récipient de culture 4 ou à partir du récipient de culture 4. La tubulure d'aération 9 est pourvue d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 1 1 de la communication fluidique dans ladite tubulure tel qu'un clamp. Ce clamp, en position fermée, est notamment utile lors de l'ajout ou du retrait de fluide du récipient de culture 4 afin d'éviter de mouiller ladite membrane de l'évent 10, ce qui conduirait à empêcher ultérieurement l'entrée d'oxygène dans ledit récipient de culture 4.
En relation avec les figures 3 à 5, l'ensemble de tubulures comprend une pluralité de tubulures 7 de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinées à être connectée de façon stérile à une tubulure d'un des dispositifs de transfert comme décrit ci-après.
En particulier, l'ensemble de tubulures comprend une première tubulure sur laquelle est branché au moins un connecteur 12 à voies multiples, d'autres tubulures étant branchées sur chacune des autres branches du connecteur 12 à voies multiples, de sorte à obtenir un ensemble comportant une pluralité de tubulures 7 de raccordement destinées à être connectées stérilement à d'autres tubulures.
Notamment, l'ensemble de tubulures comporte au moins trois, notamment entre trois et huit tubulures 7 pouvant être connectées stérilement.
Par exemple, sur les figures 3 et 4, les connecteurs 12 à voies multiples sont des connecteurs à quatre voies. En variante, chaque connecteur peut comprendre entre cinq et huit branches.
Chacune des tubulures 6, 7 du dispositif de raccord multiple 3 est équipée d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 13 de la communication fluidique dans ladite tubulure, tel qu'un clamp.
Chacune des tubulures 6, 7 du dispositif de raccord multiple 3 destinées à être connectées stérilement à une autre tubulure est fermée à son extrémité libre, c'est-à-dire l'extrémité qui n'est reliée à aucun autre élément. Par exemple, chacune des tubulures 6,7 est fermée par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité de la tubulure et qui garantit la fermeture et donc la stérilité (après stérilisation) du dispositif de raccord multiple. Un autre dispositif stérile du système de culture est le dispositif de transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture 1 ou à partir dudit dispositif de culture 1 .
Le fluide est notamment sous forme d'un liquide tel qu'un milieu de culture, une suspension cellulaire, des compléments ou additifs pour milieu de culture, des réactifs nécessaires à la culture de cellules, des solutions de rinçage, etc. Notamment, ledit dispositif de transfert 2 est destiné, via le dispositif de raccord multiple 3, à introduire des solutions comme du milieu de culture frais dans le récipient de culture 4, à supplémenter du milieu de culture frais avec des compléments ou additifs pour milieu de culture, à introduire des réactifs comme par exemple un réactif de dissociation, dans ledit récipient de culture 4, ou à recueillir le milieu de culture usagé provenant du récipient de culture 4.
En relation avec les figures 6 à 8, le dispositif de transfert 2 comprend au moins une poche vide 14 en communication fluidique avec une tubulure primaire 15 de transfert sur laquelle est branchée plus d'une tubulure secondaire 1 6 de transfert.
Selon une réalisation particulière, la tubulure primaire 15 de transfert comprend au moins un connecteur 17 à voies multiples sur lequel est branché plus d'une tubulure secondaire 16 de transfert, notamment entre deux et huit tubulures secondaires de transfert.
Ainsi, le dispositif de transfert 2 comprend une pluralité de tubulures 15, 1 6 aptes à être connectées stérilement à d'autres tubulures.
Chacune des tubulures 15, 16 de transfert destinées à être connectées stérilement à d'autres tubulures est fermée à son extrémité libre, c'est-à-dire l'extrémité qui n'est reliée à aucun autre élément. Par exemple, chacune desdites tubulures est fermée par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité de la tubulure, garantissant ainsi la stérilité du dispositif (après stérilisation).
En variante représentée sur la figure 7, l'une des tubulures de transfert 18 est pourvue à son extrémité d'un filtre 19 comprenant une membrane stérilisante. La membrane possède une porosité de 0,22 μηι. Ledit filtre 19 comprend un connecteur 20, notamment de type Luer, apte à connecter un récipient, tel qu'une seringue, équipé d'un connecteur compatible approprié. Cette tubulure 18 équipée d'un filtre stérilisant 19 pourra être utilisée par exemple pour connecter une seringue remplie d'une solution de dissociation telle que de la trypsine ou de toute autre solution additive telle que l'héparine. En particulier, chacune des tubulures 15, 16, 18 du dispositif de transfert est équipée d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture 21 de la communication fluidique dans ladite tubulure tel qu'un clamp.
Le dispositif de transfert 2 présente l'avantage de pouvoir être utilisé pour réaliser de façon sécurisé, c'est-à-dire en réduisant le risque de contamination pathogène, plusieurs opérations de culture et également d'être adapté aux différents protocoles de culture de l'utilisateur final.
En effet, grâce à la pluralité de tubulures disponibles pour réaliser des connexions stériles, l'utilisateur va pouvoir connecter stérilement les différents récipients nécessaires à l'exécution d'une opération de culture de cellules, tel qu'un récipient vide pour recueillir les cellules cultivées, un récipient contenant du milieu de culture frais ou toute autre solution. Un tel récipient est représenté sur la figure 9. Le récipient se présente sous forme d'une poche 22 à partir d'un orifice duquel s'étend une tubulure 23. Cette tubulure est fermée à son autre extrémité notamment par un bouchon ou toute autre petite pièce conique ou cylindrique qui s'encastre par pression dans ladite extrémité de la tubulure, garantissant ainsi la stérilité du dispositif (après stérilisation).
En particulier, le récipient 22 comprend du milieu de culture frais, des compléments de milieu de culture tel qu'un lysat plaquettaire, de la trypsine, etc.
La tubulure 23 est destinée à être connectée de façon stérile à l'une des tubulures 15, 16 du dispositif de transfert. An variante, de tels récipients 22 sont pré connectés ou intégrés de fabrication au dispositif de transfert.
Dans le cas où les solutions nécessaires à une opération de culture de cellules ne sont pas fournies dans des récipients munis d'une tubulure apte à être connectée à une tubulure du dispositif de transfert, celles-ci devront être reconditionnées dans des récipients équipés d'une tubulure.
La connexion stérile entre les différentes tubulures du système de culture sécurisé est notamment réalisée à l'aide d'un appareil de connexion stérile tube à tube tel que l'appareil TSCD™ (Terumo Médical Corp.), le TCD™ (Genesis BPL) ou le Biowelder™ (Sartorius Stedim).
Les tubulures destinées à être connectées stérilement sont réalisées dans un matériau soudable et stérilisable. Notamment, ces tubulures sont réalisées en polychlorure de vinyle ou tout autre élastomère thermoplastique thermosoudable comme le C-Flex™ de Saint-Gobain.
Les dispositifs du système de culture ou parties de ceux-ci sont fermés et stériles, c'est-à-dire qu'ils ont été stérilisés par une méthode de stérilisation classique comme la stérilisation vapeur ou la stérilisation par irradiation gamma ou par oxyde d'éthylène.
On décrit maintenant un procédé selon l'invention pour mettre en œuvre un système de culture de cellules tel qu'il vient d'être décrit afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant :
- un dispositif de culture 1 comprenant un récipient de culture 4 adapté à la culture de cellules,
- plus d'un dispositif de transfert 2 destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture 1 ou à partir dudit dispositif de culture, ledit dispositif de transfert 2 comprenant au moins une poche vide 14 en communication fluidique avec une tubulure primaire 15 de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires 16 de transfert, et
- un dispositif de raccord multiple 3 pour raccorder le dispositif de culture 1 à plus d'un dispositif de transfert 2, ledit dispositif de raccord multiple 2 comprenant une pluralité de tubulures 7 de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulure 1 6 de transfert desdits dispositifs de transfert 2.
Selon l'invention, le procédé comprend les étapes consistant à :
(a) connecter stérilement l'une des tubulures 7 de raccordement du dispositif de raccord multiple 3 à l'une des tubulures de transfert 1 6 d'un desdits dispositifs de transfert 2,
(b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver,
(c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert 2 dudit dispositif de raccord multiple 3, et
(d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert 2 pour réaliser une autre opération sur les cellules.
Chaque opération à réaliser sur les cellules est choisie notamment dans le groupe constitué par l'ensemencement, le changement de milieu ou le repiquage.
Après l'étape de connexion (a) de l'une des tubulures 7 de raccordement du dispositif de raccord multiple 3 à l'une des tubulures de transfert 16 d'un desdits dispositifs de transfert 2, on obtient un système fermé tel que représenté sur la figure 10.
A l'étape (d), l'autre opération à réaliser sur les cellules peut être du même type ou non. Par exemple, si la première opération est une opération de changement de milieu, l'opération suivante est une autre opération de changement de milieu ou une opération de repiquage. En particulier, le procédé comprend, préalablement à l'étape (b), l'étape consistant à connecter stérilement à au moins une des tubulures 1 6 de transfert dudit dispositif de transfert 2, au moins une tubulure 23 équipant un récipient 22 nécessaire pour réaliser l'opération à réaliser sur les cellules, par exemple un récipient comprenant un liquide tel qu'un milieu de culture, un complément ou additif pour milieu de culture, une solution tampon ou un réactif de dissociation.
Après la réalisation de l'opération, la déconnexion du dispositif de transfert 2 dudit dispositif de raccord multiple 3 est réalisée en soudant et coupant la tubulure de raccordement 7 du dispositif de raccord multiple 3 qui a été connectée à la tubulure 1 6 du dispositif de transfert 2 à l'étape (a).
Avantageusement et afin de réduire le risque de contamination en cas de connexion défectueuse, la déconnexion est réalisée en soudant coupant la tubulure de raccordement 7 au plus près du connecteur 12 à voies multiples, empêchant ainsi la ré-utilisation de la portion de tubulure restante.
On décrit maintenant des exemples particuliers de mise en œuvre du système de culture sécurisé tel que représenté sur les figures comprenant un dispositif de culture 1 , un dispositif de raccord multiple 3 et un dispositif de transfert 2.
Le procédé comprend l'étape préliminaire consistant à :
- le cas échéant, connecter stérilement la tubulure primaire 6 de raccordement du dispositif de raccord multiple 3 à l'une des tubulures secondaires 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures de sorte à former le dispositif de raccord multiple 3.
- connecter stérilement l'une des tubulures 7 de raccordement de l'ensemble de tubulures à l'une des tubulures 1 6 d'un dispositif de transfert 2.
Ces étapes préliminaires peuvent être réalisées en dehors de la hotte à flux laminaire puisque les connexions sont des connexions stériles. On décrit maintenant un procédé de mise en œuvre du système pour réaliser une opération d'ensemencement.
Pour réaliser l'ensemencement, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1 , de raccord multiple 3 et de transfert 3, d'une poche de milieu de culture frais, d'un récipient contenant une suspension cellulaire et éventuellement d'un récipient contenant des compléments de milieu de culture. La poche et chacun des récipients sont équipés d'une tubulure en communication fluidique avec le volume intérieur dudit récipient ou de ladite poche.
Le procédé comporte les étapes préliminaires suivantes :
- connecter stérilement la poche de milieu de culture frais à l'une des tubulures de transfert 1 6 du dispositif de transfert,
- connecter stérilement le récipient contenant la suspension cellulaire à ensemencer à l'une des tubulures 1 6 du dispositif de transfert,
- le cas échéant, connecter stérilement un ou plus autres récipients contenant des compléments pour milieu de culture à une ou plus autres tubulures 16 du dispositif de transfert. L'opération d'ensemencement comprend les étapes consistant à :
- transférer la suspension cellulaire et, le cas échéant, des compléments de milieu de culture dans la poche de milieu de culture frais,
- transférer le milieu de culture frais contenant les cellules et éventuellement complémenté dans le récipient de culture 4 du dispositif de culture l ,
- déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant avantageusement la tubulure de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 1 6 au plus près du connecteur à voies multiples 12 auquel la tubulure de raccordement est branchée, afin d'empêcher sa réutilisation.
Après cet opération d'ensemencement, le système de culture comprenant le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 est prêt à être utilisé pour réaliser une autre opération. Le procédé de mise en œuvre du système pour réaliser l'opération de changement de milieu est décrit ci-dessous. Pour réaliser le changement de milieu, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1 , de raccord multiple 3 et de transfert 2, d'une poche de milieu de culture frais et d'un ou plusieurs récipients contenant un complément de milieu de culture. La poche et chacun des récipients sont pourvus d'une tubulure en communication fluidique avec le volume intérieur dudit récipient ou de ladite poche.
Les étapes suivantes peuvent être réalisées en dehors de la hotte.
Le procédé comprend les étapes préliminaires consistant à :
- connecter stérilement la poche de milieu de culture frais à l'une des tubulures de transfert 1 6 du dispositif de transfert 2,
- le cas échéant, connecter stérilement un ou plus autres récipients contenant des compléments pour milieu de culture à une ou plus autres tubulures 1 6 du dispositif de transfert 2.
L'opération de changement de milieu comprend les étapes consistant à :
- transférer le milieu usagé dans la poche vide 14 de dispositif de transfert 2,
- le cas échéant, transférer les compléments de culture dans la poche de milieu de culture frais,
- transférer le milieu de culture frais éventuellement complémenté dans le récipient de culture 4,
- déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant la tubulure de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 1 6.
Après cet opération de changement de milieu, le système de cultu re comprenant le dispositif de culture 1 et le dispositif de raccord multiple 3 est prêt à être utilisé pour réaliser une autre opération. On décrit enfin un procédé de mise en œuvre du système pour réaliser une opération de repiquage. Pour réaliser le repiquage, c'est-à-dire la récupération et la concentration de cellules, on a besoin, en plus des dispositifs de culture 1 , de raccord multiple 3 et de transfert 2, d'une solution de dissociation de cellules de type trypsine, d'une solution tampon de type PBS, d'une seringue vide munie d'une tubulure et d'une poche vide de recueil des cellules. Les poches et les récipients sont équipés d'une tubulure en communication fluidique avec le volume intérieur desdits récipients ou desdites poches et d'une balance
Le procédé comprend les étapes préliminaires suivantes :
- connecter de façon stérile la poche de solution tampon, la poche de recueil des cellules, la seringue et la trypsine à l'une des tubulures 16 de transfert du dispositif de transfert 2, de sorte à former un système fermé.
L'opération de repiquage consiste à :
- transférer le milieu de culture usagé dans la poche vide 14 du dispositif de transfert 2,
- prélever un certain volume de milieu de culture dans la seringue vide,
- rincer le récipient de culture 4 avec une solution tampon,
- ajouter une solution de dissociation dans le récipient de culture 4 afin de détacher les cellules du récipient,
- transférer un volume déterminé de milieu de culture pour neutraliser la solution de dissociation en disposant le récipient de culture sur la balance,
- transférer les cellules détachées dans la poche de recueil des cellules, et
- déconnecter le dispositif de transfert 2 en soudant et coupant la tubulure de raccordement 7 connectée à la tubulure de transfert 1 6. Pour chacune de ces étapes, il est avantageux d'utiliser une tubulure de raccordement 7 qui n'a pas déjà été utilisée afin d'éviter tout risque de contamination. Si la seringue n'est pas équipée d'une tubulure, on peut alors utiliser un système de transfert tel que représenté sur la figure 7 qui comprend une tubulure 18 pourvue à son extrémité d'un filtre 19 comprenant une membrane stérilisante. La seringue est alors connectée au filtre stérilisant pour réaliser de façon sécurisée l'opération de repiquage.
Lors de chacune de ces opérations, le clamp 1 1 sur la tubulure d'aération est en position fermée. Entre chaque opération, le dispositif de culture assemblé avec le dispositif de raccord multiple est disposé dans un incubateur à 37°C, le clamp 1 1 sur la tubulure d'aération 9 étant en position ouverte.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé pour mettre en œuvre un système de culture de cellules afin de réaliser une succession d'opérations sur lesdites cellules, ledit système de culture comprenant un assortiment de dispositifs fermés et stériles, ledit assortiment de dispositifs comportant :
- un dispositif de culture (1 ) comprenant un récipient de culture (4) adapté à la culture de cellules,
- plus d'un dispositif de transfert (2) destiné à permettre le mouvement de fluide vers le dispositif de culture (1 ) ou à partir dudit dispositif de culture (1 ), ledit dispositif de transfert (2) comprenant au moins une poche vide (14) en communication fluidique avec une tubulure primaire (15) de transfert sur laquelle est branchée une ou plus tubulures secondaires (1 6) de transfert, et
- un dispositif de raccord multiple (3) pour raccorder le dispositif de culture (1 ) à plus d'un dispositif de transfert (2), ledit dispositif de raccord multiple (3) comprenant une pluralité de tubulures (7) de raccordement, plus d'une desdites tubulures de raccordement étant destinée à être connectée stérilement à l'une des tubulures de transfert (1 6) desdits dispositifs de transfert (2), ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
(a) connecter stérilement l'une des tubulures de raccordement (7) du dispositif de raccord multiple (3) à l'une des tubulures de transfert (16) d'un desdits dispositifs de transfert (2),
(b) réaliser en système fermé une opération sur les cellules à cultiver,
(c) une fois l'opération réalisée, déconnecter ledit dispositif de transfert (2) dudit dispositif de raccord multiple (3), et
(d) répéter les étapes (a) à (c) avec un autre dispositif de transfert (2) pour réaliser une nouvelle opération sur les cellules.
2. Procédé selon la revendication 1 comprenant, préalablement à l'étape (b), l'étape consistant à connecter stérilement à au moins une des tubulures de transfert (1 6) dudit dispositif de transfert, au moins une tubulure (23) équipant un récipient (22) nécessaire pour réaliser l'opération à réaliser sur les cellules.
3. Procédé selon la revendication 2 selon lequel le récipient nécessaire pour réaliser l'opération à réaliser sur les cellules comprend un liquide tel qu'un milieu de culture, un complément ou additif pour milieu de culture, une solution tampon ou un réactif de dissociation.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel l'opération de l'étape (b) est choisie dans le groupe constitué par l'ensemencement, le changement de milieu ou le repiquage.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon lequel la déconnexion du dispositif de transfert (2) dudit dispositif de culture (4) est réalisée en soudant et coupant la tubulure de raccordement (7) du dispositif de raccord multiple (3) qui a été connectée à la tubulure (1 6) du dispositif de transfert (2) à l'étape (a).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon lequel le récipient de culture (4) est rigide.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend un élément de fermeture (8) dudit récipient de culture (4) à partir duquel s'étend une pluralité de tubulures de raccordement (7).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend d'une part une tubulure primaire (6) de raccordement en communication fluidique avec le récipient de culture (4) et d'autre part un ensemble de tubulures comprenant une pluralité de tubulures secondaires (7) de raccordement, l'une au moins étant connectée ou destinée à être connectée à ladite tubulure primaire (6) de raccordement.
9. Procédé selon la revendication 8 comprenant le cas échéant l'étape préliminaire de connecter stérilement la tubulure primaire (6) de raccordement du dispositif de raccord multiple à l'une des tubulures secondaires (7) de raccordement de l'ensemble de tubulures.
10. Procédé selon la revendication 8, selon lequel le dispositif de raccord multiple (3) comprend un élément de fermeture (8) dudit récipient (4) à partir duquel s'étend ladite tubulure primaire (6) de raccordement.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 8 ou 10, selon lequel une tubulure d'aération (9) s'étend à partir dudit élément de fermeture (8), ladite tubulure d'aération (9) comprenant à son extrémité un évent (10) comprenant une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 selon lequel chacune des tubulures (7, 1 6) desdits dispositifs de raccord multiple (3) et dispositif de transfert (2) destinées à être connectées stérilement est fermée à son extrémité libre.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 selon lequel l'une au moins des tubulures de transfert (18) est pourvue à son extrémité d'un filtre (19) comprenant une membrane stérilisante.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 selon lequel chacune des tubulures (7, 1 6) desdits dispositifs de raccord multiple (3) et dispositif de transfert (2) sont équipées d'un élément sélectif d'ouverture et de fermeture (13,21 ) de la communication fluidique dans ladite tubulure.
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