WO2016064063A1 - 대상포진 예방 및 치료용 dna 백신 조성물 및 이를 이용한 vzv 항원에 대한 t세포 활성화 방법 - Google Patents

대상포진 예방 및 치료용 dna 백신 조성물 및 이를 이용한 vzv 항원에 대한 t세포 활성화 방법 Download PDF

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조병문
정문섭
이효진
조영란
오주연
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진원생명과학 주식회사
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Definitions

  • the present technology is a technique in the vaccine field, and more particularly, a technique for preventing and treating shingles, which is excellent in productivity, stability, and immune response to T cells, and which can be applied to various disease forms.
  • Herpes Zoster is a skin rash disease in which Varicella-Zoster Virus (VZV) is latent in the ganglion, and when immunity is weakened, reactivation of VZV triggers. to be.
  • VZV Varicella-Zoster Virus
  • a shingles develops, a bullous lesion appears and, even when it is recovered, there is a sequelae of postherpetic neuralgia, and once the pain occurs, it is difficult to cure and patients suffer extreme pain.
  • Reactivation of VZV and the development of shingles are associated with attenuated cellular immune responses centered on T cells, especially in older people and those receiving immunosuppressive treatment.
  • shingles develops, they are treated with antiviral agents, but the goal is to administer within 72 hours after the onset of the rash so that the rash no longer spreads to other sites and to reduce or alleviate complications after shingles.
  • the incidence of shingles is increasing rapidly in Korea, but since there is no underlying treatment, the importance of preventive vaccines is considered to be a very serious disease.
  • An object of the present invention is to solve the problems of the foregoing and the prior art, and to consider the practical needs, and to provide a DNA vaccine composition for the treatment and treatment of shingles, which is applicable to patients with various forms of diseases and has greatly improved stability. will be.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for activating T cells against VZV antigens by effectively administering the DNA vaccine composition for preventing and treating shingles in the body.
  • Plasmid DNA for preventing and treating shingles includes an insertion site of a VZV-derived gene encoding a shingles virus (VZV) protein, and is directly administered to the body by an electroporation method to a VZV antigen. Induces T cell immune activity.
  • VZV shingles virus
  • Inovio inovio
  • CELLECTRA electrical perforator
  • the gene is any one of a first gene encoding the IE-62 protein (SEQ ID NO: 1), a second gene encoding the IE-63 protein (SEQ ID NO: 2), and a third gene encoding the gE protein (SEQ ID NO: 3). It can be one.
  • the plasmid may be any one of plasmid DNA of SEQ ID NO: 4, plasmid DNA of SEQ ID NO: 5, and plasmid DNA of SEQ ID NO: 6.
  • the DNA vaccine composition for preventing and treating shingles includes at least one plasmid containing an insertion site of a VZV-derived gene encoding shingles virus (VZV) protein, and other pharmaceutically acceptable components. It may include. As said other component, water, such as a saline solution, is mentioned, for example.
  • the plasmid constituting the DNA vaccine may include a plurality of plasmids containing different heterologous gene insertion sites.
  • a plurality of plasmids containing different gene regions encoding proteins of VZV can be used as the plasmid.
  • the first plasmid included in the DNA vaccine composition including the insertion site of the first gene encoding the IE-62 protein (SEQ ID NO: 1) and the second gene encoding the IE-63 protein (SEQ ID NO: 2)
  • Three plasmids can be used, including a second plasmid comprising the insertion site and a third plasmid containing the insertion site of the third gene encoding the gE protein (SEQ ID NO: 3).
  • the content in the composition of each plasmid may be adjusted in various ways in consideration of the disease form, the age of the subject to be administered.
  • T cell activation method for a VZV antigen comprises the steps of preparing a plasmid containing the insertion site of the VZV-derived gene encoding shingles virus (VZV) protein, and the plasmid in an electroporation method Thereby administering to the body.
  • the plasmid can be mass produced by a mass production system.
  • the DNA vaccine for shingles prevention and treatment according to the present invention is a vaccine by direct administration of plasmid, it does not cause the safety problem of live attenuated vaccines. In addition, mass production of the plasmid is easy, and stability of the distribution process of the vaccine can be dramatically improved. Since the DNA vaccine is administered in the body by the electroporation method, it can exhibit an innovative in vivo delivery efficiency compared to a general injection. Meanwhile, the DNA vaccine for preventing and treating shingles can be used for prevention as well as for therapeutic purposes, and can be appropriately used for patients with various diseases and patients of various ages. The DNA vaccine for preventing and treating shingles has the advantage of being able to design a customized vaccine through various combinations of a plurality of plasmids having different gene insertion sites of plasmids.
  • FIG. 1 is a view showing an inoculation schedule according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing immunogenicity results for experimental groups according to an embodiment of the present invention.
  • 3 and 4 are graphs showing the results of comparing the protein overlap peptide immune response of each experimental group.
  • 5 to 7 are electrophoretic photographs confirming the product expressed by each plasmid gene.
  • the DNA vaccine for preventing and treating shingles according to the present invention is not a virus-based live vaccine but a DNA-based vaccine which administers DNA itself to the body. DNA itself functions as a vaccine.
  • the DNA vaccine encodes an antigenic protein derived from VZV, and ultimately forms an antigenic protein in the body.
  • Proteins derived from VZV are preferably selected in consideration of the characteristics of the required DNA vaccine, and the proteins may be selected alone or in combination of multiple species.
  • the protein is a protein capable of inducing a cellular immune response IE-62 (SEQ ID NO: 1), IE-63 (SEQ ID NO: 2), the glycoprotein gE (SEQ ID NO: 3) gene
  • the plasmid is designed to insert a gene encoding such a protein.
  • the plasmid DNA is mixed and administered to the liquid phase in the body, the plasmid DNA of the present invention is designed to be injected into the body with high efficiency by the electroporation method, it is possible to maximize the delivery efficiency in the body only by such an electroporation method Ultimately, the therapeutic efficacy can be maximized.
  • the site of administration in the body by the electroporation method is not particularly limited, such as muscle areas, it may be determined in consideration of various factors such as the age, disease type, parallel disease of the subject.
  • an electroporation device for implementing the electroporation method for example, Inobio's electroporator (CELLECTRA ® ) may be used.
  • the first gene, the second gene, and the third gene which are genes capable of encoding and expressing the IE-62, IE-63, and gE proteins, are mounted on the plasmid in a conventional manner, but maximize the effect and administration efficiency.
  • the plasmids of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively it is possible to maximize the efficiency of the DNA vaccine.
  • Each of the plasmids may be used alone, but is preferably included in the DNA vaccine in the form of a combination of two or more different plasmids.
  • a DNA vaccine containing all three plasmids can be considered.
  • other kinds of plasmids not specified in this embodiment can be introduced newly.
  • the plasmid may be administered to the body via an injection or the like, and the plasmid should be prepared in high concentration and high purity for delivery efficiency and immune response efficiency.
  • the ease of mass production must be ensured. Plasmids according to an embodiment of the present invention is currently secured the basis for such high concentration and high purity mass production.
  • the DNA vaccine for herpes prophylaxis and treatment is a vaccine containing at least one plasmid DNA as described above, that is, a vaccine of injection, and includes a plasmid DNA and a liquid component.
  • the liquid component may be pure water.
  • the DNA vaccine composition according to one embodiment of the present invention may further include pharmaceutically acceptable functional additives, and such additives may be introduced at the level of tolerance.
  • the DNA vaccine composition may include, for example, all three plasmids described above.
  • the proteins IE-62, IE-63 and glycoprotein gE genes capable of inducing cellular immune responses were selected as candidates.
  • the type of the VZV genome is divided into a total of five clades, and there is no significant difference between the clade IE-62, IE-63, and gE amino acid sequences.
  • Plasmids were prepared from the above IE-62, IE-63, and gE gene sequences.
  • the amino acid sequence of the proteins is shown in SEQ ID NOS: 1-3
  • the DNA sequence of the prepared plasmid is shown in SEQ ID NOS: 4-6.
  • the DNA vaccine contained no components other than water as the plasmid and the liquid component.
  • IE-62, IE-63, and gE genes were prepared as DNA vaccine candidates, administered to C57BL / 6 mice, and splenocytes were isolated to assess T cell immunogenicity against the VZV antigen.
  • the test group consisted of 5 groups. Each group consisted of 5 animals.
  • CELLECTRA ® manufactured by INNOBIOS was used to inoculate three times at intervals of two weeks.
  • the amount of DNA at each inoculation was 30 ⁇ g per horse, and the mixed group was inoculated with a total of 90 ⁇ g at 30 ⁇ g per DNA.
  • splenocytes were isolated and subjected to immunoassay.
  • the inoculation schedule is as shown in FIG. 1. 1. 1 is a view showing an inoculation schedule according to an embodiment of the present invention.
  • Each overlapping peptide consists of 15 amino acids and is designed to overlap a neighboring peptide with 10 amino acids.
  • Duplicate peptides were designed to include IE-62, IE-63, gE protein full amino acid sequences. 261 IE-62 duplicate peptides, 54 IE-63 duplicate peptides, and 124 gE duplicate peptides were prepared. A total of seven peptide mixtures were used by mixing 37 or 38 consecutive IE-62 duplicate peptides. A total of two peptide mixtures were made by mixing 27 consecutive IE-63 duplicate peptides.
  • a total of three peptide mixtures were made by mixing contiguous 40 or 41 gE duplicate peptides. 5% DMSO was used as a negative control, and PMA (Phorbol Myristate Acetate) ionomycin was used as a positive control. Peptide mixtures made from a mixture of duplicate peptides are shown in Table 1 below.
  • a lysate prepared by infecting MZ-5 cells with VZV was used as an antigen and MRC-5 cell lysate was used as a corresponding negative antigen.
  • the Neg group used as a negative control did not show an immune response to any duplicate peptide stimulation.
  • the immune responses were shown only against overlapping peptides of the protein.
  • the IE62 + IE63 + gE group which received all of the IE-62, IE-63, and gE DNA vaccines, all of the overlapping peptides of the three proteins showed immune responses.
  • the immune response was shown only against the overlapping peptide specific for the candidate. 2 is a graph showing immunogenicity results for experimental groups according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 3 and 4 are graphs showing the results of comparing the protein-peptide immunoglobulin in each experimental group.
  • the comparison of the protein overlap peptide immune response of the group administered with a single DNA vaccine and a mixture of three DNA vaccines, a combination of three DNA vaccines would be administered a single DNA vaccine.
  • the immune response to IE-62 was reduced by 43.3%, the immune response to IE-63 was not different, and the immune response to gE was decreased by 9.6%.
  • DNA vaccines prepared with genes encoding IE-62, IE-63, gE proteins were evaluated and analyzed in experimental animal models and showed sufficient T cell immunogenicity upon single or mixed administration.
  • T cell immunogenicity analysis through VZV lysate antigen stimulation it was determined that IE-62, IE-63, and gE were candidate candidates for the vaccine.
  • 5 to 7 are electrophoretic photographs confirming the product expressed by each plasmid gene.
  • a plasmid encoding the IE-62 gene using Lipofectamine ® 2000 was introduced into RD cells derived from human rhabdomyosarcoma cells (rhabdomyosarcoma), and the cells were lysed to extract proteins and detect expression antigens. Western blot was performed using the antibody. Expression proteins of the plasmid encoding the IE-62 gene were detected using anti-VZV IE62 (SantaCruz, cat.no.SC-2020) and visualized using HRP Chromogenic Substrates (Invitrogen Cat. No. WP20004). .
  • a plasmid encoding a gE gene into RD cells derived from human rhabdomyosarcoma cells (rhabdomyosarcoma) using Lipofectamine ® 2000, the cells were lysed to extract proteins and the antibody for detecting the expression antigen. Western Blot was performed using. Expression proteins of the plasmid encoding the gE gene were detected using HA-probe HRP (SantaCruz, cat.no. SC-805HRP) and visualized using HRP Chromogenic Substrates (Invitrogen Cat. no. WP20004).

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Abstract

본 발명은 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 적어도 일종의 플라스미드, 및 약제학적으로 허용 가능한 기타의 성분을 포함하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다. 상기 플라스미드는 서로 다른 이종(異種)의 유전자 삽입부위를 포함하는 복수의 플라스미드를 포함한다. 상기 플라스미드는 IE-62 단백질(서열목록 1)을 코딩하는 제1 유전자의 삽입부위를 포함하는 제1 플라스미드, IE-63 단백질(서열목록 2)을 코딩하는 제2 유전자의 삽입부위를 포함하는 제2 플라스미드 및 gE 단백질(서열목록 3)을 코딩하는 제3 유전자의 삽입부위를 포함하는 제3 플라스미드를 포함한다.

Description

대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물 및 이를 이용한 VZV 항원에 대한 T세포 활성화 방법
본 기술은 백신 분야의 기술로서, 더욱 구체적으로는 생산성, 안정성 및 T세포에 대한 면역반응성이 우수하고, 다양한 질환 형태에 적용 가능한 대상포진 예방 및 치료용 백신에 관한 기술이다.
일반적으로, 대상포진(Herpes Zoster)은 수두-대상포진 바이러스(Varicella-Zoster Virus, VZV)가 신경절(neuronal ganglion)에서 잠복해 있다가, 면역이 약해지면 VZV의 재활성화가 유발되어 나타나는 피부 발진 질환이다. 대상포진이 발병하면 수포성 병변이 나타나고 회복되더라도 신경성 통증 (postherpetic neuralgia)의 후유증이 남게 되며 신경성 통증은 일단 발생하면 완치가 어렵고 환자들이 극심한 통증을 겪게 된다. VZV의 재활성화 및 대상포진의 발병은 T세포를 중심으로 한 세포면역 반응의 약화와 관련이 있으며, 특히 고령자나 면역억제 치료를 받는 사람에서 호발하는 질환이다.
대상포진이 발생하면 항바이러스제로 치료를 하지만, 이의 목적은 기본적으로 발진이 시작되고 72시간 이내에 투여하여 발진이 더 이상 다른 부위로 확산되지 않게 하고, 대상포진 후 합병증을 줄이거나 완화하는 것이다. 고령자 및 면역억제 환자가 증가함에 따라, 국내에서 대상포진의 발병율은 급속도로 증가하고 있으나 근원적인 치료법이 없기 때문에, 예방 백신의 중요성이 매우 큰 질환이라고 여겨지고 있다.
현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 임상시험에서 그 효능을 인정받기는 하였으나 예방백신 투여에 따른 대상포진 발생 감소율은 50%에 그치고 있어 효능이 뛰어난 새로운 대상포진 백신 개발이 필요한 실정이다. 그리고 현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 약독화된 생백신이기 때문에 대상포진의 발병율이 높은 면역억제 환자 에서는 오히려 사용할 수 없는 역설적인 상황에 처해 있다. 이에 따라 면역억제 환자 에서도 안전하게 투여할 수 있는 새로운 대상포진 백신 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 전술한 바와 종래 기술의 문제점을 해결하고, 현실적인 요구를 고려한 발명으로서, 다양한 형태의 질환 환자에게 적용 가능하고 안정성이 획기적으로 개선된 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물을 체내에 효과적으로 투여하여 VZV 항원에 대한 T세포의 활성화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대상포진 예방 및 치료용 플라스미드 DNA는 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하고, 전기천공 방식에 의하여 체내에 직접 투여되어 VZV 항원에 대한 T세포 면역활성을 유도한다.
상기 전기천공을 위한 전기천공기로서는 이노비오(inovio)사의 전기천공기(CELLECTRA®)를 사용할 수 있다.
상기 유전자는 IE-62 단백질(서열목록 1)을 코딩하는 제1 유전자, IE-63 단백질(서열목록 2)을 코딩하는 제2 유전자 및 gE 단백질(서열목록 3)을 코딩하는 제3 유전자 중 어느 하나일 수 있다.
상기 플라스미드는 구체적으로 서열목록 4의 플라스미드 DNA, 서열목록 5의 플라스미드 DNA 및 서열목록 6의 플라스미드 DNA 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대상포진 예방 및 치료용 DNA백신 조성물은 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 적어도 일종의 플라스미드, 및 약제학적으로 허용 가능한 기타의 성분을 포함할 수 있다. 상기 기타의 성분으로서는 예를 들면 식염수 등의 물을 들 수 있다.
상기 DNA 백신을 이루는 상기 플라스미드로서는 서로 다른 이종의 유전자 삽입부위를 포함하는 복수의 플라스미드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스미드로서는 VZV의 단백질을 부호화하는 서로 다른 유전자 부위를 포함하는 복수의 플라스미드가 사용될 수 있다.
상기 DNA 백신 조성물에 포함되는 플라스미드로서는 IE-62 단백질(서열목록 1)을 코딩하는 제1 유전자의 삽입부위를 포함하는 제1 플라스미드, IE-63 단백질(서열목록 2)을 코딩하는 제2 유전자의 삽입부위를 포함하는 제2 플라스미드 및 gE 단백질(서열목록 3)을 코딩하는 제3 유전자의 삽입부위를 포함하는 제3 플라스미드 등 3종의 플라스미드가 사용될 수 있다. 상기 각 플라스미드의 조성물 내 함량은 질환형태, 투여 대상자의 연령 등을 고려하여 다양하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 VZV 항원에 대한 T세포 활성화 방법은 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 플라스미드를 준비하는 단계, 및 상기 플라스미드를 전기천공 방식에 의하여 체내에 투여하는 단계를 포함한다. 한편, 상기 플라스미드는 대량생산 시스템에 의하여 양산될 수 있다.
본 발명에 따른 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신은 플라스미드의 직접 투여에 의한 백신이므로 약독화된 생백신이 갖는 안전성 문제를 일으키지 않는다. 또한, 플라스미드의 대량생산이 용이하고, 백신의 유통 과정의 안정성이 획기적으로 개선될 수 있다. 상기 DNA 백신은 전기천공 방식에 의하여 체내에 투여되기 때문에, 일반적인 주사제와 비교하여, 혁신적인 체내 전달 효율을 나타낼 수 있다. 한편, 상기 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신은 예방뿐만 아니라 치료 목적으로 사용 가능하고, 다양한 질환을 갖는 환자 및 다양한 연령대의 환자에게 적절하게 사용될 수 있다. 상기 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신은 플라스미드의 유전자 삽입부위가 서로 다른, 복수의 플라스미드의 다양한 조합을 통하여 맞춤형 백신 설계가 가능한 장점을 갖는다.
도 1은 본 발명에 일 실시예에 따른 접종 스케쥴을 보여주기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실험군들에 대한 면역원성 결과를 보여주는 그래프들이다.
도 3 및 도 4는 각 실험군의 단백질 중복펩타이드 면역반응을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5 내지 도 7은 각각의 플라스미드 유전자에 의하여 발현되는 생성물을 확인한 전기영동 사진들이다.
이하, 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신에 관하여 자세하게 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신은 바이러스 기반의 생백신이 아니고 DNA 자체를 체내에 투여하는 DNA 기반의 백신으로서, VZV 항원에 대한 T세포 면역활성을 유도하기 위하여 체내에 투여되는 플라스미드 형태의 DNA 자체가 백신으로서 기능한다.
상기 DNA 백신은 VZV 유래의 항원 단백질을 부호화하여, 궁극적으로 체내에서 항원 단백질을 형성하는 역할을 한다. VZV 유래의 단백질은 요구되는 DNA 백신의 특성을 고려하여, 선정되는 것이 바람직하며 상기 단백질은 단독 또는 복수 종의 조합으로 선정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질로서는 세포면역반응을 유도할 수 있는 단백질인 IE-62(서열목록 1), IE-63(서열목록 2), 당단백질인 gE(서열목록 3) 유전자를 들 수 있으며, 상기 플라스미드는 이러한 단백질을 부호화하는 유전자가 삽입되도록 설계된다.
상기 플라스미드 DNA는 체내에 액상에 혼합되어 투여되는데, 본 발명의 플라스미드 DNA는 전기천공 방식에 의하여 체내에 고효율로 투입될 수 있도록 설계되며, 이러한 전기천공 방식에 의하여야만 체내 전달 효율을 극대화할 수 있고 궁극적으로 치료 효능을 극대화할 수 있다. 전기천공 방식에 의한 체내 투여 부위는 근육 부위 등 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상자의 연령, 질환 타입, 병행 질환 등 다양한 요소를 고려하여 결정될 수 있다. 전기천공 방식을 구현하는 전기천공 장비로는 예를 들면, 이노비오(inovio)사의 전기천공기(CELLECTRA®)를 사용할 수 있다.
각각, 상기 IE-62, IE-63 및 gE 단백질을 부호화하고 발현시킬 수 있는 유전자인 제1 유전자, 제2 유전자 및 제3 유전자는 통상의 방법으로 플라스미드에 탑재되며 다만, 효과와 투여 효율을 극대화하기 위하여 본 실시예에서는 각각 서열목록 4, 서열목록 5 및 서열목록 6의 플라스미드를 설계함으로써, DNA 백신의 효율을 극대화할 수 있다. 상기 각각의 플라스미드는 단독으로 사용될 수도 있으나, 서로 다른 2종 이상의 플라스미드 조합 형태로 DNA 백신에 포함되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 세 가지 플라스미드를 모두 포함하는 DNA 백신을 고려할 수 있다. 한편, 본 실시예에서 명시하지 않은 다른 종류의 플라스미드를 새로이 도입할 수 있음은 물론이다.
상기 플라스미드는 주사제 등을 통하여 체내에 투여될 수 있으며, 전달 효율 및 면역반응 효율을 위하여 상기 플라스미드는 고농도 및 고순도로 준비되어야 한다. 또한, 상업적인 관점에서 대량생산의 용이성을 확보하여야 한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드는 현재 이러한 고농도 및 고순도 대량생산의 기반을 확보한 상태이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신은 전술한 적어도 1종의 플라스미드 DNA를 포함하는 액상, 즉 주사제의 백신으로서, 플라스미드 DNA 및 액상 성분을 포함한다. 상기 액상 성분은 순수한 물일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 백신 조성물은 물 이외에, 약제학적으로 허용 가능한 기능성 첨가제들을 더 포함할 수 있으며 이러한 첨가제는 관용기술의 수준에서 도입될 수 있다.
상기 DNA 백신 조성물은, 예를 들면, 전술한 3종의 플라스미드를 모두 포함할 수 있다.
이하에서는, 구체적인 실험의 내용을 토대로 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 DNA의 유효성을 설명하도록 한다.
[실험 1] 면역원성 평가
DNA백신에 이용할 VZV 유전자 후보 선정
VZV 게놈에서 단백질을 부호화하는 67가지 유전자 중에서 세포 면역반응을 유도할 수 있는 단백질 IE-62, IE-63 및 당단백질인 gE 유전자를 후보로 선정하였다. VZV 게놈의 종류는 총 5가지 클레이드(clade)로 나뉘어지며, 클레이드간 IE-62, IE-63, gE 아미노산 서열에는 큰 차이가 없다. 이상의 IE-62, IE-63, gE 유전자 서열로 플라스미드를 제조하였다. 상기 단백질들의 아미노산 서열은 서열목록 1 내지 3에 표시된 바와 같으며, 제조된 플라스미드의 DNA 서열은 서열목록 4 내지 6과 같다. 본 실시예에서의, DNA 백신에는 플라스미드 및 액상성분으로서 물 외에는 기타 성분이 포함되지 않았다.
마우스 실험
IE-62, IE-63 및 gE 유전자를 DNA 백신 후보물질로 제조하여 C57BL/6 마우스에 투여하고 비장세포를 분리하여 VZV 항원에 대한 T세포 면역원성을 평가하였다. 시험을 시행한 군은 총 5군이며 각 군당 5마리로 다음과 같은 조합으로 구성하였다.
1) Neg :　vector 로 접종한 군 (n=5)
2) IE62 :　IE-62 DNA 백신으로 접종한 군 (n=5)
3) IE63 :　IE-63 DNA 백신으로 접종한 군 (n=5)
4) gE :　gE DNA 백신으로 접종한 군 (n=5)
5) IE62+IE63+gE : IE-62, IE-63, gE DNA 백신을 혼합하여 접종한 군
전기천공기인 CELLECTRA®(이노비오사 제조)를 이용하여 2주 간격으로 3번 접종하였으며, 매 접종시 DNA의 양은 마리당 30μg이었으며 혼합한 군은 DNA 당 30μg씩 총 90μg을 매 접종하였다. 접종이 완료된 12일 후 비장 세포를 분리하여 면역평가를 시행하였다. 접종 스케쥴은 도 1에 도시된 바와 같다. 도 1은 본 발명에 일 실시예에 따른 접종 스케쥴을 보여주기 위한 도면이다.
시험용 항원의 제조
후보 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 전체 면역반응을 체계적으로 측정하기 위해 중복 펩타이드(overlapping peptides, OLPs) 시리즈를 고안하여 제조하였다. 각각의 중복 펩타이드는 15 아미노산으로 구성되며, 이웃한 펩타이드와 10 아미노산이 중복되게 고안하였다. IE-62, IE-63, gE 단백질 전체 아미노산 서열을 포함하도록 중복 펩타이드를 고안하였다. 261개의 IE-62 중복 펩타이드, 54개의 IE-63 중복 펩타이드, 124개의 gE 중복 펩타이드를 제조하였다. 연속된 37개 또는 38개의 IE-62 중복 펩타이드를 혼합하여 총 7가지 펩타이드 혼합물을 만들어 사용하였다. 연속된 27개의 IE-63 중복 펩타이드를 혼합하여 총 2가지 펩타이드 혼합물을 만들어 사용하였다. 연속된 40개 또는 41개의 gE 중복 펩타이드를 혼합하여 총 3가지 펩타이드 혼합물을 를 만들어 사용하였다. 음성대조군으로 5% DMSO를 사용하였고, 양성대조군으로 PMA(Phorbol Myristate Acetate) ionomycin을 혼합하여 사용하였다. 중복 펩타이드의 혼합으로 만든 펩타이드 혼합물을 아래 표 1에 나타내었다.
표 1
단백질 항원 이름 아미노산 번호 혼합된 중복펩타이드 개수
IE-62 IE62-1 1-37 37
IE62-2 28-74 37
IE62-3 75-111 37
IE62-4 112-143 37
IE62-5 149-185 37
IE62-6 186-223 38
IE62-7 224-261 38
IE-63 IE63-1 1-27 27
IE63-2 28-54 27
gE gE-1 1-27 41
gE-2 28-54 40
gE-3 1-41 41
MRC-5 cell에 VZV를 감염시켜 만든 용해물(lysate)를 항원으로 사용하고, 이에 대응하는 음성 항원으로 MRC-5 cell 용해물을 사용하였다.
IFN-γ ELISPOT 어세이 프로토콜
한 웰 당 1×106 개의 비장세포를 넣어 ELISPOT 어세이(assay)를 시행하였다. 중복펩타이드 혼합물 자극시 웰 당 각 중복펩타이드 농도가 1μg/ml 가 되도록 투여하였고, lysate 항원 자극시 웰 당 당 50μg/ml 농도가 되도록 투여했으며 각 시험당 3번 반복시행을 하였다. 중복펩타이드 항원자극으로 얻은 검체 결과는 Mean of OLP pools specific spot forming cells (SFCs) - Mean of 5% DMSO specific SFCs 값으로 계산하였다. Lysate 항원자극으로 얻은 검체 결과는 Mean of VZV specific SFCs -Mean of MRC-5 specific SFCs 값으로 계산하였다. 각 웰 당 SFC 의 최대치는 500으로 계산하였다.
면역원성 실험결과
각 백신에 따른 항원 평가 결과, 음성 대조군으로 사용한 Neg 군에서는 어떠한 중복 펩타이드 자극에도 면역반응을 보이지 않았다. IE-62, IE-63, gE DNA 백신을 각각 단일 투여한 IE-62, IE-63, gE 군에서는 해당 단백질의 중복 펩타이드에 대해서만 면역반응을 보였다. IE-62, IE-63, gE DNA백신을 모두 투여한 IE62+IE63+gE 군에서는 세단백질의 중복 펩타이드에 대해서 모두 면역반응을 나타내었다. 후보 물질의 DNA백신 투여시, 후보 물질에 특이적인 중복펩타이드에 대해서만 면역반응을 나타내었다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실험군들에 대한 면역원성 결과를 보여주는 그래프들이다.
도 3 및 도 4는 각 실험군의 단백질 중복펩타이드 면역반을을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 3을 참조하면, 단일 DNA백신을 투여한 군과 세가지의 DNA백신을 혼합하여 투여한 군의 해당 단백질 중복펩타이드 면역반응을 비교한 결과, 세가지 DNA백신을 혼합하여 투여하면 단일 DNA백신을 투여했을 때보다 IE-62에 대한 면역반응은 43.3% 감소하였고, IE-63에 대한 면역반응은 차이가 없었으며, gE에 대한 면역반응은 9.6% 감소하였다.
항원 선정의 타당성
도 4를 참조하면, 각 실험군에 lysate 항원으로 자극한 결과, Neg 군에서는 면역반응을 보이지 않은 반면, 후보 물질의 DNA백신을 투여한 군에서는 강한 면역반응을 보였음을 확인하였다. 이러한 결과는 VZV에 감염된 세포에서는 IE-62, IE-63, gE 등의 단백질이 발현되고 있으며, 본 실험에서 후보물질로 선택한 IE-62, IE-63, gE에 대해 면역반응을 유도하면 VZV에 감염된 세포에 대해 면역반응이 작동할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험평가
IE-62, IE-63, gE 단백질을 코딩하는 유전자로 제조한 DNA백신을 실험동물 모델에서, 평가 및 분석한 결과, 단일 또는 혼합투여시 충분한 T세포 면역원성을 보였다. VZV 용해물 항원 자극을 통한 T세포 면역원성 분석 결과, IE-62, IE-63, gE를 백신의 후보 물질로 선정하는 것이 타당하다고 판단되었다.
[실험 2] 인비트로(in-vitro) 단백질 발현평가
발현확인 조건
- 세포도입(transfection) : RD cells (1x106 cells/ T75 flask), 30 ug of pDNA, Lipofectamine® 2000, 세포도입 24 시간 후 cell harvest
* RD cell : 인간 횡문근육종 세포 (rhabdomyosarcoma)
- 세포 용해(cell lysis) : 2x106 cells/90 ul RIPA buffer with Protease Inhibitor Cocktail
- SDS PAGE : LDS sample buffer with Reducing agent (DTT), 30 ul loading (lysate 19.5 ul), 4-12% Bis-Tris gel, MES running buffer, 165V, 35분
- Protein transfer : NC membrane, Dry blotting, 20V, 1분 → 23V, 4분 → 25V, 2분
- Protein detection : 1) Blocking 1hr, 2) Antibody reaction(1:100) 1hr 30min (HA-probe HRP (SantaCruz사, Cat. no. sc-805HRP), Goat anti-VZV IE62 (SantaCruz사, Cat. no. sc-17525), Donkey anti-goat IgG HRP (SantaCruz사, Cat. no. sc-2020), 3) HRP chromogenic substrate (Invitrogen사, Cat. no. WP20004)
발현확인 평가
도 5 내지 도 7은 각각의 플라스미드 유전자에 의하여 발현되는 생성물을 확인한 전기영동 사진들이다.
도 5를 참조하면 Lipofectamine® 2000을 이용하여 IE-62 유전자를 코딩하는 플라스미드를 인간 횡문근육종 세포(rhabdomyosarcoma)에서 유래된 RD세포에 도입 후 24시간 후에 세포를 용해하여 단백질을 추출하고 발현항원 검출용 항체를 이용하여 Western Blot을 수행하였다. IE-62 유전자를 코딩하는 플라스미드의 발현 단백질은 anti-VZV IE62 (SantaCruz사, cat.no. SC-2020)를 이용하여 검출하였고, HRP Chromogenic Substrates (Invitrogen Cat. no. WP20004) 를 사용하여 가시화 하였다. IE-62 유전자를 코딩하는 플라스미드로부터 발현되는 도입 유전자의 생성물 크기는 예측 분자량과 일치함을 확인하였으며, 이는 RD세포내에 도입된 유전자의 생성물이 VZV의 IE-62 항원 단백질임을 나타내는 것이다.
도 6을 참조하면, Lipofectamine® 2000을 이용하여 IE-63 유전자를 코딩하는 플라스미드를 인간 횡문근육종 세포 (rhabdomyosarcoma)에서 유래된 RD세포에 도입 후 24시간 후에 세포를 용해하여 단백질을 추출하고 발현항원 검출용 항체를 이용하여 Western Blot을 수행하였다. IE-63 유전자를 코딩하는 플라스미드의 발현 단백질은 HA-probe HRP (SantaCruz사, cat.no. SC-805HRP)를 이용하여 검출하였고, HRP Chromogenic Substrates (Invitrogen Cat. no. WP20004) 를 사용하여 가시화 하였다. IE-63 유전자를 코딩하는 플라스미드로부터 발현되는 도입 유전자의 생성물 크기는 예측 분자량과 일치함을 확인하였으며, 이는 RD세포내에 도입된 유전자의 생성물이 VZV의 IE-63 항원 단백질임을 나타내는 것이다.
도 7을 참조하면, Lipofectamine® 2000을 이용하여 gE 유전자를 코딩하는 플라스미드를 인간 횡문근육종 세포 (rhabdomyosarcoma)에서 유래된 RD세포에 도입 후 24시간 후에 세포를 용해하여 단백질을 추출하고 발현항원 검출용 항체를 이용하여 Western Blot을 수행하였다. gE 유전자를 코딩하는 플라스미드의 발현 단백질은 HA-probe HRP (SantaCruz사, cat.no. SC-805HRP)를 이용하여 검출하였고, HRP Chromogenic Substrates (Invitrogen Cat. no. WP20004)를 사용하여 가시화하였다. gE 유전자를 코딩하는 플라스미드로부터 발현되는 도입 유전자의 생성물 크기는 예측 분자량과 일치함을 확인하였으며, 이는 RD세포 내에 도입된 유전자의 생성물이 VZV의 gE 항원 단백질임을 나타내는 것이다.

Claims (7)

  1. 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하고,
    전기천공 방식에 의하여 체내에 직접 투여되어 VZV 항원에 대한 T세포 면역활성을 유도하는 대상포진 예방 및 치료용 플라스미드 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 IE-62 단백질(서열목록 1)을 코딩하는 제1 유전자, IE-63 단백질(서열목록 2)을 코딩하는 제2 유전자 및 gE 단백질(서열목록 3)을 코딩하는 제3 유전자 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대상포진 예방 및 치료용 플라스미드 DNA.
  3. 제1항에 있어서,
    서열목록 4의 플라스미드 DNA, 서열목록 5의 플라스미드 DNA 및 서열목록 6의 플라스미드 DNA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA.
  4. 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 적어도 일종의 플라스미드, 및 약제학적으로 허용 가능한 기타의 성분을 포함하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 플라스미드는 서로 다른 이종(異種)의 유전자 삽입부위를 포함하는 복수의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 플라스미드는 IE-62 단백질(서열목록 1)을 코딩하는 제1 유전자의 삽입부위를 포함하는 제1 플라스미드, IE-63 단백질(서열목록 2)을 코딩하는 제2 유전자의 삽입부위를 포함하는 제2 플라스미드 및 gE 단백질(서열목록 3)을 코딩하는 제3 유전자의 삽입부위를 포함하는 제3 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물.
  7. 대상포진 바이러스(VZV) 단백질을 부호화하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 플라스미드를 준비하는 단계; 및
    상기 플라스미드를 전기천공 방식에 의하여 체내에 투여하는 단계를 포함하는 VZV 항원에 대한 T세포 활성화 방법.
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