WO2016059339A1 - Procédé de fabrication de structures tridimensionnelles par moulage pour l'ingénierie tissulaire - Google Patents

Procédé de fabrication de structures tridimensionnelles par moulage pour l'ingénierie tissulaire Download PDF

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WO2016059339A1
WO2016059339A1 PCT/FR2015/052750 FR2015052750W WO2016059339A1 WO 2016059339 A1 WO2016059339 A1 WO 2016059339A1 FR 2015052750 W FR2015052750 W FR 2015052750W WO 2016059339 A1 WO2016059339 A1 WO 2016059339A1
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WO
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cells
solution
alginate
tube
microfiber
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/052750
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English (en)
Inventor
Jérôme KALISKY
Raphaël DEVILLARD
Original Assignee
Université De Bordeaux
Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale
Centre Hospitalier De Bordeaux
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Filing date
Publication date
Application filed by Université De Bordeaux, Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale, Centre Hospitalier De Bordeaux filed Critical Université De Bordeaux
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/04—Alginic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a process for manufacturing microfibers in three-dimensional structures, as well as to a crosslinked alginate substrate comprising a microfiber or a solution comprising a hydrogel-forming agent and cells that are the source of the microfiber .
  • the present invention also relates to a kit for carrying out the method of the present invention, as well as to a substitute comprising at least two microfibers.
  • the two main application fields of the process namely 3D cell modeling and regenerative medicine, are two areas in full development.
  • the first aims to fill the gap between the petri dish (two-dimensional monoculture (2D)) and the animal model for studying and understanding the mechanisms of cellular responses to environmental characteristics.
  • the in vitro 3D cell model is presented as a more predictive and physiological alternative to traditional 2D cell culture. These performances have notably been validated in the field of oncology research.
  • Regenerative medicine aims to provide viable biological substitutes for regenerating deficient tissues or creating functional functional tissues. The main advances in this area are currently focused on tissues such as skin, cartilage and cornea.
  • the two major limitations that persist are the difficulty of vascularizing and / or innervating the systems produced and the difficulty of associating within the same system various cell types.
  • the vascularization of a 3D system is essential to ensure cell viability beyond the 20 restrictive ⁇ diffusion limit.
  • the creation of micro-vascularization is crucial to ensure each cell the necessary oxygen and nutrients intake and waste disposal.
  • the innervation of the systems produced would also make it possible to obtain models and substitutes that are more advanced and better adapted to the desired function.
  • the association and organization of different cell types within a system is imperative as they closely condition the ability of the end system to perform specific functions.
  • Perez et al. (Tissue Engineering Part A 2014, 20, p.103 [7]) describe the use of 700 to 1000 micron diameter fibers having a collagen core and an alginate bark for stem cell release in the context of bone regeneration.
  • the method of preparing these fibers comprises the use of a concentric dual cannula to produce the core-bark structure of the fibers. This cannula must be manufactured specifically, and only allows the formation of linear fibers with a diameter greater than 700 microns.
  • the structure of the alginate sheath is in one piece.
  • the present invention responds precisely to these needs by providing a method of manufacturing a substrate for producing a microfiber comprising the following steps:
  • This manufacturing process is particularly simple to implement, both in terms of materials and equipment found in most laboratories. In addition, learning this The process is particularly simple, especially with respect to electrospinning or micropatterning.
  • steps a) and b), and possibly subsequent steps detailed below, can be independently performed by any suitable technique known in the art.
  • the contacting is carried out by immersion of the tube in the solution. It can also be sprinkling.
  • crosslinking solution means a solution comprising at least one compound that is suitable for crosslinking the alginate when it is brought into contact with it.
  • the crosslinking of the alginate is carried out by contact with a chemical entity in the present process because it allows a better control of the structure of the crosslinked alginate sheath obtained.
  • the crosslinking solution may for example be a solution comprising at least one divalent cation.
  • the crosslinking solution may also be a solution comprising another known alginate crosslinking agent, or a solvent, for example water or an alcohol, adapted to allow crosslinking of the alginate by irradiation or by any other known technique. in art.
  • the crosslinking solution is a solution comprising at least one divalent cation.
  • the divalent cation may be any cation which makes it possible to crosslink alginate in solution. It may be for example a divalent cation described in documents [8] Bhurhbalef a / .et [9] Kuoef al. It may be, for example, a divalent cation selected from the group consisting of Ca 2+ , Mg 2+ , Ba 2+ and Sr 2+ , or a mixture of at least two of these divalent cations.
  • the divalent cation, for example Ca 2+ is generally present in solution associated with a counterion to form, for example, CaC3 or CaCO3 type solutions, which are well known to those skilled in the art.
  • the crosslinking solution may also be a solution comprising CaCO3 coupled to Glucono delta-lactone (GDL) forming a solution of CaCO 3 -GDL.
  • the crosslinking solution can also be a mixture of CaCO3-CaSO 4 -GDL.
  • the crosslinking solution is a CaCl 2 solution.
  • any divalent cation concentration in the crosslinking solution can be used to crosslink the alginate in step (b).
  • the divalent cation concentration in the crosslinking solution may be between 10 and 1000mM.
  • the divalent cation is in the form of CaC, it may be present in the crosslinking solution at a concentration of between 10 and 1000 mM, preferably between 20 and 500 mM, preferably between 50 and 400 mM, preferably at 200 mM.
  • the crosslinking solution may comprise other constituents, which are well known to those skilled in the art, than those described above in order to improve the crosslinking of the alginate sheath under the particular conditions, in particular time and / or temperature. .
  • the alginate can be any alginate, especially in terms of chain length and distribution of the two types of monomers constituting it.
  • it may be an alginate described in [10] Lee et al.
  • the alginate is 10-60 sodium alginate.
  • the choice of the alginate may depend in particular on the application used, the desired stiffness for the sheath, and the final geometry of the desired fiber.
  • any concentration of alginate in the alginate solution allowing the alginate to crosslink to the surface of the tube after contact with a crosslinking solution, may be used.
  • concentration of alginate may be between 0.5 and 10% by weight relative to the total weight of the alginate solution.
  • concentration of alginate is between 0.5 and 5%, preferably it is 2% by weight relative to the total weight of the alginate solution.
  • any other equivalent biocompatible polymer allowing cell survival, adapted in particular to pass the nutrients and oxygen necessary for the survival of the cells and which can be present in the culture medium.
  • said polymer limits cell adhesion, in order to facilitate the step of separating the fiber and the polymer sheath.
  • the hydrogel-forming agent may be any agent capable of forming a hydrogel when placed under appropriate conditions, especially in terms of temperature, and which is compatible with the presence of cells.
  • the hydrogel-forming agent may be chosen in particular from type 1 to 19 collagen, modified or otherwise, gelatin, matrigel (registered trademark) which is a mixture of proteins secreted by sarcoma cells. mouse, fibrin, hyaluronic acid, chitosan and the mixture of at least two of these hydrogel-forming agents.
  • the hydrogel-forming agent is collagen, preferably type I collagen.
  • Other hydrogel-forming agents well known to those skilled in the art, may also be used. It is for example the hydrogel forming agents mentioned in the documents
  • the hydrogel-forming agent to be used may be a function of the intended application of the microfiber and / or the type of cells used.
  • collagen can be used as a hydrogel-forming agent when the microfiber is for tissue regeneration in the skin, bone and / or vascular domain ([12] Lee et al.).
  • Hyaluronic acid can be used when microfiber is intended for bone regeneration ([14] Patterson et al.) Or cartilage regeneration ([15] Chungef al.).
  • Gelatin can be used when the microfiber is intended for muscle regeneration ([16] Ostrovidovef al.) Or bone.
  • Fibrin can be used when the microfiber is for vascularization ([17] Barreto-Ortiz et al.).
  • the hydrogel-forming agent may be present in the solution comprising the hydrogel-forming agent and cells at any concentration for forming a hydrogel.
  • the hydrogel-forming agent may be present in the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells at a concentration of 0.5 to 10 mg / ml, preferably 5 mg / ml.
  • the crosslinking solution is a solution of CaC and the hydrogel-forming agent is collagen, preferably type I collagen.
  • the cells used in the context of the present invention depend on the intended application of the microfiber that will be produced from these cells. The person skilled in the art knows which cells to use according to the destination of the microfiber.
  • the cells used may be mammalian cells and for example human cells.
  • the cells of the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells may be selected from the group consisting of primary cells, adult, embryonic or induced stem cells, mesenchymal stem cells, somatic endothelial cells, autologous cells, vascular, glomerular, dental, chondroblastic, osteoblastic or nervous progenitor cells, in particular progenitor cells of the vascular or osteoblastic type, and the mixture of at least two of these cell types.
  • vascular-type progenitor cells mention may in particular be made of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) cells and endothelial cells derived from stem cells and in particular from mesenchymal stem cells.
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cell
  • mesenchymal stem cells including those derived from bone marrow
  • stem cells derived from the dental pulp and osteoblasts.
  • the cells are chosen from SCAP (Stem Cells from Apical Papilla) type stem cells, Human Foreskin Fibroblasts (HFF) type cells, Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) cells, EC type cells (Embryonal Carcinoma cells), D1 progenitor cells, renal podocytes and a mixture of at least two of these cell types.
  • SCAP Stee Cells from Apical Papilla
  • HFF Human Foreskin Fibroblasts
  • HFF Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • EC type cells Embryonal Carcinoma cells
  • D1 progenitor cells a mixture of at least two of these cell types.
  • the cells are chosen from SCAP (Stem Cells from Apical Papilla) type stem cells, Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) type cells, D1 type progenitor cells, renal podocytes and a mixture of at least two of these cell types. More preferably, the cells are chosen from SCAP (Stem Cells from Apical Papilla) type stem cells, D1 type progenitor cells and their mixture.
  • SCAP Ste Cells from Apical Papilla
  • UUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • the cells may be present in the solution comprising the hydrogel-forming agent and the cells at any concentration for their development. Those skilled in the art are able to determine the concentration of cells depending in particular on the cells used.
  • the cells may be present in the solution containing the hydrogel-forming agent and the cells at a concentration of between 1 and 100M / ml, preferably between 30 and 60M / ml, and preferably at a concentration of 50M / ml. ml.
  • the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells may further comprise other compounds, including useful factors for cell development.
  • These compounds may be, for example, compounds that are suitable for inducing cell differentiation and / or growth factors and / or cytokines.
  • the use of such compounds makes it possible in particular to improve cell multiplication and differentiation. Those skilled in the art are able to determine which compounds to use, in what form and at what concentration, depending on the cells used.
  • Growth factors may, for example, be selected from the group consisting of Fibroblast Growth Factors (FGFs), Transforming Growth Factors (TGFs), Insulin Growth Factors I (IGFs), Platelet Derived Growth Factors (PDGFs), Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) and Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs).
  • FGFs Fibroblast Growth Factors
  • TGFs Transforming Growth Factors
  • IGFs Insulin Growth Factors I
  • PDGFs Platelet Derived Growth Factors
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • VEGFs Vascular Endothelial Growth Factors
  • the growth factor is chosen from the group consisting of BMPs, FGFs, TGF beta and VEGFs.
  • the growth factor is a BMP.
  • Cytokines may, for example, be selected from the group consisting of interleukin 1, interleukin 6, interleukin 4, Tumor Necrosis Factor alpha, Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and Macrophage Colony-Stimulating Factor.
  • Compounds suitable for inducing cell differentiation may, for example, be hydroxyapatite (osteoinducer) or coral.
  • the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells may also include strontium, gold, nanoparticles, etc.
  • the tube may be a solid tube or a hollow tube.
  • the tube is a hollow tube.
  • the tube is a hollow tube.
  • the tube directly to deposit the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells within the crosslinked alginate sheath.
  • Said solution is thus deposited in the cross-linked alginate sheath at the end of the hollow tube as it is removed, so that the vacuum left by the tube is filled by said solution (eg by injection into exerting a slight pressure at the piston of a syringe comprising said solution); which makes it possible to mold said solution within the alginate sheath.
  • This makes it possible in particular to avoid applying too much pressure to the solution comprising the cells.
  • the tube may be for example a capillary or a hollow needle.
  • the capillary may be a polycarbonate, polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene, polyethylene terephthalate glycol (PETG), polyphenylsulfone (PPSU - Radel (registered trademark)), polysulfone (PSU - Udel (brand filed)), polycyclic oleofine polymer (Zeonor (trademark), Zeonex (registered trademark)), polytetrafluoroethylene (PTFE) or polypropylene.
  • the capillary is a polymer of polycarbonate, polymethylmethacrylate or polystyrene, preferably polycarbonate.
  • the tube may be of any form suitable for forming a channel in the crosslinked alginate sheath.
  • the tube may have a circular section, square, oval, star-shaped.
  • the tube is a hollow tube having a section of circular or oval shape, preferably circular.
  • the average external diameter may be between 50 and ⁇ ⁇ , preferably between 100 and 500 ⁇ , preferably between 200 and 400 ⁇ .
  • the tube can be of any length.
  • the tube has a length of between 2 and 10 cm, for example between 5 and 7 cm.
  • the channel formed in the reticulated alginate sheath at the end of step (c) may have a diameter that is substantially identical or even identical to that of the tube, namely a diameter of between 50 and ⁇ ⁇ , preferably between 100 and 500 ⁇ , preferably between 200 and 400 ⁇ .
  • the tube may be linear, branched, straight, curved, have angles, and / or comprise different parts of the tube. directions and / or different diameters.
  • the skilled person is able to choose the characteristics (shape, diameter, length, ...) of the tube adapted to obtain the desired fiber architecture.
  • one skilled in the art knows how to adapt the diameters of the different parts of the tube if necessary to allow the implementation of each of the steps of the process, in particular of step (c).
  • the tube may be brought into full or partial contact with the crosslinking solution.
  • the tube may be brought into full or partial contact with the alginate solution.
  • the tube portions which are contacted with the crosslinking solution and the alginate solution respectively must comprise at least one common part. Those skilled in the art are able to determine the length of the tube to be contacted with each solution for the manufacture of a microfiber and the application of the latter.
  • the tube after being brought into contact with the crosslinking solution during step (a), the tube can be removed from the crosslinking solution before being brought into contact with the alginate solution according to the invention. step (b).
  • the tube may be brought into contact with the crosslinking solution for any time to crosslink the alginate to the outer surface of the tube during step (b).
  • the tube may be contacted with the crosslinking solution for a time of between 1 and 5 seconds.
  • the tube may be contacted with the alginate solution for any time to crosslink the alginate to the outer surface of the tube.
  • the tube may be contacted with the alginate solution for a period of between 1 and 5 seconds, preferably between 1 and 3 seconds.
  • reticulated alginate sheath having the desired properties, in particular the diameter desired, on the outer surface of the tube.
  • Each of these durations can in particular be independently adapted according to the type of alginate used, the nature of the crosslinking solution, the diameter of the hollow tube, or any other parameter likely to influence the deposition of the alginate sheath. crosslinked to the outer surface of the tube.
  • the sequence of steps (a) and (b) can be carried out successively several times before the step (c) of substitution of the tube by the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells.
  • This successive repetition of steps (a) and (b) makes it possible in particular to adjust the size of the reticulated alginate sheath around the tube.
  • the skilled person is able to determine the number of times these steps must be performed successively.
  • steps (a) and (b) can be carried out successively between 2 and 100 times, for example between 2 and 50 times, for example between 10 and 20 times, for example between 7 and 10 times.
  • the composition of the crosslinking solution is not necessarily identical for each of the steps (a).
  • the crosslinking solutions are solutions comprising a divalent cation
  • the divalent nature and / or cation concentrations in the divalent cation solutions may be the same or different. It is the same for the time of contact of the tube with the crosslinking solution. The same is also true for the concentration of alginate in the alginate solution and the duration of contact of the tube with the alginate solution.
  • the steps (a) and (b) are able to determine the crosslinking solutions, the concentrations of the compound adapted to crosslink the alginate when it is brought into contact with it, the crosslinking solutions and the concentrations of the alginate solutions, as well as the tube contacting times with each of these solutions, as well as the number of repetitions of steps (a) and (b) to obtain an alginate sheath of desired diameter at the outer surface of the tube.
  • the steps (a) and (b) are able to determine the crosslinking solutions, the concentrations of the compound adapted to crosslink the alginate when it is brought into contact with it, the crosslinking solutions and the concentrations of the alginate solutions, as well as the tube contacting times with each of these solutions, as well as the number of repetitions of steps (a) and (b) to obtain an alginate sheath of desired diameter at the outer surface of the tube.
  • the steps (a) and (b) are able to determine the crosslinking solutions, the concentrations of the compound adapted
  • (a) and (b) are carried out successively, in one or more times, so that the crosslinked alginate sheath on the surface of the tube has an outer diameter of between 3 and 7 mm, preferably between 5 and 7 mm .
  • steps (a) and (b) makes it possible in particular to obtain a structure of the alginate sheath reticulated in "onion peel” (or multilayer), the structure of which is better controlled than a one-piece structure.
  • step (a) and (b) can be reversed.
  • the skilled person is able to adjust the order of these steps depending in particular on the crosslinking solution used.
  • step (b) may be carried out before or simultaneously with step (a) which allows crosslinking of the alginate.
  • the method according to the present invention makes it possible, after the step
  • the present invention also relates to a tube, preferably a hollow tube, covered with a crosslinked alginate sheath, preferably obtained at the end of step (b) of the process according to the present invention. .
  • the tube may be any tube described herein.
  • the method according to the invention may also comprise, prior to step (c), a step (b1) of contacting the tube covered by the crosslinked alginate sheath with a buffer solution.
  • This step makes it possible to exchange the water contained by the sheath with the solution buffer to avoid, in particular, osmotic shock during subsequent contact with the cells.
  • this step makes it possible to store the hollow tube covered by the crosslinked alginate sheath during the preparation of the collagen / cell mixture.
  • the buffer solution may be a phosphate salt solution (Phosphate Buffer Saline solution, PBS) or a Hank's saline solution (HBSS).
  • step (c) of substitution of the tube with a solution comprising a hydrogel-forming agent and cells can be carried out by injecting the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells concomitantly with the removal of the tube of reticulated alginate sheath.
  • the injection performed in step (c) can be carried out by an injection means comprising a solution comprising a hydrogel-forming agent and cells, and on which a hollow tube is fitted.
  • the hollow tube may be adapted directly to the injection means, for example directly on a syringe or on the tip of a needle of a syringe.
  • the tube may also be adapted to the injection means via a septum which is itself adapted or adaptable to the injection means.
  • the septa used may be those available commercially, or for example septa prepared from dental silicone (Aquasil, DENSPLY) spread in a 2 mm layer and then cut with a 5 mm punch.
  • Those skilled in the art are able to adapt the hollow tube to the injection means so that the contents of the injection means, namely the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells, can be injected into the injection mold. the reticulated alginate sheath through the hollow tube.
  • the injection means may be a syringe.
  • Injection means and septums are commonly used materials which can be obtained for example from Dutscher.
  • the injection means is a 1 mL syringe, for example a syringe sold under the reference 300013 by Dutscher.
  • the method according to the present invention makes it possible, after step (c), to obtain a substrate comprising or consisting of a crosslinked alginate sheath through which a channel containing a solution comprising a hydrogel-forming agent and cells.
  • This substrate is biocompatible and has the advantage of being easily handled while maintaining cell viability.
  • the present invention thus also relates to a substrate comprising or consisting of a crosslinked alginate sheath through which a channel containing a solution comprising a hydrogel-forming agent and cells.
  • the method according to the present invention may further comprise a step (d) of culturing the substrate obtained at the end of step (c) allowing the cells to develop in the channel, thus producing a microfiber inside. crosslinked alginate sheath.
  • This step produces a microfiber from the cells present in the hydrogel-forming agent solution and cells that are in the channel through the crosslinked alginate sheath.
  • the culturing can be carried out under standard cell culture conditions, which are well known to those skilled in the art.
  • the substrate obtained in step (c) can be cultured at 37 ° C in a culture medium, for example under a 5% CO 2 atmosphere.
  • the substrate may be placed within a cell culture incubator.
  • the culture medium may depend on the cells used in the process of the present invention, but also on the desired application. Those skilled in the art are able to determine the appropriate culture medium. It may be, for example, a culture medium specific for each cell type, for example a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium for osteoblastic progenitors, preferably supplemented with fetal calf serum, whether or not associated with antibiotics.
  • microfiber SCAPs Endothelial Cell media growth Medium for culture and Endothelial cell growth Medium2 for differentiation (PromoCell), preferably supplemented with 10% FCS decomplemented (GE Healthcare PAA, ref: A1 1 -102 100ml) associated with 1% PenStrep (GIBCO Life Technology, ref 15140 -122 100ml), for microfibers comprising HUVEC type cells (microfiber HUVECs).
  • the step (d) of culturing can be carried out for example for a period of between 1 and 21 days for cells used for vascularization and / or bone tissue.
  • the culture medium can diffuse through the reticulated alginate sheath, to provide the nutrients necessary for the viability of the cells and their organization within the microfiber.
  • the cells of the solution containing a hydrogel-forming agent and cells are located mainly at the periphery of the channel, on the surface of the crosslinked alginate sheath (see FIG. 6).
  • Compounds adapted to induce differentiation of cells and / or growth factors and / or cytokines defined herein may also be added to the culture medium used in step (d). These compounds may be added to the solution comprising a hydrogel-forming agent and cells as described above, and / or in the culture medium used in step (d).
  • a substrate comprising or consisting of a reticulated alginate sheath crossed by a channel containing a microfiber.
  • This substrate is biocompatible, that is to say it can be brought into contact with cells without affecting their viability, and has the advantage of being able to be handled easily and allow cell viability. It also has the advantage of being sterile for subsequent in vivo use of the microfiber.
  • the present invention thus also relates to a substrate comprising or consisting of a crosslinked alginate sheath crossed by a channel containing a microfiber. Also described herein is a substrate obtained or obtainable at the end of step (d) of the process according to the present invention.
  • the size of the microfiber depends on the length of the tube on the one hand, but also on its outer diameter.
  • the length of the microfiber is substantially the same as the length of the channel passing through the crosslinked alginate sheath and therefore depends on the length of the tube which has been brought into contact with the crosslinking and alginate solutions during steps (a) and (b) the method of the present invention.
  • the average outer diameter of the microfiber may be substantially less than that of the tube.
  • the average outer diameter of the microfiber may be 1.1 to 2 times smaller than the outer average diameter of the tube.
  • the microfibers obtained or likely to be obtained at the end of step (d) or step (e) of the method according to the present invention can thus have any diameter, as a function of the average external diameter of the tube.
  • the average outer diameter of the microfibers according to the invention may be between 50 and 500 ⁇ , for example between 100 and 300 ⁇ .
  • the section of the microfiber may have a different shape depending on the shape of the section of the tube used.
  • the process according to the present invention may further comprise a step (e) of separating the microfiber obtained in step (d) from the alginate sheath.
  • step (e) can be carried out enzymatically using an alginate lyase, or mechanically by pulling the alginate sheath and the microfiber in opposite directions.
  • Another object of the present invention is a microfiber obtained or obtainable at the end of step (d) or step (e) of the method according to the present invention.
  • Step (e) of the process of the present invention provides a ready-to-use microfiber.
  • This microfiber can be used in the field of 3D cellular modeling in vitro or in the medical field, particularly in regenerative medicine in orthopedics, maxillofacial surgery, or any other field of regenerative medicine.
  • microfibers can be used to:
  • each of the steps of the process of the present invention can be carried out at any temperature suitable for the crosslinking of the alginate and / or the substitution of the hollow tube by the solution of a hydrogel-forming agent and cells and / or culturing. and / or separating the microfiber from the alginate sheath.
  • the skilled person is able to determine the appropriate temperature for each of these steps.
  • the temperature is generally between 15 and 25 ° C., preferably between 18 and 22 ° C., preferably 20 ° C., with the exception of the collagen preparation steps which are carried out at a temperature of 4 ° C. C or on ice.
  • the microfibres can be associated with each other. The association can take place between microfibers containing the same cell type or different cell types.
  • the present invention also relates to a substitute comprising the mixture of at least two microfibers.
  • each of the microfibers may comprise an identical or different hydrogel-forming agent and identical or different cells.
  • the cells of the two microfibers are different.
  • the substitute may comprise a blend of at least two microfibers, each of the microfibers comprising a hydrogel-forming agent and cells, the cells of each of the microfibers being different from one microfiber to another.
  • the microfibers of the substitute have a diameter of between 50 and 500 ⁇ , in particular between 100 and 300 ⁇ , more particularly 200 ⁇ .
  • the microfibers of the substitute has a branched structure, that is to say that it comprises several parts (arms) of identical or different diameters.
  • the microfibers included in the substitute may in particular be obtained by a process according to the invention.
  • the substitute comprising at least two microfibers comprises at least one microfiber comprising bone cells (microfiber of SCAPs) and at least one microfiber comprising vascular cells (microfiber HUVEC).
  • said at least one microfiber comprising bone cells and said at least one microfiber comprising vascular cells are present in a ratio of between 1: 3 and 1: 5.
  • the substitute according to the invention may be a vascularized bone substitute.
  • This approach is a modular approach where each module, presented in the form of a microfiber corresponds to a cell type, to a specific organization and thus to a defined function.
  • the present invention also relates to a kit for the manufacture of microfiber or a substrate for the manufacture of microfiber. This kit can be used to implement the method of the present invention.
  • the kit comprises
  • At least one tube preferably a hollow tube, adaptable to the tip of the injection means so as to inject a content of the injection means.
  • the contents of the injection means may be, for example, a solution containing a hydrogel-forming agent and cells.
  • the kit may furthermore comprise:
  • hydrogel-forming agent solution for culturing cells, and / or
  • a septum adapted or adaptable to the injection means and to the hollow tube.
  • cross-linking solution, the alginate, the hydrogel-forming agent, the injection means, the hollow tube and the septum may be those defined herein.
  • the kit according to the present invention may also include a user manual.
  • FIG. 1 shows a device diagram for maintaining a capillary.
  • This device comprises a capillary ("Cap”), a septum (“Sep”) and a needle tip adaptable to a syringe (“Emb”).
  • FIG. 2 represents a diagram of implementation of steps (a) and (b) of the method of the present invention.
  • the capillary is immersed successively in solutions of calcium chloride (CaC) and sodium alginate ("Alg / Na").
  • CaC calcium chloride
  • Alg / Na sodium alginate
  • a reticulated alginate sheath (“Alg / Ca") is formed on the outer surface of the capillary.
  • FIG. 3 shows a device for maintaining a capillary whose surface is covered with a reticulated alginate sheath and whose end is cut. Cutting the end of the sheath releases the hollow end of the capillary.
  • FIG. 4 represents a filling diagram of a syringe using a micropipette containing a solution consisting of a hydrogel-forming agent and cells.
  • FIG. 5 represents an implementation diagram of step (c) of the method of the present invention.
  • the solution is injected concomitantly with removal of the capillary from the crosslinked alginate sheath.
  • FIG. 6 shows a microfiber composed of cells
  • FIG. 7 represents phase-contrast microscope views of an alginate sheath ("Alg / Ca") traversed by a channel containing cells (“Cel”) and collagen during the day (D0) and the following day. (J1) of the capillary substitution by the cell and collagen solution.
  • FIG. 8 represents phase-contrast microscopic views of an alginate sheath ("Alg / Ca") traversed by a channel containing cells (“Cel”) and collagen on the day (D 0) of the substitution of the capillary by the cell and collagen solution and on J1, J2, J3, J4, J7, J9 and J14.
  • the microfiber retracts over time during step (d) of culturing the substrate
  • FIG. 9 represents phase-contrast microscope views of the microfiber in the cross-linked alginate sheath 15 days after the capillary substitution by the cell and collagen solution (FIG. 9A), microfiber 1 and 3 days. after being separated from the sheath crosslinked alginate and disposed on a plastic support containing a culture medium (FIGS. 9B and 9C respectively).
  • FIG. 10 shows confocal microscope views of a microfiber separated from the crosslinked alginate sheath on day 1 after capillary substitution by the cell and collagen solution.
  • Figure 10A is a cross-sectional view
  • Figure 10B is a top view
  • Figure 10C is a longitudinal view of the microfiber.
  • the achieved labeling (Dapi labeling of cell nuclei, FITC labeling of collagen) makes it possible to visualize the position of cells (“Cel”) and collagen ("Col”).
  • FIG. 1 1 shows a confocal microscope view of a microfiber separated from the alginate sheath 7 days after the capillary substitution by the cell and collagen solution.
  • the achieved marking (Dapi marking of the nuclei of the cells) makes it possible to visualize the position of the cells (“Cel”) and the alignment of the cells in the longitudinal direction of the microfiber.
  • FIG. 12 represents an optical microscope view of an entire microfiber obtained from human SCAPs cells.
  • FIG. 13 represents an optical microscope view of microfibres obtained from human SCAPs cells at J1 and
  • FIG. 14 represents an optical microscope view of microfibers obtained from human endothelial cells of the HUVEC type on day 1 and day 7 of the substitution of the capillary with the cell and collagen solution.
  • FIG. 15 represents an optical microscope view of the assembly resulting from the co-culture of microfibers (without their sheath) obtained from human SCAPs cells and human endothelial cells of the HUVECs type, on day 0 and day 2 after the setting in co-culture.
  • a capillary (ParadigmOptics, Vancouver, USA) 6cm in length and whose cut to a circular shape and an average outer diameter of 200 or 300 ⁇ was introduced into a septum (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) previously adapted to the tip of a 18 G needle (Dutscher, Brumath, France) ( Figure 1).
  • This device has been adapted to a 1 ml syringe.
  • An alginate solution was prepared by mixing 2% w / w of Profanai LF-10/60 sodium alginate (FMC Biopolymer, Drammen, Norway) in deionized water or 1X PBS.
  • a crosslinking solution was prepared by adding calcium chloride (Sigma Aldrich) in deionized water so as to obtain a calcium chloride concentration of 200 mM.
  • the capillary was immersed for 2 seconds in the calcium chloride solution and then 2 seconds in the sodium alginate solution (FIG. 2). This operation was carried out successively 10 to 15 times. An alginate sheath 5 to 7 mm in diameter was thus obtained on the external surface of the capillary.
  • PBS phosphate buffer
  • D1 cells of the murine cell line D1, ATCC (LGC Standards, Molsheim, France) were cultured on plastic in low glucose DMEM medium (Gibco, Life Technologies) supplemented with 10% fetal calf serum (Lonza), under a controlled atmosphere (5% CO 2 , 100% humidity, 37 ° C).
  • a hydrogel solution was prepared from type I collagen derived from rat tail (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) according to the supplier's protocol, that is to say by reducing the pH to 7. and buffering with PBS 1 X.
  • D1 cells and the hydrogel solution were mixed in such a way as to obtain 30 ⁇ l of "hydrogel / cell” solution per fabricated fiber, the cell concentration of which was 50 ⁇ 10 6 cells / ml and the collagen concentration was 5 mg / ml. ml.
  • the amount of "hydrogel / cell” solution prepared depends on the number of cells available. Whatever the final volume of solution “hydrogel / cells” prepared, the cell concentration is of the order of 50.10 6 cells / ml and the concentration of collagen is of the order of 5 mg / ml.
  • the capillary holding device has been adapted again on the syringe.
  • Figure 12 shows the optical microscope image (2.5x magnification) of a whole microfibre of 3.2 cm in length prepared from SCAP-like strain cells (50M / ml) in collagen (5mg / ml).
  • FIG. 13 shows the image in optical microscopy (magnifications 2.5 ⁇ and ⁇ 10) of microfibers obtained from human stem cells (SCAPs, 50 ⁇ l / ml) in collagen (5 mg / ml), at day 1 and day 7 of the substitution of the capillary by the solution of cells and collagen.
  • SCAPs human stem cells
  • FIG. 14 shows the image in optical microscopy (magnification 2.5 ⁇ and ⁇ 10) of microfibers obtained from human endothelial cells (HUVECs, 50 ⁇ l / ml) in collagen (5 mg / ml), on day 1 and day 7 of the substitution of the capillary by the solution of cells and collagen.
  • HAVECs human endothelial cells
  • a crosslinked alginate sheath obtained at the end of Example 1 was placed in a DMEM culture medium (Gibco, Life Technologies) in a 6-well culture dish.
  • the box was then placed in a Thermo Scientific HERAcell (trademark) CO2 incubator for 15 days.
  • microfiber was separated from the cross-linked alginate sheath using forceps and scalpel blade. Microfiber was observed to have compacted in the alginate sheath during the ripening step. This compaction phenomenon was demonstrated by phase contrast microscopy views ( Figure 7). Compaction kinetics were performed to determine the rate of compaction of the crosslinked alginate sheath as a function of the ripening time. The results presented in
  • Figure 8 shows that the average outer diameter of the microfiber was halved in a few days.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was carried out with SCAPs type stem cells and HUVECs type endothelial cells and microfibers were obtained.
  • Figure 15 shows the result of the assembly observed at day 0 and day 2 after co-cultivation.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication de microfibres dans des structures en trois dimensions, ainsi qu'à un substrat en alginate réticulé comprenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à l'origine de la microfibre. Elle se rapporte également à un kit pour la mise en œuvre du procédé de la présente invention, ainsi qu'à un substitut comprenant au moins deux microfibres.

Description

PROCÉDÉ DE FABRICATION DE STRUCTURES
TRIDIMENSIONNELLES PAR MOULAGE POUR L'INGÉNIERIE
TISSULAIRE Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication de microfibres dans des structures en trois dimensions, ainsi qu'à un substrat en alginate réticulé comprenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à l'origine de la microfibre.
La présente invention se rapporte également à un kit pour la mise en œuvre du procédé de la présente invention, ainsi qu'à un substitut comprenant au moins deux microfibres.
Elle trouve des applications pour la réalisation de nouveaux modèles cellulaires d'étude in vitro en trois dimensions (3D), et dans le domaine médical, en particulier pour la médecine régénératrice par ingénierie tissulaire.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin des exemples. Etat de la technique
Les deux principaux champs applicatifs du procédé, à savoir la modélisation cellulaire 3D et la médecine régénératrice, sont deux domaines en plein essor.
Le premier vise à combler le vide entre la boite de pétri (monoculture en deux dimensions (2D)) et le modèle animal pour l'étude et la compréhension des mécanismes de réponses cellulaires aux caractéristiques environnementales. Le modèle cellulaire d'étude in vitro 3D se présente comme une alternative plus prédictive et plus physiologique que la culture cellulaire 2D traditionnelle. Ces performances ont notamment été validées dans le domaine de la recherche en cancérologie. La médecine régénératrice quant à elle a pour but de fournir des substituts biologiques viables pour régénérer des tissus déficients ou créer des tissus fonctionnels implantables. Les principales avancées dans ce domaine se focalisent pour l'instant sur des tissus tels que la peau, le cartilage et la cornée.
Pour ces deux applications, les deux limitations majeures qui persistent sont la difficulté de vasculariser et/ou innerver les systèmes produits et la difficulté d'associer au sein d'un même système des types cellulaires variés. La vascularisation d'un système 3D est primordiale pour assurer la viabilité cellulaire au-delà de la limite de diffusion de 20Όμηη. Ainsi, la création d'une micro-vascularisation est cruciale pour assurer à chaque cellule l'apport nécessaire en oxygène et en nutriments ainsi que l'élimination des déchets. L'innervation des systèmes produits permettrait en outre d'obtenir des modèles et substituts plus évolués et mieux adaptés à la fonction recherchée. Par ailleurs, l'association et l'organisation de différents types cellulaires au sein d'un système sont impératives puisqu'elles conditionnent étroitement la capacité du système final à réaliser des fonctions spécifiques.
Deux types d'approches sont actuellement proposés :
- l'approche guidée où l'organisation cellulaire est physiquement orientée par divers processus (matrice de soutien ou scaffold, réutilisation de structures biologiques, bio-impression) ;
- l'approche spontanée où l'organisation cellulaire s'opère librement au sein de gels, de sphéroïdes, de patchs ou de feuillets.
Concernant la problématique de la vascularisation, les acteurs s'intéressent principalement à la fabrication de vaisseaux de gros diamètre (700-1 ΟΟΌμιτι de diamètre). Plusieurs méthodes ont ainsi été développées, par exemple sur la base d'auto-assemblage cellulaire ([1] Wystrychowskief al.) ou par culture in vitro de cellules formant un feuillet qui est ensuite enroulé de manière à former un vaisseau ([2] Bourget et a/.).Toutefois, ces techniques ne permettent pas de fabriquer des structures de diamètre plus faible, de type capillaire. Pour la fabrication de structures de type capillaire, les techniques actuelles reposent sur l'approche guidée via l'utilisation de fibres d'acide poly-(L-lactique)bio-fonctionnalisées recouvertes de cellules ([3] Weinandyef al.), de gels de collagène, ou de puces de polydimethylsoloxanes (PDMS) modifiées par lithographie ([4] Zheng et al.). Le micropatterning d'hydrogel biodégradable et de cellules ([5] Muraokaef al.), ou l'électrospinning qui permet de créer des fibres cellularisables à partir de polymères ([6] Stankusef al.) sont également utilisés.
Les principales limites des techniques existantes sont leurs coûts élevés, tant en termes de matériels que de matériaux. En outre, elles requièrent des compétences techniques spécifiques (stéréolithographie, electrospinning, etc.).
Concernant la problématique de l'assemblage et de l'organisation cellulaire, la technique la plus pointue est actuellement la bio-impression 3D, approche guidée qui mime la distribution spatiale des cellules constitutives de l'organe natif. Cette technique requiert une expertise aiguë et un équipement lourd et coûteux.
Perez et al. (Tissue Engineering Part A 2014, 20, p.103 [7]) décrivent l'utilisation de fibres de diamètre de 700 à 1000 microns ayant un cœur de collagène et une écorce d'alginate pour la libération de cellules souches dans le cadre de la régénération osseuse. Le procédé de préparation de ces fibres comprend l'utilisation d'une double canule concentrique pour produire la structure cœur-écorce des fibres. Cette canule doit être fabriquée spécifiquement, et permet uniquement la formation de fibres linéaires de diamètre supérieur à 700 microns. En outre, la structure de la gaine d'alginate est en un seul bloc.
En outre, pour une utilisation optimale dans les domaines identifiés ci-dessus, il serait important de pouvoir disposer de fibres de toute géométrie, c'est-à-dire de fibres qui ne sont pas nécessairement linéaires mais éventuellement coudées, ramifiées, à plusieurs « bras » de diamètres éventuellement différents. Aucune des techniques décrites pour fabriquer des fibres ne permet une telle flexibilité dans la structure des fibres obtenues.
Il n'existe pas à ce jour de méthodes faciles à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques et qui soient peu coûteuses pour répondre aux deux problématiques majeures mentionnées ci-dessus. En particulier, il n'existe pas de telles méthodes pour la fabrication de fibres, notamment de fibres de faible diamètre, comprenant des cellules, lesdites méthodes permettant d'obtenir des fibres de géométrie variée.
II existe donc un réel besoin de procédés palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé de production de microfibres comprenant des cellules, qui soit facile à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques, qui soit peu coûteux et permette de former des fibres de géométrie variée.
Exposé de l'invention
La présente invention répond précisément à ces besoins en fournissant un procédé de fabrication d'un substrat pour la production d'une microfibre, comprenant les étapes successives suivantes :
a. mise en contact d'un tube avec une solution de réticulation, b. mise en contact du tube avec une solution d'alginate, la solution d'alginate formant alors une gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube,
c. substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, formant ainsi un substrat comprenant une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
Ce procédé de fabrication est particulièrement simple à mettre en œuvre, tant au niveau des matériaux que des équipements qui se retrouvent dans la plupart des laboratoires. En outre, l'apprentissage de ce procédé est particulièrement simple, notamment par rapport à l'electrospinning ou le micropatterning.
La mise en contact des étapes a) et b), et éventuellement des étapes ultérieures détaillées ci-après, peut être indépendamment réalisée par toute technique adaptée connue dans l'art. De préférence, la mise en contact est réalisée par immersion du tube dans la solution. Il peut également s'agir d'aspersion.
Dans la présente, on entend par « solution de réticulation », une solution comprenant au moins un composé adapté pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci.
Avantageusement, la réticulation de l'alginate est réalisée par mise en contact avec une entité chimique dans le présent procédé car elle permet une meilleure maîtrise de la structure de la gaine d'alginate réticulé obtenue. La solution de réticulation peut être par exemple une solution comprenant au moins un cation divalent. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant un autre réticulant connu de l'alginate, ou un solvant, par exemple de l'eau ou un alcool, adapté pour permettre une réticulation de l'alginate par irradiation ou par toute autre technique connue dans l'art. De préférence, la solution de réticulation est une solution comprenant au moins un cation divalent.
Selon l'invention, le cation divalent peut être tout cation permettant de réticuler de l'alginate en solution. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent décrit dans les documents [8] Bhurhbalef a/.et [9] Kuoef al. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent choisi dans le groupe comprenantCa2+, Mg2+, Ba2+ et Sr2+, ou d'un mélange d'au moins deux de ces cations divalents. Le cation divalent, par exemple le Ca2+, est généralement présent en solution associé à un contre-ion pour former par exemple des solutions de typeCaC ou CaCO3, bien connues de l'homme du métier.
La solution de réticulation peut également être une solution comprenant du CaCO3 couplé à du Glucono delta-lactone (GDL) formant une solution de CaCO3-GDL. La solution de réticulation peut également être un mélange de CaCO3-CaSO4-GDL. De préférence, la solution de réticulation est une solution de CaC^.
L'homme du métier est à même d'ajuster la nature du cation et/ou du contre-ion aux autres paramètres du procédé de la présente invention, notamment à la nature de l'alginate utilisé et à la vitesse et/ ou au degré de réticulation désiré(e).
Toute concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être utilisée pour réticuler l'alginate lors de l'étape (b). L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cation divalent à utiliser en fonction du cation divalent choisi et éventuellement d'autres paramètres tels que la nature de l'alginate ou la température de mise en contact. Par exemple, la concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être comprise entre 10 et 1000mM. Par exemple, si le cation divalent est sous forme de CaC , il peut être présent dans la solution de réticulation à une concentration comprise entre 10 et 1000mM, de préférence entre 20 et 500mM, de préférence entre 50 et 400mM, de préférence à 200mM.
La solution de réticulation peut comprendre d'autres constituants, bien connus de l'homme du métier, que ceux décrit ci-dessus afin d'améliorer la réticulation de la gaine d'alginate dans les conditions, notamment temps et/ou température, particulières.
Selon l'invention, l'alginate peut être tout alginate, notamment en termes de longueur de chaîne et de distribution des deux types de monomères le constituant. Par exemple, il peut s'agir d'un alginate décrit dans le document [10] Lee et al.. De préférence, l'alginate est de l'alginate de sodium 10-60.
Le choix de l'alginate peut dépendre notamment de l'application utilisée, de la rigidité désirée pour la gaine, et de la géométrie finale de la fibre désirée.
Toute concentration d'alginate dans la solution d'alginate, permettant la réticulation de l'alginate à la surface du tube après mise en contact avec une solution de réticulation, peut être utilisée. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration d'alginate à utiliser en fonction notamment des caractéristiques physiques du tube, de la composition de la solution de réticulation et de la gaine que l'on cherche à obtenir. Par exemple, la concentration d'alginate peut être comprise entre 0,5 et 10% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate. De préférence, la concentration d'alginate est comprise entre 0,5 et 5%, de préférence elle est de 2% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate.
L'homme du métier est à même s'il le désire de remplacer l'alginate par tout autre polymère biocompatible équivalent permettant la survie cellulaire, adapté en particulier pour laisser passer les nutriments et l'oxygène nécessaires à la survie des cellules et qui peuvent être présents dans le milieu de culture. De préférence, ledit polymère limite l'adhésion cellulaire, afin de faciliter l'étape de séparation de la fibre et de la gaine de polymère.
L'agent formant un hydrogel peut être tout agent capable de former un hydrogel lorsqu'il est placé dans des conditions appropriées, notamment en termes de température, et qui est compatible avec la présence de cellules.
Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être choisi notamment parmi le collagène de type 1 à 19, modifié ou non, la gélatine, le matrigel (marque déposée) qui est un mélange de protéines sécrétées par des cellules de sarcome de souris, la fibrine, l'acide hyaluronique, le chitosan et le mélange d'au moins deux de ces agents formant un hydrogel. De préférence, l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I. D'autres agents formant un hydrogel, bien connu de l'homme du métier peuvent également être utilisés. Il s'agit par exemple des agents formant un hydrogel cités dans les documents
[11 ] Lee et al. , [12] Lee et al. ou [13] Druryef al..
L'agent formant un hydrogel à utiliser peut être fonction de l'application destinée de la microfibre et/ou du type de cellules utilisé. Par exemple, le collagène peut être utilisé comme agent formant un hydrogel lorsque la microfibre est destinée à la régénération tissulaire dans le domaine de la peau, des os et/ou dans le domaine vasculaire ([12] Lee et al.). L'acide hyaluronique peut être utilisé lorsque la microfibre est destinée à la régénération osseuse ([14] Patterson et al.) ou la régénération du cartilage ([15] Chungef al.). La gélatine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la régénération musculaire ([16] Ostrovidovef al.) ou osseuse. La fibrine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la vascularisation ([17] Barreto-Ortiz et al.).
Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et des cellules à toute concentration permettant la formation d'un hydrogel. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration appropriée d'agent formant un hydrogel. Par exemple, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à une concentration comprise entre 0,5 et 10mg/nnl, de préférence à 5mg/ml.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la solution de réticulation est une solution de CaC et l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I.
Les cellules utilisées dans le cadre de la présente invention dépendent de l'application destinée de la microfibre qui sera produite à partir de ces cellules. L'homme du métier sait quelles cellules utiliser en fonction de la destination de la microfibre.
Les cellules utilisées peuvent être des cellules de mammifères et par exemple des cellules humaines. Selon l'invention, les cellules de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peuvent être choisies dans le groupe constitué des cellules primaires, des cellules souches adultes, embryonnaires ou induites, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules somatiques endothéliales, des cellules autologues, des cellules progénitrices de type vasculaire, glomérulaire, dentaire, chondroblastique, ostéoblastique ou nerveux, en particulier des cellules progénitrices de type vasculaire ou ostéoblastique, et du mélange d'au moins deux de ces types cellulaires. Parmi les cellules progénitrices de type vasculaire on peut citer notamment les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) et les cellules endothéliales dérivées de cellules souches et notamment de cellules souches mésenchymateuses. Parmi les cellules progénitrices de type ostéoblastique, on peut citer notamment les cellules souches mésenchymateuses (dont celles issues de moelle osseuse), les cellules souches dérivées de la pulpe dentaire et les ostéoblastes. Dans un mode de réalisation, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HFF (Human Foreskin Fibroblasts), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules de type EC (Embryonal Carcinoma cells), les cellules progénitrices de type D1 , les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules.
De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules progénitrices de type D1 , les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules. De préférence encore, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules progénitrices de type D1 et leur mélange.
Les cellules peuvent être présentes dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à toute concentration permettant leur développement. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cellules en fonction notamment des cellules utilisées. Par exemple, les cellules peuvent être présentes dans la solution contenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à une concentration comprise entre 1 et 100M/ml, de préférence entre 30 et 60 M/ml, et préférentiellement à une concentration de 50M/ml.
La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut comprendre en outre d'autres composés, notamment des facteurs utiles au développement des cellules. Ces composés peuvent être par exemple des composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou des facteurs de croissance et/ou des cytokines. L'utilisation de tels composés permet notamment d'améliorer la multiplication et la différenciation des cellules. L'homme du métier est à même de déterminer quels composés utiliser, sous quelle forme et à quelle concentration, en fonctions des cellules utilisées.
Les facteurs de croissance peuvent, par exemple, être choisis dans le groupe comprenant les Fibroblast Growth Factors (FGFs), les Transforming Growth Factors (TGFs), les Insulin Growth Factors I (IGFs), les Platelet Derived Growth Factors (PDGFs), les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) et les Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs). Préférentiellement, le facteur de croissance est choisi dans le groupe constitué par BMPs, FGFs, TGF beta et VEGFs. En particulier, le facteur de croissance est un BMP.
Les cytokines peuvent, par exemple, être choisies dans le groupe comprenant l'interleukine 1 , l'interleukine 6, l'interleukine 4, le Tumor Necrosis Factor alpha, le Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor et le Macrophage Colony-Stimulating Factor.
Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules peuvent, par exemple, être de l'hydroxyapatite (ostéoinducteur) ou du corail.
La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut également comprendre du strontium, de l'or, des nanoparticules, etc.
Selon l'invention, le tube peut être un tube plein ou un tube creux.
De préférence, le tube est un tube creux. Cela permet avantageusement lors de l'étape (c) de substitution d'utiliser le tube directement pour effectuer le dépôt de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules au sein de la gaine d'alginate réticulé. Ladite solution est ainsi déposée dans la gaine d'alginate réticulé au niveau de l'extrémité du tube creux au fur et à mesure que celui-ci est retiré, de sorte que le vide laissé par le tube est comblé par ladite solution (e.g. par injection en exerçant une légère pression au niveau du piston d'une seringue comprenant ladite solution) ; ce qui permet de mouler ladite solution au sein de la gaine d'alginate. Ceci permet notamment d'éviter d'appliquer une trop forte pression à la solution comprenant les cellules.
Selon l'invention, le tube peut être par exemple un capillaire ou une aiguille creuse. Par exemple, le capillaire peut être un capillaire de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), de polystyrène, de polyéthylène téréphtalateglycolisé (PETG), de polyphénylsulfone (PPSU - Radel (marque déposée)), de polysulfone (PSU - Udel (marque déposée)), de polymère d'oléofine polycyclique (Zeonor (marque déposée), Zeonex (marque déposée)), de polytetrafluoroéthylène (PTFE) ou de polypropylène. De préférence, le capillaire est un polymère de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle ou de polystyrène, de préférence de polycarbonate.
Selon l'invention, le tube peut être de toute forme appropriée pour former un canal dans la gaine d'alginate réticulé. Par exemple, le tube peut avoir une section de forme circulaire, carrée, ovale, en forme d'étoile. De préférence, le tube est un tube creux ayant une section de forme circulaire ou ovale, de préférence circulaire.
Quelle que soit la forme de la section du tube, le diamètre moyen externe peut être compris entre 50 et Ι ΟΟΟμηη, de préférence entre 100 et 500μηη, de préférence entre 200 et 400μηη.
Quels que soient la forme de la section du tube et son diamètre moyen externe, le tube peut être de toute longueur. Par exemple, le tube a une longueur comprise entre 2 et 10 cm, par exemple entre 5 et 7 cm.
Ainsi, le canal formé dans la gaine d'alginate réticulé à l'issue de l'étape (c) peut avoir un diamètre sensiblement identique voire identique à celui du tube, à savoir un diamètre compris entre 50 et Ι ΟΟΟμηη, de préférence entre 100 et 500μηη, de préférence entre 200 et 400μηη.
Quels que soient la forme de la section du tube, son diamètre moyen externe et sa longueur, le tube peut être linéaire, ramifié, droit, courbé, présenter des angles, et/ou comprendre différentes parties de directions et/ou de diamètres différents. L'homme du métier est à même de choisir les caractéristiques (forme, diamètre, longueur,...) du tube adaptées pour obtenir l'architecture de fibre désirée. En particulier, l'homme du métier sait adapter les diamètres des différentes parties du tube le cas échéant pour permettre la mise en œuvre de chacune des étapes du procédé, en particulier de l'étape (c).
Lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact totalement ou partiellement avec la solution de réticulation. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact totalement ou partiellement avec la solution d'alginate. L'homme du métier comprend que les parties de tube qui sont mises en contact respectivement avec la solution de réticulation et avec la solution d'alginate doivent comprendre au moins une partie commune. L'homme du métier est à même de déterminer la longueur du tube devant être mise en contact avec chaque solution en vue de la fabrication d'une microfibre et de l'application de cette dernière.
Selon l'invention, après avoir été mis en contact avec la solution de réticulation lors de l'étape (a), le tube peut être retiré de la solution de réticulation avant d'être mis en contact avec la solution d'alginate selon l'étape (b).
Par ailleurs, lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube lors de l'étape (b). Par exemple, le tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube. Par exemple, le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes, de préférence entre 1 et 3 secondes. L'homme du métier est à même de déterminer les durées de mise en contact lors des étapes (a) et (b) afin d'obtenir une gaine d'alginate réticulé ayant les propriétés désirées, notamment le diamètre désiré, à la surface externe du tube. Chacune de ces durées peut notamment être indépendamment adaptée en fonction du type d'alginate utilisé, de la nature de la solution de réticulation, du diamètre du tube creux, ou de tout autre paramètre susceptible d'influencer le dépôt de la gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube.
Selon l'invention, l'enchaînement des étapes (a) et (b) peut être réalisé successivement plusieurs fois avant l'étape (c) de substitution du tube par la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Cette répétition successive des étapes (a) et (b) permet notamment d'ajuster la taille de la gaine d'alginate réticulé autour du tube. L'homme du métier est à même de déterminer le nombre de fois où ces étapes doivent être réalisées successivement. Par exemple, les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées successivement entre 2 et 100 fois, par exemple entre 2 et 50 fois, par exemple entre 10 et 20 fois, par exemple entre 7 et 10 fois.
Lorsque les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement plusieurs fois, la composition de la solution de réticulation n'est pas nécessairement identique pour chacune des étapes (a). Par exemple, lorsque les solutions de réticulation sont des solutions comprenant un cation divalent, les natures et/ou les concentrations de cation divalent dans les solutions de cation divalent peuvent être identiques ou différentes. Il en va de même pour le temps de mise en contact du tube avec la solution de réticulation. Il en va également de même pour la concentration d'alginate dans la solution d'alginate et la durée de mise en contact du tube avec la solution d'alginate. L'homme du métier est à même de déterminer les solutions de réticulation, les concentrations du composé adaptées pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci, les solutions de réticulation et les concentrations des solutions d'alginate, ainsi que les temps de mise en contact du tube avec chacune de ces solutions, ainsi que le nombre de répétitions des étapes (a) et (b) pour obtenir une gaine d'alginate de diamètre désiré à la surface externe du tube. De préférence, dans le cadre de la présente invention, les étapes
(a) et (b) sont réalisées successivement, en une ou plusieurs fois, de manière à ce que la gaine d'alginate réticulé à la surface du tube ait un diamètre externe compris entre 3 et 7 mm, de préférence entre 5 et 7mm.
L'alternance des étapes (a) et (b) permet notamment d'obtenir une structure de la gaine d'alginate réticulé en « pelure d'oignon » (ou multicouches), dont la structure est mieux contrôlée qu'une structure monobloc.
Dans certains modes de réalisation, l'ordre des étapes (a) et (b) peut être inversé. L'homme du métier est à même d'ajuster l'ordre de ces étapes en fonction notamment de la solution de réticulation utilisée. Par exemple, dans le cas où la réticulation est réalisée par irradiation UV ou par choc thermique, l'étape (b) peut être mise en œuvre avant ou simultanément à l'étape (a) qui permet la réticulation de l'alginate.
Le procédé selon la présente invention, permet, à l'issue de l'étape
(b) , d'obtenir un tube recouvert d'une gaine d'alginate réticulé. Lorsque le tube est un tube creux, le tube creux recouvert d'une gaine d'alginate réticulé constitue un « moule » qui peut être utilisé pour injecter une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce tube creux recouvert d'une gaine d'alginate réticulé peut être utilisé extemporanément pour faire la substitution, par exemple 1 heure après l'opération de réticulation alors qu'il est conservé à une température inférieure à 20°C, dans du PBS 1 X. Ainsi, la présente invention se rapporte également à un tube, de préférence un tube creux, recouvert d'une gaine d'alginate réticulé, obtenu de préférence à l'issue de l'étape (b) du procédé selon la présente invention. Le tube peut être n'importe quel tube décrit dans la présente.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre, préalablement à l'étape (c), une étape (b1 ) de mise en contact du tube recouvert par la gaine d'alginate réticulé avec une solution tampon. Cette étape permet de d'échanger l'eau contenue par la gaine avec la solution tampon pour éviter notamment les chocs osmotiques lors de la mise en contact ultérieure avec les cellules. Aussi cette étape permet de stocker le tube creux recouvert par la gaine d'alginate réticulé le temps de la préparation du mélange collagène/cellules. Par exemple, la solution tampon peut être une solution saline de phosphate (Phosphate Buffer Saline solution, PBS) ou une solution saline de Hanks (Hank's Balance saline solution, HBSS).
Selon l'invention, l'étape (c) de substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut être réalisée par injection de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules de façon concomitante au retrait du tube de la gaine d'alginate réticulée.
Selon l'invention, l'injection réalisée à l'étape (c) peut être réalisée par un moyen d'injection comprenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, et sur lequel est adapté un tube creux.
Le tube creux peut être adapté directement sur le moyen d'injection, par exemple directement sur une seringue ou sur l'embout d'une aiguille d'une seringue. Le tube peut également être adapté sur le moyen d'injection par l'intermédiaire d'un septum qui est lui-même adapté ou adaptable au moyen d'injection. Les septums utilisés peuvent être ceux disponibles dans le commerce, ou par exemple des septums préparés à partir de silicone dentaire (Aquasil, DENSPLY) étalé en couche de 2 mm puis découpé à l'aide d'un emporte-pièce de 5 mm. L'homme du métier est à même d'adapter le tube creux au moyen d'injection de manière à ce que le contenu du moyen d'injection, à savoir la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, puisse être injecté dans la gaine d'alginate réticulé par l'intermédiaire du tube creux.
Par exemple, le moyen d'injection peut être une seringue. Les moyens d'injections et septums sont des matériels d'utilisation courante qui peuvent être obtenus par exemple auprès de Dutscher. Dans un mode de réalisation, le moyen d'injection est une seringue de 1 mL, par exemple une seringue vendue sous la référence 300013 par Dutscher. Le procédé selon la présente invention permet, à l'issue de l'étape (c), d'obtenir un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce substrat est biocompatible et présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement, tout en maintenant la viabilité cellulaire. La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (d) de mise en culture du substrat obtenu à l'issue de l'étape (c) permettant le développement des cellules dans le canal, produisant ainsi une microfibre à l'intérieur de la gaine d'alginate réticulé.
Cette étape permet de produire une microfibre à partir des cellules présentes dans la solution d'agent formant un hydrogel et des cellules qui se situent dans le canal traversant la gaine d'alginate réticulé.
La mise en culture peut être réalisée dans des conditions classiques de culture cellulaire, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, le substrat obtenu à l'étape (c) peut être mis en culture à 37°C dans un milieu de culture, par exemple sous une atmosphère à 5% de CO2. Par exemple, le substrat peut être placé au sein d'un incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture peut dépendre des cellules utilisées dans le cadre du procédé de la présente invention, mais également de l'application recherchée. L'homme du métier est à même de déterminer le milieu de culture approprié. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture spécifique à chaque type cellulaire, par exemple un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) pour les progéniteurs ostéoblastiques, de préférence complémenté avec du sérum de veau fœtal associé ou non à des antibiotiques et/ou des agents de différenciation comme de l'acide ascorbique, par exemple un milieu Gibco® MEM Alpha, GlutaMAX™ sans acide ascorbique, de préférence additionné de 10% SVF décomplémenté (GE Healthcare PAA, réf : A1 1 -102 100ml) associé à 1 % PenStrep (GIBCO Life Technology, réf : 15140-122 100ml), pour des microfibres comprenant des cellules osseuses (microfibre SCAPs), par exemple des milieux Endothelial Cell growth Médium pour la culture et Endothelial cell growth Medium2 pour la différenciation (PromoCell), de préférence additionnés de 10% SVF décomplémenté (GE Healthcare PAA, réf : A1 1 -102 100ml) associé à 1 % PenStrep (GIBCO Life Technology, réf 15140-122 100ml), pour des microfibres comprenant des cellules de type HUVEC (microfibre HUVECs). L'étape (d) de mise en culture peut être réalisée par exemple pendant une durée comprise entre 1 et 21 jours pour des cellules utilisées pour la vascularisation et/ou les tissus osseux.
Les conditions de culture en fonction des cellules utilisées sont bien connues de l'homme du métier (par exemple celles décrites dans [18] Weinandyef al. ; [19] Baranskief al. ;[20]Chenef al.).
Lors de l'étape (d), le milieu de culture peut diffuser au travers de la gaine d'alginate réticulé, permettant de fournir les nutriments nécessaires à la viabilité des cellules et à leur organisation au sein de la microfibre. Au cours de cette étape, les cellules de la solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules se disposent principalement en périphérie du canal, à la surface de la gaine d'alginate réticulé (voir Figure 6).
Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou les facteurs de croissance et/ou les cytokines définis dans la présente peuvent également être ajoutés dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d). Ces composés peuvent être ajoutés dans la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules comme décrit ci- avant, et/ou dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d).
A l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention, on obtient un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Ce substrat est biocompatible, c'est-à-dire qu'il peut être mis en contact avec des cellules sans affecter leur viabilité, et présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement et de permettre la viabilité cellulaire. Il présente également l'avantage de pouvoir être stérile pour une utilisation in vivo ultérieure de la microfibre.
La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Est également décrit dans la présente un substrat obtenu ou susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention.
La taille de la microfibre dépend de la longueur du tube d'une part, mais également de son diamètre externe. La longueur de la microfibre est sensiblement la même que la longueur du canal traversant la gaine d'alginate réticulé et dépendant donc de la longueur du tube qui a été mise en contact avec les solutions de réticulation et d'alginate lors des étapes (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le diamètre externe moyen de la microfibre peut être sensiblement inférieur à celui du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe de la microfibre peut être de 1 ,1 à 2 fois plus petit que le diamètre moyen externe du tube. Les microfibres obtenues ou susceptibles d'être obtenues à l'issue de l'étape (d) ou de l'étape (e) du procédé selon la présente invention peuvent ainsi avoir tout diamètre, en fonction du diamètre moyen externe du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe des microfibres selon l'invention peut être compris entre 50 et 500 μιτι, par exemple entre 100 et 300μηη. Jamais des microfibres de si petite taille n'ont été obtenues à ce jour par un procédé facile à mettre en œuvre et peu coûteux. Par ailleurs, la section de la microfibre peut avoir une forme différente en fonction de la forme de la section du tube utilisé.
Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (e) de séparation de la microfibre obtenue à l'étape (d) de la gaine d'alginate. Par exemple, l'étape (e) peut être réalisée par voie enzymatique à l'aide d'une alginate lyase, ou bien mécaniquement en tirant la gaine d'alginate et la microfibre dans des sens opposés. Un autre objet de la présente invention est une microfibre obtenue ou susceptible d'être obtenue à l'issue de l'étape (d) ou de l'étape (e) du procédé selon la présente invention.
L'étape (e) du procédé de la présente invention permet d'obtenir une microfibre prête à être utilisée. Cette microfibre peut être utilisée dans le domaine de la modélisation cellulaire 3D in vitro ou dans le domaine médical, notamment en médecine régénératrice que ce soit en orthopédie, chirurgie maxillo-faciale, ou tout autre domaine de médecine régénératrice. Par exemple, les microfibres peuvent être utilisées pour :
- la micro-vascularisation ou l'innervation des tissus issus de l'ingénierie tissulaire,
le patterning de cellules, par exemple de cellules nerveuses ou de cellules souches, pour la régénération tissulaire,
le développement de modèles d'études in vitro,
- des applications favorisant la perfusion de modèle tridimensionnel de culture cellulaire in vitro,
le transport de cellules, matériaux d'intérêt biologique, de molécules à intérêt thérapeutique, etc. Chacune des étapes du procédé de la présente invention peut être réalisée à toute température adaptée à la réticulation de l'alginate et/ou la substitution du tube creux par la solution content un agent formant un hydrogel et des cellules et/ou la mise en culture et/ou de séparation de la microfibre de la gaine d'alginate. L'homme du métier est à même de déterminer la température appropriée pour chacune de ces étapes. Par exemple, la température est généralement comprise entre 15 et 25 °C, de préférence entre 18 et 22 °C, préférentiel lement de 20°C, à l'exception des étapes de préparation du collagène qui se font à une température de 4°C ou sur de la glace. Les microfibres peuvent être associées entre elles. L'association peut avoir lieu entre des microfibres contenant le même type cellulaire ou des types cellulaires différents.
La présente invention a également pour objet un substitut comprenant le mélange d'au moins deux microfibres. Par exemple, chacune des microfibres peut comprendre un agent formant un hydrogel, identique ou différent, et des cellules identiques ou différentes. De préférence, les cellules des deux microfibres sont différentes. Par exemple, le substitut peut comprendre un mélange d'au moins deux microfibres, chacune des microfibres comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, les cellules de chacune des microfibres étant différentes d'une microfibre à l'autre. De préférence, les microfibres du substitut ont un diamètre compris entre 50 et 500 μιτι, en particulier compris entre 100 et 300 μιτι, plus particulièrement de 200 μιτι. De façon préférée, au moins une des microfibres du substitut a une structure ramifiée, c'est-à-dire qu'elle comprend plusieurs parties (bras), de diamètres identiques ou différents. Les microfibres comprises dans le substitut peuvent notamment être obtenues par un procédé selon l'invention. De préférence, le substitut comprenant au moins deux microfibres comprend au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses (microfibre de SCAPs) et au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires (microfibre d'HUVEC). Par exemple, ladite au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses et ladite au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires sont présentes en un ratio compris entre 1 :3 et 1 :5. Dans ce cas particulier, le substitut selon l'invention peut être un substitut osseux vascularisé.
Cette approche est une approche modulaire où chaque module, présenté sous la forme d'une microfibre correspond à un type cellulaire, à une organisation spécifique et ainsi à une fonction définie. La présente invention a également pour objet un kit pour la fabrication de microfibre ou d'un substrat pour la fabrication de microfibre. Ce kit peut permettre de mettre en œuvre le procédé de la présente invention.
Selon l'invention, le kit comprend
une solution de réticulation,
- un alginate, éventuellement en solution,
un moyen d'injection,
au moins un tube, de préférence un tube creux, adaptable sur l'embout du moyen d'injection de manière à pouvoir injecter un contenu du moyen d'injection.
Le contenu du moyen d'injection peut être par exemple une solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
Selon l'invention, le kit peut comprendre en outre :
une solution d'agent formant un hydrogel pour la mise en culture de cellules, et/ou
- un septum adapté ou adaptable au moyen d'injection et au tube creux.
La solution de réticulation, l'alginate, l'agent formant un hydrogel, le moyen d'injection, le tube creux et le septum peuvent être ceux définis dans la présente.
Le kit selon la présente invention peut également comprendre une notice d'utilisation.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif et non limitatif.
Brève description des figures
- La figure 1 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire. Ce dispositif comprend un capillaire (« Cap »), un septum (« Sep ») et un embout d'aiguille adaptable sur une seringue (« Emb »).
- La figure 2 représente un schéma de mise en œuvre des étapes (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le capillaire est immergé successivement dans des solutions de chlorure de calcium (CaC ) et d'alginate de sodium (« Alg / Na »). A l'issue de ces étapes, une gaine d'alginate réticulé (« Alg / Ca ») est formée à la surface externe du capillaire.
- La figure 3 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire dont la surface est recouverte d'une gaine d'alginate réticulé et dont l'extrémité est coupée. Le fait de couper l'extrémité de la gaine permet de libérer l'extrémité creuse du capillaire.
- La figure 4 représente un schéma de remplissage d'une seringue à l'aide d'une micropipette contenant une solution constituée d'un agent formant un hydrogel et des cellules.
- La figure 5 représente un schéma de mise en œuvre de l'étape (c) du procédé de la présente invention. L'injection de la solution se fait de manière concomitante au retrait du capillaire de la gaine d'alginate réticulé.
- La figure 6 représente une microfibre composée de cellules
(« Cel ») à l'intérieur d'une gaine d'alginate réticulé (« Alg / Ca »). « Col » représente du collagène à l'intérieur de la microfibre.
- La figure 7 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (J0) et le lendemain (J1 ) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.
- La figure 8 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (J0) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène et à J1 , J2, J3, J4, J7, J9 et J14. La microfibre se rétracte au cours du temps pendant l'étape (d) de mise en culture du substrat
- La figure 9 représente des vues au microscope à contraste de phase de la microfibre dans la gaine d'alginate réticulé 15 jours après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène (Figure 9A), de la microfibre 1 et 3 jours après avoir été séparée de la gaine d'alginate réticulé et disposée sur un support en plastique contenant un milieu de culture (Figure 9B et 9C respectivement).
- La figure 10 représente des vues au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé le jour 1 après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. La figure 10A correspond à une vue transversale, la figure 10B à une vue du dessus et la figure 10C à une vue longitudinale de la microfibre. Le marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules, Marquage FITC du collagène) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et du collagène (« Col »).
- La figure 1 1 représente une vue au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate 7 jours après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. Le marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et l'alignement des cellules dans le sens longitudinal de la microfibre.
- La figure 12 représente une vue au microscope optique d'une microfibre entière obtenue à partir de cellules humaines de type SCAPs.
- La figure 13 représente une vue au microscope optique de microfibres obtenues à partir de cellules humaines de type SCAPs à J1 et
J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.
- La figure 14 représente une vue au microscope optique de microfibres obtenues à partir de cellules endothéliales humaines de type HUVECs à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.
- La figure 15 représente une vue au microscope optique de l'assemblage issu de la co-culture de microfibres (sans leur gaine) obtenues à partir de cellules humaines de type SCAPs et de cellules endothéliales humaines de type HUVECs, à J0 et J2 après la mise en co- culture. EXEMPLES
Sauf indication contraire, l'ensemble des protocoles présenté dans les exemples ci-dessous a été réalisé en conditions stériles et à température ambiante (environ 20°C).
Exemple 1 : Protocole de mise en œuvre du procédé de la présente invention
Un capillaire (ParadigmOptics, Vancouver, USA) de 6cm de longueur et dont la coupe à une forme circulaire et un diamètre moyen externe de 200 ou 300μηη a été introduit dans un septum (Sigma-AIdrich, Saint Quentin Fallavier, France) préalablement adapté sur l'embout d'une aiguille 18 G (Dutscher, Brumath, France) (Figure 1 ). Ce dispositif a été adapté sur une seringue de 1 ml.
Une solution d'alginate a été préparée en mélangeant 2% poids/poids de d'alginate de sodium Profanai LF-10/60 (FMC Biopolymer, Drammen, Norway) dans de l'eau désionisée ou du PBS 1 X.
Une solution de réticulation a été préparée en ajoutant du chlorure de calcium (Sigma Aldrich) dans de l'eau désionisée de manière à obtenir une concentration de chlorure de calcium de 200mM.
Le capillaire a été plongé 2 secondes dans la solution de chlorure de calcium puis 2 secondes dans la solution d'alginate de sodium (Figure 2). Cette opération a été réalisée successivement 10 à 15 fois. Une gaine d'alginate de 5 à 7 mm de diamètre a ainsi été obtenue à la surface externe du capillaire.
Le capillaire et la gaine d'alginate ont ensuite été immergés dans du Phosphate buffer saline (PBS) 0.1 M (Sigma-AIdrich, Saint Quentin Fallavier, France) en attendant son utilisation (environ 20°C).
L'extrémité du capillaire gainé par l'alginate réticulé a été coupée afin d'éviter l'obstruction du capillaire (Figure 3).
Des cellules D1 de la lignée cellulaire murine D1 , ATCC (LGC Standards, Molsheim, France) ont été cultivées sur plastique dans du milieu DMEM à faible concentration de glucose (Gibco, Life Technologies) complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (Lonza), sous atmosphère contrôlée (5% de CO2, 100% d'humidité, 37 ° C).
Une solution d'hydrogel a été préparée à partir de collagène de type I issu de queue de rat (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) selon le protocole du fournisseur, c'est-à-dire en ramenant le pH à 7 et en tamponnant au PBS 1 X.
Des cellules D1 et de la solution d'hydrogel ont été mélangées de manière à obtenir 30 μΙ de solution « hydrogel/cellules » par fibre fabriquée, dont la concentration cellulaire est de 50.106 cellules/ml et la concentration de collagène est de 5mg/ml.
La quantité de solution « hydrogel/cellules » préparée dépend du nombre de cellules disponibles. Quel que soit le volume final de solution « hydrogel/cellules » préparé, la concentration cellulaire est de l'ordre de 50.106 cellules/ml et la concentration de collagène est de l'ordre de 5mg/ml.
Le dispositif de maintien du capillaire a été retiré et 30 μΙ de cette solution « hydrogel/cellules » ont été prélevés à l'aide d'une micropipette afin de remplir l'extrémité de la seringue (Figure 4). Cette étape a été réalisée de cette manière afin de minimiser les pertes.
Le dispositif de maintien du capillaire a été adapté à nouveau sur la seringue.
Ensuite, le capillaire a été retiré de la gaine d'alginate réticulé tout en effectuant une pression sur le piston de la seringue afin de substituer la solution « hydrogel/cellules » au capillaire (Figure 5).
Une gaine d'alginate réticulé remplie de la solution « hydrogel/cellules » a ainsi été obtenue.
Le même mode opératoire a été mis en œuvre avec des cellules souches de type SCAP et des cellules endothéliales et des microfibres ont été obtenues. La figure 12 montre l'image en microscopie optique (grossissement 2,5x) d'une microfibre entière de 3,2cm de longueur préparée à partir de cellules souche de type SCAP (50M/ml) dans du collagène (5mg/ml).
La figure 13 montre l'image en microscopie optique (grossissements 2,5x et x10) de microfibres obtenues à partir de cellules souches humaines (SCAPs, 50M/ml) dans du collagène (5mg/ml), à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.
La figure 14 montre l'image en microscopie optique (grossissement 2,5x et x10) de microfibres obtenues à partir de cellules endothéliales humaines (HUVECs, 50M/ml) dans du collagène (5mg/ml), à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.
Exemple 2 : Maturation des cellules présentes dans la solution « hydrogel/cellules » au cœur de la gaine d'alginate réticulé
Une gaine d'alginate réticulé obtenue à l'issue de l'exemple 1 a été placée dans un milieu de culture DMEM (Gibco, Life Technologies) en boite de culture 6 puits.
La boite a ensuite été placée dans un incubateur à CO2 Thermo Scientific HERAcell (marque déposée) pendant 15 jours.
Au bout de ces 15 jours une microfibre de 100 μιτι de diamètre a été obtenue au cœur de la gaine d'alginate réticulé (Figure 6).
La microfibre a été séparée de la gaine d'alginate réticulé à l'aide d'une pince et d'une lame de scalpel. II a été observé que la microfibre s'est compactée dans la gaine d'alginate au cours de l'étape de maturation. Ce phénomène de compaction a été mis en évidence par des vues en microscopie à contraste de phase (Figure 7). Une cinétique de compaction a été réalisée de manière à déterminer la vitesse de compaction de la gaine d'alginate réticulé en fonction du temps de maturation. Les résultats présentés en
Figure 8 montrent que le diamètre moyen externe de la microfibre a été divisé par deux en quelques jours. Exemple 3 : Viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été vérifiée en disposant la microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé dans un puits de culture en plastique (NUNC (marque déposée)) contenant un milieu de culture DMEM.
Il a été observé que les cellules de la microfibre étaient capables de coloniser le fond du puits dès le premier jour après la séparation de la microfibre de la gaine d'alginate réticulé. La colonisation s'est poursuivie également 3 jours après la séparation (Figure 9).
Exemple 4 : Co-culture de microfibres
Le même mode opératoire qu'à l'exemple 1 a été mis en œuvre avec des cellules souches de type SCAPs et des cellules endothéliales de type HUVECs et des microfibres ont été obtenues.
Pour la co-culture, environ 10cm de fibres au total ont été utilisés selon un ratio 1 :3 ; à savoir 1 SCAPs pour 3 HUVECs.
L'assemblage des différents types de microfibres, dépourvues de leur gaine comme précédemment décrit par voie mécanique, a été réalisé après 1 jour de culture de chaque type de microfibre dans leur gaine.
La figure 15 montre le résultat de l'assemblage observé, à J0 et J2 après la mise en co-culture.
Liste des références
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication d'un substrat pour la production d'une microfibre, comprenant les étapes successives suivantes :
a. mise en contact d'un tube ayant un diamètre moyen externe compris entre 50 et 1000 μιτι avec une solution de réticulation,
b. mise en contact du tube avec une solution d'alginate, la solution d'alginate formant alors une gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube,
c. substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, formant ainsi un substrat comprenant une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
2. Procédé selon la revendication 1 , comprenant en outre l'étape suivante :
d. mise en culture du substrat obtenu à l'issue de l'étape (c) permettant le développement des cellules dans le canal, produisant ainsi une microfibre à l'intérieur de la gaine d'alginate réticulé.
3. Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre l'étape suivante :
e. séparation de la microfibre obtenue à l'étape (d) de la gaine d'alginate.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement plusieurs fois avant l'étape (c) de substitution du tube par la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre, préalablement à l'étape (c), une étape (b1 ) de mise en contact du tube recouvert par la gaine d'alginate réticulé avec une solution tampon.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la solution de réticulation comprend un cation divalent choisi dans le groupe comprenantCa2+, Mg2+, Ba2+ et Sr2+, ou un mélange d'au moins deux de ces cations divalents.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'agent formant un hydrogel est choisi dans le groupe comprenant le collagène de type 1 à 19, modifié ou non, la gélatine, la fibrine, l'acide hyaluronique, le chitosan et le mélange d'au moins deux de ces agents formant un hydrogel.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la solution d'alginate est une solution d'alginate de sodium comprenant de 0,5 à 10% en poids d'alginate de sodium par rapport au poids total de la solution d'alginate.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les cellules sont des cellules choisies dans le groupe comprenant les cellules souches mésenchymateuses, les cellules somatiques endothéliales, les cellules progénitrices de type vasculaire, ostéoblastique ou nerveux, et du mélange d'au moins deux de ces catégories cellulaires.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le tube a un diamètre moyen externe compris entre 50 et Ι ΟΟΟμηη.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,dans lequel le tube est un capillaire de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle, de polystyrène, de polyéthylèn et éréphtalateglycolisé, de polyphenylsulfone, de polysulfone, de polymère d'oléofine polycyclique, de polytetrafluoroéthylène ou de polypropylène.
12. Substrat susceptible d'être obtenu selon le procédé tel que défini dans la revendication 4, comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé multicouches traversée par un canal contenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules
13. Kit pour la fabrication de microfibre ou d'un substrat pour la fabrication de microfibre, comprenant :
une solution de réticulation,
de l'alginate,
un moyen d'injection,
- au moins un tube creux adaptable sur l'embout du moyen d'injection de manière à pouvoir injecter un contenu du moyen d'injection.
14. Tube, de préférence tube creux, recouvert d'une gaine d'alginate réticulé, susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape (b) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , dans lequel le tube a un diamètre moyen externe compris entre 50 et Ι ΟΟΌμηη.
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