FR3026954A1 - Procede de fabrication de structures tridimensionnelles par moulage pour l'ingenierie tissulaire - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication de microfibres dans des structures en trois dimensions, ainsi qu'à un substrat en alginate réticulé comprenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à l'origine de la microfibre. Elle se rapporte également à un kit pour la mise en œuvre du procédé de la présente invention, ainsi qu'à un substitut comprenant au moins deux microfibres.

Description

1 PROCEDE DE FABRICATION DE STRUCTURES TRIDIMENSIONNELLES PAR MOULAGE POUR L'INGENIERIE TISSULAIRE Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication de microfibres dans des structures en trois dimensions, ainsi qu'à un substrat en alginate réticulé comprenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à l'origine de la microfibre.

La présente invention se rapporte également à un kit pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, ainsi qu'à un substitut comprenant au moins deux microfibres. Elle trouve des applications pour la réalisation de nouveaux modèles cellulaires d'étude in vitro en trois dimensions (3D), et dans le domaine médical, en particulier pour la médecine régénératrice par ingénierie tissulaire. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste des références présentée à la fin des exemples.

Etat de la technique Les deux principaux champs applicatifs du procédé, à savoir la modélisation cellulaire 3D et la médecine régénératrice, sont deux domaines en plein essor. Le premier vise à combler le vide entre la boite de pétri (monoculture en deux dimensions (2D)) et le modèle animal pour l'étude et la compréhension des mécanismes de réponses cellulaires aux caractéristiques environnementales. Le modèle cellulaire d'étude in vitro 3D se présente comme une alternative plus prédictive et plus physiologique que la culture cellulaire 2D traditionnelle. Ces performances 3 0 ont notamment été validées dans le domaine de la recherche en cancérologie.

3026954 2 La médecine régénératrice quant à elle a pour but de fournir des substituts biologiques viables pour régénérer des tissus déficients ou créer des tissus fonctionnels implantables. Les principales avancées dans ce domaine se focalisent pour l'instant sur des tissus tels que la peau, le 5 cartilage et la cornée. Pour ces deux applications, les deux limitations majeures qui persistent sont la difficulté de vasculariser et/ou innerver les systèmes produits et la difficulté d'associer au sein d'un même système des types cellulaires variés. La vascularisation d'un système 3D est primordiale pour 10 assurer la viabilité cellulaire au-delà de la limite de diffusion de 200pm. Ainsi, la création d'une microvascularisation est cruciale pour assurer à chaque cellule l'apport nécessaire en oxygène et en nutriments ainsi que l'élimination des déchets. L'innervation des systèmes produits permettrait en outre d'obtenir des modèles et substituts plus évolués et mieux adaptés 15 à la fonction recherchée. Par ailleurs, l'association et l'organisation de différents types cellulaires au sein d'un système sont impératives puisqu'elles conditionnent étroitement la capacité du système final à réaliser des fonctions spécifiques. Deux types d'approches sont actuellement proposés : 20 - l'approche guidée où l'organisation cellulaire est physiquement orientée par divers processus (matrice de soutien ou scaffold, réutilisation de structures biologiques, bio-impression) ; - l'approche spontanée où l'organisation cellulaire s'opère librement au sein de gels, de sphéroïdes, de patchs ou de feuillets.

25 Concernant la problématique de la vascularisation, les acteurs s'intéressent principalement à la fabrication de vaisseaux de gros diamètre (700-1000pm de diamètre). Plusieurs méthodes ont ainsi été développées, par exemple sur la base d'auto-assemblage cellulaire ([1] Wystrychowski et al.) ou par culture in vitro de cellules formant un feuillet qui est ensuite enroulé de manière à former un vaisseau ([2] Bourget et al.). Toutefois, ces techniques ne permettent pas de fabriquer des structures de diamètre plus faible, de type capillaire.

3026 954 3 Pour la fabrication de structures de type capillaire, les techniques actuelles reposent sur l'approche guidée via l'utilisation de fibres d'acide poly-(L-lactique) bio-fonctionnalisées recouvertes de cellules ([3] Weinandy et al.), de gels de collagène, ou de puces de 5 polydiméthylsoloxanes (PDMS) modifiées par lithographie ([4] Zheng et al.). Le micropatterning d'hydrogel biodégradable et de cellules ([5] Muraoka et al.), ou l'électrospinning qui permet de créer des fibres cellularisables à partir de polymères ([6] Stankus et al.) sont également utilisés.

10 Les principales limites des techniques existantes sont leurs coûts élevés, tant en termes de matériels que de matériaux. En outre, elles requièrent des compétences techniques spécifiques (stéréolithographie, electrospinning, etc.). Concernant la problématique de l'assemblage et de l'organisation 15 cellulaire, la technique la plus pointue est actuellement la bio-impression 3D, approche guidée qui mime la distribution spatiale des cellules constitutives de l'organe natif. Cette technique requiert une expertise aiguë et un équipement lourd et coûteux. Perez et al. (Tissue Engineering Part A 2014, 20, p.103 [7]) 20 décrivent l'utilisation de fibres de diamètre de 700 à 1000 microns ayant un coeur de collagène et une écorce d'alginate pour la libération de cellules souches dans le cadre de la régénération osseuse. Le procédé de préparation de ces fibres comprend l'utilisation d'une double canule concentrique pour produire la structure coeur-écorce des fibres. Cette 25 canule doit être fabriquée spécifiquement, et permet uniquement la formation de fibres linéaires de diamètre supérieur à 700 microns. En outre, la structure de la gaine d'alginate est en un seul bloc. En outre, pour une utilisation optimale dans les domaines identifiés ci-dessus, il serait important de pouvoir disposer de fibres de toute 30 géométrie, c'est-à-dire de fibres qui ne sont pas nécessairement linéaires mais éventuellement coudées, ramifiées, à plusieurs « bras » de diamètres éventuellement différents. Aucune des techniques décrites pour fabriquer 3026954 4 des fibres ne permet une telle flexibilité dans la structure des fibres obtenues. Il n'existe pas à ce jour de méthodes faciles à mettre en oeuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques et qui soient peu 5 coûteuses pour répondre aux deux problématiques majeures mentionnées ci-dessus. En particulier, il n'existe pas de telles méthodes pour la fabrication de fibres, notamment de fibres de faible diamètre, comprenant des cellules, lesdites méthodes permettant d'obtenir des fibres de géométrie variée.

10 Il existe donc un réel besoin de procédés palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé de production de microfibres comprenant des cellules, qui soit facile à mettre en oeuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques, qui soit peu coûteux et permette de former des fibres de géométrie variée.

15 Exposé de l'invention La présente invention répond précisément à ces besoins en fournissant un procédé de fabrication d'un substrat pour la production d'une microfibre, comprenant les étapes successives suivantes : 20 a. mise en contact d'un tube avec une solution de réticulation, b. mise en contact du tube avec une solution d'alginate, la solution d'alginate formant alors une gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube, c. substitution du tube par une solution comprenant un agent 25 formant un hydrogel et des cellules, formant ainsi un substrat comprenant une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce procédé de fabrication est particulièrement simple à mettre en 3 0 oeuvre, tant au niveau des matériaux que des équipements qui se retrouvent dans la plupart des laboratoires. En outre, l'apprentissage de ce 3026954 5 procédé est particulièrement simple, notamment par rapport à l'electrospinning ou le micropatterning. La mise en contact des étapes a) et b), et éventuellement des 5 étapes ultérieures détaillées ci-après, peut être indépendamment réalisée par toute technique adaptée connue dans l'art. De préférence, la mise en contact est réalisée par immersion du tube dans la solution. Il peut également s'agir d'aspersion. Dans la présente, on entend par « solution de réticulation », une 10 solution comprenant au moins un composé adapté pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci. Avantageusement, la réticulation de l'alginate est réalisée par mise en contact avec une entité chimique dans le présent procédé car elle permet une meilleure maîtrise de la structure de la gaine d'alginate réticulé 15 obtenue. La solution de réticulation peut être par exemple une solution comprenant au moins un cation divalent. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant un autre réticulant connu de l'alginate, ou un solvant, par exemple de l'eau ou un alcool, adapté pour permettre une réticulation de l'alginate par irradiation ou par toute autre 2 0 technique connue dans l'art. De préférence, la solution de réticulation est une solution comprenant au moins un cation divalent. Selon l'invention, le cation divalent peut être tout cation permettant de réticuler de l'alginate en solution. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent décrit dans les documents [8] Bhurhbal et al. et [9] Kuo et al. Il 25 peut s'agir par exemple d'un cation divalent choisi dans le groupe comprenant Ca2+, Mg2+, Ba2+ et Sr2+, ou d'un mélange d'au moins deux de ces cations divalents. Le cation divalent, par exemple le Ca2+, est généralement présent en solution associé à un contre-ion pour former par exemple des solutions de type CaCl2 ou CaCO3, bien connues de l'homme 30 du métier. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant du CaCO3 couplé à du Glucono delta-lactone (GDL) formant 302 6 954 6 une solution de CaCO3-GDL. La solution de réticulation peut également être un mélange de CaCO3_CaSO4-GDL. De préférence, la solution de réticulation est une solution de CaCl2. L'homme du métier est à même d'ajuster la nature du cation et/ou 5 du contre-ion aux autres paramètres du procédé de la présente invention, notamment à la nature de l'alginate utilisé et à la vitesse et/ ou au degré de réticulation désiré(e). Toute concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être utilisée pour réticuler l'alginate lors de l'étape (b).

10 L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cation divalent à utiliser en fonction du cation divalent choisi et éventuellement d'autres paramètres tels que la nature de l'alginate ou la température de mise en contact. Par exemple, la concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être comprise entre 10 et 1000mM. Par 15 exemple, si le cation divalent est sous forme de CaCl2, il peut être présent dans la solution de réticulation à une concentration comprise entre 10 et 1000mM, de préférence entre 20 et 500mM, de préférence entre 50 et 400mM, de préférence à 200mM. La solution de réticulation peut comprendre d'autres constituants, 20 bien connus de l'homme du métier, que ceux décrit ci-dessus afin d'améliorer la réticulation de la gaine d'alginate dans les conditions, notamment temps et/ou température, particulières. Selon l'invention, l'alginate peut être tout alginate, notamment en termes de longueur de chaîne et de distribution des deux types de 25 monomères le constituant. Par exemple, il peut s'agir d'un alginate décrit dans le document [10] Lee et al.. De préférence, l'alginate est de l'alginate de sodium. Le choix de l'alginate peut dépendre notamment de l'application utilisée, de la rigidité désirée pour la gaine, et de la géométrie finale de la 30 fibre désirée. Toute concentration d'alginate dans la solution d'alginate, permettant la réticulation de l'alginate à la surface du tube après mise en 3026954 7 contact avec une solution de réticulation, peut être utilisée. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration d'alginate à utiliser en fonction notamment des caractéristiques physiques du tube, de la composition de la solution de réticulation et de la gaine que l'on cherche à 5 obtenir. Par exemple, la concentration d'alginate peut être comprise entre 0,5 et 10% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate. De préférence, la concentration d'alginate est comprise entre 0,5 et 5%, de préférence elle est de 2% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate.

10 L'homme du métier est à même s'il le désire de remplacer l'alginate par tout autre polymère biocompatible équivalent permettant la survie cellulaire, adapté en particulier pour laisser passer les nutriments et l'oxygène nécessaires à la survie des cellules et qui peuvent être présents dans le milieu de culture. De préférence, ledit polymère limite l'adhésion 15 cellulaire, afin de faciliter l'étape de séparation de la fibre et de la gaine de polymère. L'agent formant un hydrogel peut être tout agent capable de former un hydrogel lorsqu'il est placé dans des conditions appropriées, notamment en termes de température, et qui est compatible avec la 20 présence de cellules. Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être choisi notamment parmi le collagène de type 1 à 19, modifié ou non, la gélatine, le matrigel (marque déposée) qui est un mélange de protéines sécrétées par des cellules de sarcome de souris, la fibrine, l'acide hyaluronique, le 25 chitosan et le mélange d'au moins deux de ces agents formant un hydrogel. De préférence, l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I. D'autres agents formant un hydrogel, bien connu de l'homme du métier peuvent également être utilisés. Il s'agit par exemple des agents formant un hydrogel cités dans les documents 30 [11] Lee et al., [12] Lee et al. ou [13] Drury et al.. L'agent formant un hydrogel à utiliser peut être fonction de l'application destinée de la microfibre et/ou du type de cellules utilisé. Par 3026954 8 exemple, le collagène peut être utilisé comme agent formant un hydrogel lorsque la microfibre est destinée à la régénération tissulaire dans le domaine de la peau, des os et/ou dans le domaine vasculaire ([12] Lee et al.). L'acide hyaluronique peut être utilisé lorsque la microfibre est destinée à la régénération osseuse ([14] Patterson et al.) ou la régénération du cartilage ([15] Chung et al.). La gélatine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la régénération musculaire ([16] Ostrovidov et al.) ou osseuse. La fibrine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la vascularisation ([17] Barreto-Ortiz et al.). Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et des cellules à toute concentration permettant la formation d'un hydrogel. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration appropriée d'agent formant un hydrogel. Par exemple, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à une concentration comprise entre 0,5 et 10mg/ml, de préférence à 5mg/ml. Selon un mode de réalisation de la présente invention, la solution de réticulation est une solution de CaCl2 et l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I. Les cellules utilisées dans le cadre de la présente invention dépendent de l'application destinée de la microfibre qui sera produite à partir de ces cellules. L'homme du métier sait quelles cellules utiliser en fonction de la destination de la microfibre. Les cellules utilisées peuvent être des cellules de mammifères et par exemple des cellules humaines. Selon l'invention, les cellules de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peuvent être choisies dans le groupe constitué des cellules primaires, des cellules souches adultes, ou induites, à l'exception des cellules provenant d'embryons humain, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules somatiques endothéliales, des cellules autologues, des cellules progénitrices de type vasculaire, glomérulaire, dentaire, chondroblastique, 3026954 9 ostéoblastique ou nerveux, en particulier des cellules progénitrices de type vasculaire ou ostéoblastique, et du mélange d'au moins deux de ces types cellulaires. Parmi les cellules progénitrices de type vasculaire on peut citer notamment les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) et les cellules endothéliales dérivées de cellules souches et notamment de cellules souches mésenchymateuses. Parmi les cellules progénitrices de type ostéoblastique, on peut citer notamment les cellules souches mésenchymateuses (dont celles issues de moelle osseuse), les cellules souches dérivées de la pulpe dentaire et les ostéoblastes. Dans un mode de réalisation, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HFF (Human Foreskin Fibroblasts), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules progénitrices de type D1, les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules. De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules progénitrices de type D1, les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules. De préférence encore, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules progénitrices de type D1 et leur mélange. Les cellules peuvent être présentes dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à toute concentration permettant leur développement. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cellules en fonction notamment des cellules utilisées. Par exemple, les cellules peuvent être présentes dans la solution contenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à une concentration comprise entre 1 et 100M/ml. La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut comprendre en outre d'autres composés, notamment des facteurs utiles au développement des cellules. Ces composés peuvent être 3026954 10 par exemple des composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou des facteurs de croissance et/ou des cytokines. L'utilisation de tels composés permet notamment d'améliorer la multiplication et la différenciation des cellules. L'homme du métier est à même de déterminer 5 quels composés utiliser, sous quelle forme et à quelle concentration, en fonctions des cellules utilisées. Les facteurs de croissance peuvent, par exemple, être choisis dans le groupe comprenant les Fibroblast Growth Factors (FGFs), les Transforming Growth Factors (TGFs), les Insulin Growth Factors I (IGFs), 10 les Platelet Derived Growth Factors (PDGFs), les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) et les Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs). Préférentiellement, le facteur de croissance est choisi dans le groupe constitué par BMPs, FGFs, TGF beta et VEGFs. En particulier, le facteur de croissance est un BMP.

15 Les cytokines peuvent, par exemple, être choisies dans le groupe comprenant l'interleukine 1, l'interleukine 6, l'interleukine 4, le Tumor Necrosis Factor alpha, le Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor et le Macrophage Colony-Stimulating Factor. Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules 20 peuvent, par exemple, être de l'hydroxyapatite (ostéoinducteur) ou du corail. La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut également comprendre du strontium, de l'or, des nanoparticules, etc. Selon l'invention, le tube peut être un tube plein ou un tube creux.

25 De préférence, le tube est un tube creux. Cela permet avantageusement lors de l'étape (c) de substitution d'utiliser le tube directement pour effectuer le dépôt de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules au sein de la gaine d'alginate réticulé. Ladite solution est ainsi déposée dans la gaine d'alginate réticulé au niveau de l'extrémité du 30 tube creux au fur et à mesure que celui-ci est retiré. Ceci permet notamment d'éviter d'appliquer une pression à la solution comprenant les cellules.

3026 954 11 Selon l'invention, le tube peut être par exemple un capillaire ou une aiguille creuse. Par exemple, le capillaire peut être un capillaire de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), de polystyrène, de polyéthylène téréphtalate glycolisé (PETG), de polyphénylsulfone 5 (PPSU - Radel (marque déposée)), de polysulfone (PSU - Udel (marque déposée)), de polymère d'oléofine polycyclique (Zeonor (marque déposée), Zeonex (marque déposée)), de polytetrafluoroéthylène (PTFE) ou de polypropylène. De préférence, le capillaire est un polymère de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle ou de polystyrène, de 10 préférence de polycarbonate. Selon l'invention, le tube peut être de toute forme appropriée pour former un canal dans la gaine d'alginate réticulé. Par exemple, le tube peut avoir une section de forme circulaire, carrée, ovale, en forme d'étoile. De préférence, le tube est un tube creux ayant une section de forme circulaire 15 ou ovale, de préférence circulaire. Quelle que soit la forme de la section du tube, le diamètre moyen externe peut être compris entre 50 et 1000pm, de préférence entre 100 et 500pm, de préférence entre 200 et 400pm. Quels que soient la forme de la section du tube et son diamètre 20 moyen externe, le tube peut être de toute longueur. Par exemple, le tube a une longueur comprise entre 2 et 10 cm, par exemple entre 5 et 7 cm. Ainsi, le canal formé dans la gaine d'alginate réticulé à l'issue de l'étape (c) peut avoir un diamètre sensiblement identique voire identique à celui du tube, à savoir un diamètre compris entre 50 et 1000pm, de préférence 25 entre 100 et 500pm, de préférence entre 200 et 400pm. Quels que soient la forme de la section du tube, son diamètre moyen externe et sa longueur, le tube peut être linéaire, ramifié, droit, courbé, présenter des angles, et/ou comprendre différentes parties de directions et/ou de diamètres différents. L'homme du métier est à même de 30 choisir les caractéristiques (forme, diamètre, longueur,...) du tube adaptées pour obtenir l'architecture de fibre désirée. En particulier, l'homme du métier sait adapter les diamètres des différentes parties du 3026954 12 tube le cas échéant pour permettre la mise en oeuvre de chacune des étapes du procédé, en particulier de l'étape (c). Lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact totalement ou 5 partiellement avec la solution de réticulation. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact totalement ou partiellement avec la solution d'alginate. L'homme du métier comprend que les parties de tube qui sont mises en contact respectivement avec la solution de réticulation et avec la solution d'alginate doivent comprendre au moins une partie 10 commune. L'homme du métier est à même de déterminer la longueur du tube devant être mise en contact avec chaque solution en vue de la fabrication d'une microfibre et de l'application de cette dernière. Selon l'invention, après avoir été mis en contact avec la solution de réticulation lors de l'étape (a), le tube peut être retiré de la solution de 15 réticulation avant d'être mis en contact avec la solution d'alginate selon l'étape (b). Par ailleurs, lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube lors de l'étape (b). Par exemple, le 20 tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube. Par exemple, le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate 25 pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes. L'homme du métier est à même de déterminer les durées de mise en contact lors des étapes (a) et (b) afin d'obtenir une gaine d'alginate réticulé ayant les propriétés désirées, notamment le diamètre désiré, à la surface externe du tube. Chacune de ces durées peut notamment être indépendamment adaptée 30 en fonction du type d'alginate utilisé, de la nature de la solution de réticulation, du diamètre du tube creux, ou de tout autre paramètre 3026954 13 susceptible d'influencer le dépôt de la gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube. Selon l'invention, l'enchaînement des étapes (a) et (b) peut être réalisé successivement plusieurs fois avant l'étape (c) de substitution du 5 tube par la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Cette répétition successive des étapes (a) et (b) permet notamment d'ajuster la taille de la gaine d'alginate réticulé autour du tube. L'homme du métier est à même de déterminer le nombre de fois où ces étapes doivent être réalisées successivement. Par exemple, les étapes (a) 10 et (b) peuvent être réalisées successivement entre 2 et 100 fois, par exemple entre 2 et 50 fois, par exemple entre 10 et 20 fois. Lorsque les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement plusieurs fois, la composition de la solution de réticulation n'est pas nécessairement identique pour chacune des étapes (a). Par exemple, 15 lorsque les solutions de réticulation sont des solutions comprenant un cation divalent, les natures et/ou les concentrations de cation divalent dans les solutions de cation divalent peuvent être identiques ou différentes. Il en va de même pour le temps de mise en contact du tube avec la solution de réticulation. Il en va également de même pour la concentration d'alginate 20 dans la solution d'alginate et la durée de mise en contact du tube avec la solution d'alginate. L'homme du métier est à même de déterminer les solutions de réticulation, les concentrations du composé adaptées pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci, les solutions de réticulation et les concentrations des solutions d'alginate, ainsi que les 25 temps de mise en contact du tube avec chacune de ces solutions, ainsi que le nombre de répétitions des étapes (a) et (b) pour obtenir une gaine d'alginate de diamètre désiré à la surface externe du tube. De préférence, dans le cadre de la présente invention, les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement, en une ou plusieurs fois, de 30 manière à ce que la gaine d'alginate réticulé à la surface du tube ait un diamètre externe compris entre 3 et 7 mm, de préférence entre 5 et 7 mm.

3026954 14 L'alternance des étapes (a) et (b) permet notamment d'obtenir une structure de la gaine d'alginate réticulé en « pelure d'oignon », dont la structure est mieux contrôlée qu'une structure monobloc. Dans certains modes de réalisation, l'ordre des étapes (a) et (b) 5 peut être inversé. L'homme du métier est à même d'ajuster l'ordre de ces étapes en fonction notamment de la solution de réticulation utilisée. Par exemple, dans le cas où la réticulation est réalisée par irradiation UV ou par choc thermique, l'étape (b) peut être mise en oeuvre avant ou simultanément à l'étape (a) qui permet la réticulation de l'alginate.

10 Le procédé selon la présente invention, permet, à l'issue de l'étape (b), d'obtenir un tube recouvert d'une gaine d'alginate réticulé. Lorsque le tube est un tube creux, le tube creux recouvert d'une gaine d'alginate réticulé constitue un « moule » qui peut être utilisé pour injecter une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ainsi, la 15 présente invention se rapporte également à un tube, de préférence un tube creux, recouvert d'une gaine d'alginate réticulé, obtenu de préférence à l'issue de l'étape (b) du procédé selon la présente invention. Le tube peut être n'importe quel tube décrit dans la présente.

20 Le procédé selon l'invention peut également comprendre, préalablement à l'étape (c), une étape (b1) de mise en contact du tube recouvert par la gaine d'alginate réticulé avec une solution tampon. Cette étape permet de d'échanger l'eau contenue par la gaine avec la solution tampon pour éviter notamment les chocs osmotiques lors de la mise en 25 contact ultérieure avec les cellules. Aussi cette étape permet de stocker le tube creux recouvert par la gaine d'alginate réticulé le temps de la préparation du mélange collagène/cellules. Par exemple, la solution tampon peut être une solution saline de phosphate (Phosphate Buffer Saline solution, PBS) ou une solution saline de Hanks (Hank's Balance 30 saline solution, HBSS). Selon l'invention, l'étape (c) de substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut être 3026954 15 réalisée par injection de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules de façon concomitante au retrait du tube de la gaine d'alginate réticulée. Selon l'invention, l'injection réalisée à l'étape (c) peut être réalisée 5 par un moyen d'injection comprenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, et sur lequel est adapté un tube creux. Le tube creux peut être adapté directement sur le moyen d'injection, par exemple directement sur une seringue ou sur l'embout d'une aiguille d'une seringue. Le tube peut également être adapté sur le 10 moyen d'injection par l'intermédiaire d'un septum qui est lui-même adapté ou adaptable au moyen d'injection. L'homme du métier est à même d'adapter le tube creux au moyen d'injection de manière à ce que le contenu du moyen d'injection, à savoir la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, puisse être injecté dans la gaine 15 d'alginate réticulé par l'intermédiaire du tube creux. Par exemple, le moyen d'injection peut être une seringue. Les moyens d'injections et septums sont des matériels d'utilisation courante qui peuvent être obtenus par exemple auprès de Dutscher. Dans un mode de réalisation, le moyen d'injection est une seringue de 1 mL, par exemple 20 une seringue vendue sous la référence 300013 par Dutscher. Le procédé selon la présente invention permet, à l'issue de l'étape (c), d'obtenir un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce substrat est biocompatible et 25 présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement, tout en maintenant la viabilité cellulaire. La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.

30 Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (d) de mise en culture du substrat obtenu à l'issue de l'étape (c) 3026954 16 permettant le développement des cellules dans le canal, produisant ainsi une microfibre à l'intérieur de la gaine d'alginate réticulé. Cette étape permet de produire une microfibre à partir des cellules présentes dans la solution d'agent formant un hydrogel et des cellules qui 5 se situent dans le canal traversant la gaine d'alginate réticulé. La mise en culture peut être réalisée dans des conditions classiques de culture cellulaire, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, le substrat obtenu à l'étape (c) peut être mis en culture à 37°C dans un milieu de culture, par exemple sous une atmosphère à 5% de 10 CO2. Par exemple, le substrat peut être placé au sein d'un incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture peut dépendre des cellules utilisées dans le cadre du procédé de la présente invention, mais également de l'application recherchée. L'homme du métier est à même de déterminer le milieu de culture approprié. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture 15 spécifique à chaque type cellulaire, par exemple un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) pour les progéniteurs ostéoblastiques, de préférence complémenté avec du sérum de veau foetal associé ou non à des antibiotiques et/ou des agents de différenciation comme de l'acide ascorbique. L'étape (d) de mise en culture peut être 20 réalisée par exemple pendant une durée comprise entre 2 et 15 jours pour des cellules utilisées pour la vascularisation et/ou les tissus osseux. Les conditions de culture en fonction des cellules utilisées sont bien connues de l'homme du métier (par exemple celles décrites dans [18] Weinandy et al. ; [19] Baranski et al. ; [20] Chen et al.).

25 Lors de l'étape (d), le milieu de culture peut diffuser au travers de la gaine d'alginate réticulé, permettant de fournir les nutriments nécessaires à la viabilité des cellules et à leur organisation au sein de la microfibre. Au cours de cette étape, les cellules de la solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules se disposent principalement en 30 périphérie du canal, à la surface de la gaine d'alginate réticulé (voir Figure 6).

3026954 17 Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou les facteurs de croissance et/ou les cytokines définis dans la présente peuvent également être ajoutés dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d). Ces composés peuvent être ajoutés dans la solution 5 comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules comme décrit ci- avant, et/ou dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d). A l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention, on obtient un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Ce substrat est 10 biocompatible, c'est-à-dire qu'il peut être mis en contact avec des cellules sans affecter leur viabilité, et présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement et de permettre la viabilité cellulaire. Il présente également l'avantage de pouvoir être stérile pour une utilisation in vivo ultérieure de la microfibre.

15 La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Est également décrit dans la présente un substrat obtenu ou susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention.

20 La taille de la microfibre dépend de la longueur du tube d'une part, mais également de son diamètre externe. La longueur de la microfibre est sensiblement la même que la longueur du canal traversant la gaine d'alginate réticulé et dépendant donc de la longueur du tube qui a été mise en contact avec les solutions de réticulation et d'alginate lors des étapes 25 (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le diamètre externe moyen de la microfibre peut être sensiblement inférieur à celui du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe de la microfibre peut être de 1,1 à 2 fois plus petit que le diamètre moyen externe du tube. Les microfibres obtenues ou susceptibles d'être obtenues à l'issue de l'étape (d) ou de 30 l'étape (e) du procédé selon la présente invention peuvent ainsi avoir tout diamètre, en fonction du diamètre moyen externe du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe des microfibres selon l'invention peut être compris 3026954 18 entre 50 et 500 pm, par exemple entre 100 et 300pm. Jamais des microfibres de si petite taille n'ont été obtenues à ce jour par un procédé facile à mettre en oeuvre et peu coûteux. Par ailleurs, la section de la microfibre peut avoir une forme différente en fonction de la forme de la 5 section du tube utilisé. Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (e) de séparation de la microfibre obtenue à l'étape (d) de la gaine d'alginate. Un autre objet de la présente invention est une microfibre 10 obtenue ou susceptible d'être obtenue à l'issue de l'étape (d) ou de l'étape (e) du procédé selon la présente invention. L'étape (e) du procédé de la présente invention permet d'obtenir une microfibre prête à être utilisée. Cette microfibre peut être utilisée dans le domaine de la modélisation cellulaire 3D in vitro ou dans le domaine 15 médical, notamment en médecine régénératrice que ce soit en orthopédie, chirurgie maxillo-faciale, ou tout autre domaine de médecine régénératrice. Par exemple, les microfibres peuvent être utilisées pour : - la microvascularisation ou l'innervation des tissus issus de l'ingénierie tissulaire, 20 - le patterning de cellules, par exemple de cellules nerveuses ou de cellules souches, pour la régénération tissulaire, - le développement de modèles d'études in vitro, - des applications favorisant la perfusion de modèle tridimensionnel de culture cellulaire in vitro, 25 - le transport de cellules, matériaux d'intérêt biologique, de molécules à intérêt thérapeutique, etc. Chacune des étapes du procédé de la présente invention peut être réalisée à toute température adaptée à la réticulation de l'alginate et/ou la 3 0 substitution du tube creux par la solution content un agent formant un hydrogel et des cellules et/ou la mise en culture et/ou de séparation de la microfibre de la gaine d'alginate. L'homme du métier est à même de 3026954 19 déterminer la température appropriée pour chacune de ces étapes. Par exemple, la température peut être comprise entre 15 et 25 °C, de préférence entre 18 et 22 °C 5 Les microfibres peuvent être associées entre elles. L'association peut avoir lieu entre des microfibres contenant le même type cellulaire ou des types cellulaires différents. La présente invention a également pour objet un substitut comprenant le mélange d'au moins deux microfibres. Par exemple, 10 chacune des microfibres peut comprendre un agent formant un hydrogel, identique ou différent, et des cellules identiques ou différentes. De préférence, les cellules des deux microfibres sont différentes. Par exemple, le substitut peut comprendre un mélange d'au moins deux microfibres, chacune des microfibres comprenant un agent formant un hydrogel et des 15 cellules, les cellules de chacune des microfibres étant différentes d'une microfibre à l'autre. De préférence, les microfibres du substitut ont un diamètre compris entre 50 et 500 pm, en particulier compris entre 100 et 300 pm. De façon préférée, au moins une des microfibres du substitut a une structure ramifiée, c'est-à-dire qu'elle comprend plusieurs parties 20 (bras), de diamètres identiques ou différents. Les microfibres comprises dans le substitut peuvent notamment être obtenues par un procédé selon l'invention. De préférence, le substitut comprenant au moins deux microfibres comprend au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses et au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires.

25 Par exemple, l'au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses et l'au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires sont présentes en un ratio compris entre 2:1 et 1:2. Dans ce cas particulier, le substitut selon l'invention peut être un substitut osseux vascularisé. Cette approche est une approche modulaire où chaque module, 30 présenté sous la forme d'une microfibre correspond à un type cellulaire, à une organisation spécifique et ainsi à une fonction définie.

3026954 20 La présente invention a également pour objet un kit pour la fabrication de microfibre ou d'un substrat pour la fabrication de microfibre. Ce kit peut permettre de mettre en oeuvre le procédé de la présente invention.

5 Selon l'invention, le kit comprend - une solution de réticulation, - un alginate, éventuellement en solution, - un moyen d'injection, - au moins un tube, de préférence un tube creux, adaptable sur 10 l'embout du moyen d'injection de manière à pouvoir injecter un contenu du moyen d'injection. Le contenu du moyen d'injection peut être par exemple une solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Selon l'invention, le kit peut comprendre en outre : 15 - une solution d'agent formant un hydrogel pour la mise en culture de cellules, et/ou - un septum adapté ou adaptable au moyen d'injection et au tube creux. La solution de réticulation, l'alginate, l'agent formant un hydrogel, 20 le moyen d'injection, le tube creux et le septum peuvent être ceux définis dans la présente. Le kit selon la présente invention peut également comprendre une notice d'utilisation.

25 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif et non limitatif. Brève description des figures 3 0 - La figure 1 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire. Ce dispositif comprend un capillaire (« Cap »), un septum (« Sep ») et un embout d'aiguille adaptable sur une seringue (« Emb »). 3026954 21 - La figure 2 représente un schéma de mise en oeuvre des étapes (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le capillaire est immergé successivement dans des solutions de chlorure de calcium (CaCl2) et d'alginate de sodium (« Alg / Na »). A l'issue de ces étapes, une gaine 5 d'alginate réticulé (« Alg / Ca ») est formée à la surface externe du capillaire. - La figure 3 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire dont la surface est recouverte d'une gaine d'alginate réticulé et dont l'extrémité est coupée. Le fait de couper l'extrémité de la gaine 10 permet de libérer l'extrémité creuse du capillaire. - La figure 4 représente un schéma de remplissage d'une seringue à l'aide d'une micropipette contenant une solution constituée d'un agent formant un hydrogel et des cellules. - La figure 5 représente un schéma de mise en oeuvre de l'étape 15 (c) du procédé de la présente invention. L'injection de la solution se fait de manière concomitante au retrait du capillaire de la gaine d'alginate réticulé. - La figure 6 représente une microfibre composée de cellules (« Cel ») à l'intérieur d'une gaine d'alginate réticulé (« Alg / Ca »). « Col » représente du collagène à l'intérieur de la microfibre. 20 - La figure 7 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (JO) et le lendemain (J1) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. 25 - La figure 8 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (JO) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène et à J1, J2, J3, J4, J7, J9 et J14. La microfibre se rétracte au cours du temps 30 pendant l'étape (d) de mise en culture du substrat - La figure 9 représente des vues au microscope à contraste de phase de la microfibre dans la gaine d'alginate réticulé 15 jours après la 3026954 22 substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène (Figure 9A), de la microfibre 1 et 3 jours après avoir été séparée de la gaine d'alginate réticulé et disposée sur un support en plastique contenant un milieu de culture (Figure 9B et 9C respectivement). 5 - La figure 10 représente des vues au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé le jour 1 après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. La figure 10A correspond à une vue transversale, la figure 10B à une vue du dessus et la figure 10C à une vue longitudinale de la microfibre. Le 10 marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules, Marquage FITC du collagène) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et du collagène (« Col »). - La figure 11 représente une vue au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate 7 jours après la substitution du 15 capillaire par la solution de cellules et de collagène. Le marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et l'alignement des cellules dans le sens longitudinal de la microfibre.

20 EXEMPLES Sauf indication contraire, l'ensemble des protocoles présenté dans les exemples ci-dessous a été réalisé en conditions stériles et à température ambiante (environ 20°C).

25 Exemple 1 : Protocole de mise en oeuvre du procédé de la présente invention Un capillaire (ParadigmOptics, Vancouver, USA) de 6cm de longueur et dont la coupe à une forme circulaire et un diamètre moyen 3 0 externe de 200pm a été introduit dans un septum (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) préalablement adapté sur l'embout d'une 3026954 23 aiguille 18 G (Dutscher, Brumath, France) (Figure 1). Ce dispositif a été adapté sur une seringue de 1 ml. Une solution d'alginate a été préparée en mélangeant 2% poids/poids de d'alginate de sodium Protanal LF-10/60 (FMC Biopolymer, 5 Drammen, Norway) dans de l'eau désionisée. Une solution de réticulation a été préparée en ajoutant du chlorure de calcium (Sigma Aldrich) dans de l'eau désionisée de manière à obtenir une concentration de chlorure de calcium de 200mM. Le capillaire a été plongé 2 secondes dans la solution de chlorure 10 de calcium puis 2 secondes dans la solution d'alginate de sodium (Figure 2). Cette opération a été réalisée successivement 15 fois. Une gaine d'alginate de 5 à 7 mm de diamètre a ainsi été obtenue à la surface externe du capillaire. Le capillaire et la gaine d'alginate ont ensuite été immergés dans 15 du Phosphate buffer saline (PBS) 0.1 M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) pendant 15min à température ambiante (environ 20°C). L'extrémité du capillaire gainé par l'alginate réticulé a été coupée afin d'éviter l'obstruction du capillaire (Figure 3). Des cellules D1 de la lignée cellulaire murine D1, ATCC (LGC 20 Standards, Molsheim, France) ont été cultivées sur plastique dans du milieu DMEM à faible concentration de glucose (Gibco, Life Technologies) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Lonza), sous atmosphère contrôlée (5% de CO2, 100% d'humidité, 37 ° C). Une solution d'hydrogel a été préparée à partir de collagène de 25 type I issu de queue de rat (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) selon le protocole du fournisseur, c'est-à-dire en ramenant le pH à 7 et en tamponnant au PBS 1X. Des cellules D1 et de la solution d'hydrogel ont été mélangées de manière à obtenir 30 ml de solution « hydrogel/cellules » par fibre 30 fabriquée, dont la concentration cellulaire est de 50.106 cellules/ml et la concentration de collagène est de 5mg/ml.

3026954 24 Le dispositif de maintien du capillaire a été retiré et 30 pl de cette solution « hydrogel/cellules » ont été prélevés à l'aide d'une micropipette afin de remplir l'extrémité de la seringue (Figure 4). Cette étape a été réalisée de cette manière afin de minimiser les pertes.

5 Le dispositif de maintien du capillaire a été adapté à nouveau sur la seringue. Ensuite, le capillaire a été retiré de la gaine d'alginate réticulé tout en effectuant une pression sur le piston de la seringue afin de substituer la solution « hydrogel/cellules » au capillaire (Figure 5).

10 Une gaine d'alginate réticulé remplie de la solution « hydrogel/cellules » a ainsi été obtenue. Le même mode opératoire a été mis en oeuvre avec des cellules souches de type SCAP et des cellules endothéliales et des microfibres ont été obtenues.

15 Exemple 2: Maturation des cellules présentes dans la solution « hydrogel/cellules » au coeur de la gaine d'alginate réticulé Une gaine d'alginate réticulé obtenue à l'issue de l'exemple 1 a été placée dans un milieu de culture DMEM (Gibco, Life Technologies) en 20 boite de culture 6 puits. La boite a ensuite été placée dans un incubateur à CO2 Thermo Scientific HERAcell (marque déposée) pendant 15 jours. Au bout de ces 15 jours une microfibre de 100 um de diamètre a été obtenue au coeur de la gaine d'alginate réticulé (Figure 6).

25 La microfibre a été séparée de la gaine d'alginate réticulé à l'aide d'une pince et d'une lame de scalpel. Il a été observé que la microfibre s'est compactée dans la gaine d'alginate au cours de l'étape de maturation. Ce phénomène de 3 0 compaction a été mis en évidence par des vues en microscopie à contraste de phase (Figure 7). Une cinétique de compaction a été réalisée de manière à déterminer la vitesse de compaction de la gaine d'alginate 3026954 25 réticulé en fonction du temps de maturation. Les résultats présentés en Figure 8 montrent que le diamètre moyen externe de la microfibre a été divisé par deux en quelques jours.

5 Exemple 3 : Viabilité cellulaire La viabilité cellulaire a été vérifiée en disposant la microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé dans un puits de culture en plastique (NUNC (marque déposée)) contenant un milieu de culture DMEM.

10 II a été observé que les cellules de la microfibre étaient capables de coloniser le fond du puits dès le premier jour après la séparation de la microfibre de la gaine d'alginate réticulé. La colonisation s'est poursuivie également 3 jours après la séparation (Figure 9).

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2010 Feb;16(2):585-94 25

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un substrat pour la production d'une microfibre, comprenant les étapes successives suivantes : a. mise en contact d'un tube avec une solution de réticulation, b. mise en contact du tube avec une solution d'alginate, la solution d'alginate formant alors une gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube, c. substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, formant ainsi un substrat comprenant une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre l'étape suivante : d. mise en culture du substrat obtenu à l'issue de l'étape (c) permettant le développement des cellules dans le canal, produisant ainsi une microfibre à l'intérieur de la gaine d'alginate réticulé.
3. 3. Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre l'étape suivante : e. séparation de la microfibre obtenue à l'étape (d) de la gaine d'alginate.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement plusieurs fois avant l'étape (c) de substitution du tube par la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. 3 0
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre, préalablement à l'étape (c), une étape (b1) de mise 3026954 29 en contact du tube recouvert par la gaine d'alginate réticulé avec une solution tampon.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans 5 lequel la solution de réticulation comprend un cation divalent choisi dans le groupe comprenant Ca2+, Mg2+, Ba2+ et Sr2+, ou un mélange d'au moins deux de ces cations divalents.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans 10 lequel l'agent formant un hydrogel est choisi dans le groupe comprenant le collagène de type 1 à 19, modifié ou non, la gélatine, la fibrine, l'acide hyaluronique, le chitosan et le mélange d'au moins deux de ces agents formant un hydrogel. 15
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la solution d'alginate est une solution d'alginate de sodium comprenant de 0,5 à 10% en poids d'alginate de sodium par rapport au poids total de la solution d'alginate. 20
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les cellules sont des cellules choisies dans le groupe comprenant les cellules souches mésenchymateuses, les cellules somatiques endothéliales, les cellules progénitrices de type vasculaire, ostéoblastique ou nerveux, et du mélange d'au moins deux de ces catégories cellulaires. 25
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le tube a un diamètre moyen externe compris entre 50 et 1000pm.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, 3 0 dans lequel le tube est un capillaire de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle, de polystyrène, de polyéthylène téréphtalate glycolisé, de 3026954 polyphenylsulfone, de polysulfone, de polymère d'oléofine polycyclique, de polytetrafluoroéthylène ou de polypropylène.
12. 12. Substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.
13. 13. Kit pour la fabrication de microfibre ou d'un substrat pour la fabrication de microfibre, comprenant : - une solution de réticulation, de l'alginate, un moyen d'injection, au moins un tube creux adaptable sur l'embout du moyen d'injection de manière à pouvoir injecter un contenu du moyen d'injection.
14. 14. Tube, de préférence tube creux, recouvert d'une gaine d'alginate réticulé, susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape (b) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel le tube a un diamètre moyen externe compris entre 50 et 1000pm.
15. 15. Substitut susceptible d'être obtenu selon le procédé tel que défini dans la revendication 2 ou l'une quelconque des revendications 4 à 11 lorsqu'elles dépendent de la revendication 2, comprenant un mélange d'au moins deux microfibres, chacune des microfibres comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, les cellules de chacune des microfibres étant différentes d'une microfibre à l'autre.