WO2016039279A1 - 皮膚付属器官を有する全層皮膚の製造方法 - Google Patents

皮膚付属器官を有する全層皮膚の製造方法 Download PDF

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孝 辻
公栄 豊島
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing full thickness skin having a skin appendage and a full thickness skin having the produced skin appendage.
  • a method for producing artificial skin having a skin appendage for example, a method has been attempted in which adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts are co-cultured at a skin excision site such as a nude mouse (Patent Document 1). ).
  • the skin appendage is partially induced, the induced skin appendage becomes inseparable from the skin of the nude mouse and is derived from stem cells including the skin appendage. It was difficult to obtain full-thickness skin (that is, skin tissue including at least epidermal layer, dermis layer, and subcutaneous tissue). The present inventors paid attention to this technical problem and attempted to develop a method for efficiently producing full-thickness skin having a skin appendage derived from a purely intended individual.
  • the present inventors stimulated the embryoid body using a physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway, combined with a scaffold material, and then transplanted to an animal.
  • a physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway capable of activating the Wnt pathway
  • a scaffold material capable of activating the Wnt pathway
  • the present invention is a method for producing full-thickness skin having skin appendages
  • the “full thickness skin having skin appendages” is at least the following (1) to (3); (1) skin including epidermis and dermis layers (2) including at least one skin appendage (3) subcutaneous tissue;
  • the method comprises the following steps: (A) stimulating the embryoid body with a bioactive substance capable of activating the Wnt pathway; (B): preparing a conjugate comprising the following (A) and (B); (A) All or part of the embryoid body stimulated in step (a) (B) Scaffold material (c): transplanting the conjugate prepared in step (b) to an animal, and (D): producing a full-thickness skin derived from the conjugate in the animal;
  • a method is provided, comprising:
  • the animal is a non-human animal.
  • the non-human animal is a non-human immunodeficient animal.
  • the Wnt path is a classic Wnt path.
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” is Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10b, and TGF-. It is selected from the group consisting of ⁇ .
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” may be, for example, a Wnt receptor agonist.
  • the embryoid body is an embryoid body prepared from iPS cells or ES cells.
  • the scaffold material is a collagen gel.
  • the transplant is a transplant under the renal capsule.
  • a full-thickness skin having a skin appendage manufactured by any of the above methods is provided.
  • full-thickness skin having skin appendages can be produced frequently in a teratoma derived from pluripotent stem cells. Since the full-thickness skin produced by the method of the present invention has a functional skin appendage similar to an animal body, it can be suitably used for, for example, pharmacological tests and safety tests of cosmetics and pharmaceuticals. Further, for example, by producing the full-thickness skin of the present invention using pluripotent stem cells derived from various individuals (for example, derived from individuals having different races, skin colors, ages, sexes, etc.), cosmetics and pharmaceuticals Appropriate pharmacological tests and safety tests can be performed according to the target. In addition, the full-thickness skin produced by the method of the present invention has a very low risk of causing a tumor when transplanted to the skin of an animal, and can be suitably used for transplantation into a living body.
  • FIG. 1 shows an HE-stained image of a teratoma formed by transplanting an embryoid body subjected to Wnt10b stimulation into a living body.
  • the left figure shows skin-like tissue containing ectodermal cyst hair follicles, and the right figure shows mucosal-like tissue.
  • FIG. 2A shows a schematic diagram of a method for forming a teratoma containing various organs, which is an embodiment of the present invention.
  • Embryoid bodies were formed from iPS cells, arranged three-dimensionally in a collagen gel, and then transplanted into adults to form teratomas.
  • FIG. 2B shows the classification of the various organs formed in the teratoma.
  • Each of the figures a to d shows typical histological images of a: skin-like tissue, b: mucosal-like tissue, c: cyst tissue consisting of transitional epithelium, and d: cyst tissue consisting of endoderm epithelium.
  • Cyst cyst cavity
  • Epi epithelial tissue
  • Der dermal tissue
  • Ad adipose tissue
  • LP lamina intestinal
  • SM smooth muscle tissue.
  • the cystic epithelial tissue of c is composed of a single-layered columnar epithelium including squamous stratified epithelium (*) and goblet cells (arrows).
  • FIG. 2C shows the frequency of organs induced by teratoma derived from an embryoid body subjected to Wnt10b stimulation (Dark bar), and the frequency of organs induced by teratoma derived from an embryoid body not stimulated by Wnt10b (Light bar). It is the graph which compared.
  • FIG. 3 shows a tissue image of a secretory gland-like structure induced by a teratoma derived from an embryoid body subjected to Wnt10b stimulation.
  • FIG. 4 is a photograph showing the course after transplantation of full-thickness skin containing iPS-induced hair follicles into nude mice.
  • FIG. 5 shows the analysis of the hair cycle of hair derived from iPS-induced hair follicles. Hair follicle growth of hair follicles induced from iPS cells was observed over time.
  • FIG. 6 shows the result of fluorescence in situ hybridization (FISH) in which the Y chromosome is labeled on the tissue developed from the transplantation site of the iPS-induced hair follicle.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • FISH shows a weakly enlarged image of the Y chromosome FISH of the entire tissue transplanted into nude mice and the surrounding host skin.
  • DIC is a differential interference image of the tissue shown by FISH, and the arrow indicates iPS-induced hair containing melanin pigment.
  • the tissue region is indicated by white squares, and ad is an enlarged photograph.
  • White dots in the figure are Y chromosomes detected by FISH.
  • FIG. 7 is an immunostained image showing that the stem cell niche is reproduced in the tissue developed from the transplantation site of the iPS-induced hair follicle.
  • FIG. 7a and 7b show double immunostaining images with anti-CK15 antibody and anti-CD34 antibody, which are hair follicle epithelial stem cell markers.
  • FIG. 7a is a weakly magnified image of a full-thickness skin transplantation site including an iPS-induced hair follicle, and the area surrounded by a dotted line shows the transplanted tissue.
  • FIG. 7b shows an enlarged image of the area surrounded by the white square in FIG. 7a.
  • the arrow in FIG. 7b shows the outer follicular root sheath co-stained with anti-CK15 and anti-CD34 antibodies.
  • FIG. 7 d show immunostained images for Lrig1 which is a sebaceous gland progenitor cell marker and CK15 which is an epithelial stem cell marker.
  • the range of the dotted line in FIG. 7c represents the transplanted tissue.
  • An enlarged photograph of the range surrounded by the white square in FIG. 7c is shown in FIG. 7d, Lrig1-positive cells are indicated by arrows and CK15-positive cells are indicated by arrowheads.
  • SG represents a sebaceous gland.
  • FIG. 7e shows an immunostained image using an anti-Lgr6 antibody. Lgr6 is expressed in the outer root sheath (arrow) near the sebaceous gland attachment site.
  • FIG. 7f shows an immunostained image using anti-Lgr5 antibody.
  • Lgr5 is expressed in the variable region of the growing hair follicle, and is strongly expressed particularly in epithelial cells (arrows) near the hair matrix region.
  • FIG. 8 is a diagram showing that the iPS-induced hair follicle is connected to the napped muscle and the nerve in the tissue developed from the implantation site of the iPS-induced hair follicle.
  • the full-thickness skin containing iPS-derived hair follicles was transplanted to the back of nude mice, and when the iPS cell-derived hair follicle reached the third growth phase, the tissue was collected to prepare a tissue section having a thickness of 100 ⁇ m. .
  • FIG. 8a A fluorescent immunostained image (FIG. 8a) with an antibody that recognizes calponin as a smooth muscle marker and neurofilament H (NF-H) as a nerve fiber marker, and a stereoscopic microscope image (FIG. 8b) with transmitted light of the same section, respectively.
  • FIG. 8b A hair follicle (FIG. 8b, black arrow) in which a hair shaft having a melanin pigment is observed in the hair follicle by a stereoscopic microscope image indicates that it is derived from iPS cells.
  • FIG. 8c An enlarged view of the region containing the hair follicle derived from the host hair follicle
  • FIG. 8d An enlarged view of the region containing the hair follicle derived from the host hair follicle
  • FIG. 8d An enlarged view of the region containing the hair follicle derived from the host hair follicle (FIG. 8c, Host) and iPS cells (FI
  • pluripotent stem cell refers to a cell having both the pluripotency capable of differentiating into any cell of the living body and the self-replicating ability capable of maintaining the pluripotency even after differentiation and proliferation, for example, ES cell And iPS cells.
  • ES cell Embryonic Stem cells
  • stem cell line made from an inner cell mass belonging to a part of an embryo at the blastocyst stage, which is an early stage of animal development, and is extremely numerous. It has the pluripotency capable of differentiating into cells and the self-replicating ability that can maintain pluripotency even after dividing proliferation.
  • the origin of ES cells that can be used in the present invention is not particularly limited, and ES cells derived from the inner cell mass of any animal can be used.
  • ES cells derived from the inner cell mass of humans, mice, rats, pigs, monkeys can be used as the origin of ES cells.
  • an “iPS cell (induced Pluripotent Stem cells)” is a universal differentiation that can differentiate into so many cells like ES cells by introducing several types of genes and / or drugs into somatic cells. A cell that has sex and self-replicating ability to maintain pluripotency even after dividing proliferation.
  • the origin of iPS cells that can be used in the present invention is not particularly limited, and iPS cells derived from any animal can be used.
  • iPS cells derived from humans, mice, rats, pigs, and monkeys can be used as the origin of iPS cells.
  • somatic cells derived from iPS cells that can be used in the present invention are not particularly limited, and iPS cells derived from cells derived from any tissue can be used.
  • the iPS cell induction method that can be used in the present invention is not particularly limited, and any method can be used as long as it can induce iPS cells from somatic cells. be able to.
  • the method for culturing pluripotent stem cells without differentiation is not particularly limited, and a person skilled in the art can appropriately select a culture environment or medium known in the art or a culture environment or medium equivalent thereto.
  • a culture environment or medium known in the art or a culture environment or medium equivalent thereto For example, mouse embryo fibroblasts (MEF) can be used as feeder cells for culturing pluripotent stem cells.
  • MEF mouse embryo fibroblasts
  • a medium for culturing pluripotent stem cells a medium generally used for culturing pluripotent stem cells can be used, and the composition thereof is not particularly limited.
  • teratoma is a well-differentiated germ cell tumor having a bi- or tri-germ component, and is also referred to as a malformed species.
  • the “teratoma” in the present invention also includes a structure histologically similar to a deformed species that can be generated when pluripotent stem cells are transplanted into a living body. Teratomas can occur naturally in vivo, but can also be generated artificially by transplanting pluripotent stem cells into animals.
  • the site for transplanting cells into an animal is not particularly limited, and for example, it can be transplanted under the kidney capsule, subcutaneous, or testis of an animal.
  • the method for transplanting cells into an animal is not particularly limited.
  • the kidney capsule of a mouse an incision of 2 to 3 mm is made in the kidney capsule, and the kidney capsule and the kidney parenchyma are peeled off. In the meantime, cells can be transplanted.
  • a method for confirming that teratoma is formed in an animal transplanted with pluripotent stem cells is not particularly limited.
  • a laparotomy is performed 3 to 4 weeks after transplantation to form a tumor in appearance. This can be confirmed by visual inspection.
  • analyzing the tumor histologically it is possible to confirm the formation of trigerminal tissue that is characteristic of teratomas.
  • full thickness skin refers to a layered tissue structure including at least the following (1) to (3).
  • Skin including epidermis and dermis layers (2) At least one kind of skin appendage (3)
  • the “skin appendage organ” means a keratinous organ and an exocrine gland that are connected to the epidermis layer constituting the skin via an epithelial tissue and have a specific function, although not limited thereto.
  • the skin appendage in this specification means organs distributed in the skin such as hair follicles, nails, sebaceous glands, sweat glands, and mammary glands, but is not limited thereto.
  • subcutaneous tissue refers to a tissue that supports the skin and skin appendages and connects them to other organ systems.
  • a skin muscle layer composed of subcutaneous adipose tissue and smooth muscle tissue, collagen A connective tissue composed of fibers and elastic fibers is included, but is not limited thereto.
  • organ primordium refers to a region of an embryo or a structure of an embryo that is determined to develop in a specific organ as the developmental stage proceeds in a living body, and is simply referred to as “primitive primordium”. There is also. Almost all organs in a living body are generated from organ primordia derived from epithelial stem cells and mesenchymal stem cells by a fetal development program, and develop into a predetermined position and a predetermined number.
  • the method for confirming that the target full-thickness skin is formed in the teratoma is not particularly limited.
  • the teratoma is opened and the skin appendages (for example, hair follicles, nails, sebaceous glands, sweat glands) It can be confirmed by looking for a structure that seems to be full-thickness skin having a mammary gland).
  • a tissue section of teratoma can be prepared and confirmed to be a predetermined organ from the tissue structure.
  • it can be analyzed by an in situ hybridization method that a gene expressed in each organ is expressed at an appropriate site.
  • embryoid body refers to a cell mass formed when pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are cultured in suspension. Embryoid bodies may take the form of embryos and may be composed of various tissues.
  • the method for producing an embryoid body that can be used in the present invention is not particularly limited. For example, a method of seeding pluripotent stem cells on a low-adhesion plate, or hanging a droplet of a cell suspension of pluripotent stem cells. The hanging drop method according to, and the method of suspension culture while shaking the culture dish of pluripotent stem cells can be used.
  • iPS cells when an embryoid body is prepared by seeding iPS cells on a low adhesion plate, iPS cells are 1500 cells to 10000 cells / 200 ⁇ l / well, more preferably 2000 cells to 4000 cells / 200 ⁇ l / well.
  • An embryoid body can be produced by seeding on an adhesive plate and culturing. If the number of cells to be seeded is less than 1500 cells / 200 ⁇ l / well, the embryoid body may not be formed properly, and if it exceeds 10,000 cells / 200 ⁇ l / well, necrosis due to lack of nutrition may occur inside the embryoid body.
  • the embryoid bodies used in the present invention are from the start of suspension culture, but, for example, those from 5 to 9 days from the start of suspension culture can be suitably used. .
  • an embryoid body when used for transplantation, all or part of the embryoid body can be used for transplantation.
  • the embryoid body can be used for transplantation as it is, or only part of the embryoid body can be used for transplantation.
  • the method for separating only the surface tissue from the embryoid body is not particularly limited.
  • the surface tissue of the embryoid body can be physically collected by microsurgery using a syringe under a stereomicroscope.
  • scaffold material expresses various cell functions such as cell adhesion, proliferation, differentiation, activation, migration, migration, and morphological change by contacting the material with the cell on or within the material. It refers to all materials that can be promoted and is not particularly limited as long as it is suitable for transplanting pluripotent stem cells.
  • a collagen gel can be used as the scaffold material, and preferably, a type I collagen gel, a type III collagen gel, a type IV collagen gel, and a matrigel can be used.
  • Transplanting pluripotent stem cells in a scaffold material prevents pluripotent stem cells from dissipating in the transplanted tissue and becomes a scaffold for tissue survival Full thickness skin can be produced in the teratoma.
  • the embryoid body can be transplanted in a collagen gel while maintaining a desired three-dimensional arrangement.
  • the full-thickness skin can be produced in the teratoma more efficiently.
  • a method for producing a conjugate including “all or part of an embryoid body” and a scaffold material It may be used for transplantation after the scaffold material is combined with “all or part of the embryoid body” in vitro.
  • the scaffold material is introduced into the body and then “all or part of the embryoid body”. May be combined by injection and transplantation may be performed.
  • the collagen gel and the embryoid body are put into a sol-like collagen gel and solidified. A combination with all or a part of can be produced.
  • the “physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway” may be, for example, a physiologically active substance capable of activating the classic Wnt pathway (also referred to as ⁇ -catenin pathway). It may be a physiologically active substance that can activate a pathway (in-plane cell polarity pathway; also referred to as PCP pathway or Ca2 + pathway). Examples of physiologically active substances that can activate the classical Wnt pathway include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10b, and TGF- ⁇ .
  • Wnt10b can activate the classical Wnt pathway ( ⁇ -catenin pathway) is described, for example, in Maksim V. Plikus et al. (Science 332, 586 (2011)), and Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt6, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b can activate the classical Wnt pathway ( ⁇ -catenin pathway), and Wnt4, Wnt5a, Wnt11 can activate the nonclassical Wnt pathway, for example, Kemp et al. Functional Development and Embryology 1 (1), 1-13 (2007)), TGF- ⁇ stabilizes ⁇ -catenin expression in dermal fibroblasts, for example, Sato (Acta Derm Venereol 2006; 86: 300-307).
  • the type of animal into which cells are transplanted is not particularly limited, and any animal can be used for transplantation.
  • non-human animals such as pigs, cows, monkeys, baboons, dogs, cats, rats, and mice can be used for transplantation to avoid ethical problems that arise when cells are transplanted into humans.
  • rejection due to the immune function of the living body can be prevented, and a teratoma can be produced efficiently.
  • a teratoma derived from a cell of another species can be produced in the living body of the non-human immunodeficient animal.
  • a human cell-derived teratoma can be produced in the living body of the non-human immunodeficient animal.
  • an “immune-deficient animal” refers to an animal that lacks part or all of the immune function of a living body, and the type of immune function that is deficient is not particularly limited, but is derived from other species of animals transplanted into the living body. Animals lacking immune function are preferred so as not to exclude the cells or tissues.
  • SCID mice nude mice, NOD mice, NOD-SCID mice, IL-2Rg knockout mice, RAG2 knockout mice, NOG mice, RAG2 / IL-2Rg double knockout mice
  • SCID mice nude mice, NOD mice, NOD-SCID mice, IL-2Rg knockout mice, RAG2 knockout mice, NOG mice, RAG2 / IL-2Rg double knockout mice
  • SCID mice nude mice, NOD mice, NOD-SCID mice, IL-2Rg knockout mice, RAG2 knockout mice, NOG mice, RAG2 / IL-2Rg double knockout mice
  • SCID mice can be used.
  • a method for extracting a desired organ from the teratoma is not particularly limited, but for example, it can be extracted by microsurgery.
  • first, second, etc. may be used to represent various elements, but these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • the medium was changed every day, and on the second day after subculture, subculture was performed using a solution in which 0.25% Trypsin-1 mM EDTA (Invitrogen) was added to D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque).
  • SNLP76.7-4 feeder cells were cultured on gelatin-coated dishes in 0.1% gelatin aqueous solution at 37 ° C. for 2 hours or more.
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM without sodium pyruvate; Nacalai Tesque), 7% fat bovine serum, 50 units / mL penicillin, 50 units / mL penicillin Medium was used.
  • Mitomycin C was added to the medium to a final concentration of 12 ⁇ g / ml, and SNLP76.7-4 feeder cells were reacted at 37 ° C. for 2 hours and 15 minutes to treat mitomycin of SNLP76.7-4 feeder cells. .
  • the reacted cells were seeded on a gelatin-coated dish at 2.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . What was cultured for 24 hours or more after mitomycin treatment was used as a feeder cell for co-culture with iPS cells.
  • Wnt10b 0.1 mg / mL Wnt10b (R & D) in PBS was added as a stock to the medium for iPS cells to 1 ⁇ g / mL.
  • Half of the Well medium in which embryoid bodies were formed was discarded, and half of the medium was replaced with a medium for iPS cells containing Wnt10b (final concentration 500 ng / mL).
  • Embryoid bodies in Wnt10b-added medium were cultured for 24 hours in a CO 2 incubator.
  • Adipose tissue was distributed in the sphere direction.
  • the epidermis layer of the cyst is a typical skin because the basal cell layer, curved cell layer, granule layer, and stratum corneum are regularly arranged, and the stratum corneum is separated into a clear layer toward the cyst cavity. It was shown to be epidermal tissue. It was shown that the hair shaft grew from the opening of the hair follicle toward the cyst lumen (FIG. 1, black arrow). The connection site between the sebaceous gland and the hair follicle is the hair follicle funnel or the opening of the pore (FIG. 1, left white arrowhead), suggesting that sebum can be secreted into the outer epidermis via the pore.
  • Tissue section of teratoma (FIG. 2A) formed under mouse kidney capsule by HE staining by the method described in (3) to (5) From the histological characteristics of the formed cyst epithelium and surrounding stromal tissue, skin-like (squamous keratinized epithelial layer / dermis layer / fatty or striated muscle), mucosal-like (squamous stratified horn epithelium / Classified into mucosal lamina (striated muscle), transitional epithelium (transitional form of flat stratified keratinized epithelium and monolayer columnar epithelium), endoderm epithelial (monolayer columnar epithelium / mucosal lamina / striated muscle) The composition ratio was measured (FIG.
  • iPS cell The entire skin including hair follicles induced by in vivo transplantation was removed, cut into hair groups, and transplanted into nude mouse skin (in the present specification, iPS cells were obtained by the method of the present invention).
  • the hair follicle derived from is called “iPS-induced hair follicle”, and the hair induced by the implantation of the iPS-derived hair follicle is called “iPS-induced hair follicle”).
  • the hair shafts of the hair shafts were identified from the transplanted group, it was shown that the hair shafts contained Zigzag, Awl, and Guard hairs contained in the body hair. Therefore, the hair shaft growth was traced to the third hair cycle for each hair type, and the hair shaft growth period, hair shaft growth pause and hair loss period length were analyzed, and it was shown that the same periodicity as adult hair was repeated. (FIG. 5). From these results, it was suggested that the iPS-induced hair reproduces the living body stem cell niche and repeats the hair cycle permanently.
  • the full-thickness skin including skin appendages such as hair follicles was composed of Y-chromosome positive cells, that is, cells derived from iPS cells (FIG. 6).
  • the epithelial layer connected to the hair follicle was positive for the Y-chromosome, whereas no Y-chromosome was detected in the host tissue.
  • iPS-induced hair has been shown to build an epithelial stem cell niche.
  • the outer root sheath cells of the hair follicle variable part and the Lgr5-positive cells that are hair matrix precursor cells are distributed below the Auber's critical line of the hair matrix, and in the resting hair follicles, the Lgr5-positive cells are secondary. It is known to localize to hair buds.
  • Lgr6 and Lrig1 positive cells are localized near the sebaceous gland attachment part from the upper part of the bulge.
  • the iPS-induced hair follicle is a colored hair and can be distinguished from the host hair follicle
  • the iPS-induced hair follicle was identified from the host hair follicle, and nerve fibers and napped muscle connections were analyzed by immunostaining.
  • calponin-positive napped muscles were connected to the bulge region (FIG. 8, arrow), and nerve fibers were connected thereto (FIG. 8, arrowhead).
  • the nerve-hair follicle junction was observed in the subbulge epithelium (FIG. 8). Neural fiber connections were seen around the bulge region, and nerve endings were distributed in the ORS outermost layer of the bulge region, and a nerve-hair follicle junction was seen (FIG. 8).
  • the method of the present invention it is possible to artificially manufacture full-thickness skin having skin appendages efficiently.
  • the full-thickness skin produced by the method of the present invention has a very low risk of causing a tumor by transplantation, and has been shown to be extremely promising as an organ formation technique on the premise of transplantation into a living body.

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Abstract

　【課題】　皮膚付属器官を有する全層皮膚を効率的に製造する方法を提供する。　【解決手段】　皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造する方法であって、前記方法は、次のステップ（ａ）～（d）；（ａ）胚様体を、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で刺激するステップ、（ｂ）：ステップ（ａ）で刺激を行った前記胚様体の全部または一部、および、足場材料、を含む結合体を調製するステップ；（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で調製した前記結合体を動物に移植するステップ、および、（ｄ）：前記動物中において、前記結合体由来の全層皮膚を製造するステップ、を含むことを特徴とする、方法を提供する。

Description

皮膚付属器官を有する全層皮膚の製造方法
　本発明は、皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造する方法、および、製造された皮膚付属器官を有する全層皮膚に関する。
　化粧品の開発や、皮膚に対する医薬品の開発においては、マウスやラット等を用いた薬理試験／安全性試験が行われる。しかし、近年、動物福祉の観点から、動物実験の代替法の開発が世界的に求められている。
　動物実験の代替法としては、培養細胞を用いた代替試験法や、動物の表皮や真皮を模した細胞シートを用いた代替試験法が開発されているが、これらの代替皮膚は、動物の皮膚が有する皮膚付属器官（例えば、毛包、爪、皮脂腺、汗腺、乳腺等）を含まない。皮膚付属器官を有しない代替皮膚は、皮脂や汗等の分泌がないため皮膚のバリア機能に乏しく、生体に近い試験結果を得ることは難しかった。また、皮膚付属器官を有しない代替皮膚では、化粧品や医薬品の皮膚付属器官自体に対する影響についての試験結果を得ることもできなかった。
　皮膚付属器官を有する人工皮膚を製造する方法としては、例えば、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および、繊維芽細胞をヌードマウス等の皮膚切除部位において共培養する方法が試みられている（特許文献１）。
特開２００９－１１５８８
　例えば上記の特許文献１に記載のような方法では、部分的に皮膚付属器官は誘導されるものの、誘導された皮膚付属器官はヌードマウスの皮膚と一体不可分となり、皮膚付属器官を含む、幹細胞由来の全層皮膚（すなわち、少なくとも表皮層、真皮層、皮下組織を含む皮膚組織）を得ることは困難であった。本発明者らは、この技術的課題に着目し、純粋に目的とする個体由来の、皮膚付属器官を有する全層皮膚を効率的に製造する方法を開発することを試みた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、Wnt経路を活性化させ得る生理活性物質を用いて胚様体を刺激し、足場材料と結合させたうえで動物へ移植することにより、効率的に皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造することができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　すなわち、本発明は、皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造する方法であって、
　前記「皮膚付属器官を有する全層皮膚」は、少なくとも下記（１）～（３）；
（１）表皮層と真皮層を含む皮膚
（２）少なくとも１種類の皮膚付属器官
（３）皮下組織
を含み、
　前記方法は、下記ステップ；
　（ａ）胚様体を、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で刺激するステップ、
　（ｂ）：下記（Ａ）および（Ｂ）を含む結合体を調製するステップ；
　　（Ａ）ステップ（ａ）で刺激を行った前記胚様体の全部または一部
　　（Ｂ）足場材料
　（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で調製した前記結合体を動物に移植するステップ、および、
　（ｄ）：前記動物中において、前記結合体由来の全層皮膚を製造するステップ、
を含むことを特徴とする、方法を提供する。
　また、本発明の一実施態様においては、前記動物が非ヒト動物であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記非ヒト動物が非ヒト免疫不全動物であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記Ｗｎｔ経路が古典的Ｗｎｔ経路であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βからなる群から選択されることを特徴とする。また、前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」は、例えば、Ｗｎｔ受容体アゴニストであってもよい。
　また、本発明の一実施態様においては、前記胚様体が、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から作製された胚様体であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記足場材料が、コラーゲンゲルであることを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記移植が、腎皮膜下への移植であることを特徴とする。
　本発明の別の実施態様では、上記のいずれかの方法によって製造される、皮膚付属器官を有する全層皮膚を提供する。
　以上の本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせたものも、本発明に含まれることはいうまでもない。
　本発明に係る全層皮膚の製造方法によれば、多能性幹細胞由来のテラトーマ内に、高頻度に皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造することができる。本発明の方法により製造された全層皮膚は、動物の生体と同様に機能的な皮膚付属器官を有するため、例えば化粧品や医薬品の薬理試験や安全性試験に好適に用いることができる。また、例えば、様々な個体由来（例えば、人種、肌の色、年齢、性別等の異なる個体由来）の多能性幹細胞を用いて本発明の全層皮膚を製造することにより、化粧品や医薬品のターゲットに応じた、適切な薬理試験や安全性試験を行うことができる。
　また、本発明の方法により製造された全層皮膚は、動物の皮膚への移植によって腫瘍を引き起こす危険性が極めて低く、生体への移植にも好適に用いることができる。
図１は、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体を生体に移植して形成されたテラトーマのＨＥ染色像を示す。左図は外胚葉性嚢胞毛包を含む皮膚様組織を示し、右図は粘膜様組織を示す。 図２Ａは、本発明の一実施形態である、様々な器官を内包するテラトーマの形成方法の模式図を示す。ｉＰＳ細胞より胚様体を形成して、コラーゲンゲル内において三次元的配置した後に、成体内へ移植してテラトーマを形成した。またＷｎｔ１０ｂ刺激は胚様体形成７日目より２４時間行い、その後三次元配置を行った。図２Ｂは、テラトーマ内に形成された各種器官の分類を示す。ａ～ｄの各図は、それぞれａ：皮膚様組織、ｂ：粘膜様組織、ｃ：移行上皮よりなる嚢胞組織、およびｄ：内胚葉性上皮よりなる嚢胞組織の典型的組織像を示す。図中の各記号は、Ｃｙｓｔ：嚢胞腔、Ｅｐｉ：上皮組織、Ｄｅｒ：真皮組織、Ａｄ：脂肪組織、ＬＰ：粘膜固有層、ＳＭ：平滑筋組織をそれぞれ示す。ｃの嚢胞上皮組織は扁平重層上皮（＊）と杯細胞（矢印）を含む単層円柱上皮より構成される。図２Ｃは、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマに誘導される器官の頻度（Ｄａｒｋ　ｂａｒ）と、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わない胚様体由来のテラトーマに誘導される器官の頻度（Ｌｉｇｈｔ　ｂａｒ）を比較したグラフである。図２Ｄは、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに誘導される毛包形成数（Ｄａｒｋ　ｂａｒ）と、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わない胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに誘導される毛包形成数（Ｌｉｇｈｔ　ｂａｒ）を比較したグラフである。 図３は、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体由来のテラトーマに誘導された分泌腺様構造の組織像を示す。左図はＨＥ染色像、中央の図は抗アミラーゼ抗体による免疫染色像、右図は抗Ｅカドヘリン抗体による免疫染色像を示す。図中の矢印は腺房様組織における細胞質内の顆粒状のアミラーゼを示す。図中の点線の範囲が腺房組織の範囲を示し、図中の「Ｄ」は、近接した導管様構造を示す。 図４は、ｉＰＳ誘導毛包を含む全層皮膚をヌードマウスに移植した後の経過を示した写真である。ｉＰＳ細胞より誘導された毛包を含む皮膚様嚢胞を分離して、２０本程度の毛包を含む全層皮膚として切り分けてヌードマウス背部皮膚へ移植し、移植後の毛幹成長を経時的に観察した。写真は３カ所に移植した毛包を含む全層皮膚より成長した毛幹の追跡例を示す。 図５は、ｉＰＳ誘導毛包由来の毛の毛周期を解析した図を示す。ｉＰＳ細胞より誘導された毛包の毛幹成長を経時的に観察した。成長毛の毛穴を識別して、第１から第３毛周期までの、毛成長期間および毛成長休止および脱毛期間の日数を計測した。追跡毛の最大成長期における拡大写真より毛種（Ｚｉｇｚａｇ毛、Ａｗｌ／Ｇｕａｒｄ毛、および体毛の形態的な定義により識別できない毛は「体毛定義外」と記述）を判別した。黒丸は毛幹が成長している期間の日数を示し、白丸は毛成長停止および脱毛している期間の日数を示す。 図６は、ｉＰＳ誘導毛包の移植部位から発達した組織に対する、Ｙ染色体を標識した蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）の結果を示す。「ＦＩＳＨ」と記載された図は、ヌードマウスへ移植した組織の全域と周辺のホスト皮膚のＹ染色体ＦＩＳＨの弱拡大像を示す。「ＤＩＣ」と記載された図は、ＦＩＳＨで示した組織の微分干渉像であり、矢印はメラニン色素を含むｉＰＳ誘導毛を示す。ＦＩＳＨの弱拡大像において組織領域を白四角により示し、ａ－ｄに拡大写真を示す。図中の白色ドットがＦＩＳＨによって検出されたＹ染色体である。 図７は、ｉＰＳ誘導毛包の移植部位から発達した組織において、幹細胞ニッチが再現されていることを示した免疫染色像である。図７ａおよび図７ｂは、毛包上皮幹細胞マーカーである抗ＣＫ１５抗体と抗ＣＤ３４抗体による二重免疫染色像を示す。図７ａはｉＰＳ誘導毛包を含む全層皮膚移植部位の弱拡大像であり、点線で囲まれた範囲が移植組織を示す。図７ａの白四角で囲んだ範囲の拡大像を図７ｂで示す。図７ｂの矢印は、抗ＣＫ１５抗体と抗ＣＤ３４抗体により共染色された毛包外毛根鞘を示す。図７ｃと図７ｄは皮脂腺前駆細胞マーカーであるＬｒｉｇ１および上皮幹細胞マーカーであるＣＫ１５に対する免疫染色像を示す。図７ｃ中の点線の範囲が移植組織を表す。図７ｃの白四角により囲まれた範囲の拡大写真を図７ｄで示し、Ｌｒｉｇ１陽性細胞を矢印、ＣＫ１５陽性細胞を矢尻で示す。図中、ＳＧは皮脂腺を表す。図７ｅは、抗Ｌｇｒ６抗体を用いた免疫染色像を示す。Ｌｇｒ６は皮脂腺付着部付近の外毛根鞘（矢印）に発現している。図７ｆは、抗Ｌｇｒ５抗体を用いた免疫染色像を示す。Ｌｇｒ５は成長期毛包の可変領域において発現を認め、特に毛母領域付近の上皮細胞（矢印）において強く発現している。 図８は、ｉＰＳ誘導毛包の移植部位から発達した組織において、ｉＰＳ誘導毛包が立毛筋および神経と接続していることを示した図である。ｉＰＳ由来の毛包を含む全層皮膚をヌードマウス背部へ移植して、ｉＰＳ細胞由来毛包が第３回目の成長期となった時点で組織を採取して、１００μｍ厚の組織切片を作製した。平滑筋マーカーであるカルポニンおよび神経繊維マーカーであるニューロフィラメントＨ（ＮＦ－Ｈ）を認識する抗体による蛍光免疫染色像（図８ａ）、および同一切片の透過光による実体顕微鏡像（図８ｂ）をそれぞれ示す。実体顕微鏡像により毛包内にメラニン色素を有する毛幹が見られた毛包（図８ｂ，黒矢印）はｉＰＳ細胞由来であることを示す。弱拡大像の白四角の範囲中、ホスト毛包（図８ｃ，Ｈｏｓｔ）およびｉＰＳ細胞由来の毛包を含む領域（図８ｄ，ｉＰＳ１および図８ｅ，ｉＰＳ２）を拡大したものを、ｃ－eで示す。それぞれの毛包に接続する、カルポニン陽性の立毛筋（白矢印）およびＮＦ－Ｈ陽性の神経繊維（白矢尻）を示す。
　本発明において、「多能性幹細胞」とは、生体のあらゆる細胞に分化できる分化万能性と、分化増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能をあわせもつ細胞をいい、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が挙げられる。
　本発明において、「ＥＳ細胞（Eｍｂｒｙｏｎｉｃ　Sｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）」とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株のことをいい、非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持つ。
　本発明において用いることのできるＥＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物の内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。例えば、ＥＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サルの内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。
　本発明において、「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Pｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Sｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）」とは、体細胞へ、例えば数種類の遺伝子および／または薬剤を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持たせた細胞をいう。
　本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。例えば、ｉＰＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。また、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞も特に限定されず、あらゆる組織由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いることができる。さらに、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の誘導方法も特に限定されず、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる方法であれば、どのような方法を用いて誘導されたｉＰＳ細胞でも用いることができる。
　本発明において、多能性幹細胞を分化させずに培養する方法は特に限定されず、当業者が公知の培養環境や培地、またはそれに準ずる培養環境や培地を適宜選択することができる。例えば、多能性幹細胞を培養するためのフィーダー細胞としては、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いることができる。また、多能性幹細胞を培養するための培地としては、一般的に多能性幹細胞の培養に用いられる培地を用いることができ、その組成については特に限定されない。
　本発明において、「テラトーマ」とは、二胚葉性あるいは三胚葉性の成分を有する、高分化な胚細胞性腫瘍であり、奇形種ともいう。本発明における「テラトーマ」には、多能性幹細胞を生体に移植した場合に発生し得る、組織学的に奇形種に似た構造物も含む。テラトーマは生体内において自然発生することがあるが、多能性幹細胞を動物に移植することによって人工的に発生させることもできる。
　本発明において、動物に細胞を移植する部位は特に限定されないが、例えば、動物の腎皮膜下、皮下、精巣に移植することができる。
　本発明において、動物に細胞を移植する方法は特に限定されないが、例えば、マウスの腎皮膜下へ移植する場合は、腎臓皮膜に２～３ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に細胞を移植することができる。
　本発明において、多能性幹細胞を移植された動物にテラトーマが形成されていることの確認方法は特に限定されないが、例えば、移植から３～４週間後で開腹し、外観での腫瘤の形成を目視することで確認することができる。好ましくは、腫瘤を組織学的に解析することにより、テラトーマの特徴である三胚葉性の組織形成を確認することができる。
　本発明において、「全層皮膚」とは、少なくとも下記の（１）～（３）を含む層状の組織構造をいう。
（１）表皮層と真皮層を含む皮膚
（２）少なくとも１種類の皮膚付属器官
（３）皮下組織
　本明細書において、「皮膚付属器官」とは、限定はされないが、皮膚を構成する表皮層と上皮組織を介して接続し、且つ、固有の機能を有する、角質器官と外分泌腺を意味する。本明細書における皮膚付属器官は、例えば毛包、爪、皮脂腺、汗腺、乳腺等、皮膚に分布する器官を意味するが、これらに限定されない。
　本明細書において、「皮下組織」とは、皮膚および皮膚付属器官を支持し、それらと他の器官系を結合する組織であり、例えば皮下脂肪組織、平滑筋組織より構成される皮筋層、膠原繊維や弾性繊維より構成される結合組織が含まれるが、これに限定されない。 
　本発明において、「器官原基」とは、生体において、発生の段階が進むと特定の器官に発生することが決定づけられた胚の領域または胚の構造をいい、単に「原基」と呼ばれることもある。生体におけるほぼ全ての器官は、胎児期の発生プログラムによって上皮系幹細胞と間葉系幹細胞から誘導された器官原基から発生し、所定の位置、所定の数に発達する。
　本発明において、テラトーマ内に目的の全層皮膚が形成されていることの確認方法は特に限定されないが、例えば、テラトーマを切開し、外観から皮膚付属器官（例えば、毛包、爪、皮脂腺、汗腺、乳腺）を有する全層皮膚と思われる構造物を探すことで確認することができる。好ましくは、テラトーマの組織切片を作製し、組織構造から所定の器官であることを確認することができる。より詳細に確認する場合は、各器官で発現する遺伝子が適切な部位で発現していることをｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法によって解析することができる。
　本発明において、「胚様体」とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を浮遊培養した際に形成される細胞塊をいう。胚様体は、胚様の形態をとることがあり、様々な組織から構成されることがある。本発明において用いることのできる胚様体の作成方法は特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞を低接着性プレートに播種する方法、多能性幹細胞の細胞懸濁液の液滴を吊るすことによるハンギングドロップ法、多能性幹細胞の培養皿を振盪させながら浮遊培養する方法を用いることができる。
　例えば、ｉＰＳ細胞を低接着性プレートに播種する方法で胚様体を作製する場合には、ｉＰＳ細胞を１５００ｃｅｌｌｓ～１００００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌ、より好ましくは、２０００ｃｅｌｌｓ～４０００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴低接着性プレートに播種し、培養することにより、胚様体を作製することができる。播種する細胞が１５００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌより少ないと胚様体が適切に形成されない恐れがあり、１００００ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌより多いと胚様体内部で栄養不足による壊死が起こる恐れがある。
　また、本発明において用いられる胚様体が、浮遊培養開始から何日目のものであるかは特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から５～９日目のものを好適に用いることができる。
　本発明において、胚様体を移植に用いる場合、胚様体の全部または一部を移植に用いることができる。胚様体をそのまま移植に用いることもできるし、胚様体の一部のみを移植に用いることもできる。胚様体の一部のみを移植に用いる場合には、胚様体の表層組織を用いることが好ましい。胚様体の表層は上皮系の細胞で構成されていることから、胚様体の表層組織を移植に用いることにより、より効率的にテラトーマ内に全層皮膚を製造することができる。
　本発明において、胚様体から表層組織のみを分離する方法は、特に限定されない。例えば、実体顕微鏡下での注射器によるマイクロサージェリーで、胚様体の表層組織を物理的に採取することができる。
　本発明において、「足場材料」とは、その材料上あるいは材料内で細胞と材料が接することにより、細胞の接着、増殖、分化、活性化、移動、遊走、形態変化など様々な細胞機能を発現、促進されるような材料全般を指し、多能性幹細胞を移植する際に好適なものであれば、特に限定されない。例えば、足場材料としてコラーゲンゲルを用いることができ、好ましくは、I型コラーゲンゲル、III型コラーゲンゲル、IV型コラーゲンゲル、マトリゲルを用いることができる。多能性幹細胞を足場材料に内包させたうえで移植することにより、移植した組織において多能性幹細胞が散逸することを防ぎ、組織が生着するための足場となることで、より効率的にテラトーマ内に全層皮膚を製造することができる。また、多能性幹細胞を足場材料に内包させたうえで移植することにより、胚様体をコラーゲンゲル内に所望の立体的配置を保ったまま移植することができる。コラーゲンゲル内において、それぞれの胚様体の表層組織どうしが接した状態で移植を行うことにより、より効率的にテラトーマ内に全層皮膚を製造することができる。
　本発明において、「胚様体の全部または一部」と足場材料を含む結合体を作製する方法は特に限定されない。生体外において「胚様体の全部または一部」と足場材料を結合させてから移植に用いてもよく、はじめに生体内に足場材料を導入し、そこに「胚様体の全部または一部」を注入することで結合させ、移植をおこなってもよい。また、例えば、足場材料としてコラーゲンゲルを用い、胚様体の全部または一部と結合させる場合には、ゾル状のコラーゲンゲルに胚様体を入れ、固化させることによって、コラーゲンゲルと胚様体の全部または一部との結合体を作製することができる。
　本発明において、「Wnt経路を活性化させ得る生理活性化物質」とは、例えば古典的Wnt経路（βカテニン経路ともいう）を活性化させ得る生理活性化物質であってよく、非古典的Wnt経路（平面内細胞極性経路；PCP経路、Ca2+経路ともいう）を活性化させ得る生理活性化物質であってもよい。古典的Wnt経路を活性化させ得る生理活性化物質としては、例えばＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βを例示することができ、非古典的Wnt経路を活性化させ得る生理活性物質としては、例えばWnt４、Wnt5a、Wnt１１が例示できる。Wnt10bが古典的Wnt経路（βカテニン経路）を活性化させ得ることは、例えばMaksim V. Plikus et al.（Science 332, 586 (2011)）に記載されており、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂが古典的Wnt経路（βカテニン経路）を活性化させ得、Wnt４、Wnt5a、Wnt１１が非古典的Wnt経路を活性化させ得ることは、例えばKemp et al.（Functional Development and Embryology 1(1), 1-13 （2007））に記載されており、TGF-βがdermal fibroblastにおいてβカテニンの発現を安定化させることは、例えばSato（Acta Derm Venereol 2006; 86: 300-307）に記載されている。
　本発明において、細胞を移植する動物の種類は特に限定されず、あらゆる動物を移植に用いることができる。好ましくは、非ヒト動物、例えば、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、イヌ、ネコ、ラット、マウスを移植に用いることで、ヒトに細胞を移植する際に生じる倫理面の問題を回避することができる。より好ましくは、非ヒト免疫不全動物を移植に用いることで、生体の免疫機能による拒絶反応を防ぐことができ、効率よくテラトーマを作製することができる。また、非ヒト免疫不全動物を移植に用いることで、非ヒト免疫不全動物の生体内に、他種の動物の細胞由来のテラトーマを作製することができる。例えば、非ヒト免疫不全動物に、ヒト由来の多能性幹細胞を移植することによって、非ヒト免疫不全動物の生体内にヒト細胞由来のテラトーマを作製することができる。
　本発明において、「免疫不全動物」とは、生体の免疫機能の一部または全部を欠損する動物をいい、欠損する免疫機能の種類は特に限定されないが、生体に移植された他種の動物由来の細胞または組織を排除しないように免疫機能を欠損する動物が好ましい。例えば、免疫不全マウスであれば、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、ＮＯＤマウス、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス、ＩＬ－２Ｒｇノックアウトマウス、ＲＡＧ２ノックアウトマウス、ＮＯＧマウス、ＲＡＧ２／ＩＬ－２Ｒｇダブルノックアウトマウスを用いることができ、好ましくは、ＳＣＩＤマウスを用いることができる。また、例えば、免疫不全ラットであれば、ＳＣＩＤラットを用いることができる。また、例えば、免疫不全ブタであれば、ＩＬ－２ｒｇノックアウトブタを用いることができる。
　本発明において、テラトーマから所望の器官を摘出する方法は特に限定されないが、例えば、マイクロサージェリーによって摘出することができる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
胚様体を含む結合体の生体内移植による全層皮膚の形成
１．材料と方法
（１）実験動物
　Ｃ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウスはクレア（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）にて、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ　ｈｒ／ｈｒ（ＳＨＯ）マウスはチャールズリバー（Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）にて購入した。マウスの管理および操作はＮＩＨの実験動物指針に従った。全ての実験は東京理科大学の実験動物管理委員会の認可の上実施した。
（２）細胞培養
　マウスｉＰＳ細胞（ｍＧＦ－ｉＰＳ－３Ｆ－３）はマイトマイシンＣ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）処理したＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞と共培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、１５％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ　Ｂｉｏ　Ｓｅｒｕｍ）、５０　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１ｘ１０－４Ｍ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１ｘ１０－４Ｍ　Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。１日毎に培地交換し、継代後２日目にＤ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて継代培養した。
　ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞は０．１％ゼラチン水溶液で３７℃，２時間以上ゼラチンコートしたディッシュ上で培養した。培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ；　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、７％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地を用いた。前記培地にマイトマイシンＣを終濃度１２μｇ／ｍｌになるよう添加し、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞を３７℃，２時間１５分反応させることにより、ＳＮＬＰ７６．７－４フィーダー細胞のマイトマイシン処理を行った。その後、反応させた細胞を２．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でゼラチンコートディッシュに播種した。マイトマイシン処理後２４時間以上培養したものをｉＰＳ細胞との共培養用のフィーダー細胞として用いた。
（３）胚様体の作製
　ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞ごと酵素処理により培養皿より剥離し、緩和なピペッティングによりシングルセル化した。セルソーター（ＦＡＣＳ　ＡｒｉａIII，　ＢＤ）を用いて、ＳＳＣとＦＳＣにより、フィーダー細胞を除去してｉＰＳ細胞のみをソーティングした。ソーティングしたｉＰＳ細胞を１．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、（２）に記載のｉＰＳ細胞の培養培地へ再懸濁し、さらに３，０００ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように、９６穴低接着性プレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ，ＮＯＦ）へ播種した。
（４）胚様体へのＷｎｔ１０ｂ刺激
　（２）および（３）に記載の方法にて低細胞付着性プレートへｉＰＳ細胞を播種した後、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ　；　ＧＩＢＣＯ）に，１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ　Ｂｉｏ　Ｓｅｒｕｍ），５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを加えた培地を用いて、７日間の培養を行った。播種後４日目に半量培地交換し、培養７日目に、胚様体の形成を位相差顕微鏡により確認を行い、形態的に異常が無い胚様体に対してＷｎｔ１０ｂ刺激を行った。０．１ｍｇ／ｍＬ　Ｗｎｔ１０ｂ（Ｒ&Ｄ）ｉｎ　ＰＢＳをストックとして、１μｇ／ｍＬとなるようにｉＰＳ細胞用の培地に添加した。胚様体を形成したＷｅｌｌの培地を半量捨てて、Ｗｎｔ１０ｂを含むｉＰＳ細胞用の培地により半量交換した（終濃度５００ｎｇ／ｍＬ）。ＣＯ２インキュベーター内にて、Ｗｎｔ１０ｂ添加培地中の胚様体を２４時間培養した。
（５）ｉＰＳ細胞由来の胚様体の移植によるテラトーマの形成
　シリコングリースを薄く塗った滅菌プラスチックディッシュ上にて３０μｌの冷I型コラーゲンゲル（新田ゼラチン）ドロップを形成し、ゲル形成する前に手早く３２個または４８個の胚様体を包含させ、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃、１０分間インキュベートしてゲル化させた。胚様体を包含したコラーゲンゲルを、１個ずつ麻酔下でＣ．Ｂ－１７／ｌｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウス（７～１０週齢）の両腎の腎皮膜下へ移植した。移植後２８または３０日目にｉＰＳ細胞由来の胚様体を移植したマウスを犠牲死させて、テラトーマを摘出した。
（６）テラトーマ内の嚢胞の組織学的分析
　テラトーマ内の嚢胞上皮の解析および誘導された器官の組織学的分析を行うために、摘出したテラトーマの重量を計測してマクロ写真を撮影した後に、当該テラトーマをマイルドホルム１０Ｎ固定液（Ｗａｋｏ）に浸漬して、室温にて一晩固定した。固定したテラトーマ組織は、通法に従ってパラフィン包埋または凍結包埋して、１０μｍ厚の連続切片を作製した。連続切片の全部または一部をマイヤー処方のヘマトキシリンを用いてＨＥ染色して、テラトーマ内嚢胞の組織学的分析を行った。テラトーマ内の毛包形成頻度を解析するために、ブロック表面より３ｍｍ厚分を組織化学解析し、正立顕微鏡Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ　Ａ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）とＡｘｉｏＣＡＭ　ＭＲｃ５（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いて、形成された毛包の個数をカウントした。連続切片上で毛球部が一番大きくなった毛包のみをカウントした。また、組織像は正立顕微鏡Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ　Ａ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）とＡｘｉｏＣＡＭ　ＭＲｃ５（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で撮影した。
２．結果
（７）胚様体を含む結合体の生体内移植による全層皮膚および粘膜様組織の形成
（７－１）胚様体を含む結合体の生体内移植物の組織学的解析
　胚様体を含む結合体を生体内に移植して形成されたテラトーマ内の嚢胞について、連続切片のＨＥ染色像を観察して、組織学的な特徴を解析した。その結果、皮膚様嚢胞には皮脂腺を有する毛包が接続しており、皮脂腺の接続位置を境界として嚢胞上皮方向には線維芽細胞が散在するエオジン好性の真皮層が位置しており、毛球部方向には脂肪組織が分布していた。嚢胞の表皮層は基底細胞層、曲細胞層、顆粒層および角質層が規則的に配置されており、角質層は嚢胞腔内に向けて明瞭な層状に剥離していることから典型的な皮膚表皮組織であることが示された。毛包の開口部より嚢胞内腔に向けて毛幹が成長していることが示された（図１、黒矢印）。皮脂腺と毛包の接続部位は毛包漏斗部または毛穴の開口部であり（図１、左白矢頭）、皮脂が毛穴を介して表皮外層に分泌しうることが示唆された。この構造は天然の皮膚の組織学的特徴と完全に一致しており、嚢胞腔を中心として全層皮膚が誘導されていることが示された。一方、粘膜様嚢胞には毛包などの外胚葉性器官は認められず、やや不明瞭な単層角化上皮層の周囲をルーズな結合組織である粘膜固有層と粘膜下層がとりまき、粘膜下層には平滑筋層と分泌腺様の組織が配置されており、組織学的に粘膜などと同等であることが示された（図１、右）。
（７－２）胚様体形成時のＷｎｔ１０ｂ添加による上皮組織の領域誘導
　（３）～（５）に記載の方法により、マウス腎皮膜下に形成したテラトーマ（図２Ａ）の組織切片をＨＥ染色し、形成された嚢胞の上皮組織および周囲の間質組織の組織学的特徴より、皮膚様（扁平重層角化上皮層／真皮層／脂肪または横紋筋）、粘膜様（扁平重層角上皮／粘膜固有層／横紋筋）、移行上皮（扁平重層角化上皮と単層柱状上皮の移行形態）、内胚葉性上皮様（単層柱状上皮／粘膜固有層／横紋筋）に分類して、その構成比率を計測した（図２Ｂ）。その結果、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行わなかった胚様体による移植物と比べて、Ｗｎｔ１０ｂ刺激を行った胚様体を移植した場合、内胚葉性上皮様の嚢胞が減少して、皮膚様および粘膜様の頻度が増加した（図２Ｃ）。
（７－３）Ｗｎｔ１０ｂ添加による毛包形成頻度の増加
　Ｗｎｔ１０ｂ刺激した胚様体由来のテラトーマ１ｇあたりに含まれる誘導毛包数（２８５±１２８，ｎ＝４）は、Ｗｎｔ１０ｂ未処理群（３９±２１，ｎ＝８）に比べて有意に増加した（図２Ｄ）。また腎皮膜下内への胚様体移植後２８－３０日目のテラトーマ内に誘導された毛包より成長した毛幹長を計測したところ、Ｗｎｔ１０ｂ添加群が未処理群に比べて２倍の長さであった。
（７－４）Ｗｎｔ１０ｂ添加による外分泌腺組織の誘導
　Ｗｎｔ１０ｂ刺激を加えた胚様体由来のテラトーマのＨＥ組織解析において、外分泌腺の腺房構造が多数集蔟した構造が認められた（図１右）。そこで、唾液腺と膵臓の外分泌腺のみが分泌するアミラーゼに対する抗体を用いて、外分泌腺の腺房類似組織を免疫染色したところ、上皮性細胞マーカーであるＥカドヘリン陽性細胞の細胞質において分泌小胞に特有な顆粒状の陽性像が示された。この結果より、Ｗｎｔ１０ｂ刺激により毛包のみならず唾液腺などの外分泌腺が誘導されたことが示唆された（図３）。
（８）ｉＰＳ細胞由来毛包および全層皮膚の品質および機能評価
（８－１）ｉＰＳ誘導毛の皮膚内移植による発毛能
　テラトーマ内にて誘導された全層皮膚に含まれる毛包器官が、完全に機能的であり移植可能であるかどうかを調べるために、ｉＰＳ細胞の生体内移植により誘導された毛包を含む全層皮膚を摘出し、毛群となるように切り分けて、ヌードマウス皮膚内に移植を行った。移植した毛群は、皮膚内移植後７日目に脱毛し、その後１４日目に６６％（１１７例中７７例）の頻度で発毛することが明らかとなった（図４）。ｉＰＳ細胞由来毛包および皮膚組織は生体の皮膚内への移植可能な機能を再現することが示された。
（８－２）ｉＰＳ誘導毛の毛周期解析
　テラトーマ内にて誘導された全層皮膚に含まれる毛包器官が、毛周期を繰り返して永続的に機能するかどうかを調べるために、ｉＰＳ細胞の生体内移植により誘導された毛包を含む全層皮膚を摘出し、毛群となるように切り分けて、ヌードマウス皮膚内に移植を行った（本明細書においては、本発明の方法によってｉＰＳ細胞から誘導された毛包を「ｉＰＳ誘導毛包」と呼び、ｉＰＳ誘導毛包の移植によって誘導された毛を、「ｉＰＳ誘導毛」と呼ぶ）。前記移植を行った群より発毛した毛幹の毛種を判別したところ、体毛に含まれるＺｉｇｚａｇ，Ａｗｌ、およびＧｕａｒｄ毛を含むことが示された。そこで、毛種ごとに毛幹の成長を第３毛周期まで追跡し、毛幹成長期間と毛幹成長休止および脱毛期間長を分析したところ、成体体毛と同等な周期性を繰り返すことが示された（図５）。これらの結果よりｉＰＳ誘導毛は、生体の幹細胞ニッチを再現しており、毛周期を永続的に繰り返すことが示唆された。
（８－３）ｉＰＳ誘導毛の由来解析
　（８－２）に記載の方法で移植した全層皮膚および発毛した毛がｉＰＳ細胞由来であることを証明するために、Ｙ染色体を標識し蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（ＦＩＳＨ）を行った。本実験で使用しているｉＰＳ細胞は雄マウス由来の細胞であり、移植先のＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスは雌マウスのため、核内のＹ－染色体を緑色蛍光色素で標識し、移植物から発生した器官（全層皮膚および発毛した毛包）の由来を解析した。その結果、毛包等の皮膚付属器を含む全層皮膚はＹ－染色体陽性の細胞すなわち、ｉＰＳ細胞より誘導された細胞で構成されていることが明らかとなった（図６）。また、毛包と連結している上皮層はＹ－染色体陽性であるのに対し、ホストの組織ではＹ－染色体は検出されなかった。
（８－４）ｉＰＳ誘導毛のニッチ解析
　ｉＰＳ細胞より誘導された全層皮膚に含まれる誘導毛が幹細胞ニッチを形成しているかを明らかとするために、上皮幹細胞マーカーであるＣＤ３４とＣＫ１５で免疫染色を行った。また可変領域方向または、皮脂腺および皮膚表皮へコミットした上皮幹細胞ニッチを再現しているかを明らかとするために、Ｌｇｒ５，Ｌｇｒ６，Ｌｒｉｇ１陽性細胞の挙動を解析した。組織学的に皮脂腺下方の膨隆した外毛根鞘と定義されるバルジ領域は、ＣＤ３４およびＣＫ１５共陽性の毛包上皮幹細胞が局在する幹細胞ニッチとして機能し、毛包の恒常性を維持するために必要不可欠であるため、これらをマーカーとしてｉＰＳ誘導毛包を免疫染色により解析した。その結果、ＣＤ３４を赤色、ＣＫ１５を緑色で蛍光標識すると、組織学的にｉＰＳ誘導毛包のバルジ領域に相当する外毛根鞘において黄色く染色された（図７ｂ、矢印）。このことから、ＣＤ３４，ＣＫ１５を共発現する上皮幹細胞がバルジ領域に格納されたことが示された。従って、ｉＰＳ誘導毛は上皮性幹細胞ニッチを構築することが示された。成長期毛包においては、毛包可変部の外毛根鞘細胞と毛母のＡｕｂｅｒ氏臨界線下方に毛母前駆細胞であるＬｇｒ５陽性細胞が分布し、休止期毛包ではＬｇｒ５陽性細胞が二次毛芽に局在することが知られている。また、Ｌｇｒ６およびＬｒｉｇ１陽性細胞はバルジの上部より皮脂腺付着部付近に局在する。ｉＰＳ誘導毛包の成長期および休止期においても、Ｌｇｒ５，Ｌｇｒ６，Ｌｒｉｇ１陽性細胞の挙動を解析したところ、Ｌｇｒ５，Ｌｇｒ６，Ｌｒｉｇ１それぞれ天然毛と同じ部位で発現が確認された（図７）。
（８－５）ｉＰＳ誘導毛包と周辺組織との接続
　ｉＰＳ誘導毛包が立毛筋および神経と接続しているかを確かめるために、１００μｍ厚切片を作製して、神経繊維マーカーであるニューロフィラメント、平滑筋マーカーであるカルポニン、横紋筋マーカーであるトロポニンに対する抗体を用いた免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で解析した。天然体毛は、バルジ領域にカルポニン陽性である平滑筋からなる立毛筋が接続している。そこへ深部神経叢から伸びた交感神経が立毛筋を取り囲むように配置することで、神経筋接合部を形成し、神経支配を受ける。ｉＰＳ誘導毛包は有色毛であり、ホスト毛包と識別することができるため、ｉＰＳ誘導毛包をホスト毛包と識別したうえで神経繊維および立毛筋接続を免疫染色により解析した。その結果、天然体毛と同様に、カルポニン陽性の立毛筋がバルジ領域に接続（図８、矢印）し、そこに神経繊維が接続していた（図８、矢頭）。さらに、毛包と立毛筋の接続だけでなく、サブバルジの上皮に神経－毛包接合部が見られた（図８）。バルジ領域周囲には神経線維の接続が見られ、神経終末端はバルジ領域のＯＲＳ最外層に分布し、神経－毛包接合部が見られた（図８）。
（８－６）単一化ｉＰＳ細胞およびｉＰＳ誘導毛包を含む全層皮膚のヌードマウス皮下移植による造腫瘍アッセイ
　ｉＰＳ細胞より誘導された全層皮膚の移植が腫瘍形成するかどうかを試験するために、２０毛包相当を含む全層皮膚をヌードマウス背部皮膚へ移植して、３ヶ月間にわたり腫瘍細胞の増殖による腫瘤形成を追跡した。比較群として同じ、ｉＰＳ細胞ラインより単個細胞の状態にしたｉＰＳ細胞を作製して、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓずつ皮内へ移植して同一期間追跡した。その結果、単個細胞の移植では、どの細胞数においても腫瘍形成による腫瘤の増大が見られ、移植後２０日から４０日において腫瘍形成が見られ、移植細胞数に依存して腫瘍形成が早い傾向となった（表１）。それに対して、ｉＰＳ誘導毛包の移植では、移植後９０日までの追跡で腫瘍形成による腫瘤の増大は認められなかった（表１）。
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　以上の結果から、本発明の方法によれば、効率的に、皮膚付属器官を有する全層皮膚を人工的に製造することができる。また、本発明の方法によって製造された全層皮膚は、移植によって腫瘍を引き起こす危険性が極めて低く、生体への移植を前提とした器官の形成技術としても極めて有望であることが示された。

Claims (9)

  1. 　皮膚付属器官を有する全層皮膚を製造する方法であって、
    　前記「皮膚付属器官を有する全層皮膚」は、少なくとも下記（１）～（３）；
    （１）表皮層と真皮層を含む皮膚
    （２）少なくとも１種類の皮膚付属器官
    （３）皮下組織
    を含み、
    　前記方法は、下記ステップ；
    　（ａ）胚様体を、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で刺激するステップ、
    　（ｂ）：下記（Ａ）および（Ｂ）を含む結合体を調製するステップ；
    　　（Ａ）ステップ（ａ）で刺激を行った前記胚様体の全部または一部
    　　（Ｂ）足場材料
    　（ｃ）：前記ステップ（ｂ）で調製した前記結合体を動物に移植するステップ、および、
    　（ｄ）：前記動物中において、前記結合体由来の全層皮膚を製造するステップ、
    を含むことを特徴とする、方法。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記動物が非ヒト動物である、
    方法。
  3. 　請求項２に記載の方法であって、
    　前記非ヒト動物が非ヒト免疫不全動物である、
    方法。
  4. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記Ｗｎｔ経路が古典的Ｗｎｔ経路である、
    方法。
  5. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記「Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質」が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、および、ＴＧＦ－βからなる群から選択される、
    方法。
  6. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記胚様体が、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から作製された胚様体である、
    方法。
  7. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記足場材料が、コラーゲンゲルである、
    方法。
  8. 　請求項２または３に記載の方法であって、
    　前記移植が、腎皮膜下への移植である、
    方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって製造される、
    　皮膚付属器官を有する全層皮膚。
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