WO2016021720A1 - Ｉｌ－１８と分子標的抗体とを併用する癌治療薬 - Google Patents

Ｉｌ－１８と分子標的抗体とを併用する癌治療薬 Download PDF

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春樹 岡村
恭輔 山西
文 李
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer therapeutic agent using interleukin 18 (hereinafter referred to as “IL-18”) in combination with a molecular target antibody. More specifically, the present invention relates to a therapeutic drug for cancer that can exhibit a synergistic and excellent antitumor effect by containing IL-18 and a molecular target antibody, and has few side effects.
  • IL-18 interleukin 18
  • peritoneal dissemination of tumors occurs with gastric cancer, colon cancer, ovarian cancer, etc., and can occur even when the tumor is removed by surgery, and is very difficult to treat.
  • a chemotherapeutic agent treatment targeting vascular endothelial growth factor (VEGF), sensitization therapy using bisphosphonic acid, and the like have been attempted.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • lymphocytes regulatory cells
  • CTLA-4 antigens or PD-1 / PD-L1 antigens which are antigens expressed on macrophages
  • Antibodies that reduce (suppressing lymphocytes) have begun to be put into practical use (patent documents 1 and 2).
  • the antibody reduces the inhibitory lymphocytes while enhancing the effector lymphocytes expressing CD28, NKG2D and the like, and eliminates tumor cells and pathogen-infected cells by the effector lymphocytes.
  • lymphocytes also referred to as effector lymphocytes or effector cells
  • the above antibody has been proved to be effective against malignant tumors such as melanoma, which has been difficult to treat with conventional therapies, and has increased efficacy and expanded application to many tumors. Expected.
  • Non-patent Document 1 attempts have been made to confirm the antitumor effect using GM-CSF, IL-15 and anti-CTLA-4 antibody. It has been disclosed that a combination of IL-18 and rituximab or HERCEPTIN (registered trademark) exhibits a therapeutic effect superior to that obtained when a single agent is used (Patent Document 3). Furthermore, it is also disclosed that cancer immunotherapy is performed using a composition comprising a compound represented by a predetermined formula, one or more molecular target antibodies, and an immunostimulatory compound (Patent Document 4).
  • Patent Documents 1 and 2 it is considered that there is still room for improvement in the therapeutic effect when the antibodies disclosed in Patent Documents 1 and 2 are used. Furthermore, as a result of decreasing the inhibitory lymphocytes and enhancing the effector lymphocytes, there is a problem that side effects such as the onset of autoimmune diseases may occur. That is, it can be said that the techniques disclosed in Patent Documents 1 and 2 leave room for improvement from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect and reducing side effects.
  • Non-Patent Document 1 has a problem that the dose of a drug is very large and is not a practical method.
  • Patent Document 3 discloses that IL-18 and rituximab or HERCEPTIN (registered trademark) are individually or sequentially administered to a patient, and the combination has a better therapeutic effect than a single agent.
  • Patent Document 4 discloses that an immune response can be increased by adding an immunopotentiator to a specific compound represented by a predetermined formula and one or more molecular target antibodies (such as rituximab and HERCEPTIN (registered trademark)). Is disclosed.
  • “Molecular target antibody” refers to an antibody capable of recognizing surface antigens involved in lymphocyte functions and surface antigens of cancer cells.
  • Patent Documents 3 and 4 do not yet provide sufficient knowledge regarding providing a therapeutic drug for cancer that can enhance the therapeutic effect and reduce side effects.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and the object thereof is to contain IL-18 and a predetermined antibody, whereby an excellent antitumor effect can be achieved, and side effects are reduced.
  • the object is to provide a novel therapeutic agent for cancer that can be alleviated.
  • IL-18 is selected from the group consisting of anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD52 antibody.
  • the present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by using in combination with the above antibody, and have completed the present invention.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes IL-18, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, One or more antibodies selected from the group consisting of a CD25 antibody, an anti-CD33 antibody and an anti-CD52 antibody are contained as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes IL-18 and anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD52 antibody. Since one or more antibodies selected from the group consisting of the above-mentioned antibodies are contained as active ingredients, the antitumor effect of the antibodies can be remarkably improved. As a result, there is an effect that it is possible to provide a cancer therapeutic agent having a high therapeutic effect and few side effects.
  • FIG. 6 is a graph showing the dose effect of anti-CTLA-4 antibody and IL-18 as the survival rate of mice administered intraperitoneally with CT-26 cells, as in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of a cancer therapeutic agent containing an anti-PD-L1 antibody and IL-18 as the survival rate of mice in the same manner as in Example 1.
  • B220 (CD45R), NKG2D of PEC induced by intraperitoneal administration of anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody or anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 to mice It is a figure which shows the result of having examined the expression intensity of DX5 (CD49b). It is a figure which shows the result of having confirmed that the therapeutic agent which concerns on this invention reduces the number of CD4 positive CD25 positive T cells. It is a figure which shows the influence which the anti-asialo GM1 antibody which destroys and removes a natural killer (NK) cell has on the survival rate of the mouse
  • NK natural killer
  • FIG. 2 is an appearance photograph showing the presence or absence of ascites in each group of mice administered with a control or therapeutic agent 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells. It is a figure which shows the change of the abdominal circumference of the mouse
  • FIG. 21 It is a figure which shows the mode of the abdominal cavity 21 days after the day which transplanted CT-26 cell about a control and the mouse
  • FIG. 7 is a view showing the appearance of a portion of the duodenum, small intestine, and large intestine 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells for a control and a mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 is there. It is a figure which shows the transplant of CT-26 cell in Example 16, and the administration schedule of a therapeutic agent.
  • albumin concentration in blood FIG. 25 (a)
  • total bilirubin concentration FIG. 25 (b)
  • AST (GOT) concentration FIG. 25 (c)
  • ALT GPT
  • FIG. 26 shows the results of tissue staining of hepatoxylin eosin (HE) in the livers of mice in groups 1 to 4 in Example 16.
  • FIG. 18 shows the results of tissue staining of hematoxylin eosin (HE) in the stomachs of mice in groups 1 to 4 in Example 16.
  • FIG. 18 shows the results of tissue staining of hematoxylin eosin (HE) in the stomachs of mice in groups 1 to 4 in Example 16.
  • FIG. 16 shows the results of tissue staining with hematoxylin and eosin (HE) of the duodenum of mice in groups 1 to 4 in Example 16.
  • FIG. 18 shows the results of tissue staining of hematoxylin eosin (HE) in the small intestine of group 1 to group 4 mice in Example 16.
  • FIG. 14 is a graph showing the result of tissue staining of hematoxylin eosin (HE) in the large intestine of group 1 to group 4 mice in Example 16.
  • FIG. 16 shows the results of tissue staining of hepatoxylin eosin (HE) in the kidneys of mice in groups 1 to 4 in Example 16. It is a figure which shows the transplant of the B16 melanoma cell in Example 17, and the administration schedule of a therapeutic agent. It is a figure which shows the result of having observed the nodule which arose in the lung of the mouse
  • Cancer therapeutic agent according to the present invention (1) Active ingredient
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes IL-18, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, and anti-CD33 antibody. And one or more antibodies selected from the group consisting of anti-CD52 antibodies.
  • IL-18 was discovered in 1995 by Okamura et al. As an inducer of IFN- ⁇ (Okamura et al., Nature, 378: 88-91, 1995) and has recently been shown to have various biological effects. It is a growing cytokine.
  • IL-18 is activated by inflammasome (a protein complex containing NLRP3, ASC, caspase-1, etc.) as a result of endoplasmic reticulum stress response due to stress such as nutrient deficiency, oxygen deficiency, and ultraviolet light. Then, caspase-1 is activated by the inflammasome, pro-IL-18 is processed by the caspase-1, and is converted into an active form of IL-18.
  • inflammasome a protein complex containing NLRP3, ASC, caspase-1, etc.
  • IL-18 acts on effector cells such as CD8 positive T cells, natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) and ⁇ T cells activated by antigens and cytokines, and the number of these cells is remarkably increased. And is known to suppress the death of these cells and promote their survival and differentiation (for example, Li Wen et. Lal, J. Leukoc. Biol., 82, 142-151, 2007). .).
  • NK cells natural killer cells
  • ⁇ T cells activated by antigens and cytokines
  • IL-18 is not particularly limited, and human IL-18 polypeptide (SEQ ID NO: 1), mouse IL-18 polypeptide (SEQ ID NO: 2), etc. described in Patent Document 3 are used. Can do. The amino acid sequence homology between human IL-18 and mouse IL-18 is 65%.
  • the human IL-18 polypeptide is disclosed in EP0692536A2, EP0712931A2, EP0767178A1, WO97 / 2441, etc., as described in Patent Document 3.
  • an IL-18 polypeptide is simply referred to as “IL-18”.
  • human IL-18 is a recombinant mature form of human IL-18 expressed in an E. coli non-pathogenic strain.
  • Mouse and human IL-18 cDNAs encode precursor proteins consisting of 192 and 193 amino acids (SEQ ID NOs: 2 and 1, respectively).
  • IL-18 is ammonium sulfate or ethanol precipitation method, acid extraction method, anion or cation exchange chromatography method, phosphocellulose chromatography method, hydrophobic interaction chromatography method, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, lectin chromatography method And can be recovered and purified from recombinant cell cultures by known methods such as high performance liquid chromatography.
  • IL-18 When IL-18 is denatured during intracellular synthesis, isolation, and / or purification, well-known techniques for protein refolding can be used to regenerate the active conformation.
  • a method for purifying and making active human IL-18 is shown in WO01 / 098455.
  • IL-18 may be a commercially available product.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention comprises, as antibodies, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and Contains one or more antibodies selected from the group consisting of anti-CD52 antibodies.
  • Patent Document 1 The anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, and anti-PD-L2 antibody are described in detail in Patent Document 1.
  • human PD-1 cDNA is obtained from EMBL / GenBank Acc. No. MN_005018
  • the mouse PD-1 cDNA is Acc. No. X67914, and its expression is observed in thymocytes upon differentiation from CD4 ⁇ CD8 ⁇ to CD 4+ CD 8+ cells (Int. Immunol., 1996, Vol. 18, Vol. 18). 5, p. 773-780, J. Exp. Med. 2000, Vol. 191, No. 5, p. 891-898).
  • PD-1 expression in the periphery is expressed by T cells or B cells activated by stimulation from antigen receptors (Int. Immunol., 1996, Vol. 18, No. 5, p. 765-772) or activity. It has been reported to be found in bone marrow cells including activated macrophages. PD-1 is also known to transmit a signal that suppresses an antigen receptor (TCR) signal.
  • TCR antigen receptor
  • PD-L1 is a ligand of PD-1, and is expressed in so-called antigen-presenting cells such as activated monocytes and dendritic cells in addition to tumor cells (J. Exp. Med. 2000, 191st). Vol. 7, p. 1027-1034).
  • human PD-L1 cDNA is EMBL / GenBank Acc. No. AF233516
  • mouse PD-L1 cDNA is composed of a base sequence represented by NM_021893.
  • PD-L1 is one of the molecules that induces inhibitory signals by PD-1. .
  • PD-L2 was identified as the second ligand of PD-1, but it has been reported that its expression and function are almost the same as PD-L1.
  • the human PD-L2 cDNA is EMBL / GenBank Acc. No. NM — 025239, mouse PD-L2 cDNA is composed of a base sequence represented by N M — 021896 (Nature Immunology, 2001, Vol. 2, No. 3, p. 261 to 267).
  • Inhibitory signals from coupled inhibitory molecules typified by PD-1 are immune tolerance or self-antigens during lymphocyte development or maturation by mechanisms that appropriately control positive signals by antigen receptors (TCRs) and conjugate stimulating molecules. It is thought to control an abnormal immune response to.
  • TCRs antigen receptors
  • CTLA-4 is cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CD152).
  • CD152 cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4
  • JP 2007-277242 A when CTLA-4 binds to its natural ligands B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86), a negative regulatory signal is transmitted to T cells. When delivered, blocking this negative regulatory signal enhances T cell immune function and antitumor activity in animal models (Thompson and Allison, Immunity, 7, 445-450 (1997); McCoy and LeGros, Immunol. & Cell Biol.77: 1-10 (1999)).
  • CTLA-4 negative regulatory signals using antibodies has been shown to enhance T cell-mediated tumor killing and induce anti-tumor immunity (eg, Leech et al., Science 271: 1734-1736 (1996)).
  • the complete sequence of human CTLA-4 is set forth in GenBank Accession No. L15006.
  • CD25 is a single-chain glycoprotein having a molecular weight of 55 kDa and is known as a surface antigen of adult T-cell leukemia cells.
  • CD33 is known as the surface antigen of acute myeloid leukemia cells, and CD52 is known as the surface antigen of B cell chronic lymphocytic leukemia cells.
  • Anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody, and anti-CD52 antibody are PD-L1, PD-1, PD-L2 respectively. Any antibody such as a human-derived antibody, a mouse-derived antibody, a rat-derived antibody, a rabbit-derived antibody, or a goat-derived antibody may be used as long as it inhibits an immunosuppressive signal caused by CTLA-4, CD25, CD33, and CD52.
  • antibody fragments antibodies, chimerized antibodies, humanized Either an antibody or a fully human antibody may be used.
  • antibodies should be produced according to known methods for producing antibodies or antisera using PD-L1, PD-1, PD-L2, CTLA-4, CD25, CD33 or CD52 partial proteins in the extracellular region as antigens. Can do.
  • the partial protein in the extracellular region can be prepared by known protein expression and purification methods.
  • Polyclonal antibodies can be produced by known methods. For example, it is produced by immunizing an appropriate animal with an antigen protein or a mixture of an antigen protein and a carrier protein, collecting an antibody-containing substance against the antigen protein from the immunized animal, and performing separation and purification of the antibody. be able to.
  • mice examples of animals used generally include mice, rats, sheep, goats, rabbits, and guinea pigs.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant can be administered together with the antigen protein. Administration is generally performed about once every 2 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of animals immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured by ELISA.
  • Separation and purification of polyclonal antibodies include, for example, antigen-binding solid phase, purification method using an active adsorbent such as protein A or protein G, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange It can be carried out in accordance with immunoglobulin separation and purification methods such as body adsorption / desorption, ultracentrifugation, and gel filtration.
  • a monoclonal antibody or a modified form thereof is used as the antibody.
  • an individual having an antibody titer is selected from animals immunized with an antigen, spleen or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization, and antibodies contained therein
  • Monoclonal antibody-producing cells can be produced by fusing the producing cells with myeloma cells from the same or different animals to produce monoclonal antibody-producing hybridomas that can be subcultured.
  • Antigen protein is administered to a site where antibody production is possible alone or with a carrier or diluent. In this case, in order to enhance antibody production ability, it is common to administer complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant.
  • animals can be immunized by a method called “DNA immunization”.
  • DNA immunization cardiotoxin is treated on the posterior tibialis muscle of the immunized animal, a vector expressing an antigen protein is introduced, and then the vector is taken into muscle cells in the process of tissue repair.
  • a mouse, rat, sheep, goat, rabbit or guinea pig can be used, but a mouse or rat is preferably used.
  • the fusion operation can be carried out by the method of Kohler and Milstein (Nature IV, 1975, Vol. 256, No. 5517, p. 495-497).
  • a fusion accelerator polyethylene glycol (PEG) or Sendai can be used.
  • Viruses are used. Examples of myeloma cells include myeloma cells such as P3U1, NS1, SP2 / 0, and AP1, but usually P3U1 is often used.
  • monoclonal antibody-producing cells are selected by, for example, detecting by ELISA method or the like by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase on which an antigen protein is adsorbed directly or together with a carrier. It can be carried out. Furthermore, the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured by ELISA. Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the polyclonal antibody.
  • the hybridoma As the hybridoma, a known hybridoma usually used for producing the antibody may be used. For example, when producing an anti-PD-L1 antibody or an anti-PD-1 antibody, the hybridoma disclosed in Patent Document 1 can be used.
  • the antibody fragment can be obtained by treating an antibody with a protease enzyme and optionally reducing it.
  • the F (ab ') 2 antibody fragment can be purified by digesting the purified monoclonal antibody completely with pepsin and using any known method of ion exchange chromatography, gel filtration, or affinity chromatography.
  • Fab 'antibody fragments can be produced by partially reducing the prepared F (ab') 2 with 2-mercaptoethylamine.
  • the Fab antibody fragment can be prepared by directly digesting with the digestive enzyme papain in the presence of cysteine and purifying it.
  • the scFv antibody can be prepared, for example, by the method of Jost et al. (J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, No. 42, p. 26267-26273).
  • the above humanized antibody can be prepared by substituting a part of a non-human antibody prepared by immunizing a mammal other than a human with a part of a human antibody.
  • a humanized antibody can be produced by constructing a chimera of a gene encoding the constant region of a human antibody and a gene encoding the variable region of a non-human antibody (Proc. Natl Acad.Sci. (USA), 1987, 84, 3439-3443, J. Immunol., 1987, 139, No. 1, p.3521).
  • the DNA sequence of the constant region of a human antibody is described in the literature, and the gene of the constant region can be easily obtained from a known clone. Subsequently, the DNA sequence encoding the variable region of the antibody is fused to the constant region sequence of the human antibody.
  • the isotype of the constant region of a human antibody can be selected depending on the desired effector function or activity in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ie, antibody-dependent cytotoxicity). Preferred isotypes are IgG1, IgG3 and IgG4. In addition, any of human light chain constant regions, ⁇ chains, or ⁇ chains can be used. This humanized chimeric antibody can be expressed by a conventional method.
  • a fully human antibody should be prepared using a mouse into which a constant region gene of human immunoglobulin has been introduced (Xenomouse (Chemical Biology, 2000, Vol. 7, No. 8, p.R185-6)). Furthermore, the antibody-producing lymphocytes isolated from the mouse can be used as a hybridoma to mass-produce the target antibody. A fully human antibody can also be produced by the phage display method (FEBS Letter, 1998, 441, p. 20-24).
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes (i) IL-18, and (ii) anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33.
  • One or more antibodies selected from the group consisting of antibodies and anti-CD52 antibodies are contained as active ingredients.
  • the “one or more antibodies” may be any number as long as they are antibodies selected from the above group.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention preferably includes an anti-PD-L1 antibody and / or an anti-CTLA-4 antibody that has a proven track record as a cancer therapeutic agent.
  • IL-18 and anti-PD-L1 Most preferably, it contains an antibody and an anti-CTLA-4 antibody.
  • PD-L1 is a ligand for PD-1 as described above
  • PD-L2 is a ligand for PD-1. Therefore, when the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L2 antibody is used instead of the anti-PD-L1 antibody, it is expected that the same effect as that obtained when the anti-PD-L1 antibody is used is obtained.
  • CD33, CD52, and CD25 are surface antigens for acute myeloid leukemia cells, B cell chronic lymphocytic leukemia cells, and surface antigens for adult T cell leukemia cells, respectively.
  • MICA and MICB are surface antigens for acute myeloid leukemia cells, B cell chronic lymphocytic leukemia cells, and surface antigens for adult T cell leukemia cells, respectively.
  • Many of the surface antigens MICA and MICB are found in tumorigenic leukocytes in patients with these cancers.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention contains IL-18 and one or more antibodies selected from the group consisting of an anti-CD25 antibody, an anti-CD33 antibody and an anti-CD52 antibody, the antibodies are CD25, CD33, CD52, respectively.
  • IL-18 can enhance the induction of NK cells with high NKG2D expression intensity. Then, the NK cell recognizes MICA and MICB by NKG2D, and can melt cells expressing these surface antigens.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention contains IL-18 and one or more antibodies selected from the group consisting of anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD52 antibody, the therapeutic agent is acute It is believed that it may work effectively for the treatment of myeloid leukemia, B-cell chronic lymphocytic leukemia, and adult T-cell leukemia.
  • the ratio of the use amount of IL-18 to the antibody is such that when one kind of the antibody is used, the mass ratio of IL-18 to the antibody is from 1:10 to 1: It is preferably 200, 1:25 to 1: 200, 1:25 to 1:50, or 1:30 to 1:50, and the living body to be administered (subject, patient)
  • the dose of IL-18 per kg of body weight is 0.1 mg / kg, it is preferable to administer the antibody at the above mass ratio.
  • the ratio of the mass of IL-18 to the sum of the masses of two or more of the antibodies is the above mass ratio, and the mass ratio between the antibodies can be any ratio. And it is sufficient.
  • the ratio to the mass of one or more antibodies is 1:10 to 1: 200, 1:25 to 1: 200, 1:25 to 1:50. Or preferably from 1:30 to 1:50, and the mass ratio of antibodies may be any ratio.
  • the mass ratio of IL-18, the first type of antibody, and the second type of antibody is 1 : 50: 50.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes IL-18 and the above-mentioned antibodies (anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD33 antibody).
  • IL-18 and the above-mentioned antibodies include IL-18 and the above-mentioned antibodies (anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD33 antibody).
  • One or more antibodies selected from the group consisting of CD52 antibodies may be a composition in which IL-18 and the antibody are mixed.
  • IL-18 and the above-mentioned antibody are not mixed and may exist separately.
  • IL-18 and the above antibody are used as active ingredients, even if IL-18 and the above antibody are not mixed, they are included in the scope of the cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention also contains IL-18 and the antibody as active ingredients in a form in which IL-18 and the antibody are not mixed. It corresponds to.
  • the order of administration is not limited to this, IL-18 may be administered after the antibody is administered to the patient, or the antibody and IL-18 may be administered to the patient at the same time. Good.
  • the administration form of the antibodies may be a form in which a plurality of types of antibodies are administered simultaneously, but is not limited thereto.
  • IL-18 the first type of antibody, and the second type of antibody may be administered to the patient over time in any order.
  • a form administered to a patient in the order of IL-18, anti-PD-L1 antibody, and anti-CTLA-4 antibody, or IL-18, anti-CTLA-4 antibody, and anti-PD-L1 antibody It may be.
  • the administration interval between IL-18 and the antibody or the administration interval between the antibody and the antibody may be 2 to 5 days. preferable.
  • the administration site may be the same or different for IL-18 and each antibody.
  • it may be a dosage form in which IL-18 and a plurality of types of antibodies are all injected intravenously, or IL-18 is injected intravenously, the first antibody is injected subcutaneously, and the second antibody is peeled.
  • It may be a form of administration such as internal injection.
  • it is preferable to administer IL-18 and the antibody at the same site.
  • the dose of the active ingredient (IL-18 and the above-mentioned antibody) of the therapeutic agent for cancer according to the present invention varies depending on the patient's age, symptoms, etc., and thus cannot be generally stated.
  • IL-18 is preferably 0.1 mg / kg
  • antibody is preferably 1 mg / kg to 20 mg / kg
  • antibody is 2.5 mg / kg to 5.0 mg / kg, or 3.0 mg More preferably, it is / kg to 5.0 mg / kg.
  • the mass ratio of IL-18 to the above-mentioned antibody as the active ingredient is as described above.
  • mice are used as subjects, but there is no significant difference between the dose per mouse body weight and the dose per human body weight.
  • IL-18 is 0.1 mg / kg
  • an administration form in which the antibody is administered 1 mg / kg to 20 mg / kg four times every three weeks is considered as an example.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient as described in Patent Document 3, for example.
  • a dosage form may further be included.
  • the carrier may be a sterile liquid such as water and peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, or oils containing petroleum, animal, plant, or synthetic oils.
  • water can be used as a carrier.
  • physiological saline and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers for injection solutions.
  • Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, flour, silica gel, magnesium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol , Water, ethanol and the like.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention may also contain a small amount of a humectant or emulsifier, or a pH buffer as necessary.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can take the form of a solution, suspension, emulsion, tablet, pill, capsule, powder, sustained-release preparation or the like.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can be formulated as a suppository having a conventional binder such as triglyceride and a carrier.
  • Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, or magnesium carbonate.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention may contain an appropriate amount of a carrier together with the above active ingredient. What is necessary is just to adjust the form of a formulation suitably according to an administration system.
  • the mode of administration of the cancer therapeutic drug according to the present invention to a patient is not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, the cancer therapeutic drug is used for intravenous administration to humans according to a conventionally known procedure.
  • Formulated as a compatible pharmaceutical composition are not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, the cancer therapeutic drug is used for intravenous administration to humans according to a conventionally known procedure.
  • a composition for intravenous administration is typically a solution in a sterile, isotonic aqueous buffer.
  • the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection.
  • the ingredients are supplied individually or in batches in unit dose form, for example, as a dry frozen powder or water free concentrate in a sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent.
  • a dry frozen powder or water free concentrate in a sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent.
  • IL-18 and the antibody do not necessarily have to be mixed in the cancer therapeutic agent. Therefore, IL-18 and the antibody may be supplied separately.
  • the cancer therapeutic agent When injecting and administering the above-mentioned cancer therapeutic agent, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or physiological saline.
  • sterile water for injection or an ampoule of physiological saline can be supplied to mix the components before administration.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can be formulated as a solution for parenteral administration or a lyophilized powder.
  • the powder can be reduced prior to use by the addition of a suitable diluent or other pharmaceutically acceptable carrier.
  • the liquid formulation can be a buffered and isotonic aqueous solution. Examples of suitable diluents are 5% standard dextrose in normal isotonic saline, water or sodium acetate buffer or ammonium acetate buffer.
  • the above preparation is suitable for parenteral administration, but can also be used for oral administration and stored in a dose-measuring inhaler or nebulizer for inhalation. It may be desirable to add excipients such as polyvinylpyrrolidone, gelatin, hydroxycellulose, acacia gum, polyethylene glycol, mannitol, sodium chloride, or sodium citrate to the cancer therapeutic.
  • excipients such as polyvinylpyrrolidone, gelatin, hydroxycellulose, acacia gum, polyethylene glycol, mannitol, sodium chloride, or sodium citrate to the cancer therapeutic.
  • the above cancer therapeutic agent can be encapsulated for oral administration, tableted, or prepared as an emulsion or syrup.
  • a pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier can be added to enhance or stabilize the cancer therapeutic agent and facilitate the preparation of the cancer therapeutic agent.
  • Solid carriers include starch, lactose, calcium sulfate dihydrate, clay, magnesium stearate or stearic acid, talc, pectin, acacia gum, agar, or gelatin.
  • Liquid carriers include syrup, peanut oil, olive oil, saline, and water.
  • the carrier may also include sustained release materials such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate, alone or with a wax.
  • the amount of solid carrier varies, but is about 20 mg to about 1 g per dosage unit.
  • the pharmaceutical formulations are made according to conventional pharmaceutical methods including tableting, if appropriate, milling, mixing, granulating and compressing, and, in the case of hard gelatin capsules, milling, mixing and filling.
  • the formulation is in the form of a syrup, elixir, emulsion, or aqueous or non-aqueous suspension.
  • Such liquid preparations can be administered orally (po) directly or filled into soft gelatin capsules.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can be used as an aqueous suspension or aqueous solution containing the above-mentioned cancer therapeutic agent buffered at physiological pH in a form prepared for injection.
  • aqueous carrier various aqueous carriers such as 0.4% physiological saline or 0.3% glycine can be used. These solutions are sterile and generally free of particulate matter.
  • the aqueous suspension or aqueous solution can be sterilized by a conventionally known sterilization method (for example, a filtration method).
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable auxiliary substance necessary to approximate physiological conditions, such as a pH adjusting agent or a buffering agent.
  • the concentration of the cancer therapeutic agent according to the present invention in such a pharmaceutical preparation containing a carrier, an auxiliary substance, etc. may be selected based on the fluid volume, consistency, etc., according to the specific administration method selected. .
  • Embodiment 2 Administration of a therapeutic drug for cancer according to the present invention
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention can be administered to a patient by any appropriate body route.
  • various conventionally known methods described in Patent Document 3 can be used. That is, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the compound, receptor-mediated endocytosis (eg, Wu et al., J. Biol. Chem., 262, 4429-4432). Page (1987)), various delivery systems such as retroviral vectors or construction of nucleic acids as part of other vectors are known and can be used to administer the cancer therapeutics of the present invention.
  • various delivery systems such as retroviral vectors or construction of nucleic acids as part of other vectors are known and can be used to administer the cancer therapeutics of the present invention.
  • Introduction methods include, but are not limited to, intradermal routes, intramuscular routes, intraperitoneal routes, intravenous routes, subcutaneous routes, intranasal routes, epidural routes, and oral routes.
  • the cancer therapeutics can be administered by any suitable route, such as infusion or bolus injection, absorption through the epithelium or mucocutaneous intima (eg, oral mucosa, rectum and intestinal mucosa, etc.) It can be administered with a bioactive agent.
  • Administration can be systemic or local.
  • Intrapulmonary administration can also be used, for example, by use of a formulation having an inhaler or nebulizer and an aerosol.
  • the dose of the active ingredient is 0.1 mg / kg for IL-18 and 1 mg / kg to 20 mg / kg for the antibody per body weight per administration. It is desirable to carry out so that it becomes kg, more preferably 2.5 mg / kg to 5.0 mg / kg or 3.0 to 5.0 mg / kg.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention is a combination of IL-18 and a predetermined antibody as active ingredients.
  • the combination and administering the cancer therapeutic agent according to the present invention compared to the case of using IL-18 alone and the case of using the antibody alone, The effect of synergistically improving the survival rate of mice transplanted with colon cancer cells causing peritoneal dissemination was achieved.
  • the effect is that IL-18 and anti-CTLA-4 antibody have a mass ratio of 1:25 to 1:50, IL-18 is 2 ⁇ g / 25 g, and anti-CTLA-4 antibody is 50 to 50%.
  • IL-18 is 2 ⁇ g / 25 g
  • anti-CTLA-4 antibody is 50 to 50%.
  • mice survived 60 days after the transplantation of colon cancer cells, and ascites did not accumulate, no autoimmune-like lesions were observed, and the mice remained healthy. . That is, it was considered that no side effects occurred.
  • the number of intraperitoneal exudate cells could be increased continuously for a long period of time by the above-mentioned combination, and the survival effect of mice due to the intraperitoneal exudate cells was also observed.
  • active NK cells proliferate and exist for a long time and decrease in inflammation-suppressing cells such as CD4-positive CD25-positive T cells. .
  • IL-18 promotes enhancement of effector cells such as NK cells, makes activated effector cells long and persistent, and reduces inflammation-suppressing cells. It is considered that the antitumor effect of the antibody used in combination can be further enhanced.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention has an advantage that there are few such side effects. .
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can be applied to the treatment of various cancers.
  • Applicable cancer types include, for example, squamous cell carcinoma (cervical canal, sputum, conjunctiva, vaginal lung, oral cavity, skin, bladder, tongue, larynx, esophagus), and adenocarcinoma (eg, prostate, small intestine, uterus) Endometrium, cervix, large intestine, lung, pancreas, esophagus, rectum, uterus, stomach, breast, ovary).
  • sarcomas eg, myogenic sarcomas
  • leukemias eg, neuromas, melanomas, lymphomas are also included in the applicable cancer types.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention includes IL-18 and anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD33 antibody and anti-CD52 antibody. It contains one or more antibodies selected from the group consisting of as an active ingredient.
  • IL-18 promotes the proliferation, survival, and differentiation of effector cells, and suppresses the proliferation of inhibitory T cells. It is estimated that the effect can be remarkably enhanced.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention can exhibit a very excellent antitumor effect that is synergistic as compared with the case of using only the above antibody or the case of using only IL-18. Moreover, it is very effective in suppressing peritoneal dissemination that is difficult to treat, while side effects may be reduced.
  • the antibody is preferably an anti-PD-L1 antibody and / or an anti-CTLA-4 antibody.
  • IL-18 since IL-18 is used in combination, a significantly superior antitumor effect can be obtained as compared with the case of using anti-PD-L1 antibody or anti-CTLA-4 antibody alone. Therefore, it is possible to further enhance the antitumor effect of these antibodies that have a proven track record in cancer treatment and to provide better cancer therapeutic agents.
  • the antibody when the antibody is an anti-PD-L1 antibody and an anti-CTLA-4 antibody, as shown in Examples described later, IL-18 and an anti-PD-L1 antibody or an anti-CTLA-4 antibody Compared with a cancer therapeutic agent containing, a synergistic and extremely excellent antitumor effect can be obtained, not just an additive effect.
  • the ratio of the mass of IL-18 to the total mass of the one or more antibodies is preferably 1:25 to 1: 200.
  • the dose of IL-18 and antibody to the living body can be an appropriate amount, the above synergistic and excellent antitumor effect is achieved. It is preferable in obtaining.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention is preferably a therapeutic agent for one or more cancers selected from the group consisting of stomach cancer, colon cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, and leukemia.
  • the above cancer is often accompanied by peritoneal dissemination of the tumor, and even when the tumor is excised, peritoneal dissemination may occur.
  • peritoneal dissemination may occur.
  • the high therapeutic effect with respect to peritoneal dissemination can be shown.
  • a cell line of CT-26 mouse colon cancer cells was purchased from the American Type Culture Collection, and at 10 ° C fetal bovine serum (FBS, Bio West) and penicillin / streptomycin (at 37 ° C, 5% CO 2 atmosphere). It was maintained in RPMI1640 medium (Nacalai Tesque) containing Gibco BRL, USA).
  • the cells are Ca 2+ and Mg 2+ free Dulbecco's PBS containing 0.05% trypsin and 0.01% EDTA (pH 7.4, manufactured by Nacalai Tesque, Inc., hereinafter referred to as “trypsin-EDTA”). And recovered.
  • IL-18 Reagents Recombinant mouse IL-18 (manufactured by GlaxoSmithKline, product number SB-528775, hereinafter simply referred to as “IL-18”) was used that was distributed with the enjoyment of GlaxoSmithKline plc.
  • Anti-mouse CD152 / CTLA-4 monoclonal antibody (mAb, clone UC10-4F10-11; hereinafter simply referred to as “anti-CTLA-4 antibody”) and anti-mouse PD-L1 antibody (clone 10F.9G2; hereinafter simply referred to as “anti-PD- “L1 antibody”) was purchased from BioXcell.
  • Rabbit anti-asialo GM1 antibody (catalog number: 014-09801, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), anti-CD8 antibody (catalog number SC-18913, manufactured by Santa Cruz) and rabbit IgG (catalog number: PM035, manufactured by MBL) are all available It is a commercially available antibody.
  • the lymphocytes were in RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque) containing 10% fetal bovine serum, L-glutamine (Gibco BRL), penicillin / streptomycin, and 2-mercaptoethanol (Sigma M7154).
  • the cells were cultured at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% CO 2 .
  • Adoptive cell transfer PEC for adoptive cell transfer experiment was prepared from the peritoneal cavity of mice transplanted with CT-26 cells. Mice were injected intraperitoneally 3 days after the day of CT-26 cell transplantation with therapeutic combinations of various combinations of anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18. PEC was collected 4 days after the intraperitoneal injection of the therapeutic agent. Most of the collected cells were lymphocytes. The lymphocytes were washed and suspended in PBS to a cell density of 2.5 ⁇ 10 7 cells / ml to prepare a cell suspension.
  • 0.2 ml of the cell suspension (about 5 ⁇ 10 6 cells / mouse) was injected into the abdominal cavity of a mouse transplanted with CT-26 cells 3 days and 7 days after the transplantation. , Injected 11 days later.
  • Cell surface markers include FITC-labeled anti-CD4 antibody (manufactured by eBioscience, clone GK1.5), APC-labeled anti-CD8 antibody (manufactured by Biolegend, clone 54-6.7), and biotin-labeled anti-CD8 antibody (manufactured by eBioscience, clone 53-6).
  • the cells were stained with a monoclonal antibody specific for CD4, CD8, CD11c, CD45R / B220, CD49b and labeled with FITC, PE, APC, or biotin, and then analyzed using a FACS Calibur flow cytometer.
  • An anti-mouse CD16 / 32 antibody (manufactured by eBioscience, clone 93) was used as an Fc blocker.
  • Data was analyzed using Cell Quest software (registered trademark, Beckton Dickinson Biosciences).
  • the conditions of flow cytometry are constant, and the flow cytometry was performed according to the conditions described in Becton-Dickinson's immunocytometry systems, 1995.
  • the expression intensity of a cell surface marker means the expression intensity measured by flow cytometry.
  • Example 1 Effect of cancer therapeutic agent containing anti-CTLA-4 antibody and IL-18 on survival rate of mice administered intraperitoneally with CT-26 cells]
  • CT-26 cells described in (1) of the above experimental method 0.25 ml of a suspension having a cell concentration of 5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml was injected into the peritoneal cavity of the BALB / C wild type mouse. And transplanted.
  • mice are administered with 100 ⁇ g of rabbit IgG as a control; a group administered with 2 ⁇ g of IL-18 alone; a group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody only; 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and IL-
  • the group was divided into groups administered with 18 to 2 ⁇ g, and each group consisted of 5 mice.
  • the therapeutic agent was injected intraperitoneally four times in total, 3 days, 7 days, 10 days, and 14 days after the CT-26 cell injection.
  • the experiment was repeated three times.
  • the doses ( ⁇ g) of the above rabbit IgG antibody, anti-CTLA-4 antibody and IL-18 are doses per 25 g body weight of the mouse.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of observing the effect of administering a cancer therapeutic agent containing anti-CTLA-4 antibody and IL-18 as the survival rate of mice from 3 days after the transplantation of CT-26 cells. It is.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the day of transplantation (intraperitoneal injection) of CT-26 cells, and the vertical axis indicates the survival rate of mice.
  • the survival rate began to decrease 24 days after the day of transplanting CT-26 cells, and all mice died after 27 days.
  • the group administered with IL-18 alone and the group administered with only the anti-CTLA-4 antibody showed a similar decrease in survival rate, and all mice died after 42 days and 49 days, respectively.
  • mice were not weak and kept healthy.
  • Example 2 Dose effect of anti-CTLA-4 antibody and IL-18] Regarding the CT-26 cells described in (1) of [Experimental method], 0.25 ml of a suspension with a cell concentration of 5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected and transplanted.
  • mice are administered with 100 ⁇ g of rabbit IgG as a control; group with 25 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g of IL-18; group with 50 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g of IL-18 Divided into a group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g of IL-18; a group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 1 ⁇ g of IL-18-, and each group was composed of 5 mice.
  • the therapeutic agent was injected intraperitoneally four times in total, 3 days, 7 days, 10 days, and 14 days after the CT-26 cell injection.
  • the doses ( ⁇ g) of the above rabbit IgG antibody, anti-CTLA-4 antibody and IL-18 are doses per 25 g body weight of the mouse.
  • FIG. 2 is a graph showing the dose effect of anti-CTLA-4 antibody and IL-18 as the survival rate of mice administered intraperitoneally with CT-26 cells, as in Example 1.
  • the horizontal and vertical axes are the same as in FIG.
  • the survival rate began to decrease 24 days after the day of transplantation of CT-26 cells, and all mice died after 28 days.
  • the survival rate decreased 28 days after the transplantation date of CT-26 cells in the group administered with 25 ⁇ g anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g IL-18 ⁇ g. Initially, all mice died after 42 days. However, the survival effect was seen compared with the control.
  • the survival rate decreased to 80% 35 days after the CT-26 cell transplantation day, but the survival rate was maintained after 60 days. Surviving mice were in good health.
  • mice survived even 60 days after the administration date. Was. The mice were in good health.
  • Example 3 Effect of therapeutic agent containing anti-PD-L1 antibody and IL-18 on the survival rate of mice transplanted intraperitoneally with CT-26 cells
  • 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected and transplanted.
  • mice were administered with 100 ⁇ g of rabbit IgG as a control; 2 ⁇ g of IL-18 alone; 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody alone; 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody and IL-
  • the group was divided into groups administered with 18 to 2 ⁇ g, and each group consisted of 5 mice.
  • the therapeutic agent was injected intraperitoneally four times in total, 3 days, 7 days, 10 days, and 14 days after the CT-26 cell injection. The above dose is the amount per 25 g of mouse body weight.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of a cancer therapeutic agent containing an anti-PD-L1 antibody and IL-18 as the survival rate of mice in the same manner as in Example 1.
  • the horizontal and vertical axes are the same as in FIG.
  • the transition of the survival rate of the group administered with only the control and IL-18 is the same as in Example 1.
  • the group administered with anti-PD-L1 antibody and IL-18 showed the same tendency as the group administered with IL-18 until 35 days after the day of transplantation of CT-26 cells, but after 35 days, In the group administered with IL-18 alone, all mice died after 42 days, whereas the survival rate remained at 60% even after 60 days. The surviving mice were in good health.
  • IL-18 and anti-PD-L1 antibody can be obtained by administering anti-PD-L1 antibody and IL-18, that is, by using anti-PD-L1 antibody and therapeutic agent containing IL-18. It was revealed that a very excellent synergistic anti-tumor effect was exhibited, not just an additive anti-tumor effect.
  • anti-tumor effect of anti-PD-L1 antibody can be remarkably enhanced by using IL-18 together with anti-PD-L1 antibody.
  • anti-PD-L1 antibody is known to have fewer side effects than anti-CTLA-4 antibody, the above synergistic anti-tumor effect provides a therapeutic agent for cancer with high anti-tumor effect and few side effects. Can be provided.
  • Example 4 Effect of cancer therapeutic agent containing anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody and IL-18 on the survival rate of mice transplanted intraperitoneally with CT-26 cells (part 1)] 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected and transplanted.
  • mice are administered with a group of 100 ⁇ g of rabbit IgG as a control; a group of 2 ⁇ g of IL-18 alone; a group of 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g of IL-18; an anti-PD-L1 antibody Group administered 100 ⁇ g and IL-18 2 ⁇ g; group administered 100 ⁇ g anti-CTLA-4 antibody and 100 ⁇ g anti-PD-L1 antibody; administered 100 ⁇ g anti-CTLA-4 antibody, 100 ⁇ g anti-PD-L1 antibody, and administered IL-18 2 ⁇ g
  • Each group consisted of 5 mice. Seven days after the day of CT-26 cell injection, the therapeutic agent was injected intraperitoneally, and then the therapeutic agent was injected intraperitoneally four times every four days.
  • FIG. 4 shows that 7 days after the transplantation of CT-26 cells, a cancer therapeutic agent containing anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18, etc. was administered, and thereafter every 4 days, It is a figure which shows the effect at the time of administering 4 times as a survival rate of a mouse
  • the horizontal and vertical axes are the same as in FIG.
  • the above dose is the amount per 25 g of mouse body weight.
  • Example 4 unlike Examples 1 to 3, administration of the therapeutic agent was started 7 days after the day when CT-26 cells were transplanted intraperitoneally. That is, administration of the therapeutic agent is started after the tumor has grown than in Examples 1 to 3, but as shown in FIG. 4, rather than the group administered with anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody, The group administered with anti-CTLA-4 antibody and IL-18 and the group administered with anti-PD-L1 antibody and IL-18 showed much higher survival rate. In addition, the surviving mice were in good health.
  • FIG. 5 shows the effect of administering a cancer therapeutic agent containing anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18, etc. 14 days after the day of transplantation of CT-26 cells. It is a figure shown as a rate.
  • the horizontal and vertical axes are the same as in FIG.
  • Example 4 As therapeutic agents, 100 ⁇ g of the control used in Example 4; 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody; 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody, 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody, and 2 ⁇ g of IL-18IL The experiment was carried out in the same manner as in Example 4 except that the therapeutic agent was injected intraperitoneally 14 days after the day of transplantation of CT-26 cells intraperitoneally. The above dose is the amount per 25 g of mouse body weight.
  • anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18 were administered as cancer therapeutic agents compared to the case of administering anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody. It can be seen that the case shows a higher survival rate.
  • Example 5 since administration of the cancer therapeutic agent was started 14 days after tumor transplantation, when the cancer therapeutic agent was administered, a tumor mass was already formed and ascites retention was also observed. Nevertheless, a clear life-prolonging effect was observed when anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18 were used. This is because therapeutic agents containing anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18 can obtain a therapeutic effect even when administered after the tumor mass is formed. It suggests that there is.
  • Example 6 Change in the number of peritoneal exudate cells
  • anti-CTLA-4 antibody and IL-18; anti-PD-L1 antibody and IL-18; and anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 transplant CT-26 cells 2 shows that the number of peritoneal exudate cells (PEC) in the isolated mice can be increased.
  • Example 2 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected. Three days after the injection, each mouse was injected intraperitoneally with the following therapeutic agent. Prepare 16 mice for each type of therapeutic agent, collect PEC from 4 mice each day 1 to 4 days after the administration of the therapeutic agent, count the number of PECs using a counter, and The average number of PECs was determined.
  • FIG. 6 shows anti-CTLA-4 antibody and IL-18; anti-PD-L1 antibody and IL-18; anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL- 3 days after the day of transplantation of CT-26 cells.
  • 18 is a graph showing changes in the number of peritoneal exudate cells (PEC) for 4 days in mice to which 18 was administered. The horizontal axis represents the number of days from the day when the therapeutic agent was administered, and the vertical axis represents the number of PECs per mouse (average value of 4 mice).
  • PEC peritoneal exudate cells
  • FIG. 6 (a) shows a group administered with 100 ⁇ g of rabbit IgG as a control as a therapeutic agent; a group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody only; a group administered with 2 ⁇ g of IL-18 only; 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody And changes in the number of PECs in the group administered with IL-18 2 ⁇ g.
  • FIG. 6 (b) shows a group administered with 100 ⁇ g of the above rabbit IgG as a therapeutic agent; a group administered with 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody only; a group administered with 2 ⁇ g of IL-18 only; 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody and IL It shows the change in the number of PECs in the group administered with ⁇ 18 to 2 ⁇ g.
  • FIG. 6 (c) shows a group administered with 100 ⁇ g of the above rabbit IgG as a therapeutic agent; a group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody; 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody, and anti-PD-L1 antibody
  • the change of the number of PECs in the group administered with 100 ⁇ g and IL-18 2 ⁇ g is shown.
  • “NE-PEC” is peritoneal exudate cells of mice administered with rabbit IgG as a control. The above dose is the amount per 25 g of mouse body weight.
  • the dosage of the cancer therapeutic agent is the same as that shown in FIG. 6 for both the first administration and the second administration.
  • FIG. 7 shows the result.
  • (A) of FIG. 7 shows the day when CT-26 cells were transplanted into the abdominal cavity (in the figure, “Shot 1”), with the first administration day of the cancer therapeutic agent as day 0 (shown as “Shot 1” in the figure).
  • “CT-26 cell inoculated”) the day when PEC was collected and analyzed (indicated as 1-8 and AnalysisA1-7 in the figure), and the second day of administration of the above cancer drug (in the figure) , “Shot 2”).
  • (B) in FIG. 7 represents the number of PECs per mouse (average value of 4 mice) on day 0 to day 8 shown in (a) of FIG. Up to the fourth day, the result is the same as that shown in FIG.
  • Example 7 Life prolongation effect by peritoneal exudate cells
  • 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected and transplanted. Then, as described in (3) of [Experimental method] above, the cancer therapeutic agent was injected intraperitoneally 3 days after the day of transplantation of CT-26 cells.
  • cancer therapeutic agents include rabbit IgG in the amounts described in FIG. 6 (c) in Example 6; anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody; anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 Antibody and IL-18 were used.
  • FIG. 8 is a graph showing the survival effect when adoptively transferring PEC induced by anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18 to tumor-bearing mice.
  • the horizontal axis represents the number of days from the day when PEC was intraperitoneally administered, and the vertical axis represents the survival rate of mice.
  • control ⁇ PECs is obtained by administering rabbit IgG as a therapeutic agent, and“ ⁇ CTLA-4 + ⁇ PD-L1 induced PECs ”is administered by anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody as therapeutic agents.
  • Induced PEC hereinafter referred to as “PEC-1” in this section
  • ⁇ CTLA-4 + ⁇ PD-L1 + IL-18 induced PECs treats anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18.
  • PEC induced by administration as a drug hereinafter referred to as “PEC-2” in this section) represents the results when each was administered.
  • mice administered with PEC-1 As can be seen from FIG. 8, in the control, all mice died 28 days after the intraperitoneal administration of PEC. In mice administered with PEC-1, a life-prolonging effect was seen as compared with the control, but all mice died 35 days after the intraperitoneal administration of PEC-1. On the other hand, mice administered with PEC-2 showed a survival rate of 20% even 58 days after the day of administration, showing a slightly longer life-span effect than when PEC-1 was administered.
  • Example 8 Enhancement of NK cells in peritoneal exudate cells
  • the therapeutic agents used in Example 6 only anti-PD-L1 antibody; IL-18 only; anti-PD-L1 antibody and IL-18; anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody;
  • What kind of trait is the intraperitoneal exudate cells induced by intraperitoneal administration of anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 to mice in the same manner as in Example 6?
  • As intraperitoneal exudate cells subjected to flow cytometry 5 mice were used for each therapeutic agent, and cells collected 4 days after the day of administration of the therapeutic agent were used.
  • Flow cytometry was carried out using the APC-labeled anti-CD45R / B220 antibody (manufactured by Biolegend, clone RA3-6B2), anti-NKG2D antibody (BD-pharmingem562347) and PE-labeled anti-CD49b antibody (Beckton) shown in (4) of [Experimental Method] above.
  • the method was carried out by the method shown in (4) of [Experimental method] above.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of examining the expression intensities of B220 (CD45R), NKG2D, and DX5 (CD49b), which are surface markers, respectively.
  • (A) to (j) horizontal axis is DX5 expression intensity
  • (a) to (e) vertical axis is B220 (CD45R) expression intensity
  • (f) to (j) vertical axis is NKG2D expression intensity Represents.
  • the notations such as “day 3.036” in (a) to (j) indicate that PEC collected three days after the day of administration of the therapeutic agent was analyzed.
  • Each of (a) to (e) of FIG. 9 is divided into four areas as shown in the figure, but the cells present in the upper right area have high B220 (CD45R) expression intensity, and It can be said that the expression intensity of DX5 is high.
  • 9 (f) to (j) are also divided into four areas, but the cells present in the upper right area have high expression intensity of NKG2D and high expression intensity of DX5. .
  • Example 9 Maintenance of NK cells induced in mouse abdominal cavity
  • anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 are administered as cancer therapeutic agents, whether or not NK cells induced in the peritoneal cavity can be maintained even after a long period of time has elapsed since administration. We examined whether.
  • Example 2 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected. Three days after the injection, the following therapeutic agents were injected intraperitoneally.
  • anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody, or anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 are intraperitoneally administered to mice in the same manner as in Example 6.
  • the PEC recovered 11 days after the day of administration was analyzed.
  • Flow cytometry was performed using the above APC-labeled anti-CD45R / B220 antibody (manufactured by Biolegend, clone RA3-6B2), PE-labeled anti-CD49b antibody (manufactured by Beckton Dickinson, clone DX5), and anti-NKG2D antibody (BD Pharmingen562349). It was carried out by the method shown in (4) of [Experiment Method].
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of examining the expression intensity of the surface markers B220 (CD45R), NKG2D and DX5 (CD49b) in the PEC. 10A to 10C, the horizontal axis represents the expression intensity of DX5, and the vertical axis represents the expression intensity of B220 (CD45R).
  • FIG. 10 (A) and (d) of FIG. 10 are controls, and represent the data of PEC collected after CT-26 cells were transplanted and not administered with a therapeutic agent.
  • FIGS. 10B and 10E show the cases where anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody are used as therapeutic agents.
  • FIGS. 10C and 10F show anti-CTLA-4 antibody The data of PEC when PD-L1 antibody and IL-18 were used are shown, respectively.
  • the region indicated by “R5” indicates PEC that can be said to have high expression intensity of DX5 and B220 (CD45R).
  • the proportion of the PEC in the whole cell was 43.93%, but it was 11 from the day when the anti-CTLA-4 antibody and the anti-PD-L1 antibody were administered.
  • the ratio was not so different as 45.57% ((b) of FIG. 10).
  • the ratio was as high as 59.79% ((c) in FIG. 10).
  • the horizontal axis of (d) to (f) in FIG. 10 represents the expression intensity of NKG2D
  • the vertical axis represents the number of cells. The relationship between the expression intensity of NKG2D and the number of cells did not change much in (d) to (f) of FIG.
  • NK cells cells having high expression intensity of DX5 and B220 (CD45R)
  • the therapeutic agent according to the present invention can enhance effector cells that attack and destroy tumor cells, and can exist for a long time.
  • Example 10 Reduction of CD4-positive CD25-positive T cells
  • changes in the number of CD4-positive CD25-positive T cells in mice administered with the cancer therapeutic agent according to the present invention were examined.
  • Example 2 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration as used in Example 1 (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was intraperitoneally injected into the BALB / C wild type mouse. Injected and transplanted. Three days after the injection, the following therapeutic agents were injected intraperitoneally.
  • Anti-PD-L1 antibody only; IL-18 only; anti-PD-L1 antibody and IL-18; anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody; anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody The collected PEC was analyzed 7 days after the administration using IL-18 and IL-18. The dose is the same as in Example 6.
  • FIG. 11 shows the results of confirming that the therapeutic agent according to the present invention reduces the number of CD4-positive CD25-positive T cells.
  • FIG. 11 show anti-PD-L1 antibody, IL-18, anti-PD-L1 antibody and IL-18, anti-CTLA-4 antibody and The results of using anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 are shown.
  • (A) to (e) show the ratio of CD4 positive T cells to the whole PEC. The obtained result is shown.
  • the horizontal axis of (a) to (e) represents the expression intensity of TCR- ⁇ (T cell receptor ⁇ ), and the vertical axis represents the expression intensity of CD4.
  • the encircled region is a region where CD4 positive T cells are present.
  • the numeral “20.35%” in FIG. 11 (a) is the ratio of CD4 positive T cells present in the circled region to the whole PEC.
  • FIGS. 11 (f) to (j) show the detection results of CD4 positive CD25 positive T cells.
  • the horizontal axis represents the expression intensity of CD4 positive CD25 positive T cells, and the vertical axis represents CD4 positive CD25 positive T cells. Each cell number is shown.
  • the numerical values in the figures (f) to (j) indicate the proportion of CD4 positive CD25 positive T cells in the CD4 positive T cells existing in the circled areas in FIGS. 11 (a) to (e). Yes.
  • CD4-positive T cells and CD25-positive T cells are inhibitory lymphocytes (Tregs) that have a function of suppressing immune reactions and inflammatory reactions when cancer cells proliferate. In other words, the increase in the number of cells helps the growth of cancer cells.
  • Tregs inhibitory lymphocytes
  • CD4 positive cells were obtained when anti-PD-L1 antibody and IL-18 were used rather than when only anti-PD-L1 antibody and IL-18 were used. It can be seen that is decreasing.
  • anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 were used rather than the case of using anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody. In the case, it can be seen that the number of CD4 positive cells is decreased.
  • the proportion of CD4-positive CD25-positive T cells was also higher than that in the case of using only anti-PD-L1 antibody and IL-18 alone, and anti-PD-L1 antibody and IL- 18 is less, and when using anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 than using anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody It can be seen that there are few.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention further suppresses the proliferation of inhibitory lymphocytes compared to the case of using only the antibody. This is presumably because the inhibitory effect of the inhibitory lymphocyte proliferation by the antibody was further enhanced by the combined use of IL-18.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can promote the enhancement and proliferation of effector cells as described above.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can suppress the proliferation of inhibitory lymphocytes and can promote the enhancement and proliferation of effector cells, it can exert a very high antitumor effect. It is considered possible.
  • Example 11 Importance of NK cells for antitumor effect
  • an anti-asialo GM1 antibody that is an antibody against NK cells was used to examine the role of NK cells in the antitumor effect of the cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • Rabbit anti-asialo GM1 antibody 50 ⁇ l or rabbit IgG 50 ⁇ g was diluted to 250 ⁇ l with PBS and injected intraperitoneally into mice one day before CT-26 cell transplantation.
  • the rabbit anti-asialo GM1 antibody or rabbit IgG was injected again with 250 ⁇ l of the diluted solution again 3 days after the intraperitoneal injection, and then the 250 ⁇ l of diluted solution was injected twice every 4 days.
  • Intraperitoneal injection That is, the intraperitoneal injection was carried out 1 day, 2 days, 6 days, and 10 days after CT-26 cell transplantation.
  • mice are divided into groups that receive 50 ⁇ g of rabbit IgG as a control as a therapeutic agent; groups that receive 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody, 100 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody, and 2 ⁇ g of IL-18. Of mice.
  • Example 2 One day after the intraperitoneal injection of the anti-asialo GM1 antibody or rabbit IgG, a suspension of CT-26 cells having the same cell concentration (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) used in Example 1 was used. The suspension was injected into the peritoneal cavity of 0.25 ml of the BALB / C wild type mouse. Then, 3 days after the injection, the therapeutic agent was injected intraperitoneally, and then every 4 days for a total of 4 times (that is, 3 days, 7 days, 11 days after the transplantation of CT-26 cells). After 15 days, the therapeutic agent was injected intraperitoneally.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of an anti-asialo GM1 antibody that destroys and removes natural killer (NK) cells on the survival rate of mice administered with a cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • FIG. 12 (a) shows the administration schedule of the above-mentioned rabbit anti-asialo GM1 antibody or rabbit IgG and the above therapeutic agent.
  • FIG. 12B shows experimental results.
  • FIG. 12 (a) shows a schedule in which the therapeutic agent is administered 3 days, 7 days, 11 days, and 15 days later, with the day when CT-26 cells are transplanted as zero day, as described above. ing.
  • the lower part of FIG. 12 (a) shows the schedule of administering the rabbit anti-asialo GM1 antibody or rabbit IgG 1 day before, 2 days, 6 days, and 10 days after the CT-26 cell transplantation as described above. .
  • the white circles represent the control (rabbit IgG administered 1 day before CT-26 cell transplantation, 2 days, 6 days, and 10 days after transplantation, and rabbit IgG was also administered as a therapeutic agent as described above. ), Triangles are administered rabbit IgG 1 day prior to CT-26 cell transplantation and 2 days, 6 days and 10 days after transplantation, and anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and A group administered IL-18 (hereinafter referred to as “Group 1”), and a square represents a group administered with an anti-asialo GM1 antibody instead of rabbit IgG in an experiment similar to that indicated by a triangle (hereinafter referred to as “Group 2”). Result).
  • the horizontal axis of FIG. 12 (b) indicates the number of days from the day when CT-26 cells were administered, and the vertical axis indicates the survival rate of the mice.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention promotes the induction of active NK cells into the peritoneal cavity. This is considered to be because IL-18 promotes the induction by the antibody.
  • IL-18 promotes the induction by the antibody.
  • NK cells were decreased by the antibody, and it is considered that the result as shown in FIG. 12 was obtained.
  • activated NK cells induced by antibodies and IL-18 play an important role in the antitumor effect of the cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • Example 12 Change in the number of NK cells in mice administered with anti-asialo GM1 antibody
  • the PEC of mice administered with anti-asialo GM1 antibody was analyzed by flow cytometry, and changes in the number of NK cells were examined.
  • Example 11 Prepare 5 mice each of group 1 and group 2 of Example 11, and administer anti-asialo GM1 antibody or rabbit IgG, transplantation of CT-26 cells, and administration of therapeutic agents according to the same schedule as in Example 11.
  • the PEC was collected 4 days after the administration of the therapeutic agent and subjected to flow cytometry.
  • FIG. 13 is a diagram showing the difference in the analysis results of mouse-derived PEC depending on whether or not anti-asialo GM1 antibody was administered.
  • (A) to (d) of FIG. 13 show the analysis results of PEC derived from mice (Group 1) not administered with anti-asialo GM1 antibody, and (e) to (h) show anti-asialo GM1 antibody.
  • the analysis result of PEC derived from the administered mouse (Group 2 above) is shown.
  • the horizontal axis indicates the expression intensity of DX5
  • the vertical axis indicates the expression intensity of B220 (CD45).
  • R4 represents a cell expressing NKG2D
  • R5 represents a T cell
  • R6 represents an NK cell (including Pre-mMK).
  • R4 is 47.91%, R5 is 21.99%, and R6 is 16.96%.
  • R4 is 36.82%, R5 is 48.97%, and R6 is 4.45%.
  • FIG. 13 represent the number of cells expressing NKG2D present in R4 of (a) and (e), respectively, and (c) and (g) of FIG. Each represents the number of T cells present in R5 in (a) and (e), and (d) and (h) in FIG. 13 respectively represent NK cells (in R6 in (a) and (e) ( (Including Pre-mMK).
  • FIG. 13 shows that in the PEC derived from group 2 above, the proportion of NK cells is significantly reduced and the proportion of T cells is increased. Such a decrease in NK cells is thought to have resulted in the results shown in FIG. That is, it is considered that active NK cells induced by antibodies and IL-18 play an important role in the antitumor effect of the cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • Example 13 Change in expression of cell surface markers specific to NK cells by administration of anti-asialo GM1 antibody
  • the PEC of mice administered with anti-asialo GM1 antibody was analyzed by flow cytometry, and changes in the expression of cell surface markers specific for NK cells were examined.
  • a PE-labeled anti-CD69 antibody (manufactured by eBiocience, clone H1.2F3) and a PE-labeled anti-CD49b antibody (manufactured by Beckton Dickinson, clone DX5), and the method described in (4) of [Experimental method] above. .
  • FIG. 14 is a diagram showing the difference in analysis results of surface markers in mouse-derived PEC depending on whether or not anti-asialo GM1 antibody is administered.
  • (A) to (d) of FIG. 14 show the results of analysis of the surface marker of PEC derived from mice (Group 1) not administered with anti-asialo GM1 antibody, and (e) to (h) show anti-asialo
  • mouth (the said group 2) which administered GM1 antibody is shown.
  • the horizontal axis shows the expression intensity of DX5, and the vertical axis shows the expression intensity of each surface marker.
  • NK1.1, CD11c, CD62L, and CD69 shown in FIG. 14 are all surface markers specific to NK cells (including Pre-mMK). Comparing (a) to (d) and (e) to (h) in FIG. 14, it can be seen that the cells expressing any surface marker are decreased in the PEC derived from group 2 above. Such a decrease in NK cells is thought to have resulted in the results shown in FIG. That is, it is considered that active NK cells induced by antibodies and IL-18 play an important role in the antitumor effect of the cancer therapeutic agent according to the present invention.
  • Example 14 Increase of CD4-positive CD25-positive T cells by administration of anti-asialo GM1 antibody
  • the PEC of mice administered with anti-asialo GM1 antibody was analyzed by flow cytometry, and changes in the number of CD4-positive CD25-positive T cells were examined.
  • Flow cytometry was carried out using the above-mentioned FITC-labeled anti-CD4 antibody (manufactured by eBioscience, clone GK1.5), APC-labeled anti-CD8 antibody (manufactured by Biolegend, clone 54-6.7), PE-labeled anti-CD25 antibody (manufactured by BD Bioscience, clone PC). -61) and the method shown in (4) of [Experimental method] above.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of confirming the expression intensity of CD4-positive T cells and CD8-positive T cells and the number of CD25-positive T cells in mouse-derived PECs with and without administration of anti-asialo GM1 antibody. .
  • the horizontal axis indicates the expression intensity of TCR- ⁇
  • the vertical axis indicates the expression intensity of CD4.
  • the horizontal axis indicates the expression intensity of CD25
  • the vertical axis indicates the number of CD4-positive CD25-positive T cells.
  • the horizontal axis indicates the expression intensity of TCR- ⁇
  • the vertical axis indicates the expression intensity of CD8.
  • CD4-positive T cells and CD25-positive T cells are inhibitory T lymphocytes, and the increase in the number of cells helps the growth of cancer cells.
  • CD8 positive T cells are cells having an antitumor effect.
  • the ratio of CD4 positive T cells present in the upper right area in the figure to the total PEC is 7.59% to 17 from the comparison between (a) and (c) of FIG. It can be seen that it has greatly increased to 0.02%.
  • mice pre-administered with anti-asialo GM1 antibody even when anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody, and IL-18 were administered, inhibitory lymphocytes were increased and CD8 positive T cells were It shows that it will decrease.
  • NK cells are known to activate CD8-positive T cells. When NK cells decrease, CD8-positive T cells also decrease.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present invention was superior by activating NK cells, making NK cells active for a long period of time, and consequently activating CD8-positive T cells. It is suggested to show an antitumor effect.
  • Example 15 therapeutic effect on ascites retention
  • the effect of the therapeutic agent for cancer according to the present invention on the accumulation of ascites in mice transplanted with tumor cells was examined.
  • a suspension of CT-26 cells (5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was injected into the peritoneal cavity of 0.25 ml of the BALB / C wild type mouse.
  • the mice were divided into groups that received 100 ⁇ g of rabbit IgG as a therapeutic agent; groups that received 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody; and groups that received 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 2 ⁇ g of IL-18. Consisted of 5 mice.
  • the therapeutic agent was injected intraperitoneally, and then the therapeutic agent was injected intraperitoneally four times every four days. Then, the therapeutic effect on the accumulation of ascites was examined 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells.
  • FIG. 16 is an appearance photograph showing the presence or absence of ascites for each group of mice 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells.
  • FIG. 17 is a diagram showing changes in the abdominal circumference of the mice in each group.
  • the horizontal axis represents the number of days from the day when CT-26 cells were transplanted, and the vertical axis represents the abdominal circumference (mm).
  • the abdominal circumference was measured for the mice constituting each group, and the average value was obtained.
  • FIG. 18 is a diagram showing changes in the body weight of the mice in each group.
  • the horizontal axis is the same as in FIG. 17, and the vertical axis represents body weight (g).
  • the body weight was measured for the mice constituting each group, and the average value was determined.
  • the control showed a significant increase due to the accumulation of ascites, and even in mice administered with anti-CTLA-4 antibody, the body weight increased to the same weight as the control after 42 days after transplantation of CT-26 cells. .
  • mice administered with the anti-CTLA-4 antibody and IL-18 did not show ascites retention, and as shown in FIG. 18, the body weight was clearly suppressed to be low and maintained in a low state.
  • FIG. 19 shows the abdominal cavity of the above-mentioned control (FIG. 19 (a)) and the mouse administered with the anti-CTLA-4 antibody (FIG. 19 (b)) 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells. It is a figure which shows a mode. As shown in FIG. 19, in both cases, many tumor masses were observed, and organ adhesions were also observed.
  • FIG. 20 shows the control (FIG. 20 (a) and its enlarged view (b)) and a mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 (FIG. 20 (c)).
  • FIG. 20 (c) shows the control
  • FIG. 20 (c) shows the control
  • FIG. 20 (c) shows the control
  • FIG. 20 (c) shows the mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18
  • FIG. 20 (c) shows the control
  • FIG. 20 (c) and its enlarged view (b) a mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18
  • FIG. 21 is a view showing the appearance of the small intestine 21 days after the day of transplanting CT-26 cells, which is the control.
  • FIG. 22 is a view showing the appearance of the small intestine 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells in a mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18. As is clear from the comparison between the two, many tumor masses were formed in the control, whereas almost no tumor mass was observed in the mice administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18. Was not.
  • FIG. 23 shows the control (FIGS. 23 (a) to (c)) and mice administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 (FIG. 23 (d) to (f)). ) And a portion of the duodenum ((a), (d)), small intestine ((b), (e)), large intestine ((c), (f)) 21 days after the day of transplantation of CT-26 cells It is a figure which shows the external appearance.
  • FIG. 23 shows that there is not much difference between the control in the large intestine and the mouse administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18, but in the duodenum and small intestine, a tumor mass is formed in the control. In contrast, mice administered with anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 remained clean.
  • mice administered with anti-CTLA-4 antibody and / or anti-PD-L1 antibody and IL-18 were healthy as far as observed, and no decrease in body weight was observed.
  • Example 16 Study on side effects of cancer therapeutic agent according to the present invention
  • Example 15 since no strong autoimmune-like lesions were observed in mice administered with the cancer therapeutic agent according to the present invention, and weight loss was not confirmed, the cancer therapeutic agent according to the present invention had reduced side effects. It was suggested that Therefore, in this example, a more detailed study was conducted on the side effects of the cancer therapeutic agent according to the present invention. Specifically, the possibility that IL-18 abolishes the side effects of antibodies that are active ingredients of the above-mentioned cancer therapeutic agents was examined.
  • Example 2 As in Example 1, 0.25 ml of a suspension of CT-26 cells (cell concentration: 5.0 ⁇ 10 4 cells / 0.25 ml) was injected into the peritoneal cavity of BALB / C wild type mice and transplanted. .
  • mice were treated with 0.25 ml of PBS as a therapeutic group (group 1); 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 200 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody (group 2); anti-CTLA-4 Group administered with 100 ⁇ g of antibody, 200 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody and IL-18 (2 ⁇ g) (group 3); Group administered with 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody, 200 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody and IL-18 (10 ⁇ g) (group 3) Divided into groups 4), each group consisted of 5 mice.
  • the doses ( ⁇ g) of PBS, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 are doses per 25 g of mouse body weight.
  • the above therapeutic agent was intraperitoneally injected into the mouse four times in total, every 4 days from 3 days after the CT-26 cell injection. Blood and tissue were collected 18 days after the CT-26 cell injection and examined for liver and kidney functions as well as tissue lesions such as intestine, liver and kidney. The experiment was repeated three times.
  • FIG. 24 is a diagram showing the above-described CT-26 cell transplantation and therapeutic drug administration schedule.
  • the day on which CT-26 cells were transplanted was designated as “Day 0”, and 3 days later, 7 days later, 11 days later. This shows that the therapeutic agent is intraperitoneally administered 15 days later, and the mice are sacrificed 18 days later.
  • FIG. 25 shows the albumin concentration in the blood (FIG. 25 (a)), total bilirubin concentration (FIG. 25 (b)), AST (GOT) concentration (FIG. 25 (c)), and ALT (GPT) concentration. It is a figure which shows the result of having measured ((d) of FIG. 25).
  • FIG. 26 shows LD (LDH) concentration in the blood (FIG. 26 (a)), creatinine concentration (FIG. 26 (b)), ALP concentration (FIG. 26 (c)), and uric acid concentration (FIG. 26). It is a figure which shows the result of having measured (d)).
  • FIG. 27 is a diagram showing the results of measuring the urea nitrogen concentration in the blood.
  • the “Negative Control” in the figure is the result of using blood of a healthy mouse (hereinafter referred to as “healthy control group”) in which CT-26 cell transplantation and therapeutic drug administration are not performed.
  • FIG. 28 are diagrams showing the results of tissue staining of hepatoxylin eosin (HE) in the livers of the mice of groups 1 to 4 described above, and the magnification is 200 times.
  • HE hepatoxylin eosin
  • FIG. 28 shows the observation result of the liver tissue of group 2 above. In all mice of this group, a large number of cell division images were observed as in FIG. 28 (b).
  • the results shown in (a) of FIG. 25 and (b) of FIG. 28 indicate the possibility that the anti-CTLA-4 antibody and the anti-PD-L1 antibody have side effects such as liver tissue damage.
  • blood creatinine tends to be high in group 2 above, and it may be possible that mild damage was caused to the kidney. .
  • the values of blood ALP and blood ALT are the values of the group not treated with only cancer cell transplantation (“PBS” in the figure).
  • PBS cancer cell transplantation
  • group 1 the value was remarkably reduced, but in groups 3 and 4, values close to those of the healthy control group were shown.
  • group 2 blood ALP was almost the same as group 1, and blood ALT (GPT) was significantly lower than group 1.
  • the results of (c) in FIG. 26 and (d) in FIG. 25 suggested that in groups 3 and 4, the values of blood ALP and blood ALT (GPT) were improved by IL-18.
  • the blood concentrations of albumin, ALT (GPT), and ALP were significantly lower than those in the healthy control group, and the blood concentrations of creatinine were significantly increased compared to the healthy control group.
  • the above groups 3 and 4 show a tendency for AST (GOT) to increase in group 4 from the healthy control group (FIG. 25 (c)), and in group 3, urea nitrogen is suppressed from the healthy control group. A trend was shown (FIG. 27).
  • uric acid was increased in group 3 and group 4 from the healthy control group ((d) in FIG. 26).
  • FIGS. 29 and 30 show the results of tissue staining with hematoxylin eosin (HE) in the stomach, FIG. 31 in the duodenum, FIG. 32 in the small intestine, FIG. 33 in the large intestine, and FIG. 34 in FIGS. )
  • HE hematoxylin eosin
  • FIGS. 29 to 34 show the results of observing the tissues of the mice in groups 1 to 4 respectively.
  • the tissues of the stomach, duodenum, small intestine, large intestine and kidney showed almost no difference between groups 1 to 4.
  • B16 melanoma cells (melanoma) are often used as a cancer metastasis model.
  • B16 melanoma cells (2 ⁇ 10 5 cells) were transferred from the tail vein of mice (C57BL / 6, Japan SLC), and the number of black nodules formed in the lungs after several weeks was counted. The degree of metastasis was measured.
  • a cell line of B16 melanoma cells was purchased from ATCC, and a suspension with a cell concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / 0.25 ml was prepared by the same method as described in Example 1. 0.25 ml of the suspension was injected into the tail vein of the C57BL / 6 mice.
  • mice were treated with 0.25 ml of PBS as a therapeutic group (group 1); 100 ⁇ g of anti-CTLA-4 antibody and 200 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody (group 2); anti-CTLA-4 It was divided into a group (group 3) to which 100 ⁇ g of antibody, 200 ⁇ g of anti-PD-L1 antibody and IL-18 (2 ⁇ g) were administered, and each group was composed of 4 mice.
  • the doses ( ⁇ g) of PBS, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 are doses per 25 g of mouse body weight.
  • FIG. 35 is a diagram showing the transplantation of B16 melanoma cells and the administration schedule of the therapeutic agent.
  • the day on which the B16 melanoma cells were transplanted was designated as “Day 0”, 3 days later, 7 days later, 11 days later, It shows that the therapeutic agent is administered intraperitoneally after 15 days and the mice are sacrificed after 28 days.
  • FIGS. 36 to 38 are diagrams showing the results of observation of nodules formed in the lungs of the mice of groups 1 to 3, respectively. (A) to (d) in each figure show the 4 animals tested Results for mice are shown.
  • the average number of nodules on the lung surface in the control group (Group 1 above) was 233 +/ ⁇ 22.6, but anti-CTLA4 antibody and anti-PD-L1 antibody were administered every 4 days from 3 days after transplantation of B16 melanoma cells. 179 +/ ⁇ 14.0 in the group administered 4 times in total (above group 2), 121 +/ ⁇ 42.7 in the group administered anti-CTLA4 antibody, anti-PD-L1 antibody and IL-18 (above group 3) there were.
  • mice were tested in this example, but the mice from the day when B16 melanoma cells were transplanted, as in Example 1, were increased. It is considered that there is a sufficient possibility that the above-mentioned significant difference is shown by obtaining the survival rate over time.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention can be used in a cancer peritoneal dissemination model by combining IL-18 with a molecular target antibody such as an anti-CTLA-4 antibody or an anti-PD-L1 antibody. It was revealed that the antitumor effect was excellent. In addition, the lung metastasis model and the solid cancer model also showed a strong antitumor effect. This is thought to be due to IL-18 significantly enhancing the therapeutic effect of molecular target antibodies.
  • IL-18 enhances the therapeutic effect of the molecular target antibody by activating effector cells such as CD8-positive T cells and NK cells and promoting proliferation in the peritoneal cavity of mice transfected with tumor cells. It is possible.
  • IKDC B-18 positive, DX5 positive, CD11c positive NK-like cells
  • IKDC is an abbreviation for Interferon introducing killer dendritic cells
  • the above combination since the proliferation of CD4-positive T cells is suppressed by the above combination, it is considered that the above combination does not promote the proliferation of lymphocytes having an immune / inflammation suppressing effect such as Treg.
  • mice administered with anti-CTLA-4 antibody and / or anti-PD-L1 antibody and IL-18 are healthy, do not show weight loss, and have strong autoimmune-like lesions in the intestine and the like I could't see it. Moreover, as a result of examining liver function, kidney function, and tissue lesion, it was confirmed that the side effect of the cancer therapeutic agent according to the present invention is considered to be small.
  • the cancer therapeutic agent according to the present invention is a useful therapeutic agent exhibiting an excellent antitumor effect, and is particularly effective for the treatment of cancer accompanied by peritoneal dissemination.
  • the present invention can be effectively used for the treatment of cancer, particularly the treatment of cancer accompanied by peritoneal dissemination. It can be widely used in medicine and related fields.

Abstract

　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有する。

Description

ＩＬ－１８と分子標的抗体とを併用する癌治療薬
　本発明はインターロイキン１８（以下、「ＩＬ－１８」と称する）と分子標的抗体とを併用する癌治療薬に関する。より詳細には、ＩＬ－１８と分子標的抗体とを含有することにより、相乗的な優れた抗腫瘍効果を奏することができ、かつ、副作用が少ない癌治療薬に関する。
　腫瘍の腹膜播種は、胃癌、大腸癌、卵巣癌などに伴って生じ、手術によって腫瘍を切除した場合でも発症することがあり、治療が非常に困難であることが知られている。腹膜播種の治療には、従来、化学療法剤による治療、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする治療、ビスホスホン酸を用いる増感作療法などが試みられている。
　また、近年、免疫反応および／または炎症反応を抑制するリンパ球（regulatory cells）並びにマクロファージに発現される抗原であるＣＴＬＡ－４抗原またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗原を標的として、上記リンパ球（抑制性リンパ球）を減少させる抗体が臨床において実用化され始めている（特許文献１，２）。
　上記抗体は、上記抑制性リンパ球を減少させる一方で、ＣＤ２８やＮＫＧ２Ｄ等を発現するエフェクターリンパ球を増強し、エフェクターリンパ球による腫瘍細胞の排除や病原体感染細胞の排除を行う。
　このように、上記抗体を用いた治療は、自然免疫および獲得免疫を活性化し、腫瘍細胞を破壊するリンパ球（エフェクターリンパ球、または、エフェクター細胞ともいう）を持続的に増やし、腫瘍への遊走性を高めることによって腫瘍の退縮や消滅を目指すものである。そして、上記抗体は、従来の治療法では治療困難であった黒色腫などの悪性腫瘍に対して有効であることが証明され、その有効性の増大と、多くの腫瘍への適用の拡大とが期待されている。
　また、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５および抗ＣＴＬＡ－４抗体を用いて抗腫瘍効果を確認する試みも行われている（非特許文献１）。そして、ＩＬ－１８と、リツキシマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）との組み合わせが、単剤を用いた場合よりも優れた治療効果を示すことが開示されている（特許文献３）。さらに、所定の式で表される化合物、１つ以上の分子標的抗体、および免疫刺激化合物を組み合わせた組成物を用いて癌免疫治療を行うことも開示されている（特許文献４）。
国際公開公報「ＷＯ２００４／００４７７１号（２００４年１月１５日公開）」 日本国公表特許公報「特表２００４－５１２００５号（２００４年４月２２日公表）」 日本国公表特許公報「特表２０１０－５２２３９号（２０１０年７月１日公表）」 日本国公表特許公報「特表２００８－５３９２４９号（２００８年１１月１３日公表）」
Fong L. et. al.，Cancer Res, 2009, 69:609-615.
　しかしながら、上記特許文献１，２に開示の抗体を用いた場合の治療効果はまだ改良の余地があるものと考えられる。さらには、上記抑制性リンパ球を減少させ、エフェクターリンパ球を増強する結果、自己免疫疾患の発症などの副作用が生じうるという問題もある。つまり、特許文献１，２に開示の技術には、治療効果を高め、かつ、副作用を軽減するという観点から改良の余地が残されていると言える。
　また、上記非特許文献１に開示の方法は、薬剤の投与量が非常に多く、現実的な方法ではないという問題がある。
　特許文献３は、ＩＬ－１８と、リツキシマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）とを同時または逐次に患者に個別投与し、単剤よりも組み合わせの方が治療効果が優れていたことを開示する。また、特許文献４は、所定の式で表される特定の化合物および１つ以上の分子標的抗体（リツキシマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）など）に免疫増強剤を加えることによって免疫反応が増大し得ることを開示する。なお、「分子標的抗体」とは、リンパ球の機能に関与する表面抗原や癌細胞の表面抗原を認識し得る抗体をいう。
　しかし、特許文献３，４で用いられている抗体以外の他の抗体を用いた場合にどのような効果が得られるかということ、および副作用の程度については明らかではない。したがって、治療効果を高め、かつ、副作用を軽減することができる癌治療薬を提供することに関し、特許文献３および４は、未だ十分な知見を提供するものではないと言える。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、ＩＬ－１８と所定の抗体とを含有することにより、優れた抗腫瘍効果を奏することができ、副作用を軽減しうる新規な癌治療薬を提供することにある。
　本発明者は、治療効果を高め、かつ、副作用を軽減することができる癌治療薬について鋭意検討した。その結果、ＩＬ－１８を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と併用することによって上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、上記の課題を解決するために、本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有することを特徴としている。
　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有するため、上記抗体による抗腫瘍効果を著しく向上させることができる。その結果、治療効果が高く、かつ、副作用が少ない癌治療薬を提供することができるという効果を奏する。
ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後から抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬を投与したときの効果を、マウスの生存率として観察した結果を示す図である。 抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８の用量効果を、実施例１と同様に、ＣＴ－２６細胞を腹腔内投与したマウスの生存率として示す図である。 抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬の効果を、実施例１と同様に、マウスの生存率として示す図である。 ＣＴ－２６細胞を移植した日から７日後に、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬等を投与し、その後、４日ごとに計４回投与した場合の効果を、マウスの生存率として示す図である。 ＣＴ－２６細胞を移植した日から１４日後に、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬等を投与した場合の効果を、マウスの生存率として示す図である。 ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後に抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、をそれぞれ投与したマウスの４日間の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）数の変化を示す図である。 抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、をそれぞれ癌治療薬として投与した４日後に、再度これらの癌治療薬をそれぞれ投与したマウスのＰＥＣ数の変化を示す図である。 腫瘍を有するマウスに抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８によって誘導されたＰＥＣを養子細胞移入した場合の延命効果を示す図である。 抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ；ＩＬ－１８のみ；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、をマウスに腹腔内投与することによって誘導されたＰＥＣの、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＮＫＧ２Ｄ、およびＤＸ５（ＣＤ４９ｂ）の発現強度を検討した結果を示す図である。 抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８をマウスに腹腔内投与することによって誘導されたＰＥＣの、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＮＫＧ２ＤおよびＤＸ５（ＣＤ４９ｂ）の発現強度を検討した結果を示す図である。 本発明に係る治療薬が、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の数を減少させることを確認した結果を示す図である。 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を破壊し除去する抗アシアロＧＭ１抗体が、本発明に係る治療薬を投与したマウスの生存率に与える影響を示す図である。 抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣの解析結果の違いを示す図である。 抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣにおける表面マーカーの解析結果の違いを示す図である。 抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の発現強度、並びに、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞数を確認した結果を示す図である。 ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後における、対照または治療薬を投与した各群のマウスについて、腹水の有無を示す外観写真である。 対照または治療薬を投与した各群のマウスの腹囲の変化を示す図である。 対照または治療薬を投与した各群のマウスの体重の変化を示す図である。 対照と、抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与したマウスとにつき、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の腹腔の様子を示す図である。 対照と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスとについて、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の腹腔の様子を示す図である。 対照のマウスの、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の小腸の外観を示す図である。 抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスの、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の小腸の外観を示す図である。 対照と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスとについて、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の十二指腸、小腸、大腸の一部分の外観を示す図である。 実施例１６におけるＣＴ－２６細胞の移植と、治療薬の投与スケジュールとを示す図である。 実施例１６において血液中のアルブミン濃度（図２５の（ａ））、総ビリルビン濃度（図２５の（ｂ））、ＡＳＴ（ＧＯＴ）濃度（図２５の（ｃ））およびＡＬＴ（ＧＰＴ）濃度（図２５の（ｄ））を測定した結果を示す図である。 実施例１６において血液中のＬＤ（ＬＤＨ）濃度（図２６の（ａ））、クレアチニン濃度（図２６の（ｂ））、ＡＬＰ濃度（図２６の（ｃ））、および尿酸濃度（図２６の（ｄ））を測定した結果を示す図である。 実施例１６において血液中の尿素窒素濃度を測定した結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの肝臓の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの胃の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの胃の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの十二指腸の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの小腸の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの大腸の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１６における群１～群４のマウスの腎臓の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図である。 実施例１７におけるＢ１６黒色腫細胞の移植と、治療薬の投与スケジュールとを示す図である。 実施例１７における群１のマウスの肺に生じた小結節を観察した結果を示す図である。 実施例１７における群２のマウスの肺に生じた小結節を観察した結果を示す図である。 実施例１７における群３のマウスの肺に生じた小結節を観察した結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。範囲を示す、例えば「Ａ～Ｂ」のような記載は、Ａ以上Ｂ以下であることを示す。なお、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　〔実施の形態１：本発明に係る癌治療薬〕
　（１）有効成分
　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有する。
　ＩＬ－１８は、ＩＦＮ－γの誘導因子として岡村らによって１９９５年に発見され（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ.ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ，３７８：８８‐９１，１９９５）、近年様々な生物学的作用を有することが明らかになってきているサイトカインである。
　ＩＬ－１８は、栄養欠乏、酸素不足、紫外線などのストレスによる小胞体ストレス応答の結果、インフラマゾーム（タンパク質の複合体であって、ＮＬＲＰ３，ＡＳＣ，カスパーゼ‐１などを含有する）が活性化され、当該インフラマゾームによってカスパーゼ‐１が活性化し、当該カスパーゼ‐１によってｐｒｏ－ＩＬ－１８がプロセシングされ、活性型のＩＬ－１８に変化することによって生成される。
　そして、ＩＬ－１８は、抗原やサイトカインによって活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と称する）、γδＴ細胞などのエフェクター細胞に作用し、これらの細胞の数を著しく増加させることができると共に、これらの細胞の死を抑制し、生存、分化を促進することが知られている（例えば、Ｌｉ Ｗｅｎ ｅｔ. ａｌ、Ｊ.Ｌｅｕｋｏｃ. Ｂｉｏｌ., ８２、１４２‐１５１、２００７.）。
　ＩＬ－１８としては、特に限定されるものではないが、特許文献３に記載されているヒトＩＬ－１８ポリペプチド（配列番号１）、マウスＩＬ－１８ポリペプチド（配列番号２）などを用いることができる。ヒトＩＬ－１８とマウスＩＬ－１８との間のアミノ酸配列の相同性は６５％である。ヒトＩＬ－１８ポリペプチドについては、特許文献３に記載されているように、ＥＰ０６９２５３６Ａ２、ＥＰ０７１２９３１Ａ２、ＥＰ０７６７１７８Ａ１およびＷＯ９７／２４４１等に開示されている。なお、以下、本明細書では、ＩＬ－１８ポリペプチドを単に「ＩＬ－１８」と称する。
　特許文献３に記載されているように、上記ヒトＩＬ－１８は、大腸菌非病原性株において発現されるヒトＩＬ－１８の組み換え成熟形態である。マウスおよびヒトのＩＬ－１８　ｃＤＮＡは、１９２アミノ酸および１９３アミノ酸からなる前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号２および１）をコードする。
　ＩＬ－１８は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー法、ホスホセルロースクロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー法、および高速液体クロマトグラフィーなどの公知の方法により、組み換え細胞培養物から回収および精製することができる。
　細胞内の合成、単離、および／または精製時にＩＬ－１８が変性される場合は、タンパク質のリフォールディングについてのよく知られた技法を用いて、活性な立体配座を再生することができる。活性型のヒトＩＬ－１８を精製および作製する方法は、ＷＯ０１／０９８４５５に示されている。ＩＬ－１８は市販品を用いても構わない。
　本願発明に係る癌治療薬は、抗体として、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体を含有する。
　抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体については、特許文献１に詳述されている。特許文献１に記載されているように、ヒトＰＤ－１ｃＤＮＡは、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５０１８に示される塩基配列で構成され、マウスＰＤ－１ｃＤＮＡは、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ６７９１４に示される塩基配列で構成され、それらの発現は、胸腺細胞においてはＣＤ４－ＣＤ８－からＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞に分化する際に認められる（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６年，第１８巻，第５号，ｐ．７７３～７８０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０００年、第１９１巻、第５号、ｐ．８９１～８９８）。
　また、末梢におけるＰＤ－１の発現は、抗原レセプターからの刺激により活性化したＴ細胞、Ｂ細胞（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６年，第１８巻，第５号，ｐ．７６５～７７２）または活性化マクロファージを含む骨髄細胞に認められることが報告されている。また、ＰＤ－１は、抗原レセプター（ＴＣＲ）シグナルを抑制するシグナルを伝達していることも知られている。
　ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１のリガンドであり、腫瘍細胞の他、活性化した単球や樹状細胞などのいわゆる抗原提示細胞に発現している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０００年、第１９１巻、第７号，ｐ．１０２７～１０３４）。特許文献１に記載されているように、ヒトＰＤ－Ｌ１ｃＤＮＡは、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２３３５１６、マウスＰＤ－Ｌ１ｃＤＮＡはＮＭ＿０２１８９３で示される塩基配列で構成される。
　これらの細胞は、Ｔリンパ球細胞に対して、さまざまな免疫誘導シグナルを誘導する相互作用分子を提示しており、ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１による抑制シグナルを誘導する分子の１つである。
　特許文献１に記載されているように、ＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－１の２番目のリガンドとして同定されたが、その発現および機能はＰＤ－Ｌ１とほぼ同じであることが報告されている。なお、ヒトＰＤ－Ｌ２ｃＤＮＡはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２５２３９、マウスＰＤ－Ｌ２ｃＤＮＡはＮ Ｍ＿０２１８９６で示される塩基配列で構成される（Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１年，第２巻，第３号，ｐ．２６１～２６７）。
　ＰＤ－１に代表される共役抑制分子からの抑制シグナルは、抗原レセプター（ＴＣＲ）および共役刺激分子によるポジティブなシグナルを適性に制御するメカニズムによって、リンパ球発生または成熟過程での免疫寛容または自己抗原に対する異常な免疫反応を制御していると考えられている。
　抗ＣＴＬＡ－４抗体については、例えば特開２００７－２７７２４２号公報に記載されている。ＣＴＬＡ－４とは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＤ１５２）のことである。特開２００７－２７７２４２号公報に記載されているように、ＣＴＬＡ－４がその天然のリガンドであるＢ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）と結合すると、負の制御シグナルがＴ細胞に送達され、この負の制御シグナルを遮断すると動物モデルでＴ細胞の免疫機能および抗腫瘍活性が亢進する（ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７、４４５～４５０頁（１９９７）；ＭｃＣｏｙおよびＬｅＧｒｏｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．＆Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．７７：１～１０頁（１９９９））。
　抗体を使用してＣＴＬＡ－４の負の制御シグナルを遮断すると、Ｔ細胞が媒介する腫瘍の死滅が亢進し、抗腫瘍性免疫を誘導できることが示されている（例えば、Ｌｅａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１７３４～１７３６頁（１９９６）など）。ヒトＣＴＬＡ－４の完全な配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６に記載されている。
　ＣＤ２５は、分子量５５ｋＤａの単鎖糖タンパクで、成人Ｔ細胞性白血病細胞の表面抗原として知られている。ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病細胞の表面抗原として知られており、ＣＤ５２は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病細胞の表面抗原として知られている。
　抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体は、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２による免疫抑制シグナルを阻害するものであれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体などのいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、完全型若しくは短縮型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片。これらを以下、「抗体断片」ともいう。）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。
　これらの抗体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２５、ＣＤ３３またはＣＤ５２の細胞外領域の部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。細胞外領域の部分タンパク質は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
　ポリクローナル抗体は、公知の方法によって製造することができる。例えば、抗原タンパク質、あるいは、抗原タンパク質とキャリアータンパク質との混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
　用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、および、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約２週毎に１回ずつ、計約３～１０回程度行うのが一般的である。
　ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。
　ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相、プロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
　上記抗体としては、モノクローナル抗体あるいはその修飾体を用いることがより好ましい。特許文献１に記載されているように、抗原で免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２～５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させ、継代培養可能なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することにより、モノクローナル抗体産生細胞を作製することができる。
　抗原タンパク質は、抗体産生が可能な部位にそれ自体を単独で、あるいは担体、希釈剤と共に投与する。この際、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与するのが一般的である。
　また、「ＤＮＡ免疫」と呼ばれる方法によっても、動物を免疫することができる。この方法は、免疫動物の後足前脛骨筋にカルジオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）を処置し、さらに抗原タンパク質を発現するベクターを導入した後、組織修復の過程でベクターが筋細胞に取りこまれ、タンパク質を発現する現象を利用した方法である（Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１年，第２巻，第３号，ｐ．２６１～２６７）。
　免疫される動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギまたはモルモットを用いることが可能であるが、好ましくはマウスまたはラットが用いられる。融合操作は、コーラーとミルシュタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ ，１９７５年，第２５６巻，第５５１７号，ｐ．４９５～４９７）で実施することができ、融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが用いられる。骨髄腫細胞としては、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ１、ＳＰ２／０、および、ＡＰ１などの骨髄腫細胞が挙げられるが、通常Ｐ３Ｕ１がよく利用される。
　モノクローナル抗体産生細胞の選別は、特許文献１に記載されているように、例えば、抗原タンパク質を直接あるいは担体と共に吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加することによるＥＬＩＳＡ法などにより検出して行うことができる。さらに、ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、ＥＬＩＳＡ法によって測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
　上記ハイブリドーマとしては、上記抗体を製造するために通常用いられる公知のハイブリドーマを用いればよい。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体を製造する場合であれば、特許文献１に開示のハイブリドーマを用いることができる。
　上記抗体断片は、プロテアーゼ酵素により抗体を処理し、場合により還元して得ることができる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、精製されたモノクローナル抗体をペプシンで完全に消化し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーのいずれかの公知の方法により精製することができる。Ｆａｂ’抗体フラグメントは、調製したＦ（ａｂ’）２を２－メルカプトエチルアミンで部分還元することによって作製することができる。また、Ｆａｂ抗体フラグメントは、システイン存在下で消化酵素パパインによって直接消化し、精製して作製することができる。
　ｓｃＦｖ抗体は、例えばジョストらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年， 第２６９巻，第４２号，ｐ．２６２６７～２６２７３）によって調製することができる。
　ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された非ヒト抗体の一部をヒト抗体の一部に置換することによって、上記ヒト化抗体を作製することができる。具体的には、ヒト抗体の定常領域をコードする遺伝子と、非ヒト抗体の可変領域をコードする遺伝子とのキメラを構築することによって、ヒト化抗体を作製できることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８７年，第８４巻，ｐ．３４３９～３４４３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８７年，第１３９巻，第１号，ｐ．３５２１）。
　ヒト抗体の定常領域のＤＮＡ配列は文献に記載されており、当該定常領域の遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。続いて、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト抗体の定常領域の配列に融合させる。ヒト抗体の定常領域のアイソタイプは所望のエフェクター機能または抗体依存性細胞性細胞毒性（すなわち抗体依存性細胞傷害）における活性によって選択できる。好ましいアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。また、ヒト軽鎖定常領域、κ鎖またはλ鎖のいずれも用いることができる。このヒト化キメラ抗体は通常の方法によって発現させることができる。
　完全ヒト型抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子が導入されたマウス（ゼノマウス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００年，第７巻，第８号，ｐ．Ｒ１８５－６））等を利用して作製することができ、さらに上記マウスから単離した抗体産生リンパ球をハイブリドーマにして、目的の抗体を量産させることができる。また、完全ヒト型抗体は、ファージ・ディスプレー法（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，１９９８年，第４４１巻，ｐ．２０－２４）によっても作製することができる。
　本発明に係る癌治療薬は、（ｉ）ＩＬ－１８と、（ｉｉ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有する。上記「１以上の抗体」は、上記群より選ばれる抗体であれば、いくつ用いてもよい。
　中でも、本発明に係る癌治療薬には、癌治療薬として実績を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体が含まれていることが好ましく、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と、抗ＣＴＬＡ－４抗体とを含有することが最も好ましい。
　一方、ＰＤ－Ｌ１は上述のようにＰＤ－１のリガンドであり、ＰＤ－Ｌ２はＰＤ－１のリガンドである。そのため、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の代わりに用いた場合も抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合と同様の効果が得られることが期待される。
　また、ＣＤ３３、ＣＤ５２、および、ＣＤ２５は、上述のように、それぞれ急性骨髄性白血病細胞の表面抗原、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病細胞の表面抗原、および、成人Ｔ細胞性白血病細胞の表面抗原として知られている。これらの癌の患者における腫瘍化した白血球には、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢという表面抗原が多く見られる。
　本発明に係る癌の治療薬がＩＬ－１８と、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを含有する場合、上記抗体がそれぞれＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２を標的とする。また、後述する実施例に示すように、ＩＬ－１８は、ＮＫＧ２Ｄの発現強度が高いＮＫ細胞の誘導を強化することができる。そして、当該ＮＫ細胞はＮＫＧ２ＤによってＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを認識し、これらの表面抗原を発現した細胞を融解させることができる。
　それゆえ、本発明に係る癌の治療薬がＩＬ－１８と、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを含有する場合、当該治療薬は、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、および、成人Ｔ細胞性白血病の治療のために有効に作用する可能性があると考えられる。
　本発明に係る癌治療薬において、ＩＬ－１８と上記抗体との使用量の比としては、上記抗体を１種類用いる場合、ＩＬ－１８と上記抗体との質量比が、１：１０～１：２００であること、１：２５～１：２００であること、１：２５～１：５０であること、または、１：３０～１：５０であることが好ましく、投与する生体（被検体、患者）の体重１ｋｇあたりのＩＬ－１８の投与量を０．１ｍｇ/ｋｇとしたときに、上記質量比で抗体を投与することが好ましい。
　また、上記抗体を２種類以上用いる場合、ＩＬ－１８の質量と、２種類以上の抗体の質量を合計した値との比が上記質量比になるようにし、抗体同士の質量比は任意の比とすればよい。
　つまり、ＩＬ－１８の質量と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体の質量（用いる抗体の質量の合計）との比が、１：１０～１：２００であること、１：２５～１：２００であること、１：２５～１：５０であること、または、１：３０～１：５０であることが好ましく、抗体同士の質量比は任意の比とすればよい。
　例えば、抗体を２種類用いる場合、ＩＬ－１８の上記投与量を０．１ｍｇ/ｋｇとしたときに、ＩＬ－１８と、１種類目の抗体と、２種類目の抗体とを、質量比１：５０：５０で用いることができる。
　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、上記抗体（抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体）とを有効成分とする。上記癌治療薬は、ＩＬ－１８と上記抗体とを混合した組成物であってもよい。また、ＩＬ－１８と、上記抗体とは混合されておらず別々に存在していてもよい。
　つまり、有効成分としてＩＬ－１８と、上記抗体とが用いられる限り、ＩＬ－１８と、上記抗体とが混合されていなくても、本発明に係る癌治療薬の範囲に含まれる。
　例えば、ＩＬ－１８と、上記抗体とを、患者に対し、ＩＬ－１８を先に投与した後に上記抗体を投与する、というように、別々に投与する場合であっても、ＩＬ－１８と、上記抗体とを有効成分として併用しているため、ＩＬ－１８と、上記抗体とが混合されていない形態も、ＩＬ－１８と、上記抗体とを有効成分として含有する本発明に係る癌治療薬に該当する。ただし、投与の順序はこれに限られるものではなく、上記抗体を患者に投与した後にＩＬ－１８を投与してもよいし、あるいは、上記抗体とＩＬ－１８とを同時に患者に投与してもよい。
　上記抗体が複数種の抗体である場合、当該抗体の投与形態は、複数種の抗体を同時に投与する形態であってよいが、これに限定されない。例えば抗体を２種類用いる場合、ＩＬ－１８と、１種類目の抗体と、２種類目の抗体とを、患者に対して、任意の順序でそれぞれ経時的に投与してもよい。例えば、ＩＬ－１８、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および、抗ＣＴＬＡ－４抗体という順序、または、ＩＬ－１８、抗ＣＴＬＡ－４抗体、および、抗ＰＤ－Ｌ１抗体という順序で患者に投与する形態等であってよい。ＩＬ－１８と、１種類または複数種の抗体とを経時的に投与する場合、ＩＬ－１８と抗体との投与間隔、または、抗体と抗体との投与間隔は、２～５日であることが好ましい。
　また、投与箇所は、ＩＬ－１８とそれぞれの抗体とで同じであってもよいし、異なっていてもよい。例えば、ＩＬ－１８と複数種の抗体とを全て静脈注射する投与形態であってもよいし、ＩＬ－１８を静脈注射し、１種類目の抗体を皮下注射し、２種類目の抗体を皮内注射するというような投与形態であってもよい。通常は、投与の簡便性に鑑みると、ＩＬ－１８と抗体とを同じ箇所に投与することが好ましい。
　本発明に係る癌治療薬の有効成分（ＩＬ－１８および上記抗体）の用量は、患者の年齢、症状等により異なるため一概には言えないが、１回の投与では通常、患者の体重あたり、有効成分として、ＩＬ－１８は０．１ｍｇ/ｋｇ、抗体は１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、抗体は２．５ｍｇ/ｋｇ～５．０ｍｇ/ｋｇであること、または３．０ｍｇ/ｋｇ～５．０ｍｇ/ｋｇであることがより好ましい。なお、有効成分に占めるＩＬ－１８と上記抗体との質量比は上述したとおりである。
　また、後述する実施例では被検体としてマウスを用いているが、マウスの体重あたりの投与量と、ヒトの体重あたりの投与量とに大きな差はない。ヒトに投与する場合、ＩＬ－１８を０．１ｍｇ/ｋｇとしたときに、抗体を１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇとして３週間ごとに４回投与する投与形態が一例として考えられる。
　（２）その他の成分
　本発明に係る癌治療薬は、上記有効成分以外に、必要に応じて、例えば特許文献３に記載されているような、医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含みうる。
　上記担体は、水およびピーナッツ油、大豆油、鉱油、または、ゴマ油など、あるいは、石油、動物、植物、または合成由来の油を含む油など、無菌の液体でありうる。
　本発明に係る癌治療薬が静脈内投与される場合は、水を担体として用いることができる。例えば、注射溶液用の液体担体としては、生理食塩液ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液もまた用いることができる。
　適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、および、エタノールなどが挙げられる。
　本発明に係る癌治療薬は、必要に応じて、少量の保湿剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をも含有しうる。本発明に係る癌治療薬は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、または、徐放製剤などの形態を取り得る。
　本発明に係る癌治療薬は、トリグリセリドなど従来の結合剤および担体を有する坐剤として調合することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、または、炭酸マグネシウムなど、標準的な担体を含みうる。本発明に係る癌治療薬は、上記有効成分と共に、適量の担体を含有していてもよい。製剤の形式は、投与方式に合わせて適宜調整すればよい。
　本発明に係る癌治療薬の患者への投与形態は特に限定されるものではないが、本発明の一実施形態において、上記癌治療薬は、従来公知の手順に従い、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として処方される。
　特許文献３に記載されているように、典型的に、静脈内投与用の組成物は、無菌で等張性の水性緩衝液中の溶液である。適切な場合、上記組成物は、可溶化剤および注射部位における疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤も含みうる。
　一般に、成分は、例えば、活性剤の量を表示するアンプルまたは小袋などの密封容器内における乾燥凍結粉末または水を含まない濃縮物として、単位用量形態で個別にまたは一括混合されて供給される。なお、上記癌治療薬は、上述したように、ＩＬ－１８と上記抗体とは必ずしも混合されていなくてもよい。したがって、ＩＬ－１８と上記抗体とが個別に供給されてもよい。
　上記癌治療薬を注入投与する場合、無菌の医薬グレードの水または生理食塩液を格納する注入ボトルにより分注することができる。上記癌治療薬を注射投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩液のアンプルを供給して、投与前に成分を混合することができる。
　本発明に係る癌治療薬は、非経口投与用の溶液または凍結乾燥粉末として調合することができる。粉末は、使用前に、適切な希釈剤または他の医薬上許容される担体の添加により還元することができる。液体製剤は、緩衝済みで等張性の水溶液でありうる。適切な希釈剤の例は、通常の等張性生理食塩液、水または酢酸ナトリウム緩衝液もしくは酢酸アンモニウム緩衝液中に５％の標準的なデキストロースである。
　上記製剤は、非経口投与に好適であるが、経口投与に用いることもでき、吸入用の用量計量型吸入器または噴霧器中に格納することもできる。上記癌治療薬には、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシアガム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの賦形剤を添加することが望ましい場合がある。
　上記癌治療薬は、経口投与用にカプセル化することも、錠剤化することも、乳剤またはシロップに調製することもできる。医薬上許容される固体または液体の担体を添加して、上記癌治療薬を増強または安定化することもでき、上記癌治療薬の調製を容易化することもできる。
　固体の担体は、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、滑石、ペクチン、アカシアガム、寒天、またはゼラチンを含む。
　液体の担体は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、生理食塩液、および水を含む。担体はまた、単独またはロウを伴うモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放用材料も含みうる。
　固体担体の量は様々であるが、用量単位当たり約２０ｍｇ～約１ｇである。医薬製剤は、錠剤形態の場合、適切ならば、粉砕、混合、造粒、および圧縮、硬質ゼラチンカプセル形態の場合、粉砕、混合、および充填を含む従来の製薬法に従い作製される。
　液体の担体を用いる場合、製剤は、シロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性の懸濁液の形態である。こうした液体製剤は、経口（ｐ．ｏ．）で直接にまたは軟質ゼラチンカプセル中に充填して投与することができる。
　本発明に係る癌治療薬は、注射用に用意された形態における、生理的ｐＨで緩衝済みの上記癌治療薬を含有する水性懸濁液または水溶液として用いることができる。水性担体としては、例えば、０．４％生理食塩液または０．３％グリシンなど、各種の水性担体を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒状物質を含まない。
　上記水性懸濁液または水溶液は、従来公知の滅菌法（例えば、濾過法）により滅菌することができる。本発明に係る癌治療薬は、ｐＨ調整剤または緩衝剤など、生理的条件を近似するのに必要な医薬上許容される補助物質を含有しうる。
　このような、担体、補助物質等を含有する医薬製剤中における本発明に係る癌治療薬の濃度は、選択される具体的な投与方式に従い、流体容量、粘稠度などに基づき選択すればよい。
　〔実施の形態２：本発明に係る癌治療薬の投与〕
　本発明に係る癌治療薬は、いずれかの適切な体内経路により患者に投与することができる。
　投与の方法としては、例えば特許文献３に記載の従来公知の各種方法を用いることができる。すなわち、リポソーム中への封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現する能力を有する組み換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、４４２９～４４３２頁（１９８７）を参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、各種のデリバリーシステムが知られており、本発明に係る癌治療薬の投与に用いることができる。
　導入法は、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路を含むがこれらに限定されない。上記癌治療薬は、任意の好適な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚による内膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収により投与することができ、他の生物活性剤と共に投与することができる。
　投与は、全身投与または局所投与でありうる。加えて、本発明に係る癌治療薬は、脳室内注射、および、くも膜下注射を含む任意の適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は、例えば、オンマヤリザーバーなどの容器に取り付けた脳室内カテーテルにより容易化することができる。例えば、吸入器または噴霧器およびエアゾール剤を有する製剤の使用により、肺内投与もまた用いることができる。
　投与は、上述したように、有効成分（ＩＬ－１８および上記抗体）の用量が、投与１回あたり、患者の体重あたり、ＩＬ－１８は０．１ｍｇ/ｋｇ、抗体は１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２．５ｍｇ／ｋｇ～５．０ｍｇ／ｋｇまたは３．０～５．０ｍｇ／ｋｇとなるように行うことが望ましい。
　〔実施の形態３：本発明に係る癌治療薬の抗腫瘍効果〕
　本発明に係る癌治療薬は、上述したように、ＩＬ－１８と所定の抗体とを有効成分として併用したものである。後述する実施例に示すように、当該併用を行い、本発明に係る癌治療薬を投与することによって、ＩＬ－１８を単独で用いた場合、および抗体を単独で用いた場合と比較して、腹膜播種を起こす大腸癌細胞を移植したマウスの生存率を相乗的に、著しく向上させることができるという効果が奏された。
　この効果は、実施例では、ＩＬ－１８と、抗ＣＴＬＡ－４抗体とを質量比１：２５～１：５０となるようにし、ＩＬ－１８が２μｇ／２５ｇ、抗ＣＴＬＡ－４抗体が５０～１００μｇ／２５ｇとなるようにマウスに腹腔内投与したとき（後述する図２）、および、ＩＬ－１８、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ－４抗体をマウスに腹腔内投与したとき（後述する図４）に非常に強く奏された。
　すなわち、大腸癌細胞の移植後６０日を経ても供試したマウスの全てが生存し、かつ、腹水の貯留も見られず、自己免疫様の病変も見られずに健康な状態を保っていた。すなわち、副作用が生じていないと考えられた。
　また、後述する実施例に示すように、上記併用によって、腹腔内滲出細胞の数を長期間持続的に増加させることができ、上記腹腔内滲出細胞によるマウスの延命効果も観察された。そして、上記腹腔内滲出細胞中では、活性型のＮＫ細胞が増殖し、長く持続的に存在すると共に、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のような、炎症抑制性の細胞が減少することが観察された。
　つまり、本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８がＮＫ細胞等のエフェクター細胞の増強を促進し、活性化されたエフェクター細胞を長く持続的に存在させ、かつ、炎症抑制性の細胞を減少させることにより、併用する抗体の抗腫瘍効果をより一層増強することができると考えられる。
　また、上記抗体の単独使用においては、上述したように、自己免疫疾患の発症などの副作用が生じうるという問題があるが、本発明に係る癌治療薬ではそのような副作用が少ないという利点がある。
　本発明に係る癌治療薬の優れた抗腫瘍効果に鑑みれば、本発明に係る癌治療薬は、各種の癌の治療に適用することが可能である。適用可能な癌種としては、例えば、扁平上皮癌（子宮頚管、瞼、結膜、膣肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、食道）、および、腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、子宮頚管、大腸、肺、膵、食道、直腸、子宮、胃、乳房、卵巣）が挙げられる。さらに、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、メラノーマ、リンパ腫も適用可能な癌種に含まれる。
　本願発明は、以下の発明を包含する。
　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有することを特徴としている。
　上記構成によれば、後述する実施例に示す結果から、ＩＬ－１８がエフェクター細胞の増殖、生存、分化を促進し、かつ、抑制性Ｔ細胞の増殖を抑制することにより、上記抗体の抗腫瘍効果を著しく高めることができると推測される。その結果、本発明に係る癌治療薬は、上記抗体のみを用いる場合、またはＩＬ－１８のみを用いる場合と比べて相乗的な、非常に優れた抗腫瘍効果を示すことができる。しかも、治療が困難である腹膜播種の抑制に非常に効果的である一方、副作用は軽減される可能性がある。
　したがって、治療効果の非常に高い癌治療薬を提供することができるとともに、副作用が患者に与える苦痛を大きく低減することができる。
　また、本発明に係る癌治療薬は、上記抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体であることが好ましい。
　上記構成によれば、ＩＬ－１８を併用するため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体を単独で用いる場合と比較して著しく優れた抗腫瘍効果を得ることができる。したがって、癌治療に実績のあるこれらの抗体の抗腫瘍効果をさらに高め、より優れた癌治療薬を提供することができる。
　さらに、上記構成のうち、上記抗体が抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体である場合、後述する実施例に示すように、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体とを含有する癌治療薬と比較しても、単に相加的な効果ではなく、相乗的な、非常に優れた抗腫瘍効果を得ることができる。
　したがって、より一層抗腫瘍効果に優れ、かつ副作用の少ない癌治療薬を提供することができる。
　本発明に係る癌治療薬は、ＩＬ－１８の質量と、上記１以上の抗体の質量の合計との比が１：２５～１：２００であることが好ましい。
　上記構成によれば、後述する実施例に示すように、ＩＬ－１８と抗体との生体への投与量を的確な量とすることができるため、上記相乗的な、非常に優れた抗腫瘍効果を得る上で好ましい。
　そして、本発明に係る癌治療薬は、胃癌、大腸癌、卵巣癌、骨肉腫、および白血病からなる群より選ばれる１以上の癌の治療薬であることが好ましい。
　上記の癌は、腫瘍の腹膜播種を伴うことが多く、腫瘍を切除した場合でも腹膜播種が発症することがある。上記構成によれば、後述する実施例に示すように、腹膜播種に対する高い治療効果を示すことができる。
　したがって、腹膜播種を伴う上記の癌に対して特に好適で、かつ、副作用が少ない癌治療薬を提供することができる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　まず、実施例において用いた材料および実験方法について説明する。
　〔材料〕
　（１）マウスおよびセルライン
　マウスとしては、日本ＳＬＣ（浜松市）から購入したＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウス（６～８週齢、オス）を用いた。上記マウスを、２５℃で、１２時間明所、１２時間暗所となるサイクルで照明を制御した条件下で、病原体フリーの状態で飼育した。マウスは、水およびペレット状のエサを自由に摂取できる状態にした。
　ＣＴ－２６マウス結腸癌細胞のセルラインは、American Type Culture Collectionから購入し、３７℃、５％ＣＯ２含有大気雰囲気下にて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Bio West）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco BRL, USA）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク（株）製）中で維持した。
　上記細胞は、０．０５％トリプシンおよび０．０１％ＥＤＴＡを含有する、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋フリーのダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４、ナカライテスク（株）製。以下、「トリプシン‐ＥＤＴＡ」と称する）を用いて処理し、回収した。
　（２）試薬
　組み換えマウスＩＬ－１８（グラクソ・スミスクライン製、品番SB-528775、以下単に「ＩＬ－１８」と称する）は、グラクソ・スミスクラインｐｌｃの厚意により分与されたものを用いた。
　抗マウスＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ、クローンUC10-4F10-11。以下単に「抗ＣＴＬＡ－４抗体」と称する）および抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（クローン10F.9G2。以下単に「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」と称する）はBioXcellから購入したものを用いた。ウサギ抗アシアロＧＭ１抗体（カタログ番号：014-09801、和光純薬（株）製）、抗ＣＤ８抗体（カタログ番号SC-18913、サンタクルーズ製）およびウサギＩｇＧ（カタログ番号：ＰＭ０３５、ＭＢＬ製）は全て市販の抗体である。
　〔実験方法〕
　（１）In vivoにおける処置
　トリプシン‐ＥＤＴＡを用いて培養容器からサブコンフルエントの状態にあるＣＴ－２６細胞を、剥離することによって回収し、ＰＢＳを用いて二度洗浄した。生細胞の数はトリパンブルー色素排除試験によって計数し、種々の細胞濃度で生細胞をＰＢＳ中に懸濁させ、懸濁液を調製した。上記細胞濃度は、５．０×１０４個／０．２５ｍｌである。
　上記懸濁液０．２５ｍｌを、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射した。ＣＴ－２６細胞の移植後適当な日に、種々の量（２５～１００μｇ）の抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、ＩＬ－１８（１～２μｇ）と共に、または、ＩＬ－１８を用いずに上記マウスに腹腔内注射した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞またはＴ細胞の関与を検討するために、抗ＮＫ細胞抗体または抗Ｔ細胞抗体も投与した。各実施例で用いた抗体およびＩＬ－１８の具体的な量、投与間隔は、各実施例に記載する。
　（２）細胞の調製および培養
　マウスの腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）は、５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄することによって腹腔から回収し、ＡＣＫ溶解バッファー（自家製）によって赤血球を３回除去し、ＰＢＳによって３回洗浄した。
　リンパ球は、１０％ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン（Gibco BRL製）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２－メルカプトエタノール（シグマ社製M7154）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク（株）製）中で、３７℃、５％ＣＯ２含有大気雰囲気下にて培養した。
　（３）養子細胞移入
　養子細胞移入実験用のＰＥＣは、ＣＴ－２６細胞を移植したマウスの腹腔から調製した。マウスには、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８について、種々の組み合わせとした治療薬を、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後に腹腔内に注射した。ＰＥＣは、上記治療薬を腹腔内注射した日の４日後に回収した。回収した細胞のほとんどはリンパ球であった。当該リンパ球を洗浄し、２．５×１０７cells／mlの細胞密度となるようにＰＢＳ中に懸濁させ、細胞懸濁液を調製した。養子細胞移入のために、ＣＴ－２６細胞を移植したマウスの腹腔内に対し、上記細胞懸濁液０．２ｍｌ（約５×１０６cells／マウス）を、移植した日の３日後，７日後，１１日後に注射した。
　（４）フローサイトメトリー
　ＰＥＣの細胞表面マーカーおよび脾細胞の細胞表面マーカーの解析はフローサイトメトリーを用いて行った。細胞表面マーカーは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（eBioscience製、クローンＧＫ１．５）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（Biolegend製、クローン５４－６．７）、ビオチン標識抗ＣＤ８抗体（eBioscience製、クローン５３－６．７）、ビオチン標識抗ＣＤ１１ｃ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＨＬ３）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（Biolegend 製、クローンＲＡ３－６Ｂ２）、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ｂ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＤＸ５）を用いて染色した。フローサイトメトリーによる解析は、FACS Calibur flow cytometer（Beckton Dickinson Biosciences製）を用いて行った。
　すなわち、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ４９ｂに特異的な、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣもしくはビオチンで標識したモノクローナル抗体で染色し、次に、FACS Calibur flow cytometerを用いて解析した。また、抗マウスＣＤ１６／３２抗体（eBioscience製、クローン９３）をＦｃブロッカーとして用いた。データは、Cell Quest ソフトウェア（登録商標、Beckton Dickinson Biosciences製）を用いて解析した。
　本明細書においてフローサイトメトリーの条件は一定であり、Becton-Dickinson immunocytometry systems, 1995.に記載されている条件に従って行った。なお、本明細書において、細胞表面マーカーの発現強度は、全てフローサイトメトリーによって測定した発現強度を意味する。
　〔実施例１：ＣＴ－２６細胞を腹腔内投与したマウスの生存率に対する、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬の効果〕
　上記実験方法の（１）に記載したＣＴ－２６細胞について、細胞濃度５．０×１０４個／０．２５ｍｌの懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ １００μｇを投与する群；ＩＬ－１８のみ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体のみ１００μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。上記ＣＴ－２６細胞を注射した日の３日後、７日後、１０日後、１４日後に、計４回、上記治療薬を腹腔内注射した。以下、全ての実施例において、実験は３回繰り返して行った。
　なお、上記ウサギＩｇＧ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８の投与量（μｇ）は、マウスの体重２５ｇあたりの投与量である。
　図１は、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後から抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬を投与したときの効果を、マウスの生存率として観察した結果を示す図である。図１において、横軸はＣＴ－２６細胞を移植（腹腔内注射）した日からの日数を示し、縦軸はマウスの生存率を示している。
　図１に示すように、対照はＣＴ－２６細胞を移植した日から２４日後に生存率が低下し始め、２７日後には全てのマウスが死亡した。また、ＩＬ－１８のみを投与した群と、抗ＣＴＬＡ－４抗体のみを投与した群とは、類似した生存率の低下傾向を示し、それぞれ４２日後、４９日後に全てのマウスが死亡した。
　一方、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与した群では、腹水の貯留もなく、全くマウスの死亡が見られず、ＣＴ－２６細胞を移植した日から６０日後でも全てのマウスが生存していた。しかも、マウスに衰弱は見られず、健康な状態を保っていた。
　以上の結果から、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与した群では、ＩＬ－１８と、抗ＣＴＬＡ－４抗体とによる単なる相加的な抗腫瘍効果ではなく、非常に優れた相乗的な抗腫瘍効果が示されることが明らかとなった。つまり、ＩＬ－１８を抗ＣＴＬＡ－４抗体と併用することにより、抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍効果を飛躍的に高めることができることが明らかとなった。
　〔実施例２：抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８の用量効果〕
　上記〔実験方法〕の（１）に記載したＣＴ－２６細胞について、細胞濃度５．０×１０４個／０．２５ｍｌの懸濁液０．２５ｍｌを上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ １００μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体２５μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体５０μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ １μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。上記ＣＴ－２６細胞を注射した日の３日後、７日後、１０日後、１４日後に、計４回、上記治療薬を腹腔内注射した。
　なお、上記ウサギＩｇＧ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８の投与量（μｇ）は、マウスの体重２５ｇあたりの投与量である。
　図２は、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８の用量効果を、実施例１と同様に、ＣＴ－２６細胞を腹腔内投与したマウスの生存率として示す図である。横軸および縦軸は図１と同じである。
　図２に示すように、対照はＣＴ－２６細胞を移植した日から２４日後に生存率が低下し始め、２８日後には全てのマウスが死亡した。
　一方、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与した群では、抗ＣＴＬＡ－４抗体２５μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群において、ＣＴ－２６細胞の移植日から２８日後に生存率が低下し始め、４２日後に全てのマウスが死亡した。しかしながら、対照と比較すると延命効果が見られた。
　抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ １μｇを投与した群では、ＣＴ－２６細胞の移植日から３５日後に生存率が８０％に低下したものの、その後は６０日後でも生存率は維持された。生存しているマウスの健康状態は良好であった。
　抗ＣＴＬＡ－４抗体５０μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群、並びに、抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群では、上記投与日から６０日後であっても全てのマウスが生存していた。マウスの健康状態は良好であった。
　以上のように、抗ＣＴＬＡ－４抗体をＩＬ－１８と併用した場合、４つの投与群のうち３つの投与群で非常に優れた抗腫瘍効果が得られ、高い治療効果が得られた。また、抗ＣＴＬＡ－４抗体２５μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群でも、延命効果が示されることが確認された。
　〔実施例３：ＣＴ－２６細胞を腹腔内へ移植したマウスの生存率に対する、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する治療薬の効果〕
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ １００μｇを投与する群；ＩＬ－１８のみ２μｇを投与する群；抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ１００μｇを投与する群；抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。上記ＣＴ－２６細胞を注射した日の３日後、７日後、１０日後、１４日後に、計４回、上記治療薬を腹腔内注射した。なお、上記投与量は、マウスの体重２５ｇあたりの量である。
　図３は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬の効果を、実施例１と同様に、マウスの生存率として示す図である。横軸および縦軸は図１と同じである。
　図３に示すように、対照およびＩＬ－１８のみを投与した群の生存率の推移は実施例１と同じである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＩＬ－１８とを投与した群では、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３５日後まではＩＬ－１８のみを投与した群と同じ傾向を示したが、３５日後以降は、ＩＬ－１８のみを投与した群で４２日後に全てのマウスが死亡したのに対し、６０日後であっても生存率が６０％のまま維持された。また、生存しているマウスの健康状態は良好であった。
　抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみを投与した群の生存率は、ＩＬ－１８のみを投与した群よりも劣っていた。この結果から、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＩＬ－１８とを投与したこと、すなわち抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する治療薬を用いたことによって、ＩＬ－１８と、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とによる単なる相加的な抗腫瘍効果ではなく、非常に優れた相乗的な抗腫瘍効果が示されることが明らかとなった。
　つまり、ＩＬ－１８を抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用することにより、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍効果を飛躍的に高めることができることが明らかとなった。また、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は抗ＣＴＬＡ－４抗体よりも副作用が少ないことが知られているため、上記相乗的な抗腫瘍効果により、抗腫瘍効果が高く、かつ副作用が少ない癌の治療薬を提供することができる。
　〔実施例４：ＣＴ－２６細胞を腹腔内へ移植したマウスの生存率に対する、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬の効果（その１）〕
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ １００μｇを投与する群；ＩＬ－１８のみ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群；抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇ、およびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。ＣＴ－２６細胞を注射した日から７日後に、上記治療薬を腹腔内注射し、その後、４日ごとに計４回、上記治療薬を腹腔内注射した。
　図４は、ＣＴ－２６細胞を移植した日から７日後に、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬等を投与し、その後、４日ごとに計４回投与した場合の効果を、マウスの生存率として示す図である。横軸および縦軸は図１と同じである。なお、上記投与量は、マウスの体重２５ｇあたりの量である。
　実施例４では、実施例１～３とは異なり、ＣＴ－２６細胞を腹腔内に移植した日の７日後に治療薬の投与を開始している。すなわち、実施例１～３よりも腫瘍が成長した後に治療薬の投与を開始しているが、図４に示すように、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与した群よりも、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与した群、および、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与した群の方が非常に高い生存率を示した。また、生存していたマウスの健康状態は良好であった。
　さらに、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与した群では、ＣＴ－２６細胞の腹腔内への移植（腫瘍移植）から７日後に投与を開始しているにもかかわらず、投与から６０日後であっても全てのマウスが生存していたという特筆すべき結果が得られた。しかも、当該マウスの健康状態は非常に良好であった。
　〔実施例５：ＣＴ－２６細胞を腹腔内へ移植したマウスの生存率に対する、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬の効果（その２）〕
　図５は、ＣＴ－２６細胞を移植した日から１４日後に、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を含有する癌治療薬等を投与した場合の効果を、マウスの生存率として示す図である。横軸および縦軸は図１と同じである。
　治療薬としては、実施例４で用いた上記対照１００μｇ；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇ；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇ、およびＩＬ－１８ ２μｇ、を用い、ＣＴ－２６細胞を腹腔内へ移植した日の１４日後に上記治療薬を腹腔内注射したこと以外は、実施例４と同様にして実験を行った。なお、上記投与量は、マウスの体重２５ｇあたりの量である。
　図５に示すように、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与した場合と比べて、癌治療薬として、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８を投与した場合の方が高い生存率を示すことが分かる。
　実施例５では、腫瘍移植の１４日後に癌治療薬の投与を開始しているため、癌治療薬を投与したときには既に腫瘍塊が形成され、腹水の貯留も観察されていた。それにも関わらず、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８を用いた場合は、明確な延命効果が観察された。このことは、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８を含有する治療薬は、腫瘍塊が形成された後から投与した場合であっても治療効果を得ることが可能であることを示唆している。
　〔実施例６：腹腔滲出細胞数の変化〕
　実施例６では、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；並びに、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８が、ＣＴ－２６細胞を移植したマウスの腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）の数を増加させることができることを示す。
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射した。上記注射を行った日の３日後に、下記の治療薬を各マウスに腹腔内注射した。マウスは、治療薬の種類ごとに１６匹用意し、治療薬を投与した日の１日後～４日後に各日４匹ずつからＰＥＣを回収し、計数盤を用いてＰＥＣ数を計数し、４匹のＰＥＣ数の平均値を求めた。
　図６は、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後に抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、をそれぞれ投与したマウスの４日間の腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）数の変化を示す図である。横軸は上記治療薬を投与した日からの日数を表し、縦軸は、マウス１匹あたりのＰＥＣ数（４匹の平均値）を表す。
　図６の（ａ）は、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ１００μｇを投与した群；抗ＣＴＬＡ－４抗体のみ１００μｇを投与した群；ＩＬ－１８のみ２μｇを投与した群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群、におけるＰＥＣ数の変化を示すものである。
　図６の（ｂ）は、治療薬として、上記ウサギＩｇＧ１００μｇを投与した群；抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ１００μｇを投与した群；ＩＬ－１８のみ２μｇを投与した群；抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群、におけるＰＥＣ数の変化を示すものである。
　図６の（ｃ）は、治療薬として、上記ウサギＩｇＧ１００μｇを投与した群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇを投与した群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与した群、におけるＰＥＣ数の変化を示すものである。図中、「ＮＥ－ＰＥＣ」とは、対照としてのウサギＩｇＧを投与したマウスの腹腔滲出細胞である。なお、上記投与量は、マウスの体重２５ｇあたりの量である。
　図６の（ａ）～（ｃ）のいずれにおいても、抗体のみを投与した場合と比べて、抗体とＩＬ－１８とを併用した場合の方がＰＥＣの数を大幅に増加させることができたことが分かる。
　また、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、をそれぞれ投与した４日後に、再度これらの癌治療薬をそれぞれ投与したマウスのＰＥＣ数の変化も観察した。上記癌治療薬の投与量は、１回目の投与、２回目の投与ともに、図６に示したものと同じである。
　図７はその結果を示すものである。図７の（ａ）は、上記癌治療薬の１回目の投与日を０日目として（図中、「Ｓｈｏｔ １」と表示）、ＣＴ－２６細胞を腹腔内へ移植した日（図中、「CT-26 cell inoculated」と表示）、ＰＥＣの回収および解析を行った日（図中、１～８およびAnalysis １～７と表示）、並びに上記癌治療薬の２回目の投与日（図中、「Ｓｈｏｔ ２」と表示）を示している。
　図７の（ｂ）は、図７の（ａ）に示す０日目～８日目におけるマウス１匹あたりのＰＥＣ数（４匹の平均値）を表す。４日目までは、図６に示す結果と同じである。
　図７の（ｂ）より、上記癌治療薬を投与した日の４日後に低下し始めたＰＥＣの数が、同日に再度上記癌治療薬を投与することによって再び上昇傾向を示したことが分かる。また、ＰＥＣの数は、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合よりも、ＩＬ－１８を抗体と併用した場合の方が多くなり、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合に最も多くなっていた。
　〔実施例７：腹腔滲出細胞による延命効果〕
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。そして、上記〔実験方法〕の（３）に記載したように、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後に癌治療薬を腹腔内に注射した。癌治療薬としては、実施例６の図６の（ｃ）について言及した箇所に記載した量のウサギＩｇＧ；抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、を用いた。
　上記〔実験方法〕の（３）に記載したように、上記治療薬を腹腔内注射した日の４日後にＰＥＣを回収し、ＰＥＣの細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液０．２ｍｌ（約５×１０６cells／マウス）を、ＣＴ－２６細胞を移植したマウスの腹腔内に、移植した日の３日後，７日後，１１日後に注射した。
　図８は、腫瘍を有するマウスに抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８によって誘導されたＰＥＣを養子細胞移入した場合の延命効果を示す図である。横軸はＰＥＣを腹腔内投与した日からの日数を示し、縦軸はマウスの生存率を示している。
　また、凡例の「control PECs」はウサギＩｇＧを治療薬として投与して得たＰＥＣを、「αCTLA-4＋αPD-L1 induced PECs」は抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を治療薬として投与して誘導したＰＥＣ（以下、本項にて「ＰＥＣ－１」と称する）を、「αCTLA-4＋αPD-L1＋IL-18 induced PECs」は抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を治療薬として投与して誘導したＰＥＣ（以下、本項にて「ＰＥＣ－２」と称する）を、それぞれ投与した場合の結果を表している。
　図８から分かるように、対照ではＰＥＣを腹腔内投与した日から２８日後には全てのマウスが死亡した。ＰＥＣ－１を投与したマウスでは、対照と比較して延命効果が見られたが、ＰＥＣ－１を腹腔内投与した日から３５日後には全てのマウスが死亡した。一方、ＰＥＣ－２を投与したマウスでは、投与した日から５８日後であっても２０％の生存率を示し、ＰＥＣ－１を投与した場合よりも若干の延命効果が示された。
　すなわち、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体にＩＬ－１８を併用することによって、より抗腫瘍効果に優れたＰＥＣを誘導することができ、その結果、抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合よりも優れた延命効果を奏することができたと考えられる。
　〔実施例８：腹腔内滲出細胞におけるＮＫ細胞の増強〕
　本実施例では、実施例６で用いた治療薬のうち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ；ＩＬ－１８のみ；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、を実施例６と同様の方法でマウスに腹腔内投与することによって誘導された腹腔内滲出細胞がどのような形質の細胞であるのかを、フローサイトメトリーによって調べた。フローサイトメトリーに供した腹腔内滲出細胞としては、各治療薬あたり５匹のマウスを用い、上記治療薬を投与した日から４日後に回収した細胞を用いた。
　フローサイトメトリーは、上記〔実験方法〕の（４）に示したＡＰＣ標識抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（Biolegend 製、クローンＲＡ３－６Ｂ２）、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（BD-pharmingem562347）およびＰＥ標識抗ＣＤ４９ｂ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＤＸ５）を用いて、上記〔実験方法〕の（４）に示した方法で行った。
　図９は、それぞれ表面マーカーであるＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＮＫＧ２Ｄ、およびＤＸ５（ＣＤ４９ｂ）の発現強度を検討した結果を示す図である。（ａ）～（ｊ）の横軸はＤＸ５の発現強度、（ａ）～（ｅ）の縦軸はＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現強度、（ｆ）～（ｊ）の縦軸はＮＫＧ２Ｄの発現強度を表す。（ａ）～（ｊ）の「day 3.036」等の表記は、上記治療薬を投与した日の３日後に回収したＰＥＣを解析したことを示している。
　図９の（ａ）～（ｅ）はそれぞれ、図中に示すように４つのエリアに分割されているが、右上のエリアに存在する細胞が、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現強度が高く、かつ、ＤＸ５の発現強度が高いと言える。そして、図９の（ｆ）～（ｊ）もそれぞれ４つのエリアに分割されているが、右上のエリアに存在する細胞が、ＮＫＧ２Ｄの発現強度が高く、かつ、ＤＸ５の発現強度が高いと言える。
　図９の（ａ）および（ｂ）と（ｃ）とを比較すると、（ｃ）に示す抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が、右上のエリアに存在する細胞が多くなっている。また、（ｄ）と（ｅ）とを比較すると、（ｅ）に示す抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が、右上のエリアに存在する細胞が多くなっている。
　そして、図９の（ｈ）に示すように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合、（ｇ）に示すＩＬ－１８のみを用いた場合よりも右上のエリアに存在する細胞の割合が少なくなっている。しかしながら、図９の（ｉ）と（ｊ）とを比較して分かるように、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合よりも、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が右上のエリアの細胞の割合が多くなっている。よって、抗体とＩＬ－１８とを併用することによって、抗体によるＮＫ細胞の腹腔内への誘導がさらに強化されることが分かる。
　このように、図９の（ａ）～（ｊ）に示す結果から、ＮＫ細胞の中でもＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＮＫＧ２Ｄ、およびＤＸ５の発現強度が高いＮＫ細胞、つまり活性型のＮＫ細胞の腹腔内への誘導が、抗体とＩＬ－１８とを併用することによって強化されることが明らかとなった。このことが、本発明に係る治療薬が高い抗腫瘍効果を示す一因であると考えられる。
　〔実施例９：マウス腹腔内に誘導されたＮＫ細胞の維持〕
　本実施例では、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を癌治療薬として投与した場合に、投与から長期間経過後も腹腔内に誘導されたＮＫ細胞を維持できるか否かについて検討した。
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射した。上記注射を行った日の３日後に、下記の治療薬を腹腔内注射した。
　治療薬としては、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を、実施例６と同様の方法でマウスに腹腔内投与し、投与した日から１１日後に回収したＰＥＣを解析した。
　フローサイトメトリーは、上記ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（Biolegend 製、クローンＲＡ３－６Ｂ２）、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ｂ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＤＸ５）、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（BD Pharmingen562349）を用いて、上記〔実験方法〕の（４）に示した方法で行った。
　図１０は、それぞれ表面マーカーであるＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＮＫＧ２ＤおよびＤＸ５（ＣＤ４９ｂ）の、上記ＰＥＣにおける発現強度を検討した結果を示す図である。図１０の（ａ）～（ｃ）の横軸はＤＸ５の発現強度、縦軸はＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現強度をそれぞれ表している。
　図１０の（ａ），（ｄ）は対照であり、ＣＴ－２６細胞を移植後、治療薬を投与せずに回収したＰＥＣのデータを表す。図１０の（ｂ），（ｅ）は治療薬として抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合、図の（ｃ）、（ｆ）は治療薬として抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合のＰＥＣのデータをそれぞれ表す。
　図１０の（ａ）～（ｃ）において枠囲みし「Ｒ５」と記載した領域は、ＤＸ５の発現強度とＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現強度とが共に高いと言えるＰＥＣを示しており、治療薬を投与しなかった対照（図１０の（ａ））では当該ＰＥＣが細胞全体に占める割合が４３．９３％であったが、上記抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与した日から１１日後に回収したＰＥＣでは上記割合が４５．５７％とあまり変わらなかった（図１０の（ｂ））。これに対し、上記抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与した日から１１日後に回収したＰＥＣでは上記割合が５９．７９％と高かった（図１０の（ｃ））。
　また、図１０の（ｄ）～（ｆ）の横軸はＮＫＧ２Ｄの発現強度を表し、縦軸は細胞の数を表している。ＮＫＧ２Ｄの発現強度と細胞数との関係は、図１０の（ｄ）～（ｆ）においてあまり変化がなかった。
　以上の結果から、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を治療薬として投与した場合、投与から１１日という長期間が経過した後も、腹腔内に誘導された活性型のＮＫ細胞（ＤＸ５の発現強度とＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）の発現強度とが共に高い細胞）を維持できていることが明らかとなった。
　つまり、本発明に係る治療薬は、腫瘍細胞を攻撃、破壊するようなエフェクター細胞を増強し、長く持続的に存在させることができることが明らかとなった。
　〔実施例１０：ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の減少〕
　本実施例では、本発明に係る癌治療薬を投与したマウスにおけるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の数の変化について検討した。
　実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。上記注射を行った日の３日後に、下記の治療薬を腹腔内注射した。
　治療薬としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ；ＩＬ－１８のみ；抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８；抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用い、投与した日から７日後に回収したＰＥＣを解析した。投与量は、実施例６と同じである。
　図１１は、本発明に係る治療薬が、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の数を減少させることを確認した結果を示す図である。
　図１１の（ａ）～（ｅ）、（ｆ）～（ｊ）は、治療薬としてそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＩＬ－１８、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の結果を示し、（ａ）～（ｅ）はＣＤ４陽性Ｔ細胞が上記ＰＥＣ全体に占める割合を求めた結果を示す。
　（ａ）～（ｅ）の横軸はＴＣＲ－β（Ｔ細胞レセプターβ）の発現強度を表し、縦軸はＣＤ４の発現強度を表す。図１１の（ａ）～（ｅ）中、丸囲みした領域は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の存在する領域であり、例えば図１１の（ａ）の「２０．３５％」と記載した数字は、図１１の（ａ）の丸囲みした領域に存在するＣＤ４陽性Ｔ細胞が上記ＰＥＣ全体に占める割合である。
　また、図１１の（ｆ）～（ｊ）は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の検出結果を示しており、横軸はＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現強度を、縦軸はＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞数をそれぞれ表している。（ｆ）～（ｊ）の図中の数値は、図１１の（ａ）～（ｅ）に丸囲みした領域に存在するＣＤ４陽性Ｔ細胞に占める、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合を示している。
　ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、癌細胞が増殖する際、免疫反応、炎症反応を抑制する働きを有する抑制性リンパ球（Ｔｒｅｇ）である。つまり、上記細胞の増加は癌細胞の増殖を助けることになる。
　図１１の（ａ）～（ｃ）より、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ、ＩＬ－１８のみを用いた場合よりも、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が、ＣＤ４陽性細胞が減少していることが分かる。また、図１１の（ｄ）、（ｅ）より、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合よりも、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が、ＣＤ４陽性細胞が減少していることが分かる。
　また、図１１の（ｆ）～（ｊ）から、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合も、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ、ＩＬ－１８のみを用いた場合よりも、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が少ないこと、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた場合よりも、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合の方が少ないことが分かる。
　以上の結果から、本発明に係る癌治療薬は、抗体のみを用いる場合よりも、抑制性リンパ球の増殖をより一層抑制することが分かる。これは、ＩＬ－１８を併用することにより、抗体による抑制性リンパ球の増殖抑制効果が一層高められたことによると考えられる。
　また、本発明に係る癌治療薬は、上述したようにエフェクター細胞の増強、増殖を促進することができる。このように、本発明に係る癌治療薬は、抑制性リンパ球の増殖を抑制し、かつ、エフェクター細胞の増強、増殖を促進することができるため、非常に高い抗腫瘍効果を発揮することができるものと考えられる。
　〔実施例１１：抗腫瘍効果に対するＮＫ細胞の重要性について〕
　本実施例では、ＮＫ細胞に対する抗体である抗アシアロＧＭ１抗体を用い、本発明に係る癌治療薬の抗腫瘍効果にＮＫ細胞が果たす役割について検討した。
　ウサギ抗アシアロＧＭ１抗体５０μｌまたはウサギＩｇＧ ５０μｇをＰＢＳによって２５０μｌに希釈して、ＣＴ－２６細胞移植の１日前にマウスに腹腔内注射した。上記ウサギ抗アシアロＧＭ１抗体またはウサギＩｇＧは、上記腹腔内注射を行った日の３日後に再度上記２５０μｌの希釈液を腹腔内注射し、その後、４日ごとに２回、上記２５０μｌの希釈液を腹腔内注射した。つまり、ＣＴ－２６細胞移植の１日前、２日後、６日後、１０日後に上記腹腔内注射を行った。
　マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ５０μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体１００μｇ、およびＩＬ－１８　２μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。
　上記抗アシアロＧＭ１抗体またはウサギＩｇＧを腹腔内注射した日の１日後、実施例１で用いたのと同じ細胞濃度（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を有するＣＴ－２６細胞の懸濁液を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射した。そして、上記注射を行った日の３日後に、上記治療薬を腹腔内注射し、その後、４日ごとに計４回（つまり、ＣＴ－２６細胞を移植した日の３日後、７日後、１１日後、１５日後）、上記治療薬を腹腔内注射した。
　図１２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を破壊し除去する抗アシアロＧＭ１抗体が、本発明に係る癌治療薬を投与したマウスの生存率に与える影響を示す図である。図１２の（ａ）は、上述したウサギ抗アシアロＧＭ１抗体またはウサギＩｇＧ、並びに上記治療薬の投与スケジュールを示すものである。図１２の（ｂ）は実験結果を示すものである。
　図１２の（ａ）の上段はＣＴ－２６細胞を移植した日をゼロ日として、上述のように、その３日後、７日後、１１日後、１５日後に上記治療薬を投与するというスケジュールを示している。図１２の（ａ）の下段は、上述のように、ＣＴ－２６細胞移植の１日前、２日後、６日後、１０日後にウサギ抗アシアロＧＭ１抗体またはウサギＩｇＧを投与するというスケジュールを示している。
　図１２の（ｂ）中、白丸は対照（ＣＴ－２６細胞移植の１日前および移植の２日後、６日後、１０日後にウサギＩｇＧを投与し、治療薬としても上述のようにウサギＩｇＧを投与）、三角形は、ＣＴ－２６細胞移植の１日前および移植の２日後、６日後、１０日後にウサギＩｇＧを投与し、治療薬として上述のように抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与した群（以下、「群１」と称する）、四角形は、三角形で示すものと同様な実験でウサギＩｇＧの代わりに抗アシアロＧＭ１抗体を投与した群（以下、「群２」と称する）の結果を示す。図１２の（ｂ）の横軸はＣＴ－２６細胞を投与した日からの日数を示し、縦軸はマウスの生存率を示している。
　上記群１では、例えば実施例４で示されたのと同様に、全てのマウスがＣＴ－２６細胞を移植した日から６０日経過後でも生存し、健康状態も良好であった。一方、群２では、対照より延命効果は見られているが、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８を用いているにも関わらず群１よりも効果は大きく劣り、ＣＴ－２６細胞を移植した日から３５日後には全てのマウスが死亡した。
　実施例８に示したように、本発明に係る癌治療薬は、活性型のＮＫ細胞の腹腔内への誘導を促進する。これは、抗体による上記誘導をＩＬ－１８が促進することによると考えられる。しかし、抗アシアロＧＭ１抗体を投与した群２では、当該抗体によってＮＫ細胞が減少してしまうため、図１２のような結果が得られたと考えられる。このように、本発明に係る癌治療薬による抗腫瘍効果には、抗体とＩＬ－１８とによって誘導された活性型ＮＫ細胞が重要な役割を果たしていることが示唆された。
　〔実施例１２：抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウスにおけるＮＫ細胞数の変化〕
　本実施例では、抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウスのＰＥＣをフローサイトメトリーによって解析し、ＮＫ細胞数の変化について検討した。
　実施例１１の群１および群２のマウスをそれぞれ５匹用意し、実施例１１と同様のスケジュールで抗アシアロＧＭ１抗体またはウサギＩｇＧの投与、ＣＴ－２６細胞の移植、および治療薬の投与を行い、治療薬を投与した日の４日後にＰＥＣを回収し、フローサイトメトリーに供した。
　フローサイトメトリーは、上記ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（Biolegend 製、クローンＲＡ３－６Ｂ２）、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ｂ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＤＸ５）を用いて、上記〔実験方法〕の（４）に示した方法で行った。
　図１３は、抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣの解析結果の違いを示す図である。図１３の（ａ）～（ｄ）は、抗アシアロＧＭ１抗体を投与しなかったマウス（上記群１）由来のＰＥＣの解析結果を示し、（ｅ）～（ｈ）は、抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウス（上記群２）由来のＰＥＣの解析結果を示す。
　図１３の（ａ）および（ｅ）において横軸はＤＸ５の発現強度を示し、縦軸はＢ２２０（ＣＤ４５）の発現強度を示している。Ｒ４はＮＫＧ２Ｄを発現している細胞、Ｒ５はＴ細胞、Ｒ６はＮＫ細胞（Ｐｒｅ－ｍＭＫを含む）を示している。
　図１３の（ａ）において、Ｒ４が４７．９１％、Ｒ５が２１．９９％、Ｒ６が１６．９６％である。また、図１３の（ｅ）において、Ｒ４が３６．８２％、Ｒ５が４８．９７％、Ｒ６が４．４５％である。
　図１３の（ｂ）および（ｆ）は、それぞれ、（ａ），（ｅ）のＲ４に存在するＮＫＧ２Ｄを発現している細胞の数を表し、図１３の（ｃ）および（ｇ）は、それぞれ、（ａ），（ｅ）のＲ５に存在するＴ細胞の数を表し、図１３の（ｄ）および（ｈ）は、それぞれ、（ａ），（ｅ）のＲ６に存在するＮＫ細胞（Ｐｒｅ－ｍＭＫを含む）の数を表している。
　図１３から、上記群２由来のＰＥＣでは、ＮＫ細胞の割合が大幅に減少し、Ｔ細胞の割合が増加していることが分かる。このようなＮＫ細胞の減少によって、図１２に示す結果がもたらされたものと考えられる。つまり、本発明に係る癌治療薬による抗腫瘍効果には、抗体およびＩＬ－１８によって誘導された活性型のＮＫ細胞が重要な役割を果たしていると考えられる。
　〔実施例１３：抗アシアロＧＭ１抗体の投与による、ＮＫ細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現の変化〕
　本実施例では、抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウスのＰＥＣをフローサイトメトリーによって解析し、ＮＫ細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現の変化について検討した。
　実施例１２と同様に、上記群１および群２のマウスについてＰＥＣを回収し、フローサイトメトリーに供した。フローサイトメトリーは、上記ビオチン標識抗ＣＤ１１ｃ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＨＬ３）、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（BD Bioscience製、クローンＰＫ１３６）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ６２Ｌ抗体（BD Bioscience製、クローンＭＥＬ－１４）、ＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（eBiocience製、クローンＨ１．２Ｆ３）、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ｂ抗体（Beckton Dickinson製、クローンＤＸ５）を用いて、上記〔実験方法〕の（４）に示した方法で行った。
　図１４は、抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣにおける表面マーカーの解析結果の違いを示す図である。図１４の（ａ）～（ｄ）は、抗アシアロＧＭ１抗体を投与しなかったマウス（上記群１）由来のＰＥＣの表面マーカーの解析結果を示し、（ｅ）～（ｈ）は、抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウス（上記群２）由来のＰＥＣの表面マーカーの解析結果を示す。横軸はＤＸ５の発現強度を示し、縦軸は各表面マーカーの発現強度を示す。
　図１４に示すＮＫ１．１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９は、いずれもＮＫ細胞（Ｐｒｅ－ｍＭＫを含む）に特有の表面マーカーである。図１４の（ａ）～（ｄ）と、（ｅ）～（ｈ）とをそれぞれ対比すると、上記群２由来のＰＥＣでは何れの表面マーカーを発現する細胞も減少していることが分かる。このようなＮＫ細胞の減少によって、図１２に示す結果がもたらされたものと考えられる。つまり、本発明に係る癌治療薬による抗腫瘍効果には、抗体およびＩＬ－１８によって誘導された活性型のＮＫ細胞が重要な役割を果たしていると考えられる。
　〔実施例１４：抗アシアロＧＭ１抗体の投与による、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の増加〕
　本実施例では、抗アシアロＧＭ１抗体を投与したマウスのＰＥＣをフローサイトメトリーによって解析し、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞数の変化について検討した。
　実施例１２と同様に、上記群１および群２のマウスについてＰＥＣを回収し、フローサイトメトリーに供した。
　フローサイトメトリーは、上記ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（eBioscience製、クローンＧＫ１．５）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（Biolegend製、クローン５４－６．７）、ＰＥ標識抗ＣＤ２５抗体（BD Bioscience製、クローンＰＣ－６１）を用いて、上記〔実験方法〕の（４）に示した方法で行った。
　図１５は、抗アシアロＧＭ１抗体の投与の有無による、マウス由来のＰＥＣにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の発現強度、並びに、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞数を確認した結果を示す図である。
　図１５の（ａ）、（ｃ）において横軸はＴＣＲ－βの発現強度を示し、縦軸はＣＤ４の発現強度を示す。図１５の（ｂ）、（ｄ）において横軸はＣＤ２５の発現強度を示し、縦軸は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の数を示す。図１５の（ｅ）、（ｆ）において横軸はＴＣＲ－βの発現強度を示し、縦軸はＣＤ８の発現強度を示す。
　ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、上述したとおり、抑制性のＴリンパ球であり、上記細胞の増加は癌細胞の増殖を助けることになる。一方、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有する細胞である。
　抗アシアロＧＭ１抗体を投与した場合、図１５の（ａ）と（ｃ）との対比から、図中の右上のエリアに存在するＣＤ４陽性Ｔ細胞が全ＰＥＣに占める割合は７．５９％から１７．０２％に大きく増加していることが分かる。
　また、図１５の（ｂ）と（ｄ）との対比から、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞が全ＰＥＣに占める割合も２．３４％から７．８７％に大きく増加していた。一方、図１５の（ｅ）と（ｆ）との対比から、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が全ＰＥＣに占める割合は２．２６％から１．２２％にほぼ半減していることが分かった。
　この結果は、抗アシアロＧＭ１抗体を予め投与したマウスでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびＩＬ－１８を投与しても、抑制性リンパ球を増加させ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が減少してしまうことを示している。ＮＫ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することが知られており、ＮＫ細胞が減少するとＣＤ８陽性Ｔ細胞も減少してしまう。
　したがって、本実施例の結果から、本発明に係る癌治療薬は、ＮＫ細胞を活性化させ、ＮＫ細胞を活性型として長期間持続させ、その結果ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することによって優れた抗腫瘍効果を示すことが示唆される。
　〔実施例１５：腹水の貯留に対する治療効果〕
　本実施例では、腫瘍細胞を移植したマウスにおける腹水の貯留に対する、本発明に係る癌治療薬の効果を検討した。
　ＣＴ－２６細胞の懸濁液（５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）を０．２５ｍｌ、上記ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射した。マウスは、治療薬として、対照としてのウサギＩｇＧ１００μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇを投与する群；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよびＩＬ－１８ ２μｇを投与する群、とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。ＣＴ－２６細胞を移植した日から３日後に、上記治療薬を腹腔内注射し、その後、４日ごとに計４回、上記治療薬を腹腔内注射した。そして、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後に腹水の貯留に対する治療効果を検討した。
　図１６は、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後における上記各群マウスについて、腹水の有無を示す外観写真である。
　図１７は、上記各群のマウスの腹囲の変化を示す図である。横軸はＣＴ－２６細胞を移植した日からの日数を表し、縦軸は腹囲（ｍｍ）を表す。腹囲は、各群を構成するマウスについて測定し、その平均値を求めた。
　図１７に示すように、対照は、ＣＴ－２６細胞の移植後２６日目には腹水の貯留に伴い腹囲が著しく増加して１１５ｍｍに達し、以後維持された。一方、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスは、腹囲が８０ｍｍ前後という低いレベルに留まり、ＣＴ－２６細胞の移植後５６日目であっても、移植後１日目とあまり変化していなかった。また、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスは、抗ＣＴＬＡ－４抗体のみを投与したマウスと比較しても腹囲が大きく抑制されており、腹水の貯留が認められなかった。
　図１８は、上記各群のマウスの体重の変化を示す図である。横軸は図１７と同じであり、縦軸は体重（ｇ）を表す。体重は、各群を構成するマウスについて測定し、その平均値を求めた。
　体重についても、対照は腹水の貯留により著しい上昇が見られ、抗ＣＴＬＡ－４抗体のみを投与したマウスでも、ＣＴ－２６細胞の移植後４２日目以降は、対照と大差ない体重にまで増加した。
　一方、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスは、腹水の貯留が認められず、図１８に示すように明らかに体重が低く抑制され、低い状態で維持されていた。
　図１９は、上記対照（図１９の（ａ））と、抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与したマウス（図１９の（ｂ））とにつき、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の腹腔の様子を示す図である。図１９に示すように、両者とも、多くの腫瘍塊が見られ、臓器の癒着も見られていた。
　図２０は、上記対照（図２０の（ａ）およびその拡大図である（ｂ））と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウス（図２０の（ｃ）およびその拡大図である（ｄ））とについて、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の腹腔の様子を示す図である。抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスでは、腫瘍塊および臓器の癒着は見られず、臓器の状態が非常に良好に保たれていた。
　図２１は、上記対照の、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の小腸の外観を示す図である。図２２は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスの、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の小腸の外観を示す図である。両者の対比から明らかなように、対照では多数の腫瘍塊が形成されているのに対し、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスでは、ほとんど腫瘍塊は観察されなかった。
　図２３は、上記対照（図２３の（ａ）～（ｃ））と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウス（図２３の（ｄ）～（ｆ））とについて、ＣＴ－２６細胞を移植した日から２１日後の十二指腸（（ａ）、（ｄ））、小腸（（ｂ）、（ｅ））、大腸（（ｃ）、（ｆ））の一部分の外観を示す図である。
　図２３より、大腸では対照と、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスとであまり差は見られていないが、十二指腸および小腸では、対照において腫瘍塊が形成されているのに対し、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与したマウスではきれいな状態が保たれていた。
　図２０の（ｃ）、（ｄ）、図２２、図２３の（ｄ）～（ｆ）に示すように、腸などで強い自己免疫様の病変があるようには見えなかった。また、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、並びにＩＬ－１８を投与したマウスは、観察した限り健康であり、体重の減少なども見られなかった。
　以上の結果から、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を用いた場合、マウス大腸癌細胞であるＣＴ－２６細胞を移植したことによる腹膜播種が十分に抑制されていることが分かる。胃癌、大腸癌、卵巣癌、骨肉腫、および白血病等は、腹膜播種して治療困難を起こすことが知られているが、本発明に係る癌治療薬は、腹膜播種を有効に抑制できるため、これらの癌の治療に非常に有効な治療薬であると言える。
　〔実施例１６：本発明に係る癌治療薬の副作用に関する検討〕
　実施例１５では、本発明に係る癌治療薬を投与したマウスにおいて、強い自己免疫様の病変は見られず、体重の減少等も確認されなかったため、本発明に係る癌治療薬は副作用が軽減されたものであることが示唆された。そこで本実施例では、本発明に係る癌治療薬の副作用についてより詳細な検討を行った。具体的には、ＩＬ－１８が上記癌治療薬の有効成分である抗体の副作用を憎悪させる可能性について検討した。
　実施例１と同様に、ＣＴ－２６細胞（細胞濃度５．０×１０４個／０．２５ｍｌ）の懸濁液を０．２５ｍｌ、ＢＡＬＢ/Ｃ野生型マウスの腹腔内に注射し、移植した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのＰＢＳを０．２５ｍｌ投与する群（群１）；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇを投与する群（群２）；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇおよびＩＬ－１８（２μｇ）を投与する群（群３）；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇおよびＩＬ－１８（１０μｇ）を投与する群（群４）とに分け、各群は５匹のマウスから構成した。なお、ＰＢＳ、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８の投与量（μｇ）は、マウスの体重２５ｇあたりの投与量である。
　上記ＣＴ－２６細胞を注射した日の３日後から４日おきに、計４回、上記治療薬を上記マウスに腹腔内注射した。上記ＣＴ－２６細胞を注射した日の１８日後に血液および組織を採取し、肝機能、腎機能のほか、腸、肝臓、腎臓などの組織病変について調べた。なお、実験は３回繰り返して行った。
　図２４は、上述したＣＴ－２６細胞の移植と、治療薬の投与スケジュールとを示す図であり、ＣＴ－２６細胞を移植した日を「Day 0」とし、その日の３日後、７日後、１１日後、１５日後に上記治療薬の腹腔内投与を行い、１８日後にマウスを屠殺することを示している。
　図２５は、上記血液中のアルブミン濃度（図２５の（ａ））、総ビリルビン濃度（図２５の（ｂ））、ＡＳＴ（ＧＯＴ）濃度（図２５の（ｃ））およびＡＬＴ（ＧＰＴ）濃度（図２５の（ｄ））を測定した結果を示す図である。図２６は、上記血液中のＬＤ（ＬＤＨ）濃度（図２６の（ａ））、クレアチニン濃度（図２６の（ｂ））、ＡＬＰ濃度（図２６の（ｃ））、および尿酸濃度（図２６の（ｄ））を測定した結果を示す図である。図２７は、上記血液中の尿素窒素濃度を測定した結果を示す図である。なお、図中の「Negative Control」は、ＣＴ－２６細胞の移植および治療薬の投与を行っていない健常なマウス（以下「健常コントロール群」と称する）の血液を用いた場合の結果である。
　図２５の（ａ）の「αＣＴＬＡ－４＋αＰＤ－Ｌ１」に示すように、抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇを投与した上記群２では、血中アルブミン濃度が、健常コントロール群と比べて有意に低下していた。図２８の（ａ）～（ｄ）は、上記群１～群４のマウスの肝臓の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示す図であり、倍率は２００倍である。
　上記群２の肝臓の組織の観察結果を図２８の（ｂ）に示す。この群のすべてのマウスにおいて、図２８の（ｂ）と同様に、多数の細胞分裂像が見られた。図２５の（ａ）および図２８の（ｂ）に示す結果は、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、肝組織障害などの副作用を持っている可能性を示している。
　また、図２６の（ｂ）の「αＣＴＬＡ－４＋αＰＤ－Ｌ１」に示すように、上記群２では血中クレアチニンが高い傾向にあり、腎臓に対しても軽度の障害を引き起こした可能性が考えられる。
　一方、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と、ＩＬ－１８とを組み合わせて投与した群（群３、群４）では、図２５の（ａ）に示すように血中アルブミン濃度は健常マウスのものとほとんど同じであった。また、図２８の（ｃ）、（ｄ）に示すように、肝臓組織における細胞分裂像も見られなかった。さらに、図２６の（ｂ）に示すように、血中クレアチニンについても、群３、群４では健常コントロール群のものとほぼ同じであった。血中の尿素窒素は、図２７に示すように、群３において抑制傾向が見られた。
　図２６の（ｃ）、図２５の（ｄ）に示すように、血中ＡＬＰおよび血中ＡＬＴ（ＧＰＴ）の値は、癌細胞移植のみで治療を施さなかった群（図中「ＰＢＳ」で示した上記群１）では著しく低下しているが、群３および群４では健常コントロール群の値に近い値を示していた。一方、群２については、血中ＡＬＰは群１とほとんど変わりがなく、血中ＡＬＴ（ＧＰＴ）は群１よりも著しく低下していた。図２６の（ｃ）、図２５の（ｄ）の結果から、群３および群４では、ＩＬ－１８によって血中ＡＬＰおよび血中ＡＬＴ（ＧＰＴ）の値が改善されたことが示唆された。
　本実施例の結果は、抗ＣＴＬＡ－４抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせが、副作用として肝臓、腎臓などに障害を起こす可能性を示しており、ＩＬ－１８は上記副作用を抑制するか、障害からの修復を促進することを示唆している。抗ＣＴＬＡ－４抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体のうち、どちらが組織障害に関わっているのかということ等については、今後さらなる検討を行うことが必要である。
　上述のように、上記群２では、アルブミン、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、およびＡＬＰの血中濃度が健常コントロール群よりも大きく低下し、クレアチニンの血中濃度が健常コントロール群よりも大きく増加した。一方、上記群３および群４については、群４でＡＳＴ（ＧＯＴ）が健常コントロール群より増加する傾向を示し（図２５の（ｃ））、群３で尿素窒素が健常コントロール群より抑制される傾向を示した（図２７）。また、尿酸については群３および群４で健常コントロール群より増加していた（図２６の（ｄ））。
　しかしながら、図２５～２７に示す９項目のうち、群２では４項目が健常コントロール群より大きく外れる結果となったこと；群３と群４とが共に健常コントロール群より劣る結果を示したのは尿酸についてのみであったこと；を踏まえると、総合的に見て、上記群３および群４で用いた治療薬は、群２で用いた治療薬よりも副作用が少ないと考えられる。
　図２９および３０は胃、図３１は十二指腸、図３２は小腸、図３３は大腸、図３４は腎臓の、ヘマトキシリンエオジン（HE）による組織染色結果を示しており、図２９～３４において、（ａ）～（ｄ）はそれぞれ上記群１～群４のマウスの組織を観察した結果を示している。図２９～３４から分かるように、胃、十二指腸、小腸、大腸および腎臓の組織は、群１～群４の間で殆ど相違が見られなかった。
　〔実施例１７：Ｂ１６黒色腫細胞の転移に対する癌治療薬の効果〕
　Ｂ１６黒色腫細胞（メラノーマ）はがんの転移モデルとしてしばしば用いられる。本実施例では、Ｂ１６黒色腫細胞（２×１０５個）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本ＳＬＣ）の尾静脈から移入し、数週間後に肺にできる黒い小結節（ノデュール）の数を数えて転移の多少を測定した。
　Ｂ１６黒色腫細胞のセルラインは、ＡＴＣＣから購入したものを用い、実施例１に記載したのと同様の方法によって、細胞濃度が２×１０５個／０．２５ｍｌである懸濁液を調製し、当該懸濁液０．２５ｍｌを、上記Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。
　上記マウスは、治療薬として、対照としてのＰＢＳを０．２５ｍｌ投与する群（群１）；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇを投与する群（群２）；抗ＣＴＬＡ－４抗体１００μｇ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体２００μｇおよびＩＬ－１８（２μｇ）を投与する群（群３）；とに分け、各群は４匹のマウスから構成した。なお、ＰＢＳ、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８の投与量（μｇ）は、マウスの体重２５ｇあたりの投与量である。
　図３５は、Ｂ１６黒色腫細胞の移植と、治療薬の投与スケジュールとを示す図であり、Ｂ１６黒色腫細胞を移植した日を「Day 0」とし、その日の３日後、７日後、１１日後、１５日後に上記治療薬の腹腔内投与を行い、２８日後にマウスを屠殺することを示している。
　屠殺したマウスから肺を摘出し、肺に生じた黒い小結節（ノデュール）の数を数えて転移の多少を測定した。図３６～３８は、それぞれ、上記群１～群３のマウスの肺に生じた小結節を観察した結果を示す図であり、各図の（ａ）～（ｄ）は、供試した４匹のマウスの結果を示している。
　コントロール群（上記群１）における肺表面の小結節の数は平均２３３＋／－２２．６であったが、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体をＢ１６黒色腫細胞の移植３日後から４日おきに計４回投与した群（上記群２）では１７９＋／－１４．０、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＩＬ－１８を投与した群（上記群３）では１２１＋／－４２．７であった。
　上記群３の結果は、上記群２の結果に対して統計学的な有意差は示さなかったが、図３７と図３８との対比から分かるように、臓器への転移は群３の方が群２より抑制されている。この結果から、本実施例では４匹のマウスを供試したが、供試するマウスの数をより多くすること、あるいは、実施例１のように、Ｂ１６黒色腫細胞を移植した日からのマウスの生存率を経時的に求めることによって、上記有意差が示される可能性は十分にあると考えられる。
　なお、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を腹腔内へ投与し、ＩＬ－１８を皮下に投与した場合も、上記群３の治療効果は、上記抗体およびＩＬ－１８を共に腹腔内投与した場合と違いはなかった。これは、上記抗体およびＩＬ－１８が共に血中へ移行するため、投与経路に関わらず同じ効果を示したものと考えられる。
　〔まとめ〕
　実施例に示したように、本発明に係る癌治療薬は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の分子標的抗体と、ＩＬ－１８とを併用することにより、癌腹膜播種モデルにおいて非常に優れた抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。この他、肺転移モデルや固形癌モデルにおいても同様に強い抗腫瘍効果を示した。これは、ＩＬ－１８が分子標的抗体の治療効果を著しく高めることによると考えられる。
　つまり、ＩＬ－１８が、腫瘍細胞を移入されたマウスの腹腔でＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞等のエフェクター細胞の活性化や増殖の促進を行うことによって分子標的抗体の治療効果が高められていることが考えられる。
　特に、Ｂ２２０陽性、ＤＸ５陽性、ＣＤ１１ｃ陽性のＮＫ様細胞（ＩＫＤＣと呼ばれる。ＩＫＤＣとはInterferon introducing killer dendritic cellsの略称）が、ＩＬ－１８によって増えることが、上記併用による抗腫瘍効果の増大に関わっていることが示唆される。
　一方、上記併用によってＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖は抑制されるため、上記併用によってＴｒｅｇなどの免疫／炎症抑制作用を持つリンパ球の増殖を促進することはないと思われる。
　また、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、並びにＩＬ－１８を投与したマウスは、健康であり、体重減少等は見られず、腸などに強い自己免疫様の病変があるようには見えなかった。また、肝機能、腎機能、および組織病変について検討した結果、本発明に係る癌治療薬の副作用が少ないと考えられることが確認された。
　以上のことから、本発明に係る癌治療薬は優れた抗腫瘍効果を示す有用な治療薬であると言え、特に、腹膜播種を伴う癌の治療に有効であると言える。
　本発明は、癌の治療、特に、腹膜播種を伴う癌の治療に有効に利用することができる。医薬およびこれに関連する分野において広く利用することができる。

Claims (4)

  1. 　ＩＬ－１８と、
    　抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５２抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、を有効成分として含有することを特徴とする癌治療薬。
  2. 　上記抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療薬。
  3. 　ＩＬ－１８の質量と、上記１以上の抗体の質量の合計との比が１：２５～１：２００であることを特徴とする請求項１または２に記載の癌治療薬。
  4. 　上記癌治療薬が、胃癌、大腸癌、卵巣癌、骨肉腫、白血病およびメラノーマからなる群より選ばれる１以上の癌の治療薬であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の癌治療薬。
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