WO2016006577A1 - 医薬組成物 - Google Patents

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ischemia
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mitochondrial
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健輔 江頭
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition.
  • Ischemic diseases such as acute myocardial infarction and cerebral infarction are the most serious diseases that threaten the prognosis of patients.
  • ischemic disease is the leading cause of human death.
  • the most important prognostic determinant for patients with ischemic disease is infarct size.
  • reperfusion injury is known in which blood flow recovery itself by reperfusion promotes irreversible cardiomyocyte necrosis and reduces the infarct reduction effect of reperfusion therapy.
  • reperfusion injury cancels the effect of reducing the infarct size by reperfusion therapy by about 50%.
  • Non-Patent Document 1 Because of reperfusion injury, the therapeutic effect of reperfusion therapy, that is, the effect of reducing infarct size is insufficient. For this reason, the long-term prognosis of patients with ischemic disease has not improved at all. For example, it has been reported that early reperfusion therapy in a large-scale registration study in the United States is inadequate in reducing infarct size and improving patient prognosis (see Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 ischemia-reperfusion injury
  • the main factors are (1) injury caused by mitochondrial injury early (less than 10 minutes) after ischemia (in particular, mitochondrial permeability-transition pore (hereinafter, simply referred to as “mPTP”)) or Failure) and (2) inflammation in the late stage of ischemia (1-3 hours) (particularly infiltration of activated monocytes).
  • mPTP mitochondrial permeability-transition pore
  • Non-Patent Documents 4 to 7 report that the combined use of a small amount (subthreshold dose) of two agents, which is almost ineffective with a single agent, is more effective than that obtained with a single agent. Even when two drugs were combined at an effective dose, the obtained effect was not more than the effect of a single drug.
  • Non-Patent Documents 4 to 7 all drugs are administered before the occurrence of ischemia, and are not administered at the time of reperfusion. In view of clinical application, it is necessary to administer the drug when the patient receives reperfusion therapy, rather than administering the drug before the occurrence of ischemia.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a pharmaceutical composition capable of reducing the infarct size as much as possible.
  • the present inventor applies a drug delivery system (DDS) and simultaneously intervenes in the above (1) and (2) of ischemia / reperfusion injury, thereby suppressing the effect on ischemia / reperfusion injury, that is, reducing the infarct size. We found that the effect could be maximized.
  • DDS drug delivery system
  • a pharmaceutical composition for use in treating or preventing a disorder caused by ischemia according to an aspect of the present invention, A mitochondrial injury inhibitor; An anti-inflammatory agent, Biocompatible particles encapsulating both or each of the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent; including.
  • the biocompatible particles are A polylactide glycolide copolymer having a number average particle diameter of 2.5 to 1000 nm or a modified polyethylene glycol thereof, It is good as well.
  • the disorder caused by ischemia is Ischemic reperfusion injury, It is good as well.
  • the mitochondrial injury inhibitor is Cyclosporine or Mitochondral division inhibitor 1, It is good as well.
  • the anti-inflammatory agent is Selected from the group consisting of pitavastatin, irbesartan, pioglitazone and a CC chemokine receptor type 2 inhibitor; It is good as well.
  • the pharmaceutical composition is administered to a patient in combination with reperfusion therapy. It is good as well.
  • the disorder caused by ischemia is Is a disorder in an ischemic organ, It is good as well.
  • the infarct size can be made as small as possible.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the image of the heart sample obtained from the myocardial ischemia reperfusion model mouse which administered the physiological saline, FITC, and FITC nanoparticle (FITC-NP) at the time of reperfusion. It is a figure which shows the fluorescence intensity obtained by the image analysis of the heart sample obtained from the myocardial ischemia reperfusion model mouse. It is a figure which shows the fluorescence image of the heart sample of a FITC-NP administration group. It is a figure which shows the optical image and fluorescence image of the mitochondrial fraction extracted from the myocardial ischemia reperfusion model mouse. It is a figure which shows the data which quantified FITC in a mitochondrial fraction.
  • FITC-NP FITC nanoparticle
  • (A) is a view showing an image of cultured cardiomyocytes stained with mitochondria.
  • (B) is a view showing an image of cultured cardiomyocytes exposed to hydrogen peroxide and treated with FITC nanoparticles.
  • (C) is a diagram showing an image obtained by superimposing the image shown in (A) and the image shown in (B). It is a figure which shows the FITC signal obtained by the flow cytometry analysis of the lymphocyte, the neutrophil, and the monocyte in the heart, blood, and spleen 6 hours after the reperfusion of the myocardial ischemia reperfusion model mouse.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment includes a mitochondrial injury inhibitor, an anti-inflammatory agent, and biocompatible particles encapsulating both or each of the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent.
  • the mitochondrial damage inhibitor is, for example, an mPTP opening inhibitor that inhibits mitochondrial damage by directly or indirectly suppressing mPTP opening.
  • mPTP is composed of cyclophilin D, VDAC (voltage dependent anion channel), etc., and has a pore structure at the contact site between the inner and outer mitochondrial membranes.
  • the mitochondrial injury inhibitor is specifically cyclosporine. Cyclosporine is a cyclic polypeptide, has calcineurin inhibitory action, and is also used as an immunosuppressant. Cyclosporine is known to inhibit the opening of mPTP by binding to cyclophilin D and removing cyclophilin D from the inner membrane.
  • cyclosporin A which is most abundant in cyclosporine
  • derivatives of cyclosporine such as N-methyl-valine-cyclosporine and N-methyl-4-isoleucine-cyclosporine (NIM811) may be used as mitochondrial injury inhibitors.
  • mitochondrial injury inhibitors in addition to cGMP-phosphodiesterase inhibitors, cGMP analogs (cGMP activators or stimulators) and nitric oxide producers that suppress the opening of mPTP via cGMP-dependent protein kinase, Mention may be made of aminoethoxydiphenylborate (2-APB), bongcrekinic acid, sungferin A and inhalation anesthetics such as isoflurane.
  • 2-APB aminoethoxydiphenylborate
  • bongcrekinic acid bongcrekinic acid
  • sungferin A inhalation anesthetics such as isoflurane.
  • Mitochondrial division inhibitor 1 (Mdiv-1,3- (2,4-dichloro-5-methoxyphenyl) -2,3-dihydro-2-thioxo-4 (1H) -quinazolinone or 3- (2, 4-Dichloro-5-methoxyphenyl) -2-sulfanyl-4 (3H) -quinazolinone) is preferred as a mitochondrial injury inhibitor.
  • Mdiv-1 selectively inhibits mitochondrial division DRP (dynamin-related GTPase) and further inhibits mitochondrial division dynamin (Dnm1). Mitochondrial fusion and division are involved in cell apoptosis, and Mdiv-1 inhibits mitochondrial injury and suppresses apoptosis.
  • the mitochondrial injury inhibitor can be produced by a known synthesis method, for example, a synthesis method using a chemical reaction or an enzymatic reaction (for example, see JP-A-2005-325061 for cyclosporine).
  • a known method for example, an image analysis using a fluorescent dye calcein or a method of evaluation by flow cytometry may be used.
  • the mitochondrial injury inhibitor may be quantified using a commercially available measurement kit. More specifically, the measurement kit is, for example, MitoProbe (trademark), Transition Pore assay kit (manufactured by Molecular Probes).
  • the anti-inflammatory agent may be a steroidal anti-inflammatory agent or a non-steroidal anti-inflammatory agent, such as piroxicam, diclofenac, propionic acids (naproxen, flurbiprofen, fenoprofen, ketoprofen and ibuprofen), phenamates ( Mefenamic acid), indomethacin, zulindac, apazone, pyrazolone (phenylbutazone), salicylate (aspirin), COX-2 inhibitors (celecoxib and rofecoxib) and the like.
  • piroxicam diclofenac
  • propionic acids naproxen, flurbiprofen, fenoprofen, ketoprofen and ibuprofen
  • phenamates Mefenamic acid
  • indomethacin zulindac
  • apazone pyrazolone
  • salicylate aspirin
  • COX-2 inhibitors c
  • anti-inflammatory agent those having an action of inhibiting infiltration or mobilization of activated monocytes or an action of suppressing monocyte activation are particularly suitable.
  • anti-inflammatory agents are, for example, pitavastatin, irbesartan and pioglitazone.
  • a CCR2 inhibitor which is a receptor for Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) is also suitable as an anti-inflammatory agent.
  • anti-inflammatory agents can be used.
  • the anti-inflammatory agent can be produced by a known synthesis method, for example, a synthesis method using a chemical reaction or an enzyme reaction.
  • an anti-inflammatory agent screened by allowing a compound, nucleic acid, peptide or the like to act on cells and quantifying the expression or secretion of inflammatory mediators can also be used.
  • the anti-inflammatory agent may be losartan, valsartan, candesartan cilexetil, telmisartan, olmesartan medoxomil, and the like.
  • Biocompatible particles may encapsulate both mitochondrial injury inhibitors and anti-inflammatory agents.
  • the biocompatible particles may encapsulate a mitochondrial injury inhibitor and an anti-inflammatory agent, respectively.
  • Biocompatible particles can be manufactured from biocompatible polymers.
  • Biocompatible polymers provide differences in internal viscosity and polymer properties due to their various average chain lengths.
  • the polymer used in the present embodiment is preferably a biodegradable polymer that has biocompatibility with low irritation and toxicity to a living body and is decomposed and metabolized after administration.
  • biodegradable polymers include macromolecules such as polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvalerate, and natural polymers such as collagen, cellulose acetate, bacterial cellulose, high amylose corn starch, starch, and chitosan. Examples include molecules.
  • the biocompatible particles obtained from the biocompatible polymer continuously release, that is, gradually release the encapsulated mitochondrial injury inhibitor and anti-inflammatory agent.
  • the biocompatible polymer for example, those having a molecular weight of 5,000 to 200,000 and those having a molecular weight of 15,000 to 25,000 are preferable.
  • Biocompatible particles can be made from a biocompatible polymer, such as a biocompatible polyester.
  • the biocompatible polyester include D, L-lactide, D-lactide, L-lactide, D, L-lactic acid, D-lactic acid, L-lactic acid, glycolide, glycolic acid, ⁇ -caprolactone, ⁇ -hydroxyhexanoic acid, It is a polyester synthesized by polymerizing one or more monomers selected from ⁇ -butyrolactone, ⁇ -hydroxybutyric acid, ⁇ -valerolactone, ⁇ -hydroxyvaleric acid, hydroxybutyric acid, malic acid and the like.
  • the biocompatible polymer is polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid / glycolic acid copolymer, or lactic acid / aspartic acid copolymer, especially polylactide glycolide copolymer (PLGA) or polyethylene glycol / chitosan modified— PLGA (PEG / CS-PLGA).
  • PLGA polylactide glycolide copolymer
  • PEG / CS-PLGA polyethylene glycol / chitosan modified— PLGA
  • PLGA as a biocompatible polymer is a copolymer of lactic acid or lactide and glycolic acid or glycolide in a ratio of, for example, 1:99 to 99: 1, preferably 3: 1.
  • PLGA having a lactic acid and glycolic acid content of 25 wt% to 65 wt% is preferably amorphous because it is amorphous and soluble in an organic solvent such as acetone.
  • the biocompatible particles When the biocompatible particles are produced from PLGA, the biocompatible particles have a particle size of less than 1,000 nm, such as 2.5 to 1,000 nm, preferably 5 to 800 nm, more preferably 25 to 600 nm, A PLGA of preferably 50 to 500 nm, most preferably 200 to 400 nm may be included.
  • the particle size can be measured by a screening method, a sedimentation method, a microscope method, a light scattering method, a laser diffraction / scattering method, an electrical resistance test, and the like.
  • the particle diameter can be represented by a Stoke equivalent diameter, a circle equivalent diameter, or a sphere equivalent diameter depending on the measurement method.
  • the particle diameter may be a number average particle diameter, a volume average particle diameter, an area average particle diameter, or the like represented by an average of a plurality of particles as a measurement target.
  • the number average particle diameter is an average particle diameter calculated from a number distribution based on a measurement such as a laser diffraction / scattering method.
  • the 50% diameter (D50) which is the particle diameter at which the cumulative curve becomes 50%, may be used as the average particle diameter. .
  • Biocompatible particles manufactured with PLGA easily migrate to endothelial cells, leukocytes, cardiomyocytes, inflammatory cells, highly vascularly permeable sites, etc., so encapsulated mitochondrial injury inhibitors and anti-inflammatory agents are used as endothelial cells, leukocytes It is preferable in that it is continuously released at a cardiomyocyte, an inflammatory cell, a site having high vascular permeability, and the like.
  • the biocompatible particles may be manufactured using a modified polyethylene glycol (PEG) of PLGA. It is preferable to modify the surface of PLGA with PEG from the viewpoint of improving blood stability.
  • PEG polyethylene glycol
  • the biocompatible particles have a biocompatible polymer and at least one of a mitochondrial injury inhibitor and an anti-inflammatory agent of less than 1,000 nm, for example, 2.5 to Any method can be used as long as it can be processed into particles having a number average particle size of 1,000 nm, preferably 5 to 800 nm, more preferably 25 to 500 nm, further preferably 50 to 300 nm, and most preferably 100 to 250 nm. Can also be manufactured.
  • the biocompatible particles can be produced, for example, by a spherical crystallization method.
  • the spherical crystallization method is a method of granulating crystals precipitated during the crystallization operation into a spherical shape.
  • the compound can be processed by controlling the physical properties of the compound to be produced.
  • spherical crystallization methods include an emulsion solvent diffusion method (hereinafter simply referred to as “ESD method”).
  • the ESD method two types of solvents are used: a good solvent that dissolves the biocompatible polymer encapsulating at least one of the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent, and a poor solvent that does not dissolve the biocompatible polymer.
  • a good solvent an organic solvent that dissolves the biocompatible polymer and is miscible with the poor solvent is used.
  • the kind of good solvent and poor solvent is determined according to the kind of the substance to be encapsulated and is not particularly limited. Since the biocompatible particles according to the present embodiment are mainly used as a raw material for pharmaceutical preparations that act on the human body, it is preferable to use particles that are highly safe for the human body and have a low environmental load.
  • the poor solvent examples include water or water to which a surfactant is added.
  • a polyvinyl alcohol aqueous solution is preferable as the surfactant.
  • surfactants other than polyvinyl alcohol include lecithin, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and the like. In the case where polyvinyl alcohol remains, the polyvinyl alcohol may be removed by centrifugation after the solvent is distilled off.
  • good solvents include halogenated alkanes, which are low-boiling and poorly water-soluble organic solvents, acetone, methanol, ethanol, ethyl acetate, diethyl ether, cyclohexane, benzene, toluene, and the like.
  • halogenated alkanes which are low-boiling and poorly water-soluble organic solvents
  • acetone methanol, ethanol, ethyl acetate, diethyl ether, cyclohexane, benzene, toluene, and the like.
  • acetone methanol
  • ethanol ethyl acetate
  • diethyl ether diethyl ether
  • cyclohexane benzene
  • benzene toluene
  • the production of drug-encapsulated particles encapsulating a mitochondrial injury inhibitor by the ESD method will be described.
  • a mitochondrial injury inhibitor solution is added and mixed in the good solvent so that the biocompatible polymer does not precipitate.
  • a mixed solution containing a biocompatible polymer and a mitochondrial injury inhibitor is dropped into a poor solvent under stirring, the good solvent in the mixed solution is rapidly diffused and transferred into the poor solvent.
  • the good solvent is emulsified in the poor solvent, and good solvent emulsion droplets having a diameter of several ⁇ m are formed.
  • the organic solvent continuously diffuses from the emulsion to the poor solvent due to the mutual diffusion of the good solvent and the poor solvent, the solubility of the biocompatible polymer and the mitochondrial injury inhibitor in the emulsion droplet is lowered. Eventually, biocompatible particles of spherical crystal particles encapsulating mitochondrial injury inhibitors are produced. Thereafter, the organic solvent which is a good solvent is centrifuged or distilled off under reduced pressure to obtain biocompatible particle powder. The obtained powder is compounded into aggregated particles that can be re-dispersed as it is or by freeze-drying as required. The composite particles are filled in a container as drug-encapsulated particles.
  • the thus obtained drug-encapsulated particles preferably contain 0.1 to 99% (w / v) of mitochondrial injury inhibitor, more preferably 0.1 to 30% (w / v), even more Preferably it is 1 to 10% (w / v), particularly preferably 2 to 3% (w / v).
  • drug particles encapsulating an anti-inflammatory agent can be produced by an ESD method using an anti-inflammatory agent solution. Further, in the ESD method, after dissolving the biocompatible polymer in a good solvent, the mitochondrial injury inhibitor solution and the anti-inflammatory agent solution are added to the good solvent and mixed. Drug-encapsulated particles encapsulating both can be produced.
  • the obtained drug nanoparticles are substantially spherical, it is not necessary to consider the problem of remaining catalyst and raw material compounds.
  • the spherical crystallization method it is possible to easily form drug-encapsulated particles with little variation in particle diameter.
  • a cationic polymer may be added to the poor solvent.
  • the cationic polymer adsorbed on the biocompatible particle surface interacts with the mitochondrial injury inhibitor or anti-inflammatory agent present on the emulsion droplet surface, and enters the poor solvent. It is thought that leakage of mitochondrial injury inhibitors or anti-inflammatory agents can be suppressed.
  • cationic polymers examples include chitosan and chitosan derivatives, cationized cellulose in which a plurality of cationic groups are bonded to cellulose, polyamino compounds such as polyethyleneimine, polyvinylamine and polyallylamine, polyamino acids such as polyornithine and polylysine, and polyvinylimidazole. , Polyvinylpyridinium chloride, alkylaminomethacrylate quaternary salt polymer (DAM), alkylaminomethacrylate quaternary salt / acrylamide copolymer (DAA), and the like.
  • chitosan or a derivative thereof is preferably used.
  • Chitosan is a natural polymer in which many glucosamines, one of the sugars having an amino group, are bonded, and has characteristics such as emulsion stability, shape retention, biodegradability, biocompatibility, and antibacterial properties. It is widely used as a raw material for foods, clothing and pharmaceuticals. By adding this chitosan into a poor solvent, it is possible to produce drug-encapsulated particles having no adverse effects on the living body and high safety.
  • the drug-encapsulated particles obtained as described above can be combined into aggregated particles (nanocomposites) that can be redispersed when powdered by freeze drying or the like.
  • the organic or inorganic substance is combined so as to be redispersible and dried together with the drug-encapsulated particles.
  • sugar alcohol or sucrose it is possible to effectively prevent variation in the encapsulation rate, and sugar alcohol or the like can serve as an excipient to increase the ease of handling of the drug-encapsulated particles.
  • sugar alcohol include mannitol, trehalose, sorbitol, erythritol, maltose, xylitol, etc. Among them, trehalose is particularly preferable.
  • This composite makes it easy to handle agglomerated particles in which drug encapsulated particles gather. Then, the drug-encapsulated particles return to the particles when exposed to moisture during use, and exhibit characteristics such as high reactivity.
  • the freeze-drying method for example, it can be combined by a fluidized bed drying granulation method using Agromaster AGM (manufactured by Hosokawa Micron Co., Ltd.) and integrated again in a separable state.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is produced by a known method, and contains 0.1% to 99%, 1% to 50%, preferably 1 to 20% (% is% by weight) of an active ingredient as an active ingredient. Contains particles.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is preferably an injection, a rectal suppository, a vaginal suppository, a nasal absorption agent, a transdermal absorption agent, a pulmonary absorption agent, an oral absorption agent, or an oral administration agent.
  • the pharmaceutical composition may be, for example, a combination containing a pharmacologically acceptable carrier.
  • the pharmacologically acceptable carriers are various organic carrier materials or inorganic carrier materials used as pharmaceutical materials. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations, solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, and buffering agents in liquid preparations. It is used as a soothing agent in oxidative stress diseases. Moreover, additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used as necessary.
  • Excipients are, for example, lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid and the like.
  • examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, and the like.
  • examples of the binder include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.
  • Disintegrants are, for example, starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • Solvents are, for example, water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol and the like.
  • solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Suspending agents are surfactants, hydrophilic polymers and the like, for example, stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, and the like.
  • surfactants for example, stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxyprop
  • isotonic agents are sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • the buffering agent is, for example, a phosphate, acetate, carbonate, citrate buffer or the like.
  • the soothing agent is, for example, benzyl alcohol.
  • the preservative include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, and the like.
  • examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is preferably used for treatment or prevention of a disorder caused by ischemia, for example.
  • the disorder caused by ischemia includes, for example, ischemic disorder, ischemia reperfusion disorder and the like.
  • Disorders caused by ischemia include abnormalities caused by ischemia, such as decreased oxygen supply to tissues, swelling of cells and organelles, destruction of mitochondrial and lysosomal membranes, cell damage, vascular damage, It also includes organ damage and other abnormalities caused by reperfusion, cell damage, vascular damage, and organ damage.
  • the ischemic site is preferably an organ such as heart, lung, kidney, brain and the like.
  • a disorder caused by ischemia is a disorder in an organ that is in an ischemic state.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment reduces the infarct size (infarct size) of an ischemic organ as shown in the following examples.
  • the pharmaceutical composition is preferably used for treatment or prevention of a disorder caused by ischemia. Infarct size is the most important prognostic factor of ischemic disease.
  • the pharmaceutical composition reduces cardiogenic shock, lethal arrhythmia and heart failure in the prognosis of ischemic disease.
  • biocompatible particles containing PLGA are efficiently and selectively delivered to the ischemic region as shown in Examples 2 and 3 below.
  • cyclosporine nanoparticles in which cyclosporine is encapsulated as a mitochondrial injury inhibitor in the biocompatible particle and anti-inflammatory agent nanoparticles in which pitavastatin, irbesartan, or pioglitazone is encapsulated as an anti-inflammatory agent in the biocompatible particle,
  • the infarct size is dramatically reduced (see Examples 6-8 below).
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment easily migrates to endothelial cells, leukocytes, cardiomyocytes, inflammatory cells, and sites with high vascular permeability, organ transplantation such as kidney, liver, heart, lung, pancreas, etc. Suppression of rejection in bone marrow, rejection of bone marrow transplantation and graft-versus-host disease, Behcet's disease, psoriasis vulgaris, pustular psoriasis, erythrodermic psoriasis, psoriatic arthritis, aplastic anemia, erythroblasts It may be applied to epilepsy and nephrotic syndrome, inflammatory diseases involving inflammatory cells, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present embodiment is appropriately determined according to the sex, age, weight, symptoms, etc. of the subject.
  • the pharmaceutical composition is administered so that the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent are in a therapeutically effective amount.
  • An effective amount is the amount of mitochondrial injury inhibitor and anti-inflammatory agent needed to achieve the desired result, and is necessary to provide delay, inhibition, prevention, reversal or cure of the progress of the condition being treated or treated Amount.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is typically 0.01 mg / kg to 1000 mg / kg, preferably 0.1 mg / kg to 200 mg / kg, more preferably 0.2 mg / kg to 20 mg / kg. It can be administered once a day or divided into more than one.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered 1 to 4 times a day.
  • the pharmaceutical composition may be administered at various administration frequencies such as daily, every other day, once a week, every other week, once a month.
  • the dosing frequency is easily determined by a physician. If necessary, an amount outside the above range can be used.
  • the method for administering the pharmaceutical composition according to the present embodiment is not particularly limited, and can be administered by injection, nasal, transdermal, transpulmonary, oral, or the like.
  • As an administration method intravenous administration or intracoronary administration is particularly preferable.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is administered to a patient in combination with reperfusion therapy.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a patient at the same time as reperfusion therapy, or hours, tens of minutes or minutes before reperfusion therapy is performed.
  • the pharmaceutical composition may be administered to the patient during a door-to-balloon time. Since the pharmaceutical composition is selectively and rapidly delivered to the ischemic region, the infarct size can be significantly reduced even when administered to a patient after the ischemic event, rather than before the ischemic event.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is such that the mitochondrial injury inhibitor and anti-inflammatory agent encapsulated in biocompatible particles are selectively transported to the ischemic site, and the mitochondrial injury inhibitor And release anti-inflammatory agents.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment provides a sufficient medicinal effect at a low concentration as compared with the case where the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent are not encapsulated in the biocompatible particles, the mitochondrial injury inhibitor
  • systemic side effects of anti-inflammatory agents such as nephrotoxicity and hypertension when cyclosporine is used can be reduced to increase safety.
  • the biocompatible particles may include PLGA having a number average particle diameter of 2.5 to 1000 nm or a modified PEG thereof. Since PLGA is biocompatible with low irritation and toxicity to a living body and has biodegradability that is decomposed and metabolized after administration, it is suitable for pharmaceutical use, particularly for administration to the human body.
  • PEG-modified products of PLGA are useful for optimizing pharmacokinetic profiles such as metabolic absorption stability because the stability in blood is improved.
  • PLGA and modified PEGs of PLGA are transported to endothelial cells, leukocytes, cardiomyocytes, inflammatory cells, and highly vascularly permeable sites, accumulate, and slowly release the encapsulated drug. Can be safely transported to the target site.
  • the mitochondrial injury inhibitor may be cyclosporine.
  • Cyclosporine is selectively transported to the ischemic region by encapsulating in biocompatible particles in the following examples, and exhibits an excellent infarct size reduction action.
  • the failure caused by ischemia may be a failure in an organ that has become ischemic.
  • the biocompatible particles according to the present embodiment have high blood vessel permeability and are selectively transported to an organ ischemia region where inflammatory cells accumulate. For this reason, in addition to the heart, it also exhibits an organ protecting action against damages in organs that are ischemic, such as lungs, kidneys, and brain.
  • the drug to be encapsulated in the biocompatible particle may be two or more mitochondrial injury inhibitors or two or more anti-inflammatory agents, or two or more mitochondrial injury inhibitors and two or more anti-inflammatory agents. And may be enclosed in combination.
  • the biocompatible particles may contain other drugs, such as antibiotics, analgesics or vitamins, other than drugs that are not desirably used in combination with mitochondrial injury inhibitors and anti-inflammatory agents.
  • the method for treating a disorder caused by ischemia includes a step of administering to a patient a combination of a mitochondrial injury inhibitor encapsulated in biocompatible particles and an anti-inflammatory agent encapsulated in biocompatible particles.
  • the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent may be administered as a pharmaceutical composition containing a pharmacologically acceptable carrier or the like as an active ingredient, as long as they are encapsulated in biocompatible particles.
  • “In combination” means, for example, the simultaneous administration of a mitochondrial injury inhibitor encapsulated in biocompatible particles and an anti-inflammatory agent encapsulated in biocompatible particles, and the mitochondrial injury inhibitor and anti-inflammatory agent , Continuously administered at intervals of several seconds or minutes, or administering a combination of the mitochondrial injury inhibitor and an anti-inflammatory agent.
  • the method for administering the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent is not particularly limited, and can be administered by injection, nasal, transdermal, pulmonary, oral, or the like.
  • a method for administering the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent intravenous administration or intracoronary artery administration is particularly preferable.
  • the method for treating a disorder caused by ischemia may include a step of performing reperfusion therapy.
  • the administration step is preferably performed simultaneously with the reperfusion therapy, or several hours, tens of minutes or minutes before the reperfusion therapy is performed.
  • the mitochondrial injury inhibitor and the anti-inflammatory agent encapsulated in the biocompatible particles are selectively transported to the ischemic site. It is possible to simultaneously intervene in early post-ischemic mitochondrial injury and late post-ischemic inflammation, which are the main factors in the pathology of blood reperfusion injury. By doing so, the maximum suppression effect of infarct size based on a mitochondrial injury inhibitor and an anti-inflammatory agent is obtained.
  • Example 1 Preparation of drug-encapsulated nanoparticles
  • 0.05 g cyclosporin A manufactured by Sigma, hereinafter simply referred to as “CsA”
  • CsA cyclosporin A
  • CsA-NP cyclosporine nanoparticle
  • the mixed solvent was distilled off while continuing stirring at 40 ° C. and 100 rpm under reduced pressure.
  • the suspension was filtered with a filter (aperture 32 ⁇ m), and the filtrate was freeze-dried overnight to obtain a dry powder of CsA-NP.
  • the obtained dry powder had a number average particle diameter of 221 nm, and the encapsulation rate of CsA with respect to PLGA was 2.67% (w / v).
  • Pitavastatin nanoparticles were prepared in the same manner as CsA-NP using 46.2 g of PLGA and 10.414 g of pitavastatin (manufactured by Kowa).
  • the obtained dry powder of pitavastatin-NP had a number average particle diameter of 180 nm, and the encapsulation rate of pitavastatin in PLGA was 12% (w / v).
  • Irbesartan nanoparticles (irbesartan-NP) were prepared in the same manner as CsA-NP using 2 g of PLGA and 150 mg of irbesartan (manufactured by Shionogi & Co., Ltd.).
  • the obtained dry powder of irbesartan-NP had a number average particle size of 234 nm and the encapsulation rate of irbesartan in PLGA was 3.29% (w / v).
  • Pioglitazone nanoparticles were prepared in the same manner as CsA-NP using 2 g of PLGA and 100 mg of pioglitazone (manufactured by Takeda Pharmaceutical Company Limited).
  • the obtained dry powder of pioglitazone-NP had a number average particle size of 380 nm, and the encapsulation rate of pioglitazone in PLGA was 3.7% (w / v).
  • CCR2 inhibitor-NP consists of 20-100 g PLGA and 5-20 g BMS CCR2 22 (2-[(Isopropylaminocarbonyl) amino] -N- [2-[[cis-2-[[4- (methylthio) benzoyl] ) Amino] cyclohexyl] amino] -2-oxoethyl] -5- (trifluoromethyl) benzamide, manufactured by Bristol, Myers, Squibb) and the same as above for CsA-NP.
  • the obtained dry powder of CCR2 inhibitor-NP had a number average particle size of 179 nm, and the encapsulation rate of the CCR2 inhibitor in PLGA was 3.33% (w / v).
  • FITC-NP FITC nanoparticles
  • FITC fluorescent markers
  • the definition of the number average particle diameter was defined as follows.
  • the 50% diameter (D50) which is the particle diameter at which the cumulative curve becomes 50%, was used as the cumulative median diameter (average particle diameter).
  • D50 the cumulative diameter at which the cumulative curve becomes 50%
  • the average particle size was measured by a light scattering method using a Microtrack UPA150 (manufactured by Nikkiso Co., Ltd.) with a sample in which particles were suspended in distilled water.
  • a silicon tube with an outer diameter of 1 mm was snare-shaped through 8-0 silk, and the left anterior descending branch was ligated at the lower edge of the left atrial appendage.
  • the ST change in the electrocardiogram and the color change of the myocardium were observed to confirm myocardial ischemia.
  • the silicon tube was removed and reperfusion was performed, and at the same time, 0.1 to 0.2 ml of the test substance solution was injected into the vein. After closing the chest with 5-0 silk, spontaneous breathing was confirmed and extubation was performed.
  • the test substances injected into the vein are FITC (40 mg / kg) and FITC-NP (800 mg / kg).
  • physiological saline was injected into the mice.
  • TTC triphenyltetrazolium chloride
  • DAPI Vectashield, H1200
  • SMZ1500 manufactured by Nikon was used as an optical and fluorescent microscope.
  • FIG. 1 shows a specimen observed under a stereomicroscope.
  • the FITC fluorescence was not confirmed at the infarct site (white) confirmed by Evans Blue / TCC staining.
  • FITC fluorescence was observed in agreement with the infarcted area (white).
  • FIG. 2 shows the fluorescence intensity obtained by image analysis for the specimen. A strong FITC signal was obtained only at the ischemic site in the FITC-NP administration group.
  • FIG. 3 shows a fluorescence image of the specimen of the FITC-NP administration group.
  • FITC-NP was shown to migrate into cardiomyocytes. From the above results, it was revealed that PLGA nanoparticles are selectively transported to cardiomyocytes in the ischemia / reperfusion region.
  • Example 3 FITC-NP distribution in the myocardium of myocardial ischemia / reperfusion model mice
  • FITC 0.06 mg in physiological saline 5.0 ml / kg
  • FITC-NP saline 5
  • PLGA 1.4 mg containing FITC at 0.06 mg / kg at 0.0 ml / kg
  • Mitochondria were isolated using the Mitochondria Isolation Kit for Tissue (ab110168, Abcam, Mass., USA) according to the protocol of the kit.
  • the isolated heart was cut into pieces while cooling with ice, immersed in a solution of EDTA (1 mM) in 1 ml of a homogenization buffer (10 mM Tris, 250 mM sucrose, protease inhibitor, pH 7.5), and homogenized with a Dounce homogenizer. .
  • the homogenate was centrifuged at 1000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the resulting supernatant was further centrifuged at 1500 ⁇ g for 15 minutes to obtain a pellet (mitochondrial fraction).
  • the resulting pellet was washed twice with homogenization buffer.
  • FIG. 4 shows an optical image and a fluorescence image of the mitochondrial fraction.
  • FITC-NP more fluorescence was observed in the mitochondrial fraction than in unencapsulated FITC.
  • FIG. 5 shows the amount (in moles) of FITC relative to the protein weight of the mitochondrial fraction. The amount of FITC relative to the amount of mitochondria was significantly higher with FITC-NP relative to unencapsulated FITC.
  • Example 4 FITC-NP uptake in primary cultured cardiomyocytes
  • Newborn rat ventricular myocytes were prepared from the ventricle of newborn Sprague Dawley rats with reference to the method of Fujino et al. (Fujino T et al., Recombinant mitochondrial transcription factor A protein inhibits nuclear factor of activated T cells signaling and attenuates pathological hypertrophy of cardiac myocytes., Mitochondrion, 2012, 12, 449-458).
  • Newborn rats were euthanized under isoflurane anesthesia, and the heart was quickly removed and disassembled.
  • the tissue was digested with trypsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and collagenase type 2 (manufactured by Worthington, NJ, USA), and then 10% fetal calf serum (hereinafter simply referred to as “FBS”. Thermo Scientific, USA) Suspension of cells in Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter simply referred to as “DMEM medium”, Sigma-Aldrich) containing Massachusetts), penicillin (Invitrogen, California, USA) and streptomycin (Invitrogen) did.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the suspended cells were seeded twice in a 100 mm culture dish (Cellstar TM, manufactured by Greiner Bio-One, North Carolina, USA), and allowed to stand for 70 minutes each to reduce the number of non-cardiomyocytes.
  • Non-adherent cardiomyocytes were seeded in a culture dish (Primaria (trademark), Falcon) at an optimal density for each experiment, and maintained for 36 hours in a humidified air environment containing 37 ° C. and 5% Co 2 .
  • the cardiomyocytes were washed with HBSS and treated with 250 nM MitoTracker (trademark) Orange (manufactured by Invitrogen) for 30 minutes in the culture medium.
  • the culture medium was changed and cardiomyocytes were exposed to 100 ⁇ M hydrogen peroxide for 30 minutes to simulate ischemia-reperfusion conditions.
  • the culture dish was washed and fresh medium containing FITC-NP (59.0 ⁇ g / ml PLGA containing 2.53 ⁇ g / ml FITC) was added to the culture dish. After 30 minutes, the plate was washed with PBS and fixed with -20 ° C methanol for 20 minutes. Then, it labeled using the culture medium containing DAPI (Vectashield (trademark), Vector Laboratories company make), and observed with the confocal microscope (A1, Nikon company make).
  • DAPI Vectashield (trademark), Vector Laboratories company make
  • DAPI DAPI was detected at 405 nm
  • MitoTracker (trademark) Orange was detected at 561 nm
  • FITC was detected at 457 nm.
  • Fluorescent radiation was collected with two photomultiplier tubes tuned with band-pass filters at 425-475 nm (DAPI), 565-615 nm (MitoTracker TM Orange), 500-530 nm (FITC). All observations were made using a 60x oil immersion objective. Multicolor images were obtained by switching fluorescence channels using each excitation wavelength.
  • cardiomyocytes treated with 100 ⁇ M hydrogen peroxide incorporated a large amount of FITC-NP (evaluation of 100 cardiomyocytes in each group). Moreover, the fluorescence of FITC was localized in mitochondria.
  • PLGA nanoparticles were promoted to be incorporated into mitochondria of rat cardiomyocytes by in vitro exposure to hydrogen peroxide that mimics the oxidative stress of ischemia-reperfusion. It has been reported that ischemia reperfusion in the myocardium is due to resting traits and loss of mitochondrial membrane potential, which causes anionic PLGA particles to be transported to ischemic reperfusion cardiomyocytes and mitochondria It is thought that it has increased relatively.
  • Example 5 Flow cytometry analysis using FITC-NP
  • White blood cells (monocytes, neutrophils and lymphocytes) in blood, spleen and heart were analyzed by flow cytometry.
  • Monocytes are CD11bhi (CD90 / B220 / CD49b / NK1.1 / Ly-6G) loLy-6Chi / lo and neutrophils are CD11bhi (CD90 / B220 / CD49b / NK1.1 / Ly-6G) hiLy-6Cint Lymphocytes were defined as CD11blo (CD90 / B220 / CD49b / NK1.1 / Ly-6G) hi.
  • FACSCalibur manufactured by BD Bioscience
  • FIG. 7 shows FITC signals detected by flow cytometric analysis for leukocytes in blood, spleen and heart. In monocytes, a stronger FITC signal was observed in the FITCNP administration group than in the FITC administration group.
  • PLGA particles are also selectively delivered to activated monocytes that are mobilized to the ischemia-reperfusion site.
  • Example 6 Evaluation of drug efficacy of simultaneous administration of CsA-NP and pitavastatin-NP
  • the test substance injected into the vein was CsA (1.0 mg / kg), pitavastatin (0.3 mg / kg), CsA-NP (1.0 mg / kg), pitavastatin-NP (0.3 mg
  • CsA 1.0 mg / kg
  • CsA-NP 1.0 mg / kg
  • pitavastatin-NP 0.3 mg
  • physiological saline was administered to mice as a control.
  • the dose of pitavastatin is 10 mg / kg, which is the maximum soluble amount. Even so, there was no dramatic reduction in infarct size.
  • the single administration of pitavastatin-NP and the combination of CsA-NP and pitavastatin-NP when the dose of pitavastatin was 0.1 mg / kg, there was no significant reduction in infarct size.
  • Example 7 Evaluation of efficacy of simultaneous administration of CsA-NP and irbesartan-NP
  • Test substance solutions were injected intravenously 0-5 minutes before reperfusion.
  • the test substance injected into the vein was CsA (1.0 mg / kg), irbesartan (1.0 mg / kg), CsA-NP (1.0 mg / kg), irbesartan-NP (1.0 mg).
  • CsA 1.0 mg / kg
  • irbesartan 1.0 mg / kg
  • CsA-NP 1.0 mg / kg
  • irbesartan 1.0 mg / kg
  • CsA -NP 1.0 mg / kg
  • irbesartan-NP 1.0 mg / kg
  • physiological saline was administered to mice as a control.
  • the dose of irbesartan is 3.0 mg which is the maximum soluble amount. There was no dramatic reduction in infarct size even at / kg.
  • Example 8 Efficacy evaluation of simultaneous administration of CsA-NP and pioglitazone-NP
  • Test substance solutions were injected intravenously 0-5 minutes before reperfusion.
  • the test substance injected into the vein was CsA (1.0 mg / kg), pioglitazone (1.0 mg / kg), CsA-NP (1.0 mg / kg), pioglitazone-NP (1.0 mg).
  • CsA 1.0 mg / kg
  • pioglitazone 1.0 mg / kg
  • CsA-NP 1.0 mg / kg
  • pioglitazone 1.0 mg / kg
  • CsA -NP 1.0 mg / kg
  • pioglitazone-NP 1.0 mg / kg
  • physiological saline was administered to mice as a control.
  • the dose of pioglitazone is 3.0 mg which is the maximum soluble amount. There was no dramatic reduction in infarct size even at / kg.
  • Example 9 Efficacy evaluation using knockout mice
  • the therapeutic effect of the activated monocyte inhibitor was evaluated using mice deficient in cyclophilin D (CypD), which is the main regulator of mPTP.
  • Mice deficient in CypD were obtained from Jackson Laboratories.
  • the myocardium of the mouse was ischemia, reperfusion was performed after 30 minutes, and a solution of the test substance was injected into the vein from 5 minutes before the reperfusion until the same time as the reperfusion.
  • infarct size was evaluated using mice lacking both CypD and CCR2. Mice deficient in CCR2 and mice deficient in both CypD and CCR2 were prepared by crossing each other.
  • Example 10 CCR2 inhibitor-NP efficacy evaluation
  • Test substance solutions were injected intravenously 0-5 minutes before reperfusion.
  • the test substances injected into the vein were CCR2 inhibitor (1.0 mg / kg) and CCR2 inhibitor-NP (1.0 mg / kg).
  • physiological saline was administered to mice as a control.
  • dissolve the active ingredient of BMS CCR2 22 as a CCR2 inhibitor was 1.0 mg / kg.
  • CCR2 inhibitor-NP reduced infarct size. It has been shown in Example 9 above that CCR2 is a target in inhibiting ischemia-reperfusion injury. In this example, it was further confirmed that inhibition of CCR2 was effective as a drug target in suppressing ischemia-reperfusion injury by using a nanoparticulate CCR2 inhibitor.
  • the present invention is suitable for treating a disorder caused by ischemia.
  • the results of treatment for disorders caused by ischemia are improved, and the quality of life of patients is improved.

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Abstract

　虚血に起因する障害の治療または予防に使用するための医薬組成物は、ミトコンドリア傷害阻害剤と、抗炎症剤と、前記ミトコンドリア傷害阻害剤および前記抗炎症剤の両方または各々を封入する生体適合性粒子と、を含む。前記生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５～１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体などそのポリエチレングリコール修飾体を含むものであってもよい。

Description

医薬組成物
　本発明は、医薬組成物に関する。
　急性心筋梗塞および脳梗塞などの虚血性疾患は、患者の生命予後を脅かす最も重篤な疾患である。世界保健機関によれば、虚血性疾患は人類死因の第一位である。虚血性疾患患者の最も重要な予後決定因子は、梗塞サイズである。このため、現在行われている唯一の最適な治療は、早期に血流を再開して虚血を解除する早期再灌流療法による梗塞サイズの縮小である。しかし、再灌流による血流回復そのものが不可逆的な心筋細胞の壊死を促進し、再灌流療法の梗塞縮小効果を減少させる再灌流傷害が知られている。動物実験では、再灌流傷害によって、再灌流療法による梗塞サイズの縮小効果が５０％程度キャンセルされる。
　再灌流傷害のため、再灌流療法の治療効果、すなわち梗塞サイズの縮小効果は不十分である。このため、虚血性疾患患者の長期予後は、まったく改善していない。例えば、米国における大規模登録研究における早期再灌流療法では、梗塞サイズの縮小および患者の予後改善が不十分であると報告されている（非特許文献１参照）。
　虚血再灌流傷害の病態には多くの因子が関与する（非特許文献２参照）。中でも主な因子は、（１）虚血後早期（１０分以内）のミトコンドリア傷害（特にミトコンドリア膜透過性遷移孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ－ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｐｏｒｅ、以下単に「ｍＰＴＰ」とする。）の開口による傷害または破綻）および、（２）虚血後後期（１～３時間）の炎症（特に活性化単球の浸潤）である。
　これに対し、従来のほとんどの基礎研究は、上記（１）および（２）のいずれか一つ、あるいは、（１）、（２）とは異なる他の１つの因子を標的にして治療介入するプロトコルで実施されたものである。これは、虚血再灌流傷害の機序に重要な１因子に十分介入すれば、相互作用によって更なる治療効果が生じ、複数の因子に介入しても更なる治療効果は得られにくい、というのが通説であるからである（非特許文献２、特に図３参照）。これまでに基礎研究の成果を実用化するために、多くの臨床試験が実施されてきたものの、多くはエンドポイントを達成できず、臨床試験の結果は好ましくなかった（非特許文献３参照）。
　臨床試験の結果が好ましくない理由はいくつか考えられる。一因として、動物実験で達成された虚血再灌流傷害の抑制効果（梗塞サイズとして５０％程度抑制）では不十分であったことが挙げられる。
　非特許文献４～７では、単剤では効果のほとんどない少量（ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｄｏｓｅ）の２剤併用によって単剤で得られる以上の効果があることが報告されている。効果のある用量で２剤併用した場合でも、得られた効果は、単剤での効果を足した以上のものではなかった。
　また、上記非特許文献４～７は、いずれも虚血発生前に薬剤を投与しており、再灌流時に投与したものではない。臨床応用を視野に入れると、虚血発生前に薬剤を投与するのではなく、患者が再灌流療法を受ける際に薬剤を投与する必要がある。
Daniel S et al., Door-to-Balloon Time and Mortality among Patients Undergoing Primary PCI., N. Engl. J. Med., 2013, 369, 901-909 Prasad A et al., Reperfusion injury, microvascular dysfunction, and cardioprotection: the "dark side" of reperfusion., Circulation, 2009, 120(21), 2105-2112 Kloner RA et al., Current state of clinical translation of cardioprotective agents for acute myocardial infarction., Circ. Res., 2013, 113(4), 451-463 Mao X et al., N-acetylcysteine and allopurinol confer synergy in attenuating myocardial ischemia injury via restoring HIF-1α/HO-1 signaling in diabetic rats., PLoS One, 2013, 8(7), e68949 Manickavasagam S et al., The cardioprotective effect of a statin and cilostazol combination: relationship to Akt and endothelial nitricoxide synthase activation. Cardiovasc. Drugs Ther., 2007, 21(5), 321-330 Aitchison KA et al., Potential interactions between iloprost and SIN-1 on platelet aggregation and myocardial infarct size in vivo., Eur. J. Pharmacol., 1999, 374(1), 59-69 Ma J et al., Synergistic effects of caspase inhibitors and MK-801 in brain injury after transient focal cerebral ischaemia in mice., Br. J. Pharmacol., 1998, 124(4), 756-762
　上記のように、虚血再灌流傷害を抑制し、梗塞サイズを十分に小さくする有効な治療法はない。急性心筋梗塞および脳梗塞などの虚血性疾患患者の生活の質と予後とを改善するには、虚血再灌流傷害に対する革新的治療法の開発が緊急の課題である。
　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、梗塞サイズを極力小さくすることができる医薬組成物を提供することを目的とする。
　上記のように虚血再灌流傷害の機序に関与する複数の因子に介入しても更なる治療効果は得られにくいということが通説であるものの、梗塞サイズの最大抑制効果を達成するためには、基礎研究で得られた分子細胞学的に重要な一因子への介入にこだわる必要はない。一方、虚血再灌流部位では、内皮細胞傷害および血栓などの微小血管傷害ならびに炎症などに起因する血流不全がある。このため、再灌流時に薬剤を静脈内投与、あるいは、冠動脈内に投与しても虚血再灌流部位に有効量の薬剤が送達されないという問題がある。つまり、上記（１）および（２）に介入する薬剤を再灌流時に原体で投与しても、再灌流部位に有効量が送達されないため、梗塞サイズの縮小効果が不十分であると考えられる。
　本発明者は、薬剤輸送システム（ＤＤＳ）を応用し、虚血再灌流傷害の上記（１）および（２）に同時に介入することで、虚血再灌流傷害に対する抑制効果、つまり梗塞サイズの縮小効果を最大化できることを見出した。
　すなわち、本発明の観点に係る虚血に起因する障害の治療または予防に使用するための医薬組成物は、
　ミトコンドリア傷害阻害剤と、
　抗炎症剤と、
　前記ミトコンドリア傷害阻害剤および前記抗炎症剤の両方または各々を封入する生体適合性粒子と、
　を含む。
　この場合、前記生体適合性粒子は、
　個数平均粒子径が２．５～１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体またはそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
　こととしてもよい。
　また、前記虚血に起因する障害は、
　虚血再灌流障害である、
　こととしてもよい。
　また、前記ミトコンドリア傷害阻害剤は、
　シクロスポリンまたはＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１である、
　こととしてもよい。
　また、前記抗炎症剤は、
　ピタバスタチン、イルベサルタン、ピオグリタゾンおよびＣ－Ｃケモカイン受容体タイプ２阻害剤からなる群から選択される、
　こととしてもよい。
　また、上記医薬組成物は、再灌流療法と組み合わせて患者に投与される、
　こととしてもよい。
　また、前記虚血に起因する障害は、
　虚血状態になった臓器における障害である、
　こととしてもよい。
　本発明によれば、梗塞サイズを極力小さくすることができる。
再灌流時に生理食塩水、ＦＩＴＣおよびＦＩＴＣナノ粒子（ＦＩＴＣ－ＮＰ）を投与した心筋虚血再灌流モデルマウスから得られた心臓標本の画像を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスから得られた心臓標本の画像解析により得られた蛍光強度を示す図である。 ＦＩＴＣ－ＮＰ投与群の心臓標本の蛍光画像を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスから抽出したミトコンドリア画分の光学画像および蛍光画像を示す図である。 ミトコンドリア画分におけるＦＩＴＣを定量したデータを示す図である。 （Ａ）はミトコンドリアを染色した培養心筋細胞の画像を示す図である。（Ｂ）は過酸化水素に暴露し、ＦＩＴＣナノ粒子を作用させた培養心筋細胞の画像を示す図である。（Ｃ）は（Ａ）に示す画像と（Ｂ）に示す画像とを重ね合わせた画像を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスの再灌流６時間後の心臓、血液および脾臓におけるリンパ球、好中球および単球のフローサイトメトリー解析で得られたＦＩＴＣシグナルを示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスに対するシクロスポリンＡナノ粒子（ＣｓＡ－ＮＰ）およびピタバスタチンナノ粒子（ピタバスタチン－ＮＰ）の併用による梗塞面積の縮小作用を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスに対するＣｓＡ－ＮＰおよびイルベサルタンナノ粒子（イルベサルタン－ＮＰ）の併用による梗塞面積の縮小作用を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスに対するＣｓＡ－ＮＰおよびピオグリタゾンナノ粒子（ピオグリタゾン－ＮＰ）の併用による梗塞面積の縮小作用を示す図である。 シクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）を欠損した心筋虚血再灌流モデルマウスに対するＣｓＡ－ＮＰ、ピタバスタチン－ＮＰ、イルベサルタン－ＮＰおよびピオグリタゾン－ＮＰによる梗塞面積の縮小作用、ならびにＣｙｐＤとＣ－Ｃケモカイン受容体タイプ２（Ｃ－Ｃ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ２、「ＣＣＲ２」ともいう）とを欠損させた心筋虚血再灌流モデルマウスにおける虚血領域に対する梗塞領域の割合を示す図である。 心筋虚血再灌流モデルマウスにおけるＣＣＲ２阻害剤ナノ粒子（ＣＣＲ２阻害剤－ＮＰ）による梗塞面積の縮小作用を示す図である。
　本発明に係る実施の形態について説明する。
　（実施の形態１）
　まず、本発明の実施の形態１について説明する。本実施の形態に係る医薬組成物は、ミトコンドリア傷害阻害剤と、抗炎症剤と、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の両方または各々を封入する生体適合性粒子と、を含む。
　ミトコンドリア傷害阻害剤は、例えば、ｍＰＴＰの開口を直接的、あるいは間接的に抑制することでミトコンドリア傷害を阻害するｍＰＴＰ開口抑制剤である。ｍＰＴＰは、シクロフィリンＤ、ＶＤＡＣ（ｖｏｌｔａｇｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌ）などから構成され、ミトコンドリア内膜と外膜との接触部位にある孔構造である。ミトコンドリア傷害阻害剤は、具体的には、シクロスポリンである。シクロスポリンは、環状ポリペプチドで、カルシニューリン阻害作用を有し、免疫抑制剤としても用いられている。シクロスポリンは、シクロフィリンＤに結合し、シクロフィリンＤを内膜から除去することで、ｍＰＴＰの開口を抑制することが知られている。ミトコンドリア傷害阻害剤として、シクロスポリンの中でも天然に最も多いシクロスポリンＡを用いてもよい。また、ミトコンドリア傷害阻害剤として、Ｎ－メチル－バリン－シクロスポリン、Ｎ－メチル－４－イソロイシン－シクロスポリン(ＮＩＭ８１１)などのシクロスポリンの誘導体を用いてもよい。
　また、ミトコンドリア傷害阻害剤として、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼを介してｍＰＴＰの開口を抑制するｃＧＭＰ－ホスホジエステラーゼ阻害剤、ｃＧＭＰアナログ（ｃＧＭＰ活性化薬あるいは刺激薬）および一酸化窒素産生剤の他、２－アミノエトキシジフェニルホウ酸塩（２－ＡＰＢ）、ボングクレキン酸、サングフェリンＡおよび吸入麻酔薬、例えばイソフルランなどを挙げることができる。
　上記の他、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１（Ｍｄｉｖｉ－１、３－（２，４－ジクロロ－５－メトキシフェニル）－２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－４（１Ｈ）－キナゾリノンまたは３－（２，４－ジクロロ－５－メトキシフェニル）－２－スルファニル－４（３Ｈ）－キナゾリノン）がミトコンドリア傷害阻害剤として好適である。Ｍｄｉｖｉ－１は、ミトコンドリア分裂ＤＲＰ（ダイナミン関連ＧＴＰａｓｅ）を選択的に阻害し、さらに、ミトコンドリア分裂ダイナミン（Ｄｎｍ１）を阻害する。ミトコンドリアの融合および分裂は、細胞のアポトーシスに関与しており、Ｍｄｉｖｉ－１は、ミトコンドリア傷害を阻害してアポトーシスを抑制する。
　ミトコンドリア傷害阻害剤は、市販のものを用いることができる。また、ミトコンドリア傷害阻害剤は、既知の合成法、例えば化学反応または酵素反応を利用した合成法で製造することができる（例えば、シクロスポリンであれば特開２００５－３２５０６１号公報参照）。
　ミトコンドリア傷害阻害剤としてのｍＰＴＰ開口抑制作用を有する化合物の選択には、既知の方法、例えば、蛍光色素カルセインを用いた画像解析あるいはフローサイトメトリーで評価する方法などを利用してもよい。また、ミトコンドリア傷害阻害剤は、市販の測定キットを用いて定量してもよい。より具体的には、該測定キットは、例えば、ＭｉｔｏＰｒｏｂｅ（商標）　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　Ｐｏｒｅ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（モレキュラープローブス社製）などである。
　抗炎症剤は、ステロイド系抗炎症剤または非ステロイド系抗炎症剤であってもよく、例えばピロキシカム、ジクロフェナク、プロピオン酸類（ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブプロフェン）、フェナメート類（メフェナミン酸）、インドメタシン、ズリンダック、アパゾン、ピラゾロン（フェニルブタゾン）、サリシレート（アスピリン）、ＣＯＸ－２阻害剤（セレコキシブおよびロフェコキシブ）などである。
　抗炎症剤としては、特に活性化した単球の浸潤もしくは動員を阻害する作用または単球の活性化を抑制する作用を有するものが好適である。このような抗炎症剤は、例えばピタバスタチン、イルベサルタンおよびピオグリタゾンなどである。
　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭＣＰ－１）の受容体であるＣＣＲ２阻害剤も抗炎症剤として好適である。
　上記抗炎症剤は、市販のものを用いることができる。また、抗炎症剤は、既知の合成法、例えば化学反応または酵素反応を利用した合成法で製造することができる。その他、化合物、核酸、ペプチドなどを、細胞に作用させ、炎症性メディエータの発現、分泌などを定量することでスクリーニングした抗炎症剤を用いることもできる。
　抗炎症剤は、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、オルメサルタンメドキソミルなどであってもよい。
　生体適合性粒子は、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の両方を封入してもよい。あるいは、生体適合性粒子がミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤をそれぞれ封入してもよい。
　生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーから製造することができる。生体適合性ポリマーは、その様々な平均鎖長によって、内部粘性およびポリマー特性の差異をもたらす。本実施の形態で用いられるポリマーは、生体への刺激や毒性が低い生体適合性を備え、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが好ましい。生体内分解性のポリマーとしては、例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレートなどの部生物で産生される高分子およびコラーゲン、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、ハイアミロースコーンスターチ、澱粉、キトサンなどの天然高分子などが挙げられる。
　生体適合性ポリマーから得られた生体適合性粒子は、封入するミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を持続して放出、すなわち徐放することが好ましい。このため、生体適合性ポリマーとしては、例えば分子量５，０００～２００，０００のもの、分子量１５，０００～２５，０００のものが好ましい。
　生体適合性粒子は、生体適合性ポリマー、例えば生体適合性ポリエステルから製造することができる。生体適合性ポリエステルは、例えばＤ，Ｌ－ラクチド、Ｄ－ラクチド、Ｌ－ラクチド、Ｄ，Ｌ－乳酸、Ｄ－乳酸、Ｌ－乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε－カプロラクトン、ε－ヒドロキシヘキサン酸、γ－ブチロラクトン、γ－ヒドロキシ酪酸、δ－バレロラクトン、δ－ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸などから選択される１種またはそれ以上のモノマーを重合することにより合成されるポリエステルである。好ましくは、生体適合性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、または乳酸・アスパラギン酸共重合体、とりわけポリラクチドグリコライド共重合体（ＰＬＧＡ）またはポリエチレングリコール／キトサン修飾－ＰＬＧＡ（ＰＥＧ／ＣＳ－ＰＬＧＡ）である。
　生体適合性ポリマーとしてのＰＬＧＡは、例えば１：９９～９９：１、好ましくは３：１の割合で、乳酸またはラクチドとグリコール酸またはグリコライドとからなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから一般的な方法で合成してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬工業社製）が挙げられる。乳酸およびグリコール酸の含有量が２５重量％～６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトンなどの有機溶媒に可溶である点で好ましい。
　上記生体適合性粒子をＰＬＧＡから製造する場合、生体適合性粒子は、その粒子径が１，０００ｎｍ未満、例えば２．５～１，０００ｎｍ、好ましくは５～８００ｎｍ、より好ましくは２５～６００ｎｍ、さらに好ましくは５０～５００ｎｍ、最も好ましくは２００～４００ｎｍのＰＬＧＡを含むようにしてもよい。粒子径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験などで測定できる。粒子径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、粒子径は、複数の粒子を測定対象として、その平均で表した個数平均粒子径、体積平均粒子径、面積平均粒子径などであってもよい。例えば、個数平均粒子径は、レーザー回折・散乱法などの測定に基づく個数分布などから算出される平均粒子径である。具体的には、粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を平均粒子径としてもよい。
　ＰＬＧＡで製造された生体適合性粒子は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位などに移行しやすいため、封入するミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位などで持続して放出する点で好ましい。
　また、上記生体適合性粒子は、ＰＬＧＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体を用いて製造してもよい。ＰＬＧＡの表面をＰＥＧで修飾すると、血中安定性が向上する点で好ましい。
　上記生体適合性粒子は、生体適合性ポリマーと、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の少なくとも一方とを、例えば、レーザー回折・散乱法などで測定したときに１，０００ｎｍ未満、例えば２．５～１，０００ｎｍ、好ましくは５～８００ｎｍ、より好ましくは２５～５００ｎｍ、さらに好ましくは５０～３００ｎｍ、最も好ましくは１００～２５０ｎｍの個数平均粒子径を有する粒子に加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造することができる。生体適合性粒子は、例えば、球形晶析法で製造することができる。球形晶析法は、晶析操作中に析出する結晶を球状に造粒する方法である。球形晶析法によれば、製造する化合物の物性を制御して化合物を加工できる。例えば、球形晶析法には、エマルジョン溶媒拡散法（以下、単に「ＥＳＤ法」とする）がある。
　ＥＳＤ法では、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の少なくとも一方を封入する生体適合性ポリマーを溶解する良溶媒と、生体適合性ポリマーを溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、生体適合性ポリマーを溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒および貧溶媒の種類は、封入される物質の種類などに応じて決定されるものであり、特に限定されるものではない。本実施形態に係る生体適合性粒子は、主に人体に作用させる医薬製剤の原料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、かつ環境負荷の少ないものを用いることが好ましい。
　貧溶媒としては、水または界面活性剤を添加した水が挙げられる。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール水溶液が好ましい。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。なお、ポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去の後に、遠心分離などによりポリビニルアルコールを除去してもよい。
　良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンなどが挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみまたはアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。
　以下では、ミトコンドリア傷害阻害剤を封入した薬剤封入粒子のＥＳＤ法による製造について説明する。ＥＳＤ法では、まず、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、生体適合性ポリマーが析出しないように、ミトコンドリア傷害阻害剤溶解液を良溶媒中へ添加混合する。生体適合性ポリマーとミトコンドリア傷害阻害剤を含む混合液を、攪拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、直径数μｍほどの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマーおよびミトコンドリア傷害阻害剤の溶解度が低下する。最終的には、ミトコンドリア傷害阻害剤を封入した球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離または減圧留去し、生体適合性粒子粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、または必要に応じて凍結乾燥などにより再分散可能な凝集粒子に複合化される。複合化された粒子は、薬剤封入粒子として、容器内に充填される。このようにして得られた薬剤封入粒子には、好ましくは、ミトコンドリア傷害阻害剤が０．１～９９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１～３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１～１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましく２～３％（ｗ／ｖ）封入される。
　なお、上記同様、抗炎症剤を封入した薬剤粒子は、抗炎症剤溶解液を用いてＥＳＤ法で製造できる。また、上記ＥＳＤ法において、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、ミトコンドリア傷害阻害剤溶解液および抗炎症剤溶解液を良溶媒中へ添加混合すれば、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の両方を封入した薬剤封入粒子を製造できる。
　上記球形晶析法では、得られる薬剤ナノ粒子が略球形であるため触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要がない。また、球形晶析法によれば、粒子径のばらつきが少ない薬剤封入粒子を容易に形成することができる。
　なお、生体適合性粒子内部へのミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の少なくとも一方の封入率を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子を貧溶媒中に添加した場合は、生体適合性粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルション滴表面に存在するミトコンドリア傷害阻害剤または抗炎症剤と相互作用し、貧溶媒中へのミトコンドリア傷害阻害剤または抗炎症剤の漏出を抑制することができると考えられる。
　カチオン性高分子としては、キトサンおよびキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミンなどのポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）などが挙げられる。特にキトサンまたはその誘導体が好適に用いられる。
　キトサンは、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合した天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性などの特徴を有するため、化粧品、食品、衣料品および医薬品などの原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、生体への悪影響がなく、安全性の高い薬剤封入粒子を製造することができる。
　以上のようにして得られた薬剤封入粒子は、凍結乾燥などにより粉末化させる際に再分散可能な凝集粒子（ナノコンポジット）に複合化できる。このとき、有機または無機の物質を再分散可能に複合化させ、薬剤封入粒子と共に乾燥させることが好ましい。例えば、糖アルコールやショ糖を用いることにより、封入率のばらつきを効果的に防止するとともに、糖アルコールなどが賦形剤となり薬剤封入粒子の取り扱いやすさを高めることができる。糖アルコールとしては、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトース、キシリトースなどが挙げられ、この中でも特にトレハロースが好ましい。
　この複合化により、薬剤封入粒子が集まった、取り扱いやすい凝集粒子となっている。そして、使用時に水分に触れることで薬剤封入粒子は、粒子に戻って高反応性などの特性を示す。なお、凍結乾燥法に代えて、例えばアグロマスタＡＧＭ（ホソカワミクロン社製）を使用した流動層乾燥造粒法により複合化して、再度分離可能な状態で一体化することもできる。
　本実施の形態に係る医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として０．１％～９９％、１％～５０％、好ましくは１～２０％（％は重量％）の薬剤封入粒子を含む。
　本実施の形態に係る医薬組成物は、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤および経口投与剤などが好ましい。このとき、当該医薬組成物は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質または無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして酸化ストレス疾患治療薬に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を用いることもできる。
　賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などである。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどである。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどである。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどである。
　溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴールなどである。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどである。懸濁化剤は、界面活性剤、親水性高分子などであって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどである。
　等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトールなどである。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液などである。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコールなどである。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などである。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などである。
　本実施の形態に係る医薬組成物は、例えば、虚血に起因する障害の治療または予防に使用するのが好適である。虚血に起因する障害は、例えば、虚血障害、虚血再灌流障害などを含む。虚血に起因する障害には、虚血による組織への酸素供給の低下、細胞および細胞内小器官の膨化、ミトコンドリア膜およびライソゾーム膜の破壊などを起因とする状態異常、細胞障害、血管障害、臓器傷害など、さらに再灌流によって惹起される状態異常、細胞障害、血管障害、臓器傷害も含む。ここで、虚血部位は、好ましくは、心臓、肺、腎臓、脳などの臓器である。この場合、虚血に起因する障害は、虚血状態になった臓器における障害となる。
　特に、本実施の形態に係る医薬組成物は、下記実施例に示すように、虚血状態になった臓器の梗塞サイズ（梗塞の大きさ）を小さくする。この点においても、当該医薬組成物は、虚血に起因する障害の治療または予防に使用するのが好適である。梗塞サイズは、虚血性疾患の最も重要な予後規定因子である。このため、当該医薬組成物は、虚血性疾患の予後における心原性ショック、致死性不整脈および心不全を減少させる。
　ＰＬＧＡを含む生体適合性粒子は、下記実施例２、３に示すように、虚血領域に効率よく選択的に送達される。また、当該生体適合性粒子にミトコンドリア傷害阻害剤としてシクロスポリンを封入したシクロスポリンナノ粒子と、当該生体適合性粒子に抗炎症剤としてピタバスタチン、イルベサルタンまたはピオグリタゾンを封入した抗炎症剤ナノ粒子とを、虚血再灌流モデルマウスに虚血後再灌流前に投与すると、梗塞サイズが劇的に縮小される（下記実施例６～８参照）。
　この他、本実施の形態に係る医薬組成物は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位に移行しやすいため、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓などの臓器移植における拒絶反応の抑制、骨髄移植における拒絶反応および移植片対宿主病の抑制、ベーチェット病、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬、再生不良性貧血、赤芽球癆およびネフローゼ症候群、炎症細胞が関与する炎症性疾患などに適用されてもよい。
　本実施の形態に係る医薬組成物の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状などによって適宜決定される。当該医薬組成物は、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤が治療上有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の量であり、治療または処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転または治癒をもたらすのに必要な量である。当該医薬組成物の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、またはそれ以上に分割して投与することができる。当該医薬組成物を分割して投与する場合、当該医薬組成物は、好ましくは１日に１～４回投与される。また、当該医薬組成物は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回などの様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
　本実施の形態に係る医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、注射、経鼻、経皮、経肺、経口などで投与できる。投与方法としては、静脈内投与、または冠動脈内投与が特に好ましい。
　本実施の形態に係る医薬組成物は、再灌流療法と組み合わせて患者に投与される。例えば、当該医薬組成物は、再灌流療法と同時、あるいは再灌流療法を実施する数時間前、数十分前または数分前に患者に投与されてもよい。当該医薬組成物は、ｄｏｏｒ－ｔｏ－ｂａｌｌｏｏｎ　ｔｉｍｅの間に患者に投与されてもよい。当該医薬組成物は、虚血領域に選択的に速やかに送達されるため、虚血発生前ではなく、虚血発生後の患者に投与しても梗塞サイズを顕著に縮小させることができる。
　以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、生体適合性粒子に封入されたミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤が虚血部位に選択的に輸送され、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を放出する。これにより、虚血再灌流傷害の病態の主な因子である虚血後早期のミトコンドリア傷害および虚血後後期の炎症に同時に介入できるため、虚血再灌流傷害を抑制できる。この結果、梗塞サイズを極力小さくすることができる。
　また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を生体適合性粒子に封入しない場合と比較して、低濃度で十分な薬効が得られるので、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の全身的副作用、例えば、シクロスポリンを用いた場合の腎毒性、高血圧などのリスクを小さくして、安全性を高めることができる。
　また、本実施の形態では、生体適合性粒子は、個数平均粒子径が２．５～１０００ｎｍのＰＬＧＡまたはそのＰＥＧ修飾体を含むものでもよいこととした。ＰＬＧＡは、生体に対する刺激や毒性が低い生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性を備えるため、医薬用途、特に人体への投与に適している。また、ＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、血中安定性が向上するため、代謝吸収安定性などの薬物動態プロファイルを最適化するのに有用である。また、ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体は、内皮細胞、白血球、心筋細胞、炎症細胞、血管透過性の高い部位に輸送され、蓄積され、封入する薬剤を徐放するので、封入した薬剤を選択的に安全に対象部位に輸送することができる。
　なお、本実施の形態では、ミトコンドリア傷害阻害剤は、シクロスポリンであってもよいこととした。シクロスポリンは、下記実施例において生体適合性粒子に封入することで虚血領域に選択的に輸送され、優れた梗塞サイズの縮小作用を発揮する。
　また、本実施の形態では、虚血に起因する障害は、虚血状態になった臓器における障害であってもよいこととした。本実施の形態に係る生体適合性粒子は、下記実施例に示すように、血管透過性が高く、炎症細胞の集積する臓器虚血領域に選択的に輸送される。このため、心臓の他、肺、腎臓、脳などの虚血状態になった臓器における障害に対しても臓器保護作用を発揮する。
　なお、生体適合性粒子に封入する薬剤は、２種類以上のミトコンドリア傷害阻害剤または２種類以上の抗炎症剤であってもよく、２種類以上のミトコンドリア傷害阻害剤と２種類以上の抗炎症剤とを組み合わせて封入してもよい。また、生体適合性粒子には、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤と併用することが望ましくない薬剤を除くその他の薬剤、例えば抗生物質、鎮痛剤またはビタミン類などを封入してもよい。
　（実施の形態２）
　次に、本発明の実施の形態２について説明する。
　本実施の形態に係る虚血に起因する障害の治療方法は、生体適合性粒子に封入されたミトコンドリア傷害阻害剤と生体適合性粒子に封入された抗炎症剤とを組み合わせて患者に投与するステップを含む。ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤は、それぞれ生体適合性粒子に封入されていれば、有効成分として、薬理上許容される担体などを含む医薬組成物として投与されてもよい。
　「組み合わせて」とは、例えば、生体適合性粒子に封入されたミトコンドリア傷害阻害剤と生体適合性粒子に封入された抗炎症剤とを同時に投与すること、当該ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を、数秒、数分間の間隔で連続して投与すること、あるいは当該ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を配合した合剤を投与することなどである。　
　上記ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を投与する方法は、特に限定されないが、注射、経鼻、経皮、経肺、経口などで投与できる。上記ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤を投与する方法として、特に静脈内投与、または冠動脈内投与が好ましい。
　当該虚血に起因する障害の治療方法は、再灌流療法を行うステップを含んでもよい。この場合、好適には、再灌流療法と同時、あるいは再灌流療法を実施する数時間前、数十分前または数分前に上記投与ステップが行われる。
　以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る治療方法によれば、生体適合性粒子に封入されたミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤が虚血部位に選択的に輸送されるため、虚血再灌流傷害の病態の主な因子である虚血後早期のミトコンドリア傷害および虚血後後期の炎症に同時に介入できる。こうすることで、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤に基づく梗塞サイズの最大抑制効果が得られる。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：薬剤封入ナノ粒子の作製）
　１．２ｇのＰＬＧＡ（和光純薬工業社製、ＰＬＧＡ７５２０、乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００）と０．０５ｇのシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ社製、以下単に「ＣｓＡ」ともいう）とを、アセトン４０ｍｌおよびエタノール２０ｍｌの混合溶媒に溶解しポリマー溶液とした。これを４０℃、４００ｒｐｍで攪拌した０．５ｗｔ％ＰＶＡ溶液１２０ｍｌ中に一定速度（４ｍｌ／分）で滴下し、シクロスポリンナノ粒子（ＣｓＡ－ＮＰ）懸濁液を得た。続いて減圧下４０℃、１００ｒｐｍで攪拌を続けながら、混合溶媒を留去した。約２時間の混合溶媒留去後、懸濁液をフィルターろ過（目開き３２μｍ）し、ろ液を一晩凍結乾燥し、ＣｓＡ－ＮＰの乾燥粉末を得た。得られた乾燥粉末は、個数平均粒子径が２２１ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＣｓＡの封入率は、２．６７％（ｗ／ｖ）であった。
　ピタバスタチンナノ粒子（ピタバスタチン－ＮＰ）は、４６．２ｇのＰＬＧＡと、１０．１４１４ｇのピタバスタチン（興和社製）とを用いて、上記ＣｓＡ－ＮＰと同様に作製した。得られたピタバスタチン－ＮＰの乾燥粉末は、個数平均粒子径が１８０ｎｍ、ＰＬＧＡに対するピタバスタチンの封入率は、１２％（ｗ／ｖ）であった。
　イルベサルタンナノ粒子（イルベサルタン－ＮＰ）は、２ｇのＰＬＧＡと、１５０ｍｇのイルベサルタン（塩野義製薬社製）とを用いて、上記ＣｓＡ－ＮＰと同様に作製した。得られたイルベサルタン－ＮＰの乾燥粉末は、個数平均粒子径が２３４ｎｍ、ＰＬＧＡに対するイルベサルタンの封入率は、３．２９％（ｗ／ｖ）であった。
　ピオグリタゾンナノ粒子（ピオグリタゾン－ＮＰ）は、２ｇのＰＬＧＡと、１００ｍｇのピオグリタゾン（武田薬品工業社製）とを用いて、上記ＣｓＡ－ＮＰと同様に作製した。得られたピオグリタゾン－ＮＰの乾燥粉末は、個数平均粒子径が３８０ｎｍ、ＰＬＧＡに対するピオグリタゾンの封入率は、３．７％（ｗ／ｖ）であった。
　ＣＣＲ２阻害剤－ＮＰは、２０～１００ｇのＰＬＧＡと、５～２０ｇのＢＭＳ　ＣＣＲ２　２２（２－［（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［２－［［ｃｉｓ－２－［［４－（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］ａｍｉｎｏ］－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ］－５－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ブリストール、マイヤーズ、スクイブ社製）とを用いて、上記ＣｓＡ－ＮＰと上記と同様に作製した。得られたＣＣＲ２阻害剤－ＮＰの乾燥粉末は、個数平均粒子径が１７９ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＣＣＲ２阻害剤の封入率は、３．３３％（ｗ／ｖ）であった。
　蛍光マーカー（ＦＩＴＣ）を封入したＦＩＴＣナノ粒子（ＦＩＴＣ－ＮＰ）を、上記ＣｓＡ－ＮＰと同様に製造した。ＦＩＴＣ－ＮＰの乾燥粉末は、個数平均粒子径が２２５ｎｍ、ＰＬＧＡに対するＦＩＴＣの封入率は、５％（ｗ／ｖ）であった。
　本実施例において、個数平均粒子径の定義は以下のように定義した。その粉体の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である５０％径（Ｄ５０）を累積中位径（平均粒子径）として一般的に粒度分布を評価するパラメータとして定義した。平均粒子径は、粒子を蒸留水に懸濁したサンプルをＭｉｃｒｏｔｒａｃｋ　ＵＰＡ１５０（日機装社製）を用いて光散乱法で計測した。
　（実施例２：虚血再灌流部位への選択的な薬剤輸送の確認）
　マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、８～１０週齢、雄、２５～３０ｇ、ｎ＝３）の腹腔内にペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、あるいはイソフルランを用いて吸入麻酔した。手技中は、人工呼吸器管理を行い（１回の換気量：０．５ｍｌ、呼吸数１４０回／分）、加温パッドを用いてマウスを保温し、直腸温を３６．８℃から３７．２℃に維持した。第３－４肋間の高さで水平に切開し、心膜を開いた。外径１ｍｍのシリコンチューブに８‐０シルクを通してスネア状にし、左心耳の下縁で左前下行枝を結紮した。心電図のＳＴ変化、心筋の色調変化を観察し、心筋の虚血を確認した。結紮から３０分経過後にシリコンチューブを除去し、再灌流を行い、同時に被験物質の溶液０．１～０．２ｍｌを静脈に注射した。５‐０シルクにて閉胸後、自発呼吸を確認して抜管した。静脈に注射した被験物質は、ＦＩＴＣ（４０ｍｇ／ｋｇ）、ＦＩＴＣ－ＮＰ（８００ｍｇ／ｋｇ）である。なお、対照として生理食塩水をマウスに注射した。
　再灌流から２４時間後、再度麻酔し、気管内挿管後に開胸した。左前下行枝を上記と同じ部位で同様に結紮し、虚血領域（Ａｒｅａ　ａｔ　Ｒｉｓｋ；ＡＡＲ）を明瞭にするために、２％のエバンスブルーを下大動脈から投与した。続いて速やかに心臓を摘出し、－８０℃で凍結させた。左室を１ｍｍの厚さに短軸方向に分割し、５つの切片を標本として切り出した。得られた標本における心筋を、１％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）溶液内で染色した（３７℃、１０分間）。また、ＦＩＴＣ－ＮＰ投与群の標本を、核染色用試薬であるＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｈ１２００）で処理した。標本の評価において光学および蛍光顕微鏡はＳＭＺ１５００（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いた。
　（結果）
　図１は、実体顕微鏡下で観察した標本を示す。ＦＩＴＣ投与群の標本では、エバンスブルー／ＴＣＣ染色で確認された梗塞部位（白色）に、ＦＩＴＣの蛍光が確認されなかった。一方、ＦＩＴＣ－ＮＰ投与群の標本では、梗塞部位（白色）に一致してＦＩＴＣの蛍光が観察された。
　図２は、上記標本について画像解析により得られた蛍光強度を示す。ＦＩＴＣ－ＮＰ投与群の虚血部位のみで、強いＦＩＴＣシグナルが得られた。
　図３は、ＦＩＴＣ－ＮＰ投与群の標本の蛍光画像を示す。ＦＩＴＣ－ＮＰは、心筋細胞内に移行していることが示された。以上の結果より、ＰＬＧＡナノ粒子が虚血再灌流領域の心筋細胞に選択的に輸送されることが明らかとなった。
　（実施例３：心筋虚血再灌流モデルマウスの心筋におけるＦＩＴＣ－ＮＰの分布）
　ＦＩＴＣ－ＮＰの細胞内分布を調べるために、上記心筋虚血再灌流モデルマウスにおいて、再灌流と同時にＦＩＴＣ（生理食塩水５．０ｍｌ／ｋｇに０．０６ｍｇ）またはＦＩＴＣ－ＮＰ（生理食塩水５．０ｍｌ／ｋｇに０．０６ｍｇ／ｋｇでＦＩＴＣを含有するＰＬＧＡ１．４ｍｇ）を静脈に注射し、再灌流５分後の虚血心筋からミトコンドリアを単離した。ミトコンドリアは、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｔｉｓｓｕｅ（ａｂ１１０１６８、Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州）を使用して、当該キットのプロトコルに従って単離した。摘出した心臓を氷冷しながら細かく切り、１ｍｌのホモジネーション緩衝液（１０ｍＭトリス、２５０ｍＭスクロース、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．５）にＥＤＴＡ（１ｍＭ）を加えた溶液に浸し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化した。ホモジネートを４℃で５分間、１０００×ｇで遠心分離し、得られた上清をさらに１５分間、１５００×ｇで遠心分離し、ペレット（ミトコンドリア画分）を得た。ホモジネーション緩衝液を用いて、得られたペレットを２回洗浄した。　
　（結果）
　図４は、ミトコンドリア画分の光学画像、蛍光画像を示す。ＦＩＴＣ－ＮＰでは、封入していないＦＩＴＣより多くの蛍光がミトコンドリア画分に観察された。図５は、ミトコンドリア画分のタンパク質の重量に対するＦＩＴＣの量（モル）を示す。ミトコンドリアの量に対するＦＩＴＣの量は、封入してないＦＩＴＣに対してＦＩＴＣ－ＮＰで有意に高かった。
　（実施例４：初代培養心筋細胞におけるＦＩＴＣ－ＮＰの取り込み）
　細胞へのＦＩＴＣ－ＮＰの取り込みおよびＦＩＴＣ－ＮＰの細胞内局在を調べるため、初代培養のラット心筋細胞を用いた。新生ラットの心室筋細胞は、Ｆｕｊｉｎｏらの方法を参考にして、新生のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットの心室から調製した（Fujino T et al., Recombinant mitochondrial transcription factor A protein inhibits nuclear factor of activated T cells signaling and attenuates pathological hypertrophy of cardiac myocytes., Mitochondrion, 2012, 12, 449-458）。
　新生ラットをイソフルラン麻酔下で安楽死させ、素早く心臓を摘出し分解した。トリプシン（和光純薬工業社製）およびコラゲナーゼタイプ２（ワーシントン社製、米国ニュージャージー州）で組織を分解後、１０％ウシ胎仔血清（以下単に「ＦＢＳ」とする。サーモサイエンティフィック社製、米国マサチューセッツ州）、ペニシリン（インビトロジェン社製、米国カリフォルニア州）およびストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下単に「ＤＭＥＭ培地」とする、シグマ－アルドリッチ社製）に、細胞を懸濁した。懸濁した細胞を１００ｍｍの培養皿（Ｃｅｌｌｓｔａｒ（商標）、Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製、米国ノースカロライナ州）に２回播き、それぞれ７０分間静置して、非心筋細胞の数を減らした。非接着性の心筋細胞を培養皿（Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）、ファルコン社）に各実験に最適な密度となるように播き、３７℃、５％Ｃｏ２を含む加湿空気環境下で３６時間維持した。
　続いて、心筋細胞をＨＢＳＳで洗浄し、培養培地において２５０ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）　Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社製）で３０分間処理した。次に、培養培地を交換し、虚血再灌流状態を模するために１００μＭの過酸化水素に心筋細胞を３０分間暴露した。培養皿を洗浄し、ＦＩＴＣ－ＮＰ（２．５３μｇ／ｍｌのＦＩＴＣを含有する５９．０μｇ／ｍｌのＰＬＧＡ）を含む新たな培地を培養皿に加えた。３０分後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、－２０℃のメタノールで２０分間固定した。その後、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を含む培地を用いて標識し、共焦点顕微鏡（Ａ１、ニコン社製）で観察した。
　ＤＡＰＩは４０５ｎｍで、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）　Ｏｒａｎｇｅは５６１ｎｍで、ＦＩＴＣは４５７ｎｍで検出した。蛍光放射光は、４２５～４７５ｎｍ（ＤＡＰＩ）、５６５～６１５ｎｍ（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）　Ｏｒａｎｇｅ）、５００～５３０ｎｍ（ＦＩＴＣ）にバンド－パスフィルタで調整された２個の光電子増倍管で集められた。すべての観察は、６０倍の油浸対物レンズを用いて行った。多色画像は、各励起波長を使用し、蛍光チャンネルを切り替えることで得た。
　（結果）
　図６に示すように、１００μＭの過酸化水素で処理した心筋細胞には、ＦＩＴＣ－ＮＰが多く取り込まれていた（各群１００個の心筋細胞を評価）。また、ＦＩＴＣの蛍光は、ミトコンドリアに局在していた。
　本実施例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいても虚血再灌流の酸化ストレスを模した過酸化水素への暴露によって、ＰＬＧＡナノ粒子は、ラット心筋細胞のミトコンドリアへの取り込みが促進された。心筋での虚血再灌流は静止形質およびミトコンドリア膜電位の消失に起因することが報告されており、これによって、虚血再灌流の心筋細胞およびミトコンドリアに輸送される陰イオン性のＰＬＧＡの粒子が相対的に多くなったと考えられる。
　（実施例５：ＦＩＴＣ－ＮＰを用いたフローサイトメトリー解析）
　上記実施例２に従って、生理食塩水、ＦＩＴＣまたはＦＩＴＣ－ＮＰを投与したマウスを再灌流２４時間後に安楽死させた(各群ｎ＝３)。血液、脾臓および心臓における白血球（単球、好中球およびリンパ球）をフローサイトメトリーで解析した。単球は、ＣＤ１１ｂｈｉ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ－６Ｇ）ｌｏＬｙ－６Ｃｈｉ／ｌｏ、好中球は、ＣＤ１１ｂｈｉ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ－６Ｇ）ｈｉＬｙ－６Ｃｉｎｔ、リンパ球は、ＣＤ１１ｂｌｏ（ＣＤ９０／Ｂ２２０／ＣＤ４９ｂ／ＮＫ１．１／Ｌｙ－６Ｇ）ｈｉと定義した。測定にはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、解析はＣｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で行った。
　（結果）
　図７は、血液、脾臓および心臓における白血球に対するフローサイトメトリー解析で検出したＦＩＴＣシグナルを示す。単球において、ＦＩＴＣ投与群と比較して、ＦＩＴＣＮＰ投与群で強いＦＩＴＣシグナルを認めた。
　本実施例によって、ＰＬＧＡの粒子が虚血再灌流部位に動員される活性化単球にも選択的に送達されることが示された。
　（実施例６：ＣｓＡ－ＮＰおよびピタバスタチン－ＮＰの同時投与の薬効評価）
　実施例２と同様に、マウス（ｎ＝８）の心筋を虚血させ、再灌流を行った。再灌流の０～５分前に被験物質の溶液を静脈に注射した。静脈に注射した被験物質は、単剤投与の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピタバスタチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピタバスタチン－ＮＰ（０．３ｍｇ／ｋｇ）とし、２剤併用の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピタバスタチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピタバスタチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピタバスタチン－ＮＰ（０．３ｍｇ／ｋｇ）とした。なお、対照として生理食塩水をマウスに投与した。
　上記と同様に染色した各切片の梗塞（白色部位）およびＡＡＲ（赤色部位）の面積をそれぞれ計測し、梗塞領域の面積／ＡＡＲの面積を算出した。
　（結果）
　図８に示すように、ＣｓＡ－ＮＰおよびピタバスタチン－ＮＰを併用することで、梗塞サイズの劇的な縮小効果が認められた。これは、ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の有効量がＰＬＧＡの粒子によって、再灌流部位に送達されたためである。ミトコンドリア傷害阻害剤および抗炎症剤の投与によって、虚血再灌流傷害の病態の主な因子である虚血後早期のミトコンドリア傷害および虚血後後期の炎症に同時に介入できるので、虚血再灌流傷害が十分に抑制され、梗塞サイズが劇的に縮小された。
　なお、ピタバスタチンの単剤投与、ピタバスタチン－ＮＰの単剤投与、ＣｓＡおよびピタバスタチンの２剤併用、ＣｓＡ－ＮＰおよびピタバスタチンの２剤併用において、ピタバスタチンの用量を、それぞれ可溶最大量である１０ｍｇ／ｋｇとしても梗塞サイズの劇的な縮小は見られなかった。また、ピタバスタチン－ＮＰの単剤投与ならびにＣｓＡ－ＮＰおよびピタバスタチン－ＮＰの２剤併用において、ピタバスタチンの用量がそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇの場合、梗塞サイズの有意な縮小は見られなかった。
　（実施例７：ＣｓＡ－ＮＰおよびイルベサルタン－ＮＰの同時投与の薬効評価）
　実施例２と同様に、マウス（ｎ＝８）の心筋を虚血させ、再灌流を行った。再灌流の０～５分前に被験物質の溶液を静脈に注射した。静脈に注射した被験物質は、単剤投与の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、イルベサルタン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、イルベサルタン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とし、２剤併用の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびイルベサルタン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびイルベサルタン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびイルベサルタン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とした。なお、対照として生理食塩水をマウスに投与した。
　上記と同様に染色した各切片の梗塞およびＡＡＲの面積をそれぞれ計測し、梗塞領域の面積／ＡＡＲの面積を算出した。
　（結果）
　図９に示すように、ＣｓＡ－ＮＰおよびイルベサルタン－ＮＰを併用することで、梗塞サイズの劇的な縮小効果が認められた。
　なお、イルベサルタンの単剤投与、イルベサルタン－ＮＰの単剤投与、ＣｓＡおよびイルベサルタンの２剤併用、ＣｓＡ－ＮＰおよびイルベサルタンの２剤併用において、イルベサルタンの用量を、それぞれ可溶最大量である３．０ｍｇ／ｋｇとしても梗塞サイズの劇的な縮小は見られなかった。
　（実施例８：ＣｓＡ－ＮＰおよびピオグリタゾン－ＮＰの同時投与の薬効評価）
　実施例２と同様に、マウス（ｎ＝３）の心筋を虚血させ、再灌流を行った。再灌流の０～５分前に被験物質の溶液を静脈に注射した。静脈に注射した被験物質は、単剤投与の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピオグリタゾン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピオグリタゾン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とし、２剤併用の場合、ＣｓＡ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピオグリタゾン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピオグリタゾン（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびピオグリタゾン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とした。なお、対照として生理食塩水をマウスに投与した。
　上記と同様に染色した各切片の梗塞およびＡＡＲの面積をそれぞれ計測し、梗塞領域の面積／ＡＡＲの面積を算出した。
　（結果）
　図１０に示すように、ＣｓＡ－ＮＰおよびピオグリタゾン－ＮＰを併用することで、梗塞サイズの劇的な縮小効果が認められた。
　なお、ピオグリタゾンの単剤投与、ピオグリタゾン－ＮＰの単剤投与、ＣｓＡおよびピオグリタゾンの２剤併用、ＣｓＡ－ＮＰおよびピオグリタゾンの２剤併用において、ピオグリタゾンの用量を、それぞれ可溶最大量である３．０ｍｇ／ｋｇとしても梗塞サイズの劇的な縮小は見られなかった。
　（実施例９：ノックアウトマウスを用いた薬効評価）
　ｍＰＴＰの主な制御因子であるシクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）を欠損させたマウスを用いて、活性化単球抑制剤の治療効果を評価した。ＣｙｐＤを欠損させたマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。実施例２と同様に、マウスの心筋を虚血させ、３０分経過後に再灌流を行い、再灌流の５分前から再灌流と同時までに被験物質の溶液を静脈に注射した。被験物質は、ＣｓＡ－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピタバスタチン－ＮＰ（０．３ｍｇ／ｋｇ）、イルベサルタン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ピオグリタゾン－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とした。再灌流から２４時間後、梗塞およびＡＡＲの面積をそれぞれ計測し、梗塞面積／ＡＡＲの面積を算出した（ｎ＝８）。なお、対照として生理食塩水をマウスに投与した。
　また、単球活性化に関与するＣＣＲ２を欠損させたマウスに加え、ＣｙｐＤとＣＣＲ２とを両方欠損させたマウスを用いて、梗塞サイズを評価した。ＣＣＲ２を欠損させたマウスおよびＣｙｐＤとＣＣＲ２とを両方欠損させたマウスは、それぞれを交配して作製した。
　上記と同様に、マウスの心筋を虚血させ、３０分経過後に再灌流を行い、再灌流から２４時間後、梗塞およびＡＡＲの面積をそれぞれ計測し、梗塞領域の面積／ＡＡＲの面積を算出した（ｎ＝８）。
　（結果）
　ＣｙｐＤ欠損マウスは、ｍＰＴＰを制御するＣｙｐＤを欠くため、ｍＰＴＰは開口しない。図１１に示すように、ＣｙｐＤ欠損マウスにＣｓＡ－ＮＰを投与しても、梗塞サイズが縮小しないことを確認した。一方、ＣｙｐＤ欠損マウスに、ピタバスタチン－ＮＰ、イルベサルタン－ＮＰまたはピオグリタゾン－ＮＰを投与すると梗塞サイズが有意に減少した。このことは、ピタバスタチン－ＮＰ、イルベサルタン－ＮＰおよびピオグリタゾン－ＮＰがミトコンドリア傷害抑制とは独立した機序を介して、梗塞サイズを縮小させたことを示唆する。
　さらに、ＣｙｐＤとＣＣＲ２とを両方欠損させたマウス（ＣｙｐＤ欠損＋ＣＣＲ２欠損）の梗塞サイズは、ＣｙｐＤ欠損マウス（ＣｙｐＤ欠損）またはＣＣＲ２欠損マウス（ＣＣＲ２欠損）と比較して有意に小さかった。この結果は、上記の実施例６～８で得られた「ミトコンドリア傷害抑制＋抗炎症が虚血再灌流傷害を劇的に抑制する」という結果を支持するものである。
　（実施例１０：ＣＣＲ２阻害剤－ＮＰの薬効評価）
　実施例２と同様に、マウス（ｎ＝５～８）の心筋を虚血させ、再灌流を行った。再灌流の０～５分前に被験物質の溶液を静脈に注射した。静脈に注射した被験物質は、ＣＣＲ２阻害剤（１．０ｍｇ／ｋｇ）およびＣＣＲ２阻害剤－ＮＰ（１．０ｍｇ／ｋｇ）とした。なお、対照として生理食塩水をマウスに投与した。また、ＣＣＲ２阻害剤としてのＢＭＳ　ＣＣＲ２　２２の原体を溶解できる最大量が１．０ｍｇ／ｋｇであった。
　上記と同様に染色した各切片の梗塞およびＡＡＲの面積をそれぞれ計測し、梗塞領域の面積／ＡＡＲの面積を算出した。
　（結果）
　図１２に示すように、ＣＣＲ２阻害剤－ＮＰは、梗塞サイズを縮小させた。ＣＣＲ２は虚血再灌流傷害抑制における標的となることが、上記実施例９において示されている。本実施例では、さらに、ナノ粒子化したＣＣＲ２阻害剤を用いることで、虚血再灌流傷害の抑制における薬剤標的として、ＣＣＲ２の阻害が有効であることが確認できた。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態および変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１４年７月７日に出願された、日本国特許出願特願２０１４－１３９９９５号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０１４－１３９９９５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、虚血に起因する障害の治療に好適である。本発明を適用することにより、虚血に起因する障害の治療の成績が向上し、患者の生活の質が向上する。

Claims (7)

  1. 　ミトコンドリア傷害阻害剤と、
    　抗炎症剤と、
    　前記ミトコンドリア傷害阻害剤および前記抗炎症剤の両方または各々を封入する生体適合性粒子と、
    　を含む、
    　虚血に起因する障害の治療または予防に使用するための医薬組成物。
  2. 　前記生体適合性粒子は、
    　個数平均粒子径が２．５～１０００ｎｍのポリラクチドグリコライド共重合体またはそのポリエチレングリコール修飾体を含む、
    　請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記虚血に起因する障害は、
    　虚血再灌流障害である、
    　請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記ミトコンドリア傷害阻害剤は、
    　シクロスポリンまたはＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１である、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 　前記抗炎症剤は、
    　ピタバスタチン、イルベサルタン、ピオグリタゾンおよびＣ－Ｃケモカイン受容体タイプ２阻害剤からなる群から選択される、
    　請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 　再灌流療法と組み合わせて患者に投与される、
    　請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記虚血に起因する障害は、
    　虚血状態になった臓器における障害である、
    　請求項１乃至６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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