WO2016002680A1 - 形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数４のジカルボン酸の製造方法 - Google Patents

形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数４のジカルボン酸の製造方法 Download PDF

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太志 原
修一郎 木村
哲也 小谷
崇之 田中
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旭硝子株式会社
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    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a transformant and a method for producing the same, and a method for producing a C4 dicarboxylic acid (C4 dicarboxylic acid). More specifically, Schizosaccharomyces pombe (hereinafter also referred to as S. pombe), phosphoenolpyruvate carboxykinase (hereinafter also referred to as PCK) gene, pyryboxycarboxylase, pyruvate carboxylate.
  • PCK phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • PYC pyruvate carboxylate
  • MDH malate dehydrogenase
  • the present invention relates to a method for producing C4 dicarboxylic acid to obtain C4 dicarboxylic acid.
  • Malic acid (HOOCCH (OH) CH 2 COOH) is a four-carbon dicarboxylic acid (C4 dicarboxylic acid), which is generally chemically synthesized from petroleum-derived raw materials or microbial fermentation from renewable feedstocks Manufactured commercially.
  • malic acid is produced as the main fermenting organism.
  • malic acid is produced by culturing Aspergillus flavus (Non-patent Document 1) and Penicillium sclerotiorum (Non-patent Document 2). A method is disclosed.
  • Patent Document 1 As a microorganism having improved malic acid production ability by gene recombination, for example, in Patent Document 1, by introducing a C4 dicarboxylic acid transporter into a filamentous fungus such as Aspergillus oryzae, It is described that C4 dicarboxylic acid production ability is improved.
  • Patent Document 2 also discloses that a PDC gene is deleted from Saccharomyces cerevisiae, and a PYC gene or a phosphoenolpyruvate carboxykinase (hereinafter also referred to as PCK gene) and MD gene. Malate is produced using a transformant introduced with a malate transporter protein gene.
  • Non-Patent Document 3 malic acid is produced from Saccharomyces cerevisiae using a transformant in which the PDC gene is deleted and the PYC gene, MDH gene, and malate transporter protein gene are introduced.
  • Patent Document 3 discloses that for Saccharomyces cerevisiae, the PDC enzyme gene, pyruvate kinase (PYK) gene, and hexokinase (HXK) gene are deleted, and the PYC gene, MDH gene, malate transporter protein gene, and PCK gene are deleted. Malate is produced using a transformant introduced with.
  • Non-Patent Document 4 describes a trait in which Escherichia coli has an improved ability to produce malic acid by deactivating a plurality of enzymes involved in pathways other than the pathway from pyruvate to malic acid production. Although a transformant is produced, it is disclosed that the malate enzyme gene maeB deletion strain and the non-deletion strain have a higher production rate of malic acid in the strain in which the maeB gene has not been deleted.
  • the maeB gene of E. coli is It corresponds to the pombe malate enzyme gene mae2.
  • the malic acid production rates of the transformants disclosed in Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 3 to 4 are both less than 1.0 g / (L ⁇ h), and the malic acid-producing ability is higher. Development of microorganisms is desired.
  • An object of the present invention is to provide a transformant of Schizosaccharomyces pombe which has an excellent ability to produce C4 dicarboxylic acid by microbial fermentation from a renewable feedstock, and a method for producing the transformant. Moreover, it aims at the method of manufacturing C4 dicarboxylic acid including malic acid using the said transformant.
  • the transformant according to the present invention has Schizosaccharomyces pombe as a host, and is incorporated with one or more foreign genes selected from the group consisting of a phosphoenolpyruvate carboxykinase gene and a pyruvate carboxylase gene.
  • the malate dehydrogenase gene is a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 17 to 21, represented by any one of SEQ ID NOs: 17 to 21.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, or deleted, and having malate dehydrogenase activity or represented by any of SEQ ID NOs: 17 to 21
  • a gene that encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence and having malate dehydrogenase activity is preferred.
  • the malate enzyme gene is deleted or inactivated.
  • At least one exogenous phosphoenolpyruvate carboxykinase gene or exogenous pyruvate carboxylase gene and one exogenous malate dehydrogenase gene are incorporated, respectively, and the pdc2 gene and It is preferred that any malic enzyme gene is deleted or inactivated.
  • the foreign gene is integrated into the host chromosome.
  • the transformant is cultured in a culture solution, and the C4 dicarboxylic acid is obtained from the cultured transformant or culture supernatant. It is characterized by that.
  • the C4 dicarboxylic acid is preferably malic acid or oxaloacetic acid.
  • the transformant of Schizosaccharomyces pombe according to the present invention can produce C4 dicarboxylic acid such as malic acid at an unprecedented high production rate.
  • the transformant can be easily obtained by the method for producing a transformant according to the present invention.
  • the manufacturing method of C4 dicarboxylic acid which concerns on this invention can manufacture C4 dicarboxylic acid with high productivity by microbial fermentation.
  • FIG. 1 is a block diagram of a single locus integrated recombinant vector pSMh.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relative values of PYC expression levels of 16 transformants introduced with the PYC gene.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative PYC activity (mU / mL) per enzyme solution of the 8 transformants introduced with the PYC gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relative values of the MDH expression levels of the five types of transformants introduced with the MDH gene.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relative MDH activity (mU / mL) per enzyme solution of the three transformants introduced with the MDH gene.
  • FIG. 1 is a block diagram of a single locus integrated recombinant vector pSMh.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relative values of PYC expression levels of 16 transformants introduced with the PYC gene.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative PYC activity (mU / mL)
  • FIG. 6 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of the wild strain (ARC010 strain).
  • FIG. 7 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of the ASP4590 strain ( ⁇ pdc2).
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of ASP4491 strain ( ⁇ pdc2, + ScePYC, + DacMDH). .
  • FIG. 9 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of the ASP4964 strain ( ⁇ pdc2, ⁇ mae2, + ScePYC, + DacMDH). It is.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of the ASP4933 strain ( ⁇ pdc2, ⁇ fum1, + ScePYC, + DacMDH). It is.
  • FIG. 10 is a graph showing changes over time in the glucose concentration (g / L), ethanol concentration (g / L), and malic acid concentration (g / L) of the ASP4933 strain ( ⁇ pdc2, ⁇ fum1, + ScePYC, + DacMDH). It is.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in glucose concentration (g / L) and malic acid concentration (g / L) over time in culture solutions of the ASP4491 strain and the ASP4892 strain.
  • FIG. 12 is a diagram showing the relative values of the PCK expression levels of 20 transformants into which the PCK gene was introduced.
  • the transformant according to the present invention uses Schizosaccharomyces pombe as a host and incorporates one or more foreign genes selected from the group consisting of a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) gene and a pyruvate carboxylase (PYC) gene. And a part of the gene group encoding pyruvate decarboxylase of the Schizo Saccharomyces pombe host is deleted or inactivated.
  • PCK phosphoenolpyruvate carboxykinase
  • PYC pyruvate carboxylase
  • a foreign gene is not a structural gene originally possessed by a host (a structural gene contained in a chromosome of a natural host before transformation), but a transformation operation, etc.
  • Means the structural gene introduced by A gene introduced by a transformation operation or the like is a foreign gene in the present invention even if it is a gene originally possessed by the host.
  • Oxaloacetic acid is a kind of C4 dicarboxylic acid. In Pombe, it is important as a raw material for the synthesis of other C4 dicarboxylic acids such as malic acid. Wild type S. In Pombe, oxaloacetic acid is mainly synthesized by PYC via pyruvate via a pathway directly synthesized by phosphoenolpyruvate by PCK. Therefore, by increasing PCK activity and PYC activity, It is expected that the production amount of pombe oxaloacetate can be increased.
  • pyruvic acid is important in ethanol fermentation, and pyruvic acid is converted to acetaldehyde by pyruvic acid decarboxylase, and then the acetaldehyde is converted to ethanol by alcohol dehydrogenase. That is, since pyruvic acid is a raw material for ethanol fermentation, it is necessary not only to increase PCK activity and PYC activity but also to suppress ethanol fermentation in order to increase the production amount of oxaloacetate.
  • the transformant according to the present invention incorporates at least one foreign gene of the PCK gene and the PYC gene, and in addition to the improvement of at least one of the PCK activity and the PYC activity, the transformant contains pyruvate decarboxylase. A part of the encoded gene group is deleted or inactivated, and the efficiency of ethanol fermentation is reduced.
  • the transformant according to the present invention is suppressed in ethanol fermentation and has a large amount of pyruvic acid that can be used as a substrate for PYC. Therefore, the transformant is excellent in oxaloacetic acid production and is synthesized from oxaloacetate. It is also excellent in the ability to produce C4 dicarboxylic acid.
  • malic acid is aerobically produced from pyruvic acid through acetyl CoA, citric acid, succinic acid, etc., and then fumaric acid is hydrolyzed by fumarate dehydrase.
  • oxaloacetate is produced anaerobically by PYC, and produced from malate dehydrogenase (MDH) from oxaloacetate. Since the transformant according to the present invention has an increased production amount of oxaloacetate, the malic acid production ability is also high.
  • At least one PCK gene or at least one PYC gene is introduced as a foreign gene into the transformant according to the present invention.
  • the number of PYC genes to be introduced is not limited to one and may be two or more. The more foreign genes that are introduced, the more transformants with higher PYC activity can be obtained.
  • PYC genes When two or more PYC genes are introduced, the same type of PYC gene may be introduced, or two or more types of PYC genes may be introduced. Similarly, one PCK gene may be introduced into the transformant according to the present invention, or two or more of the same or different types of PCK genes may be introduced.
  • transformants according to the present invention in order to obtain a transformant having particularly high malic acid production ability, it is preferable to increase the MDH activity and suppress the degradation of malic acid.
  • one or more foreign MDH genes have been incorporated into the pombe, and one of the genes that encode pyruvate decarboxylase
  • a transformant in which the malate enzyme gene is deleted or inactivated in addition to the part is preferred.
  • at least one of the PCK gene and the PYC gene and an exogenous gene of the MDH gene are incorporated, and at least one of the PCK activity and the PYC activity and the MDH activity are improved.
  • a part of the gene group encoding acid decarboxylase is deleted or inactivated, and the efficiency of ethanol fermentation is reduced. That is, since the transformant promotes malic acid fermentation while suppressing ethanol fermentation, it is excellent in malic acid production ability.
  • one MDH gene may be introduced into the transformant according to the present invention, and the same or Two or more heterologous MDH genes may be introduced.
  • At least one PCK gene, at least one PYC gene, and at least one MDH gene are introduced as foreign genes.
  • foreign genes such as PCK gene, PYC gene and MDH gene, malic acid production ability is further improved.
  • Pombe is a yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces (fission yeast), and is a microorganism particularly excellent in acid resistance compared to other yeasts.
  • a gene encoding pyruvate decarboxylase in Pombe includes a gene encoding pyruvate decarboxylase 1 (hereinafter referred to as “PDC1 gene”).
  • a gene encoding pyruvate decarboxylase 2 (hereinafter referred to as “PDC2 gene”), a gene encoding pyruvate decarboxylase 3 (hereinafter referred to as “PDC3 gene”), pyruvate decarboxylase
  • PDC4 gene A gene encoding pyruvate decarboxylase 2 (hereinafter referred to as “PDC2 gene”), a gene encoding pyruvate decarboxylase 3 (hereinafter referred to as “PDC3 gene”), pyruvate decarboxylase
  • PDC4 gene There are four types of genes encoding 4 (hereinafter referred to as “PDC4 gene”). In particular, S.M. In Pombe, the PDC2 gene and the PDC4 gene are PDC genes having major functions.
  • the system name of each PDC gene is as follows. PDC1 gene (pdc1); SPAC13A11.06 PDC2 gene (pdc2); SPAC1F8.07c PDC3 gene (pdc3); SPAC186.09 PDC4 gene (pdc4); SPAC3G9.11c
  • the sequence data of the PDC gene is the S.P. It can be obtained by searching by gene name or strain name from the Pombe gene database.
  • the transformant according to the present invention has a chromosome in which a part of the gene group encoding the pyruvate decarboxylase is deleted or inactivated. Since a part of the PDC gene group of the transformant is deleted or inactivated, the efficiency of ethanol fermentation of the transformant is reduced, and the amount of pyruvic acid converted to ethanol is reduced. The productivity of C4 dicarboxylic acid including the first is improved. However, if the PDC gene group is completely deleted or inactivated, ethanol fermentation cannot be performed at all and growth is inhibited. Therefore, deletion or inactivation is a part of the PDC gene group.
  • the PDC gene to be deleted or inactivated is particularly preferably a PDC2 gene.
  • the PDC2 gene is a PDC gene having a particularly major function.
  • S. The amino acid sequence of PDC2 (SpoPDC2) encoded by the Pombe PDC2 gene is shown in SEQ ID NO: 22.
  • deletion or inactivation of the PDC gene reduces the ethanol fermentation ability and improves the fermentation efficiency of C4 dicarboxylic acid while leaving the ethanol fermentation ability necessary for growth and obtaining a sufficient amount of transformant.
  • mae gene a gene encoding malate enzyme 2 (hereinafter referred to as “mae2 gene”).
  • the system name of the mae2 gene is as follows. mae2 gene (mae2); SPCC 794.12c
  • the sequence data of the mae2 gene is the S.P. It can be obtained by searching by gene name or strain name from the Pombe gene database.
  • S. SEQ ID NO: 23 shows the amino acid sequence of mae2 (Spomae2) encoded by the pombe mae2 gene.
  • Deletion and inactivation of the PDC gene and the mae2 gene can be performed by known methods.
  • the PDC gene or the like can be deleted by using the Latour method (described in Nucleic Acids Research, 2006, 34, e11, International Publication No. 2007/063919).
  • the PDC gene or the like can be inactivated by causing deletion, insertion, substitution or addition to a part of the base sequence of the PDC gene or the like. Mutation due to deletion, insertion, substitution, or addition may cause only one of them, or may cause two or more.
  • a known method can be used. For example, mutation isolation method using a mutation agent (Yeast Molecular Genetics Experimental Method, 1996, Society Press Center) and random mutation method using PCR (Polymerase Chain Reaction) (Volume 2 of PCR Methods Application, 28-33 pages, 1992).
  • the PDC gene into which a mutation has been partially introduced may express a temperature-sensitive mutant pyruvate decarboxylase.
  • a temperature-sensitive mutant pyruvate decarboxylase is an enzyme that exhibits the same activity as wild-type pyruvate decarboxylase at a certain culture temperature, but loses or decreases its activity at a specific culture temperature or higher. It is.
  • Mutant strains expressing mutant pyruvate decarboxylase show the same growth rate as wild-type yeast under conditions where activity is not limited by temperature, and the growth rate is significantly higher under specific temperature conditions where activity is limited. It is obtained by selecting the one that decreases.
  • the mae2 gene into which a mutation has been partially introduced may express a temperature-sensitive mutant mae2.
  • deletion or inactivation of a gene does not mean only the deletion or inactivation of a structural gene. If the structural gene is deleted, of course, even if the protein encodes a protein, or if the protein is not an active enzyme even if the protein is expressed, it means that the gene is inactivated To do.
  • the gene of the structural region of the gene does not express a protein in the structural region of the gene even if the structural region of the gene encodes an active enzyme, the gene encoding the regulatory region is deleted or its sequence is mutated. Means “deleted or inactivated”. Therefore, the PDC gene or mae2 gene to be deleted or inactivated may be either the structural region or the regulatory region of the PDC gene or mae2 gene, or both.
  • PYC gene introduced as a foreign gene into the transformant according to the present invention examples include S. cerevisiae. It may be a structural gene that can express a protein that exhibits PYC activity when introduced into pombe, and may be a PYC gene derived from any species.
  • PYC encoded by the PYC gene introduced as a foreign gene examples include PYC (AniPYC) (AC. No .: CAC19838.1.) (SEQ ID NO: 1) derived from Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), Brevibacillus PYC (SEQ ID NO: 2) derived from BbrPYC (Brevibacillus brevis), PYC (DhaPYC) derived from Debaryomyces hansenii (AC. No .: CAG8615.
  • Candida tropicalis derived from Candida tropicalis EER35520.1.
  • SEQ ID NO: 9 PYC (NcaPYC) derived from Naumovozyma castellii (NcaPYC) ( C. No .: CCC 71457.1.)
  • SEQ ID NO: 10 PYC (NdaPYC) (AC.
  • the PYC gene comprises a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids of these PYC amino acid sequences (SEQ ID NOs: 1 to 16) are substituted, added, or deleted, and having PYC activity. It may be a gene.
  • the PYC gene has a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with these PYC amino acid sequences (SEQ ID NOs: 1 to 16). It may be a gene consisting of an amino acid sequence and encoding a polypeptide having PYC activity.
  • AC No. means an accession number of the database GenBank of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • severe amino acids means 2 to 20 amino acids, preferably 2 to 10 amino acids.
  • the PYC gene introduced into the transformant according to the present invention is a gene encoding BbrPYC, KlaPYC, LelPYC, PYC derived from Saccharomyces cerevisiae, ScePYC, SpoPYC, or PYC having the same or similar amino acid sequence to TblPYC It is preferable.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4-7, 12-14, one or several amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4-7, 12-14 are substituted, added, Or a polypeptide having a deleted amino acid sequence and having PYC activity, or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4 to 7, 12 to 14, and PYC activity
  • a gene encoding a polypeptide having is preferred.
  • a polypeptide comprising SEQ ID NO: 7 a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 are substituted, added or deleted, and having PYC activity, or SEQ ID NO: 7 More preferred is a gene consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence and encoding a polypeptide having PYC activity.
  • the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 7, or one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 7 or A polypeptide having an amino acid sequence in which several amino acids are substituted, added, or deleted and having PYC activity is more preferable.
  • MDH gene introduced as a foreign gene into the transformant according to the present invention examples include S. cerevisiae. Any structural gene may be used as long as it can express a protein that exhibits MDH activity when introduced into pombe, and may be an MDH gene derived from any species.
  • MDH encoded by the MDH gene introduced as a foreign gene examples include MDH (AfuMDH) (SEQ ID NO: 17) derived from Archaeoglobus fulgidus and MDH (Cligibacter litoralis) derived from MDH (Cligibacter litoralis). ) (SEQ ID NO: 18), MDH (DacMDH) derived from Delftia acidovorans (SEQ ID NO: 19), MDH (HelMDH) derived from Halomonas elongata (SEQ ID NO: 20), or Schwanella Putrepha MDH (SpuMDH) derived from Shewanella pu Economicsaciens ( Column number 21), and the like.
  • the MDH gene encodes a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids of these amino acid sequences (SEQ ID NOs: 17 to 21) are substituted, added, or deleted, and having MDH activity. It may be a gene. Further, the MDH gene has a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with these MDH amino acid sequences (SEQ ID NOs: 17 to 21). It may be a gene consisting of an amino acid sequence and encoding a polypeptide having MDH activity.
  • the MDH gene to be introduced into the transformant according to the present invention is preferably a gene encoding MDH having the same amino acid sequence as that of CliMDH, DacMDH, or HelMDH.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 to 20
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids of these amino acid sequences are substituted, added or deleted, and having MDH activity
  • a gene consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 20 and encoding a polypeptide having MDH activity is preferable.
  • PCK gene introduced as a foreign gene into the transformant according to the present invention examples include S. cerevisiae. It may be a structural gene that can express a protein that exhibits PCK activity when introduced into pombe, and may be a PCK gene derived from any species.
  • PCK encoded by the PCK gene introduced as a foreign gene examples include Candida glabrata-derived PCK (CglPCK) (AC. No .: CAG60019.1) (SEQ ID NO: 94), Citrobacter coseri PCK (CkoPCK) (AC.No .: KGY18702.1) (SEQ ID NO: 95) derived from (Cirobacter koseri), PCK (CsaPCK) (AC.No .: EGL73852.1) derived from Cronobacter sakazaki (SEQ ID NO: 96), PCK derived from Debaryomyces hansenii (DhaPCK) (AC.
  • PCK PcaPCK
  • PlePCK PCK
  • SEQ ID NO: 103 derived from Photobacterium leiognathi
  • PCK PrePCK
  • PrePCK Providencia rettgeri
  • SEQ ID NO: 104 PCK derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NO: 105 PCK derived from Serratia odorifera ( SodPCK) (Ac.
  • the PCK gene encodes a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids of these PCK amino acid sequences (SEQ ID NOs: 94 to 113) are substituted, added, or deleted, and having PCK activity. It may be a gene. Furthermore, the PCK gene has a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with the amino acid sequence of these PCKs (SEQ ID NOs: 94 to 113). It may be a gene consisting of an amino acid sequence and encoding a polypeptide having PCK activity.
  • PCK, PYC, and MDH exhibiting high activity include PCK derived from Escherichia coli (EcoPCK) (AC.No .: AAA58200.1) (SEQ ID NO: 154), PYC derived from chicken (Gallus gallus). (GglPYC) (AC.No.:AAM92771.1.) (SEQ ID NO: 155) and MDH (EcoMDH) derived from Escherichia coli (AC.No.:AAA58038.1) (SEQ ID NO: 156) are known It has been.
  • the transformant according to the present invention includes S. cerevisiae in which a part of the PDC gene group has been deleted or inactivated. It can be obtained by using a pombe as a host and introducing at least one foreign gene of the PCK gene and the PYC gene into the host by a genetic engineering method. In addition, S. as a host. A transformant according to the present invention is obtained by deleting or inactivating a part of the PDC gene group of a transformant in which at least one of the PCK gene and the PYC gene is introduced into the pombe by a genetic engineering method. You can also
  • those in which an exogenous MDH gene has been introduced and the mae2 gene has also been deleted include those in which a part of the PDC gene group has been deleted or inactivated.
  • a pombe as a host, at least one foreign gene of the PCK gene and the PYC gene and at least one foreign MDH gene are introduced into the host by a genetic engineering method, and the mae2 gene of the host is deleted or lost. It is obtained by making it live.
  • a part of the PDC gene cluster has been deleted or inactivated.
  • the pombe is used as a host and the mae2 gene of the host is deleted or inactivated, at least one foreign gene of PCK gene and PYC gene and at least one foreign MDH gene may be incorporated by a genetic engineering method.
  • a method for producing a transformant will be described by taking as an example a method of deleting or inactivating the mae2 gene after introducing a PYC gene and an MDH gene into a pombe as a host.
  • the pombe may be a wild type or a mutant type in which a specific gene is deleted or inactivated depending on the use.
  • a known method can be used as a method for deleting or inactivating a specific gene. Specifically, the gene can be deleted by using the Latour method.
  • the gene can be inactivated by introducing a mutation into a part of the gene.
  • yeasts belonging to the genus Schizosaccharomyces from which a specific gene has been deleted or inactivated are described in, for example, WO 2002/101038 and WO 2007/015470.
  • the part that deletes or inactivates a specific gene may be an ORF (open reading frame) part or an expression regulatory sequence part.
  • a particularly preferred method is a method of deletion or inactivation by a PCR-mediated homologous recombination method (Yeast, Vol. 14, pages 943-951, 1998) in which the ORF portion of the structural gene is replaced with a marker gene.
  • a mutant in which the PDC gene is deleted or inactivated can be preferably used as a host for producing the transformant according to the present invention. Furthermore, in addition to the PDC gene, a specific gene other than the PDC gene was deleted or inactivated. Pombe can be the host. Deletion or inactivation of a protease gene or the like can increase the expression efficiency of a heterologous protein, and application to a host in the present invention can be expected to improve the production efficiency of C4 dicarboxylic acids such as malic acid.
  • S. is used as a host. It is preferable to use a pombe having a marker for selecting a transformant. For example, it is preferable to use a host in which a specific nutritional component is essential for growth because a certain gene is missing. When a transformant is produced by transforming with a vector containing the target gene sequence, by incorporating this missing gene (an auxotrophic complementary marker) into the vector, the transformant is required for host nutrition. Sex disappears. Due to the difference in auxotrophy between the host and the transformant, a transformant can be obtained by distinguishing the two.
  • ura4 gene S. cerevisiae that requires uracil due to deletion or inactivation of the orotidine phosphate decarboxylase gene (ura4 gene).
  • a transformant in which the vector has been incorporated can be obtained by selecting those that have lost uracil requirement.
  • the gene that becomes auxotrophic due to deletion in the host is not limited to the ura4 gene as long as it is used for selection of transformants, and may be an isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene) or the like.
  • ⁇ Foreign gene introduction method> As a method for introducing a foreign gene into a host by a genetic engineering method, a known method can be used. S. Examples of methods for introducing a structural gene of a heterologous protein into pombe as a host include, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-15380, International Publication No. 95/09914, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-234375, Japan The methods described in JP-A No. 2000-262284, JP-A No. 2005-198612, International Publication No. 2011/021629 can be used.
  • An expression cassette is a combination of DNAs necessary for expressing a target protein, and includes a structural gene encoding the target protein, a promoter functioning in the host, and a terminator.
  • the expression cassette used in the production of the transformant according to the present invention is one of the PYC gene and the MDH gene, A promoter that functions in Pombe Including a terminator that functions within the pombe.
  • the expression cassette may contain one or more of 5'-untranslated region and 3'-untranslated region. Furthermore, the auxotrophic complementary marker may be included. Multiple expression genes may be present in one expression cassette. The number of foreign genes in one expression cassette is preferably 1-8, and more preferably 1-5.
  • Preferred expression cassettes are those comprising one or more PYC and MDH genes, promoters, terminators, 5'-untranslated regions, 3'-untranslated regions, auxotrophic complementary markers.
  • the PYC gene and the MDH gene may be introduced into the host by separate expression cassettes, or both genes may be introduced into the host by one expression cassette.
  • the expression cassette containing the PYC gene and the MDH gene include an expression cassette having a promoter, PYC gene, cleavage sequence, auxotrophic complementary marker (for example, Ura4 gene), MDH gene, and terminator from the 5 ′ end side. preferable.
  • the gene encoded by the wild type may be used as it is.
  • the wild type gene sequence was transformed into S. cerevisiae. It may be modified to a codon frequently used in pombe.
  • S. Examples of promoters that function in pombe include S. cerevisiae. Pombe's inherent promoter (preferably having high transcription initiation activity) or S.
  • a promoter eg, a virus-derived promoter
  • Two or more promoters may be present in the vector.
  • promoters inherent to Pombe include alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter involved in thiamine metabolism, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter involved in glucose metabolism, and invertase gene involved in catabolite repression. Examples include promoters (see International Publication No. 99/23223), heat shock protein gene promoters (see International Publication No. 2007/26617), and the like.
  • promoters that Pombe does not originally have are derived from animal cell viruses described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-15380, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-163373, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-234375. And hCMV promoter and SV40 promoter are preferable.
  • S. Pombe's inherent terminator and S.P. A terminator that Pombe does not have can be used. Two or more terminators may be present in the vector. Examples of the terminator include human-derived terminators described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-15380, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-163373, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-234375. The rutin I terminator is preferred.
  • the transformant according to the present invention has an expression cassette containing a foreign gene in the chromosome or as an extrachromosomal gene. Having an expression cassette in the chromosome means that the expression cassette is incorporated at one or more positions in the chromosome of the host cell, and having as an extrachromosomal gene means having a plasmid containing the expression cassette in the cell. That is.
  • a transformant containing each expression cassette is used as a host using a vector containing each expression cassette. It is obtained by transforming pombe.
  • the vector can be produced by incorporating the expression cassette into a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure.
  • the vector is a sequence for replication in the host cell, that is, an autonomously replicating sequence (Autonomously Replicating).
  • the plasmid contains (Sequence: ARS).
  • the vector when producing a transformant in which the expression cassette is integrated into the host cell chromosome, the vector is assumed to have a linear DNA structure and no ARS. It is preferable to be introduced into.
  • the vector may be a vector composed of linear DNA, or a vector having a circular DNA structure provided with a restriction enzyme recognition sequence for cleavage into linear DNA upon introduction into a host.
  • the vector when the vector is a plasmid having ARS, it can be introduced into the host after forming a linear DNA structure by deleting the ARS part or a linear DNA structure in which the function of ARS is inactivated by cleaving the ARS part.
  • Each foreign gene is S.P. It is preferably introduced into the pombe chromosome. By introducing a foreign gene into the chromosome, a transformant having excellent passage stability can be obtained. A plurality of foreign genes can also be introduced into the chromosome.
  • the number of PYC genes integrated into the chromosome is preferably 1-20, and more preferably 1-8.
  • the number of MDH genes integrated in the chromosome of the transformant is preferably 1-20, and particularly preferably 1-8.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site needs to be 70% or more. Further, the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more from the viewpoint that homologous recombination is likely to occur.
  • the expression cassette is incorporated into the target site by homologous recombination.
  • the length (number of bases) of the recombination site is preferably 20 to 2000 bp. If the length of the recombination site is 20 bp or more, homologous recombination is likely to occur. Moreover, if the length of the recombination site is 2000 bp or less, it is easy to prevent the vector from becoming too long and causing homologous recombination to hardly occur.
  • the length of the recombination site is more preferably 100 bp or more, and further preferably 200 bp or more. Further, the length of the recombination site is more preferably 800 bp or less, and further preferably 400 bp or less.
  • the vector may have other DNA regions in addition to the expression cassette and the recombination site.
  • a replication initiation region called “ori” necessary for replication in E. coli and an antibiotic resistance gene (neomycin resistance gene, etc.) can be mentioned. These are genes usually required when constructing a vector using Escherichia coli.
  • the replication initiation region is preferably removed when the vector is integrated into the host chromosome as described later.
  • the vector When integrating foreign genes into chromosomes, the vector is S. When introducing into a pombe cell, it is preferable to introduce it in a linear DNA structure. That is, in the case of a vector having a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA, S. It is preferable to introduce into pombe cells.
  • the position where the vector having the circular DNA structure is opened is within the recombination site.
  • the recombination sites partially exist at both ends of the opened vector, and the entire vector is integrated into the target site of the chromosome by homologous recombination.
  • the vector may be constructed by a method other than the method of cutting a vector having a circular DNA structure, as long as it can have a linear DNA structure in which a part of the recombination site exists at each end.
  • the method for constructing the vector from which the replication start region has been removed is not particularly limited, but the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-262284 is preferably used. That is, a method is preferred in which a precursor vector in which a replication initiation region is inserted at the cleavage site in the recombination site is constructed so that the replication initiation region is excised at the same time as the linear DNA structure as described above. Thereby, a vector from which the replication initiation region has been easily removed can be obtained.
  • the expression vectors described in Japanese Patent Laid-Open No. 5-15380, Japanese Patent Laid-Open No. 7-163373, International Publication No. 96/23890, Japanese Patent Laid-Open No. 10-234375, etc. Is applied to construct a precursor vector having an expression cassette and a recombination site, and further, the replication initiation region is removed from the precursor vector by a conventional genetic engineering technique to obtain a vector used for homologous recombination. There may be.
  • an expression cassette containing a PYC gene is incorporated into a vector having a first target site
  • an expression cassette containing an MDH gene is incorporated into a vector having a second target site
  • a part of the PDC gene group is incorporated using the vector.
  • the target site described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-262284 can be used.
  • Two or more vectors having different integration sites can be used to integrate the vectors into different target sites.
  • this method is complicated when the vector is integrated at two or more sites on the chromosome.
  • a single vector can be used for more than one location on the chromosome. Can incorporate vectors.
  • “Substantially identical base sequences to each other” means that the base sequence homology is 90% or more.
  • the homology between the target sites is preferably 95% or more.
  • the length of the base sequences that are substantially identical to each other is a length that includes the recombination site of the vector, and is preferably 1000 bp or more.
  • the foreign genes are dispersed and incorporated into multiple target sites In this case, when the transformant grows, the foreign gene is less likely to drop off from the chromosome at a time, and the maintenance stability in the passage of the transformant is improved.
  • a transposon gene Tf2 is preferable as a target site present in a plurality of locations in a chromosome.
  • Tf2 is the S.T.
  • a vector can be incorporated into only one location of Tf2 that exists in 13 locations on a chromosome.
  • a transformant having two or more foreign genes can be obtained by incorporating a vector having two or more foreign genes.
  • a transformant having two or more foreign genes can be obtained by incorporating a vector into two or more locations of Tf2.
  • a transformant having more foreign genes can be obtained by incorporating a vector having two or more foreign genes. If the vector is incorporated at all 13 positions of Tf2, the burden on the survival and growth of the transformant may be too great.
  • the vector is preferably incorporated at 8 sites or less of 13 Tf2, and more preferably at 5 sites or less.
  • Transformation method Any known transformation method may be used as the transformation method.
  • the transformation method include conventionally known methods such as lithium acetate method, electroporation method, spheroplast method, glass bead method, and the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-198612.
  • a commercially available yeast transformation kit may also be used.
  • S. As a method for transforming the pombe host by the homologous recombination method, a known homologous recombination method can be used. As a transformation method for producing the transformant according to the present invention, S. cerevisiae in which a part of the PDC gene group described above has been deleted or inactivated. A method in which the expression cassette is integrated by homologous recombination using the above-mentioned vector as a host and pombe as a host is preferable.
  • the obtained transformant is usually selected after homologous recombination.
  • the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected.
  • the expression level of the heterologous protein in each culture solution is examined, and a transformant with a higher expression level of the heterologous protein is selected.
  • a transformant with a higher expression level of the heterologous protein is selected.
  • the number of vectors integrated into the chromosome can be adjusted to some extent by adjusting the integration conditions. Depending on the size (number of bases) and structure of the vector, the integration efficiency and the number of integrations may change.
  • the transformant according to the present invention has an unprecedented high malic acid producing ability.
  • the malic acid production rate of the transformant is preferably 2.0 g / (L ⁇ h) or more, more preferably 5.0 g / (L ⁇ h) or more, and further more preferably 10 g / (L ⁇ h) or more. 15 to 30 g / (L ⁇ h) is particularly preferable.
  • the method for producing C4 dicarboxylic acid according to the present invention is a method for producing C4 dicarboxylic acid by culturing the transformant according to the present invention in a culture solution and obtaining C4 dicarboxylic acid from the culture solution.
  • oxaloacetate is produced from pyruvic acid obtained from the sugar by a glycolysis system by PYC, or from phosphoenolpyruvate by PCK. Is done.
  • Malic acid is produced by MDH from the produced oxaloacetic acid.
  • Other C4 dicarboxylic acids are also produced from the produced malic acid.
  • C4 dicarboxylic acid including malic acid produced is accumulated inside the cells, but a part is released to the culture supernatant by Mae1 (C4 dicarboxylic acid transporter).
  • C4 dicarboxylic acid can be produced by obtaining C4 dicarboxylic acid from the cultured transformant or culture supernatant. Examples of the C4 dicarboxylic acid produced by the transformant include oxaloacetic acid, malic acid, fumaric acid, succinic acid and the like, and oxaloacetic acid or malic acid is preferable.
  • a known yeast culture medium containing sugar can be used as a culture solution used for production of C4 dicarboxylic acid. Contains a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be utilized by Pombe; Any material that can efficiently culture pombe is acceptable.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as the culture solution.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.
  • nitrogen source include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, and ammonium acetate, or ammonium salts of inorganic acids, peptone, casamino acid, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • a fermentation promoting factor such as proteolipid can be included.
  • a culture solution containing glucose or sucrose as sugar.
  • concentration of glucose or sucrose in the culture medium (100% by mass) at the initial stage of culture is preferably 1% by mass or more, more preferably 1 to 50% by mass, and further preferably 2 to 16% by mass. Since the glucose concentration or sucrose concentration is lowered by the culture, it is preferable to continue the culture by adding glucose if necessary.
  • the glucose concentration and the like at the end of the culture may be 1% by mass or less.
  • the productivity of C4 dicarboxylic acid is further improved.
  • the production efficiency of C4 dicarboxylic acid improves more by making glucose or sucrose in a culture solution into 16 mass% or less.
  • the initial cell concentration of the transformant in the culture solution is preferably 0.1 to 100 g / L in terms of dry cell weight. More preferably, the initial bacterial cell concentration of the transformant in the culture solution is 20 to 60 g / L expressed in terms of dry cell weight.
  • High productivity can be achieved in a short time by increasing the initial cell concentration.
  • the initial bacterial cell concentration is too high, there is a possibility that problems such as bacterial cell aggregation and reduction in purification efficiency may occur.
  • cell concentration indicated in the Examples etc. described later is a value converted from JASCO Corporation ultraviolet-visible spectrometer wavelength 660nm absorbance of light measured by V550 (OD 660).
  • OD 660 1 at 660 nm corresponds to 0.2 g of fission yeast dry weight and 0.8 g of wet weight.
  • a known yeast culture method can be used for the culture, for example, shaking culture, stirring culture, or the like.
  • the culture temperature is preferably 23 to 37 ° C. Further, the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • the cells can be separated from the culture solution to obtain a culture solution containing C4 dicarboxylic acid.
  • the continuous culture method for example, a part of the culture solution is extracted from the culture tank being cultured, C4 dicarboxylic acid is separated from the extracted culture solution, the culture supernatant is recovered, and glucose or There is a method of continuously culturing by repeatedly adding a new culture solution and returning it to the culture tank. By performing continuous culture, the productivity of C4 dicarboxylic acid is further improved.
  • C4 dicarboxylic acid can be produced without neutralization even when the pH becomes low (about pH 2 to 4) due to accumulation of C4 dicarboxylic acid. Therefore, C4 dicarboxylic acid can be produced by continuous culture in which the culture is further continued even after the pH of the culture solution becomes 3.5 or lower.
  • the pH at the end of culture and the pH in continuous culture are preferably 3.5 or less, and particularly preferably 2.3 to 3.5. In some cases, the culture may be terminated before the pH of the culture solution becomes 3.5 or less.
  • a known method can be used to obtain C4 dicarboxylic acid from the culture solution. For example, by separating the cells from the culture broth after completion of the culture by centrifugation, extracting with pH 1 or less and then extracting with diethyl ether or ethyl acetate, etc. And a method of removing impurities using, a method of distilling after reacting with an alcohol in the presence of an acid catalyst, and a method of separating using a separation membrane.
  • C4 dicarboxylic acid can also be obtained by neutralizing C4 dicarboxylic acid in the culture solution and then separating the culture solution and C4 dicarboxylate.
  • C4 dicarboxylic acid can also be obtained by converting C4 dicarboxylic acid in the culture solution into calcium salt or lithium salt and crystallizing the neutralized salt.
  • C4 dicarboxylic acid can be easily produced with high productivity using a transformant having pombe as a host. According to the production method, the production rate of C4 dicarboxylic acid is easily adjusted to 5 g / L / h or more, and in some cases, the production rate of C4 dicarboxylic acid reaches 15 g / L / h or more. Further, the method for producing C4 dicarboxylic acid according to the present invention is also suitable for high-density culture in the presence of a high concentration of glucose and a high concentration of transformant.
  • UP regions with UF and UR, OL regions with OF and OR, and DN regions with DF and DR were prepared by PCR using KOD-Dash (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • Full length deletion fragments were prepared by the same PCR method using FF and FR as templates.
  • two synthetic oligo DNAs manufactured by Operon
  • the pombe uracil auxotrophic marker ura4 strain name SPCC330.05c, Genetidine-5'-phosphate decarboxylase gene listed in GeneDB
  • region fragment was also used as a template.
  • the obtained S.P. A Pombe PDC2 gene deleted strain (IGF836 strain, h - leu1-32 ura4-D18 ade6-M216 pdc2-D23) was transformed with the DNA fragment obtained by treating the pSHh vector with the restriction enzyme PmaCI, and uracil-requiring And the ASP4590 strain in which the adenine requirement was recovered.
  • Example 2 ⁇ Preparation of foreign gene transfer strain> Aspergillus niger-derived PYC (AniPYC) (SEQ ID NO: 1), Brevibacillus brevis-derived PYC (BbrPYC) (SEQ ID NO: 2), Devalyomyces Hansenii-derived PYC (DhaPYC) (SEQ ID NO: 3), derived from Kruberomyces lactis PYC (KlaPYC) (SEQ ID NO: 4), PYC (LthPYC) (SEQ ID NO: 5) derived from Lachansea thermotolerance, PYC (LelPYC) derived from Roderomyces elongis spors (SEQ ID NO: 6), PYC derived from Saccharomyces cerevisiae (ScePYC) (SEQ ID NO: 7), PYC derived from Candida orthopsis (CorPYC) (SEQ ID NO: 8), PYC
  • the IGF836 strain (S. pombe gene-deleted strain) prepared in Example 1 was used as a single locus-integrated recombinant vector pSLh-AniPYC carrying an ANIPYC gene expression cassette, and a single locus set carrying a BbrPYC gene expression cassette.
  • the monodentate recombination vector pSMh can be prepared by the following steps. First, a fragment obtained by digesting a DNA fragment (Fr.1) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 prepared by DNA total synthesis with the restriction enzyme BsiWI, and a pSE vector digested with the restriction enzyme BsiWI, and the restriction enzyme again. The DNA fragment obtained by double digestion with KpnI and SnaBI was ligated to prepare pSMh (8849 bp, FIG. 1) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 (5 ′ ⁇ 3 ′, circular).
  • PSLh-AniPYC was produced by the following steps. First, two synthetic oligo DNAs (AniPYC-F, AniPYC-R, and Operon) shown in Table 3 were prepared using the whole genome DNA prepared from DNeasy (Qiagen) from a culture of Aspergillus niger as a template. The ORP fragment of the AniPYC gene was obtained by PCR using KOD-Dash (Toyobo Co., Ltd.). The ORF fragment encoded AniPYC (SEQ ID NO: 1).
  • the obtained amplified fragment was incorporated into pSLh using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (manufactured by Clontech) to prepare pSLh-AniPYC.
  • the In-Fusion method was performed according to the manual of the kit. That is, the obtained PCR product was purified by a spin column, added to the In-Fusion reaction solution together with pSLh, and reacted at 50 ° C. for 15 minutes.
  • the ASP4590 strain was transformed with the single locus integration type recombinant vectors pSLh-ScePYC vector and pSMh-DacMDH vector to prepare ASP4491 strain into which the ScePYC gene and the DacMDH gene were introduced.
  • Table 24 shows the name, host, and introduced foreign gene name of each transformant produced.
  • MDH expression level was confirmed for five transformants into which only the MDH gene was introduced. Specifically, each transformant was cultured in the same manner as in ⁇ Confirmation of PYC expression>, a purified enzyme solution was prepared, SDS-PAGE was performed with the enzyme solution, and the relative expression level was calculated. The results of the MDH expression level (relative value) calculated for each transformant are shown in FIG. As a result, the expression of MDH was confirmed in all cases.
  • Example 3 Production of mae2 deletion strain A deletion strain (ASP4964 strain) from which the mae2 gene of the ASP4491 strain into which the ScePYC gene and the DacMDH gene were introduced was produced.
  • the method for preparing the deleted fragment of mae2 was the same as the method for preparing the deleted fragment of pdc2 deletion.
  • S. Pombe's ASP4491 strain (genotype: h ⁇ , leu1-32, ura4-D18, Ade6-M216, ⁇ pdc2, + ScePYC, + DacMDH) was transformed according to the Latour method, and the mae2 gene (strain name: SPCC794.12c) was deleted.
  • ASP4964 strain was produced.
  • Example 4 Production of fumu1 deleted strain A deleted strain (ASP4933 strain) from which the fumu1 gene of the ASP4491 strain into which the ScePYC gene and the DacMDH gene were introduced was produced.
  • fum1 is an enzyme that produces fumaric acid using malic acid as a substrate.
  • the production method of the deletion fragment of fum1 was the same as the production method of the deletion fragment of pdc2 deletion.
  • S. Pombe's ASP4491 strain was transformed according to the Latour method to produce ASP4933 strain from which the fum1 gene (line name: SPCC18.18c / SPCC290.01c) was deleted. For production of deleted fragments, S.
  • the cells were seeded on a YES plate and cultured at 30 ° C. for 96 hours to obtain colonies.
  • the obtained colonies were transferred to 5 mL of a YES medium (test tube) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • the obtained bacterial solution was transferred to 100 mL of YPD6 medium (Sakaguchi flask) and cultured with shaking at 30 ° C. for 44 hours.
  • the obtained cells are collected and added to 3 mL of fermentation medium (100 g / L glucose, 111 g / L calcium carbonate) in a test tube so that the weight of the cells is 36 g dry cell weight / L. Fermented. Timely sampling was performed from the fermentation broth.
  • glucose concentration and ethanol concentration were measured using enzyme electrode method biosensor BF-7 (manufactured by Oji Scientific Instruments), and malic acid concentration was measured by HPLC.
  • HPLC measurement a high performance liquid chromatograph Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) is used, the column is Aminex HPX-87H 300 ⁇ 7.8 mm (manufactured by Bio-RAD), the injection volume is 10 ⁇ L, and the solvent is 10 mM H 2 SO. 4 , the flow rate was 0.6 mL / min, the measurement time was 35 minutes, the measurement temperature was 60 ° C., and diode array detection (210 nm) and differential refractive index detection were used for detection. Each concentration is a concentration per culture broth or fermentation broth.
  • “MA-4892” and “MA-4491” are those of the ASP4892 strain and the ASP4491 strain, respectively.
  • the time-dependent change of malic acid concentration is shown.
  • the malic acid concentration of the fermentation liquid of ASP4892 strain exceeds 20 g / L at the time when 1 hour has elapsed from the start of fermentation, and the malic acid production rate is 20 g / (L ⁇ h) or more.
  • the malic acid concentration in the fermentation broth was 28.9 g / L.
  • the malic acid concentration at the time point of 2 hours was 3.9 g / L.
  • Example 5 Preparation of strains introduced with PCK PCK derived from Candida globulata (CglPCK) (SEQ ID NO: 94), PCK derived from Citrobacter coseri (CkoPCK) (SEQ ID NO: 95), PCK derived from Cronobacter sakazaki (CsaPCK) (SEQ ID NO: 96), PCK derived from Debaryomyces Hansenii (DhaPCK) (SEQ ID NO: 97), PCK derived from Escherichia Fergusoni (EfePCK) (SEQ ID NO: 98), PCK derived from Edward Sierra Thada (EtaPCK) (SEQ ID NO: 99) ), PCK (KlaPCK) derived from Kluveromyces lactis (SEQ ID NO: 100), PCK derived from Roderomyces elongis pors (LelPCK) (SEQ ID NO: 101), PCK derived from Pectobacterium carotovorum
  • the IGF836 strain prepared in Example 1 was digested with restriction enzyme BsiWI digestion of each single-site integrated recombinant vector carrying the PCK gene expression cassette described in Table 47.
  • the product was transformed according to the method of Bahler et al. (Yeast magazine, 1998, Vol. 14, pages 943-951).
  • PSLh-CglPCK was produced by the following steps. First, using the whole genome DNA prepared from the Candida globulata culture by DNeasy (Qiagen) as a template, two kinds of synthetic oligo DNAs (CglPCK-F, CglPCK-R, Operon) shown in Table 27 were used.
  • the ORF fragment of the CglPCK gene was obtained by PCR using KOD-Dash (Toyobo Co., Ltd.).
  • the ORF fragment encoded CglPCK (SEQ ID NO: 94).
  • the IGF836 strain (S. pombe gene-deleted strain) prepared in Example 1 was used as a monodentate recombinant vector pSNh-EcoPCK carrying an EcoPCK gene expression cassette, and a monodentate group carrying a GglPYC gene expression cassette.
  • the method of Bahler et al. (Yeast, 1998, Vol. 14, 943-943) 951).
  • PSNh-EcoPCK was produced by the following steps. First, using the whole genome DNA prepared from a culture of Escherichia coli by DNeasy (manufactured by Qiagen) as a template, two kinds of synthetic oligo DNAs (EcoPCK-F, EcoPCK-R, manufactured by Operon) described in Table 48 were used. Then, an ORF fragment of the EcoPCK gene was obtained by PCR using KOD-Dash (Toyobo Co., Ltd.). The ORF fragment encoded EcoPCK (SEQ ID NO: 154).
  • the obtained amplified fragment was incorporated into pSNh using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (manufactured by Clontech) to prepare pSNh-EcoPCK.
  • the In-Fusion method was performed according to the manual of the kit. That is, the obtained PCR product was purified by a spin column, added to the In-Fusion reaction solution together with pSNh, and reacted at 50 ° C. for 15 minutes.
  • Table 51 shows the name, host, and introduced foreign gene name of each transformant produced.
  • Example 7 Production of malic acid producing strain According to the methods described in Examples 2, 3 and 5, transformants described in Table 52 were produced.
  • Example 8 Confirmation of effect of deletion of mae2
  • fermentation production of malic acid was carried out using the ASP4491 strain, the ASP4964 strain, the ASP4933 strain, and the ASP5127 strain.
  • the cells were seeded on a YES plate and cultured at 30 ° C. for 96 hours to obtain colonies.
  • the obtained colonies were transferred to 5 mL of a YES medium (test tube) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • the obtained bacterial solution was transferred to 100 mL of YPD6 medium (Sakaguchi flask) and cultured with shaking at 30 ° C. for 44 hours.
  • the obtained cells are collected and added to 3 mL of fermentation medium (100 g / L glucose, 111 g / L calcium carbonate) in a test tube so that the weight of the cells is 36 g dry cell weight / L. Fermented. Timely sampling was performed from the fermentation broth.
  • glucose concentration and ethanol concentration were measured using enzyme electrode method biosensor BF-7 (manufactured by Oji Scientific Instruments), and malic acid concentration was measured by HPLC.
  • HPLC measurement a high performance liquid chromatograph Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation) is used, the column is Aminex HPX-87H 300 ⁇ 7.8 mm (manufactured by Bio-RAD), the injection volume is 10 ⁇ L, and the solvent is 10 mM H 2 SO. 4 , the flow rate was 0.6 mL / min, the measurement time was 35 minutes, the measurement temperature was 60 ° C., and diode array detection (210 nm) and differential refractive index detection were used for detection. Each concentration is a concentration per culture broth or fermentation broth. The results are shown in Table 53.
  • the ASP4964 strain from which mae2 was deleted increased the production amount of malic acid by about 10 times.
  • the amount of malic acid produced hardly increased.
  • about 5 g / L of malic acid was produced in the ASP5127 strain in which only mae2 and pdc2 were deleted and PYC and MDH were not introduced.
  • Example 9 Confirmation of effect of introduction of PCK
  • fermentation production of malic acid was performed using the ASP5126 strain, the ASP5087 strain, the ASP5088 strain, and the ASP5089 strain.
  • Malic acid fermentation production was carried out in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 54.
  • Example 10 Confirmation of effect of introduction of PYC
  • fermentation production of malic acid was performed using the ASP5126 strain, the ASP4964 strain, the ASP5132 strain, and the ASP5135 strain.
  • Malic acid fermentation production was carried out in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 55.
  • the ASP4964 strain introduced with PYC derived from Saccharomyces cerevisiae
  • the ASP5132 strain introduced with PYC derived from Kluberomyces lactis (KlaPYC)
  • KlaPYC Kluberomyces lactis
  • S. cerevisiae S. cerevisiae.
  • the ASP5135 strain into which Pombe derived PYC (SpoPYC) was introduced was confirmed to improve the production rate of malic acid and the final concentration of malic acid.
  • Example 11 Confirmation of MDH introduction effect
  • ASP5125 strain, ASP5215 strain, ASP5216 strain, ASP5127 strain, ASP4964 strain, ASP5129 strain, and ASP5131 strain were used to ferment malic acid. Production was performed. Malic acid fermentation production was carried out in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 56.
  • MDH is not introduced, compared to ASP5125 strain with PYC introduced, ASP5215 strain with CLIMDH and PCK introduced, ASP5216 strain with HelMDH and PCK introduced, ASP5217 strain with SpuMDH and PCK introduced, HelMDH and PYC
  • ASP4964 strain introduced with CliMDH and PYC and the ASP5131 strain introduced with SpuMDH and PYC, the production rate of malic acid and the final malic acid concentration were improved.
  • Example 12 Confirmation of effect of increase in copy number of introduced gene
  • fermentation production of malic acid was performed using the ASP4964 strain and the ASP5235 strain. Malic acid fermentation production was carried out in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 57.
  • the ASP5235 strain into which two copies of PYC and MDH were introduced was confirmed to improve the production rate of malic acid and the final concentration of malic acid.
  • Example 13 Fermentative production of malic acid under non-neutralized conditions
  • fermentative production of malic acid was carried out using the ASP4964 strain and the ASP5235 strain. Specifically, the cells increased in the same manner as in Example 7 were added to 3 mL of fermentation medium (100 g / L glucose) in a test tube so that the weight of the cells was 36 g dry cell weight / L, and the shaking condition was 30 ° C. And fermented. Timely sampling was performed from the fermentation broth. The obtained sample was measured in the same manner as in Example 7. The results are shown in Table 58. As a result, both strains confirmed the production of malic acid under non-neutralizing conditions.
  • the pH of the 1 hour fermentation sample of the ASP4964 strain was 3.5, and the pH of the 2 hour fermentation sample was 3.0. Moreover, pH of the fermentation progress 1 hour sample of ASP5235 stock

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Abstract

　シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子からなる群より選択される１以上の外来遺伝子が組み込まれており、かつ、前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のｐｄｃ２遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする形質転換体該形質転換体、および該形質転換体を用いた炭素数４のジカルボン酸の製造方法である。

Description

形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数４のジカルボン酸の製造方法
　本発明は、形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数４のジカルボン酸（Ｃ４ジカルボン酸）の製造方法に関する。より詳細には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、以下、Ｓ．ポンベともいう。）に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ、以下ＰＣＫともいう。）遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、以下、ＰＹＣともいう。）遺伝子およびリンゴ酸脱水素酵素（Ｍａｌａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下、ＭＤＨともいう。）遺伝子からなる群より選択される１種以上の外来遺伝子が１以上組み込まれ、かつピルビン酸脱炭酸酵素（Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、以下、ＰＤＣともいう。）をコードする遺伝子群の一部およびリンゴ酸酵素（Ｍａｌｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ、以下、ＭＡＥともいう。）遺伝子を欠失または失活させた形質転換体、該形質転換体の製造方法、および該形質転換体を培養液中で培養し、該培養液からＣ４ジカルボン酸を取得するＣ４ジカルボン酸の製造方法に関する。
　リンゴ酸（ＨＯＯＣＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＯＯＨ）は４個の炭素からなるジカルボン酸（Ｃ４ジカルボン酸）であり、一般的に、石油由来の原料からの化学合成または再生可能な供給原料からの微生物発酵のいずれかにより商業的に製造される。
　多くの天然または遺伝子組換え体の微生物が、主要な発酵性生物としてリンゴ酸を生産し得ることが知られている。たとえば、野生型の微生物を用いる方法としては、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）（非特許文献１）およびペニシリウム・スクレロティオラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（非特許文献２）を培養してリンゴ酸を産生する方法が開示されている。
　また、遺伝子組換えによりリンゴ酸産生能を向上させた微生物としては、たとえば、特許文献１には、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）等の糸状菌に、Ｃ４ジカルボン酸トランスポーターを導入することにより、Ｃ４ジカルボン酸産生能が向上することが記載されている。
　また、特許文献２には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対し、ＰＤＣ遺伝子を削除し、ＰＹＣ遺伝子またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ、以下、ＰＣＫともいう。）遺伝子と、ＭＤＨ遺伝子とリンゴ酸輸送体タンパク質遺伝子とを導入した形質転換体を用いて、リンゴ酸を産生させている。
　非特許文献３には、サッカロミセス・セレビシエに対し、ＰＤＣ遺伝子を削除し、ＰＹＣ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、およびリンゴ酸輸送体タンパク質遺伝子を導入した形質転換体を用いて、リンゴ酸を産生させている。特許文献３には、サッカロミセス・セレビシエに対し、ＰＤＣ酵素遺伝子、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子、およびヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）遺伝子を削除し、ＰＹＣ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、リンゴ酸輸送体タンパク質遺伝子、およびＰＣＫ遺伝子を導入した形質転換体を用いて、リンゴ酸を産生させている。
　その他にも、非特許文献４には、大腸菌に、ピルビン酸からリンゴ酸が産生されるまでの経路以外の経路に関与する複数の酵素を失活させてリンゴ酸の産生能を向上させた形質転換体を製造しているが、リンゴ酸酵素遺伝子ｍａｅＢの削除株と未削除株では、ｍａｅＢ遺伝子未削除株の方がリンゴ酸の生産速度が速かったことが開示されている。なお、大腸菌のｍａｅＢ遺伝子は、Ｓ．ポンベのリンゴ酸酵素遺伝子ｍａｅ２に相当する。
日本国特表２０１３－５０３６３１号公報 日本国特表２００９－５１６５２６号公報 国際公開第２００９／０１１９７４号
Ｂａｔｔａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９１，ｖｏｌ．３７，ｐ．１１０８－１１１６． Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，ｖｏｌ．１４３，ｐ．６７４－６７７． Ｚｅｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，ｖｏｌ．７４，ｐ．２７６６－２７７７． Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．７７，ｐ．４２７－４３４．
　特許文献１～３、非特許文献３～４に開示されている形質転換体のリンゴ酸の生産速度は、いずれも１．０ｇ／（Ｌ・ｈ）未満であり、よりリンゴ酸生産能の高い微生物の開発が望まれている。
　本発明では、再生可能な供給原料からの微生物発酵によるＣ４ジカルボン酸の産生能に優れたシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体、および該形質転換体の製造方法を提供することを目的とする。
　また、前記形質転換体を用いて、リンゴ酸をはじめとするＣ４ジカルボン酸を製造する方法を目的とする。
　本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上の外来遺伝子が１以上組み込まれており、かつ、前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活しており、
　前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が、配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、
　前記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、または配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、
　欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がｐｄｃ２遺伝子であることを特徴とする。
　本発明に係る形質転換体においては、さらに、外来のリンゴ酸脱水素酵素遺伝子が１以上組み込まれていることが好ましい。
　また、本発明に係る形質転換体においては、前記リンゴ酸脱水素酵素遺伝子が、配列番号１７～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１７～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、または配列番号１７～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることが好ましい。
　また、本発明に係る形質転換体においては、さらに、リンゴ酸酵素遺伝子が欠失または失活していることが好ましい。
　また、本発明に係る形質転換体においては、外来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子または外来のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と、外来のリンゴ酸脱水素酵素遺伝子とが、それぞれ１以上組み込まれ、ｐｄｃ２遺伝子とリンゴ酸酵素遺伝子のいずれもが欠失または失活していることが好ましい。
　さらに、本発明に係る形質転換体においては、前記外来遺伝子が宿主の染色体に組み込まれていることも好ましい。
　また、本発明に係る炭素数４のジカルボン酸の製造方法は、前記形質転換体を培養液中で培養し、培養された該形質転換体または培養上清から炭素数４のジカルボン酸を取得することを特徴とする。
　本発明に係る炭素数４のジカルボン酸の製造方法においては、炭素数４のジカルボン酸がリンゴ酸またはオキサロ酢酸であることが好ましい。
　また、本発明に係る炭素数４のジカルボン酸の製造方法においては、培養を、培養液のｐＨが３．５以下となった後も継続することが好ましい。
　本発明に係るシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体は、従来になく速い生産速度でリンゴ酸をはじめとするＣ４ジカルボン酸を産生できる。
　前記形質転換体は、本発明に係る形質転換体の製造方法により簡便に得られる。
　また、本発明に係るＣ４ジカルボン酸の製造方法は、微生物発酵により高い生産性でＣ４ジカルボン酸を製造できる。
図１は、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈの構成図である。 図２は、ＰＹＣ遺伝子を導入した１６種の形質転換体のＰＹＣ発現量の相対値を示した図である。 図３は、ＰＹＣ遺伝子を導入した８種の形質転換体の相対的な酵素液当たりのＰＹＣ活性（ｍＵ／ｍＬ）を示した図である。 図４は、ＭＤＨ遺伝子を導入した５種の形質転換体のＭＤＨ発現量の相対値を示した図である。 図５は、ＭＤＨ遺伝子を導入した３種の形質転換体の相対的な酵素液当たりのＭＤＨ活性（ｍＵ／ｍＬ）を示した図である。 図６は、野生株（ＡＲＣ０１０株）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図７は、ＡＳＰ４５９０株（Δｐｄｃ２）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図８は、ＡＳＰ４４９１株（Δｐｄｃ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図９は、ＡＳＰ４９６４株（Δｐｄｃ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図１０は、ＡＳＰ４９３３株（Δｐｄｃ２，Δｆｕｍ１，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図１１は、ＡＳＰ４４９１株およびＡＳＰ４８９２株の培養液のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図１２は、ＰＣＫ遺伝子を導入した２０種の形質転換体のＰＣＫ発現量の相対値を示した図である。
［遺伝子組換え体］
　本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）遺伝子およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）遺伝子からなる群より選択される１以上の外来遺伝子が組み込まれており、かつ、前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体である。
　なお、本発明および本願明細書において、外来遺伝子とは、宿主が本来有している構造遺伝子（形質転換前の天然型の宿主の染色体に含まれている構造遺伝子）ではなく、形質転換操作等により導入された構造遺伝子を意味する。宿主が本来有している遺伝子であっても、形質転換操作等により導入された遺伝子は、本発明における外来遺伝子である。
　オキサロ酢酸は、Ｃ４ジカルボン酸の一種であり、Ｓ．ポンベでは、リンゴ酸等の他のＣ４ジカルボン酸の合成の原料として重要である。野生型Ｓ．ポンベでは、オキサロ酢酸は、主に、ホスホエノールピルビン酸からＰＣＫにより直接合成される経路と、ピルビン酸を介してＰＹＣにより合成される。このため、ＰＣＫ活性とＰＹＣ活性を高めることにより、Ｓ．ポンベのオキサロ酢酸の産生量を高められることが期待される。
　一方で、ピルビン酸はエタノール発酵において重要であり、ピルビン酸がピルビン酸脱炭酸酵素によりアセトアルデヒドに変換され、次いで該アセトアルデヒドがアルコール脱水素酵素によりエタノールへと変換される。つまり、ピルビン酸はエタノール発酵の原料となるため、オキサロ酢酸の産生量を高めるためには、単にＰＣＫ活性とＰＹＣ活性を高めるだけではなく、エタノール発酵も抑制する必要がある。
　本発明に係る形質転換体は、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子が組み込まれており、ＰＣＫ活性およびＰＹＣ活性の少なくとも一方が向上していることに加えて、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部が欠失または失活しており、エタノール発酵の効率が低下している。
　つまり、本発明に係る形質転換体は、エタノール発酵が抑えられており、ＰＹＣの基質として利用できるピルビン酸量が多くなるため、オキサロ酢酸の産生能に優れており、オキサロ酢酸から合成される他のＣ４ジカルボン酸の産生能にも優れている。
　野生型Ｓ．ポンベでは、リンゴ酸は、好気的にピルビン酸からアセチルＣｏＡ、クエン酸、コハク酸などを経て、フマル酸脱水酵素によるフマル酸の加水により産生される。また嫌気的にＰＹＣによりオキサロ酢酸が産生され、オキサロ酢酸からリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）により産生される。本発明に係る形質転換体は、オキサロ酢酸の産生量が高められているため、リンゴ酸の産生能も高い。
　本発明に係る形質転換体には、少なくとも１個のＰＣＫ遺伝子、または少なくとも１個のＰＹＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されていればよい。導入されるＰＹＣ遺伝子は、１個ではなく、２個以上であってもよい。導入される外来遺伝子が多いほど、ＰＹＣ活性の高い形質転換体が得られる。
　２個以上のＰＹＣ遺伝子が導入される場合、同種のＰＹＣ遺伝子が導入されていてもよく、２種類以上のＰＹＣ遺伝子が導入されていてもよい。同様に、本発明に係る形質転換体には、１個のＰＣＫ遺伝子が導入されていてもよく、互いに同種または異種のＰＣＫ遺伝子が２個以上導入されていてもよい。
　本発明に係る形質転換体のうち、特にリンゴ酸の産生能の高い形質転換体とするためには、ＭＤＨ活性を高め、かつリンゴ酸の分解を抑制することが好ましい。
　具体的には、宿主となるＳ．ポンベに対して、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子に加えて、さらに、外来のＭＤＨ遺伝子が１以上組み込まれており、かつ、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうちの一部に加えてリンゴ酸酵素遺伝子も欠失または失活している形質転換体が好ましい。該形質転換体は、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方、およびＭＤＨ遺伝子の外来遺伝子が組み込まれており、ＰＣＫ活性およびＰＹＣ活性の少なくとも一方、およびＭＤＨ活性が向上していることに加えて、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活しており、エタノール発酵の効率が低下している。つまり、該形質転換体は、エタノール発酵を抑えつつリンゴ酸発酵を促進しているため、リンゴ酸の産生能に優れている。
　本発明に係る形質転換体が少なくとも１個のＭＤＨ遺伝子が外来遺伝子として導入されている場合、本発明に係る形質転換体には、１個のＭＤＨ遺伝子が導入されていてもよく、互いに同種または異種のＭＤＨ遺伝子が２個以上導入されていてもよい。
　本発明に係る形質転換体としては、少なくとも１個のＰＣＫ遺伝子、少なくとも１個のＰＹＣ遺伝子、および少なくとも１個のＭＤＨ遺伝子が外来遺伝子として導入されていることが好ましい。ＰＣＫ遺伝子、ＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子の外来遺伝子が組み込まれていることにより、リンゴ酸産生能がより向上する。
＜Ｓ．ポンベ＞
　宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは元々ｍａｅ１（Ｃ４ジカルボン酸トランスポーター）遺伝子を有しているため、菌体内におけるＣ４ジカルボン酸の生産量を増大させた場合にも、過剰量のＣ４ジカルボン酸による菌体の生育等への影響を抑えられる。このため、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ等のＭａｅ１遺伝子を有していない他の酵母よりも、Ｃ４ジカルボン酸産生に適している。
　なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　Ｇｅｎｅ　ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名や前記系統名で検索して、入手できる。
＜ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子＞
　Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という。）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。
　各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
　ＰＤＣ１遺伝子（ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
　ＰＤＣ２遺伝子（ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
　ＰＤＣ３遺伝子（ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
　ＰＤＣ４遺伝子（ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
　前記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名や系統名で検索して入手できる。
　本発明に係る形質転換体は、前記ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部が欠失または失活した染色体を有する。形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活していることにより、形質転換体のエタノール発酵の効率が低下し、エタノールに変換されるピルビン酸量が少なくなるため、リンゴ酸をはじめとするＣ４ジカルボン酸の生産性が向上する。ただし、ＰＤＣ遺伝子群を完全に欠失または失活させると、エタノール発酵が全く行えなくなって生育が阻害されるため、欠失または失活させるのはＰＤＣ遺伝子群の一部とする。
　欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ２遺伝子であることが特に好ましい。ＰＤＣ２遺伝子は、特に主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。Ｓ．ポンベのＰＤＣ２遺伝子がコードするＰＤＣ２（ＳｐｏＰＤＣ２）のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
　前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させてＣ４ジカルボン酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。
　この課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率でのＣ４ジカルボン酸の生産が両立できることを見出した。
＜リンゴ酸酵素遺伝子＞
　Ｓ．ポンベにおけるリンゴ酸酵素をコードする遺伝子（リンゴ酸酵素遺伝子、以下「ｍａｅ遺伝子」ともいう。）は、リンゴ酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ｍａｅ２遺伝子」という。）である。ｍａｅ２遺伝子の系統名は以下の通りである。
　ｍａｅ２遺伝子（ｍａｅ２）；ＳＰＣＣ７９４．１２ｃ
　前記ｍａｅ２遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名や系統名で検索して入手できる。Ｓ．ポンベのｍａｅ２遺伝子がコードするｍａｅ２（Ｓｐｏｍａｅ２）のアミノ酸配列を配列番号２３に示す。
　野生型のＳ．ポンベでは、産生されたリンゴ酸の一部は、ｍａｅ２によりピルビン酸に変換される。本発明に係る形質転換体のうち、ｍａｅ２遺伝子が欠失または失活しているものは、該形質転換体内では産生されたリンゴ酸がピルビン酸へ変換されないため、リンゴ酸産生量が飛躍的に向上する。
＜遺伝子の欠失または失活＞
　ＰＤＣ遺伝子およびｍａｅ２遺伝子の欠失や失活は、公知の方法で行える。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることによりＰＤＣ遺伝子等を欠失させられる。
　また、ＰＤＣ遺伝子等の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ＰＤＣ遺伝子等を失活させることもできる。欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
　ＰＤＣ遺伝子等の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。
　たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ誌、第２巻、２８－３３ページ、１９９２年）等が挙げられる。
　また、一部に変異が導入されたＰＤＣ遺伝子は、温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現するものであってもよい。温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素とは、ある培養温度においては野生型のピルビン酸脱炭酸酵素と同等の活性を示すが、特定の培養温度以上になると活性の消失または低下が見られる酵素である。
　変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、温度により活性が制限されない条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得られる。
　同様に、一部に変異が導入されたｍａｅ２遺伝子は、温度感受性の変異型ｍａｅ２を発現するものであってもよい。
　なお、遺伝子の欠失または失活とは、構造遺伝子の欠失または失活のみを意味しない。構造遺伝子が欠失している場合は勿論、たとえあるタンパク質を構造遺伝子がコードしていても、該構造遺伝子が発現しても該タンパク質が活性のある酵素ではない場合は遺伝子の失活を意味する。
　しかし、遺伝子の構造領域が活性のある酵素をコードしていても、調節領域をコードする遺伝子が欠失またはその配列が変異していることにより遺伝子の構造領域のタンパク質を発現しない場合は、遺伝子は「欠失または失活している」ことを意味する。したがって、欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子またはｍａｅ２遺伝子は、ＰＤＣ遺伝子またはｍａｅ２遺伝子の構造領域と調節領域のいずれでもよく、その両方でもよい。
＜ＰＹＣ遺伝子＞
　本発明に係る形質転換体に外来遺伝子として導入されるＰＹＣ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＰＹＣ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＰＹＣ遺伝子であってもよい。
　外来遺伝子として導入されるＰＹＣ遺伝子がコードするＰＹＣとしては、たとえば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のＰＹＣ（ＡｎｉＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＡＣ１９８３８．１．）（配列番号１）、ブレビバチルス・ブレビス（ＢｂｒＰＹＣ）（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）由来のＰＹＣ（配列番号２）、デバリョミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）由来のＰＹＣ（ＤｈａＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＡＧ８６１５３．２．）（配列番号３）、クルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）由来のＰＹＣ（ＫｌａＰＹＣ）（配列番号４）、ラチャンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）由来のＰＹＣ（ＬｔｈＰＹＣ）（配列番号５）、ロデロミセス　エロンギスポルス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）由来のＰＹＣ（ＬｅｌＰＹＣ）（配列番号６）、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＹＣ（ＳｃｅＰＹＣ）（配列番号７）、カンジダ・オルトプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のＰＹＣ（ＣｏｒＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＣＧ２３８０１．１．）（配列番号８）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のＰＹＣ（ＣｔｒＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＥＥＲ３５５２０．１．）（配列番号９）、ナウモボジマ・カステリィ（Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ　ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）由来のＰＹＣ（ＮｃａＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＣＣ７１４５７．１．）（配列番号１０）、ナウモボジマ・ダイレネンシス（Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ　ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）由来のＰＹＣ（ＮｄａＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＣＤ２６７４０．１．）（配列番号１１）、サッカロミセス・クドリアベゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）由来のＰＹＣ（ＳｋｕＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＥＪＴ４１２６０．１．）（配列番号１２）、Ｓ．ポンベ由来のＰＹＣ（ＳｐｏＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＢＡＡ１１２３９．１．，ＣＡＢ５２８０９．１．）（配列番号１３）、テトラピシスポラ・ブラッタエ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ　ｂｌａｔｔａｅ）由来のＰＹＣ（ＴｂｌＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＣＨ５８７７９．１．）（配列番号１４）、トルラスポラ・デルブルエキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）由来のＰＹＣ（ＴｄｅＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＣＥ９３７２２．１．）（配列番号１５）、またはジゴサッカロミセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）由来のＰＹＣ（ＺｒｏＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＡＲ２６９３４．１．）（配列番号１６）が挙げられる。
　また、該ＰＹＣ遺伝子は、これらのＰＹＣのアミノ酸配列（配列番号１～１６）の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　さらに、該ＰＹＣ遺伝子は、これらのＰＹＣのアミノ酸配列（配列番号１～１６）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　本願明細書中、「ＡＣ．Ｎｏ．」は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を意味する。
　また、本発明および本願明細書中、「数個のアミノ酸」とは、２～２０個のアミノ酸を意味し、２～１０個のアミノ酸が好ましい。
　本発明に係る形質転換体に導入されるＰＹＣ遺伝子としては、ＢｂｒＰＹＣ、ＫｌａＰＹＣ、ＬｅｌＰＹＣ、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＹＣ、ＳｃｅＰＹＣ、ＳｐｏＰＹＣ、もしくはＴｂｌＰＹＣと同一またはアミノ酸配列が類似したＰＹＣをコードする遺伝子であることが好ましい。
　具体的には、配列番号２、４～７、１２～１４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２、４～７、１２～１４のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチド、または配列番号２、４～７、１２～１４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が好ましい。
　また、配列番号７からなるポリペプチド、配列番号７のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチド、または配列番号７のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく、配列番号７からなるポリペプチド、または配列番号７のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰＹＣ活性を有するポリペプチドがさらに好ましい。
＜ＭＤＨ遺伝子＞
　本発明に係る形質転換体に外来遺伝子として導入されるＭＤＨ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＭＤＨ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＭＤＨ遺伝子であってもよい。
　外来遺伝子として導入されるＭＤＨ遺伝子がコードするＭＤＨとしては、たとえば、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＭＤＨ（ＡｆｕＭＤＨ）（配列番号１７）、コングレギバクター・リトラリス（Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＭＤＨ（ＣｌｉＭＤＨ）（配列番号１８）、デルフチア・アシドボランス（Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）由来のＭＤＨ（ＤａｃＭＤＨ）（配列番号１９）、ハロモナス・エロンガタ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｎｇａｔａ）由来のＭＤＨ（ＨｅｌＭＤＨ）（配列番号２０）、またはシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＭＤＨ（ＳｐｕＭＤＨ）（配列番号２１）が挙げられる。
　また、該ＭＤＨ遺伝子は、これらのＭＤＨのアミノ酸配列（配列番号１７～２１）の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。さらに、該ＭＤＨ遺伝子は、これらのＭＤＨのアミノ酸配列（配列番号１７～２１）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　本発明に係る形質転換体に導入されるＭＤＨ遺伝子としては、ＣｌｉＭＤＨ、ＤａｃＭＤＨ、またはＨｅｌＭＤＨと同一またはアミノ酸配列が類似したＭＤＨをコードする遺伝子であることが好ましい。
　具体的には、配列番号１８～２０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、これらのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチド、または配列番号１８～２０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が好ましい。
　また、配列番号１９からなるポリペプチド、配列番号１９のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチド、または配列番号１９のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく、配列番号１９からなるポリペプチド、または配列番号１９のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＤＨ活性を有するポリペプチドがさらに好ましい。
＜ＰＣＫ遺伝子＞
　本発明に係る形質転換体に外来遺伝子として導入されるＰＣＫ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＰＣＫ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＰＣＫ遺伝子であってもよい。
　外来遺伝子として導入されるＰＣＫ遺伝子がコードするＰＣＫとしては、たとえば、カンジダ・グロブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ）由来のＰＣＫ（ＣｇｌＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＡＧ６００１７．１）（配列番号９４）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｋｏｓｅｒｉ）由来のＰＣＫ（ＣｋｏＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＫＧＹ１８７０２．１）（配列番号９５）、クロノバクター・サカザキ（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓａｋａｚａｋｉｉ）由来のＰＣＫ（ＣｓａＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＥＧＬ７３８５２．１）（配列番号９６）、デバリョミセス・ハンセニイ由来のＰＣＫ（ＤｈａＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＣＡＧ８８３７９．１）（配列番号９７）、エシェリキア・フェルグソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）由来のＰＣＫ（ＥｆｅＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＥＧＣ９６８０２．１）（配列番号９８）、エドワードシエラ・ターダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ）由来のＰＣＫ（ＥｔａＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＧＡＣ６６０７０．１）（配列番号９９）、クルベロミセス・ラクティス由来のＰＣＫ（ＫｌａＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＡＡＣ２７６６１．１）（配列番号１００）、ロデロミセス　エロンギスポルス由来のＰＣＫ（ＬｅｌＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＤＫ４１８７７．１）（配列番号１０１）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）由来のＰＣＫ（ＰｃａＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＡＣＴ１４９１１．１）（配列番号１０２）、フォトバクテリウム・ロイナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）由来のＰＣＫ（ＰｌｅＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＧＡＡ０３０１５．１）（配列番号１０３）、プロヴィデンシア・レトゲア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）由来のＰＣＫ（ＰｒｅＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＦＥ５２６７０．１）（配列番号１０４）、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＣＫ（ＳｃｅＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＣＡＡ３１４８８．１）（配列番号１０５）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）由来のＰＣＫ（ＳｏｄＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＦＥ９７３４３．１）（配列番号１０６）、ビブリオ・オリエンタリス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＰＣＫ（ＶｏｒＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＧＵ５２１９４．１）（配列番号１０７）、バンデルワルトジマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）由来ＰＣＫ（ＶｐｏＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＤＯ１７８８４．１）（配列番号１０８）、ビブリオ・ツビアシ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｔｕｂｉａｓｈｉｉ）由来のＰＣＫ（ＶｔｕＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＩＦ０４９２２．１）（配列番号１０９）、イエシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来ＰＣＫ（ＹｂｅＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＥＥＱ０７８８７．１）（配列番号１１０）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来ＰＣＫ（ＹｌｉＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＣＡＧ８２２４８．１）（配列番号１１１）、イエシニア・ロデイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｏｈｄｅｉ）由来のＰＣＫ（ＹｒｏＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＡＪＪ１１５８５．１）（配列番号１１２）、またはジゴサッカロミセス・ロキシイ由来ＰＣＫ（ＺｒｏＰＣＫ）（Ａｃ．Ｎｏ．：ＣＡＲ２６７１６．１）（配列番号１１３）が挙げられる。
　また、該ＰＣＫ遺伝子は、これらのＰＣＫのアミノ酸配列（配列番号９４～１１３）の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。さらに、該ＰＣＫ遺伝子は、これらのＰＣＫのアミノ酸配列（配列番号９４～１１３）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　また高い活性を示すＰＣＫ、ＰＹＣ、およびＭＤＨとして、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のＰＣＫ（ＥｃｏＰＣＫ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＡＡＡ５８２００．１）（配列番号１５４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）由来のＰＹＣ（ＧｇｌＰＹＣ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＡＡＭ９２７７１．１．）（配列番号１５５）およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のＭＤＨ（ＥｃｏＭＤＨ）（ＡＣ．Ｎｏ．：ＡＡＡ５８０３８．１）（配列番号１５６）が知られている。
［形質転換体の製造］
　本発明に係る形質転換体は、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子を遺伝子工学的方法で該宿主に導入することにより得られる。また、宿主とするＳ．ポンベに、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子を遺伝子工学的方法で導入した形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることもできる。
　本発明に係る形質転換体のうち、外来のＭＤＨ遺伝子が導入されており、かつｍａｅ２遺伝子も欠失等しているものは、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子と少なくとも１個の外来のＭＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で該宿主に導入し、さらに該宿主のｍａｅ２遺伝子を欠失または失活させることにより得られる。
　または、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、該宿主のｍａｅ２遺伝子を欠失または失活させた後に、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子と少なくとも１個の外来のＭＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で組み込んでもよい。
　その他、宿主とするＳ．ポンベに、ＰＣＫ遺伝子およびＰＹＣ遺伝子の少なくとも一方の外来遺伝子と、少なくとも一個の外来のＭＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入した形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部およびｍａｅ２遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることもできる。複数の外来遺伝子を導入する場合、全てを同時に宿主に導入してもよく、順次（順不同）導入してもよい。
　以下、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子を導入した後、ｍａｅ２遺伝子を欠失または失活させる方法を例に、形質転換体の製造方法を説明する。
＜宿主＞
　宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、前記Ｌａｔｏｕｒ法を用いることにより遺伝子を欠失させられる。
　また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲを利用したランダム変異法（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ誌、第２巻、２８－３３ページ、１９９２年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
　また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Ｙｅａｓｔ誌、第１４巻、９４３－９５１ページ、１９９８年）による削除または不活性化の方法である。
　ＰＤＣ遺伝子が欠失または失活した変異体は、本発明に係る形質転換体を製造するための宿主として好ましく使用できる。さらに、ＰＤＣ遺伝子以外にさらにＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベを宿主とすることもできる。プロテアーゼ遺伝子等を欠失または失活させることにより異種蛋白質の発現効率を高めることができ、本発明における宿主に適用することによりリンゴ酸等のＣ４ジカルボン酸の生産効率の向上が期待できる。
　さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得られる。
　たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得られる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
　また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを形質転換体製造のための宿主として使用することもできる。この場合の宿主としては、ＰＤＣ遺伝子以外の前記のような遺伝子（栄養要求性マーカーやプロテアーゼ遺伝子など）が欠失または失活しているものを使用できる。該宿主を用いて形質転換体を製造した後、得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体が得られる。
＜外来遺伝子導入方法＞
　遺伝子工学的方法で宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、日本国特開平５－１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、日本国特開平１０－２３４３７５号公報、日本国特開２０００－２６２２８４号公報、日本国特開２００５－１９８６１２号公報、国際公開第２０１１／０２１６２９号などに記載の方法を使用できる。
＜発現カセット＞
　発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体の製造において用いられる発現カセットは、ＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子のいずれか一方と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。
　該発現カセットは、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。１の発現カセットには複数の外来遺伝子が存在していてもよい。１の発現カセット中の外来遺伝子の数は１～８が好ましく、１～５がより好ましい。
　また、１の発現カセット中に複数の外来遺伝子が含まれている場合、２種類以上の外来遺伝子を含んでいてもよい。好ましい発現カセットは、１または複数のＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。
　本発明に係る形質転換体の製造において、ＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子は、それぞれ別個の発現カセットにより宿主に導入してもよく、両遺伝子を１の発現カセットにより宿主に導入してもよい。ＰＹＣ遺伝子およびＭＤＨ遺伝子を含む発現カセットとしては、たとえば、５’末端側から、プロモーター、ＰＹＣ遺伝子、切断配列、栄養要求性相補マーカー（たとえば、Ｕｒａ４遺伝子）、ＭＤＨ遺伝子、およびターミネーターを有する発現カセットが好ましい。
　発現カセットに含めるＰＹＣ遺伝子またはＭＤＨ遺伝子の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明に係る形質転換体によりＣ４ジカルボン酸が蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能して外来遺伝子がコードするタンパク質の発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）などが挙げられる。
　Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、日本国特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　ターミネーターとしては、たとえば、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、日本国特開平１０－２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
＜ベクター＞
　本発明に係る形質転換体は、外来遺伝子を含む発現カセットを、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。各発現カセットを含む形質転換体は、各発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
　該ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＲＳ）を含むプラスミドであることが好ましい。
　一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
　該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
　各外来遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体に外来遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、外来遺伝子は染色体に複数導入することもできる。本発明に係る形質転換体において、染色体に組み込まれたＰＹＣ遺伝子の数は１～２０が好ましく、特に１～８が好ましい。また、該形質転換体の染色体に組み込まれたＭＤＨ遺伝子の数は１～２０が好ましく、特に１～８が好ましい。
　染色体に外来遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。たとえば、前記日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法で染色体に外来遺伝子を複数導入できる。また、該方法で染色体に外来遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数の外来遺伝子を導入することもできる。
　外来遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、外来遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
　ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
　前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
　組換え部位の長さ（塩基数）は、２０～２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
　染色体に外来遺伝子を組み込む場合、ベクターは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
　この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
　ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
　ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
　この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させられる。
　複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得られる。
　また、日本国特開平５－１５３８０号公報、日本国特開平７－１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、日本国特開平１０－２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
＜標的部位＞
　ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中の外来遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数の外来遺伝子を組み込める。
　さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数の外来遺伝子を組み込むことができ、これにより外来遺伝子がコードするＰＹＣまたはＭＤＨの発現量を増大させ、Ｃ４ジカルボン酸の生産性を向上させられる。
　たとえば、ＰＹＣ遺伝子を含む発現カセットを第１の標的部位を有するベクターに組み込み、ＭＤＨ遺伝子を含む発現カセットを第２の標的部位を有するベクターに組み込み、該ベクターを用いてＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活しているＳ．ポンベを宿主として形質転換した後、得られた形質転換体のｍａｅ２遺伝子を欠失または失活させることにより、本発明に係る形質転換体が得られる。
　１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば日本国特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組み込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込める。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、該方法は煩雑である。
　染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込める。
　互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。
　１箇所の標的部位に複数の外来遺伝子が組み込まれている場合に比較して、外来遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位に外来遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際に外来遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
　染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
　Ｎａｔｈａｎ　Ｊ．Ｂｏｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ，“Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌ　ＩＩ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ”，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．２００３　１３：１９８４－１９９７
　染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込める。この場合、２個以上の外来遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上の外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上の外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。この場合、２個以上の外来遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くの外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。好ましくは、１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。
＜形質転換方法＞
　形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、日本国特開２００５－１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
　Ｓ．ポンベ宿主を相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。本発明に係る形質転換体を製造する際の形質転換方法としては、上述のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、その染色体に上述のベクターを用いて、発現カセットを相同組換えにより組み込む方法が好ましい。
　形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。
　次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質の発現量を調べ、該異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
　染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
　本発明に係る形質転換体は、リンゴ酸産生能が従来になく高い。該形質転換体のリンゴ酸の生産速度としては、２．０ｇ／（Ｌ・ｈ）以上が好ましく、５．０ｇ／（Ｌ・ｈ）以上がより好ましく、１０ｇ／（Ｌ・ｈ）以上がさらに好ましく、１５～３０ｇ／（Ｌ・ｈ）が特に好ましい。
［Ｃ４ジカルボン酸の製造方法］
　本発明に係るＣ４ジカルボン酸の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体を培養液中で培養し、該培養液からＣ４ジカルボン酸を取得するＣ４ジカルボン酸の製造方法である。
　本発明に係る形質転換体を、糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸からＰＹＣにより、または、ホスホエノールピルビン酸からＰＣＫにより、オキサロ酢酸が産生される。産生されたオキサロ酢酸からＭＤＨによりリンゴ酸が産生される。産生されたリンゴ酸から他のＣ４ジカルボン酸も産生される。
　産生されたリンゴ酸をはじめとするＣ４ジカルボン酸は、菌体内部に蓄積されるが、一部はＭａｅ１（Ｃ４ジカルボン酸トランスポーター）により培養上清に放出される。培養された該形質転換体または培養上清からＣ４ジカルボン酸を取得することでＣ４ジカルボン酸を製造できる。該形質転換体により製造されるＣ４ジカルボン酸としては、オキサロ酢酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸等が挙げられ、オキサロ酢酸またはリンゴ酸が好ましい。
　Ｃ４ジカルボン酸の製造に用いる培養液としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を用いることができ、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを含ませることができる。
　本発明に係るＣ４ジカルボン酸の製造方法では、糖として特にグルコースまたはスクロースを含有する培養液を用いることが好ましい。培養初期の培養液（１００質量％）中のグルコースまたはスクロース濃度は１質量％以上が好ましく、１～５０質量％がより好ましく、２～１６質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度またはスクロース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度等は１質量％以下となってもよい。
　また、Ｃ４ジカルボン酸を分離しながら培養液を循環させて連続的に培養を行う場合には、前記グルコース濃度等を維持することが好ましい。グルコース濃度等を２質量％以上とすることにより、Ｃ４ジカルボン酸の生産性がより向上する。また、培養液中のグルコースまたはスクロースを１６質量％以下とすることにより、Ｃ４ジカルボン酸の生産効率がより向上する。
　また、Ｃ４ジカルボン酸製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１～１００ｇ／Ｌとすることが好ましい。培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して２０～６０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。
　なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ６６０＝１は、分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
　培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行える。
　また、培養温度は、２３～３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を培養液から分離して、Ｃ４ジカルボン酸を含む培養液を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から培養液の一部を抜き出し、抜き出した培養液からＣ４ジカルボン酸を分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースや新たな培養液を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、Ｃ４ジカルボン酸の生産性がより向上する。
　本発明に係る形質転換体は、耐酸性に特に優れているため、Ｃ４ジカルボン酸の蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２～４程度）となっても中和を行わずにＣ４ジカルボン酸を生産できる。そのため、培養液のｐＨが３．５以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養によりＣ４ジカルボン酸を製造できる。培養終期のｐＨおよび連続培養におけるｐＨは、３．５以下が好ましく、特に２．３～３．５が好ましい。場合によっては培養液のｐＨが３．５以下になる前に培養を終了してもよい。
　培養液からのＣ４ジカルボン酸の取得は、公知の方法を用いることができる。たとえば、培養終了後の培養液から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。
　また、場合によっては培養液中のＣ４ジカルボン酸を中和した後培養液とＣ４ジカルボン酸塩を分離して、Ｃ４ジカルボン酸を取得することもできる。たとえば、培養液中のＣ４ジカルボン酸をカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、該中和塩を晶析する方法でＣ４ジカルボン酸を取得することもできる。
　以上説明した本発明に係るＣ４ジカルボン酸の製造方法は、Ｓ．ポンベを宿主とする形質転換体を用い、高い生産性で簡便にＣ４ジカルボン酸を製造できる。該製造方法によれば、Ｃ４ジカルボン酸の生産速度を５ｇ／Ｌ／ｈ以上とすることが容易であり、場合により、Ｃ４ジカルボン酸の生産速度は１５ｇ／Ｌ／ｈ以上にも達する。また、本発明に係るＣ４ジカルボン酸の製造方法は、高濃度のグルコース存在下、および高濃度の形質転換体による高密度培養にも適している。
　以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
＜Ｓ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株の作製＞
　Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１９株（遺伝子型：ｈ－、ｌｅｕ１－３２、ｕｒａ４－Ｄ１８、Ａｄｅ６－Ｍ２１６）（Ｓｔｒａｉｎ　ｎａｍｅ：ＪＹ７４１，ＮＢＲＰＩＤ：ＦＹ７５１２）をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）に従って形質転換し、ＰＤＣ２遺伝子（系統名：ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）を削除した削除株（ＩＧＦ８３６株）を作製した。
　削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ－）（国際公開第２００７／０１５４７０号参照。）からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的には、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表２に示す塩基配列を有する２種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したＳ．ポンベのウラシル要求性マーカーｕｒａ４（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＣＣ３３０．０５ｃ、オロチジン－５’－リン酸脱炭酸酵素遺伝子）領域断片も鋳型として合わせて使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られたＳ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株（ＩＧＦ８３６株、ｈ－ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８　ａｄｅ６－Ｍ２１６　ｐｄｃ２－Ｄ２３）を、ｐＳＨｈベクターを制限酵素ＰｍａＣＩで処理し得られたＤＮＡ断片を用いて形質転換し、ウラシル要求性とアデニン要求性が回復したＡＳＰ４５９０株を取得した。
［例２］
＜外来遺伝子導入株の作製＞
　アスペルギルス・ニガー由来のＰＹＣ（ＡｎｉＰＹＣ）（配列番号１）、ブレビバチルス・ブレビス由来のＰＹＣ（ＢｂｒＰＹＣ）（配列番号２）、デバリョミセス・ハンセニイ由来のＰＹＣ（ＤｈａＰＹＣ）（配列番号３）、クルベロミセス・ラクティス由来のＰＹＣ（ＫｌａＰＹＣ）（配列番号４）、ラチャンセア・サーモトレランス由来のＰＹＣ（ＬｔｈＰＹＣ）（配列番号５）、ロデロミセス　エロンギスポルス由来のＰＹＣ（ＬｅｌＰＹＣ）（配列番号６）、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＹＣ（ＳｃｅＰＹＣ）（配列番号７）、カンジダ・オルトプシローシス由来のＰＹＣ（ＣｏｒＰＹＣ）（配列番号８）、カンジダ・トロピカリス由来のＰＹＣ（ＣｔｒＰＹＣ）（配列番号９）、ナウモボジマ・カステリィ由来のＰＹＣ（ＮｃａＰＹＣ）（配列番号１０）、ナウモボジマ・ダイレネンシス由来のＰＹＣ（ＮｄａＰＹＣ）（配列番号１１）、サッカロミセス・クドリアベゼビイ由来のＰＹＣ（ＳｋｕＰＹＣ）（配列番号１２）、Ｓ．ポンベ由来のＰＹＣ（ＳｐｏＰＹＣ）（配列番号１３）、テトラピシスポラ・ブラッタエ由来のＰＹＣ（ＴｂｌＰＹＣ）（配列番号１４）、トルラスポラ・デルブルエキ由来のＰＹＣ（ＴｄｅＰＹＣ）（配列番号１５）、ジゴサッカロミセス・ロキシイ由来のＰＹＣ（ＺｒｏＰＹＣ）（配列番号１６）、アーケオグロブス・フルギダス由来のＭＤＨ（ＡｆｕＭＤＨ）（配列番号１７）、コングレギバクター・リトラリス由来のＭＤＨ（ＣｌｉＭＤＨ）（配列番号１８）、デルフチア・アシドボランス由来のＭＤＨ（ＤａｃＭＤＨ）（配列番号１９）、ハロモナス・エロンガタ由来のＭＤＨ（ＨｅｌＭＤＨ）（配列番号２０）、またはシュワネラ・プトレファシエンス由来のＭＤＨ（ＳｐｕＭＤＨ）（配列番号２１）を導入したポンベ形質転換株を作製した（表２４）。
　具体的には、例１で作製したＩＧＦ８３６株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＡｎｉＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＡｎｉＰＹＣ、ＢｂｒＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＢｂｒＰＹＣ、ＤｈａＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＤｈａＰＹＣ、ＫｌａＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＫｌａＰＹＣ、ＬｔｈＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＬｔｈＰＹＣ、ＬｅｌＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＬｅｌＰＹＣ、ＳｃｅＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｃｅＰＹＣ、ＣｏｒＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｏｒＰＹＣ、ＣｔｒＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｔｒＰＹＣ、ＮｃａＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＮｃａＰＹＣ、ＮｄａＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＮｄａＰＹＣ、ＳｋｕＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｋｕＰＹＣ、ＳｐｏＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｐｏＰＹＣ、ＴｂｌＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＴｂｌＰＹＣ、ＴｄｅＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＴｄｅＰＹＣ、ＺｒｏＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＺｒｏＰＹＣ、ＡｆｕＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＡｆｕＭＤＨ、ＣｌｉＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＣｌｉＭＤＨ、ＤａｃＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＤａｃＭＤＨ、ＨｅｌＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＨｅｌＭＤＨ、またはＳｐｕＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＳｐｕＭＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３－９５１頁）に従い形質転換した。
　単座組込型組換えベクターｐＳＭｈは、以下に示す工程で作製することができる。まず、ＤＮＡ全合成により作製された配列番号３４に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片（Ｆｒ．１）を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し得られた断片と、ｐＳＥベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し再び制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩで二重消化して得られたＤＮＡ断片をライゲーションし、配列番号３５に示す塩基配列（５’→３’、環状）からなるｐＳＭｈ（８８４９ｂｐ、図１）を作製した。
　ｐＳＬｈ－ＡｎｉＰＹＣは、以下に示す工程で作製した。まず、アスペルギルス・ニガーの培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＡｎｉＰＹＣ－Ｆ、ＡｎｉＰＹＣ－Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＡｎｉＰＹＣ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＡｎｉＰＹＣ（配列番号１）をコードしていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　得られた増幅断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ－ＡｎｉＰＹＣを作製した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法の方法は該キットのマニュアルに則り行った。すなわち、得られたＰＣＲ産物をスピンカラムにより精製し、ｐＳＬｈと共にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液に加え、５０℃、１５分間反応させた。
　同様の手法で単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＢｂｒＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＤｈａＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＫｌａＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＬｔｈＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＬｅｌＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｃｅＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｏｒＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｔｒＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＮｃａＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＮｄａＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｋｕＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｐｏＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＴｂｌＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＴｄｅＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＺｒｏＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＡｆｕＭＤＨ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＣｌｉＭＤＨ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＤａｃＭＤＨ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＨｅｌＭＤＨ、および単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＳｐｕＭＤＨを作製した。それぞれ用いたプライマーセットを記す。
　また、ＡＳＰ４５９０株に、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｃｅＰＹＣベクターおよびｐＳＭｈ－ＤａｃＭＤＨベクターを用いて形質転換し、ＳｃｅＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４４９１株を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　製造された各形質転換体の名称、宿主、および導入した外来遺伝子名を表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
＜ＰＹＣ発現の確認＞
　ＰＹＣ遺伝子のみを導入した１６種の形質転換体について、ＰＹＣ発現量を確認した。具体的には、各形質転換体をそれぞれ、２０ｍＬのＹＰＤ６培地で４４時間振とう培養した後、増殖させた菌体を集菌し、マルチビーズショッカーを用いて破砕した。得られた菌体破砕液をＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、プロトコールに従い精製した。精製した酵素液でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、検出されたバンドを画像解析装置ＬＡＳ４０００にて数値化し、相対発現量を算出した。各形質転換体について算出したＰＹＣ発現量（相対値）の結果を図２に示す。この結果、いずれもＰＹＣの発現が確認された。
＜ＰＹＣ活性の確認＞
　ＰＹＣ遺伝子のみを導入した１６種の形質転換体のうち、ＢｂｒＰＹＣ、ＫｌｕＰＹＣ、ＬｔｈＰＹＣ、ＬｅｌＰＹＣ、ＳｃｅＰＹＣ、ＳｋｕＰＹＣ、ＳｐｏＰＹＣ、またはＴｂｌＰＹＣを発現させた８種の形質転換体について、ＰＹＣ活性を調べた。具体的には、前記の精製した酵素液を３０℃で保温しておいた反応液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２ｍＭ　ＡＴＰ，１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＫＣｌ，５ｍＭ　Ｐｙｒｕｖｉｃ　ａｃｉｄ，５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，０．１ｍＭ　Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ，０．１５ｍＭ　ＮＡＤＨ）に混合した後、ミキシング機能をもつ吸光光度計を用いて経時的に測定した。得られた経時的な吸光度の変化から、相対的な酵素液あたりの活性（ｍＵ／ｍＬ）を算出した。各形質転換体について算出した酵素液あたりのＰＹＣ活性の結果を図３に示す。この結果、いずれもＰＹＣ活性が確認された。
＜ＭＤＨ発現の確認＞
　ＭＤＨ遺伝子のみを導入した５種の形質転換体について、ＭＤＨ発現量を確認した。具体的には、＜ＰＹＣ発現の確認＞と同様にして各形質転換体を培養し、精製した酵素液を調製し、該酵素液でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、相対発現量を算出した。各形質転換体について算出したＭＤＨ発現量（相対値）の結果を図４に示す。この結果、いずれもＭＤＨの発現が確認された。
＜ＭＤＨ活性の確認＞
　ＭＤＨ遺伝子のみを導入した５種の形質転換体のうち、ＣｌｉＭＤＨ、ＤａｃＭＤＨ、またはＨｅｌＭＤＨを発現させた３種の形質転換体について、ＭＤＨ活性を調べた。具体的には、前記の精製した酵素液を３０℃で保温しておいた反応液（９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０），０．５ｍＭ　Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ，０．２５ｍＭ　ＮＡＤＨ）に混合した後、ミキシング機能をもつ吸光光度計を用いて経時的に測定した。得られた経時的な吸光度の変化から、相対的な酵素液あたりの活性（ｍＵ／ｍＬ）を算出した。各形質転換体について算出した酵素液あたりのＭＤＨ活性の結果を図５に示す。この結果、いずれもＭＤＨ活性が確認された。
［例３］ｍａｅ２削除株の作製
　ＳｃｅＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４４９１株のｍａｅ２遺伝子を削除した削除株（ＡＳＰ４９６４株）を作製した。ｍａｅ２の削除断片の作製方法は、ｐｄｃ２削除の削除断片と同様の作製方法で行った。
　Ｓ．ポンベのＡＳＰ４４９１株（遺伝子型：ｈ－、ｌｅｕ１－３２、ｕｒａ４－Ｄ１８、Ａｄｅ６－Ｍ２１６、Δｐｄｃ２、＋ＳｃｅＰＹＣ、＋ＤａｃＭＤＨ）をＬａｔｏｕｒ法に従って形質転換し、ｍａｅ２遺伝子（系統名：ＳＰＣＣ７９４．１２ｃ）を削除したＡＳＰ４９６４株を作製した。
　削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２５に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
［例４］ｆｕｍ１削除株の作製
　ＳｃｅＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４４９１株のｆｕｍ１遺伝子を削除した削除株（ＡＳＰ４９３３株）を作製した。ｆｕｍ１は、リンゴ酸を基質としてフマル酸を生産する酵素である。ｆｕｍ１の削除断片の作製方法は、ｐｄｃ２削除の削除断片と同様の作製方法で行った。
　Ｓ．ポンベのＡＳＰ４４９１株をＬａｔｏｕｒ法に従って形質転換し、ｆｕｍ１遺伝子（系統名：ＳＰＣＣ１８．１８ｃ／ＳＰＣＣ２９０．０１ｃ）を削除したＡＳＰ４９３３株を作製した。
　削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２６に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
＜リンゴ酸生産能の確認＞
　Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０１０株）、ＰＤＣ２遺伝子削除株（ＡＳＰ４５９０株、ΔＰＤＣ２）、ＡＳＰ４５９０株にＳｃｅＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４４９１株、ＡＳＰ４４９１株のｍａｅ２遺伝子を削除したＡＳＰ４９６４株（ΔＰＤＣ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）、およびＡＳＰ４４９１株のｆｕｍ１遺伝子を削除したＡＳＰ４９３３株（ΔＰＤＣ２，Δｆｕｍ１，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のリンゴ酸生産速度を調べた。
　具体的には、菌体をＹＥＳプレートに播種し、３０℃で９６時間培養しコロニーを得た。得られたコロニーを５ｍＬのＹＥＳ培地（試験管）に植継ぎ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた菌液を１００ｍＬのＹＰＤ６培地（坂口フラスコ）に植継ぎ、３０℃で４４時間振とう培養した。
　得られた菌体を集菌し、試験管内の３ｍＬの発酵培地（１００ｇ／Ｌ　グルコース、１１１ｇ／Ｌ　炭酸カルシウム）に３６ｇ乾燥菌体重量／Ｌとなるように加え、３０℃、振とう条件で発酵させた。発酵液から適時サンプリングを行った。
　得られたサンプルについて、酵素電極法バイオセンサＢＦ－７（王子計測機器社製）を用いてグルコース濃度とエタノール濃度を測定し、ＨＰＬＣによりリンゴ酸濃度を測定した。ＨＰＬＣ測定では、高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を用い、カラムはＡｍｉｎｅｘ　ＨＰＸ―８７Ｈ　３００×７．８ｍｍ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ社製）を用い、インジェクション容量を１０μＬとし、溶媒に１０ｍＭ　Ｈ２ＳＯ４を用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとし、測定時間は３５分間とし、測定温度は６０℃とし、検出にはダイオードアレイ検出（２１０ｎｍ）と示差屈折率検出を用いた。各濃度は、培養液または発酵液当たりの濃度である。
　グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を、図６～１０に示す。この結果、ＡＳＰ４９６４株（ΔＰＤＣ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のみが、リンゴ酸の産生が確認された。
＜リンゴ酸生産速度の測定＞
　ＡＳＰ４４９１株（ΔＰＤＣ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）およびＡＳＰ４８９２株（ΔＰＤＣ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のリンゴ酸生産速度を測定した。
　具体的には、＜リンゴ酸生産能の確認＞と同様にして各株をそれぞれ発酵させ、発酵液から適時サンプリングを行い、グルコース濃度とリンゴ酸濃度を測定した。測定結果を図１１に示す。図１１中、「Ｇｌｕ－４８９２」および「Ｇｌｕ－４４９１」はそれぞれＡＳＰ４８９２株およびＡＳＰ４４９１株のグルコース濃度の経時変化を示し、「ＭＡ－４８９２」および「ＭＡ－４４９１」はそれぞれＡＳＰ４８９２株およびＡＳＰ４４９１株のリンゴ酸濃度の経時変化を示す。この結果、発酵開始から１時間経過時点でＡＳＰ４８９２株の発酵液のリンゴ酸濃度は２０ｇ／Ｌを超えており、リンゴ酸生産速度は２０ｇ／（Ｌ・ｈ）以上であり、２時間経過時点では発酵液のリンゴ酸濃度は２８．９ｇ／Ｌになっていた。一方で、ＡＳＰ４４９１株の発酵液では、２時間経過時点でのリンゴ酸濃度は３．９ｇ／Ｌであった。
［例５］ＰＣＫ導入株の作製
　カンジダ・グロブラータ由来のＰＣＫ（ＣｇｌＰＣＫ）（配列番号９４）、シトロバクター・コセリ由来のＰＣＫ（ＣｋｏＰＣＫ）（配列番号９５）、クロノバクター・サカザキ由来のＰＣＫ（ＣｓａＰＣＫ）（配列番号９６）、デバリョミセス・ハンセニイ由来のＰＣＫ（ＤｈａＰＣＫ）（配列番号９７）、エシェリキア・フェルグソニ由来のＰＣＫ（ＥｆｅＰＣＫ）（配列番号９８）、エドワードシエラ・ターダ由来のＰＣＫ（ＥｔａＰＣＫ）（配列番号９９）、クルベロミセス・ラクティス由来のＰＣＫ（ＫｌａＰＣＫ）（配列番号１００）、ロデロミセス　エロンギスポルス由来のＰＣＫ（ＬｅｌＰＣＫ）（配列番号１０１）、ペクトバクテリウム・カロトボラム由来のＰＣＫ（ＰｃａＰＣＫ）（配列番号１０２）、フォトバクテリウム・ロイナチ由来のＰＣＫ（ＰｌｅＰＣＫ）（配列番号１０３）、プロヴィデンシア・レトゲア由来のＰＣＫ（ＰｒｅＰＣＫ）（配列番号１０４）、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＣＫ（ＳｃｅＰＣＫ）（配列番号１０５）、セラチア・オドリフェラ由来のＰＣＫ（ＳｏｄＰＣＫ）（配列番号１０６）、ビブリオ・オリエンタリス由来のＰＣＫ（ＶｏｒＰＣＫ）（配列番号１０７）、バンデルワルトジマ・ポリスポラ由来ＰＣＫ（ＶｐｏＰＣＫ）（配列番号１０８）、ビブリオ・ツビアシ由来のＰＣＫ（ＶｔｕＰＣＫ）（配列番号１０９）、イエシニア・ベルコビエリ由来ＰＣＫ（ＹｂｅＰＣＫ）（配列番号１１０）、ヤロウィア・リポリチカ由来ＰＣＫ（ＹｌｉＰＣＫ）（配列番号１１１）、イエシニア・ロデイ由来のＰＣＫ（ＹｒｏＰＣＫ）（配列番号１１２）、またはジゴサッカロミセス・ロキシイ由来ＰＣＫ（ＺｒｏＰＣＫ）（配列番号１１３）を導入したポンベ形質転換株を作製した（表４７）。
　具体的には、例１で作製したＩＧＦ８３６株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、表４７に記載のＰＣＫ遺伝子の発現カセットをそれぞれ保持した各単座組込型組換えベクターの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３－９５１頁）に従い形質転換した。
　ｐＳＬｈ－ＣｇｌＰＣＫは、以下に示す工程で作製した。まず、カンジダ・グロブラータの培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２７に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＣｇｌＰＣＫ－Ｆ、ＣｇｌＰＣＫ－Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＣｇｌＰＣＫ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＣｇｌＰＣＫ（配列番号９４）をコードしていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　同様の手法で単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｋｏＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＣｓａＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＤｈａＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＥｆｅＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＥｔａＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＫｌａＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＬｅｌＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＰｃａＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＰｌｅＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＰｒｅＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｃｅＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＳｏｄＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＶｏｒＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＶｐｏＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＶｔｕＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＹｂｅＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＹｌｉＰＣＫ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＹｒｏＰＣＫ、および単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＺｒｏＰＣＫを作製した。それぞれ用いたプライマーセットを記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
＜ＰＣＫ発現の確認＞
　ＰＣＫ遺伝子のみを導入した２０種の形質転換体について、ＰＣＫ発現量を確認した。具体的には、各形質転換体をそれぞれ、２０ｍＬのＹＰＤ６培地で４４時間振とう培養した後、増殖させた菌体を集菌し、マルチビーズショッカーを用いて破砕した。得られた菌体破砕液をＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）　Ｍ１　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、プロトコールに従い精製した。精製した酵素液でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、検出されたバンドを画像解析装置ＬＡＳ４０００にて数値化し、相対発現量を算出した。各形質転換体について算出したＰＣＫ発現量（相対値）の結果を図１２に示す。この結果、いずれもＰＣＫの発現が確認された。
［例６］ＥｃｏＰＣＫ導入株、ＧｇｌＰＹＣ導入株、ＥｃｏＭＤＨ導入株の作製
　エシェリキア・コリ由来のＰＣＫ（ＥｃｏＰＣＫ）（配列番号１５４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）由来のＰＹＣ（ＧｇｌＰＹＣ）（配列番号１５５）、エシェリキア・コリ由来のＭＤＨ（ＥｃｏＭＤＨ）（配列番号１５６）を導入したポンベ形質転換株を作製した。
　具体的には、例１で作製したＩＧＦ８３６株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＥｃｏＰＣＫ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＮｈ－ＥｃｏＰＣＫ、ＧｇｌＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＧｇｌＰＹＣまたはＥｃｏＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＥｃｏＭＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３－９５１頁）に従い形質転換した。
　ｐＳＮｈ－ＥｃｏＰＣＫは、以下に示す工程で作製した。まずは、エシェリキア・コリの培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調整した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４８に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＥｃｏＰＣＫ－Ｆ、ＥｃｏＰＣＫ－Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＥｃｏＰＣＫ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＥｃｏＰＣＫ（配列番号１５４）をコードしていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　得られた増幅断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＳＮｈに組み込んで、ｐＳＮｈ－ＥｃｏＰＣＫを作製した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法の方法は該キットのマニュアルに則り行った。すなわち、得られたＰＣＲ産物をスピンカラムにより精製し、ｐＳＮｈと共にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液に加え、５０℃、１５分間反応させた。
　同様の手法で単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ－ＧａｌＰＹＣ、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ－ＥｃｏＭＤＨを作製した。それぞれ用いたプライマーセットを記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　製造された各形質転換体の名称、宿主、および導入した外来遺伝子名を表５１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　＜ＰＣＫ、ＰＹＣまたはＭＤＨの発現の確認＞
　ＰＣＫ、ＰＹＣまたはＭＤＨ遺伝子のみを導入した３種の形質転換体について、ＰＣＫ、ＰＹＣまたはＭＤＨの発現量を確認した。具体的には、各形質転換体をそれぞれ、２０ｍＬのＹＰＤ６培地で４４時間振とう培養した後、増殖させた菌体を集菌し、マルチビーズショッカーを用いて破砕した。得られた菌体破砕液をＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、プロトコールに従い精製した。精製した酵素液でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行ったところ、いずれの酵素液でもバンドが検出されなかった。この事からＳ．ポンベにＥｃｏＰＣＫ、ＧｇｌＰＹＣまたはＥｃｏＭＤＨ遺伝子を導入しても、これらの酵素が発現されないため有効な活性が得られない事が示唆された。
［例７］リンゴ酸生産株の作製
　例２、例３、および例５に記載の方法に従い、表５２に記載の形質転換体を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
［例８］ｍａｅ２削除の効果の確認
　ｍａｅ２の削除による効果を確認するため、ＡＳＰ４４９１株、ＡＳＰ４９６４株、ＡＳＰ４９３３株、およびＡＳＰ５１２７株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　具体的には、菌体をＹＥＳプレートに播種し、３０℃で９６時間培養しコロニーを得た。得られたコロニーを５ｍＬのＹＥＳ培地（試験管）に植継ぎ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた菌液を１００ｍＬのＹＰＤ６培地（坂口フラスコ）に植継ぎ、３０℃で４４時間振とう培養した。
　得られた菌体を集菌し、試験管内の３ｍＬの発酵培地（１００ｇ／Ｌ　グルコース、１１１ｇ／Ｌ　炭酸カルシウム）に３６ｇ乾燥菌体重量／Ｌとなるように加え、３０℃、振とう条件で発酵させた。発酵液から適時サンプリングを行った。
　得られたサンプルについて、酵素電極法バイオセンサＢＦ－７（王子計測機器社製）を用いてグルコース濃度とエタノール濃度を測定し、ＨＰＬＣによりリンゴ酸濃度を測定した。ＨＰＬＣ測定では、高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を用い、カラムはＡｍｉｎｅｘ　ＨＰＸ―８７Ｈ　３００×７．８ｍｍ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ社製）を用い、インジェクション容量を１０μＬとし、溶媒に１０ｍＭ　Ｈ２ＳＯ４を用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとし、測定時間は３５分間とし、測定温度は６０℃とし、検出にはダイオードアレイ検出（２１０ｎｍ）と示差屈折率検出を用いた。各濃度は、培養液または発酵液当たりの濃度である。結果を表５３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　その結果、ＡＳＰ４４９１株と比べて、ｍａｅ２が削除されているＡＳＰ４９６４株では、リンゴ酸の生産量が約１０倍に増加した。一方、ｍａｅ２と同様にリンゴ酸を基質とするｆｕｍ１がＡＳＰ４４９１株から削除されたＡＳＰ４９３３株では、リンゴ酸の生産量はほとんど増加しなかった。また、ｍａｅ２とｐｄｃ２を削除したのみでＰＹＣとＭＤＨが導入されていないＡＳＰ５１２７株では、５ｇ／Ｌほどのリンゴ酸の生産が認められた。
［例９］ＰＣＫ導入の効果の確認
　ＰＣＫの導入による効果を確認するために、ＡＳＰ５１２６株、ＡＳＰ５０８７株、ＡＳＰ５０８８株、およびＡＳＰ５０８９株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　リンゴ酸の発酵生産は例７と同様にして行った。結果を表５４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　ＰＣＫおよびＰＹＣを導入していないＡＳＰ５１２６株に比べて、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＣＫ（ＳｃｅＰＣＫ）が導入されたＡＳＰ５０８７株、フォトバクテリウム・ロイナチ由来のＰＣＫ（ＰｌｅＰＣＫ）が導入されたＡＳＰ５０８８株、およびイエシニア・ベルコビエリ由来ＰＣＫ（ＹｂｅＰＣＫ）が導入されたＡＳＰ５０８９株らは、リンゴ酸の生産速度またはリンゴ酸の終濃度の向上が確認された。
［例１０］ＰＹＣ導入の効果の確認
　ＰＹＣの導入による効果を確認するために、ＡＳＰ５１２６株、ＡＳＰ４９６４株、ＡＳＰ５１３２株、およびＡＳＰ５１３５株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　リンゴ酸の発酵生産は例７と同様にして行った。結果を表５５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　ＰＣＫおよびＰＹＣを導入していないＡＳＰ５１２６株に比べて、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＹＣが導入されたＡＳＰ４９６４株、クルベロミセス・ラクティス由来のＰＹＣ（ＫｌａＰＹＣ）が導入されたＡＳＰ５１３２株、およびＳ．ポンベ由来のＰＹＣ（ＳｐｏＰＹＣ）が導入されたＡＳＰ５１３５株らは、リンゴ酸の生産速度およびリンゴ酸の終濃度の向上が確認された。
［例１１］ＭＤＨ導入の効果の確認
　ＭＤＨの導入による効果を確認するために、ＡＳＰ５１２５株、ＡＳＰ５２１５株、ＡＳＰ５２１６株、ＡＳＰ５１２７株、ＡＳＰ４９６４株、ＡＳＰ５１２９株、およびＡＳＰ５１３１株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　リンゴ酸の発酵生産は例７と同様にして行った。結果を表５６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　ＭＤＨは導入されず、ＰＹＣが導入されたＡＳＰ５１２５株に比べて、ＣｌｉＭＤＨとＰＣＫが導入されたＡＳＰ５２１５株、ＨｅｌＭＤＨとＰＣＫが導入されたＡＳＰ５２１６株、ＳｐｕＭＤＨとＰＣＫが導入されたＡＳＰ５２１７株、ＨｅｌＭＤＨとＰＹＣが導入されたＡＳＰ４９６４株、ＣｌｉＭＤＨとＰＹＣが導入されたＡＳＰ５１２９株、およびＳｐｕＭＤＨとＰＹＣが導入されたＡＳＰ５１３１株らは、リンゴ酸の生産速度およびリンゴ酸の終濃度の向上が確認された。
［例１２］導入遺伝子のコピー数増加の効果の確認
　導入した遺伝子のコピー数増加の効果を確認するために、ＡＳＰ４９６４株およびＡＳＰ５２３５株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　リンゴ酸の発酵生産は例７と同様にして行った。結果を表５７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
　ＰＹＣとＭＤＨが１コピーずつ導入されたＡＳＰ４９６４株に比べ、ＰＹＣとＭＤＨが２コピーずつ導入されたＡＳＰ５２３５株は、リンゴ酸の生産速度およびリンゴ酸の終濃度の向上が確認された。
［例１３］無中和条件下でのリンゴ酸の発酵生産
　無中和条件でのリンゴ酸の生産を確認するために、ＡＳＰ４９６４株およびＡＳＰ５２３５株を用いて、リンゴ酸の発酵生産を行った。
　具体的には、例７と同じ方法で増やした菌体を、試験管内の３ｍＬの発酵培地（１００ｇ／Ｌ　グルコース）に３６ｇ乾燥菌体重量／Ｌとなるように加え、３０℃、振とう条件で発酵させた。発酵液から適時サンプリングを行った。
　得られたサンプルに対して例７と同様にして測定した。結果を表５８に示す。この結果、どちらの株でも無中和条件下でのリンゴ酸の生産が確認された。ＡＳＰ４９６４株の発酵経過１時間サンプルのｐＨは３．５であり、発酵経過２時間サンプルのｐＨは３．０であった。またＡＳＰ５２３５株の発酵経過１時間サンプルのｐＨは３．０であり、発酵経過２時間サンプルのｐＨは２．８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　本願は、２０１４年６月３０日に日本国に出願された特願２０１４－１３５０４３号、に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。

Claims (9)

  1. 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上の外来遺伝子が１以上組み込まれており、かつ、前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活しており、
    　前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が、
    配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    配列番号９４～１１３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、
    　前記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、
    配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、または
    配列番号１～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、
    　欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がｐｄｃ２遺伝子であることを特徴とする形質転換体。
  2. 　さらに、外来のリンゴ酸脱水素酵素遺伝子が１以上組み込まれている、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　前記リンゴ酸脱水素酵素遺伝子が、
    配列番号１７～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    配列番号１７～２１の１いずれかで表されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、または
    配列番号１７～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載の形質転換体。
  4. 　さらに、リンゴ酸酵素遺伝子が欠失または失活している、請求項１～３のいずれか一項に記載の形質転換体。
  5. 　外来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子または外来のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と、外来のリンゴ酸脱水素酵素遺伝子とが、それぞれ１以上組み込まれ、ｐｄｃ２遺伝子とリンゴ酸酵素遺伝子のいずれもが欠失または失活している、請求項１に記載の形質転換体。
  6. 　前記外来遺伝子が宿主の染色体に組み込まれている、請求項１～５のいずれか一項に記載の形質転換体。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の形質転換体を培養液中で培養し、培養された該形質転換体または培養上清から炭素数４のジカルボン酸を取得することを特徴とする炭素数４のジカルボン酸の製造方法。
  8. 　前記炭素数４のジカルボン酸がリンゴ酸またはオキサロ酢酸である、請求項７に記載の炭素数４のジカルボン酸の製造方法。
  9. 　培養を、培養液のｐＨが３．５以下となった後も継続する、請求項７または８に記載の炭素数４のジカルボン酸の製造方法。
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