WO2015188288A1 - Moduladores específicos de hemicanales de conexinas - Google Patents

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WO2015188288A1
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connexins
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Juan Carlos Saez
Carlos Lagos
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Pontificia Universidad Católica De Chile
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Definitions

  • the present invention relates to methods for identifying specific hemichannel modulating compounds (blockers) formed by connexins, the new use of the compounds identified by this methodology and the pharmaceutical compositions comprising said compounds for treating diseases associated with increased hemichannel activity.
  • connexins such as inflammatory diseases, vascular disorders, arrhythmias, chronic wounds, retinal neuroprotection, pain treatment, skeletal muscle denervation, muscular dystrophies, post-ischemia reperfusion (example: heart or brain infarctions), spinal cord damage spinal and genetic diseases that are characterized by an increase in the activity of hemichannels formed by connexins.
  • the connexins are intrinsic membrane proteins, which form hexagonal arrangements in the plasma membrane called connective or hemichannels. Two hemichannels can be joined through their extracellular segments to form a gap junction channel or intercellular junction ("gap-junction"), which allow the direct transfer of various substances between cells (Sáez, Berthoud et al. 2003).
  • connexin 26 The recent determination of the crystalline structure of connexin 26 to 3.5A resolution by X-ray crystallography (Maeda et al., 2009), shows that hemichannels are the conserved motifs of the gap junctions ("gap junctions" ) and can be considered as structural unit modules (Yeager, 2009).
  • the structure of the hemicanal formed by connexin 26 shows that each monomer is composed of 4 transmembrane alpha helices (TM1-TM4), 2 extracellular loops (E1, E2), 1 intracellular loop and a helical N-terminal domain (NTH) and the C-terminal domain.
  • connection monomer 26 contains an arrangement of six protomers and each connection monomer 26 contains a typical four-helices beam in which any pair of adjacent propellers is antiparallel (Maeda and Tsukihara, 201 1).
  • the provision of the secondary connexin structure 26 is as follows: TM1, TM2 and E1 face the pore; TM3, TM4 and E2 are located in the perimeter of the hemicanal against the lipids of the membrane or the extracellular environment, respectively; TM2 and the cytoplasmic half of TM1 are covered by NTH and these are not exposed ( Figure 1).
  • connexin modulators are currently known, but most of them simultaneously affect the activity of hemichannels and channels formed by connexins.
  • connexin modulators are currently known, but most of them simultaneously affect the activity of hemichannels and channels formed by connexins.
  • the use of antisense RNA or morpholinos that inhibit the expression of connexins eliminate the expression of both hemichannels and channels of cleft junctions. Consequently, the compounds described in the art have low efficacy and non-specific mechanisms of action or secondary to the pharmacological action in other therapeutic targets that modify the activity of connexins (eg, kinases).
  • patent application WO2007002139 claims a method of neuroprotection in retinal cells by decreasing the release of connexin-mediated ATP in response to local hypertension.
  • hemichannel blockers can be mefloquine, meclofenamic acid, retinoic acid, 18-alpha-glycyretinic acid, flufenamic acid, niflumic acid, carbenoxolone, peptidomimetics or combinations thereof.
  • these compounds are not selective for hemichannels formed by connexins since which also block groove junction channels and the pharmacological effect depends on the transport of ATP, which can be transported via alternatives to hemichannels.
  • oligonucleotides such as application WO2009148613, the use of antisense oligonucleotides, interfering RNA or siRNA is included to inhibit the expression of both the intercellular channels located between two cells, and of the hemichanals located on the cell surface.
  • these oligonucleotides are directed to specifically modulate connexin isoform 43 (in human there are 20 other connexins) and only allow formulation in pharmaceutical forms for transdermal, intravenous, or depot administration.
  • JP201 application 1506446 describes the use of antibodies or antigen-binding fragments, which are not useful in chronic inflammatory diseases since strong rejection or allergic reactions can be generated. In view of this, the great interest in being able to have drugs that modulate the formation, opening or activities of hemichannels formed by connexins is evident.
  • modulating agents that are antisense oligonucleotides, ribozymes, RNAi or siRNAs with lengths between 15-35 nucleotides and with at least 70% homology to the antisense sequence of connexin mRNA 43 is claimed.
  • Biological are selective only because of the connexin isoform 43 and its effect prevents both the formation of hemichannels and channels of groove joints formed by connexin 43. Blocking the formation of groove joints is a side effect detrimental to the normal functioning of organs expressing connexin 43.
  • said compounds have the general limitations of oligonucleotides, for example, which cannot be administered orally and must be formulated in other types of pharmaceutical forms of intravenous administration.
  • US20090143425 describes compounds derived from quinolines, which affect the joints in the slit or "gap junctions". However, these compounds they are not selective inhibitors of hemichannels formed by connexins.
  • the application US20090163440 describes the modulation of ion channels, in particular channels composed of connexin 43, where the drugs used for their modulation are chosen from different regulators of known ion channels: amlodipine, bepridyl, diltiazem, disopyramide, encainide, felodipine, galopamil, isradipine , mexithyl, nicardipine, nifedipine, nimodipine, nitrendipine, procainamide, quinidine, tetrodotoxin, verapamil. Of all the options described in the document, only quinidine has activity on connexin channels, this being nonspecific and low potency.
  • mefloquine is described, among others, as a connexin blocking agent.
  • mefloquine is a non-selective blocker of the groove joint channels formed by the Cx26, Cx32, Cx36, Cx43, and Cx50 connexins. This compound does not selectively inhibit hemichannels formed by said connexins.
  • compositions that restore the functioning of groove joints (“gap junctions"). These compositions are intended to promote the activity of slit channels. However, such compounds are not known to have an inhibitory effect of hemichannels formed by connexins.
  • hemichannel blockers formed by available connexins also inhibit the gap junctions ("gap junctions"), which play an important role in coordinating numerous electrical and metabolic responses in tissues. Therefore, it is desirable to obtain specific hemichannel blocking compounds, which have no effect on the groove junction channels, which could be useful to rationally design therapeutic treatments for various diseases, minimizing unwanted side effects.
  • gap junctions the gap junctions
  • US2014141099 presents methods of drug discovery, particularly, Aurora kinase inhibitors and a pharmacophore that describes compounds that promote a conformational change in the AuroraB protein and whose binding constant for the two-step process is Ki * y It also refers to compounds that have the characteristics of the pharmacophore.
  • Said method for selecting an Aurora B inhibitor comprises the steps of determining Ki; Ki * determination and selection of a compound with a predefined Ki / Ki * ratio. For the determination of Ki * , the compound under study and Aurora kinase are pre-incubated; The test mixture is diluted and Ki * is determined for a period of time.
  • US8131527 shows a method of identifying a compound that is a modulator of fibroblast growth factor receptors (FGFR) with a higher affinity for FGFR that by VEGFR2, which comprises the design and / or selection steps of a modulator using the pharmacophore represented by the given formula, then an in silico representation of said modulator of step (a) is generated; Atomic coordinates of an FGFR protein or a portion thereof are generated for at least the binding pocket around Asp641; adjustment of one or more candidate modulators according to step (b) to one or more FGFR residues to determine the probability that the candidate modulator interacts with FGFR, in which the NHs of the initially defined formula form a hydrogen bond direct with one or both of the Asp641 carboxylic acid oxygens; optionally, the modulation of the modulator under study can be made based on the result of the assembly stage; and contacting the modulator under study with FGFR and / or
  • patent application WO2004012683 it is disclosed a method for identifying a therapeutic compound for a disease caused by an organism that has a SET domain protein, which comprises analyzing the ability of a compound under study to modulate the activity of at least one drug-free region of the protein, in which the Modular ability indicates a candidate therapeutic compound.
  • FIG. 1 Schematic representation of the basic structure of connexin hemichannels.
  • the secondary structure of a connexin hemicanal is composed of the hexamerican arrangement of connexin protomers.
  • the domains of each protomer are indicated by names and coded by different gray intensities and indicated by arrows.
  • the membrane planes are represented in black lines.
  • Figure 2 Scheme of analysis of the biological evaluation of synthetic hemichannel inhibitors in which Cx 43 cell cultures are subcultured in 96-well black plates and subjected to the 3 ethidium uptake analyzes indicated to be evaluated as fluorescence emitted in a fluorimeter
  • FIG. 3 Ethidium uptake in HeLa Cx43-EGFP. Effect of the DCFS.
  • A Cultured cells.
  • B Graph of ethidium uptake in HeLa Cx43-EGFP.
  • Figure 4 Unit currents of hemichannels formed by connexin 43 in HeLa cells bathed in saline without calcium (or Ca) ion and in the presence of EGTA.
  • Figure 5 Percentage of coupling incidence as a function of time.
  • Figure 6 Cellular coupling evaluated with ethidium transfer.
  • Figure 7 Functional status of hemichannels formed by panexinal (Panxl) activated by mechanical stress.
  • Ci- 3 alkyl refers to a hydrocarbon chain comprising 1 to 3 carbon atoms.
  • C3 -3 alkoxy refers to a hydrocarbon chain comprising 1 to 3 carbon atoms attached to an oxygen atom.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount sufficient to effect treatment when administered to a patient in need of treatment.
  • treatment refers to the treatment of a disease or medical condition in a human patient that includes: (a) prevent the onset of disease or pathological medical condition, that is, the prophylactic treatment of a patient;
  • disease or pathological condition associated with connexin activity includes all disease states and / or states that are currently recognized or that are in the future, that are associated with increased activity of hemichannels formed by connexins 26 and / or 43.
  • disease states or conditions include, but are not limited to, inflammatory diseases, vascular disorders, arrhythmia, chronic wounds, retinal neuroprotection, fibrosis, pain treatment, skeletal muscle denervation, dystrophies muscle damage, spinal cord damage and genetic diseases that are characterized by an increase in the activity of hemichannels formed by connexins.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt prepared from a base or acid that is acceptable for administration to a patient such as a mammal. Said salts may be obtained from pharmaceutically acceptable inorganic or organic bases and pharmaceutically acceptable inorganic or organic acids.
  • Salts derived from pharmaceutically acceptable acids include acetic, benzenesulfonic, benzoic, canphosulfonic, citric, ethanesulfonic, fumaric, gluconic, glutamic, hydrobromic, hydrochloric, lactic, maleic, malic, mandelic, methanesulphonic, mucic, nitric, pantothenic, phosphoric, phosphoric, sucrose sulfuric, tartaric, p-toluenesulfonic, xinafoic (1-hydroxy-2-naphthoic acid) and the like. You go out Particularly preferred are those derived from fumaric, hydrobromic, hydrochloric, acetic, sulfuric, methanesulfonic, xinafoic and tartaric acids.
  • Salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic bases include salts of aluminum, ammonium, calcium, copper, ferric, ferrous, lithium, magnesium, manganic, manganous, potassium, sodium, zinc and the like. Particularly preferred are ammonium, calcium, magnesium, potassium and sodium salts.
  • Salts derived from pharmaceutically acceptable organic bases include salts of primary, secondary and tertiary amines, including substituted amines, cyclic amines, naturally occurring amines and the like, such as, arginine, betaine, caffeine, choline ⁇ , ⁇ '-dibenzylethylenediamine, diethylamine, 2-diethylaminoethanol, 2-dimethylaminoethanol, ethanolamine, ethylenediamine, N-ethylmorpholine, N-ethylpiperidine, glucosamine, histidine, isopropylamine, lysine, methylglucamine, morpholine, piperazine, piperidine, polyamine resins, procathylamine, purine, triamine, trifylamine, purine, thieminine, purine tripropylamine, tromethamine and the like.
  • solvate refers to a complex or aggregate formed by one or more molecules of a solute, that is, a compound of the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof and one or more solvent molecules. Such solvates are typically crystalline solids that have a substantially fixed molar ratio of solute and solvent.
  • Representative solvents include, by way of example, water, methanol, ethanol, isopropanol, acetic acid and the like. When the solvent is water, the solvate formed is a hydrate.
  • a pharmaceutically acceptable salt or solvate of its stereoisomers includes all combinations of salts, solvates and stereoisomers, such as a solvate of a pharmaceutically acceptable salt of a stereoisomer of a compound of formula (A-G).
  • drugable region refers to a region of a Hemichannel-forming connexin protein, which is a target or is a likely target for binding an agent that reduces or inhibits hemichannel activity.
  • a drug region generally refers to a region in which several amino acids of a polypeptide would be able to interact with an agent.
  • examples of drug regions are pockets and binding sites, the interfaces between the domains of a polypeptide, grooves or surface complex or contours or surfaces of a polypeptide or complex that are capable of participating in interactions with other molecules, such as the cell membrane.
  • a drug-free region in the connexins will correspond to a pocket delimited by the residues corresponding to the segments of the residues 3-10 (NTH), 29-40 (TM1), 74-93 (TM2) of a protomer and the residues 29-40 (TM1) of an adjacent protomer in connexin 26 or equivalent residues in other connexins.
  • the present invention relates to methods for identifying efficient and specific hemichannel modulating compounds (blockers) formed by connexins, the compounds identified by this methodology and the pharmaceutical compositions comprising said compounds.
  • methods of using said compounds and elaborating medicaments useful for treating diseases associated with increased activity of hemichannels formed by connexins are provided, in particular in the treatment of inflammatory diseases, vascular disorders, arrhythmias, wounds.
  • the use to treat inflammatory disorders in a subject comprises administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound that inhibits the activity, opening, or transport through a hemicanal formed by connexins.
  • a drug identification methodology based on the three-dimensional structure of the therapeutic targets has been used to solve the technical problem of obtaining efficient and specific modulatory compounds of hemichannels formed by connexins.
  • the objective of this drug identification strategy based on structures applied to connexins is to obtain new hemichannel modulating agents formed by connexins with greater affinity and selectivity, which, being specific, reduces the side effects in patients.
  • the method for identifying specific hemichannel inhibitor compounds formed by connexins begins with the analysis of the therapeutic target structure of different human connexins and from this, generate comparative models of other connexins.
  • the comparative models were based on the hypothesis that the binding of compounds to a pocket limited by the N-terminal helical domain (NTH), the transmembrane segments of the TM1 and TM2 helices of a protomer and the transmembrane segments of the TM1 helices
  • NTH N-terminal helical domain
  • the adjacent protomer prevents the conformational changes necessary to generate the opening / activation of hemichannels formed by connexins.
  • the OpenNCI chemical compound database was filtered to eliminate salts and counterions using the FILTER v2.1 program (OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM) and then converted into 3D coordinates using the program OMEGA v2.4.6 (OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM) thus giving a database of approximately 195,000 compounds and conformers.
  • FILTER v2.1 program OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM
  • OMEGA v2.4.6 OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM
  • FRED v2.2.5 program OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM
  • a virtual screening campaign is carried out in order to identify potential hemichannel modulators formed by connexin using the structure of the hemicanal constituted of human connexin 26, and in a model of the hemicanal formed by human connexin 43 developed by comparative modeling using the structure of the human connexin 26 as a pattern.
  • Candidate binding modes of ligands at the receptor site (100) optimized using the Chemgauss3 scoring function were obtained.
  • the consensus structures for the binding modes of the exhaustive molecular coupling process and optimization were obtained by consensus scoring using the PLP, Chemscore and Chemgauss3 evaluation functions.
  • the binding modes for the 1,000 best classified compounds were minimized with the CHARMm22 force field in DiscoveryStudio v2.1 (Accelrys Inc., San Diego). He The protocol allows the minimization of the side chains of the residues within 6A from the mass centroid of all coupled ligands, using the conjugate gradient algorithm to a convergence criterion of 0.001 kcal / mol for the mean square deviation (RMS) of the energy gradient.
  • RMS mean square deviation
  • the binding energy evaluation was performed for each complex obtained using the PLP, LigScore, PMF and LUDI evaluation functions.
  • the consensus scoring protocol available in Discovery Studio v2.1 was used. Based on this new classification, the results of the compounds with the 100 best results were visually inspected and 40 compounds were selected. within said group that showed the highest affinity against hemichannels formed by connexin 26 or connexin 43.
  • the compounds are tested in experiments based on cells deficient in the expression of hemichannels and transfected with different connexins to evaluate and / or confirm their ability to modulate transport across the cell membrane.
  • the transport of permeability tracer molecules is evaluated and compared with channel inhibitors formed by known connexins, such as beta glycyrritic acid (BGA) and carbenoxolone (CBX).
  • BGA beta glycyrritic acid
  • CBX carbenoxolone
  • the cells are incubated in extracellular medium without divalent cations to increase the probability of opening of hemichannels formed by connexins.
  • parental cells that do not express hemichannels and cells transfected with panexinal and mechanically stimulated are used as a negative control to induce the opening of hemichannels formed by panexin 1.
  • Molecules that inhibit hemichannels formed by connexins are evaluated by their action on hemichannels formed by panexin 1.
  • Molecules that inhibit hemichannels formed by connexins in the nanomolar range are studied as possible inhibitors of intercellular junction channels using the technique of coupling to dyes and by means of electrophysiology using double voltage fixation.
  • the invention provides new hemichannel inhibitor compounds formed by connexins 26 and / or 43.
  • An objective of the present invention is to provide a method for identifying compounds with inhibitory potential on hemichannels formed by connexins, in which a method of virtual screening of ligands on a crystallographic structure or a comparative model of proteins, corresponding to a formed hemichannel is used. by connexin 26 or connexin 43.
  • the method is characterized by evaluating the interaction energy of the compounds at a binding site bounded by residues corresponding to the segments of residues 3-10 (NTH), 29-40 (TM1), 74-93 (TM2) of a protomer and residues 29-40 (TM1) of an adjacent protomer in connexin 26 or equivalent residues in other connexins.
  • the method of the present invention makes it possible to determine that the identified compounds inhibit the opening / activation of hemichannels formed by connexins induced by the absence of divalent cations in the extracellular medium or by the application of positive voltages to the cell membrane and thus avoid dependence of the mechanism that induces hemichannel opening.
  • Another object of the invention is to provide a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compounds identified in a therapeutically effective amount of one or more specific hemichannel modulators formed by connexins according to the present invention that access the site of action in the cells to be treated.
  • Pharmaceutical compositions comprising at least one compound of the The present invention optionally comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another object of the invention is the use of one or more hemichannel modulators formed by connexins in the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases associated with the over activation of hemichannels formed by connexin 26 or connexin 43, wherein said hemichannel modulators formed by connexins reach the site of action in said cells.
  • the compounds obtained according to the present invention can be used to develop a useful medicine for the prevention and / or treatment of inflammatory diseases, vascular disorders, arrhythmia, chronic wounds, retinal neuroprotection, fibrosis, pain treatment, skeletal muscle denervation, muscular dystrophies, spinal cord damage and genetic diseases characterized by an increase in the activity of hemichannels formed by connexins, in which said compositions comprise therapeutically effective amounts of one or more agents that inhibit the opening / activation of hemichannels formed by connexins in the cells to be treated.
  • the compounds identified by the method according to the present invention blocked only hemichannels and not intercellular channels formed by connexins or hemichannels formed by panexinal.
  • the new hemichannel inhibitor compounds formed by identified conneinases bind directly to the hemichannels, and have better efficacy and potency than the compounds described in the state of the art.
  • the method for obtaining specific inhibitors of connexin hemichannel compounds comprises the steps of:
  • select hemichannel blocking compounds formed by connexins based on an energy function that allows estimating the relative affinity of each compound to the reference connexin; evaluate the ability of the compounds to modulate transport across the cell membrane in cells deficient in the expression of hemichannels, transfected with different connexins with respect to reference inhibitor compounds;
  • compositions can be conveniently presented in unit dosage form and can be prepared by any of the procedures well known in the pharmaceutical art. All procedures include the step of putting the active ingredient or ingredients in contact with the vehicle. In general, the formulations are prepared by uniformly contacting the active ingredient with liquid vehicles or finely divided solid vehicles and then, if deemed necessary, forming the product in the desired formulation.
  • the formulations of the present invention suitable for oral administration may be presented as capsules, tablets each containing a predetermined amount of the active ingredient, such as a powder or granulate; as a solution or suspension in an aqueous liquid or in a non-aqueous liquid; or as an oil-in-water liquid emulsion or water-in-oil liquid emulsion.
  • the active ingredient can also be presented as an injection, medicinal powder mixed with honey or syrup or thick ointment.
  • a syrup formulation will generally consist of a suspension or solution of the compound or salt in a liquid vehicle.
  • Typical dermal and transdermal formulations comprise a conventional aqueous or non-aqueous vehicle, for example, a thick cream, ointment, lotion or ointment or are in the form of a medicated plaster, patch or membrane.
  • Table 1 Percentage tracer inhibition percentage at a concentration of 5 ⁇ .
  • CBX, ABG carbenoxolone or beta-glycyretinic acid
  • the inhibitors of the present invention show adequate blocking / opening activity of connexin hemichannels 26 and 43 in vitro.
  • the method comprises selectively or specifically contacting a hemicanal formed by connexins 26 or 43, with a therapeutically effective amount (in the nanomolar range) of at least two of the following compounds: A: (f ⁇ ) -2- (4-chlorophenyl) -2-oxo-1-phenylethylquinoline-2-carboxylate,
  • HeLa cells transfected with mouse connexins 26 or 43 are used.
  • 10 3 HeLa cells transfected with connexins are seeded by well in multiwell plates (90) 24 h before each experiment.
  • the cells are then washed Locke solution containing normal levels of divalent cations (Ca 2+ and Mg 2+ ) or a Locke solution free of divalent cations containing 5 ⁇ 5 ethidium bromide.
  • the cells are treated with different concentrations of each candidate compound and incubated for 5 min.
  • HeLa cells transfected with connexin 43 are seeded in multiwell plates (96 wells) and after 24 h the ethidium uptake is evaluated in the presence of cation free medium (DCFS) in the presence or absence of the compound of interest. Ethidium uptake is evaluated as emitted fluorescence that is measured with a fluorimeter. If the fluorescence value in the presence of the inhibitor is equal to or close to that measured in cells bathed in solution containing divalent cations, the compound still corresponds to inhibitors of hemichannels formed by connexins.
  • DCFS cation free medium
  • the upper left panel (A) corresponds to a phase photomicrograph showing HeLa cells expressing connexin 43 conjugated with green fluorescent protein (EGFP) present in the microscopic field. Fluorescence is shown on the right indicating that all cells in the field express connexin 43.
  • the etidium uptake in basal conditions presence of Ca 2+ in the extracellular medium
  • DCFS divalent cations
  • the graph in (B) shows the activity of hemichannels as "Dye uptake” (dye uptake) in arbitrary units (Arbitrary Units. AU) in at least 40 cells bathed in control medium, followed by DCFS, application of 10 nM inhibitor molecule (fl) -2- (4-chlorophenyl) -2- oxo-1-phenylethylquinoline-2-carboxylate (compound 4 or inhibitor molecule), washed with DCFS and followed by a new application of 10 nM inhibitor molecule ( MX).
  • the inhibitory molecule inhibits the activity of hemichannels evaluated as ethidium uptake (Dye uptake).
  • Panel (C) shows that the rate or rate of ethidium uptake per minute is completely inhibited by the inhibitor molecule and its effect is partially reversed by washing with DCFS.
  • Figure 5 illustrates that cells transfected with connexin 26 are very well coupled by groove junction channels.
  • the incidence of cell coupling evaluated with microinjections of Lucifer yellow is close to 100% (black boxes).
  • Figure 6 illustrates that the application of 1 mM compound 4 (inhibitory molecule) does not inhibit cell coupling mediated by groove junction channels, while other compounds evaluated partially or totally inhibit crevice junction channels formed by connexin 43.
  • the functional state of hemichannels formed by panexin 1 (Panxl, Figure 7) activated by mechanical stress is not inhibited by the application of 100 nM of compound 4 but is completely blocked by the application of 5 ⁇ carbenoxolone.
  • concentrations of the nanomolar range of compound 4 inhibit hemichannels formed by connexins and not those formed by panexin 1 and that the compound also does not inhibit the groove junction channels formed by connexin. Therefore, the compound is a hemichannel inhibitor formed by highly specific connexins.

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Abstract

La invención provee métodos de identificación de moduladores específicos de hemicanales formados por conexinas mediante el uso de métodos de bioinformática estructural para el cálculo de la energía de interacción con ligandos y composiciones para modular selectivamente la actividad de hemicanales formados por conexinas. Entre otros aspectos la invención describe un método asistido por computador en el cual es posible estimar la energía de interacción entre ligandos provenientes de una bases de datos de compuestos químicos, con un bolsillo de unión definido por la región que comprende los residuos 3-10 (NTH), 29-40 (TM1), 74-93 (TM2) de un protómero y los residuos 29-40 (TM1) de un protómero adyacente en la conexina 26 o los residuos equivalentes en otras conexinas. En particular, la invención provee compuestos que inhiben específicamente la activación/apertura de hemicanales de conexinas, identificados mediante el método descrito, que pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmia cardiacas, heridas crónicas, neuroprotección de retina, tratamiento del dolor, denervación de músculos esqueléticos, distrofias musculares, daño de la medula espinal y enfermedades genéticas que se caracterizan por un aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas.

Description

MODULADORES ESPECÍFICOS DE HEMICANALES DE CONEXINAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para identificar compuestos moduladores (bloqueadores) específicos de hemicanales formados por conexinas, el nuevo uso de los compuestos identificados por esta metodología y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos para tratar enfermedades asociadas con aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas, tales como enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmias, heridas crónicas, neuroprotección de retina, tratamiento de dolor, denervación de músculos esqueléticos, distrofias musculares, reperfusión post-isquemia (ejemplo: infartos cardiacos o cerebrales), daño de la medula espinal y enfermedades genéticas que se caracterizan por un aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas.
ANTECEDENTES
Las conexinas son proteínas intrínsecas de membranas, que forman arreglos hexagonales en la membrana plasmática llamados conexones o hemicanales. Dos hemicanales pueden unirse mediante sus segmentos extracelulares para formar un canal de unión en hendidura o unión intercelular ("gap-junction"), los cuales permiten la transferencia directa de diversas sustancias entre células (Sáez, Berthoud et al. 2003). Durante la última década, ha sido demostrado que bajo condiciones fisiológicas los hemicanales juegan un importante rol en la transferencia de metabolitos y nutrientes (Chandrasekhar and Bera 2012) como también, en la liberación de moléculas de señalización intercelular, como el ATP, glutamato, prostaglandina E2 y NAD+, proporcionando una vía en la membrana para la señalización autocrina y paracrina (Wang, De Bock et al. 2012). Sin embargo, en diversas condiciones patológicas, la actividad de los hemicanales formados por conexinas está regulada al alza y contribuye significativamente al resultado de la
i degeneración celular (Sáez, Schalper et al. 2010).
La reciente determinación de la estructura cristalina de la conexina 26 a 3,5Á de resolución mediante cristalografía de rayos-X (Maeda et al., 2009), muestra que los hemicanales son los motivos conservados de las uniones en hendidura ("gap junctions") y pueden ser considerados como módulos de unidad estructural (Yeager, 2009). La estructura del hemicanal formado por la conexina 26 muestra que cada monómero está compuesto por 4 alfa hélices transmembrana (TM1 -TM4), 2 asas ("loops") extracelulares (E1 , E2), 1 asa intracelular y un dominio N-terminal helical (NTH) y el dominio C-terminal. Cada conexón contiene un arreglo de seis protómeros y cada monómero de conexina 26 contiene un haz de cuatro hélices típico en el que cualquier par de hélices adyacentes es antiparalela (Maeda y Tsukihara, 201 1 ). La disposición de la estructura secundaria de conexina 26 es el siguiente: TM1 , TM2 y E1 enfrentan al poro; TM3, TM4 y E2 están situados en el perímetro del hemicanal frente a los lípidos de la membrana o el medio ambiente extracelular, respectivamente; TM2 y la mitad citoplasmática de TM1 están cubiertos por NTH y éstos no están expuestos (Figura 1 ).
Varias líneas de investigación sugieren que el uso de inhibidores específicos de canales formados por conexinas puede tener utilidad terapéutica en el tratamiento de la epilepsia, arritmias cardíacas, cáncer, accidente cerebrovascular u otras condiciones (Spray, Rozental et al. 2002). Aunque el uso de técnicas electrofisiológicas y en ensayos in vitro utilizando proteínas recombinantes ha permitido la identificación de fármacos que supuestamente actúan directamente sobre hemicanales o canales para modular su función, para la mayoría si no todos los inhibidores de hemicanales formados por conexinas reportados hasta ahora el mecanismo preciso de acción a través del cual modulan la actividad y propiedades de transporte de estas permanece desconocido (Juszczak and Swiergiel 2009). Además, todos los compuestos descritos hasta ahora son efectivos en concentraciones micromolar, lo que revela que son poco selectivos y muchos de ellos bloquean además, a los hemicanales formados por panexinas (Verselis and Srinivas 2013). Por lo tanto, se necesitan con urgencia herramientas farmacológicas para aclarar aún más sus funciones y para validarlos como blancos farmacológicos para el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades basadas en la disfunción de las conexinas (Bodendiek and Raman 2010).
Actualmente se conocen varios moduladores de conexinas, pero la mayor parte ellos afectan simultáneamente la actividad de hemicanales y de canales formados por conexinas. Por otro lado, el uso de RNA antisentido o morfolinos que inhiben la expresión de conexinas eliminan la expresión tanto de hemicanales como de canales de uniones en hendidura. En consecuencia, los compuestos descritos en la técnica presentan una baja eficacia y mecanismos de acción inespecíficos o secundarios a la acción farmacológica en otros blancos terapéuticos que modifican la actividad de las conexinas (por ej., quinasas).
En el estado del arte existen, por ejemplo, las patentes o solicitudes de patente EP1469875, US7153822, WO2003063891 , US20040092429, US20070042964 y WO2006134494 que describen composiciones y métodos para modular la actividad de hemicanales formados por conexinas. Entre los mecanismos propuestos en tales documentos se encuentran la fosforilación de residuos de tirosina en el segmento C-terminal de la conexina 43, bloqueo de la unión de 2 hemicanales mediante el uso de compuestos peptidomiméticos que son similares a la zona de unión entre hemicanales, o regiones transmembrana de estos que modifican la formación de hemicanales. Sin embargo, estos compuestos no son selectivos por el transporte a través de hemicanales y también afectan canales en uniones en hendidura (gap- junctions) no siendo específicos.
Por otra parte, la solicitud de patente WO2007002139 reivindica un método de neuroprotección en células de retina mediante la disminución de la liberación de ATP mediada por conexinas en respuesta a una hipertensión local. En esta solicitud se especifica que los bloqueadores de hemicanales pueden ser mefloquina, ácido meclofenámico, ácido retinoico, ácido 18-alfa-glicirretinico, ácido flufenámico, ácido niflúmico, carbenoxolona, peptidomiméticos o combinaciones de ellos. Sin embargo, estos compuestos no son selectivos para hemicanales formados por conexinas ya que además bloquean canales de uniones en hendidura y el efecto farmacológico depende del transporte de ATP, el cual puede ser transportado por vía alternativas a los hemicanales.
En otros ejemplos, tales como la solicitud WO2009148613, se incluye el uso de oligonucleótidos antisentido, RNA de interferencia o siRNA, para inhibir la expresión tanto de los canales intercelulares localizados entres dos células, como de los hemicanales localizados en la superficie celular. Sin embargo, estos oligonucleótidos están dirigidos a modular específicamente la isoforma conexina 43 (en humano hay 20 otras conexinas) y solo permiten la formulación en formas farmacéuticas para la administración por vía transdérmica, intravenosa, o de depósito.
En la solicitud JP201 1506446 se describe el uso de anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos, que no son de utilidad en enfermedades inflamatorias crónicas ya que se pueden generar fuertes reacciones de rechazo o alérgicas. En vista de ello se hace manifiesto el gran interés en poder contar con fármacos que modulen la formación, apertura o actividades de los hemicanales formados por conexinas.
En la solicitud US201 10223204 se reivindica el uso de agentes moduladores que son oligonucleótidos antisentido, ribozimas, RNAi o siRNA con largos entre 15-35 nucleótidos y con al menos 70% de homología a la secuencia antisentido del mRNA de la conexina 43. Estos derivados biológicos son selectivos solo por la isoforma conexina 43 y su efecto evita tanto la formación de hemicanales como de canales de uniones en hendidura formados por conexina 43. El bloqueo de la formación de uniones en hendidura es un efecto lateral perjudicial para el normal funcionamiento de los órganos que expresan conexina 43. Además, dichos compuestos presentan las limitaciones generales de los oligonucleótidos, por ejemplo que no pueden administrarse por vía oral y deben formularse en otro tipo de formas farmacéuticas de administración intravenosa.
El documento US20090143425 describe compuestos derivados de quinolinas, que afectan las uniones en hendidura o "gap junctions". Sin embargo, estos compuestos no son inhibidores selectivos de hemicanales formados por conexinas.
La solicitud US20090163440 describe la modulación de canales iónicos, en particular canales compuestos por conexina 43, donde los fármacos utilizados para su modulación se eligen entre distintos reguladores de canales iónicos conocidos: amlodipino, bepridil, diltiazem, disopiramida, encainida, felodipino, galopamilo, isradipino, mexitilo, nicardipino, nifedipino, nimodipino, nitrendipino, procainamida, quinidina, tetrodotoxina, verapamilo. De todas las opciones descritas en el documento, solo quinidina presenta actividad sobre canales de conexinas, siendo esta inespecífica y de baja potencia.
En las solicitudes de patente US20120135960 y US201 10172188, se describe el uso de mefloquina, entre otros, como agente bloqueador de conexinas. Sin embargo, mefloquina es un bloqueador no selectivo de los canales de uniones en hendidura formados por las conexinas Cx26, Cx32, Cx36, Cx43, y Cx50. Este compuesto no inhibe selectivamente hemicanales formados por dichas conexinas.
Los documentos US20080131528, US20060228433 y US20080096854, describen el uso de composiciones que restablecen el funcionamiento de uniones en hendidura ("gap junctions"). Estas composiciones tienen como objeto promover la actividad de los canales en hendidura. Sin embargo, a tales compuestos no se les conoce un efecto inhibitorio de hemicanales formados por conexinas.
A partir de lo descrito, se desprende que en la actualidad, los bloqueadores de hemicanales formados por conexinas disponibles también inhiben las uniones en hendidura ("gap junctions"), que desempeñan un papel relevante en la coordinación de numerosas respuestas eléctricas y metabolicas en los tejidos. Por lo tanto, es deseable la obtención de compuestos bloqueadores específico de hemicanales, que no presenten efecto sobre los canales de las uniones en hendidura, que podrían ser útiles para diseñar racionalmente tratamientos terapéuticos para diversas enfermedades, minimizando los efectos secundarios no deseados. En cuanto a las metodologías de identificación de nuevas drogas, en el estado del arte existen diversos enfoques en la búsqueda de compuestos con mayor especificidad. Por ejemplo, el documento US2014141099 presenta métodos de descubrimiento de fármacos, particularmente, inhibidores de la quinasa Aurora y a un farmacóforo que describe compuestos que promueven un cambio conformacional en la proteína AuroraB y cuya constante de unión para el proceso de dos pasos es Ki* y también se refiere a compuestos que tienen las características del farmacóforo. Dicho método para seleccionar un inhibidor de Aurora B comprende las etapas de determinación de Ki; determinación de Ki* y selección de un compuesto con una relación de Ki/Ki* predefinida. Para la determinación de Ki * se preincuba el compuesto en estudio y la Aurora quinasa; se diluye la mezcla de ensayo y se determina Ki * durante un lapso de tiempo.
En cuanto a la búsqueda de compuestos con una mayor afinidad a determinado receptor, el documento de patente US8131527 muestra un método de identificación de un compuesto que es un modulador de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) con una mayor afinidad por FGFR que por VEGFR2, que comprende los pasos de diseño y/o selección de un modulador usando el farmacóforo representado por la fórmula dada, luego se genera una representación in silico de dicho modulador de la etapa (a); se generan las coordenadas atómicas de una proteína FGFR o una porción de la misma para al menos el bolsillo de unión alrededor de Asp641 ; ajuste de uno o más moduladores candidatos de acuerdo con la etapa (b) a uno o más residuos de FGFR para determinar la probabilidad de que el modulador candidato interactuar con FGFR, en el que los NH de la fórmula definida inicialmente forman un enlace de hidrógeno directo con uno o ambos de los oxígenos Asp641 del ácido carboxílico; opcionalmente se puede hacer la modificación del modulador en estudio basándose en el resultado de la etapa de montaje; y poner en contacto el modulador en estudio con FGFR y/o VEGFR2 para determinar la capacidad de dicho modulador candidato para interactuar con una afinidad preferente por uno de los receptores.
Por otra parte, en cuanto la solicitud de patente WO2004012683, en ella se divulga un método para identificar un compuesto terapéutico para una enfermedad causada por un organismo que tiene una proteína de dominio SET, que comprende analizar la capacidad de un compuesto en estudio para modular la actividad de al menos una región drogable de la proteína, en el que la capacidad de modular indica un compuesto terapéutico candidato.
Además, de tales documentos y de la información disponible en el estado del arte se desprende que no existen antecedentes que exploren metodologías efectivas y específicas para identificar y seleccionar compuestos capaces de modular la actividad de hemicanales formados por conexinas en forma selectiva.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Representación esquemática de la estructura básica de los hemicanales de conexina. La estructura secundaria de un hemicanal de conexina está compuesta por la disposición hexamérica de protómeros de conexina. Los dominios de cada protómero aparecen indicados con nombres y codificados por diferentes intensidades de grises e indicados con flechas. Los planos membrana aparecen representados en líneas negras.
Figura 2: Esquema de análisis de la evaluación biológica de los inhibidores sintéticos de hemicanales en donde los cultivos celulares Cx 43 se subcultivan en placas negras de 96 pocilios y se someten a los 3 análisis de captación de etidio indicados para ser evaluado como fluorescencia emitida en un fluorímetro.
Figura 3: Captación de etidio en HeLa Cx43-EGFP. Efecto del DCFS. A: Células en cultivo. B: Gráfico de captación de etidio en HeLa Cx43-EGFP. C: DCSF extracelular induce la entrada de etidio en Cx43, se muestra el efecto de DCSF, el cual fue bloqueado por la molécula inhibidora (MX) (10nM), (P<0,05, n=4).
Figura 4: Corrientes unitarias de los hemicanales formados por conexina 43 en células HeLa bañadas con solución salina sin ion calcio (o Ca ) y en presencia EGTA.
Figura 5: Porcentaje de incidencia de acoplamiento en función del tiempo.
Figura 6: Acoplamiento celular evaluado con transferencia de etidio. A. Efecto de los diferentes inhibidores en células Hel_a-Cx43 (transfectadas con conexina 43). B. índice de acoplamiento celular.
Figura 7: Estado funcional de los hemicanales formados por panexinal (Panxl ) activados por estrés mecánico.
DEFINICIONES
Cuando se describen los compuestos, composiciones y procedimientos de la invención los siguientes términos tienen los siguientes significados, a no ser que se indique de otro modo.
El término "Alquilo Ci-3" se refiere a una cadena hidrocarbonada que comprende de 1 a 3 átomos de carbono.
El término "Alcoxi Ci-3" se refiere a una cadena hidrocarbonada que comprende de 1 a 3 átomos de carbono unida a un átomo de oxígeno.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que necesita el tratamiento.
El término "tratamiento" tal y como se usa en la presente memoria, se refiere al tratamiento de una enfermedad o estado médico patológico en un paciente humano que incluye: (a) prevenir la aparición de enfermedad o estado médico patológico, es decir, el tratamiento profiláctico de un paciente;
(b) aliviar la enfermedad o estado médico patológico, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o estado médico patológico en un paciente;
(c) suprimir la enfermedad o condición médica patológica, es decir, ralentizar el desarrollo de la enfermedad o condición médica patológica en un paciente; o
(d) aliviar los síntomas de la enfermedad o condición médica patológica en un paciente.
La expresión "enfermedad o condición patológica asociada con actividad de conexinas" incluye todos los estados de enfermedad y/o estados que son reconocidos en la actualidad o que se encuentren en un futuro, que estén asociados con aumento de la actividad de hemicanales formados por las conexinas 26 y/o 43. Tales estados de enfermedad o condiciones incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmia, heridas crónicas, neuroprotección de retina, fibrosis, tratamiento de dolor, denervación de músculos esqueléticos, distrofias musculares, daño de la medula espinal y enfermedades genéticas que se caracterizan por un aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal preparada a partir de una base o ácido que es aceptable para administración a un paciente tal como un mamífero. Dichas sales pueden obtenerse de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables.
Sales derivadas de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, canfosulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico, xinafoico (ácido 1 -hidroxi-2-naftoico) y similares. Sales particularmente preferidas son las derivadas de los ácidos fumárico, bromhídrico, clorhídrico, acético, sulfúrico, metanosulfónico, xinafoico y tartárico.
Sales derivadas de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aluminio, de amonio, de calcio, de cobre, férricas, ferrosas, de litio, de magnesio, mangánicas, manganosas, de potasio, de sodio, de zinc y similares. Se prefieren de forma particular las sales de amonio, de calcio, de magnesio, de potasio y de sodio.
Sales derivadas de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo aminas sustituidas, aminas cíclicas, aminas de origen natural y similares, tales como, arginina, betaína, cafeína, colina Ν,Ν'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2- dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucosamina, histidina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.
El término "solvato" se refiere a un complejo o agregado formado por una o más moléculas de un soluto, es decir, un compuesto de la invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y una o más moléculas de disolvente. Dichos solvatos son de forma típica sólidos cristalinos que tienen una relación molar sustancialmente fija de soluto y disolvente. Disolventes representativos incluyen, a modo de ejemplo, agua, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético y similares. Cuando el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato.
El término "o una de sus sales farmacéuticamente aceptable o solvato de sus estereoisómeros" incluye todas las combinaciones de sales, solvatos y estereoisómeros, tal como un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de un estereoisómero de un compuesto de fórmula (A-G).
El término "región drogable" (druggable región), se usa en referencia a un ácido nucleico, un polipéptido, complejos y similares, se refiere a una región de una proteína conexina que forma hemicanales, que es un objetivo o es un objetivo probable para la unión un agente que reduce o inhibe la actividad del hemicanal. Para un polipéptido, una región drogable generalmente se refiere a una región en la que varios aminoácidos de un polipéptido serían capaces de interactuar con un agente. Para un polipéptido o complejo de los mismos, ejemplos de regiones drogables lo constituyen bolsillos y sitios de unión, las interfaces entre los dominios de un polipéptido, ranuras o complejo de superficie o contornos o superficies de un polipéptido o complejo que son capaces de participar en las interacciones con otras moléculas, tal como la membrana de la célula. En particular, una región drogable en las conexinas corresponderá a un bolsillo delimitado por los residuos correspondientes a los segmentos de los residuos 3-10 (NTH), 29-40 (TM1 ), 74-93 (TM2) de un protómero y los residuos 29-40 (TM1 ) de un protómero adyacente en la conexina 26 o los residuos equivalentes en otras conexinas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para identificar compuestos moduladores (bloqueadores) eficaces y específicos de hemicanales formados por conexinas, los compuestos identificados por esta metodología y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos.
En una realización de la invención, se proveen procedimientos de uso de dichos compuestos y elaboración de medicamentos útiles para tratar enfermedades asociadas con aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas, en particular en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmias, heridas crónicas, neuroprotección de retina, tratamiento de dolor, denervación de músculos esqueléticos, distrofias musculares, daño de la medula espinal y enfermedades genéticas que se caracterizan por un aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas.
El uso para tratar trastornos inflamatorios en un sujeto, comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la actividad, apertura, o transporte a través de un hemicanal formado por conexinas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se ha utilizado una metodología de identificación de fármacos basado en la estructura tridimensional de las dianas terapéuticas para resolver el problema técnico de obtener compuestos moduladores eficaces y específicos de hemicanales formados por conexinas. El objetivo de la presente estrategia de identificación de fármacos basados en estructuras aplicadas a conexinas es la obtención de nuevos agentes de modulación de hemicanales formados por conexinas con mayor afinidad y selectividad, que al ser específicos reduce los efectos secundarios en los pacientes.
La actividad biológica de los compuestos descritos fue verificada por medio de ensayos de permeabilidad de la membrana celular y mediciones de corrientes microscópicas.
El método para identificar compuestos inhibidores específicos de hemicanales formados por conexinas de acuerdo a la presente invención se inicia con el análisis de la estructura del blanco terapéutico de diferentes conexinas humanas y a partir de esta generar modelos comparativos de otras conexinas. Para preparar la proteína para el acoplamiento molecular, primero se completó la estructura cristalina del hemicanal formado por la conexina 26 humana.
Los modelos comparativos se fundamentaron en la hipótesis de que la unión de los compuestos a un bolsillo limitado por la dominio N-terminal helical (NTH), los segmentos transmembrana de las hélices TM1 y TM2 de un protómero y el segmentos transmembrana de las hélices TM1 del protómero adyacente impide los cambios conformacionales necesarios para generar la apertura/activación de los hemicanales formados por conexinas. Se generaron un total de 500 modelos de hemicanales formados por las conexinas 26 o 43 humanas, utilizando el programa Modeller v9.2 (Sali, 1995), y el mejor modelo seleccionado de acuerdo con la puntuación DOPE interna fue seleccionado para su posterior análisis y optimización. La validación de las estructuras se realizó utilizando las herramientas disponibles en el servidor web SAVES (http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES).
Antes del proceso de cribado virtual, la base de datos de compuestos químicos OpenNCI fue filtrada para eliminar las sales y los contraiones utilizando el programa FILTER v2.1 (OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM) y luego convertida en coordenadas 3D usando el programa OMEGA v2.4.6 (OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM) dando así una base de datos de aproximadamente 195.000 compuestos y confórmeros. Estos fueron sometidos a un protocolo de acoplamiento molecular exhaustivo en la estructura cristalina modificada del hemicanal formado por la conexina 26 y el modelo del hemicanal formado por la conexina 43, usando el programa FRED v2.2.5 (OpenEye Scientific Software, Santa Fe, NM). Los sitios de unión del hemicanal formado por la conexina 26 y el modelo de hemicanal formado por la conexina 43 se identificaron y prepararon usando el programa FRED receptor.
Se lleva a cabo una campaña de cribado virtual con el fin de identificar potenciales moduladores de hemicanales formados por conexina utilizando la estructura del hemicanal constituido de la conexina 26 humana, y en un modelo del hemicanal formado por la conexina 43 humano desarrollado mediante modelamiento comparativo usando la estructura de la conexina 26 humana como patrón.
Se obtuvieron los modos de unión candidatos de los ligandos en el sitio del receptor (100) optimizados usando la función de puntuación Chemgauss3. Las estructuras de consenso para los modos de unión del proceso de acoplamiento molecular exhaustivo y optimización fueron obtenidas por puntuación de consenso usando las funciones de evaluación PLP, Chemscore y Chemgauss3. Por último, los modos de unión para los 1 .000 compuestos mejor clasificados fueron minimizados con el campo de fuerza CHARMm22 en DiscoveryStudio v2.1 (Accelrys Inc., San Diego). El protocolo permite la minimización de las cadenas laterales de los residuos dentro de 6Á desde el centroide de masa de todos los ligandos acoplados, usando el algoritmo de gradiente conjugado hasta un criterio de convergencia de 0.001 Á kcal / mol para la desviación cuadrática media (RMS) del gradiente de energía.
La evaluación de la energía de unión se realizó para cada complejo obtenido usando las funciones de evaluación PLP, LigScore, PMF y LUDI. Para la identificación final de compuestos con potencial inhibidor, se utilizó el protocolo de puntuación de consenso disponible en Discovery Studio v2.1 A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron visualmente los resultados de los compuestos que presentaban los 100 mejores resultados y se seleccionaron 40 compuestos dentro de dicho grupo que mostraban la mayor afinidad frente a los hemicanales formados por conexina 26 o conexina 43.
Los compuestos se ensayan en experimentos basados en células deficientes en la expresión de hemicanales y transfectadas con diferentes conexinas para evaluar y/o confirmar su capacidad de modular el transporte a través de la membrana celular. Se evalúa el transporte de moléculas trazadoras de permeabilidad y se compara con inhibidores de canales formados por conexinas conocidos, tales como el ácido beta glicirriténico (BGA) y carbenoxolona (CBX).
Las células son incubadas en medio extracelular sin cationes divalentes para aumentar la probabilidad de apertura de los hemicanales formados por conexinas. Además se usan como control negativo células parentales que no expresan hemicanales y células transfectadas con panexinal y estimuladas mecánicamente para inducir la apertura de los hemicanales formados por panexina 1 .
Las moléculas que inhiben los hemicanales formados por conexinas se evalúan por su acción sobre los hemicanales formados por panexina 1 . Las moléculas que inhiben los hemicanales formados por conexinas en el rango nanomolar son estudiadas como posibles inhibidores de canales de uniones intercelulares utilizando la técnica de acoplamiento a colorantes y por medio de electrofisiología usando doble fijación de voltaje.
Si las moléculas no inhiben los canales intercelulares formados por conexinas en el rango milimolar y no afectan los hemicanales formados por panexina 1 , se les estudia su efecto inhibidor de corrientes de hemicanales formados por conexinas usando la metodología de fijación de voltaje en modalidad de célula completa.
La invención proporciona nuevos compuestos inhibidores de hemicanales formados por las conexinas 26 y/o 43.
Un objetivo de la presente invención es proveer un método para identificar compuestos con potencial inhibitorio sobre los hemicanales formados por conexinas, en que se utiliza un método de cribado virtual de ligandos sobre una estructura cristalográfica o un modelo comparativo de proteínas, correspondiente a un hemicanal formado por conexina 26 o conexina 43. El método se caracteriza por evaluar la energía de interacción de los compuestos en un sitio de unión delimitado por los residuos correspondientes a los segmentos de los residuos 3-10 (NTH), 29- 40 (TM1 ), 74-93 (TM2) de un protómero y los residuos 29-40 (TM1 ) de un protómero adyacente en la conexina 26 o los residuos equivalentes en otras conexinas.
El método de la presente invención permite determinar que los compuestos identificados inhiben la apertura/activación de hemicanales formados por conexinas inducida por ausencia de cationes divalentes en el medio extracelular o por la aplicación de voltajes positivos a la membrana celular y de esta manera evitan la dependencia del mecanismo que induce apertura de los hemicanales.
Otro objetivo de la invención es proveer una composición farmacéutica que comprende los compuestos identificados en una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más moduladores específicos de hemicanales formados por conexinas de acuerdo a la presente invención que acceden al sitio de acción en las células a tratar. Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la presente invención comprenden opcionalmente al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la invención es la utilización de uno o más moduladores de hemicanales formados por conexinas en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas a la sobre activación de hemicanales formados por la conexina 26 o la conexina 43, en que dichos moduladores de hemicanales formados por conexinas llegan al sitio de acción en dichas células.
Los compuestos obtenidos de acuerdo a la presente invención se pueden usar para elaborar un medicamento útil la prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmia, heridas crónicas, neuroprotección de retina, fibrosis, tratamiento de dolor, denervación de músculos esqueléticos, distrofias musculares, daño de la medula espinal y enfermedades genéticas que se caracterizan por un aumento de la actividad de hemicanales formados por conexinas, en que dichas composiciones comprenden cantidades terapéuticamente efectivas de uno o más agentes que inhiben la apertura/activación de hemicanales formados por conexinas en las células a ser tratadas.
Los compuestos identificados mediante el método de acuerdo a la presente invención bloquearon solo hemicanales y no canales intercelulares formados por conexinas ni los hemicanales formados por panexinal . Los nuevos compuestos inhibidores de hemicanales formados por conexinas identificados se unen directamente a los hemicanales, y presentan mejor eficacia y potencia que los compuestos descritos en el estado de la técnica.
En resumen, el método para obtener compuestos inhibidores específicos de hemicanales de conexina, de acuerdo a la presente invención comprende las etapas de:
• generar y validar modelos comparativos de hemicanales formados por las conexinas de interés; analizar la estructura y definir el sitio de interacción de la conexina de referencia;
generar un base de datos de compuestos químicos en formato tridimensional que contiene las cargas parciales y la geometría óptima de cada compuesto, eliminando las sales y contraiones;
realizar un cribado virtual para identificar moduladores de hemicanales formados por conexinas;
seleccionar compuestos bloqueadores de los hemicanales formados por conexinas basado en una función de energía que permite estimar la afinidad relativa de cada compuesto a la conexina de referencia; evaluar la capacidad de los compuestos de modular el transporte a través de la membrana celular en células deficientes en la expresión de hemicanales, transfectadas con diferentes conexinas respecto a compuestos inhibidores de referencia;
determinar que los compuestos identificados inhiben la apertura/activación de hemicanales formados por conexinas inducida por ausencia de cationes divalentes en el medio extracelular o por la aplicación de voltajes positivos a la membrana celular; y
clasificar las moléculas que inhibieron los hemicanales formados por conexinas según su acción sobre los hemicanales.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Las formulaciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los procedimientos incluyen la etapa de poner el ingrediente o ingredientes activos en contacto con el vehículo. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de modo uniforme el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos y a continuación, si se considera necesario, conformar el producto en la formulación deseada.
Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral se pueden presentar como cápsulas, comprimidos conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como un polvo o granulado; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida aceite en agua o emulsión líquida agua en aceite. El ingrediente activo también puede presentarse en forma de inyección, polvo medicinal mezclado con miel o sirope o pomada espesa.
Una formulación de jarabe consistirá por lo general en una suspensión o solución del compuesto o sal en un vehículo líquido.
Las formulaciones dérmicas y transdérmicas típicas comprenden un vehículo acuoso o no acuoso convencional, por ejemplo, una crema, pomada, loción o pomada espesa o están en forma de un emplasto, parche o membrana medicados.
EJEMPLOS Ejemplo 1 :
Ensayo de bloqueo de la apertura/activación de hemicanales formados por conexinas (26 o 43) in vitro Se ensayó la capacidad de diferentes moléculas trazadoras para evaluar la capacidad de los compuestos de disminuir el transporte de estas moléculas in vitro utilizando las células HeLa transfectadas con conexinas 26 o 43.
Tabla 1 : Porcentaje de inhibición al trazador de permeabilidad a una concentración de 5 μΜ.
% Inhibición
Actividad hemicanal (Cx26 o
Compuesto 43)
Ejemplo 1 (A) 0
Ejemplo 2 (B) 20
Ejemplo 3 (C) 0
Ejemplo 4 (D) 100
Ejemplo 5 (E) 100
Ejemplo 6 (F) 0
Ejemplo 7 (G) 0
Control (CBX, ABG) 100
El inhibidor más potente in vitro, resultó ser el ejemplo 4 con un ICso de 20 nM y una eficacia del 100%, seguido por el ejemplo 5 con un IC50 de 50 μΜ y una eficacia del 100%.
Como referencia se utilizó como control carbenoxolona o ácido beta-glicirretínico (CBX, ABG), un bloqueador de conexinas ampliamente utilizado, que mostró un IC50 de 100 μΜ y una eficacia del 100%.
Por lo tanto, los inhibidores de la presente invención muestran adecuada actividad bloqueadora de la apertura/activación de los hemicanales de conexina 26 y 43 in vitro.
Ejemplo 2:
Uso de un compuesto bloqueador de la actividad de hemicanales formados por la conexina 26 o la conexina 43.
El método comprende poner en contacto en forma selectiva o específica un hemicanal formado por las conexinas 26 o 43, con una cantidad terapéuticamente efectiva (en el rango nanomolar) de al menos dos de los siguientes compuestos: A:(fí)-2-(4-clorofenil)-2-oxo-1 -feniletilquinolina-2-carboxylato,
B:1 ,3-bis(4-(4-clorofenil)piperazin-1 -il)propano
C: Acido 2,2-bis([1 ,1 '-bifenil]-4-iloxi)acético.
D:(2fl,5S,8fl,9S,10S,13S,14S,17S)-2-fluoro-10,13-dimetil-3-oxohexadecahidro-1 H- ciclopenta[a]fenantren-17-il benzoato.
E:(3S,5S,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-3-acetoxi-10,13-dimetilhexadecahidro-1 H- ciclopenta[a]fenantren-17-il ciclohexanocarboxilato.
F:(3S,8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-etinil-17-hidroxi-10,13-dimetil-
2,3,4,7,8,9,10,1 1 ,12,13,14, 15,16,17-tetradecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3- ciclohexilpropanoato.
G: bis(4-metil-2-morfolinoquinolin-6-il)metano.
Figure imgf000021_0001
Los mejores resultados se obtienen para A y D, ya que resultaron ser potentes inhibidores de hemicanales formados por conexinas, y no afectan los canales de uniones en hendidura o los hemicanales formados por panexinas. Ejemplo 3: Evaluación Biológica
Se utilizan células HeLa transfectadas con conexinas 26 o 43 de ratón. Para evaluar la actividad de cada compuesto sobre los hemicanales de conexinas, 103 células HeLa transfectadas con conexinas son sembradas por pocilio en placas multipocillo (90) 24 h antes de cada experimento. Luego las células son lavadas solución de Locke que contiene niveles normales de cationes divalentes (Ca2+ and Mg2+) o una solución de Locke libre de cationes divalente que contiene 5 μΜ de bromuro de etidio. En paralelo, las células son tratadas con diferentes concentraciones de cada compuesto candidato e incubado por 5 min.
Como lo indica el esquema de la Figura 2, las células HeLa transfectadas con conexina 43 (Cx43) son sembradas en placas multipocillo (96 pocilios) y después de 24 h se evalúa la captación de etidio en presencia de medio libre de cationes (DCFS) en presencia o ausencia del compuesto de interés. La captación de etidio se evalúa como fluorescencia emitida que se mide con un fluorímetro. Si el valor de fluorescencia en presencia del inhibidor es igual o cercano al medido en células bañadas con solución que contiene cationes divalentes, el compuesto corresponde aun inhibidor de hemicanales formados por conexinas. Por el contrario si el valor de fluorescencia emitido por células expuestas a posible inhibidor en DCFS es igual a las de células bañadas solo con DCFS (sin compuesto de interés), el compuesto no es inhibidor de hemicanales formados por conexinas. El mismo ensayo se realiza con diferentes concentraciones de cada compuesto para determinar la mínima concentración efectiva (EC50).
En la Figura 3, el panel superior izquierdo (A) corresponde a una microfotografía de fase donde se aprecian las células HeLa que expresan conexina 43 conjugada con proteína fluorescente verde (EGFP) presentes en el campo microscópico. A la derecha se ilustra la fluorescencia indicando que todas las células del campo expresan conexina 43. En el panel inferior izquierdo se muestra la captación de etidio en condiciones básales (presencias de Ca2+ en el medio extracelular) y en el panel inferior derecho se muestra la captación de etidio a los 5 minutos de haber cambiado la solución extracelular por una sin cationes divalentes (DCFS), que aumenta la actividad de los hemicanales. En el gráfico en (B) se muestra la actividad de los hemicanales como "Dye uptake" (captación de colorante) en unidades arbitrarias (Arbitrary Units. AU) en al menos 40 células bañadas en medio control, seguido de DCFS, aplicación de 10 nM molécula inhibidora (fl)-2-(4-clorofenil)-2- oxo-1 -feniletilquinolina-2-carboxylato (compuesto 4 o molécula inhibidora), lavado con DCFS y seguido de una nueva aplicación de 10 nM de molécula inhibidora (MX). Claramente la molécula inhibidora inhibe la actividad de los hemicanales evaluado como captación de etidio (Dye uptake). En el panel (C) se muestra que la velocidad o tasa de captación de etidio por minuto es completamente inhibido por la molécula inhibidora y su efecto es parcialmente revertido con el lavado con DCFS.
La corrientes unitarias de los hemicanales formados por conexina 43 son muy frecuentes en células HeLa bañadas con solución salina sin ion calcio (o Ca2+) y en presencia EGTA, un agente quelante de Ca2+ (Ver la Figura 4, los dos trazos superiores). Sin embargo la aplicación de 10 nM del compuesto 4 (molécula inhibidora) inhibió drásticamente la actividad de los hemicanales formados por conexina 43 (dos trazos inferiores 1 y 3).
La Figura 5 ilustra que las células transfectadas con conexina 26 se encuentra muy bien acopladas por canales de uniones en hendidura. La incidencia de acoplamiento celular evaluado con microinyecciones de amarillo de Lucifer es cercano a 100% (cuadros negros). Además, muestra que la adición de 1 mM de compuesto 4 no reduce significativamente la incidencia de acoplamiento (cuadros blancos), indicando que no afecta el estado funcional de los canales de uniones en hendidura formados por conexina 26.
La Figura 6 ilustra que la aplicación de 1 mM compuesto 4 (molécula inhibidora) no inhibe el acoplamiento celular mediado por canales de uniones en hendidura, mientras que otros compuesto evaluados inhiben parcialmente o totalmente los canales de uniones en hendidura formados por conexina 43. El estado funcional de los hemicanales formados por panexina 1 (Panxl , Figura 7) activados por estrés mecánico no es inhibido por la aplicación de 100 nM del compuesto 4 pero si es totalmente bloqueado por la aplicación de 5 μΜ carbenoxolona. Este resultado indica que concentraciones del rango nanomolar del compuesto 4 inhiben los hemicanales formados por conexinas y no los formados por panexina 1 y que además el compuesto no inhibe a los canales de uniones en hendidura formados por conexina. Por lo tanto, el compuesto es un inhibidor de hemicanales formados por conexinas altamente específico.
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Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método para identificar compuestos inhibidores específicos de hemicanales de conexina, CARACTERIZADO porque comprende:
a) analizar la estructura de la conexina de referencia;
b) generar modelos comparativos de conexinas;
c) realizar un cribado virtual para identificar moduladores de hemicanales formados por conexina;
d) evaluar la capacidad de los compuestos de modular el transporte a través de la membrana celular en células deficientes en la expresión de hemicanales, transfectadas con diferentes conexinas respecto a compuestos inhibidores de referencia; y
e) clasificar las moléculas que inhibieron los hemicanales formados por conexinas según su acción sobre hemicanales.
2. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque las conexinas de referencia corresponden a las conexinas 26 y/o 43.
3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa
(a) la conexina de referencia es conexina 26 humana.
4. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa
(b) el modelo comparativo se basa la evaluación de la energía de interacción en el dominio que impide los cambios conformacionales para generar la apertura/activación de los hemicanales formados por conexina.
5. Método de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la energía de interacción se evalúa en el dominio definido por la hélice N-terminal (NTH) y los segmentos transmembrana de las alfa hélices 1 y 2 de un protómero de conexina y el segmento transmembrana de la alfa hélice 1 de otro protómero en un hemicanal.
6. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa (c) el cribado virtual se realiza utilizando la estructura del hemicanal constituido por la conexina de referencia y un modelo del hemicanal formado por una conexina de comparación mediante modelamiento comparativo usando como patrón la estructura de la conexina de referencia.
7. Método de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque en la etapa (c), la conexina de comparación es la conexina 43.
8. Método de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque en la etapa
(c) , el cribado virtual de ligandos utilizado es sobre una estructura cristalográfica o un modelo comparativo de proteínas correspondiente a un hemicanal de conexina 26, 43 u otra.
9. Método de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque se evalúa la energía de interacción de los compuestos en un sitio de unión delimitado por los residuos correspondientes a los segmentos de los residuos 3-10 (NTH), 29-40 (TM1 ), 74-93 (TM2) de un protómero y los residuos 29-40 (TM1 ) de un protómero adyacente en la conexina 26 o los residuos equivalentes en otras conexinas.
10. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa
(d) , los inhibidores de referencia son el ácido beta glicirriténico (BGA), la carbenoxolona (CBX) o mezclas de ellos.
1 1 . Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa (d), la evaluación se realiza utilizando células incubadas en medio extracelular sin cationes divalentes.
12. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa (d), se usó un control negativo de células parentales que no expresan hemicanales de conexina.
13. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa (d), se utilizan como control células transfectadas con panexina 1 .
14. Método de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque en la etapa (d), las células son estimuladas mecánicamente para inducir la apertura de los hemicanales formados por panexina 1 .
15. Método de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en la etapa (d), se ponen en contacto células con al menos un compuesto seleccionado en el sitio de unión delimitado por los residuos correspondientes a los segmentos de los residuos 3-10 (NTH), 29-40 (TM1 ), 74-93 (TM2) de un protómero y los residuos 29-40 (TM1 ) de un protómero adyacente en la conexina 26 o los residuos equivalentes en otras conexinas y detectar un cambio en la permeabilidad de los hemicanales de Cx26 o Cx43 al trazador, en el que el cambio en la permeabilidad de trazador es indicativo de la modulación del hemicanal por un compuesto.
16. Uso de compuestos inhibidores específicos de hemicanales de conexina, obtenidos de acuerdo al método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque sirve para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas a la sobre activación de hemicanales de conexina 26 o 43.
17. Uso de compuestos inhibidores específicos de hemicanales de conexina, obtenidos de acuerdo al método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque sirve para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias, desordenes vasculares, arritmia, heridas crónicas, neuroprotección de retina, fibrosis, tratamiento de dolor.
18. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 16 o 17, CARACTERIZADO porque el medicamento contiene uno o más inhibidores específicos de hemicanales de conexina seleccionados de entre derivados de quinolina o de ciclopentafenantreno o combinaciones de ellos.
19. Uso de acuerdo a la reivindicación 18, CARACTERIZADO porque el derivado de quinolina es (R)-2-(4-(clorofenil)-2-oxo)-1 -feniletilquinolina-2-carboxilato.
20. Uso de acuerdo a la reivindicación 18, CARACTERIZADO porque el derivado de ciclopentafenantreno es (2R,5S,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-2-fluoro-10,13-dimetil- 3-oxodecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantreno-17-il-benzoato.
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