WO2015172215A1 - Selante de fibrina para uso tópico, método de formação do mesmo e seu uso - Google Patents

Selante de fibrina para uso tópico, método de formação do mesmo e seu uso Download PDF

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WO2015172215A1
WO2015172215A1 PCT/BR2015/000065 BR2015000065W WO2015172215A1 WO 2015172215 A1 WO2015172215 A1 WO 2015172215A1 BR 2015000065 W BR2015000065 W BR 2015000065W WO 2015172215 A1 WO2015172215 A1 WO 2015172215A1
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fibrin sealant
cryoprecipitate
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serinoprotease
fibrinogen
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Rui SEABRA FERREIRA JUNIOR
Benedito BARRAVIERA
Silvia Regina SARTORI BARRAVIERA
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Universidade Estadual Paulista Júlio De Mesquita Filho - Unesp
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Definitions

  • the present invention is in the medical field, more precisely as regards tissue repair, and describes a fibrin sealant.
  • the fibrin sealant described herein comprises a serinoprotease, which is extracted from the venom of the snake Crotalus durissus terrificus, a fibrinogen rich cryoprecipitate extracted from buffaloes and the calcium chloride diluent.
  • the invention further teaches the method of sealant formation, the components of which are provided separately and polymerize in situ after mixing as well as their use.
  • the fibrin sealant described has numerous topical medical applications and there is no risk of transmitting infectious diseases.
  • sealant should be of animal origin, thus avoiding the transmission of infectious diseases carried by human blood.
  • this invention proposes a fibrin sealant, which mimics the final stage of the coagulation cascade.
  • an animal-derived fibrinogen-rich cryoprecipitate and a thrombin-like enzyme, also known as serinoprotease (SPase), are used. extracted from the venom of a snake.
  • Cryoprecipitate is the cold-precipitated insoluble fraction of fresh frozen plasma. It contains fibrinogen, factor VIII (F VIII ⁇ , von Willebrand factor (F vW), factor XIII (F XIII) and fibronectin.
  • the main indications for cryoprecipitate are to replace fibrinogen in patients with congenital or acquired isolated fibrinogen hemorrhages and deficits, replace fibrinogen in patients with disseminated intravascular coagulation and severe hypofibrinogenemia, replace factors XIII and von Willebrand when industrial concentrate is not available and, finally, compose the autologous or heterologous fibrin sealant formula for topical use.
  • SPases act on the hemostatic system by cleaving the fibrinogen molecule into fibrin monomers. In the presence of calcium, they polymerize and acquire a sealing and adhesive capacity by the formation of a stable clot.
  • the venom is subjected to fractionation techniques using high performance liquid chromatography (HPLC) and finally the purity of serinoprotease of interest is evaluated by sequencing and mass spectrometry techniques in order to obtain obtain a pure, safe and serinoprotease free from undesirable substances to the human body.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the venom composition of Crotalus durissus terrificus snakes is complex and consists of enzymes, toxins and peptides.
  • Resin column spinning reveals the enzymes 5-nucleotidases, phosphodiesterases, thrombin-like enzyme, 1-aminoxidases, kallikrein activity enzymes NAD tissue and hydrolase.
  • crotamine crotapotin
  • phospholipase A2 convulxine and gyroxine.
  • the latter belongs to the group of thrombin-like enzymes and also to a larger group of serinoprotease enzymes, characterized by having a common catalytic site by a mechanism involving a highly reactive serine active amino acid present at position 195.
  • FIG. 1 The theoretical modeling of Crotalus durissus terrificus serxnoprotease is shown in Figure 1.
  • the monomeric globular structure has two alpha helix structures (in red) containing residues 145-152 and 215-227; two ⁇ -barrel structures formed by six antiparallel leaves (in yellow) and loops (in green); five disulfide bridges (in blue) and the catalytic triad (in orange).
  • This molecule is a single chain protein with an estimated molecular mass of 34 kDa. Its stability depends on pH, being maximum at pH 8.0. It has maximum activity at pH 4.0.
  • EP 0,592,242 B1 refers to a fibrin composition comprising any form of fibrin monomer that can be converted to polymer. Also, the monomer should not polymerize for at least 1.5 minutes after preparation of the composition.
  • European document EP 2.010.238 A2 describes a fibrin sealant, the purpose of which is to accelerate the tissue regeneration process.
  • the liquid composition comprises fibrin monomers or polymers, a fibrinogen binding agent and a polyglycosamine based material.
  • US5739288A describes different fibrin sealant compositions. More . Specifically, the invention relates to the use of a fibrin sealant, wherein a composition comprising non-crosslinked fibrin or fibrin monomer used as homeostatic agents.
  • This invention describes a fibrin sealant which comprises a serinoprotease extracted from Crotalus durissus venom. terrificus, a tibrinogen-rich cryoprecipitate extracted from buffalo and the calcium chloride diluent.
  • the invention further teaches the method of sealant formation and its use, in which the components are separately provided and polymerized in situ after mixing, being applied over the skin wound providing an action adjuvant in its healing.
  • Figure 1 represents the theoretical structure of serinoprotease from Crotalus durissus terrificus venom.
  • Figure 2 shows fibrin sealant applied topically to a chronic dermal ulcer.
  • This invention discloses a fibrin sealant which comprises a serinoprotease, a fibrinogen rich cryoprecipitate and a diluent in the ratio for topical use of 0.4: 1: 0.6.
  • the sealant is formed in situ by polymerization of the three components after mixing.
  • the invention teaches sealant formation.
  • the three components are individually supplied in separate vials and frozen at -20 ° C until use.
  • the vials should be removed from the freezer and kept at room temperature (between 15 and 25 ° C) for 10 to 20 minutes for thawing.
  • Serinoprotease is extracted from snake venom and is present in a concentration ranging from 4.3 to 5.3 mg / mL.
  • the snake is Crotalus durissus terrificus.
  • Cryoprecipitate is extracted from the blood (plasma) of large animals, preferably buffaloes.
  • the cryoprecipitate of this invention comprises:
  • the diluent used is calcium chloride in a concentration between 20 and 30 mM, preferably 25 mM.
  • the diluent content is injected into the vial. containing the serinoprotease, shaken and then set aside.
  • Fibrin sealant may be denatured upon contact with solutions containing alcohol, iodine or heavy metals (such as an antiseptic solution). Therefore, they must be removed before applying the product.
  • cryoprecipitate was analyzed by two-dimensional electrophoresis (20 ⁇ , a tool responsible for isolating and identifying proteins by their molecular masses and isoelectric points on polyacrylamide gel.
  • beta chain fibrinogen There are three classes of fibrinogen called beta chain fibrinogen, alpha chain and partial forms of alpha chain fibrinogen, totaling 40 different forms of the molecule.
  • histidine-deficient Salmonella strains were used, as well as mutations that increase the sensitivity to detect mutagens, such as rfa mutation, uvrB deletion, and pkMIOl plasmid.

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Abstract

A presente invenção descreve um selante de fibrina, o qual compreende uma serinoprotease extraída a partir de veneno de serpente, um crioprecipitado rico em fibrinogênio extraído de bubalinos e o diluente cloreto de cálcio. A invenção ainda ensina o método de formação do selante, cujos componentes são providos separadamente e polimerizam- se in situ após mistura, bem como seu uso. 0 selante de fibrina descrito apresenta inúmeras aplicações médicas tópicas e não há o risco de transmitir doenças infecciosas.

Description

SELANTE DE FIBRINA PARA USO TÓPICO , MÉTODO DE FORMAÇÃO DO
MESMO E SEU USO
Campo da Invenção :
[1] A presente invenção se insere no campo médico, mais precisamente no que diz respeito à reparação tecidual, e descreve um selante de fibrina.
[2] O selante de fibrina ora descrito compreende uma serinoprotease, a qual é extraída a partir do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, um crioprecipitado rico em fibrinogênio extraído de bubalinos e o diluente cloreto de cálcio.
[3] A invenção ainda ensina o método de formação do selante, cujos componentes são providos separadamente e polimerizam-se 'in situ após a mistura, bem como seu uso.
[4] O selante de fibrina descrito apresenta inúmeras aplicações médicas tópicas e não há o risco de transmitir doenças infecciosas.
Fundamentos da invenção:
[5] A tentativa de utilizar agentes hemostáticos e adesivos tópicos em procedimentos cirúrgicos e em feridas crónicas é prática comum há muitos anos.
. [6] Assim,, a. busca por uma substância adesiva com excelente efeito hemostático e que proporcionasse aderência firme entre os tecidos, além de não alterar o processo de reparação tecidual e não desencadear efeitos colaterais, e ação carcinogênica é uma constante.
[7] As primeiras pesquisas datam da Segunda Guerra Mundial, quando foi proposta pela primeira vez a cola de fibrina. Naquela época, utilizavam-se o fibrinogênio e a trombina humanos, os quais eram misturados no local de aplicação durante o procedimento.
[8] Por volta de 1940, avaliou-se uma cola produzida a partir de plasma enriquecido com fibrinogênio heterólogo. Em 1944, utilizou-se plasma enriquecido com fibrinogênio homólogo. Estes experimentos não tiveram sucesso.
[9] Em 1970, voltou-se a reavaliar a proposta da cola de fibrina e, nessa época, já se conheciam os princípios básicos de extração do crioprecipitado, um composto rico em fibrinogênio e fator XIII, bem como outros fatores de coagulação.
[10] Além disso, a purificação da trombina proveniente do sangue de animais também já estava padronizada. Assim, a proposta deste novo adesivo era misturar o crioprecipitado rico em fibrinogênio extraído de seres humanos com trombina bovina .
[11] Posteriormente, com o conhecimento da transmissão de doenças infecciosas por intermédio de produtos derivados do sangue humano, verificou-se a transmissão dos vírus das hepatites pelo adesivo e, em 1978, o FDA {do inglês Food and Drug Administration) suspendeu a comercialização deste em território americano, vindo a ser liberado apenas em 1998.
[12] Hoje se comercializa um produto extraído a partir de plasma e fatores de coagulação humanos acrescido ou não de agente antifibrinolítico. Este produto é indicado para procedimentos cirúrgicos como cirurgias cardiovasculares, pulmonares, abdominais e neurológicas, além de curativos tópicos para feridas crónicas.
[13] A partir dos anos 90, estudos para padronizar um novo tipo de selante foram iniciados. O selante deveria ser de procedência animal, evitando-se assim, a transmissão das doenças infecciosas veiculadas pelo sangue humano.
[14] Sendo assim, esta invenção propõe um selante de fibrina, o qual mimetiza a etapa final da cascata da coagulação .
[15] Para tal fim, utiliza-se um crioprecipitado rico em fibrinogênio de origem animal e uma enzima trombina símile, também conhecida como serinoprotease (SPase) , extraída do veneno de uma serpente.
[16] O crioprecipitado consiste na fração insolúvel, precipitada a frio, do plasma fresco congelado. Contém fibrinogênio, fator VIII (F VIII}, fator de von Willebrand (F vW) , fator XIII (F XIII) e fibronectina . As principais indicações do crioprecipitado são para repor fibrinogênio em pacientes com hemorragias e déficits isolados congénitos ou adquiridos de fibrinogênio, repor fibrinogênio em pacientes em coagulação intravascular disseminada e com graves hipofibrinogenemias , repor fatores XIII e de von Willebrand quando não se dispuser do concentrado industrial e, por fim, compor a fórmula do selante de fibrina autólogo óu heterólogo para uso tópico.
[17] As SPases atuam sobre o sistema hemostático, clivando a molécula de fibrinogênio em monômeros de fibrina. Na presença do cálcio, estas se polimerizam e adquirem uma capacidade selante e adesiva pela formação de um coágulo estável.
[18] A partir do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus é extraído e processado a fração de interesse de acordo com a dosagem proteica, seguido de liofilização .
[19] Posteriormente, o veneno é submetido às técnicas de fracionamento por intermédio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e, por fim, é avaliada a pureza da serinoprotease de interesse por técnicas de sequencíamento e espectrometria de massas, a fim de se obter uma serinoprotease pura, segura e isenta de substâncias indesejáveis para o organismo humano.
[20] A composição do veneno das serpentes Crotalus durissus terrificus é complexa e constituída de enzimas, toxinas e peptídeos.
[21] O f acionamento em coluna de resina revela as enzimas 5-nucleotidases, fosfodiesterases, enzima tipo trombina, 1-aminoxidases, enzimas com atividade calicreina tecidual e hidrolase do NAD.
[22] As demais frações presentes são: crotamina, crotapotinã, fosfolipase A2, convulxina e giroxina. Esta última pertence ao grupo das enzimas trombina símile e, também, a um grupo maior de enzimas serinoproteases, que se caracterizam por apresentar um sítio catalítico comum por meio de um mecanismo que envolve um aminoácido ativo serina altamente reativo e presente na posição 195.
[23] No seu sítio ativo, existe uma tríade catalítica semelhante aquela presente na tripsina, a qual é formada pelo agrupamento dos aminoácidos Ser 195, His 57 e Asp 102.
[24] A modelagem teórica da serxnoprotease de Crotalus durissus terrificus é mostrada na Figura 1. A estrutura globular monomérica apresenta duas estruturas alfa-hélice (em vermelho), contendo os resíduos 145-152 e 215-227; duas estruturas β-barris formada por seis folhas antiparalelas (em amarelo) e loops (em verde) ; cinco pontes dissulfeto (em azul) e a tríade catalítica (em laranja).
[25] Esta molécula é uma proteína de cadeia única, com massa molecular estimada em 34 kDa. A sua estabilidade depende do pH, sendo máxima no pH 8,0. Possui atividade máxima em pH 4.0.
[26] Não é alterada por congelamento e descongelamento ou tratamento térmico a 40 °C durante 15 minutos. Devido a sua atividade enzimática semelhante à trombina, atua sobre o fibrinogênio humano e animal clivando a cadeia alfa próxima ao N-terminal.
[27] Os monômeros de fibrina resultantes polimerizam- se em uma rede intensa e estável, que difere da produzida tradicionalmente pela trombina.
[28] Como aplicação médica, o selante ora proposto não apresenta risco de transmissão de doenças infecciosas. No âmbito da mutagenicidade, por sua vez, os testes realizados indicaram ausência de atividade mutagênica. Estado da técnica :
[29] Documentos disponíveis no estado da técnica descrevem diferentes selantes de fibrina, os quais são utilizados em procedimentos cirúrgicos e feridas crónicas.
[30] No documento EP 0.592.242 BI, faz-se referência a uma composição de fibrina compreendendo qualquer forma de monômero de fibrina que possa ser convertida em polímero. Ainda, o monômero não deve se polimerizar por pelo menos 1,5 minutos após o preparo da composição.
[31] O documento europeu EP 2.010.238 A2 descreve um selante de fibrina, cujo objetivo é acelerar o processo de regeneração tecidual. A composição líquida compreende monômeros ou polímeros de fibrina, um agente ligante de fibrinogênio e um material â base de poliglicosamina .
[32] No documento US5739288A descreve diferentes composições de selantes de fibrina. Mais. especificamente, a invenção relaciona-se com a utilização de um selante de fibrina, no qual uma- composição que compreende monômero de fibrina ou de fibrina não reticulada utilizado como agentes homeostáticos .
[33] Nenhum dos documentos citados propõe um selante de fibrina tal como o descrito na presente invenção. Ainda, o selante de fibrina descrito apresenta inúmeras aplicações médicas e não há o risco de transmitir doenças infecciosas.
Breve descrição da invenção:
[34] Esta invenção descreve um selante de fibrina, o qual compreende uma serinoprotease extraída a partir do veneno da Crotalus durissus . terrificus, um crioprecipitado rico em tibrinogênio extraído de bubalinos e o diluente cloreto de cálcio.
[35] A invenção ainda ensina o método de formação do selante e seu uso, no qual os componentes são providos separadamente e polimerizam-se in situ após mistura, sendo aplicados sobre a ferida cutânea proporcionando uma ação adjuvante na sua cicatrização.
Breve descrição das figuras:
[36] A Figura 1 representa a estrutura teórica da serinoprotease proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus.
[37] A Figura 2 mostra o selante de fibrina aplicado topicamente sobre uma úlcera dérmica crónica.
Descrição detalhada da invenção:
[38] Esta invenção descreve um selante de fibrina, o qual compreende uma serinoprotease, um crioprecipitado rico em fibrinogênio e um diluente, na proporção para utilização tópica de 0,4:1:0,6. 0 selante é formado in situ, pela polimerização dos três componentes após mistura.
[39] Além disso, a invenção ensina a formação do selante. Os três componentes são providos individualmente, em frascos separados, e congelados a -20 °C até o seu uso. Os frascos deverão ser retirados do freezer e mantidos a temperatura ambiente (entre 15 e 25 °C) durante 10 a 20 minutos para descongelamento.
[40] A serinoprotease é extraída a partir do veneno de uma serpente e está presente em uma concentração que varia entre 4,3 e 5,3 mg/mL. Em uma modalidade preferida da invenção, a serpente é a Crotalus durissus terrificus .
[41] 0 crioprecipitado é extraído do sangue (plasma) de grandes animais, preferencialmente bubalínos.
[42] O crioprecipitado desta invenção compreende:
- fibrinogênio em concentração entre 0,7 e 1,4 dg/mL;
- fator V em concentração entre 70 e 200 UI/dL;
- fator VIII em concentração entre 100 e 700 U∑/dL; e
- fator de von Willebrand em concentração entre 50 e 500 UI/dL.
[43] O diluente utilizado é o cloreto de cálcio em concentração entre 20 e 30 mM, preferencialmente 25 mM.
[44] O conteúdo do diluente é injetado no frasco contendo a serinoprotease, agitado e reservado em seguida.
[45] Com outra seringa e agulha, todo o conteúdo do crioprecipitado é aspirado e, concomitantemente, realiza-se a aplicação tópica com as duas seringas em paralelo e biseis dirigidos para o local de interesse.
[46] Segundos depois, observa-se a formação de um coágulo translúcido, que corresponde ao selante de fibrina (vide figura 2 ) .
[47] O selante de fibrina pode ser desnaturado após contato com soluções contendo álcool, iodo ou metais pesados (tais como uma solução antisséptica) . Logo, estas devem ser removidas antes da aplicação do produto.
Crioprecipitado:
[48] Para assegurar de que o crioprecipitado é seguro e isento de qualquer substância estranha ou indesejável ao organismo humano, faz-se necessário selecionar e certificar a sanidade dos animais doadores.
[49] Logo, o manejo sanitário (vacinas e vermifugação, testes sorológicos diagnósticos e de tuberculinização, além de exames clínicos) deve ser realizado com frequência.
[50] Após extraído, o crioprecipitado foi analisado por eletroforese bidimensional (20} , ferramenta responsável por isolar e identificar proteínas por meio das suas massas moleculares e pontos isoelétricos em gel de poliacrilamida .
[51] O perfil protéico do crioprecipitado extraído de bubalinos apresenta as diferentes formas de fibrinogênio, proteína responsável pela formação do coágulo estável de fibrina .
[52] Existem três classes de fibrinogênio denominadas fibrinogênio de cadeia beta, de cadeia alfa e formas parciais do fibrinogênio de cadeia alfa, totalizando 40 diferentes formas da molécula.
Toxicologia e mutagenicidade:
[53] Para analisar a viabilidade do selante de fibrina da invenção, foram realizados testes de toxicidade, bem como testes de mutagenicidade .
- Toxicologia:
[54] Para analisar a toxicologia do selante de fibrina desta invenção, foram realizados os testes de determinação da DL50 oral em ratos com a serinoprotease e determinação da sensibilidade dérmica em cobaios com a serinoprotease e o crioprecipitado .
[55] Para ambos os experimentos realizados, não houve sensibilização a levar ao quadro de choque nos animais experimentados .
- Mutagenicidade:
[56] Para avaliar a mutagenicidade do selante aqui descrito, foi realizado o teste de AMES et al., que utiliza linhagens de Salmonella typhimurium capazes de detectar produtos químicos que causam mutações gênicas por deslocamento do quadro de leitura ou por substituição dos pares de base de DNA.
[57] Para isto, foram usadas linhagens de Salmonella deficientes em histidina, além de mutações que aumentam a sensibilidade em detectar mutágenos, tais como mutação rfa, deleção uvrB e plasmídio pkMIOl.
[58] Os resultados mostraram que a frequência normal de mutações reversas, típica da linhagem de Salmonella, não sofreu alterações quando em presença da serinoprotease, nem em presença do crioprecipitado, um indicativo de que os componentes do selante de fibrina não apresentam atividade mutagênica .
[59] Os resultados obtidos mostram que o selante de fibrina da presente invenção é seguro e eficaz, favorece sobremaneira a hemostasia, tem bom desempenho como adesivo, é biocompatível e bioabsorvível, é menos alergênico que a sutura convencional e não altera a reparação tecidual, bem como não ocasionou eventos adversos decorrentes do uso, nem toxicidade local ou sistémica

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Selante de fibrina para uso tópico caracterizado por compreender uma serinoprotease, um crioprecipitado rico em fibrinogênio e um diluente, na proporção de 0,4:1:0,6.
2. Selante de fibrina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a serinoprotease ser extraída a partir do veneno de uma serpente e estar presente em uma concentração que varia entre 4,3 e 5,3 mg/mL.
3. Selante de fibrina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da serpente ser a Crotalus durissus terrificus.
4. Selante de fibrina, de acordo com a reivindicação 1, caracter zado pelo fato de o crioprecipitado ser extraído do sangue de grandes animais, preferencialmente bubalinos.
5. Selante de fibrina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o crioprecipitado compreender:
- fibrinogênio em concentração entre 0,7 e 1,4 dg/mL;
- fator V em concentração entre 70 e 200 UI/dL;
- fator VIII em concentração entre 100 e 700 UI/dL; e
- fator de von Willebrand em concentração entre 50 e 500 UI/dL.
5. Selante de fibrina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o diluente ser o cloreto de cálcio em concentração entre 20 e 30 mM, preferencialmente 25 mM.
7. Selante de fibrina, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de os componentes serem providos individualmente e polimerizarem-se in situ após mistura.
8. Método de formação do selante de fibrina conforme definido nas reivindicações 1 a 7, carac erizado por compreender as etapas de:
a) descongelamento dos componentes em temperatura entre 15 e 25 °C durante 10 a 20 minutos; b) injeção do diluente na serinoprotease, seguida de agitação e reserva;
c) aplicação concomitante e em paralelo da mistura de diluente e serinoprotease com o crioprecipitado; e
d) formação do coágulo translúcido.
9. Uso do selante de fibrina conforme definido nas reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser no preparo de um coágulo translúcido para ser aplicado topicamente em lesões em necessidade de reparação tecidual.
PCT/BR2015/000065 2014-05-12 2015-05-08 Selante de fibrina para uso tópico, método de formação do mesmo e seu uso WO2015172215A1 (pt)

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