WO2015167011A1 - ヒト抗体を産生する細胞 - Google Patents

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heavy chain
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修一 橋本
智朗 内木
滋久 川田
健二郎 浅越
崇吏 矢吹
瞳 佐野
俊輔 宮井
高橋 直樹
亜希 武居
篤志 澤田
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株式会社カイオム・バイオサイエンス
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    • C12N2510/00Genetically modified cells
    • C12N2510/02Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to cells that produce human antibodies. More specifically, it relates to avian B cells that produce human antibodies.
  • Antibodies are useful for identifying biological materials and analyzing their functions, and play a major role in the treatment of diseases.
  • Antibodies bind to specific antigens in the body and cause various in vivo defense reactions such as antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity and complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity. Recognize and remove the “foreign matter”. Focusing on the ability of such antibodies, development of antibody drugs has been actively conducted in recent years. In order to treat a wide variety of diseases, it is necessary to quickly and easily supply antibodies that recognize various target antigens.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • a single chain valuable fragment (scFv) gene consisting of variable regions of various antibodies is embedded in a phage particle, and a single chain antibody gene product is displayed on the phage.
  • a method for obtaining a clone having affinity for a target antigen from an antibody library which is called a phage display method.
  • This technique is superior in avoiding immune tolerance, but since clones obtained from phage libraries are single-stranded, preparation of a complete antibody consisting of two chains by recombinant DNA technology, etc. There is a need to do.
  • affinity may change in the process of converting a single-chain antibody into a complete antibody, and adjustment of the variable region sequence is often necessary. Therefore, in terms of time and labor, it is difficult to say that the method has made much progress compared to the in vivo immunization method.
  • the ADLib system (Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1) and the ADLib system (Patent Literature 2) that have been further improved have been reported as methods for overcoming the problems of the existing monoclonal antibody production technology.
  • the ADLib system is a technology that allows easy preparation of various antibodies with desired binding characteristics against any type of antigen. This method is a technique for selectively obtaining a desired antibody from an antibody library constructed by a chicken B cell-derived cell line DT40 in which antibody gene diversification has progressed autonomously.
  • the ADLib system is superior to conventional techniques in that immune tolerance, which is an advantage of in vitro antibody production technology, can be avoided and that an IgM-type complete antibody can be obtained quickly.
  • an antibody when administered to an animal or human as a pharmaceutical, it is required to match the type of the animal species in consideration of minimizing the in vivo immunogenicity. Therefore, using recombinant DNA technology, a chimeric antibody in which the constant region of a monoclonal antibody produced in a mouse or the like is replaced with a human type, or a human in which the antigen recognition site (complementarity determining region: CDR) of the antibody is transplanted to a human antibody Antibody was produced.
  • the affinity and function may change in the process of chimerization / humanization, and the probability that a humanized antibody having the function can be produced is not high.
  • chimeric antibodies or humanized antibodies have less regions derived from other animal species, they are less immunogenic than the original monoclonal antibodies, but the antigen recognition site has immunogenicity, so anti-antibodies There was also a problem that appeared. Therefore, an attempt was made to produce an animal that produces a human antibody by introducing a human antibody gene into a mouse.
  • a chimeric mouse that expresses a human antibody is produced by transplanting a microcell of a chromosome fragment containing a human antibody gene into a mouse ES cell and producing a chimeric mouse from the ES cell.
  • Non-Patent Document 2 a chimeric mouse that expresses a human antibody is prepared by replacing the genomic DNA of the mouse antibody locus with the corresponding genomic DNA of the human antibody locus.
  • any method it is possible to obtain an antibody having an antigen recognition site completely derived from a human antibody gene.
  • it since it uses in vivo immunity, it is necessary to obtain a final desired antibody. Time and effort issues remain.
  • variable region sequences There are regions, and all or part of the variable region sequences are rewritten with pseudogene sequences by a phenomenon called gene conversion, and various sequences are created.
  • V (D) J recombination In animals such as humans and mice, antibody diversification occurs due to V (D) J recombination, whereas in animals such as birds, rabbits, cattle, and sheep, antibody diversification occurs through a completely different mechanism of gene conversion. That is happening.
  • the pseudogene region may have a structure containing a very large amount of repetitive sequences, and it is very difficult to analyze the sequence of the region. It has not been. Due to the difference in mechanism and the structural problem of the antibody locus, it was thought that it was very difficult to construct a system for producing desired human antibodies from avian B cells.
  • Non-patent Document 3 a cell line in which the variable region and pseudogene region present in the antibody locus of DT40 cells were replaced with human-derived sequences.
  • the avian antibody variable region is replaced with a gene sequence containing fluorescent proteins Green Fluorescent Protein (GFP) and Cyan Fluorescent Protein (CFP) and recombinase recognition site attP sequence.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • CFP Cyan Fluorescent Protein
  • the antibody molecule to be expressed is a human-bird chimeric antibody, and the immunogenicity of the antibody is very high.
  • the light chain is a fusion protein of a human-derived ⁇ chain and a bird-derived ⁇ chain, the antibody molecule is greatly different from a natural human antibody. Therefore, further chimerization operations are required to obtain human therapeutic antibodies, and there remains a possibility that affinity and function may change in the process of chimerization / humanization.
  • the pseudogene region sequence used here is a minimalist library, which is an aggregate of artificial sequences in which each CDR sequence of the inserted human antibody variable region is replaced with Tyr or Trp for each light chain, A variant of the naturally occurring human antibody variable region is used in which the framework region is mutated.For the heavy chain, each CDR sequence of the inserted human antibody variable region is expressed by one amino acid at Tyr or It consists of an artificial sequence substituted for Trp and its mutant sequence. These are designed for the purpose of dealing with various antigens with a small number of pseudogenes, but acquisition of antigen-specific antibodies in the cells has not been reported.
  • Patent 4214234 WO2008 / 047480 WO97 / 07671
  • an object of the present invention is to provide avian B cells that produce various human antibodies. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for producing an antibody from the avian B cell.
  • the inventors have found that light chain and heavy chain variable regions of human antibodies at the antibody light and heavy chain loci of avian B cells and When the gene of the constant region was inserted or replaced, a transformed cell expressing a human antibody was successfully obtained.
  • the inventors further produced a transformed cell in which a plurality of human-derived antibody variable region sequences were inserted into the light and heavy chains as pseudogenes, and this cell was treated with an HDAC inhibitor. It was confirmed that gene conversion occurred like B cells.
  • the inventors succeeded in producing antigen-specific human antibodies from the cells. That is, the inventors have confirmed that by preparing the cells, it is possible to obtain antibodies having variously altered variable regions from the cells, and have succeeded in producing various antibodies that are human antibodies.
  • the present invention has been completed.
  • the number of DNA sequences derived from a human antibody light chain variable region, which is inserted at an antibody light chain pseudolocus or replaces the sequence of the antibody light chain pseudolocus is 5 or more.
  • the number of DNA sequences derived from human antibody heavy chain variable regions that are inserted at the antibody heavy chain pseudolocus or replace the sequence of the antibody heavy chain pseudolocus is 5 or more, The avian B cell according to (1) above.
  • the number of DNA sequences derived from the human antibody light chain variable region, which is inserted or substituted at the antibody light chain pseudolocus, is 15 or more, The avian B cell according to (1).
  • the number of DNA sequences derived from a human antibody heavy chain variable region inserted at or replacing the antibody heavy chain pseudolocus is 15 or more.
  • the avian B cell according to (1) above.
  • (6) The position of the human antibody light chain variable region-derived DNA sequence inserted in the antibody light chain locus is upstream of the position where the human antibody light chain constant region-derived DNA sequence is present, and the antibody heavy chain gene (1) to (5) above, wherein the position of the human antibody heavy chain variable region-derived DNA sequence inserted into the locus is upstream of the position where the human antibody heavy chain constant region-derived DNA sequence is present.
  • the avian B cell according to any one of the above.
  • the position of the human antibody light chain variable region-derived DNA sequence and the constant region-derived DNA sequence inserted into the antibody light chain locus is upstream of the position of the avian antibody light chain variable region and the constant region; and (6), wherein the positions of the human antibody heavy chain variable region and the constant region inserted into the antibody heavy chain locus are upstream of the positions of the avian antibody heavy chain variable region and the constant region.
  • Avian B cells as described. (8) The avian B cell according to any one of (1) to (7) above, wherein the human antibody heavy chain is a ⁇ chain. (9) The avian B cell according to any one of (1) to (8) above, wherein the human antibody light chain is a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • the avian B cell has the ability to express a human antibody on the cell surface and secrete the human antibody in the culture medium as described in any one of (1) to (9) above Avian B cells.
  • the avian B cell according to (12), wherein the treatment for relaxing chromatin is to reduce or lose the function of histone deacetylase in the avian B cell.
  • An antibody-producing cell library comprising the avian B cells according to any one of (12) to (16) above.
  • (19) An antibody obtained by the method according to (18) above.
  • cpV1 to cpV3 avian pseudogene
  • GC confirmation sequence human pseudogene consisting of a sequence derived from a human antibody variable region; the same applies hereinafter
  • cpV1 to cpV3 avian pseudogene It is the figure which showed typically the structure of the targeting vector for substituting the deletion of the antibody light chain pseudogene region of DT40 cell, and the antibody light chain pseudogene region of DT40 cell with GC confirmation sequence.
  • cpV25, cpV1 avian pseudogene Schematic structure of the targeting vector for replacing the antibody heavy chain constant region and antibody variable region of DT40 cells with the human-derived antibody (IgG) heavy chain constant region and antibody heavy chain variable region, and further inserting a GC confirmation sequence
  • cpV1 to cpV3 avian pseudogene To replace the antibody light chain gene region of DT40 cells with human-derived antibody light chain variable region and antibody light chain constant region genes, and to insert a GC confirmation sequence downstream of the antibody light chain pseudogene region of DT40 cells It is the figure which showed typically the procedure and the antibody light-chain gene region of the obtained DT40 cell.
  • cpV1 to cpV3 avian pseudogene
  • hpV1 to hpV2 human pseudogene Procedure for replacing the antibody light chain gene region of DT40 cells with human-derived antibody light chain variable region and antibody light chain constant region genes, and further deleting the antibody light chain pseudogene region of DT40 cells and obtained It is the figure which showed typically the antibody light chain gene area
  • cpV25, cpV1 avian pseudogene Procedure for replacing the antibody light chain gene region of DT40 cells with human-derived antibody light chain variable region and antibody light chain constant region genes, and further replacing the pseudo gene region of DT40 cells with GC confirmation sequences, and obtained It is the figure which showed typically the DT40 cell antibody light chain gene region.
  • a cell line in which a human-derived antibody light chain gene region is inserted into the antibody light chain gene region of DT40 cells or a cell line in which the antibody light chain gene region of DT40 cells is replaced with a human antibody light chain gene The results analyzed by flow cytometry are shown. It is the figure which showed typically the procedure which changes the antibody heavy chain gene region of a DT40 cell into a human origin antibody heavy chain variable region and an antibody heavy chain constant region, and the antibody heavy chain gene region of the obtained DT40 cell.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the antibody light chain gene region of the obtained DT40 cell and the structure of the targeting vector used.
  • hpV1, hpV2 human pseudogene Produced by a cell line in which the antibody heavy chain gene region of DT40 cells is changed to human-derived antibody heavy chain variable region and antibody heavy chain constant region genes, and a GC confirmation sequence is inserted downstream of the DT40 cell heavy chain pseudogene region
  • the results of analysis by flow cytometry are shown for the antibodies to be treated.
  • An antibody heavy chain constant region of DT40 cells is a diagram of the structure of the targeting vector shown schematically for replacing the heavy chain gene region of human IgG 1.
  • Schematic diagram of the structure of a targeting vector for introducing a pseudogene (human heavy chain pseudogene) consisting of a human-derived antibody heavy chain variable region and 5 human Ig ⁇ variable region sequences into the antibody heavy chain variable region of DT40 cells FIG.
  • the antibody light chain gene region and antibody heavy chain gene region of DT40 cells were changed to human-derived antibody genes, and the antibodies produced by the cell lines inserted with human light chain pseudogene sequences (5) were analyzed by flow cytometry. Results are shown.
  • pV25, pV1 avian pseudogene Procedure for introducing human heavy chain antibody variable region and antibody heavy chain constant region into the antibody heavy chain gene region of DT40 cells and inserting human heavy chain pseudogene sequences (15) and the structure of the targeting vector used It is the figure shown typically.
  • the antibody light chain gene region and antibody heavy chain gene region of DT40 cells were changed to human-derived antibody gene regions, and 30 human light chain pseudogene sequences were inserted into the light chain and 30 human heavy chain pseudogene sequences were inserted into the heavy chain.
  • the result which analyzed by flow cytometry about the antibody which L30 / H30 cell line produces is shown.
  • the antibody light chain gene region and antibody heavy chain gene region of DT40 cells were changed to human-derived antibody gene regions, and 30 human light chain pseudogene sequences were inserted into the light chain and 15 human heavy chain pseudogene sequences were inserted into the heavy chain.
  • the result which analyzed by flow cytometry about the antibody which L30 / H15 cell line produces is shown.
  • RMCE Using the RMCE method, add 15 human heavy chain pseudogene sequences forward or reverse to the antibody heavy chain gene region of the L30 / H15 cell line to make a total of 30 and the targeting used It is the figure which showed the structure of the vector typically.
  • for and rev mean forward direction and reverse direction, respectively.
  • a cell line in which 15 human heavy chain pseudogene sequences have been inserted in the antibody heavy chain gene region of the L30 / H15 cell line in the forward or reverse direction using the RMCE method forward is the L30 / H15f15f cell line, reverse The direction shows the result of analyzing the antibody produced by L30 / H15r15f cell line) by flow cytometry.
  • results of flow cytometry analysis of antibodies produced by a cell line (L30 / H15r15r15f cell line) in which 15 additional human heavy chain pseudogene sequences were inserted in the reverse direction into the antibody heavy chain gene region of the L30 / H15r15f cell line Indicates.
  • a total of 60 human heavy chain pseudogene sequences were inserted into the antibody heavy chain gene region of the L30 / H15f15f15f cell line and L30 / H15r15r15f cell line, either forward or reverse, respectively, for a total of 60 It is the figure which showed typically the procedure and the structure of the used targeting vector.
  • FIG. 36 shows the results of performing single cell sorting on the cell population in the P5 area in FIG. 36, then seeding and culturing in a 96-well cell plate, and performing ELISA analysis on the cell supernatant of each well.
  • the horizontal axis indicates the number of each well fraction of the 96-well plate from which the cell supernatant as the measurement sample is derived.
  • Trypsin inhibitor Trypsin inhibitor
  • SA Streptavidin
  • OA Ovalbumin
  • the antibodies secreted from positive clones # 62 and # 20 were analyzed by Western blotting. The result of processing the sample under reducing and non-reducing conditions and performing Western blotting using a goat anti-human IgG ⁇ antibody is shown.
  • the antibodies secreted from positive clones # 62 and # 20 were analyzed by Western blotting. The result of processing the sample under reducing and non-reducing conditions and performing Western blotting using a goat anti-human IgG ⁇ antibody is shown.
  • the antibodies secreted from positive clones # 62 and # 20 were analyzed by Western blotting.
  • restoration and non-reduction, and performing Western blotting using a goat anti-avian IgM antibody is shown.
  • bonds with His-AP-hSema3A using the ADLib system from the L15 / H15 cell line which carried out TSA processing is shown.
  • bonded with His-AP-hSema3A is shown.
  • the His-AP-hSema3A antibody secreted from the positive clone after the secondary screening was analyzed by Western blotting.
  • the result of processing the sample under reducing and non-reducing conditions and performing Western blotting using goat anti-human IgG ⁇ antibody or goat anti-human IgG ⁇ antibody is shown.
  • bonds with IL-8 using ADLib system from the L30 / H45 cell line which carried out TSA is shown.
  • bonds with IL-8 is shown.
  • the result of processing the sample under reducing and non-reducing conditions and performing Western blotting using goat anti-human IgG ⁇ antibody or goat anti-human IgG ⁇ antibody is shown.
  • One of the embodiments of the present invention is that, in the antibody light chain locus, all or part of the DNA sequence derived from the human antibody light chain variable region and the human antibody light chain constant region is inserted, or the human antibody light chain variable region and All or part of the DNA sequence derived from the human antibody light chain constant region is replaced, and all or part of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region and the human antibody heavy chain constant region is inserted at the antibody heavy chain locus. Or substituted with all or a part of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region and the human antibody heavy chain constant region, and at the antibody light chain pseudolocus, the DNA sequence derived from the human antibody light chain variable region is 2 or more.
  • the B cells of the present invention are avian-derived antibody-producing B cells, and examples thereof include chicken-derived DT40 cells.
  • B cells such as cattle, sheep and rabbits having a system for diversifying antibody sequences by gene conversion can also be used.
  • the avian B cell of the present invention has a human antibody light chain variable region and a human antibody light chain constant region-derived DNA sequence inserted in whole or in part at the antibody light chain locus, or a human antibody light chain variable region. And all or part of the DNA sequence derived from the human antibody light chain constant region, and at the antibody heavy chain locus, all or part of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region and the human antibody heavy chain constant region Inserted or substituted with all or part of the DNA sequence from the human antibody heavy chain variable region and the human antibody heavy chain constant region, and at the antibody light chain pseudolocus, the DNA sequence from the human antibody light chain variable region 2 or more inserted or replaced with DNA sequence 2 or more derived from human antibody light chain variable region, and / or DNA sequence 2 or more derived from human antibody heavy chain variable region inserted at antibody heavy chain pseudolocus
  • other gene regions or the like may be mutated or modified.
  • the antibody light chain locus is a locus where genes encoding the light chain variable region and the light chain constant region of an antibody are present
  • the antibody heavy chain locus is a heavy chain variable region of an antibody.
  • a pseudogene refers to a DNA sequence that is similar to a functioning gene but not functioning as a gene to be expressed.
  • the avian antibody light chain pseudo-locus and the heavy chain pseudo-locus are located upstream of the antibody light chain and heavy chain loci, respectively, where functional genes are present. Yes.
  • DNA sequences derived from the human antibody light chain variable region and the human antibody light chain constant region inserted into the avian antibody light chain locus or replaced with the sequence of the avian antibody light chain locus are each human antibody light chain variable It may be the entire sequence of the region and the human antibody light chain constant region, or a partial sequence thereof. Further, the position of the DNA sequence derived from the human antibody light chain variable region inserted into the avian antibody light chain locus is preferably upstream of the position where the DNA sequence derived from the human antibody light chain constant region is inserted. . Similarly, DNA sequences derived from the human antibody heavy chain variable region and human antibody constant region that are inserted into or replaced by the sequence of the avian antibody heavy chain locus are each human heavy chain variable.
  • the position of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region inserted in the avian antibody heavy chain locus is preferably upstream of the position where the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain constant region is inserted. .
  • the positions of the human antibody light chain variable region and the DNA sequence derived from the human antibody light chain constant region inserted into the avian antibody light chain gene locus are based on the positions of the avian antibody light chain variable region and the avian antibody light chain constant region. It is desirable to be upstream.
  • the position of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region and heavy chain constant region inserted in the chicken antibody heavy chain locus is upstream of the positions of the chicken antibody heavy chain variable region and heavy chain constant region. It is desirable to be.
  • a DNA sequence derived from a human antibody light chain variable region inserted in the avian antibody light chain pseudolocus or substituted with the DNA sequence of the avian antibody light chain pseudolocus (in the present specification and drawings) also referred to as “human light chain pseudogene sequence”.
  • human light chain pseudogene sequence a known human antibody light chain variable region sequence can be used.
  • sequence information can also be obtained from websites such as V Base (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php).
  • a DNA sequence containing all or part of CDR1, CDR2, CDR3 of the human antibody light chain variable region can be used, and each CDR is in the avian antibody light chain locus.
  • the human antibody light chain variable region DNA sequence inserted or replaced with the avian antibody light chain locus sequence or the CDRs of other human light chain pseudogene sequences is not identical to the human antibody light chain variable region DNA sequence inserted or replaced with the avian antibody light chain locus sequence or the CDRs of other human light chain pseudogene sequences.
  • the framework (FW) region of the human light chain pseudogene sequence is identical to that of the human antibody light chain variable region inserted into the avian antibody light chain locus or replaced with the sequence of the avian antibody light chain gene. It is desirable that For example, when the DNA sequence of SEQ ID NO: 5 is selected as the antibody light chain variable region, the light chain pseudogene can be used by combining the sequences shown in SEQ ID NO: 69 to SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 127 to SEQ ID NO: 141, etc. it can.
  • a DNA sequence derived from a human antibody heavy chain variable region that has been inserted into or replaced with a sequence of an avian antibody heavy chain pseudolocus (in this specification and drawings, “human As a “heavy chain pseudogene sequence”, a known human antibody heavy chain variable region sequence can be used. Such sequence information can also be obtained from websites such as V Base (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php).
  • a DNA sequence containing all or part of CDR1, CDR2, and CDR3 of the human antibody heavy chain variable region can be used.
  • the human antibody heavy chain variable region inserted or replaced with the sequence of the avian antibody heavy chain locus or the CDRs of other human heavy chain pseudogene sequences.
  • the framework (FW) region of the human heavy chain pseudogene sequence is identical to that of the human antibody heavy chain variable region inserted into the tri heavy chain antibody locus or replaced with the sequence of the tri heavy chain antibody locus. It is desirable to do it.
  • the heavy chain pseudogenes are SEQ ID NO: 89 to SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 127 to SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 147 to SEQ ID NO: 161, and SEQ ID NO: 165 to SEQ ID NO: 179 can be used in combination.
  • the position of the DNA sequence derived from the human antibody light chain variable region inserted in the avian antibody light chain pseudolocus is upstream of the human antibody light chain variable region inserted in the avian antibody light chain locus.
  • the avian antibody light chain pseudogene sequence remains, it is preferably located downstream of the avian antibody light chain pseudogene region.
  • the position of the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region inserted in the avian antibody heavy chain pseudolocus is located upstream from the human antibody heavy chain variable region inserted in the avian antibody heavy chain locus.
  • the avian antibody heavy chain pseudogene sequence remains, it is preferably located downstream from the avian antibody heavy chain pseudogene region.
  • the DNA sequence derived from the human antibody variable region inserted or replaced as a pseudogene upstream of the avian antibody variable region has the same orientation as the human antibody variable region sequence inserted or replaced in the avian antibody variable region. But it can be used in either direction.
  • the number of DNA sequences derived from the human antibody light chain variable region that are inserted into the avian antibody light chain pseudolocus or that replace (replace) the pseudogene of the avian antibody light chain pseudolocus is preferably 2 or more Preferably they are 5 or more, 7 or more, 9 or more, 11 or more, 13 or more, More preferably, they are 15 or more, 20 or more, 25 or more.
  • the number of DNA sequences derived from a human antibody heavy chain variable region that is inserted into or replaces (replaces) a pseudogene in the avian antibody heavy chain pseudolocus is preferably 2 More preferably, it is 5 or more, 7 or more, 9 or more, 11 or more, 13 or more, more preferably 15 or more, 20 or more, 25 or more, and most preferably 30 or more.
  • the DNA sequence derived from the human antibody light chain variable region or the DNA sequence derived from the human antibody heavy chain variable region includes any one of FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, and FW4, and is variable.
  • a continuous series of variable region homologous sequences contained in the region over the region is treated as one.
  • the type of human antibody heavy chain inserted into the avian antibody heavy chain locus may be any of ⁇ chain, s chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, but preferably ⁇ chain Is a chain.
  • the type of human antibody light chain inserted into the avian antibody light chain locus and the avian antibody light chain pseudolocus may be either a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • the avian B cells in order to use the avian B cells into which the gene has been introduced as an antibody library, the avian B cells not only express human antibodies on the cell membrane surface but also secrete human antibodies into the culture medium. It is preferable to have the ability.
  • a knock-in method using homologous recombination is used as a method for inserting a human antibody gene into a bird antibody locus and / or replacing it with a human antibody gene.
  • human antibody variable region-derived sequences are inserted and / or replaced with human antibody genes in the pseudogene region of the avian antibody chain locus by knock-in method using homologous recombination or site-specific recombination.
  • the used Recombinase mediated cassette) exchange (RMCE) method can be preferably used.
  • the avian B cell produced in this embodiment includes a human antibody locus in addition to a cell in which a DNA sequence derived from a human antibody locus is inserted or replaced with a DNA sequence derived from a human antibody locus.
  • Avian B cells in which a variety of mutations are further introduced into the derived antibody light chain or heavy chain variable region are also included.
  • Antibody diversity is achieved by rearranging the variable regions to produce a variety of variable region sequences. Therefore, the avian B cells produced in the present embodiment include avian B cells that have been subjected to treatments for introducing various mutations necessary for rearrangement of variable regions.
  • methods for introducing mutations necessary for rearrangement of variable regions include, for example, methods using B cells lacking XRCC2 and XRCC3 (for example, CumberCuet al., Nature Biotech. 204: 1129-1134). 2002 or JP 2003-503750), methods for controlling the expression of AID gene (eg KanayamaKet al., Nucleic Acids Res. 34: e10., 2006 or JP2004-298072), or relaxation of chromatin
  • a method known in the art such as a method for promoting gene conversion (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, or Non-Patent Document 1).
  • a preferred method is a method of promoting gene conversion by relaxing chromatin.
  • a method of relaxing chromatin in avian B cells for example, a method of significantly promoting gene conversion in the cells by inhibiting histone deacetylase (HDAC) activity inherent in avian B cells by any method (For details, see Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 1, and the like).
  • HDAC histone deacetylase
  • a method of inhibiting the activity of HDAC inherent in cells a method of treating the B cell of the present invention with an HDAC inhibitor (see Patent Document 1 or Non-Patent Document 1) and the function of the HDAC gene in avian B cells A method of reducing or losing (see Patent Document 2) or the like can be used.
  • the HDAC inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the activity of HDAC.
  • trichostatin A TSA
  • butyric acid valproic acid
  • suberoylanilide hydroxamic acid SAHA
  • CBHA m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamide
  • PTACH PTACH
  • Apicidin Scriptaid
  • M344, APHA compound 8 BML-210
  • Oxamflatin MS-275, etc.
  • an inactive protein (dominant negative) of HDAC that is a target of activity inhibition may be used as an inhibitor.
  • the HDAC isoform to which the gene function is reduced or lost varies depending on the antibody-producing B cell used, but is preferably the HDAC2 gene (for details, see Patent (Ref. 2).
  • the embodiment of the present invention related to the above embodiment includes an antibody producing cell library comprising the avian B cells of the present invention.
  • the cell library is a group of avian B cells of the present invention that produce antibodies against various antigens.
  • the avian B cells described in the above embodiment of the present invention have diversity in antibody variable region sequences produced by inserting DNA sequences derived from human-derived antibody variable regions into the avian antibody pseudo-locus, etc.
  • the cells have the ability to produce antibodies against various antigens by further diversifying the antibody variable region sequence by treatment such as chromatin relaxation. Therefore, it can be said that a population containing a plurality of avian B cells of the present invention is a cell population that produces antibodies against various antigens.
  • the antibody produced from the avian B cell of the present invention is a human antibody, and more preferably a human antibody.
  • a human antibody is an antibody in which the amino acid sequence of the heavy chain or light chain of the antibody to be produced contains a part of the sequence derived from the avian gene, and the human antibody is the heavy chain of the antibody to be produced. Or it is an antibody whose amino acid sequence of a light chain is a sequence derived from a human gene.
  • the antibody-producing cell library described above can also be prepared by using the ADLib system (see Patent Document 1 or Non-Patent Document 1).
  • ADLib axCELL a ntigen e x pressing cell
  • kits for producing the avian B cells of the invention or producing antibodies include kits for producing the avian B cells of the invention or producing antibodies.
  • a kit for producing avian B cells in addition to the medium and necessary supplements necessary for culturing avian B cells, a DNA sequence derived from a human antibody gene is inserted at the avian B cell antibody locus, etc.
  • vectors and reagents for substitution with a DNA sequence derived from a human antibody gene are included.
  • elements necessary for preparing an antibody-producing cell library for example, reagents necessary for performing an HDAC inhibitor or a decrease in function or loss of function of the HDAC gene may be included.
  • kits for producing an antibody as reagents for selecting an antibody having a desired antigen specificity, for example, various antigens, magnetic beads, etc., as well as reagents for preparing magnetic beads, antibody selection Any material may be included as long as it is considered necessary for the production of the antibody, such as a labeled antibody to be used and a plate necessary for the examination such as ELISA.
  • a labeled antibody to be used and a plate necessary for the examination such as ELISA.
  • variable region and constant region of human Ig ⁇ Using cDNA prepared from human Burkitt lymphoma cell line Ramos as a template, a sense primer (TCCACCATGGCCTGGGCTCTG) (SEQ ID NO: 1) and an antisense primer (GTTGAGAACCTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC) (SEQ ID NO: 2) The variable region and constant region of the human antibody light chain (Ig ⁇ ) were amplified by PCR used and cloned into pGEM-T-Easy (Promega) to obtain pGEM-hIgG1-LC.
  • variable region of human Ig ⁇ (SEQ ID NO: 5) is obtained by PCR using the sense primer (ATTGGCGCGCCTCTCCAGGTTCCCTGGTGCAGGCACAGTCTGCCCTGACTCAGC) (SEQ ID NO: 3) and the antisense primer (TTCCATATGAGCGACTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC) (SEQ ID NO: 4).
  • the constant region of human Ig ⁇ (SEQ ID NO: 8) was obtained by PCR using pGEM-hIgG1-LC as a template and a sense primer (ATTGGCGCGCCTCTGCCTCTCTCTTGCAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTC) (SEQ ID NO: 6) and an antisense primer (GGAATTCCATATGGAGTGGGACTACTATGAACATTCTGTAGGGG) (SEQ ID NO: 7). Obtained.
  • FIG. 1 Knock-in downstream of the pseudogene region of the avian antibody light chain (Ig ⁇ ) (KI-C-IN vector) To insert a sequence for confirming gene conversion (GC confirmation sequence; human pseudogene consisting of a sequence derived from the variable region of human Ig ⁇ ) (SEQ ID NO: 17) downstream of the pseudogene region of avian Ig ⁇ , first, FIG. A targeting vector as shown in FIG. The manufacturing method of each part is shown below.
  • Left Arm 4.3 kb (pseudogene (pV) 1) upstream of the variable region promoter using DT40 genomic DNA as a template and using a sense primer (TTCTGTGAGCTGAGAAAAGGAGTGTA) (SEQ ID NO: 18) and an antisense primer (CCTGCATTGTGGCACAGCGGGGTT) (SEQ ID NO: 19) ⁇ 3) was amplified by PCR and then cloned into pCR4blunt-TOPO (Life Technologies) to obtain pCR4-cIgM-LC pV1genome. Based on this sequence, a region containing pV1-3 (SEQ ID NO: 20) was cloned to be a Left Arm.
  • TTCTGTGAGCTGAGAAAAGGAGTGTA SEQ ID NO: 18
  • an antisense primer CCTGCATTGTGGCACAGCGGGGTT
  • GC confirmation sequence downstream of pseudogene region of avian antibody light chain (Ig ⁇ ) (KI-C-IN-C vector)
  • Ig ⁇ avian antibody light chain
  • a targeting vector as shown in FIG. 2 was prepared. The manufacturing method of each part is shown below.
  • (1) GC confirmation sequence Based on the variable region of human Ig ⁇ cloned in 1-1 above, a mutant sequence in which 3 bases were inserted into each CDR and a mutant sequence in which 3 bases were deleted were designed.
  • a GC confirmation sequence (SEQ ID NO: 17) linked using the untranslated region sequence of the pseudogene region was synthesized.
  • avian antibody light chain (KI-C-DE vector)
  • a targeting vector as shown in FIG. 3 was prepared. The manufacturing method of each part is shown below.
  • (1) Left Arm DT40 genomic DNA was used as a template, and about 3.0 kb upstream of pV25 was amplified by PCR using a sense primer (CGCTTTGTACGAACGTTGTCACGT) (SEQ ID NO: 24) and an antisense primer (TACCTGAAGGTCTCTTTGTGTTTTG) (SEQ ID NO: 25), and then pCR4blunt- Cloning into TOPO gave the Left Arm shown in SEQ ID NO: 26.
  • CGCTTTGTACGAACGTTGTCACGT SEQ ID NO: 24
  • an antisense primer TACCTGAAGGTCTCTTTGTGTTTTTTG
  • a targeting vector as shown in FIG. 3 was prepared. The manufacturing method of each part is shown below. (1) GC confirmation sequence The GC confirmation sequence prepared in 1-2 above was used. (2) Construction of targeting vector The KI-C-DE-C vector was obtained by incorporating the GC confirmation sequence into the structure shown in FIG. 3 into the KI-C-DE vector prepared in 1-3 above. . The gene sequence of this vector is shown in SEQ ID NO: 28.
  • FIG. 1 Knock-in of the avian antibody heavy chain (IgM) to the constant region / variable region To replace the region from the variable region of the chicken IgM (IgM) to the constant region ⁇ 1 with the human antibody heavy chain (IgG 1 ), FIG. Targeting vectors as shown were made. The manufacturing method of each part is shown below. (1) Among the sequences obtained by shotgun sequencing of the human genome chromosome 14 32.33 containing human IgG 1 constant region human IgG 1, it was obtained a sequence corresponding to IgG 1 (accession number: NW_001838121.1).
  • Center Arm 1 Center Arm 1 corresponding to about 1.4 kbp upstream of the avian IgM variable region was synthesized based on the sequence of about 4.1 kbp from upstream to the variable region of the chicken IgM variable region cloned at the time of cloning the above Left Arm (SEQ ID NO: 34). ).
  • Center Arm 2 After PCR amplification of about 4.3kbp downstream of the avian IgM variable region using DT40 genomic DNA as a template and using a sense primer (GGGGATCCTGGGTCAGTCGAAGGGGGCG) (SEQ ID NO: 35) and an antisense primer (GTGCGGCCGCCAAAAGCGGTAAAATCCACCC) (SEQ ID NO: 36) Cloning gave Center Arm 2 shown in SEQ ID NO: 37.
  • the human HC VC vector was obtained by incorporating the structure shown in FIG. The gene sequence of this vector is shown in SEQ ID NO: 41.
  • a chicken B cell-derived cell line was used as the host.
  • the culture method of DT40 was performed by the following method. Using a CO 2 constant temperature bath, the cells were cultured at 39.5 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the medium was IMDM (Life Technologies), and 9% FBS, 1% chicken serum, penicillin 100 units / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, and monothioglycerol 50 ⁇ M were used.
  • “medium” refers to the composition described above.
  • five cell lines shown in the following table were prepared. A manufacturing method is shown below.
  • the KI-C-IN vector prepared in 1-2 above was linearized with the restriction enzyme NotI and then introduced into the cell line 37-3.
  • the cells were cultured for 7 to 10 days in a medium supplemented with 2 mg / mL G418.
  • the grown cells were genotyped by PCR to obtain a cell line LP1 in which gene insertion had occurred at the target locus (FIG. 5).
  • a washing solution PBS containing 0.05% Tween 20
  • a blocking solution PBS containing 1% BSA
  • the plate was washed 5 times with a washing solution, 20 ⁇ L of TMB + (Dako, S159985) was added, color reaction was performed at room temperature for 3 minutes, and 20 ⁇ L of 1 N sulfuric acid was added to stop the reaction. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN).
  • the system of alphaLISA immunoassay (Perkin Elmer) was used for the measurement of IgM.
  • Goat anti-chicken IgM antibody (Bethyl, A30-102A) was labeled with biotin using Chromalink TM Biotin Labeling Reagent (SoluLink Inc., # B1001-105) to prepare a biotinylated antibody.
  • a manufacturing method is shown below. (1) using human IgG 1 constant region produced in the human IgG1 constant region above 1-6. (2) Left Arm The Center Arm 2 produced in 1-6 above was used. (3) Right Arm The Right Arm produced in 1-6 above was used. (4) said Left Arm to produce pBluescript targeting vector, human IgG 1 constant region sequence, neomycin resistance gene, incorporate Right Arm, to produce a human CH KI vector. The gene sequence of this vector is shown in SEQ ID NO: 52.
  • L5 / H5 cell line in which 5 human pseudogenes were introduced into the avian antibody light chain and heavy chain gene loci respectively.
  • the cell line 37-3 obtained in 2-2 was prepared in 8-2.
  • a human CH KI vector, the human pVH VH KI vector prepared in the above 8-3, and the human LC pV KI vector prepared in the above 8-1 were introduced into a gene to produce an L5 / H5 cell line (FIG. 15).
  • a human CH KI vector linearized with the restriction enzyme SalI was introduced into 37-3, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR to obtain the desired gene locus. And confirmed that the substitution was taking place.
  • Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • a human pVH VH KI vector linearized with the restriction enzyme SacI is introduced into the gene, cultured in a medium containing 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells are subjected to genotyping by PCR for the target gene. We confirmed that substitution occurred at the locus.
  • Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • Human antibody light chain pseudogene sequence (pVL15) By selecting 15 sequences of CDR1, CDR2, CDR 3 based on the sequence of human immunoglobulin ⁇ variable region in the database and combining the framework sequence of human Ig ⁇ variable region cloned in 1-1 above, Sequence pVL101 (SEQ ID NO: 74), pVL102 (SEQ ID NO: 75), pVL103 (SEQ ID NO: 76), pVL104 (SEQ ID NO: 77), pVL105 (SEQ ID NO: 78), pVL106 (SEQ ID NO: 79), pVL107 (SEQ ID NO: 80), pVL108 (SEQ ID NO: 81), pVL109 (SEQ ID NO: 82), pVL110 (SEQ ID NO: 83), pVL111 (SEQ ID NO: 84), pVL112 (SEQ ID NO: 84), pVL112 (SEQ ID NO: 84),
  • Preparation of cell line DT40 cells were prepared by adding Lambda-VL-CL KI vector 2.0 prepared in 12-1 above, pVL KI_pUC19_step5_BrRev prepared in 12-2 above, pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL # odd prepared in 12-3 above, 12-4 above Cells by introducing the human CH KI vector prepared in 1), H (X) 0 ⁇ hV (B) — 074-009 / No4 prepared in 12-5 and pVH KI_pUC19_step3_pVH # odd_15pVH_RMCE prepared in 12-6 above Strains were created.
  • a human CH KI vector linearized with the restriction enzyme SalI is introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418, and the grown cells are genotyped by PCR to be replaced with the target gene locus. Confirmed that is happening. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • Lambda-VL-CL KI vector 2.0 linearized with restriction enzyme NotI was introduced into DT40, cultured in a medium containing 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR. To confirm that substitution occurred at the target locus.
  • Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed. Furthermore, pVL KI_pUC19_step5_BrRev linearized with the restriction enzyme NotI was introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR. It was confirmed that substitution occurred at the target locus. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL # odd linearized with the restriction enzyme NotI was introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were genotyped by PCR. To confirm that substitution occurred at the target locus. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • H (X) 0hV (B) _074-009 / No4 linearized with the restriction enzyme ScaI and pVH KI_pUC19_step3_pVH # odd_15pVH_RMCE linearized with the restriction enzyme NotI were introduced, and 2 mg / mL
  • the cells were cultured in a medium containing G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR to confirm that substitution had occurred at the target locus.
  • a sense primer (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC) (SEQ ID NO: 46) and an antisense primer, which were given from the cells cultured in the presence of TSA for 21 days or 42 days using the genomic DNA extracted according to the method described in 4 above as a template.
  • a human CH KI vector linearized with the restriction enzyme SalI is introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418, and the grown cells are genotyped by PCR to be replaced with the target gene locus. Confirmed that is happening. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • Lambda-VL-CL KI vector 2.0 linearized with restriction enzyme NotI was introduced into DT40, cultured in a medium containing 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR. To confirm that substitution occurred at the target locus.
  • Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed. Furthermore, pVL KI_pUC19_step5_BrRev linearized with the restriction enzyme NotI was introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells were subjected to genotyping by PCR. It was confirmed that substitution occurred at the target locus. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL # odd linearized with restriction enzyme NotI is introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells are genotyped by PCR. To confirm that substitution occurred at the target locus. Thereafter, Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to confirm that the drug resistance gene was removed.
  • the plate was washed 5 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20), 50 ⁇ L of blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the plate was washed 5 times with a washing solution, 20 ⁇ L of a measurement sample or avian serum (GIBCO, 16110) as a standard substance was added, and reacted at room temperature for 1 hour. Wash 5 times with the washing solution, add 20 ⁇ L of Goat anti-chicken IgM HRP conjugated (Bethyl, A30-102P) diluted 1: 5000 with PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween20, and react at room temperature for 1 hour.
  • L30 / H30 cell line in which a pseudogene region comprising 30 human variable region-derived sequences is inserted in the light chain and 30 in the heavy chain20 .
  • Avian antibody light chain (Ig ⁇ ) pseudogene / knock-in to variable region (1)
  • Human antibody light chain pseudogene sequence (pVL30) Based on the sequence of human immunoglobulin ⁇ variable region in the database, 30 sequences of CDR1, CDR2 and CDR 3 are selected and 30 framework sequences of human Ig ⁇ variable region cloned in 1-1 are combined.
  • L30 / H15 cell line in which a pseudogene region consisting of 30 human variable region-derived sequences is inserted in the light chain and 15 in the heavy chain 24.
  • Preparation of cell line A cell line was prepared by introducing the gene pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL # odd + even prepared in 20 above into the L15 / H15 cell line A12-4 prepared in 17 above.
  • PVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL # odd + even linearized with the restriction enzyme NotI is introduced, cultured in a medium containing 2 mg / mL G418 and 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells are subjected to genotyping by PCR.
  • Cre_pEGFP-C1 was introduced, and GFP positive cells were sorted by cell sorting, and then genotyping by PCR was performed to obtain cell lines A77-3 and A77-2 from which the drug resistance gene had been removed.
  • Insert 15 forward constructed pseudogenes into avian antibody heavy chain (IgM) pseudogene region (1) Human antibody heavy chain pseudogene sequence (pVH15a) PVH15a (SEQ ID NO: 144) obtained by concatenating pVH116, pVH117, pVH118, pVH119, pVH120, pVH121, pVH122, pVH123, pVH124, pVH125, pVH126, pVH127, pVH128, pVH129, and pVH130 designed in 16 above (sequence number 144) .
  • the sequence analysis results (top 10) of the light chain and heavy chain variable regions at 1-6-1 are shown in Table 23 and Table 24, respectively, and the light chain and heavy chain variable regions at 7-3-2 are shown.
  • Table 25 and Table 26 show the results of the sequence analysis (the top 10), respectively.
  • a clone containing a sequence derived from a human pseudogene additionally inserted in both the light chain and heavy chain variable regions was confirmed, indicating that various sequences were produced as in the L30 / H30 cell line. Similarly, in other cell lines, it was confirmed that various sequences were generated by gene conversion.
  • the L30 / H15r15r15f cell line was prepared by introducing the pVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev prepared in 27-2 above into the L30 / H15r15f cell line prepared in 27 above. After introducing pVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev together with Cre_pEGFP-C1 to induce site-specific recombination, the cells are cultured in a medium containing 10 ⁇ g / mL blasticidin, and the grown cells are subjected to genotyping by PCR and the target gene Cell lines 4-1-5, 4-1-7 and 3-1-11 were confirmed which confirmed the substitution at the locus.
  • FIGS. 32 and 33 Wild-type DT40 expresses only avian IgM, whereas transformed strains 2-1-3, 2-1-11, 1-n-1, 2-n-3 (above, FIG. 32) 4-1-5, 4-1-7, and 3-1-11 (FIG. 33), it was confirmed that the expression of avian IgM disappeared and human Ig ⁇ and Ig ⁇ were expressed instead.
  • a sense primer (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC) (SEQ ID NO: 46) and an antisense primer (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCCGAA) using a genomic DNA extracted based on the method described in 4 above as a template from a cell line cultured for 42 days in the presence of TSA.
  • IgM avian antibody heavy chain
  • the cells After introducing pVH15A _RMCE1st_Rv ⁇ ⁇ ⁇ together with Cre_pEGFP-C1 to induce site-specific recombination, the cells are cultured in a medium containing 2 mg / mL G418, and the grown cells are subjected to genotyping by PCR at the target locus. Cell line 3111-1, which confirmed that the substitution had occurred, was obtained.
  • sequence analysis results of the light chain and heavy chain variable regions at 1n1-3 are shown in Table 33 and Table 34, respectively, and the sequence analysis results of the light chain and heavy chain variable regions at 3111-1 (Top 10) are shown in Table 35 and Table 36, respectively.
  • a clone containing a sequence derived from a human pseudogene additionally inserted in both the light chain and heavy chain variable regions was confirmed, and it was shown that more diverse sequences were produced. Similarly, in other cell lines, it was confirmed that various sequences were generated by gene conversion.
  • Plexin A4 is a molecule belonging to the Plexin A type, and is known as a factor that controls sensory and sympathetic nerve axon extension.
  • a Plexin A4 Sema domain and a PSI (Plexin-Semaphorin-Integrin) domain C-terminal added with a FLAG tag (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68) were used. Based on ACCESSION No. NM_020911 and ACCESSION No.
  • EAW83796 an expression vector obtained by synthesizing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 67 and deleting the EBNA-1 gene and Hygromycin resistance gene of pCEP4 (Life Technologies, V044-50) To construct a Plexin A4 expression vector.
  • the obtained Plexin A4 expression vector was introduced into FreeStyle 293 F cells (Life Technologies, R790-07) using PEI (polyethyleneimine) and expressed.
  • PEI polyethyleneimine
  • an expression vector for the EBNA-1 gene was also introduced separately. Expression was performed on a 3L scale, and culture was performed for 7 days. The target protein in the culture supernatant was purified using the FLAG tag.
  • XK16 / 20 column (GE Healthcare, 28-9889-37) is packed with 2.5 mL of anti-M2-agarose resin (Sigma, A2220) and D-PBS (-) (Wako Pure Chemical, 045-29795) After the equilibration, the culture supernatant was loaded, washed with D-PBS ( ⁇ ), and then eluted with D-PBS ( ⁇ ) containing 0.1 mg / mL FLAG peptide (Sigma, F3290). By monitoring the absorbance at 280 nm, the fraction corresponding to the peak was recovered, and the molecular weight of the protein recovered by SDS-PAGE and CBB staining was confirmed to confirm that it matched with the molecular weight of the target protein.
  • 39-4 Screening by antigen-fixed ELISA
  • the cell culture supernatant of 39-3 above was collected, and clones that react with Plexin A4 antigen were screened by antigen-fixed ELISA using Plexin A4 antigen.
  • the solution was dispensed into plate maxisorp (Nunc, 464718), reacted at 4 ° C. overnight and immobilized on the plate.
  • the plate was washed three times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20), 45 ⁇ L of blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • the sample was washed 3 times with a washing solution, 25 ⁇ L of a measurement sample was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ L of Goat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated (Bethyl, A80-104P) diluted 2000 times with PBS buffer solution was added and reacted for 1 hour.
  • the IgM measurement method is as follows. Dispense 100 ⁇ L of Goat anti-chicken IgM (Bethyl, A30-102A) diluted to 1.0 ⁇ g / mL with PBS into F96 maxisorp Nunc immunoplate (Nunc, 439454), and react at 4 ° C. overnight. Immobilized on a plate. Thereafter, the plate was washed 5 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20), 200 ⁇ L of blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 95 minutes.
  • a washing solution PBS containing 0.05% Tween 20
  • PBS containing 1% BSA blocking solution
  • the plate was washed 5 times with a washing solution, 100 ⁇ L of a measurement sample or avian serum (GIBCO, 16110) as a standard substance was added, and reacted at room temperature for 1 hour. Wash 5 times with the washing solution, add 100 ⁇ L of Goat anti-chicken IgM HRP conjugated (Bethyl, A30-102P) diluted 1: 5000 with PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween20, and react at room temperature for 1 hour. It was.
  • the plate was washed 5 times with a washing solution, 100 ⁇ L of TMB + (Dako, S159985) was added, color reaction was performed at room temperature for 3 minutes, and 100 ⁇ L of 1 N sulfuric acid was added to stop the reaction. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN). The measurement results are shown in Table 37. In clone # 20 and clone # 62, the human IgG 1 is secreted, secretion of birds IgM was confirmed to be negligible.
  • the target protein in the culture supernatant was purified using the His tag. After equilibrating HisTrap EXCEL 5mL (GE Healthcare, 17-3712-06) with solution A (20 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazole (pH 7.5)), the culture supernatant was loaded. And washed with solution A. Then, it eluted by the gradient which is linearly replaced by 25 column volumes from A liquid to B liquid (20 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole (pH7.5)).
  • the fraction corresponding to the peak was recovered, and the molecular weight of the protein recovered by SDS-PAGE and CBB staining was confirmed to confirm that it matched with the molecular weight of the target protein.
  • an ultrafiltration membrane Amicon, UFC0801008
  • the recovered fraction was loaded and eluted with the elution buffer.
  • an elution buffer 50 mM Na-phosphate, 300 mM NaCl, 400 mM Arginine, pH 7.0
  • the recovered fraction was loaded and eluted with the elution buffer.
  • the absorbance at 280 nm the fraction corresponding to the peak was collected, and the molecular weight of the collected protein was confirmed by SDS-PAGE and CBB staining.
  • gel filtration chromatography was performed a second time with D-PBS ( ⁇ ).
  • the absorbance at 280 nm was monitored, the fraction corresponding to the peak was collected, and the molecular weight of the collected protein was confirmed by SDS-PAGE and CBB staining.
  • Magnetic beads are Dynabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies, 14305D), Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies, 14301) and Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown (Life Technologies, 10103D). Used and bound to the antigen according to the manual. At this time, MPC-S (Life Technologies, DBA13346) was used as the magnetic stand.
  • Dynabeads M-270 Carboxylic Acid wash 40 ⁇ L of beads 3 times with 80 ⁇ L of 25 mM MES (pH 5.0), add 40 ⁇ L of 50 mg / mL NHS solution and 50 mg / mL EDC solution at room temperature.
  • His-AP-hSema3A was prepared by washing 40 ⁇ L of beads 3 times with 80 ⁇ L of 100 mM Na-phosphate buffer and then adjusting to 0.45 mg / mL with 100 mM Na-phosphate buffer for positive selection.
  • the cell culture solution of 42-2 was collected and screened for clones that react specifically with the target antigen based on the antigen reactivity of the secreted IgG in the antigen-fixed ELISA.
  • Dispense 20 ⁇ L of antigen protein and negative control antigen solution (His-Ubiquitin, Ovalbumin, Streptavidin) adjusted to 2.5 ⁇ g / mL with PBS into immuno 384-well plate maxi soap (Nunc, 464718) and react overnight at 4 ° C. To be solid-phased.
  • the plate was washed 5 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20), 45 ⁇ L of blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 115 minutes.
  • the plate was washed 5 times with the washing solution, and 25 ⁇ L of the culture supernatant was added and reacted at room temperature for 130 minutes.
  • 25 ⁇ L of Goat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated diluted 2000 times with the blocking solution was added and reacted at room temperature for 47 minutes.
  • 25 ⁇ L of TMB + (Dako, S159985) was added and allowed to react for 5 minutes.
  • Antibody selection 3 44 Preparation of antigen IL-8 was selected as the antigen protein.
  • IL-8 is a type of chemokine that exhibits chemotaxis to neutrophils and T lymphocytes and has the activity of promoting the adhesion of leukocytes to vascular endothelial cells and the function of neutrophils. Therefore, it is considered to be involved in inflammatory diseases associated with neutrophil infiltration, rheumatoid arthritis, and the like.
  • Antigens are human IL-8 (Immune TECH, IT-401-003P) for selection, and two human IL-8 (Immune TECH, IT-401-003P and CELL Signaling Technology, 8921LF) for screening. ) was used.
  • Magnetic beads are Dynabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies, 14305D), Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies, 14301) and Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown (Life Technologies, 10103D). Used and bound to the antigen according to the manual. At this time, MPC-S (Life Technologies, DBA13346) was used as the magnetic stand.
  • MPC-S Life Technologies, DBA13346
  • For Dynabeads M-270 Carboxylic Acid wash 35 ⁇ L of beads with 70 ⁇ L of 25 mM MES (pH 5.0) three times, then add 35 ⁇ L of 50 mg / mL NHS solution and 50 mg / mL EDC solution at room temperature.
  • the present invention relates to a method for rapidly producing various human antibodies.
  • the technology provided by the present invention is expected to play an extremely important role in the development of biopharmaceuticals exhibiting desired drug efficacy, particularly antibody drugs, in the future drug discovery and medical fields. Is done.

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Abstract

 本発明は、多様なヒト抗体を発現するトリB 細胞の提供を目的とする。本発明は、抗体軽鎖遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域及びヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA 配列の全部又は一部が挿入され、又はヒト抗体軽鎖可変領域及びヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA 配列の全部又は一部で置換され、並びに抗体重鎖遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域及びヒト抗体重鎖定常領域由来DNA 配列の全部又は一部が挿入され、又はヒト抗体重鎖可変領域及びヒト抗体重鎖定常領域由来DNA 配列の全部又は一部で置換され、並びに抗体軽鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA 配列2 以上が挿入され、又はヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA 配列2 以上で置換され、及び/又は抗体重鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA 配列2以上が挿入され、又はヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA 配列2 以上で置換されたトリB 細胞を解決手段とする。

Description

ヒト抗体を産生する細胞
 本発明は、ヒト抗体を産生する細胞に関する。より具体的には、ヒト抗体を産生するトリB細胞に関する。
 抗体は、生体物質の同定や機能解析などを行う上で有用であり、また、疾患の治療においても抗体の果たす役割は大きい。抗体は、生体内において特定の抗原と結合し、様々な生体内防御反応、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性や、補体依存性細胞傷害(CDC)活性を惹起して、生体にとっての「異物」を認識し、除去を行う。このような抗体の能力に着目し、抗体医薬の開発が近年盛んに行われるようになってきた。多種多様な疾患の治療を行うには、様々な標的抗原を認識する抗体を迅速、簡便に供給する必要がある。
 これまで、所望の物理的、生理的特徴を備えた抗体群を調製する手法として、モノクローナル抗体の作製技術が用いられてきた。モノクローナル抗体を作製する場合、一般的には、生体内免疫によって生じたB細胞をミエローマと融合させるハイブリドーマ法が用いられる。しかしながら、この方法には、生体内免疫の利用によって生じる免疫寛容の他、最終的な所望の抗体を取得するまでに時間と労力が掛かるなど、多くの問題が存在している。
 免疫寛容の問題を克服する技術として、生体内免疫を利用しない方法が開発された。この方法は、ファージ粒子に種々の抗体の可変領域からなる1本鎖抗体(single chain valuable fragment: scFv)遺伝子を埋め込み、1本鎖抗体遺伝子産物をファージ上に提示させ、このファージによる1本鎖抗体ライブラリーから目的抗原への親和性を有するクローンを取得する方法で、ファージディスプレイ法と呼ばれている。この技術は、免疫寛容を回避する点では優れているが、ファージライブラリーから得られるクローンは1本鎖であるため、組換えDNA技術等により、2本鎖から成る完全型の抗体の調製を行う必要がある。また、1本鎖抗体を完全型抗体にする過程で親和性に変化を生じることもあり、可変領域配列の調整が必要な場合も少なくない。従って、時間と労力の点においては、生体内免疫による方法と比較して、格段に進展したとまでは言い難い。
 上記の既存のモノクローナル抗体作製技術の課題を克服した方法として、ADLibシステム(特許文献1および非特許文献1)およびADLibシステムをさらに改良した方法(特許文献2)が報告されている。ADLibシステムは、あらゆるタイプの抗原に対して、所望の結合特性を備えた多様な抗体を簡便に調製することが可能な技術である。この方法は、自律的に抗体遺伝子の多様化が進行したニワトリB細胞由来細胞株DT40によって構築される抗体ライブラリーから、所望の抗体を選択的に取得する技術である。ADLibシステムは、インビトロ系抗体作製技術の利点である免疫寛容の回避が可能である点、迅速にIgM型の完全抗体が得られる点において、従来の技術と比較して優れている。
 一般的に、抗体を動物やヒトに医薬品として投与する場合には、体内での免疫原性を最小化することを考慮し、その動物種の型に合わせることが求められる。そこで、DNA組換え技術を利用して、マウスなどで作製したモノクローナル抗体の定常領域をヒト型に置換したキメラ抗体や、抗体の抗原認識部位(complementarity determining region : CDR)をヒト抗体に移植したヒト化抗体が作製された。しかし、キメラ化・ヒト化の過程において親和性や機能に変化を生じることもあり、機能を保持したヒト化抗体を作製できる確率は決して高いとはいえない。さらに、これらのキメラ抗体またはヒト化抗体は他の動物種に由来する領域が少ないため、元のモノクローナル抗体と比べて免疫原性は低いものの、抗原認識部位が免疫原性を持つため、抗抗体が現れるという問題点もあった。
 そこで、マウスにヒト抗体遺伝子を遺伝子導入し、ヒト抗体を産生する動物の作製が試みられた。特許文献3では、ヒト抗体遺伝子を含む染色体断片のミクロセルをマウスES細胞に移植し、該ES細胞からキメラマウスを作製することで、ヒト抗体を発現するキメラマウスを作製している。また、非特許文献2では、マウス抗体遺伝子座のゲノムDNAを対応するヒト抗体遺伝子座のゲノムDNAと置換することで、ヒト抗体を発現するキメラマウスを作製している。いずれの方法においても、完全にヒト抗体遺伝子に由来する抗原認識部位を持つ抗体の取得が可能であるが、やはり生体内免疫を利用することから、最終的な所望の抗体を取得するまでに要する時間と労力の問題は残っている。
 以上のような状況において、ADLibシステムを使用する場合であっても、抗体医薬を調製するためには、ヒト由来のアミノ酸配列を持つ抗体をトリB細胞から産生させる方法が必要である。さらに、様々な疾患の治療を行うためには、多様な抗原認識特性を持つ抗体群を簡便に産生させる技術が必要となる。
 しかしながら、マウスにヒト抗体遺伝子を導入して「ヒト化」する場合と異なり、トリB細胞を「ヒト化」する場合、抗体の多様化システムの相違が問題となる。なぜなら、トリ、ウサギ、ウシ、ヒツジなどの動物の場合、抗体可変領域の上流には、可変領域と類似した配列であってそれ自身は抗体遺伝子として発現していない偽遺伝子と呼ばれる配列が集まった領域があり、遺伝子変換と呼ばれる現象によって可変領域配列の全部または一部が偽遺伝子配列によって書き換えられることで、多様な配列が生み出されている。ヒトやマウスなどの動物においては、V(D)J組換えにより抗体の多様化が起こるのに対し、トリ、ウサギ、ウシ、ヒツジなどの動物においては、遺伝子変換という全く異なるメカニズムによって抗体の多様化が起きていることになる。さらに、偽遺伝子領域は非常に大量の繰り返し配列を含む構造になっていることもあり、当該領域の配列解析が非常に困難で、2015年3月時点においてもトリ抗体重鎖偽遺伝子領域は解読されていない。こういったメカニズムの相違や抗体遺伝子座の構造上の問題から、トリB細胞から所望のヒト抗体を産生させるシステムを構築することは非常に困難であると考えられていた。
 こういった背景の下、DT40細胞の抗体遺伝子座に存在する可変領域および偽遺伝子領域をヒト由来の配列に置換した細胞株を作製したことが報告された(非特許文献3)。本文献においては、トリ抗体可変領域を蛍光タンパク質であるGreen Fluorescent Protein (GFP)およびCyan Fluorescent Protein (CFP)ならびにリコンビナーゼ認識部位であるattP配列を含む遺伝子配列に置換した後、リコンビナーゼを利用してヒト抗体可変領域および後述する偽遺伝子配列を挿入したDT40細胞を作製し、遺伝子変換が起きることを確認している(非特許文献3、4)。しかし、定常領域はトリ由来配列をそのまま利用しているため、発現する抗体分子はヒト-トリのキメラ抗体であり、抗体の免疫原性は非常に高い。さらに、軽鎖はヒト由来のκ鎖とトリ由来のλ鎖との融合タンパクになっていることから、その抗体分子は天然のヒト抗体とは大きく異なっている。よって、ヒトの治療用抗体とするにはさらなるキメラ化の操作が必要であり、キメラ化・ヒト化の過程において親和性や機能が変化する可能性が残っていることは変わらない。また、ここで用いた偽遺伝子領域の配列は、軽鎖については、挿入したヒト抗体可変領域のそれぞれのCDR配列を1アミノ酸ずつTyrまたはTrpへ置換した人工配列の集合体であるminimalist libraryや、天然に存在するヒト抗体可変領域のバリアントに対してフレームワーク領域に変異を施したものを利用しており、重鎖については、挿入したヒト抗体可変領域のそれぞれのCDR配列を1アミノ酸ずつTyrまたはTrpへ置換した人工配列およびその変異配列で構成されている。これらは、少ない偽遺伝子で多様な抗原に対応することを目的として設計されたものであるが、該細胞における抗原特異的な抗体の取得については報告されていない。
特許4214234号 WO2008/047480 WO97/07671
Seoら、Nature Biotech, Volume 23, pp731-735, 2005 Recombinant Antibodies for Immunotherapy, pp100-108, 2009, Cambridge Press Schusserら、PLOS ONE, Volume 8 issue 11 e80108, 2013 Leightonら、Frontiers in Immunology, Volume 6 Article 126, 2015
 上記事情に鑑み、本発明の目的は、多様なヒト抗体を産生するトリB細胞を提供することである。
 さらに、本発明の目的は、該トリB細胞から抗体を産生する方法を提供することである。
 発明者らは、多様なヒト抗体を産生する細胞の作製につき、鋭意研究を行った結果、トリB細胞の抗体軽鎖および重鎖遺伝子座において、ヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域および定常領域の遺伝子を挿入または置換したところ、ヒト抗体を発現する形質転換細胞を得ることに成功した。また、発明者らは、さらに偽遺伝子として軽鎖・重鎖に複数個のヒト由来の抗体可変領域配列を挿入した形質転換細胞を作製し、この細胞をHDAC阻害剤処理したところ、本来のトリB細胞と同様に遺伝子変換が起きることを確認した。さらに、発明者らは、該細胞から抗原特異的なヒト抗体を産生させることに成功した。
 すなわち、発明者らは、前記細胞を調製することで、該細胞から可変領域が種々に変更された抗体を取得できることを確認し、ヒト抗体であって、多様な抗体を産生させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
 すなわち、本発明の以下の(1)~(21)である。
(1)抗体軽鎖遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体重鎖遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体軽鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換され、および/または、抗体重鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換されたトリB細胞。
(2)抗体軽鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体軽鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の数が、5 以上であることを特徴とする上記(1)に記載のトリB細胞。
(3)抗体重鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体重鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の数が、5以上であることを特徴とする上記(1)に記載のトリB細胞。
(4)抗体軽鎖偽遺伝子座において挿入、または該抗体軽鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の数が、15以上であることを特徴とする上記(1)に記載のトリB細胞。
(5)抗体重鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体重鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の数が、15以上であることを特徴とする上記(1)に記載のトリB細胞。
(6)抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来DNA配列の位置が、ヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列が存在する位置の上流であり、および、抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域由来DNA配列の位置が、ヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列が存在する位置の上流であることを特徴とする上記(1)乃至(5)のいずれかに記載のトリB細胞。
(7)抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来DNA配列および定常領域由来DNA配列の位置が、トリ抗体軽鎖可変領域および定常領域の位置よりも上流であり、および、抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域および定常領域の位置が、トリ抗体重鎖可変領域および定常領域の位置よりも上流であることを特徴とする上記(6)に記載のトリB細胞。
(8)前記ヒト抗体重鎖がγ鎖であることを特徴とする上記(1)乃至(7)のいずれかに記載のトリB細胞。
(9)前記ヒト抗体軽鎖がλ鎖またはκ鎖であることを特徴とする上記(1)乃至(8)のいずれかに記載のトリB細胞。
(10)前記トリB細胞が、細胞表面にヒト抗体を発現し、かつ培養液中にもヒト抗体を分泌する能力を有することを特徴とする上記(1)乃至(9)のいずれかに記載のトリB細胞。
(11)トリB細胞がDT40細胞であることを特徴とする上記(1)乃至(10)のいずれかに記載のトリB細胞。
(12)クロマチンを弛緩させる処理を行った上記(1)乃至(11)のいずれかに記載のトリB細胞。
(13)前記クロマチンを弛緩させる処理が、該トリB細胞中のヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させることである上記(12)に記載のトリB細胞。
(14)前記ヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させる方法が、該トリB細胞中のヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の発現を低下または喪失させることである上記(13)に記載のトリB細胞。
(15)前記ヒストン脱アセチル化酵素がHDAC2であることを特徴とする上記(14)に記載のトリB細胞。
(16)前記ヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させる方法がHDAC阻害剤で処理することを特徴とする上記(13)に記載のトリB細胞。
(17)上記(12)乃至(16)のいずれかに記載のトリB細胞からなる抗体産生細胞ライブラリー。
(18)上記(1)乃至(16)のいずれかに記載のトリB細胞から抗体を作製する方法。
(19)上記(18)に記載の方法により取得される抗体。
(20)上記(1)乃至(16)のいずれかに記載のトリB細胞を作製するためのキット。
(21)上記(18)に記載の方法により抗体を産生させるためのキット。
 本発明の細胞から、多様な抗原を認識するヒト抗体を簡便、かつ、迅速に取得することが可能となる。
DT40細胞の抗体軽鎖定常領域および抗体軽鎖可変領域を、ヒト由来抗体(IgG)軽鎖定常領域および抗体軽鎖可変領域で置換するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。cpV1~cpV3:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖偽遺伝子領域下流へ、遺伝子変換確認用配列(GC確認配列;ヒト抗体可変領域に由来する配列からなるヒト偽遺伝子。以下同じ。)を挿入するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。cpV1~cpV3:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖偽遺伝子領域の欠損、およびDT40細胞の抗体軽鎖偽遺伝子領域をGC確認配列で置換するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。cpV25、cpV1:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体重鎖定常領域および抗体可変領域を、ヒト由来抗体(IgG)重鎖定常領域および抗体重鎖可変領域で置換し、さらに、GC確認配列を挿入するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域で置換する手順と、得られたDT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。cpV1~cpV3:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域遺伝子で置換し、さらに、DT40細胞の抗体軽鎖偽遺伝子領域の下流にGC確認配列を挿入するための手順と、得られたDT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。cpV1~cpV3:トリ偽遺伝子、hpV1~hpV2:ヒト偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域遺伝子で置換し、さらに、DT40細胞の抗体軽鎖偽遺伝子領域を欠損させるための手順と、得られたDT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。cpV25、cpV1:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域遺伝子で置換し、さらにDT40細胞の偽遺伝子領域をGC確認配列に置換するための手順と、得られたDT40細胞抗体軽鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。cpV25、cpV1:トリ偽遺伝子、hpV1、hpV2:ヒト偽遺伝子 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域に、ヒト由来抗体軽鎖遺伝子領域を挿入した細胞株、または、DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト抗体軽鎖遺伝子で置換した細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体重鎖可変領域および抗体重鎖定常領域に変える手順と、得られたDT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体重鎖可変領域および抗体重鎖定常領域遺伝子に変え、さらに、DT40細胞の重鎖偽遺伝子領域の下流にGC確認配列を挿入するための手順と、得られたDT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域、および、使用したターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。hpV1、hpV2:ヒト偽遺伝子 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体重鎖可変領域および抗体重鎖定常領域遺伝子に変え、さらに、DT40細胞の重鎖偽遺伝子領域の下流にGC確認配列を挿入した細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 DT40細胞の抗体軽鎖の偽遺伝子領域を、ヒトIgλの可変領域由来配列から成る偽遺伝子(ヒト軽鎖偽遺伝子)で置換する手順と、得られたDT40細胞の抗体軽鎖領域、および、使用したターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体重鎖定常領域を、ヒトIgG1の重鎖遺伝子領域に置換するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体重鎖可変領域に、ヒト由来抗体重鎖可変領域と5個のヒトIgγの可変領域由来配列から成る偽遺伝子(ヒト重鎖偽遺伝子)を導入するためのターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域で置換し、ヒト軽鎖偽遺伝子配列(5個)を挿入する手順と、得られたDT40細胞抗体軽鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。cpV25、cpV1:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域に、ヒト由来抗体重鎖可変領域および抗体重鎖定常領域を導入し、ヒト重鎖偽遺伝子配列(5個)を挿入する手順と、得られたDT40細胞抗体重鎖遺伝子領域を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域および抗体重鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体遺伝子に変え、ヒト軽鎖偽遺伝子配列(5個)を挿入した細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体軽鎖可変領域および抗体軽鎖定常領域で置換し、ヒト重鎖偽遺伝子配列(15個)を挿入する手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。pV25、pV1:トリ偽遺伝子 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域に、ヒト由来抗体重鎖可変領域および抗体重鎖定常領域を導入し、ヒト重鎖偽遺伝子配列(15個)を挿入する手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域および抗体重鎖遺伝子領域を、ヒト由来抗体遺伝子領域に変え、ヒト軽鎖偽遺伝子配列(15個)を挿入したL15/H15細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 図21に示した結果について、誤りのあったデータを優先日前のデータに基づいて修正したものを示す。 DT40細胞の抗体重鎖可変領域を、ヒト由来抗体重鎖可変領域で置換すると同時に、DT40細胞の抗体重鎖可変領域にRMCE用カセット配列を挿入する手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体重鎖遺伝子領域に、ヒト重鎖偽遺伝子配列を30個挿入する手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域および抗体重鎖遺伝子領域をヒト由来抗体遺伝子領域に変え、軽鎖にヒト軽鎖偽遺伝子配列を15個、重鎖にヒト重鎖偽遺伝子配列を30個挿入したL15/H30細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域に、ヒト軽鎖偽遺伝子配列を30個挿入する手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域および抗体重鎖遺伝子領域をヒト由来抗体遺伝子領域に変え、軽鎖にヒト軽鎖偽遺伝子配列を30個、重鎖にヒト重鎖偽遺伝子配列を30個挿入したL30/H30細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域および抗体重鎖遺伝子領域をヒト由来抗体遺伝子領域に変え、軽鎖にヒト軽鎖偽遺伝子配列を30個、重鎖にヒト重鎖偽遺伝子配列を15個挿入したL30/H15細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 RMCE法を利用して、L30/H15細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、ヒト重鎖偽遺伝子配列を順向きまたは逆向きに15個追加挿入して合計30個にする手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。図中、forおよびrevは、各々、順向き、逆向きを意味する。以下、他の図において同様。 RMCE法を利用してL30/H15細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、順向きまたは逆向きにヒト重鎖偽遺伝子配列15個を追加挿入した細胞株(順向きはL30/H15f15f細胞株、逆向きはL30/H15r15f細胞株)が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 L30/H15f15f細胞株およびL30/H15r15f細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、各々、ヒト重鎖偽遺伝子配列を順向きまたは逆向きに15個追加挿入して合計45個にする手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 L30/H15f15f細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、順向きにヒト重鎖偽遺伝子配列15個を追加挿入した細胞株(L30/H15f15f15f細胞株)が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 L30/H15r15f細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、逆向きにヒト重鎖偽遺伝子配列15個を追加挿入した細胞株(L30/H15r15r15f細胞株)が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 RMCE法を利用して、L30/H15f15f15f細胞株およびL30/H15r15r15f細胞株の抗体重鎖遺伝子領域に、各々、ヒト重鎖偽遺伝子配列を順向きにまたは逆向きに15個追加挿入して合計60個にする手順と、用いたターゲティングベクターの構造を模式的に示した図である。 DT40細胞の抗体軽鎖遺伝子領域にヒト軽鎖偽遺伝子配列30個を挿入し、抗体重鎖遺伝子領域にヒト重鎖偽遺伝子60個を挿入した細胞株が産生する抗体について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 TSA処理したL15/H15細胞株から、ADLibシステムを用いてPlexin A4タンパク質に結合する細胞集団を分離し、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 図36のP5エリアの細胞集団に対してsingle cell sortingを行った後、96well plateに播種して培養し、各ウェルの細胞上清に対し、ELISA解析を行った結果を示す。横軸は、測定試料である細胞上清が由来する96well plateの各ウェル画分の番号を示す。Trypsin inhibitor:トリプシンインヒビター、SA:ストレプトアビジン、OA:オボアルブミン ウェスタンブロット法により、陽性クローンである#62および#20から分泌されている抗体の分析を行った。還元および非還元の条件でサンプルを処理し、ヤギ抗ヒトIgGγ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 ウェスタンブロット法により、陽性クローンである#62および#20から分泌されている抗体の分析を行った。還元および非還元の条件でサンプルを処理し、ヤギ抗ヒトIgGλ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 ウェスタンブロット法により、陽性クローンである#62および#20から分泌されている抗体の分析を行った。還元および非還元の条件でサンプルを処理し、ヤギ抗トリIgM抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 TSA処理したL15/H15細胞株から、ADLibシステムを用いてHis-AP-hSema3Aに結合する細胞集団の1次スクリーニングの結果を示す。 His-AP-hSema3Aに結合する細胞集団をモノクローン化した後に行った2次スクリーニングの結果を示す。 ウェスタンブロット法により、2次スクリーニング後の陽性クローンから分泌されるHis-AP-hSema3A抗体の分析を行った。還元および非還元の条件でサンプルを処理し、ヤギ抗ヒトIgGγ抗体またはヤギ抗ヒトIgGλ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 TSA処理したL30/H45細胞株から、ADLibシステムを用いてIL-8に結合する細胞集団の1次スクリーニングの結果を示す。 IL-8に結合する細胞集団をモノクローン化した後に行った2次スクリーニングの結果を示す。 ウェスタンブロット法により、2次スクリーニング後の陽性クローンから分泌されるIL-8抗体の分析を行った。還元および非還元の条件でサンプルを処理し、ヤギ抗ヒトIgGγ抗体またはヤギ抗ヒトIgGλ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
 本発明の実施形態の1つは、抗体軽鎖遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体重鎖遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体軽鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換され、および/または、抗体重鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換されたトリB細胞である。
 本発明のB細胞は、トリ由来の抗体産生B細胞であり、例えば、ニワトリ由来のDT40細胞を挙げることができる。その他にも、遺伝子変換によって抗体配列を多様化するシステムを有するウシ、ヒツジ、ウサギなどのB細胞も用いることができる。
 また、本発明のトリB細胞は、その抗体軽鎖遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、その抗体重鎖遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体軽鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入、またはヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換され、および/または、抗体重鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換されている他、他の遺伝子領域等に変異や修飾が施されていてもよい。
 ここで、抗体軽鎖遺伝子座とは、抗体の軽鎖可変領域および軽鎖定常領域をコードする遺伝子が存在する遺伝子座のことであり、抗体重鎖遺伝子座とは、抗体の重鎖可変領域および重鎖定常領域をコードする遺伝子が存在する遺伝子座のことである。
 また、偽遺伝子とは、機能している遺伝子と類似の配列ではあるが、発現する遺伝子としては機能していないDNA配列のことをいう。トリの抗体軽鎖偽遺伝子座および重鎖偽遺伝子座は、各々、機能遺伝子が存在する抗体軽鎖遺伝子座および重鎖遺伝子座よりも上流に位置しており、遺伝子変換により多様性を生み出している。ヒトのゲノム中の抗体遺伝子座には偽遺伝子は存在しないが、本明細書においては、挿入されたヒト抗体可変領域と遺伝子変換を生じさせる目的でトリ抗体遺伝子座に導入された、ヒト抗体可変領域と類似の配列を持つDNA配列を「ヒト偽遺伝子」と総称する。
 トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体軽鎖遺伝子座の配列と置換されているヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来のDNA配列は、各々、ヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域の全ての配列であっても、あるいは、その一部の配列であってもよい。また、トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の位置は、ヒト抗体軽鎖定常領域由来のDNA配列が挿入されている位置の上流であることが望ましい。
 同様に、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体重鎖遺伝子座の配列と置換されているヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体定常領域由来のDNA配列は、各々、ヒト重鎖可変領域および重鎖定常領域の全ての配列であっても、あるいは、その一部の配列であってもよい。また、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の位置は、ヒト抗体重鎖定常領域由来のDNA配列が挿入されている位置の上流であることが望ましい。
 また、トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来のDNA配列の位置は、トリ抗体軽鎖可変領域およびトリ抗体軽鎖定常領域の位置よりも上流であることが望ましい。同様に、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域および重鎖定常領域由来のDNA配列の位置は、トリ抗体重鎖可変領域および重鎖定常領域の位置よりも上流であることが望ましい。
 本実施形態において、トリ抗体軽鎖偽遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体軽鎖偽遺伝子座のDNA配列と置換されているヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列(本明細書および図面においては、「ヒト軽鎖偽遺伝子配列」とも記載する)は、公知のヒト抗体軽鎖可変領域の配列を用いることができる。こういった配列情報は、たとえばV Base (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)のようなウェブサイトからも入手することができる。このヒト軽鎖偽遺伝子配列は、ヒト抗体軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の全部またはその一部を含むDNA配列を使用することができるが、各CDRが、トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体軽鎖遺伝子座の配列と置換されているヒト抗体軽鎖可変領域のDNA配列や他のヒト軽鎖偽遺伝子配列のCDRと同一でないことが望ましい。また、ヒト軽鎖偽遺伝子配列のフレームワーク(FW)領域については、トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体軽鎖遺伝子の配列と置換されたヒト抗体軽鎖可変領域のそれと一致していることが望ましい。たとえば、抗体軽鎖可変領域として配列番号5のDNA配列を選択した場合、軽鎖偽遺伝子は配列番号69~配列番号88および配列番号127~配列番号141に示す配列などを組み合わせて使用することができる。
 同様に、トリ抗体重鎖偽遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体重鎖偽遺伝子座の配列と置換されているヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列(本明細書および図面においては、「ヒト重鎖偽遺伝子配列」とも記載する)は、公知のヒト抗体重鎖可変領域の配列を用いることができる。こういった配列情報は、たとえばV Base(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)のようなウェブサイトからも入手することができる。このヒト重鎖偽遺伝子配列は、ヒト抗体重鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の全部またはその一部を含むDNA配列を使用することができるが、各CDRが、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入され、またはトリ抗体重鎖遺伝子座の配列と置換されているヒト抗体重鎖可変領域のDNA配列や他のヒト重鎖偽遺伝子配列のCDRと同一でないことが望ましい。また、ヒト重鎖偽遺伝子配列のフレームワーク(FW)領域については、トリ重鎖抗体遺伝子座に挿入され、またはトリ重鎖抗体遺伝子座の配列と置換されたヒト抗体重鎖可変領域のそれと一致していることが望ましい。たとえば、抗体重鎖可変領域として配列番号30のDNA配列を選択した場合、重鎖偽遺伝子は配列番号89~配列番号108、配列番号127~配列番号141、配列番号147~配列番号161および配列番号165~配列番号179に示す配列などを組み合わせて使用することができる。
 本実施形態において、トリ抗体軽鎖偽遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の位置は、トリ抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域より上流に位置することが望ましく、また、トリ抗体軽鎖偽遺伝子配列が残っている場合においては、トリ抗体軽鎖偽遺伝子領域より下流に位置していることが望ましい。同様に、トリ抗体重鎖偽遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の位置は、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域より上流に位置することが望ましく、また、トリ抗体重鎖偽遺伝子配列が残っている場合においては、トリ抗体重鎖偽遺伝子領域より下流に位置していることが望ましい。
 また、本実施形態において、トリ抗体可変領域の上流に偽遺伝子として挿入または置換されるヒト抗体可変領域由来のDNA配列は、トリ抗体可変領域に挿入または置換されたヒト抗体可変領域配列と同じ向きでも逆向きでも、どちらでも利用可能である。
 トリ抗体軽鎖偽遺伝子座に挿入され、または、トリ抗体軽鎖偽遺伝子座の偽遺伝子を置換する(置き換える)ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の数は、好ましくは、2以上、より好ましくは5以上、7以上、9以上、11以上、13以上、さらに好ましくは15以上、20以上、25以上である。同様に、トリ抗体重鎖偽遺伝子座に挿入され、または、トリ抗体重鎖偽遺伝子座の偽遺伝子を置換する(置き換える)ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の数は、好ましくは、2以上、より好ましくは5以上、7以上、9以上、11以上、13以上、さらに好ましくは15以上、20以上、25以上、もっとも好ましくは30以上である。
 なお、ここでいうヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列またはヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列は、FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4のいずれか1個を含み、可変領域にわたる領域に含まれる連続した一連の可変領域相同配列を以って1個として取り扱う。
 本実施形態において、トリ抗体重鎖遺伝子座に挿入されるヒト抗体重鎖の種類は、γ鎖、s鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、γ鎖である。また、トリ抗体軽鎖遺伝子座およびトリ抗体軽鎖偽遺伝子座に挿入されるヒト抗体軽鎖の種類は、λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。
 本実施形態において、遺伝子導入を行ったトリB細胞を抗体ライブラリーとして利用するためには、該トリB細胞が細胞膜表面にヒト抗体を発現するのみでなく、培養液中にヒト抗体を分泌する能力を有することが好ましい。このためには、導入したヒト抗体遺伝子が転写される際に、生体における発現制御の機構に類似したalternative splicingが適切に起こる必要がある。そのため、定常領域の遺伝子導入においては、トリ抗体重鎖定常領域と完全に同じゲノム構造を利用することが理想的であるが、トリの当該ゲノム領域の塩基配列は2015年3月の時点で解読されていないため、これを用いることができない。本実施形態においてはマウス抗体重鎖ゲノム配列中のイントロン配列を利用し、その結果、細胞膜表面と分泌型の両方のヒト抗体を同時に発現させることに成功していることから、マウスやヒトなど、公知の哺乳類動物由来のイントロン配列で代用することも可能である。
 本実施形態において、トリ抗体遺伝子座にヒト抗体遺伝子を挿入および/またはヒト抗体遺伝子で置換する方法としては、相同組換えを利用したノックイン法が用いられる。また、トリ抗体鎖遺伝子座の偽遺伝子領域にヒト抗体可変領域由来配列を挿入および/またはヒト抗体遺伝子で置換する方法としては、相同組換えを利用したノックイン法のほか、部位特異的組換えを利用したRecombinase mediated cassette exchange (RMCE)法が好ましく利用できる。
 本実施形態で作製されるトリB細胞には、上述のように、ヒトの抗体遺伝子座由来のDNA配列を挿入またはヒトの抗体遺伝子座由来のDNA配列で置換した細胞の他、該細胞のヒト由来抗体軽鎖または重鎖可変領域に、さらに、多種多様な変異を導入したトリB細胞も含まれる。抗体の多様性は、可変領域が再編成されることで、多様な可変領域の配列が生じることによって達成される。よって、本実施形態で作製されるトリB細胞には、可変領域の再編成に必要な多様な変異を導入する処理が施されたトリB細胞も含まれる。ここで、可変領域の再編成に必要な変異を導入する方法は、例えば、XRCC2およびXRCC3を欠失させたB細胞を使用する方法(例えば、Cumber et al., Nature Biotech. 204:1129-1134 2002または特開2003-503750など)、AID遺伝子の発現を制御する方法(例えば、Kanayama et al., Nucleic Acids Res. 34:e10.,2006または特開2004-298072など)、あるいは、クロマチンを弛緩させて遺伝子変換を促進する方法(例えば、特許文献1、特許文献2または非特許文献1など)など、当該技術分野で公知の方法を利用することができる。とりわけ、好ましい方法は、クロマチンを弛緩させて遺伝子変換を促進させる方法である。
 トリB細胞中のクロマチンを弛緩させる方法としては、例えば、トリB細胞中に内在するヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)活性を何らかの方法で阻害して、該細胞内における遺伝子変換を著しく促進させる方法をあげることができる(詳細は、上記特許文献1、特許文献2または非特許文献1などを参照のこと)。細胞に内在するHDACの活性を阻害する方法として、HDAC阻害剤で、本発明のB細胞を処理する方法(特許文献1または非特許文献1を参照)やトリB細胞中のHDAC遺伝子の機能を低下または喪失させる方法(特許文献2を参照)などを使用することができる。HDAC阻害剤は、HDACの活性を阻害するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、トリコスタチンA(TSA)、ブチル酸、バルプロ酸、suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)、CBHA(m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamide)、PTACH、Apicidin、Scriptaid、M344、APHA compound 8、BML-210、Oxamflatin、MS-275、などが使用可能である。その他、可能であれば、活性阻害の対象であるHDACの不活性型タンパク質(ドミナントネガティブ)などを阻害物質として使用してもよい。
 HDAC遺伝子の機能を低下または喪失させる場合、遺伝子機能を低下または喪失させる対象となるHDACのアイソフォームは、使用する抗体産生B細胞によっても異なるが、好ましくは、HDAC2遺伝子である(詳細は、特許文献2を参照のこと)。
 前記実施形態に関連した本発明の実施形態には、本発明のトリB細胞からなる抗体産生細胞ライブラリーが含まれる。当該細胞ライブラリーとは、本発明のトリB細胞であって、様々な抗原に対する抗体を産生する該トリB細胞の集団のことである。本発明の上記実施形態に記載したトリB細胞は、トリ抗体偽遺伝子座にヒト由来の抗体可変領域由来のDNA配列を挿入等することで産生される抗体可変領域配列に多様性が生じ、また、クロマチンの弛緩等の処理により、さらに抗体可変領域の配列が多様化し、様々な抗原に対する抗体を産生し得る能力を持つ細胞である。
 従って、本発明のトリB細胞を複数含む集団は、多様な抗原に対する抗体を産生する細胞集団であるということができる。
 本発明の他の実施形態は、本発明のトリB細胞から抗体を産生する方法、および、調製された抗体である。
 本発明のトリB細胞から産生される抗体は、ヒト型抗体であり、より好ましくは、ヒト抗体である。ヒト型抗体とは、産生される抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列に、トリ遺伝子由来の配列が一部含まれた抗体のことであり、ヒト抗体とは、産生される抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列が全てヒト遺伝子由来の配列である抗体のことである。
 本発明のトリB細胞を該細胞に適した培養条件で培養を行うと、ヒト型抗体またはヒト抗体を産生する。DT40細胞のようなトリB細胞由来の細胞株においては、それほど高い効率ではないが、抗体遺伝子座において遺伝子変換が生じていることが知られている。従って、本発明のトリB細胞においても、遺伝子変換が生じており、ヒト由来の抗体遺伝子を挿入された抗体遺伝子座の遺伝子変換によって、産生される抗体の第一次の多様性が獲得されている。さらに、その上で、本発明のトリB細胞のクロマチンを弛緩させることにより、抗体遺伝子座における遺伝子変換効率をさらに上昇させることで、より多様な抗体を産生し得るトリB細胞の集団を調製することが可能である。このようなクロマチンの弛緩を利用して、所望の抗原特異性を示す抗体を産生するトリB細胞を選択するために、ADLibシステムを利用することができる。前述の抗体産生細胞ライブラリーは、ADLibシステムを利用することによっても調製が可能である(特許文献1または非特許文献1を参照のこと)。
 また、特に、膜結合蛋白質に対する所望の抗体を取得する方法としては、ADLib axCELL(antigen expressing cell)法を利用することができる(WO2010/064454)。
 本発明の他の実施形態には、本発明のトリB細胞の作製または抗体を産生させるためのキットが含まれる。
 トリB細胞を作製するためのキットとしては、トリB細胞を培養するために必要な培地や必要なサプリメントなどの他、トリB細胞の抗体遺伝子座等において、ヒト抗体遺伝子由来のDNA配列を挿入あるいは、ヒト抗体遺伝子由来のDNA配列で置換を行うためのベクターや、試薬類が含まれる。さらには、抗体産生細胞ライブラリーを調製するために必要な要素、例えば、HDAC阻害剤やHDAC遺伝子の機能低下または機能喪失を行うために必要な試薬類が含まれていてもよい。
 さらに、抗体を産生するためのキットには、所望の抗原特異性を有する抗体を選択するための試薬類として、例えば、種々の抗原、磁気ビーズなどの他、磁気ビーズ調製用試薬、抗体選択に使用される標識抗体、ELISAなどの検査に必要なプレートなど、抗体の作製に必要と考えられるものであれば、いかなる物が含まれていてもよい。
 以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
遺伝子変換の確認
1.ベクターの調製
1-1.トリ抗体軽鎖(Igλ)の定常領域・可変領域の置換(human LC KI vector)
 トリIgλの定常領域および可変領域を置換するために、図1に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)ヒトIgλの可変領域および定常領域
 ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ramosから調製したcDNAを鋳型として、センスプライマー(TCCACCATGGCCTGGGCTCTG)(配列番号1)とアンチセンスプライマー(GTTGAGAACCTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC)(配列番号2)とを用いたPCRにより、ヒト抗体軽鎖(Igλ)の可変領域および定常領域を増幅し、pGEM-T-Easy(プロメガ社)にクローニングし、pGEM-hIgG1-LCを得た。このプラスミドpGEM-hIgG1-LCを鋳型として、センスプライマー(ATTGGCGCGCCTCTCCAGGTTCCCTGGTGCAGGCACAGTCTGCCCTGACTCAGC)(配列番号3)とアンチセンスプライマー(TTCCATATGAGCGACTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC)(配列番号4)とを用いたPCRにより、ヒトIgλの可変領域(配列番号5)を得た。
また、pGEM-hIgG1-LCを鋳型として、センスプライマー(ATTGGCGCGCCTCTGCCTCTCTCTTGCAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTC)(配列番号6)とアンチセンスプライマー(GGAATTCCATATGGAGTGGGACTACTATGAACATTCTGTAGGGG)(配列番号7)とを用いたPCRによりヒトIgλの定常領域(配列番号8)を得た。
(2) Left Arm
 ニワトリB細胞株DT40のゲノムDNAを鋳型にして、センスプライマー(GAGATCTCCTCCTCCCATCC)(配列番号9)とアンチセンスプライマー(CAAAGGACACGACAGAGCAA)(配列番号10)とを用いたPCRによりトリIgλの可変領域上流から定常領域下流までの領域を増幅した。電気泳動によりFunctional allele(機能性対立遺伝子)とNon-functional allele(非機能性対立遺伝子)に分離し、約8.0kbpのFunctional alleleを切り出し、pGEM-T-Easyにクローニングし、pGEM-cIgM-LCgenomeを得た。pGEM-cIgM-LCgenomeを鋳型にして、センスプライマー(TGTCTCGAGTGAAGGTCACCAAGGATGG))(配列番号11)とアンチセンスプライマー(TTAAGCTTGGAGAGGAGAGAGGGGAGAA)(配列番号12)とを用いたPCRにより、配列番号13に示すLeft Armを得た。
(3)Center Arm
pGEM-cIgM-LCgenomeの配列解析からトリIgλの可変領域と定常領域の間に位置するイントロン領域の配列を決定し、配列番号14に示すCenter Arm(途中に、両端にloxP配列を有するブラストサイジン耐性遺伝子を挿入している)を合成した。
(4) Right Arm
 pGEM-cIgM-LCgenomeを用いてトリIgλの定常領域の下流領域の配列を決定し、配列番号15に示すRight Arm(途中に、両端にlox2272配列を有するネオマイシン耐性遺伝子を挿入している)を合成した。
(5) ターゲティングベクターの構築
 pBluescriptに前記のLeft Arm、ヒトIgλ可変領域、Center Arm、ヒトIgλ定常領域、Right Armを図1に示す構造になるよう組み込み、human LC KI vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号16に示す。
1-2.トリ抗体軽鎖(Igλ)の偽遺伝子領域下流へのノックイン(KI-C-IN vector)
 トリIgλの偽遺伝子領域下流に、遺伝子変換を確認するための配列(GC確認配列;ヒトIgλの可変領域由来配列から成るヒト偽遺伝子。)(配列番号17)を挿入するために、まず図2に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)Left Arm
 DT40のゲノムDNAを鋳型にし、センスプライマー(TTCTGTGAGCTGAGAAAAGGAGTGTA)(配列番号18)とアンチセンスプライマー(CCTGCATTGTGGCACAGCGGGGTT)(配列番号19)を用いて、可変領域のプロモーターより上流の4.3kb(偽遺伝子(pV)1~3)をPCRで増幅した後、pCR4blunt-TOPO(ライフテクノロジーズ社)にクローニングし、pCR4-cIgM-LC pV1genomeを得た。この配列に基づき、pV1~3を含む領域(配列番号20)をクローニングし、Left Armとした。
(2)Right Arm
 前項で得たpCR4-cIgM-LCpV1genomeの配列に基づき、pV1とプロモーターの間の領域(配列番号21)にあたる部分をクローニングし、Right Armとした。
(3)ターゲティングベクターの構築
 pCR4blunt-TOPOに前記のLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、Right Armを図2に示す構造になるよう組み込み、KI-C-IN vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号22に示す。
1-3.トリ抗体軽鎖(Igλ)の偽遺伝子領域下流へのGC確認配列の挿入(KI-C-IN-C vector)
 トリIgλの偽遺伝子領域下流に、GC確認配列を挿入するために、図2に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)GC確認用配列
 上記1-1でクローニングしたヒトIgλの可変領域に基づき、それぞれのCDRに3塩基ずつ挿入した変異配列と3塩基ずつ欠損させた変異配列を設計し、それをトリIgλ偽遺伝子領域の非翻訳領域配列を用いて連結したGC確認用配列(配列番号17)を合成した。
(2)ターゲティングベクターの構築
 上記1-2で作製したKI-C-IN vectorに、GC確認用配列を図2に示す構造になるよう組み込み、KI-C-IN-C vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号23に示す。
1-4.トリ抗体軽鎖(Igλ)の偽遺伝子領域の欠損(KI-C-DE vector)
 トリIgλの偽遺伝子領域を欠損させるために、図3に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)Left Arm
 DT40のゲノムDNAを鋳型にし、センスプライマー(CGCTTTGTACGAACGTTGTCACGT)(配列番号24)とアンチセンスプライマー(TACCTGAAGGTCTCTTTGTGTTTTG)(配列番号25)を用いて、pV25より上流の約3.0kbをPCRで増幅した後、pCR4blunt-TOPOにクローニングし、配列番号26に示すLeft Armを得た。
(2)Right Arm
 上記1-2で調製したRight Armと同じものを用いた。
(3)ターゲティングベクターの構築
 pCR4blunt-TOPOに前記のLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、Right Armを図3に示す構造になるよう組み込み、KI-C-DE vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号27に示す。
1-5.トリ抗体軽鎖(Igλ)の偽遺伝子領域をGC確認用配列に置換(KI-C-DE-C vector)
 トリIgλの偽遺伝子領域を、GC確認用配列に置換するために、図3に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)GC確認用配列
 上記1-2で調製したGC確認用配列を用いた。
(2)ターゲティングベクターの構築
 上記1-3で作製したKI-C-DE vector に、前記のGC確認用配列を図3に示す構造になるよう組み込み、KI-C-DE-C vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号28に示す。
1-6.トリ抗体重鎖(IgM)の定常領域・可変領域へのノックイン
 トリIgM(IgM)の可変領域から定常領域μ1にかけての領域を、ヒト抗体重鎖(IgG1)に置換するために、図4に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)ヒトIgG1定常領域
 ヒトIgG1 を含むヒトゲノム染色体14 32.33のショットガンシークエンシングで得られた配列のうち、IgG1に相当する配列を取得した(アクセッション番号:NW_001838121.1)。41520番塩基と43117番塩基の間の配列から“IGH1”の”C_region”にあたるCH1, hinge, CH2, CH3, transmembrane domainの配列を抽出し、イントロンをマウスIgG2a由来の配列に置き換えた配列を設計し、合成によってヒトIgG1定常領域配列(配列番号29)を得た。
(2)ヒトIgG1可変領域
 ヒトの生殖細胞由来のIgG1可変領域遺伝子の配列に基づいて、VH3-23, D5-12, JH1配列を連結した配列を設計し、トリ由来の分泌シグナル配列やスプライシングシグナル配列を付加して、ヒトIgG1可変領域(配列番号30)とした。
(3)Left Arm
 DT40のゲノムDNAを鋳型にして、センスプライマー (TTCCCGAAGCGAAAGCCGCGT)(配列番号31) とアンチセンスプライマー (ACTCACCGGAGGAGACGATGA)(配列番号32)を用いて、トリIgM可変領域上流から可変領域にかけての領域をPCRで増幅し、約4.1kbpのフラグメントをクローニングし、pCR4 Blunt-TOPO-cIgM-HC pV1genomeを得た。この配列に基づき、3’側にVlox配列を付加したLeft Arm(配列番号33)を設計・合成した。
(4)Center Arm 1
 上記のLeft Armのクローニングの際にクローニングしたトリIgM可変領域上流から可変領域にかけての約4.1kbpの配列に基づきトリIgM可変領域上流の約1.4kbpに相当するCenter Arm 1を合成した(配列番号34)。
(5)Center Arm 2
 DT40のゲノム DNAを鋳型にして、センスプライマー (GGGGATCCTGGGTCAGTCGAAGGGGGCG)(配列番号35)とアンチセンスプライマー(GTGCGGCCGCCAAAAGCGGTAAAATCCACCC)(配列番号36) を用いて、トリIgM可変領域下流の約4.3kbpをPCRで増幅した後クローニングし、配列番号37に示すCenter Arm 2を得た。
(6)Right Arm
 DT40のゲノム DNAを鋳型にして、センスプライマー (CCAAACCACCTCCTGGTGTCC)(配列番号38)とアンチセンスプライマー (CAAACCAAAACTACGGATTCTCTGACC)(配列番号39)を用いて、トリIgM定常領域μ2を含む約0.9kbpをPCRで増幅した後クローニングし、配列番号40に示すRight Armを得た。
(7)ターゲティングベクターの構築
 pBluescriptに前記のLeft Arm、マルチクローニングサイト、Center Arm1、ヒトIgG1可変領域、ブラストサイジン耐性遺伝子、Center Arm 2、ヒトIgG1定常領域、ネオマイシン耐性遺伝子、Right Armを図4に示す構造になるよう組み込み、human HC V-C vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号41に示す。
1-7.トリ抗体重鎖(IgM)の定常領域・可変領域・偽遺伝子領域へのノックイン(human HC KI vector)
 トリIgMの偽遺伝子領域下流から定常領域μ1にかけての領域に、遺伝子変換を確認するための配列(GC確認配列;ヒトIgγの可変領域由来配列から成るヒト偽遺伝子。)、ヒトIgG1可変領域およびヒトIgG1定常領域を挿入するために、図4に示すようなターゲティングベクターを作製した。それぞれのパーツの作製方法を以下に示す。
(1)ヒトIgG1定常領域
 上記1-6に記載したヒトIgG1定常領域配列を用いた。
(2)ヒトIgG1可変領域
 上記1-6に記載したヒトIgG1可変領域を用いた。
(3)遺伝子変換確認用配列
 上記1-6で設計したヒトIgγの可変領域に基づき、CDR1を1塩基欠損させ、CDR2を2塩基欠損させ、CDR3を1塩基挿入した変異配列を設計し、それをトリIgγ偽遺伝子領域の非翻訳領域配列を用いて連結したGC確認用配列(配列番号42)を合成した。
(4)Left Arm
 上記1-6に記載したLeft Armを用いた。
(5)Center Arm 1
 上記1-6に記載したCenter Arm 1を用いた。
(6)Center Arm 2
 上記1-6に記載したCenter Arm 2を用いた。
(7)Right Arm
 上記1-6に記載したRight Armを用いた。
(8)ターゲティングベクターの構築
 pBluescriptに前記のLeft Arm、GC確認用配列、Center Arm 1、ヒトIgG1可変領域、ブラストサイジン耐性遺伝子、Center Arm 2、ヒトIgG1定常領域、ネオマイシン耐性遺伝子、Right Armを図4に示す構造になるよう組み込み、human HC KI vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号43に示す。
1-8.Creリコンビナーゼを発現するベクターの構築
 前記で作製したベクターの薬剤耐性遺伝子は両端にloxP配列を付加した形でベクターに組み込んでいるため、遺伝子導入後にCre リコンビナーゼを作用させることで当該遺伝子を除去することができる。そこで、pEGFP-C1(BD Bioscience社、#6084-1)に、配列番号44で示すCreリコンビナーゼ遺伝子を組み込み、配列番号45に示すCre_EGFP-C1を作製した。
2.軽鎖をヒト配列に挿入・置換した細胞株の作製
 宿主はニワトリのB細胞由来細胞株であるDT40を用いた。DT40の培養方法は以下の方法で行った。
 CO2恒温槽を用いて、39.5℃、5 % CO2存在下で培養した。培地はIMDM (ライフテクノロジーズ社)を用い、9 % FBS、1 % ニワトリ血清、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、モノチオグリセロール 50μMを加えて使用した。以下、特に断りがない限り、「培地」とは前記組成のものを指す。
 軽鎖での遺伝子変換を評価するために、下表に示す5種類の細胞株を用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 作製方法を以下に示す。
2-1.可変領域・定常領域をヒト型に置換した細胞株の作製
 上記1-1で調製したhuman LC KI vectorを制限酵素NotIで直鎖状にした後、DT40細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。2 mg/mL のG418および10μg/mLのブラストサイジンを加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座で遺伝子の置換が起こっていた細胞株を選択した。その細胞株に、上記1-8で作製したCre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、フローサイトメトリーによるsingle cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行い、薬剤耐性遺伝子が除去されていることが確認できた細胞株37-3を得た。その後、上記1-2で作製したKI-C-IN vectorを制限酵素NotIで直鎖状にした後、細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418を加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座に遺伝子の挿入が起こっていた細胞株LP1を得た(図5)。
2-2.可変領域・定常領域をヒト型に置換し、さらにトリ偽遺伝子領域の下流に遺伝子変換確認用配列(GC配列)を挿入した細胞株の作製
 上記1-3で調製したKI-C-IN-C vectorを制限酵素NotIで直鎖状にした後、前段で得られた細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418を加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座に遺伝子の挿入が起こっていた細胞株LP9を得た(図6)。
2-3.可変領域・定常領域をヒト型に置換し、さらにトリ偽遺伝子領域を欠損させた細胞株の作製
 上記1-4で調製したKI-C-DE vectorを制限酵素NotIで直鎖状にした後、上記2-1で得られた細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418を加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座に遺伝子の挿入が起こっていた細胞株LP18を得た(図7)。
2-4.可変領域・定常領域をヒト型に置換し、さらにトリ偽遺伝子領域を遺伝子変換確認用配列(GC配列)に置換した細胞株の作製
 上記1-5で調製したKI-C-DE-C vectorを制限酵素Not Iで直鎖状にした後、上記2-1で得られた細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418を加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座で遺伝子の置換が起こっていた細胞株LP20を得た(図8)。
3.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
3-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記2で作製した細胞株の細胞表面に発現している抗体の解析を行った。それぞれの細胞株を培養し、96ウェルプレート(Nunc社、249662)に5 × 105個ずつ分注し、150μLのFACS バッファー(0.3 % 牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS)で2度洗浄した後、Goat anti-Chicken IgM-FITC conjugate(Bethyl社、A30-102F-20)、Goat Anti-Human IgG(Gamma chain specific)R-PE conjugate(Southern biotech社、A2040-09)またはGoat Anti-human lambda PE conjugate(Southern biotech社、2070-09)をFACSバッファーでそれぞれ1000倍、500倍、500倍に希釈した1次抗体液50μLを添加した。氷上暗所で30分インキュベートした後、150μLのFACS バッファーで2度洗浄し、FACS バッファーで1000倍希釈したPI溶液200μLを添加し、懸濁した。この懸濁液をフローサイトメトリー解析に供し、トリIgMおよびヒトIgγ(重鎖)またはヒトIgλ(軽鎖)の発現を解析したところ、図9に示すように、野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株のLP1、 LP9、LP18、LP20ではトリIgMおよびヒトIgλが発現していることを確認した。いずれの細胞株においても、遺伝子導入を行っていないIgγの発現は認められなかった。
3-2.ELISAによる解析
 上記2で作製された細胞から培養上清中に分泌されているトリIgMおよびヒトIgG1の濃度の測定を行った。それぞれの細胞株を、ニワトリ血清を含まない培地で4 × 105 cells/mLに懸濁した後、24-well プレートに2 mLずつ播種し、3日間培養した後、培養液を回収し、0.22μm filterで濾過した後、測定に用いた。
 IgGの測定方法は以下の通りである。1.0μg/mLのGoat anti-Human IgG-Fc affinity purified(Bethyl社、A80-104A)20μLをイムノ384ウェルプレートマキシソープ(Nunc社、464718)に分注し室温で1時間以上反応させ、プレートに固相化した。その後、洗浄液(0.05 % Tween20を含むPBS)で5回洗浄し、ブロッキング液(1 % BSAを含むPBS)50μLを加え、室温で30分間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、測定試料または標準物質となるHuman IgG1 Lambda-UNLB(SouthernBiotech社、0151L-01)を20μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、Goat anti-Human IgG-Fc HRP conjugated(Bethyl社、A80-104P)を1 % BSAおよび0.05 % Tween20を含むPBSで1000倍に希釈したものを20μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985)20μLを加え、室温で3分発色反応させ、1 N硫酸20μLを加えて反応を停止させた。Infinite M1000(TECAN社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。
 IgMの測定にはalphaLISAイムノアッセイ(Perkin Elmer社)のシステムを用いた。Goat anti-chicken IgM antibody (Bethyl社、A30-102A)をChromalinkTM Biotin Labeling Reagent(SoluLink Inc., #B1001-105)を用いてビオチン標識し、ビオチン化抗体を調製した。次に、Goat anti-chicken IgM antibody (Bethyl社、A30-102A)をUnconjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Perkin Elmer社)と結合させ、抗体結合Alpha Screenビーズを調製した。このビオチン標識抗体および抗体結合Alpha Screenビーズを、アッセイバッファー(1 % BSAを含むPBS)でそれぞれ4.5 nMおよび50μg/mLに希釈した後、等量を混合し、トリIgM濃度測定溶液とした。96ウェルプレート(Nunc社)において、トリIgM濃度測定溶液 20μLと測定試料または標準物質となるトリ血清(GIBCO社、16110) 5μLを混合した後、12.5μLずつをAlpha Plate-384(Perkin Elmer社)に分注した。室温で60分反応させた後、アッセイバッファーで80μg/mLに調製したAlphaScreen streptavidinドナービーズ(Perkin Elmer社)を12.5μL加え、室温遮光にて30分間反応させた。その後、EnSpire(Perkin Elmer社)を用いて解析を行った。
 測定結果を表2に示す。野生型のDT40と同様に、形質転換株のLP1、LP9、LP18、LP20でもトリIgMが分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
4.遺伝子変換の確認
 上記3においてヒトIgλ(軽鎖)の発現を確認した細胞株を、2.5 ng/mLのTSAを含む培地で20日間培養した後、1 × 106個の細胞からゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型とし、識別配列を付与したセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を増幅し、アガロースゲル抽出による精製を行った後、QIAGEN PCR Purification Kit(QIGEN社)を用いて濃縮した。ロシュ・ダイアグノスティックス社の次世代シークエンス解析システムを用いてこのサンプルの配列解析を行い、挿入したヒト偽遺伝子配列と同一の遺伝子配列が可変領域に存在するかどうかで遺伝子変換の有無を評価した。その結果を表3に示す。ヒト偽遺伝子配列を含まないLP1、LP18においては遺伝子変換が起こらなかったのに対し、ヒト偽遺伝子配列を持つLP9、LP20においては遺伝子変換が起こっていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
5.重鎖をヒト配列に挿入・置換した細胞株の作製
 重鎖での遺伝子変換を評価するために、表4に示す3種類の細胞株を用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 作製方法を以下に示す。
5-1.重鎖の可変領域・定常領域をヒト型に変換した細胞株の作製
 上記1-6で得られたhuman HC V-C vectorを制限酵素SalIで直鎖状にした後、上記2-2で得られた細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418および10μg/mLのブラストサイジンを加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座で遺伝子の置換が起こっている細胞株T18を得た(図10)。
5-2.重鎖の可変領域・定常領域をヒト型に変換し、偽遺伝子領域下流に遺伝子変換確認用配列(GC確認配列)を挿入した細胞株の作製
 上記1-7で得られたhuman HC KI vectorを制限酵素SalIで直鎖状にした後、上記2-2で得られた細胞株37-3に遺伝子導入した。2 mg/mL のG418および10μg/mLのブラストサイジンを加えた培地で7~10日間培養した。生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行い、目的の遺伝子座で遺伝子の置換が起こっている細胞株T11、T12を得た(図11)。
6.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
6-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3-1に記載した方法に基づき、上記5で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図12に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株であるT18、T11、T12においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した。
6-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載した方法に基づき、上記5で作製した細胞から培養上清中に分泌される抗体の濃度の測定を行った。その結果を表5に示す。6-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、ヒトIgG1を導入したT18, T11, T12はヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
7.遺伝子変換の確認
 上記6で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、センスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号48)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCC ATCAGNNNNNNNNNNCGGTGACCAGGGTGCCCTG)(配列番号49)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。その結果を表6に示す。ヒト偽遺伝子を含まないT18においては全く遺伝子変換が起こらなかったのに対し、ヒト偽遺伝子配列を持つT11、T12においては遺伝子変換が起こっていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
軽鎖・重鎖に各5個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL5/H5細胞株の作製
8.ベクターの調製
8-1.トリ抗体(Igλ)偽遺伝子領域へのノックイン
 トリIgλの偽遺伝子領域を、ヒトIgλの可変領域由来配列から成る偽遺伝子(ヒト軽鎖偽遺伝子)に置換するために、図13に示すようなターゲティングベクターを作製した。作製方法を以下に示す。
(1)ヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列(pVL5)の設計と作製
 データベース上のヒトゲノムのV(D)J組換えを起こしていないイムノグロブリンλ軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を各々5個選択し、1-1でクローニングしたIgλ可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで5個の配列pVL001(配列番号69)、 pVL002(配列番号70)、pVL003(配列番号71)、pVL004(配列番号72)およびpVL005(配列番号73)を設計し、これらを含むヒト軽鎖偽遺伝子配列pVL5(配列番号50)を設計し、遺伝子合成した。
(2)ターゲティングベクターの作製
 上記1-4で作製したKI-C-DE vectorを元に、GC確認用配列を前項のヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列pVL5に置換することで、human LCpV KI vectorを作製した。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号51に示す。
8-2.トリ抗体重鎖(IgM)定常領域の置換
 トリIgMの重鎖定常領域をヒトIgG1に置換するために、図14に示すようなターゲティングベクターを作製した。作製方法を以下に示す。
(1)ヒトIgG1定常領域
 上記1-6で作製したヒトIgG1定常領域を用いた。
(2)Left Arm
 上記1-6で作製したCenter Arm 2を用いた。
(3)Right Arm
 上記1-6で作製したRight Armを用いた。
(4)ターゲティングベクターの作製
 pBluescriptに前記のLeft Arm、ヒトIgG1定常領域配列、ネオマイシン耐性遺伝子、Right Armを組み込み、human CH KI vectorを作製した。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号52に示す。
8-3.トリIgM可変・偽遺伝子領域への挿入
(1)ヒトIgG1可変領域
 上記1-6で調製したヒトIgG1可変領域を用いた。
(2)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH5)の設計と作製
 データベース上のヒトイムノグロブリン重鎖可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を各々5個選択し、上記1-6でクローニングした可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで5個の配列pVH001(配列番号89)、pVH002(配列番号90)、pVH003(配列番号91)、pVH004(配列番号92)およびpVH005(配列番号93)を設計し、これらを含むヒト抗体重鎖偽遺伝子配列pVH5(配列番号53)を設計し、遺伝子合成した。
(3)Left Arm
 上記1-6で調製したLeft Armを用いた。
(4)Center Arm
 上記1-6で調製したCenter Arm 1を用いた。
(5)Right arm
 上記1-6で調製したCenter Arm 2を用いた。確認されたRight Armの配列を配列番号54に示す。
(6)ターゲティングベクターの調製
 pBluescriptに前記のLeft Arm、ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列pVH5、Center Arm、ヒトIgG1可変領域配列、ブラストサイジン耐性遺伝子、Right Armを組み込み、human pVH VH KI vectorを得た。当該ベクターの遺伝子配列を配列番号55に示す。
9.トリ抗体軽鎖および重鎖の遺伝子座に各5個のヒト偽遺伝子を導入したL5/H5細胞株の作製
 上記2-2で得られた細胞株37-3に、上記8-2で調製したhuman CH KI vector、上記8-3で調製したhuman pVH VH KI vector、上記8-1で調製したhuman LC pV KI vectorを遺伝子導入することで、L5/H5細胞株細胞株を作製した(図15)。
 制限酵素SalIで直鎖状にしたhuman CH KI vectorを37-3に遺伝子導入し、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 次に、制限酵素SacIで直鎖状にしたhuman pVH VH KI vectorを遺伝子導入し、10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 最後に、制限酵素NotIで直鎖状にしたhuman LC pV KI vectorを遺伝子導入し、2mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行ったところ、目的の遺伝子座で置換が起こっている細胞株B-B10およびJ-D3を得た(図16、図17)。
10.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
10-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3-1に記載した方法に基づき、上記9で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図18に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株であるB-B10およびJ-D3においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した。
10-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記9で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表7に示す。10-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株のB-B10およびJ-D3ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
11.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。B-B10での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析の結果をそれぞれ表8および表9に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、遺伝子変換によって多様な配列が生み出されていることが示された。また、J-D3においても同様に、遺伝子変換によって多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
トリ抗体の軽鎖・重鎖遺伝子座に各15個のヒト可変領域由来配列を挿入したL15/H15細胞株の作製
12.ベクターの調製
12-1.トリ抗体軽鎖(Igλ)可変・定常領域へのノックイン
 上記1-1に記載した方法に基づき、図19に示すターゲティング用ベクターLambda-VL-CL KI vector 2.0を作製した。
(1)ヒトIgλの可変領域および定常領域
 上記1-1で作製した可変領域および定常領域を用いた。
(2)Left Arm
 上記1-1で作製したLeft Armを用いた。
(3)Center Arm
 上記1-1で作製したCenter Armを用いた。
(4)Right Arm
 上記1-1で決定したトリ抗体軽鎖の定常領域の下流領域の配列に基づき、Right Armを合成した。
(5)ターゲティングベクターの構築
 pBluescriptに前記のLeft Arm、ヒトIgλ可変領域、Center Arm、ヒトIgλ定常領域、Right Armを図19に示す構造になるよう組み込み、Lambda-VL-CL KI vector 2.0(配列番号58)を得た。
12-2.トリ抗体軽鎖(Igλ)偽遺伝子のノックアウト
(1)ヒトIgλ可変領域
 上記1-1に記載した可変領域配列を用いた。
(2)Left Arm
 上記1-2に記載したLeft Arm を用いた。
(3)Center Arm
 上記1-1に記載したLeft ArmをCenter Armとして用いた。
(4)Right Arm
 上記1-1に記載したCenter ArmをRight Armを用いた。
(5)マルチクローニングサイト
 ヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列pVL15を挿入するために、配列番号59に示すマルチクローニングサイトを設計した。
(6)ターゲティングベクターの構築
 pUC19にLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、マルチクローニングサイト、Center Arm, ヒトIgλ可変領域、ブラストサイジン耐性遺伝子、Right Armを組み込み、図19に示すようなターゲティングベクターpVL KI_pUC19_step5_BrRev(配列番号60)を構築した。
12-3.トリ抗体軽鎖(Igλ)偽遺伝子・可変領域へのノックイン
(1)ヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列(pVL15)
 データベース上のヒトイムノグロブリンλ可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を15個選択し、上記1-1でクローニングしたヒトIgλ可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで15個の配列pVL101(配列番号74)、pVL102(配列番号75)、pVL103(配列番号76)、pVL104(配列番号77)、pVL105(配列番号78)、pVL106(配列番号79)、pVL107(配列番号80)、pVL108(配列番号81)、pVL109(配列番号82)、pVL110(配列番号83)、pVL111(配列番号84)、pVL112(配列番号85)、pVL113(配列番号86)、pVL114(配列番号87)、pVL115(配列番号88)を設計し、これらを含むヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列pVL15(配列番号61)を設計し、遺伝子合成した。
(2)ターゲティングベクターの構築
 上記12-2で作製したpVL KI_pUC19_step6_BrRevのマルチクローニングサイトに前項のヒト偽遺伝子配列pVL15を組み込み、図19に示すようなターゲティングベクターpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd(配列番号62)を構築した。
12-4.トリ抗体重鎖(IgM)定常領域へのノックイン
 上記8-2で作製したhuman CH KI vectorを用いた。
12-5.トリ抗体重鎖(IgM)可変領域へのノックイン
(1)ヒトIgG1可変領域
 上記1-6に記載した可変領域配列を用いた。
(2)Left Arm
 上記1-6に記載したCenter Armを用いた。
(3)Right Arm
 上記1-6に記載したRight Armを用いた。
(4)ターゲティングベクターの構築
 pUC19にLeft Arm、ヒトIgG1可変領域、ブラストサイジン耐性遺伝子、Right Armを組み込み、図20に示すようなターゲティングベクターH(X)0・hV(B)_074-009/No4(配列番号63)を作製した。
12-6.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へのノックイン
(1)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH15)
 データベース上のヒトイムノグロブリン重鎖可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を15個選択し、上記1-6でクローニングしたヒトIgG1可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで15個の配列pVH101(配列番号94)、pVH102(配列番号95)、pVH103(配列番号96)、pVH104(配列番号97)、pVH105(配列番号98)、pVH106(配列番号99)、pVH107(配列番号100)、pVH108(配列番号101)、pVH109(配列番号102)、pVH110(配列番号103)、pVH111(配列番号104)、pVH112(配列番号105)、pVH113(配列番号106)、pVH114(配列番号107)、pVH115(配列番号108)を設計し、これらを連結したヒト抗体重鎖偽遺伝子配列pVH15(配列番号64)を設計し、遺伝子合成した。
(2)Left Arm
 上記1-6に記載したLeft Armを用いた。
(3)Right Arm
 上記1-6に記載したCenter Armを用いた。
(4)マルチクローニングサイト
 ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列を挿入するために、配列番号65に示すマルチクローニングサイトを設計した。
(5)Creリコンビナーゼによる部位特異的組換え(RMCE法)
 偽遺伝子配列領域が長くなると、相同組換えによる導入効率が低下することが知られている。そこで、Creリコンビナーゼを用いて簡便に偽遺伝子配列を挿入することができるよう、RMCE法を利用することとした。そこで、loxm3 rev配列とloxm7 rev RE配列を含むRMCE用カセット配列を設計した。
(6)ターゲティングベクターの構築
 pUC19にLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、RMCE用カセット配列、マルチクローニングサイト、Right Arm、ヒトIgG1可変領域を組み込んだ後、マルチクローニングサイトにヒト抗体重鎖偽遺伝子領域pVH15を組み込むことで、図20に示すようなターゲティングベクター pVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCE(配列番号66)を作製した。
13.細胞株の作製
 DT40細胞に、上記12-1で調製したLambda-VL-CL KI vector 2.0、上記12-2で調製したpVL KI_pUC19_step5_BrRev、上記12-3で調製したpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd、上記12-4で調製したhuman CH KI vector、上記12-5で調製したH(X)0・hV(B)_074-009/No4および上記12-6で調製したpVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCEを遺伝子導入することで、細胞株を作製した。
 まず、制限酵素SalIで直鎖状にしたhuman CH KI vectorを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 次に、制限酵素NotIで直鎖状にしたLambda-VL-CL KI vector 2.0をDT40に遺伝子導入し、10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 さらに、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step5_BrRevを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418と10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 次に、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#oddを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418と10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 最後に、制限酵素ScaIで直鎖状にしたH(X)0・hV(B)_074-009/No4および制限酵素NotIで直鎖状にしたpVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCEを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418および10μg/mLのブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されている細胞株A12-3、A12-4、A12-5、B7-3、B7-9およびB7-11を得た。
14.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
14-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記13で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図21および図22に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株のA12-3、A12-4、A12-5、B7-3、B7-9およびB7-11においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図21、22)。なお、図21は、A12-5のIgλのヒストグラムに誤りがあったため、優先日前に取得していた正しいデータに修正した図22を添付した。
14-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記13で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表10に示す。10-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株のA12-3、A12-4、A12-5、B7-3、B7-9およびB7-11ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
15.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で21日間ないしは42日間培養した細胞から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、TSA存在下で21日間培養したB7-11での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果をそれぞれ表11および表12に、TSA存在下で42日間培養したB7-11での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表13および表14に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においてもヒト偽遺伝子由来の配列を含むようなクローンが確認され、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
軽鎖に15個、重鎖に30個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL15/H30細胞株の作製
16.ベクターの調製
16-1.トリ抗体軽鎖(Igλ)可変・定常領域へのノックイン
 上記12-1で作製したLambda-VL-CL KI vector 2.0を用いた。
16-2.トリ抗体軽鎖(Igλ)偽遺伝子のノックアウト
 上記12-2で作製したpVL KI_pUC19_step5_BrRevを用いた。
16-3.トリ抗体軽鎖(Igλ)偽遺伝子・可変領域へのノックイン
 上記12-3で作製したpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#oddを用いた。
16-4.トリ抗体重鎖(IgM)定常領域へのノックイン
 上記8-2で作製したhuman CH KI vectorを用いた。
16-5.トリ抗体重鎖(IgM)可変領域のノックイン
(1)ヒトIgG1可変領域
 上記1-6に記載した可変領域配列を用いた。
(2)Left Arm
 上記1-6に記載したLeft Armを用いた。
(3)Center Arm
 上記1-6に記載したCenter Armを用いた。
(4)Right Arm
 上記1-6に記載したRight Armを用いた。
(5)RMCE用カセット配列
 上記12-6で設計したRMCE用カセット配列を用いた。
(6)ターゲティングベクターの構築
 pUC19にLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、RMCE用カセット配列、Center Arm、ヒトIgG1可変領域、Right Armを組み込み、図23に示すようなターゲティングベクターpVH KI_pUC19_step5_BsrRev_RMCE_cassette(配列番号109)を作製した。
16-6.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へのノックイン
(1)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH30)
 データベース上のヒトイムノグロブリン重鎖可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を30個選択し、上記1-6でクローニングしたヒトIgG1可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで30個の配列pVH101(配列番号94)、pVH102(配列番号95)、pVH103(配列番号96)、pVH104(配列番号97)、pVH105(配列番号98)、pVH106(配列番号99)、pVH107(配列番号100)、pVH108(配列番号101)、pVH109(配列番号102)、pVH110(配列番号103)、pVH111(配列番号104)、pVH112(配列番号105)、pVH113(配列番号106)、pVH114(配列番号107)、pVH115(配列番号108)、pVH116(配列番号110)、pVH117(配列番号111)、pVH118(配列番号112)、pVH119(配列番号113)、pVH120(配列番号114)、pVH121(配列番号115)、pVH122(配列番号116)、pVH123(配列番号117)、pVH124(配列番号118)、pVH125(配列番号119)、pVH126(配列番号120)、pVH127(配列番号121)、pVH128(配列番号122)、pVH129(配列番号123)、pVH130(配列番号124)を設計し、これらを連結したヒト抗体重鎖偽遺伝子配列pVH30(配列番号125)を設計し、遺伝子合成した。
(2)Left Arm
 上記1-6に記載したLeft Armを用いた。
(3)Right Arm
 上記1-6に記載したCenter Armを用いた。
(4)マルチクローニングサイト
 ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列を挿入するために、配列番号65に示すマルチクローニングサイトを設計した。
(5)ターゲティングベクターの構築
 pUC19にLeft Arm、ネオマイシン耐性遺伝子、マルチクローニングサイト、Right Arm、ヒトIgG1可変領域を組み込んだ後、マルチクローニングサイトにヒト抗体重鎖偽遺伝子領域pVH30を組み込むことで、図24に示すようなターゲティングベクター pVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_even(配列番号126)を作製した。
17.細胞株の作製
 DT40細胞に、上記12-1で調製したLambda-VL-CL KI vector 2.0、上記12-2で調製したpVL KI_pUC19_step5_BrRev、上記12-3で調製したpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd、上記12-4で調製したhuman CH KI vector、上記16-5で調製したpVH KI_pUC19_step5_BsrRev_RMCE_cassetteおよび上記16-6で調製したpVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_evenを遺伝子導入することで、細胞株を作製した。
 まず、制限酵素SalIで直鎖状にしたhuman CH KI vectorを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 次に、制限酵素NotIで直鎖状にしたLambda-VL-CL KI vector 2.0をDT40に遺伝子導入し、10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 さらに、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step5_BrRevを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418および10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 次に、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#oddを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418および10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 さらに、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVH KI_ pUC19_ step5_ BsrRev_ RMCE_ cassetteを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418および10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されていることを確認した。
 最後に、制限酵素NotIで直鎖状にしたpVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_evenを遺伝子導入し、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されている細胞株#7-7、#11-3および#11-6を得た。
18.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
18-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記16で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図25に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株の#7-7、#11-3および#11-6においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図25)。
18-2.ELISAによる解析
 上記17で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。ヒトIgGの測定は上記3-2に記載されている方法に基づいて行った。トリIgMの測定法は以下の通りである。
 1.0μg/mLのGoat anti-chicken IgM(Bethyl社、A30-102A)20μLをイムノ384ウェルプレートマキシソープ(Nunc社、464718)に分注し、室温で1時間以上反応させ、プレート上に固相化した。その後、洗浄液(0.05 % Tween20を含むPBS)で5回洗浄し、ブロッキング液(1 % BSAを含むPBS) 50μLを加え、室温で30分間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、測定試料または標準物質となるトリ血清(GIBCO社、16110)を20μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、Goat anti-chicken IgM HRP conjugated(Bethyl社、A30-102P)を1 % BSAおよび0.05 % Tween20を含むPBSで5000倍に希釈したものを20μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985) 20μLを加え、室温で3分発色反応させ、1 N硫酸 20μLを加えて反応を停止させた。Infinite M1000(TECAN社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。
 その結果を表15に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株の#7-7、#11-3および#11-6ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
19.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞株から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、#11-6での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表16および表17に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても追加挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、L15/H15細胞株よりさらに多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
軽鎖に30個、重鎖に30個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL30/H30細胞株の作製
20.トリ抗体軽鎖(Igλ)偽遺伝子・可変領域へのノックイン
(1)ヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列(pVL30)
 データベース上のヒトイムノグロブリンλ可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を30個選択し、上記1-1でクローニングしたヒトIgλ可変領域のフレームワーク配列を組み合わせることで30個の配列pVL101(配列番号74)、pVL102(配列番号75)、pVL103(配列番号76)、pVL104(配列番号77)、pVL105(配列番号78)、pVL106(配列番号79)、pVL107(配列番号80)、pVL108(配列番号81)、pVL109(配列番号82)、pVL110(配列番号83)、pVL111(配列番号84)、pVL112(配列番号85)、pVL113(配列番号86)、pVL114(配列番号87)、pVL115(配列番号88)、pVL116(配列番号127)、pVL117(配列番号128)、pVL118(配列番号129)、pVL119(配列番号130)、pVL120(配列番号131)、pVL121(配列番号132)、pVL122(配列番号133)、pVL123(配列番号134)、pVL124(配列番号135)、pVL125(配列番号136)、pVL126(配列番号137)、pVL127(配列番号138)、pVL128(配列番号139)、pVL129(配列番号140)、pVL130(配列番号141)を設計し、これらを含むヒト抗体軽鎖偽遺伝子配列pVL30(配列番号142)を設計し、遺伝子合成した。
(2)ターゲティングベクターの構築
 上記16-2のpVL KI_pUC19_step6_BrRevのMulti-cloning siteに前項のヒト偽遺伝子配列pVL30を組み込み、図26に示すようなターゲティングベクターpVL KI_pUC19_step6_BrRev_#odd+even(配列番号143)を構築した。
21.細胞株の作製
 上記17で作製したL15/H30細胞株に、上記20で調製したpVL KI_pUC19_step6_BrRev_ #odd+evenを遺伝子導入することで、細胞株を作製した。
 制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step6_BrRev_ #odd+evenを遺伝子導入し、2 mg/mLのG418および10μg/mLのブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されている細胞株#7-7-48-5、#7-7-48-7および#7-7-48-10を得た。
22.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
22-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記21で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図27に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株の#7-7-48-5、#7-7-48-7および#7-7-48-10においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図27)。
22-2.ELISAによる解析
 上記18-2に記載されている方法に基づき、上記21で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表18に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株の#7-7-48-5、#7-7-48-7および#7-7-48-10ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
23.遺伝子変換の確認
 上記22で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞株から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、 7-7-48-10での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表19および表20に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても追加挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、偽遺伝子の個数を増やすことでさらに多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
軽鎖に30個、重鎖に15個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL30/H15細胞株の作製
24. 細胞株の作製
 上記17で作製したL15/H15細胞株A12-4に、上記20で調製したpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd+evenを遺伝子導入することで、細胞株を作製した。
 制限酵素NotIで直鎖状にしたpVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd+evenを遺伝子導入し、2 mg/mLのG418および10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した。その後、Cre_pEGFP-C1を遺伝子導入し、cell sortingによりGFP陽性細胞を選別した後、PCRによるジェノタイピングを行って薬剤耐性遺伝子が除去されている細胞株A77-3およびA77-2を得た。
25.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
25-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記24で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図28に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株のA77-3およびA77-2においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図28)。
25-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記24で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表21に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株のA77-3およびA77-2ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
RMCE法を利用して軽鎖に30個、重鎖に30個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL30/H15f15fおよびL30/H15r15f細胞株の作製
26. ベクターの作製
26-1.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、順向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
(1)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH15a)
 上記16で設計したpVH116、pVH117、pVH118、pVH119、pVH120、pVH121、pVH122、pVH123、pVH124、pVH125、pVH126、pVH127、pVH128、pVH129、pVH130を順向きで連結させたpVH15a(配列番号144)を作製した。
(2)ベクターの構築
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、Neomycin耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxP for RE配列、pVH15a(順向き)、loxm7 rev LE配列を挿入し、図29に示すようなベクターRMCE_pVH1stKI_pVH15evenFor(配列番号145)を作製した。
26-2.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、逆向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、Neomycin耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxP for RE配列、pVH15a(逆向き)、loxm7 rev LE配列を挿入し、図29に示すようなベクターRMCE_pVH1stKI_pVH15evenRev(配列番号146)を作製した。
27.細胞株の作製
 L30/H15f15f細胞株は、上記24で作製したL30/H15細胞株に、上記26-1で調製したRMCE_pVH1stKI_pVH15evenForを導入して作製した。
 RMCE_pVH1stKI_pVH15evenFor をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株1-6-1および1-7-3を得た。
 L30/H15r15f細胞株は、上記24で作製したL30/H15細胞株に、上記26-2で調製したRMCE_pVH1stKI_pVH15evenRevを導入して作製した。
 RMCE_pVH1stKI_pVH15evenRev をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株2-1-1および7-3-2を得た。
28.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
28-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記27で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図30に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株の1-6-1、1-7-3、2-1-1および7-3-2においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図30)。
28-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記27で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表22に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株の1-6-1、1-7-3、2-1-1および7-3-2ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
29.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞株から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、1-6-1での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表23および表24に、7-3-2での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表25および表26に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても追加挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、L30/H30細胞株と同様に多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
RMCE法を利用して軽鎖に30個、重鎖に45個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL30/H15f15f15fおよびL30/H15r15r15f細胞株の作製
30. ベクターの作製
30-1.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、順向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
(1)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH15b)
 データベース上のヒトイムノグロブリン重鎖可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を新たに15個選択し、pVH131(配列番号147)、pVH132(配列番号148)、pVH133(配列番号149)、pVH134(配列番号150)、pVH135(配列番号151)、pVH136(配列番号152)、pVH137(配列番号153)、pVH138(配列番号154)、pVH139(配列番号155)、pVH140(配列番号156)、pVH141(配列番号157)、pVH142(配列番号158)、pVH143(配列番号159)、pVH144(配列番号160)、pVH145(配列番号161)を順向きで連結させたpVH15b(配列番号162)を作製した。
(2)ベクターの構築
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、ブラストサイジン耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxm7 rev RE配列、pVH15b(順向き)、loxP for LE配列を挿入し、図31に示すようなベクターpVH15B-ver3_RMCE2nd_For(配列番号163)を作製した。
30-2.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、逆向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、ブラストサイジン耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxm7 rev RE配列、pVH15b(逆向き)、loxP for LE配列を挿入し、図31に示すようなベクターpVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev(配列番号164)を作製した。
31.細胞株の作製
 L30/H15f15f15f細胞株は、上記2で作製したL30/H15f15f細胞株に、上記30-1で調製したpVH15B-ver3_RMCE2nd_Forを導入して作製した。
 pVH15B-ver3_RMCE2nd_For をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株2-1-3、2-1-11、1-n-1および2-n-3を得た。
 L30/H15r15r15f細胞株は、上記27で作製したL30/H15r15f細胞株に、上記27-2で調製したpVH15B-ver3_RMCE2nd_Revを導入して作製した。
 pVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、10μg/mL のブラストサイジンを含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株4-1-5、4-1-7および3-1-11を得た。
32.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
32-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記31で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図32および図33に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株の2-1-3、2-1-11、1-n-1、2-n-3(以上、図32)、4-1-5、4-1-7および3-1-11(以上、図33)においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した。
32-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記31で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表27に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株の2-1-3、2-1-11、1-n-1、2-n-3、4-1-5、4-1-7および3-1-11ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
33.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞株から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー(CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー(CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、2-1-3での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表28および表29に、3-1-11での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表30および表31に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても追加挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
RMCE法を利用して軽鎖に30個、重鎖に60個のヒト可変領域由来配列から成る偽遺伝子領域を挿入したL30/H15f15f15f15fおよびL30/H15r15r15r15f細胞株の作製
34. ベクターの作製
34-1.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、順向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
(1)ヒト抗体重鎖偽遺伝子配列(pVH15c)
 データベース上のヒトイムノグロブリン重鎖可変領域の配列に基づいてCDR1、CDR2、CDR 3の配列を新たに15個選択し、pVH146(配列番号165)、pVH147(配列番号166)、pVH148(配列番号167)、pVH149(配列番号168)、pVH150(配列番号169)、pVH151(配列番号170)、pVH152(配列番号171)、pVH153(配列番号172)、pVH154(配列番号173)、pVH155(配列番号174)、pVH156(配列番号175)、pVH157(配列番号176)、pVH158(配列番号177)、pVH159(配列番号178)、pVH160(配列番号179)を順向きで連結させたpVH15c(配列番号180)を作製した。
(2)ベクターの構築
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、ネオマイシン耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxP for RE配列、pVH15c(順向き)、loxm7 rev LE配列を挿入し、図34に示すようなベクターpVH15A _RMCE1st_Fw(配列番号181)を作製した。
34-2.トリ抗体重鎖(IgM)偽遺伝子領域へ、逆向きに構築した偽遺伝子15個をさらに挿入
 pUC57-Ampベクターに、loxm3 rev配列、ネオマイシン耐性遺伝子、SV40 early polyA terminator、SV40 polyadenylation region、loxP for RE配列、pVH15c(逆向き)、loxm7 rev LE配列を挿入し、図34に示すようなベクターpVH15A _RMCE1st_Rv(配列番号182)を作製した。
35.細胞株の作製
 L30/H15f15f15f15f細胞株は、上記31で作製したL30/H15f15f15f細胞株に、上記34-1で調製したpVH15A _RMCE1st_Fwを導入して作製した。
 pVH15A _RMCE1st_Fw をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株1n1-3, 1n1-4, 1n1-5を得た。
L30/H15r15r15r15f細胞株は、上記31で作製したL30/H15r15r15f細胞株に、上記34-2で調製したpVH15A _RMCE1st_Rvを導入して作製した。
 pVH15A _RMCE1st_Rv をCre_pEGFP-C1とともに遺伝子導入して部位特異的組換えを誘導した後、2 mg/mL のG418を含む培地で培養し、生育した細胞についてPCRによるジェノタイピングを行って目的の遺伝子座で置換が起こっていることを確認した細胞株3111-1を得た。
36.抗体発現の確認(フローサイトメトリー、ELISA)
36-1.フローサイトメトリーによる解析
 上記3に記載した方法に基づき、上記35で作製した細胞における抗体発現を確認した。その結果を図35に示す。野生型のDT40ではトリIgMのみが発現しているのに対し、形質転換株の1n1-3、1n1-4、1n1-5および3111-1においてはトリIgMの発現が消失し、代わりにヒトIgγおよびIgλが発現していることを確認した(図35)。
36-2.ELISAによる解析
 上記3-2に記載されている方法に基づき、上記35で作製された細胞から分泌されている抗体の測定を行った。その結果を表32に示す。13-1と同様、野生型のDT40ではトリIgMのみが分泌されているのに対し、形質転換株の1n1-3、1n1-4、1n1-5および3111-1ではヒトIgG1が分泌されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
37.遺伝子変換の確認
 上記10で抗体発現を確認した細胞株を用いて、遺伝子変換の確認を行った。TSA存在下で42日間培養した細胞株から、上記4に記載した方法に基づいて抽出したゲノムDNAを鋳型として、識別配列を付与したセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCAGGC)(配列番号46)とアンチセンスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA)(配列番号47)とを用いたPCRにより軽鎖可変領域を、センスプライマー (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT)(配列番号56)と識別タグを付与したアンチセンスプライマー (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATATGAAG)(配列番号57)とを用いたPCRにより重鎖可変領域を増幅した後、上記4に記載した方法に基づいて配列解析を行った。そのうち、1n1-3での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表33および表34に、3111-1での軽鎖および重鎖の可変領域の配列解析結果(上位10個)をそれぞれ表35および表36に示す。軽鎖と重鎖のいずれの可変領域においても追加挿入したヒト偽遺伝子由来の配列を含むクローンが確認され、より多様な配列が生み出されていることが示された。また、他の細胞株でも同様に、遺伝子変換により多様な配列が生み出されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
抗体セレクション1
38.抗原の調製
 抗原タンパク質として、Plexin A4を選択した。Plexin A4はPlexin A typeに属する分子で、感覚神経や交感神経の軸索伸展を制御する因子として知られている。
 抗原にはPlexin A4のSemaドメインおよびPSI(Plexin-Semaphorin-Integrin)ドメインのC末端にFLAGタグを付加したもの(アミノ酸配列を配列番号68に示す)を用いた。ACCESSION No. NM_020911およびACCESSION No. EAW83796に基づいて、配列番号67に示す塩基配列を合成し、pCEP4(ライフテクノロジーズ社、V044-50)のEBNA-1遺伝子およびHygromycin耐性遺伝子を欠失させた発現ベクターに挿入し、Plexin A4発現ベクターを構築した。
 得られたPlexin A4発現ベクターをFreeStyle 293 F細胞(ライフテクノロジーズ社、R790-07)にPEI(ポリエチレンイミン)を用いて導入し、発現させた。その際、別途EBNA-1遺伝子の発現ベクターも同時に導入した。発現は3Lスケール、培養は7日間行った。
 FLAGタグを利用して培養上清中の目的タンパク質を精製した。XK16/20カラム(GEヘルスケア社、28-9889-37)にanti-M2-agarose樹脂(シグマ社、A2220)を2.5 mL充填し、D-PBS(-)(和光純薬、045-29795)で平衡化した後、培養上清をロードし、D-PBS(-)で洗浄した後0.1 mg/mLのFLAGペプチド(シグマ社、F3290)を含むD-PBS(-)で溶出した。280 nmの吸光度でモニターして、ピークに相当する画分を回収し、SDS-PAGEおよびCBB染色により回収されたタンパク質の分子量を確認し、目的タンパク質の分子量と一致することを確認した。
 限外ろ過膜(アミコン社、UFC0801008)を用いて約24 mLの回収画分を2 mLに濃縮し、Hi Load 16/600 Superdex 200 pg(GEヘルスケア社、28-9893-35)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーによる精製を行った。D-PBS(-)でカラムを平衡化した後、回収画分をロードし、D-PBS(-)で溶出した。280 nmの吸光度でモニターして、ピークに相当する画分を回収し、SDS-PAGEおよびCBB染色により回収されたタンパク質の分子量を確認した。
39.抗体の選択
39-1.抗原磁気ビーズの作製
 磁気ビーズはDynabeads M-270 Carboxylic Acid(ライフテクノロジーズ社、14305D)およびDynabeads M-270 Epoxy(ライフテクノロジーズ社、14301)を用い、抗原との結合は解説書に従った。この際、磁気スタンドはMPC-S(ライフテクノロジーズ社、DBA13346)を用いた。Dynabeads M-270 Carboxylic Acidについては、ビーズ10μLを20μLの25mM MES (pH5.0)で3回洗浄した後、50 mg/mLのNHS溶液と50 mg/mLのEDC溶液を10μL ずつ加え、室温で30分反応させた後、20μLの25 mM MES (pH5.0)で2回洗浄した。この磁気ビーズ懸濁液から上清を除いた後、25 mM MES (pH5.0)で0.6 mg/mLに調製したPlexin A4タンパク質溶液を10μL添加し、4℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。上清を除いた後、クエンチングバッファー(50 mM Tris-HCl)20μLを加え、室温で15分間、回転攪拌しながら反応させた。Dynabeads M-270 Epoxyについては、ビーズ10μLを20μLの100 mM Na-phosphate bufferで3回洗浄した後、100 mM Na-phosphate bufferで0.45 mg/mlに調製したPlexin A4タンパク質溶液13.3μLならびに3 M 硫酸アンモニウムを含む100 mM Na-phosphate buffer 6.7μLを添加して懸濁し、37℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。2種類のビーズは上清を除いたのちにセレクションバッファー(1 % BSAを含むPBS)1 mLにまとめて懸濁し、同バッファーで3回洗浄した後、200μLのセレクションバッファーに懸濁して、セレクションに供した。
39-2.抗原磁気ビーズによるセレクション
 L15/H15細胞株であるB7-3を、2.5 ng/mLのTSAを含む培地で3週間培養した後、約1 × 108個の細胞をセレクションバッファー10 mLにより洗浄し、上清を除いた後にセレクションバッファー1 mLで洗浄し、その後950μLのセレクションバッファーに懸濁した。この細胞懸濁液に、上記17-1で調製した抗原磁気ビーズ50μLを加え、4℃で30分間、回転により攪拌しながら反応させた。KingFisher ml(Thermo社、5400050)を用い、0.5 mLのセレクションバッファーで3回洗浄した。その後回収した細胞を20 mLの培地で懸濁した後、9cmディッシュに播種し、CO2インキュベータ―で7日間培養した。
39-3.フローサイトメトリーによるスクリーニング
 上記39-2の細胞培養液を回収し、3 × 106個の細胞を1.5 mLチューブに分取して遠心により上清を除去し、1.5 mLのPBSで洗浄し、上清を除いた。EZ-Link(登録商標)NHS-PEG4-Biotinylation Kit(PIERCE社、21455)を用いてビオチン標識したPlexinA4タンパク質を調製し、1次染色液(2.5μg/mLのビオチン標識Plexin A4タンパク質溶液)を300μL添加し、4℃遮光にて60分静置した。遠心により上清を除き、500μL のPBSで2回洗浄した後、Goat Anti-Human IgG gamma chain specific R-FITC conjugated(Southern biotech社、 A2040-02)とStreptavidin PE conjugated(eBioscience社、12-4317-87)をバッファーでそれぞれ1000倍または500倍希釈になるよう調製した2次染色液を300μL添加し、4℃遮光にて60分静置した。遠心により上清を除き、500μL のPBSで2回洗浄した後、500μL のFACSバッファー(PBSで1000倍希釈したPI溶液(Invitrogen社、P3566)を含む)で懸濁した。このサンプルについてフローサイトメトリー解析を行った。その結果を図36に示す。Plexin A4タンパク質とIgGγのシグナルがいずれも高いP5のエリアの細胞集団を確認した。
39-4.抗原固定ELISA法によるスクリーニング
 上記39-3の細胞培養上清を回収し、Plexin A4抗原を用いた抗原固定ELISA法により、Plexin A4抗原に反応するクローンのスクリーニングを行った。
 まず、2.5μg/mLのPlexin A4抗原タンパク質および陰性対照であるトリプシンインヒビター(シグマ社、T6522)、ストレプトアビジン(ナカライテスク社、32243)またはオボアルブミン(シグマ社、A5503)の溶液20μLをイムノ384ウェルプレートマキシソープ (Nunc社、464718)に分注し、4℃で一晩反応させ、プレートに固相化した。その後、洗浄液(0.05 % Tween20を含むPBS)で3回洗浄し、ブロッキング液(1 % BSAを含むPBS)45μLを加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で3回洗浄し、測定試料を25μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で3回洗浄し、Goat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated(Bethyl社、A80-104P)をPBS緩衝液で2000倍に希釈したものを25μL加え、1時間反応させた。洗浄液で3回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985)25μLを加え、5分発色反応させ、1 M硫酸25μLを加えて反応を停止させた。 Infinite M1000(TECAN社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。その結果を図37に示す。ほとんどのクローンでPlexin A4に特異的に反応する抗体が産生されていることが示された。
 上記39-3に記載したフローサイトメトリーと上記39-4に記載した抗原固定ELISA法を組み合わせたスクリーニングにより、Plexin A4に特異的に結合する陽性クローンを同定することができた。なお、B7-3以外に、L15/H30細胞株の#11-6、L30/H30細胞株の7-7-48-10を用いたセレクションにおいても、Plexin A4に特異的に結合する陽性クローンを同定することができた。
40.抗Plexin A4抗体の発現確認
40-1. ELISAによる解析
 上記39-5で同定した陽性クローンのうち、#62および#20について、培養上清中に分泌されているトリIgMおよびヒトIgG1の濃度の測定を行った。それぞれの細胞株を、ニワトリ血清を含まない培地で4 × 105 cells/mLに懸濁した後、24-well プレートに1 mLずつ播種し、3日間培養した後、培養液を回収し、0.22μm filterで濾過した後、測定に用いた。
 IgGの測定方法は以下の通りである。PBSで1.0μg/mLに希釈調製したGoat anti-Human IgG-Fc affinity purified(Bethyl社、A80-104A)100μLを F96 マキシソープNuncイムノプレート(Nunc社、464718)に分注し4℃で1時間以上反応させ、プレートに固相化した。その後、洗浄液(0.05 % Tween20を含むPBS)で5回洗浄し、ブロッキング液(1 % BSAを含むPBS)200μLを加え、室温で95分間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、測定試料または標準物質となるHuman IgG1 Lambda-UNLB(SouthernBiotech社、0151L-01)を100μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、Goat anti-Human IgG-Fc HRP conjugated(Bethyl社、A80-104P)をPBSで1000倍に希釈したものを100μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で3回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985)100μLを加え、室温で3分発色反応させ、1 M硫酸20μLを加えて反応を停止させた。 Infinite M1000(TECAN社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。
 IgMの測定方法は以下の通りである。PBSで1.0μg/mLに希釈したGoat anti-chicken IgM (Bethyl社、A30-102A)100μLをF96マキシソープ Nuncイミュノプレート(Nunc社、439454)に分注し、4℃で一晩反応させ、プレート上に固相化した。その後、洗浄液(0.05 % Tween20を含むPBS)で5回洗浄し、ブロッキング液(1 % BSAを含むPBS)200μLを加え、室温で95分間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、測定試料または標準物質となるトリ血清(GIBCO社、16110)を100μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、Goat anti-chicken IgM HRP conjugated (Bethyl社、A30-102P)を1 % BSAおよび0.05 % Tween20を含むPBSで5000倍に希釈したものを100μL加え、室温で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985)100μLを加え、室温で3分発色反応させ、1 N硫酸100μLを加えて反応を停止させた。 Infinite M1000(TECAN社)を用いて、450 nmの吸光度を測定した。
 測定結果を表37に示す。クローン#20およびクローン#62において、ヒトIgG1が分泌されていること、トリIgMの分泌はごくわずかであることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
40-2.ウェスタンブロット法による解析
 ウェスタンブロット法により、17-4で得られた抗原反応性抗体を産生する陽性クローンである#62および#20から分泌されている抗体の分析を行った。
 それぞれの細胞株を、ニワトリ血清を含まない培地で4 × 105 cells/mLに懸濁した後、24-well プレートに1 mLずつ播種し、3日間培養した後、細胞株の培養液を回収し、0.22μmフィルター(ミリポア社、SLGV J13 SL)で濾過した。IgγおよびIgλの検出用にはProtein Aカラムで精製したサンプルを、IgMの検出用には精製前のサンプルを用いた。還元条件での検出に用いるサンプル(還元サンプル)については、トリス-SDS-βメルカプトエタノールサンプル処理液(コスモバイオ社、423437)を、非還元条件での検出に用いるサンプル(非還元サンプル)については、トリス-SDSサンプル処理液(コスモバイオ社、423420)をそれぞれ等量加えて混合した。その後、還元サンプルは98℃, 3分間、非還元サンプルは37℃、30分間反応させた後、4~20%ポリアクリルアミドゲル(コスモバイオ社、414879)で電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、ブロッキングバッファー(1 % BSAを含むPBS)でブロッキングし、1次抗体(Goat Anti-Human IgG-Fc Fragment Ab-HRP(Bethyl社、A80-104P)、Goat Anti-Human IgG Lambda-HRP(Southern Biotech社、2070-05)、Goat Anti-chicken IgM-HRP(Bethyl社、A30-102P)を反応させた。0.1 % Tween20を含むPBSで3回洗浄した後、ECL plus(GEヘルスケア社、RPN2132)による化学発光でトリIgM、ヒトIgγ(重鎖)、ヒトIgλ(軽鎖)を検出した。その結果を図38~図40に示す。抗Igγ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で55 kDa、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図38)。抗Igλ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で25 kDa、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図39)。また、抗IgM抗体でのウェスタンブロットではシグナルが検出されなかった(図40)。
 これにより、得られた陽性クローンが産生する抗体が完全長のヒト抗体であることを確認した。
抗体セレクション2
41.抗原の調製
 抗原タンパク質として、Semaphorin 3A (Sema3A)を選択した。Sema3AはSema3ファミリーに属する分子で、感覚神経や交感神経の軸索伸展を制御する因子として知られている。
 抗原にはSema3AのN末端にHisタグとヒトアルカリフォスファターゼ(AP)を付したHis-AP-hSema3A(配列番号183)を用いた。このタンパク質を発現する安定発現株HEK293は横浜市立大学医学部分子薬理神経生物学教室より提供された。
 発現は4Lスケール、培養は4日間行った。Hisタグを利用して培養上清中の目的タンパク質を精製した。HisTrap EXCEL 5mL (GEヘルスケア社, 17-3712-06)をA液(20 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazole(pH7.5))で平衡化した後、培養上清をロードし、A液で洗浄した。その後、A液からB液(20 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole(pH7.5))に25カラム容量で直線的に置き換わるグラジエントによって溶出した。280 nmの吸光度でモニターして、ピークに相当する画分を回収し、SDS-PAGEおよびCBB染色により回収されたタンパク質の分子量を確認し、目的タンパク質の分子量と一致することを確認した。
 限外ろ過膜(アミコン社、UFC0801008)を用いて約80 mLの回収画分を1.5 mLにまで濃縮し、Hi Load 16/600 Superdex 200 pg(GEヘルスケア社, 28-9893-35)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーによる精製を行った。溶出バッファー(50 mM Na-phosphate, 300 mM NaCl, 400 mM Arginine, pH7.0)でカラムを平衡化した後、回収画分をロードし、溶出バッファーで溶出した。280 nmの吸光度でモニターして、ピークに相当する画分を回収し、SDS-PAGEおよびCBB染色により回収されたタンパク質の分子量を確認した。次いで、溶離液中のアルギニンを除去するために、D-PBS(-)で2度目のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。同様に280 nmの吸光度でモニターして、ピークに相当する画分を回収し、SDS-PAGEおよびCBB染色により回収されたタンパク質の分子量を確認した。
42.抗体の選択
42-1.抗原磁気ビーズの作製
 磁気ビーズはDynabeads M-270 Carboxylic Acid(ライフテクノロジーズ社、14305D)、Dynabeads M-270 Epoxy(ライフテクノロジーズ社、14301)およびDynabeads His-Tag Isolation & Pulldown(ライフテクノロジーズ社、10103D)を用い、抗原との結合は解説書に従った。この際、磁気スタンドはMPC-S(ライフテクノロジーズ社、DBA13346)を用いた。Dynabeads M-270 Carboxylic Acidについては、ビーズ40μLを80μLの25 mM MES(pH5.0)で3回洗浄した後、50 mg/mLのNHS溶液と50 mg/mLのEDC溶液を40μL ずつ加え、室温で30分反応させた後、80μLの25 mM MES(pH5.0)で2回洗浄した。この磁気ビーズ懸濁液から上清を除いた後、ポジティブセレクション用には25 mM MES(pH5.0)で0.475 mg/mlに調製したHis-AP-hSema3Aタンパク質溶液を50.6μLを、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを使用して25 mM MES(pH 5.0)で希釈した溶液50.6μLを添加して懸濁し、4℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。上清を除いた後、クエンチングバッファー(50 mM Tris-HCl)80μLを加え、室温で15分間、回転攪拌しながら反応させた。Dynabeads M-270 Epoxyについては、ビーズ40μLを80μLの100 mM Na-phosphate bufferで3回洗浄した後、ポジティブセレクション用には100 mM Na-phosphate bufferで0.45 mg/mLに調製したHis-AP-hSema3Aタンパク質溶液53.3μLならびに3 M 硫酸アンモニウムを含む100 mM Na-phosphate buffer 26.7μLを、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを使用して25 mM MES(pH 5.0)で希釈した溶液53.3μLならびに3 M 硫酸アンモニウムを含む100 mM Na-phosphate buffer 26.7μLを添加して懸濁し、37℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldownについては、ビーズ8μLを80μLのPBSで3回洗浄した後、ポジティブセレクション用には抗原濃度4.49μMのHis-AP-hSema3Aタンパク質溶液101.9μL、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを101.9μL添加して懸濁し、4℃で10分間回転攪拌しながら反応させた。3種類のビーズは上清を除いたのちにセレクションバッファー(1 % BSAを含むPBS)1 mLにまとめて懸濁し、同バッファーで3回洗浄した後、200μLのセレクションバッファーに懸濁して、セレクションに供した。
42-2.抗原磁気ビーズによるセレクション
 L15/H15細胞株であるB7-3を、2.5 ng/mLのTSAを含む培地で86日間培養した後、約1.5 × 107個の細胞をセレクションバッファー10 mLにより洗浄し、上清を除いた後にセレクションバッファー1 mLで洗浄し、その後950μLのセレクションバッファーに懸濁した。この細胞懸濁液に、上記39-1で調製したネガティブセレクション用抗原磁気ビーズ50μLを加え、4℃で30分間、回転により攪拌しながら反応させた。KingFisher mL(Thermo社、5400050)を用いて磁気ビーズを取り除いた後、細胞懸濁液にポジティブセレクション用抗原磁気ビーズを50μL 加え、4℃で30分間回転拡販しながら反応させた。KingFisher mL(Thermo社、5400050)を用い、1.7 mLのセレクションバッファーで3回洗浄した。その後回収した細胞を20 mLの培地で懸濁した後、96ウェルプレート1枚に播種し、CO2インキュベータ―で培養した。
42-3.1次スクリーニング
 上記42-2の細胞培養液を回収し抗原固定ELISAにおける分泌IgGの抗原反応性に基づき、標的抗原に対して特異的に反応するクローンのスクリーニングを行った。PBSで2.5μg/mLに調製した抗原タンパク質および陰性対照抗原溶液(His-Ubiquitin, Ovalbumin, Streptavidin)20μLをイムノ384ウェルプレートマキシソープ(Nunc社、464718)に分注し、4℃で一晩反応させて固相化した。洗浄溶液(0.05 % Tween20を含むPBS)で5回洗浄し、ブロッキング溶液(1 % BSAを含むPBS)を 45μL加えて室温で115分間反応させた。洗浄溶液で5回洗浄し、培養上清を25μL加えて室温で130分間反応させた。洗浄溶液で5回洗浄し、ブロッキング溶液で2000倍に希釈したGoat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugatedを25μL加えて室温で47分間反応させた。洗浄溶液で5回洗浄し、TMB+(Dako社、S159985)を25μL加えて5分反応させた。1 N硫酸を25μL加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した(図41)。吸光度0.1以上、S/N比5倍以上の細胞を陽性と判定し、2次スクリーニングに供した。
42-4.2次スクリーニング
 上記42-3の細胞培養上清を回収し、42-3記載の方法に基づき抗原固定ELISAによる2次スクリーニングを行った。吸光度0.5以上、S/N比5倍以上の細胞を陽性と判定し、モノクローン化を行った。
42-5.モノクローン化後の1次スクリーニング
 上記42-4の細胞培養上清を回収し、42-3記載の方法に基づき抗原固定ELISAによるスクリーニングを行った。吸光度0.2以上、S/N比5倍以上の細胞を陽性と判定し、2次スクリーニングに供した。
42-6.モノクローン化後の2次スクリーニング
 上記42-5の細胞培養上清を回収し、42-3記載の方法に基づき抗原固定ELISAによるスクリーニングを行った。吸光度0.5以上、S/N比5倍以上の陽性クローン#64、#69および#77を選択した(図42)。
43.抗His-AP-hSema3A抗体の発現確認
43-1. ELISAによる解析
 上記42-6で選択された陽性クローンのうち、#64について、培養上清中に分泌されているトリIgMおよびヒトIgG1の濃度の測定を行った。測定法は上記40-1に従った。
 測定結果を表38に示す。野生型のDT40と同様に、陽性クローン#64からヒトIgGが分泌されていること、トリIgMの分泌は認められないことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
43-2.ウェスタンブロット法による解析
 ウェスタンブロット法により、上記42-6で得られた抗原反応性抗体を産生する陽性クローン#64から分泌されている抗体の分析を行った。
 それぞれの細胞株を、ニワトリ血清を含まない培地で4 × 105 cells/mLに懸濁した後、9cmディッシュに20 mL播種し、4日間培養した後、細胞株の培養液を回収し、0.22μmフィルター(ミリポア社、SLGV J13 SL)で濾過した。IgγおよびIgλの検出用にはProtein Aカラムで精製したサンプルを、IgMの検出用には精製前のサンプルを用いた。還元条件での検出に用いるサンプル(還元サンプル)については、トリス-SDS-βメルカプトエタノールサンプル処理液(コスモバイオ社、423437)を、非還元条件での検出に用いるサンプル(非還元サンプル)については、トリス-SDSサンプル処理液(コスモバイオ、423420)をそれぞれ等量加えて混合した。その後、還元サンプルは98℃, 3分間、非還元サンプルは37℃, 30分間反応させた後、XV PANTERA 5-20% T-HCL 10W(DRC、NXV-275HP)で電気泳動し、PVDF膜に転写後、ブロッキングバッファー(5 %スキムミルクおよび0.1 % Tween20を含むTBS)でブロッキングし、1次抗体(Goat Anti-Human IgG-Fc Fragment Ab-HRP(Bethyl社、A80-104P)、Goat Anti-Human IgG Lambda-HRP(Southern Biotech社、2070-05)を反応させた。0.1 % Tween20を含むTBSで3回洗浄した後、Luminata Forte Western HRP substrate(ミリポア社、WBLUF0100)による化学発光でトリIgM、ヒトIgγ(重鎖)、ヒトIgλ(軽鎖)を検出した。その結果を図43に示す。抗Igγ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で55 kDa(図43A)、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図43B)。抗Igλ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で25 kDa(図43C)、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図43D)。
 これにより、得られた陽性クローンが産生する抗体が完全長のヒト抗体であることを確認した。
抗体セレクション3
44.抗原の調製
 抗原タンパク質として、IL-8を選択した。IL-8は、ケモカインの一種であり、好中球やTリンパ球に対して走化性を示し、白血球の血管内皮細胞への接着や好中球の機能を促進する活性を持つ。そのため、好中球の浸潤を伴う炎症疾患、関節リウマチなどに関与していると考えられている。
 抗原は、セレクションにおいてはヒトIL-8(Immune TECH社、IT-401-003P)を、スクリーニングにおいては2種類のヒトIL-8(Immune TECH社、IT-401-003PおよびCELL Signaling Technology社、8921LF)を用いた。
45.抗体の選択
45-1.抗原磁気ビーズの作製
 磁気ビーズはDynabeads M-270 Carboxylic Acid(ライフテクノロジーズ社, 14305D)、Dynabeads M-270 Epoxy(ライフテクノロジーズ社、14301)およびDynabeads His-Tag Isolation & Pulldown(ライフテクノロジーズ社、10103D)を用い、抗原との結合は解説書に従った。この際、磁気スタンドはMPC-S(ライフテクノロジーズ社、DBA13346)を用いた。Dynabeads M-270 Carboxylic Acidについては、ビーズ35μLを70μLの25 mM MES(pH5.0)で3回洗浄した後、50 mg/mLのNHS溶液と50 mg/mLのEDC溶液を35μL ずつ加え、室温で30分反応させた後、70μLの25 mM MES (pH5.0)で2回洗浄した。この磁気ビーズ懸濁液から上清を除いた後、ポジティブセレクション用には25 mM MES(pH5.0)で0.6 mg/mlに調製したIL-8(Immune TECH社、IT-401-003P)タンパク質溶液35μLを、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを使用して25 mM MES(pH 5.0)で希釈した溶液35μLを添加して懸濁し、4℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。上清を除いた後、クエンチングバッファー(50mM Tris-HCl)70μLを加え、室温で15分間、回転攪拌しながら反応させた。Dynabeads M-270 Epoxyについては、ビーズ35μLを70μLの100 mM Na-phosphate bufferで3回洗浄した後、ポジティブセレクション用には100 mM Na-phosphate bufferで0.45 mg/mLに調製したIL-8タンパク質溶液46.7μLならびに3 M 硫酸アンモニウムを含む100 mM Na-phosphate buffer 23.3μLを、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを使用して100 mM Na-phosphate bufferで希釈した溶液46.7μLならびに3 M 硫酸アンモニウムを含む100 mM Na-phosphate buffer 23.3μLを添加して懸濁し、37℃で一晩、回転攪拌しながら反応させた。Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldownについては、ビーズ7μLを70μLのPBSで3回洗浄した後、ポジティブセレクション用には抗原濃度5.75μMのIL-8タンパク質溶液70μL、ネガティブセレクション用には抗原溶液の代わりにPBSを70μL添加して懸濁し、4℃で210分間回転攪拌しながら反応させた。3種類のビーズは上清を除いたのちにセレクションバッファー(1 % BSAを含むPBS)1 mLにまとめて懸濁し、同バッファーで3回洗浄した後、700μLのセレクションバッファーに懸濁して、セレクションに供した。
45-2.抗原磁気ビーズによるセレクション
 L30/H15f15f15f細胞株である2-1-3を、2.5 ng/mLのTSAを含む培地で45 日間培養した後、約1.5 × 107個の細胞をセレクションバッファー10 mLにより洗浄し、上清を除いた後にセレクションバッファー10 mLで洗浄し、その後950μLのセレクションバッファーに懸濁した。この細胞懸濁液に、上記39-1で調製したネガティブセレクション用抗原磁気ビーズ50μLを加え、4℃で30分間、回転により攪拌しながら反応させた。KingFisher mL(Thermo社、5400050)を用いて磁気ビーズを取り除いた後、細胞懸濁液にポジティブセレクション用抗原磁気ビーズを50μL 加え、4℃で30分間回転攪拌しながら反応させた。KingFisher ml(Thermo社、5400050)を用い、1.7 mLのセレクションバッファーで3回洗浄した。その後回収した細胞を20 mLの培地で懸濁した後、96ウェルプレート1枚に播種し、CO2インキュベータ―で培養した。
45-3.スクリーニングおよび陽性クローンの同定
 上記42-3~42-6と同様に、2度のスクリーニング、モノクローン化、2度のスクリーニングを実施し、陽性クローン#117、#121および#123を得た。セレクション後の1次スクリーニングの結果を図44に、モノクローン化後の2次スクリーニングの結果を図45に示す。
46.抗IL-8抗体の発現確認
46-1. ELISAによる解析
 上記45-3で得られた抗原反応性抗体を産生する陽性クローンである#117および#121について、培養上清中に分泌されているトリIgMおよびヒトIgG1の濃度の測定を行った。測定法は上記40-1に従った。
 測定結果を表39に示す。野生型のDT40と同様に、陽性クローン#117および#121からヒトIgGが分泌されていること、トリIgMの分泌は認められないことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
46-2.ウェスタンブロット法による解析
 ウェスタンブロット法により、#117, #121から分泌されている抗体の分析を行った。方法は上記40-2に従った。
 その結果を図46に示す。抗Igγ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で55 kDa(図46A)、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図46B)。抗Igλ抗体でのウェスタンブロットでは、還元状態で25 kDa(図46C)、非還元状態では約160 kDaのバンドが検出された(図46D)。
 これにより、得られた陽性クローンが産生する抗体が完全長のヒト抗体であることを確認した。
 本発明は、多様なヒト抗体を迅速に作製する方法に関するものである。抗体医薬の重要性に鑑み、今後の創薬、医療の分野において、所望の薬効を示すバイオ医薬品、特に抗体医薬の開発に際し、本発明が提供する技術は、極めて重要な役割を担うものとして期待される。

Claims (21)

  1.  抗体軽鎖遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体重鎖遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列の全部または一部で置換され、ならびに、抗体軽鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換され、および/または、抗体重鎖偽遺伝子座において、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上が挿入され、またはヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列2以上で置換されたトリB細胞。
  2.  抗体軽鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体軽鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の数が、5以上であることを特徴とする請求項1に記載のトリB細胞。
  3.  抗体重鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体重鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の数が、5以上であることを特徴とする請求項1に記載のトリB細胞。
  4.  抗体軽鎖偽遺伝子座において挿入、または該抗体軽鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体軽鎖可変領域由来のDNA配列の数が、15以上であることを特徴とする請求項1に記載のトリB細胞。
  5.  抗体重鎖偽遺伝子座において挿入され、または該抗体重鎖偽遺伝子座の配列を置換する、ヒト抗体重鎖可変領域由来のDNA配列の数が、15以上であることを特徴とする請求項1に記載のトリB細胞。
  6.  抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来DNA配列の位置が、ヒト抗体軽鎖定常領域由来DNA配列が存在する位置の上流であり、および、抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域由来DNA配列の位置が、ヒト抗体重鎖定常領域由来DNA配列が存在する位置の上流であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載のトリB細胞。
  7.  抗体軽鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体軽鎖可変領域由来DNA配列および定常領域由来DNA配列の位置が、トリ抗体軽鎖可変領域および定常領域の位置よりも上流であり、および、抗体重鎖遺伝子座に挿入されているヒト抗体重鎖可変領域および定常領域の位置が、トリ抗体重鎖可変領域および定常領域の位置よりも上流であることを特徴とする請求項6に記載のトリB細胞。
  8.  前記ヒト抗体重鎖がγ鎖であることを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載のトリB細胞。
  9.  前記ヒト抗体軽鎖がλ鎖またはκ鎖であることを特徴とする請求項1乃至8のいずれかに記載のトリB細胞。
  10.  前記トリB細胞が、細胞表面にヒト抗体を発現し、かつ培養液中にもヒト抗体を分泌する能力を有することを特徴とする請求項1乃至9のいずれかに記載のトリB細胞。
  11.  トリB細胞がDT40細胞であることを特徴とする請求項1乃至10のいずれかに記載のトリB細胞。
  12.  クロマチンを弛緩させる処理を行った請求項1乃至11のいずれかに記載のトリB細胞。
  13.  前記クロマチンを弛緩させる処理が、該トリB細胞中のヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させることである請求項12に記載のトリB細胞。
  14.  前記ヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させる方法が、該トリB細胞中のヒストン脱アセチル化酵素遺伝子の発現を低下または喪失させることである請求項13に記載のトリB細胞。
  15.  前記ヒストン脱アセチル化酵素がHDAC2であることを特徴とする請求項14に記載のトリB細胞。
  16.  前記ヒストン脱アセチル化酵素の機能を低下または喪失させる方法がHDAC阻害剤で処理することを特徴とする請求項13に記載のトリB細胞。
  17.  請求項12乃至16のいずれかに記載のトリB細胞からなる抗体産生細胞ライブラリー。
  18.  請求項1乃至16のいずれかに記載のトリB細胞から抗体を作製する方法。
  19.  請求項18に記載の方法により取得される抗体。
  20.  請求項1乃至16のいずれかに記載のトリB細胞を作製するためのキット。
  21.  請求項18に記載の方法により抗体を産生させるためのキット。
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