WO2015160147A1 - 캐드헤린11 또는 n-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

캐드헤린11 또는 n-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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WO2015160147A1
WO2015160147A1 PCT/KR2015/003609 KR2015003609W WO2015160147A1 WO 2015160147 A1 WO2015160147 A1 WO 2015160147A1 KR 2015003609 W KR2015003609 W KR 2015003609W WO 2015160147 A1 WO2015160147 A1 WO 2015160147A1
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cadherin
skin
expression
fibroblasts
cells
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PCT/KR2015/003609
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이애영
김난형
이태룡
최현정
이은경
조은경
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(주)아모레퍼시픽
동국대학교 산학협력단
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to skin improving substances that modulate Cadherin 11 or N-cadherin expression and methods of screening the same.
  • the skin has a natural pigment called melanin to prevent damage to skin cells caused by ultraviolet rays.
  • Melanin is made by melanocytes (melanocytes) located on the basement membrane, the epidermal-dermal boundary of the skin, and migrates to the surrounding keratinocytes. Skin hyperpigmentation occurs.
  • Hyperpigmentation is caused by excessive melanin production and dispersion, and the cause and mechanism of normal skin and its different.
  • One of the features of skin hyperpigmentation such as blemishes, surpluses, and blotch is that melanocytes leave their original position and move from the basement membrane to the dermis when the melanocytes move into the dermis and enter the dermis.
  • melanin production and dispersion There was no research on the effects of melanin production and dispersion and on the effect of fibroblasts on melanocytes.
  • Patent Document 1 Korean Registered Patent No. 10-0840144
  • Embodiments of the present invention are to provide a skin improving material effective for improving skin whitening and aging, a system and a screening method for screening the same.
  • Embodiments of the present invention provides a composition for improving skin and a skin improvement kit comprising the same as an active ingredient containing at least one expression inhibiting agent of Cadherin 11 and N-cadherin.
  • embodiments of the present invention comprises the step of treating the candidate in the co-culture of the skin improvement material screening system, and measuring the change in expression of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin Provided are methods for screening skin improving substances.
  • Skin improvement composition by inhibiting the expression of one or more of the skin keratinocytes, fibroblasts or melanogenesis cells Cad Herin 11 and N-cadherin, melanin-producing tyrosinase of the melanocytes, MITF, the transcription factor thereof It can inhibit expression and inhibit the activity of RAC and beta-catenin. This can improve the skin hyperpigmentation by inhibiting the production and dispersion of melanin, it can provide a skin whitening effect.
  • Cadherin 11 it inhibits the expression of collagenase, prevents collagen degradation and inhibits the migration of melanocytes from the basement membrane to the dermis, thereby preventing or alleviating skin wrinkles. It has an aging effect.
  • Skin improvement material screening system and screening method of the present invention comprises two or more co-cultures of fibroblasts, keratinocytes and melanogenesis cells have a condition similar to the degree of gene expression of the actual skin tissue and the degree of phosphorylation of signaling factors Therefore, the expression changes of Cadherin 11 and N-cadherin can be effectively measured clinically in vitro.
  • FIG. 1 to 6 are experimental results showing that miR-675 inhibits the expression of Cadherin 11 by targeting 3′UTR of Cadherin 11 (CDH11).
  • Figure 1 shows the complementary sequence between miR-675 and 3'UTR of Cadherin 11 mRNA
  • Figure 2 shows that pMIR-CDH11 or variant in combination with miR-675 in normal human fibroblasts, or Relative ratio of luciferase activity when transfected and cultured without miR-675 is shown (P ⁇ 0.05).
  • the graph of FIG. 2 shows average values of values obtained from five independent experiments.
  • 3 and 4 show that fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) were not treated with various concentrations of miR-675 analogs or inhibitors (FIG.
  • FIG. 4 shows the degree of expression of each Cadherin 11 (CDH11) in the case of inhibitor treatment (Western blot analysis).
  • ⁇ -actin ⁇ -actin
  • Figure 5 shows the results of analyzing the relative ratio of the Cadherin 11 expression of hyperpigmented skin to normal pigmented skin of five mime-6 patients with reduced miR-675 by RT (Real time) PCR.
  • GAPDH used international standard.
  • FIG. 6 is immunofluorescent staining of normal pigmented skin (N) and hyperpigmented skin (L) of four bleeding patients with reduced miR-675 using anti-Cadherin 11 and anti-K14 antibodies and fluorescence microscopy. One result is shown.
  • FIG. 7 is a fibroblast-melanin producing cell coculture, which is a monomolecular coculture from the left, coculture of the fibroblasts at the bottom of the chamber and the melanin producing cells at the upper part of the insert, and the fibroblasts at the insert and the upper part of the insert. The coculture of melanin producing cells is shown, respectively.
  • FIG. 8 shows Western blot analysis of Cadherin 11 expression after transfection of Cadherin 11 (CDH11) gene or Cadherin 11 siRNA (control, CDH11, control siRNA, CDH11 siRNA from the left side of the graph x-axis).
  • FIG. 9 and 10 show tyrosinase, MITF, CREB, p-CREB, ERK, when LY294002 of melanin-producing cells co-cultured with Cadherin 11 coexpressed with reduced or decreased expression of fibroblasts.
  • Expression levels of p-ERK, AKT, p-AKT, Wnt-3A, and ⁇ -catenin ( ⁇ -catenin) are shown by Western blot analysis.
  • FIG. 11 and FIG. 12 show Western blot analysis of ⁇ -catenin expression in membrane and nuclear regions of fibroblast monomolecular membrane coculture in which Cadherin 11 is overexpressed or decreased.
  • FIG. 11 and FIG. 12 show Western blot analysis of ⁇ -catenin expression in membrane and nuclear regions of fibroblast monomolecular membrane coculture in which Cadherin 11 is overexpressed or decreased.
  • FIG. 13 shows the results of immunoprecipitation in fibroblast monomolecular membrane co-cultures with reduced expression of Cadherin 11 using anti-Cadherin 11 antibody.
  • FIG. 15 and 16 are experimental results showing the relationship between the expression of Cadherin 11 in the fibroblasts and the melanosome migration.
  • FIG. 15 shows FACS using anti-TYRP1 and anti-K14 antibodies to cells in a coculture system consisting of fibroblasts (Cadherin 11 overexpression or reduced expression) outside the insert and keratinocytes / melanin producing cells inside the insert. The analysis results are shown.
  • Figure 16 shows the results of Western blot analysis of p-Rac1 and PAR2 expression treated or untreated with Rac1 and LY294002 involved in the formation of dendrite of melanocytes. Each graph represents the mean SD of five independent experiments (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 17 shows experimental results confirming the relationship between the expression of Cadherin 11 in the keratinocytes, melanogenesis and melanosomal migration.
  • FIG. 17 shows the result of Western blot analysis of Cadherin 11 expression after transfection of Cadherin 11 gene or Cadherin siRNA.
  • Figures 18 and 19 show tyrosinase, MITF, CREB, p-CREB, AKT, p-AKT, Wnt treated or untreated with LY294002 in melanocytes co-cultured with keratinocytes over-expressed or reduced expression of Cadherin11.
  • Western blot analysis of the expression of -3A and ⁇ -catenin is shown.
  • Figure 20 shows the results of Western blot analysis of the expression of ⁇ -catenin in the cytoplasm and nuclear portion of the melanogenesis cells co-cultured with keratinocytes over-expressed Cadherin 11.
  • Figure 21 shows the effect of Cadherin11 inhibitors on the binding of ⁇ -catenin and Wnt-3A by immunoprecipitation Western blot using anti-Cadherin11 antibody.
  • FIG. 22 shows the number of keratinocytes (Keratin14: keratinocyte marker protein) having melanoma (TRP1: melanosome marker protein) when Cadherin 11 co-cultured with overexpressed or reduced expression of keratinocytes and melanocytes. ) Is the result of FACS analysis.
  • FIG 23 shows the results of Western blot analysis of Rac1, p-Rac1 and PAR2 expression in co-cultures with Cadherin 11 overexpressed or reduced expression keratinocytes. Each graph represents the mean SD of five independent experiments (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 24 and 25 show the results of experiments induced expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) of Cadherin 11 in fibroblasts.
  • Figure 24 shows the results of Western blot analysis of the expression of MMP-1 and MMP-2 collagen degrading enzymes in fibroblasts over-expressed or reduced expression of Kedherin 11.
  • Each graph represents the mean SD of five independent experiments (P ⁇ 0.05).
  • FIGS. 26 to 28 show the results of N-cadherin expression inducing melanin-producing cells of cadherin 11 in fibroblasts.
  • FIGS. 26 to 28 show differences in N-cadherin and E-cadherin expression of fibroblast-melanin producing cell co-cultures in which Cadherin 11 is overexpressed (FIGS. 26 and 27) and decreased expression (FIG. 28).
  • Is shown by Western blot analysis. 29 and 30 are immunofluorescent staining using anti-cadherin 11 and anti-N-cadherin antibodies in monomolecular co-culture of fibroblasts overexpressed (FIG. 29) and reduced expression (FIG. 30) of Cadherin 11. The results are shown.
  • FIG. 29 and 30 are immunofluorescent staining using anti-cadherin 11 and anti-N-cadherin antibodies in monomolecular co-culture of fibroblasts overexpressed (FIG. 29) and reduced expression (FIG. 30) of Cadherin
  • Figure 32 shows the results of Western blot analysis of Twist1 expression in fibroblasts over-expressing Cadherin 11 with or without melanin-producing cells.
  • Figure 33 shows the results of Western blot analysis of tyrosinase expression of melanin-producing cells in inserts co-cultured with N-cadherin reduced or unexpressed Cadherin 11 overexpressing fibroblasts.
  • FIG. 34 is a diagram showing the results of the Boyden chamber assay for melanocyte-producing cell migration in the presence of fibroblasts over-expressed or reduced expression of Cadherin 11. Each graph represents the mean ⁇ SD values obtained from five independent experiments (P ⁇ 0.05).
  • 35 and 36 show the results of EMT-induced experiment of Cadherin 11 in keratinocytes, specifically N-cadherin, E-cadherin and Twist1 in Cadherin 11 overexpressing keratinocytes with or without melanin-producing cells.
  • the results of Western blot analysis are shown.
  • the graph shows the mean ⁇ SD of the values from five independent experiments (P ⁇ 0.05).
  • Figure 37 schematically shows the role of Cadherin 11 in blemish skin.
  • skin refers to a tissue covering the body surface of an animal, and is a broad concept including not only tissues covering the body surface such as the face or body, but also the scalp and hair.
  • Embodiments of the present invention include Cadherin 11 (CDH11), ACCESSION: AAD27755, VERSION: AAD27755.1, GI: 4689094) and N-cadherin, (ACCESSION: AAB22854, VERSION: AAB22854.1 , GI: 253483) provides a composition for skin improvement comprising at least one expression inhibiting substance as an active ingredient.
  • the microRNA miR-675 is reduced in the skin of skin hyperpigmentation patients such as melasma.
  • the miR-675 is an H19-derived microRNA, and the H19 gene is downregulated at the spot.
  • the miR-675 targets a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) and is released from keratinocytes in exosomes.
  • the miR-675 also targets Cadherin 11, which is an active ingredient of the composition according to the embodiment of the present invention, in addition to the MITF.
  • the 3'UTR (untranslate region) of Cadherin 11 includes a miRNA target estimation site.
  • miR-675 can be transfected with cells comprising the 3'UTR of Cadherin11 but the variants of Cadherin11 3'UTR do not reduce the expression of Cadherin11 ( Figure 1 and See FIG. 2). This means that miR-675 binds directly to 3'UTR of Cadherin 11. Increasing or decreasing the expression level of CADHERIN 11 may be induced by transfection of miR-675, for example, mimic or inhibitor of miR-675. Accordingly, in the case of hyperpigmentation, miR-675 does not inhibit the expression of Cadherin 11 of keratinocytes and fibroblasts, which are the target genes, and thus the expression of hyperpigmentation is increased at the site of hyperpigmentation.
  • Cadherin 11 is a superfamily of Cadherin, a Ca 2+ dependent transmembrane cell junction molecule, and Cadherin is a type 1 transmembrane protein that plays an important role in cell junction. In cells, cells form tight junctions. Cadherin 11 contributes to embryonic development, tissue morphogenesis, tumor invasion and metastasis, inflammation, and signal transduction. Cadherin 11 according to embodiments of the present invention is expressed in keratinocytes and fibroblasts. Although Cadherin 11 is not expressed in melanocytes, the fibroblast-derived Cadherin 11 may migrate melanocytes from the basement membrane to the dermis.
  • Cadherin11 derived from fibroblasts or keratinocytes is not only melanogenesis and melanosomes via the AKT- ⁇ -catenin-Wnt and AKT-Rac1 pathways, but also EMT (melanosomes). It is involved in the upregulation of N-cadherin in cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.
  • Cadherin 11 included in the embodiments of the present invention with reference to FIG. 37 in more detail.
  • Overexpression of Cadherin 11 in fibroblasts and keratinocytes leads to expression of N-cadherin in co-cultured melanogenesis cells, which are melanin formation and AKT / Rac1 phosphorylation via canonical Wnt and AKT activity pathways. It is associated with the movement of melanosomes through phosphorylation. That is, fibroblasts and keratinocytes overexpressing Cadherin 11 increase N-cadherin expression present in keratinocytes, melanogenesis cells and fibroblasts.
  • EMT is promoted by increasing N-cadherin and Twist1 expression, and / or decreasing E-cadherin expression. It also increases melanin production and dispersion through RAC and ⁇ -catenin.
  • Cadherin11 overexpression in fibroblasts increases the expression of collagen degrading enzymes, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), resulting in degradation of collagen in the basement membrane and dermis, and cell migration. make it possible.
  • MMP-1 matrix metalloproteinase-1
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • increased expression of N-cadherin in melanocytes assists intercellular contact between fibroblasts and melanocytes. As a result, melanocytes move away from the basement membrane and move into the dermis to promote skin wrinkles.
  • embodiments of the present invention can suppress the melanin production of melanin-producing cells by including a substance that inhibits the expression of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin as an active ingredient. Therefore, the reduction of miR-675 may improve the hyperpigmentation skin with increased expression of Cadherin 11, or may provide a whitening effect on the skin.
  • the expression of CADHERIN 11 or suppressing the expression of N-cadherin collagen degradation can be suppressed by inhibiting the expression of collagen degrading enzymes such as MMP-1 and MMP-2. This can prevent skin wrinkles and provide skin anti-aging effects.
  • the composition may include, for example, at least one of siRNA that binds to the mRNA of Cadherin 11 or N-cadherin, and at least one antibody of Cadherin 11 or N-cadherin as an active ingredient. have.
  • the present invention provides a skin improvement use of at least one expression inhibiting substance of Cadherin 11 and N-cadherin described in the specification of the present invention as described above, or expression of at least one of Cadherin 11 and N-cadherin It provides a skin improving use of a composition comprising an inhibitory substance.
  • another embodiment provides a method for skin improvement comprising administering to the subject an effective amount of one or more expression inhibitory substances of Cadherin 11 and N-cadherin described in the specification of the present invention as an active ingredient,
  • the expression inhibitory substance may be administered in a composition.
  • another embodiment of the present invention may provide an expression inhibitory substance of at least one of the Cadherin 11 and N-Cadherin described in the specification of the present invention as described above for use in skin improvement, wherein the expression Inhibitors can be included in the composition and used.
  • composition according to embodiments of the present invention may be a topical skin composition, and may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • embodiments of the present invention can provide a skin improvement kit comprising the composition as described above, the skin improvement kit is skin whitening, hyperpigmentation improvement, skin wrinkle reduction or prevention, anti It may further include instructions describing skin use and effects such as aging.
  • the skin improvement material screening system may include a co-culture of fibroblasts and melanogenesis cells or a co-culture of fibroblasts, keratinocytes and melanogenesis cells. More specifically, the co-culture of fibroblasts and melanogenesis cells may be co-culture of fibroblasts and melanogenesis cells at a ratio of 30: 1 to 1: 1 cells.
  • the coculture of fibroblasts, keratinocytes and melanogenesis cells may be cocultured at a cell number ratio of 30: 30: 1 to 1: 1: 1.
  • the ratio is a physiologically significant range of the skin, the number of melanocytes is increased in the case of skin hyperpigmentation, such as surplus, blotch, blemishes.
  • one or more cells of the fibroblasts and keratinocytes may include Cadherin 11 overexpression cells, one of the fibroblasts, keratinocytes and melanogenesis cells
  • the above cells may include N-cadherin overexpressing cells.
  • one or more cells of the fibroblasts, keratinocytes and melanogenesis cells may include cells derived from one or more selected from human, mouse, guinea pig, chicken and pig.
  • the skin improvement material screening system may include a chamber including an insert, wherein at least one of the cells of the coculture is cultured inside the insert in the chamber.
  • the skin improvement material screening system may culture the melanocytes in the insert during co-culture of fibroblasts and melanocytes.
  • keratinocytes and melanogenesis cells can be cultured inside the insert.
  • Such a system has physiological and chemical characteristics similar to those of the actual skin, so that the skin improving substance can be screened effectively in vitro, thereby improving skin whitening or hyperpigmentation or preventing or improving skin aging.
  • the substance to choose can be selected.
  • Still further embodiments of the present invention include the steps of treating candidates with co-cultures of the skin improvement material screening system, and measuring the change in expression of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin.
  • Methods of screening skin improving substances can be provided.
  • the method may further include determining a substance that reduces the expression of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin as a skin improving substance.
  • the measuring method of measuring the expression change is not limited to being able to measure the expression change of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin, for example RT (Real time) -PCR,
  • RT Real time
  • One or more methods of western blot, immunofluorescence staining and immunoprecipitation can be included.
  • blemishes on the facial skin of women, skin tissues from cesarean section, and foreskin tissues from men's annulotomy (circumcision) were used as samples for cell culture. It is not limited to the cells obtained from the skin tissue, for example, cells purchased from Invitrogen can be used.
  • keratinocytes are epidermal supplemented with bovine pituitary extract (BPE), bovine insulin (BI), hydrocortisone, human epidermal growth factor and bovine transferring (# S-001-5; Invitrogen). Culture was added to Life Medium (EpiLife Medium, # M-EPI-500-CA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  • Melanogenic cells are BPE, fetal bovine serum, BI, hydrocortisone, bFGF, BT, heparin and phorbol 12-myristate 13-acetate (Invitrogen) Incubated in supplemented medium 254 (Medium 254, Invitrogen).
  • Fibroblasts were DMEM (Gibco / BRL, Grand Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco / BRL), 100 m / L penicillin (Gibco / BRL) and 0.1 mg / ml streptomycin (Gibco / BRL). Epidermal cells were put into the culture.
  • the first screening system was prepared by mixing fibroblasts and melanocytes in a 2: 1 ratio in DMEM.
  • a second screening system was used to plant fibroblasts in an outer culture vessel (dish) in DMEM supplemented with 10% FBS and placed inside a biocoat cell culture insert (collagen type I, 6-well, 0.45 ⁇ m, Becton Dickinson). , Bedford, MA, USA) was prepared by planting melanocytes.
  • the third screening system inverted the insert, planted fibroblasts on the outside of the insert membrane for one day, and then inverted the insert to plant keratinocytes and melanocytes, or only melanocytes inside the insert membrane. In the case of using both keratinocytes and melanocytes, a mixture of keratinocytes and melanocyte producing media in a ratio of 9: 1 was prepared and used.
  • Control microRNA analogs (Dhmarcon Research, Lafayette, CO) or human miR-675 analogs (Dhmarcon Research, Lafayette, CO) were prepared using TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus, PanVera, Madison, WI) on cells. Transfection was carried out according to the protocol.
  • Cadherin 11 Overexpression of Cadherin 11 was induced by transfecting cells with pCMV containing Cadherin 11 gene using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's protocol. Decreased expression of Cadherin 11 was determined using the TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus) using 100 nM of siRNA or non-targeting siRNA (Dharmacon) of human Cadherin 11 according to the manufacturer's protocol. 50 nM was induced by transfection into cells cultured in 6-well plates.
  • Labeled cells were analyzed with CytomicsTM FC500 flow cytometer (Beckman Coulter, Hialeah, Fla., USA) using CXP software (Beckman Coulter) and melanosome migration efficiency values were cytokeratin 14-positive cells and TYRP-1-positive The number of cells was obtained by dividing the total number of cytokeranin 11-positive cells.
  • Taqman microRNA analyzer (Applied Biosystems) specified for hsa-mir-675.
  • Taqman microRNA analysis was used for miRNA quantification by real-time RT-qPCR, where real-time qPCR was performed using a TaqMan universal master mix, and U18 was housekeeping for normalization. Used as a gene (Roche, Mannheim, Germany).
  • the amount of mRNA for GAPDH was measured by real-time PCR using quantitative light cycler real-time PCR (Roche, Mannheim, Germany), and the primers used were as follows.
  • the same amount of protein extracted (20 mg) was digested using 10% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane.
  • the membrane may be phosphor-ERK, ERK, phosphor-CREB, CREB, phosphor-AKT, AKT, phosphor-Rac1, Rac1, beta-catenin, rabbit polyclonal; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), tyrosinase, collagen I (goat polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), CADHERIN 11, PAR-2, Twist, MMP-1 Anti-rabbit or anti-mouse to antibodies against MMP-2, Integrina2 (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology), WNT3A, E-cadherin (mouse monoclonal; Santa Cruz Biotechnology), N-cadherin (Abcam, Cambridge, UK) The cells were incubated with horseradish peroxidase-conjugated antibodies (Santa Cruz Biotechnology).
  • Enhanced chemiluminescence solution Enhanced chemiluminescence solution
  • Thermo Rockford, IL, USA
  • Signals were captured with an image reader (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan).
  • image reader LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan
  • the membranes were returned to mouse monoclonal anti- ⁇ -actin antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA). Probes were made and the procedure described above was again processed. And protein bands were analyzed by densitometry.
  • Human Cadherin 11 3'UTR was amplified by PCR using the following primers.
  • the amplified 3'UTR was replicated downstream of the luciferase gene in the pMIR-REPORT luciferase vector (Ambion, Austin, TX). It was used for transfection in fibroblasts and 293T. Deletion was then generated at the speculative target site of Cadherin 11 3'UTR using the QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Lo Jolla, Calif.) According to the manufacturer's protocol. Cells are backed in 6-well plates and each cell contains a pRL-TK vector (Promega, Madison) containing 50 nM of Renilla luciferase, miR-675 or negative control (Dharmacon, Lafayette, LA).
  • Cadherin 11 3'-UTR Two complementary sequences consisting of 6 and 8 base pairs between MiR-675 and Cadherin 11 3'-UTR (3'-untranslated region, 829 base pairs) were expressed.
  • Cadherin 11 3'-UTR can be converted to miR-675 analogs (miR-675 mimic, Dhmarcon Research, Lafayette, Co.) or non-targeting. control miRNA) and cotransfection into primary dermal fibroblasts and 293T cells. At this time, it was transfected with TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus, PanVera, Madison, WI).
  • miR-675 did not reduce the luciferase activity of the mutated Cadherin 11 3'-UTR.
  • the same result was obtained in 293T cells. From this, it can be seen that miR-675 inhibits Cadherin 11 expression by targeting the 3'-UTR of Cadherin 11.
  • KC normal human skin keratinocytes
  • melanocytes melanocytes
  • fibroblasts fibroblasts
  • Cadherin 11 protein expression was detected in keratinocytes (KC) and fibroblasts (FB) as shown in FIG.
  • KC keratinocytes
  • FB fibroblasts
  • transfection of miR-675 inhibitors increased the amount of fibroblasts (upper left upper row of FIG. 4) and keratinocytes (upper left lower row of FIG. 4) as the amount increased.
  • Cadherin 11 expression was increased. Western blot results were quantified and shown graphically in the lower part of FIG. 4. Cadherin 11 was not detected in melanocytes. Although not included in the figure, all of the miR-675 analogs or inhibitors did not change the amount of Cadherin 11 expression.
  • Cadherin 11 was detected in keratinocytes and fibroblasts (FIG. 3), and miR in which Cadherin 11 was generated in the H19 gene in keratinocytes and delivered to adjacent cells in exosomes. It was confirmed that it is a direct target of -675 (Fig. 2). In addition, it was confirmed that Cadherin 11 expression was higher in fibroblasts compared to keratinocytes from FIG. 3. Thus, in this experiment, an experiment was conducted to determine the effects of Cadherin 11 overexpression and expression on melanin production in fibroblasts.
  • Cadherin 11 may not only express tyrosinase, which is a melanin-forming enzyme, and its transcription factor, MITF (micropthalmia-associated transcription factor), but also cAMP-responsive element-binding protein from melanocytes.
  • tyrosinase which is a melanin-forming enzyme, and its transcription factor, MITF (micropthalmia-associated transcription factor)
  • MITF micropthalmia-associated transcription factor
  • cAMP-responsive element-binding protein from melanocytes Phosphorylation of responsive-element-binding protein (CREB), extracellular signal-regulated kinases (ERK), and protein kinase B (AKT) significantly increased (P ⁇ 0.05).
  • CREB responsive-element-binding protein
  • ERK extracellular signal-regulated kinases
  • AKT protein kinase B
  • Fluorescence activated cell sorter results are the same as confocal microscopy, so tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) and cytokeratin 14 (K14) stained cells. Only FACS analysis was performed. As a result, as shown in FIG. 15, fibroblasts overexpressing Cadherin 11 significantly increased the ratio of TYRP1 and K14 double-positive keratinocytes (P ⁇ 0.05). Reduced fibroblasts reduced this ratio. In other words, the co-culture of keratinocytes and melanocytes that increased the expression of Cadherin 11 increased melanocytes (melanosomes), and from melanocytes to keratinocytes when Cadrine 11 decreased. Melanosome migration was confirmed to be inhibited.
  • TYRP1 tyrosinase-related protein 1
  • K14 cytokeratin 14
  • Keratinocytes were co-cultured with melanin-producing cells in a monolayer, and the effects of Cadherin 11 overexpression and decreased expression in keratinocytes were again analyzed.
  • CADHERIN11 overexpression in keratinocytes significantly increased the expression of melaninase and MIFT as well as the phosphorylation of CREB and AKT from co-cultured melanocytes and keratinocytes (P ⁇ 0.05).
  • Cadherin11 expression significantly reduced the proteins (FIG. 18).
  • FIG. 19 the expression of ⁇ -catenin and Wnt-3A was increased by CADHERIN11 overexpression and decreased by CADHERIN11 expression decrease.
  • LY249002 treatment inhibited CaDerin11-induced ⁇ -catenin expression in keratinocytes.
  • FIG. 21 shows that the binding of ⁇ -catenin and Wnt-3A was also decreased when the immunoprecipitation with the anti-cadherin 11 antibody resulted in the reduction of the expression of the Cadherin 11 with the Cadherin 11 inhibitor.
  • Cadherin 11 is a cell-to-cell adhesion molecule. Although Cadherin11 overexpression or decreased expression in fibroblasts affects melanogenesis and melanosomal migration of cocultured melanocytes (FIGS. 7-16), adherence between cells directly or almost directly Coculture systems contribute to these results, unlike physiological conditions. In order for Cadherin 11 of dermal fibroblasts to function on epithelial melanin producing cells in vivo, fibroblast migration through damaged basement membranes and direct cell-cell adhesion between fibroblasts and melanogenesis cells may be required.
  • MMP-1 matrix metalloproteinase-1
  • Cadherin (CDH) modulates homophilic adhesion with the same Cadherin species in adjacent cells, but Cadherin 11 expression was not detected in melanocytes.
  • the fibroblast-melanin producing cell co-culture system shown in FIG. 7 has an effect on the expression of E-cadherin and N-cadherin in co-cultured melanin-producing cells with reduced expression or decreased expression. It was analyzed using.
  • fibroblasts with reduced expression of Cadherin 11 reduced N-cadherin bound as shown in FIG. 31. 11 did not appear to bind to E-cadherin in cocultured cells.
  • CaHermin11 overexpression in fibroblasts increased the expression of Twist1, a transcription inhibitor of E-Cadherin, and as shown in FIG. 33, the decrease in N-cadherin expression was observed in tyrosinase expression.
  • fibroblasts overexpressing Cadherin 11 in the outer side of the insert greatly promoted the migration of melanin-producing cells in the inner side of the insert (p ⁇ 0.05). Fibroblasts with reduced Cadherin 11 expression were found to inhibit the migration.

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Abstract

본 발명은 캐드헤린11(Cadherin 11) 및 N-캐드헤린(N-cadherin) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 및 이를 포함하는 피부 개선 키트를 제공함으로써 피부 과색소침착증을 개선할 수 있으며, 피부 미백 효과를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템, 및 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공함으로써, 피부 개선 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

캐드헤린11 또는 N-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법
본 발명은 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법에 대한 것이다.
피부는 자외선에 의한 피부 세포의 손상을 차단하기 위하여 멜라닌(melanin)이라는 천연 색소를 가지고 있다. 멜라닌은 피부의 표피-진피 경계 부위인 기저막 위에 위치한 멜라닌 생성 세포(melanocyte)에 의해 만들어지고 주변에 있는 각질 형성 세포(keratinocyte)로 이동하게 되는데 필요 이상으로 멜라닌이 많이 만들어지거나 과도하게 분산되게 되면 원치 않은 피부 과색소침착증이 발생한다.
피부 과색소침착증은 과도한 멜라닌 생성과 분산에 의한 것으로 정상적인 피부와 그 발생 원인이나 기전이 다르다. 기미나 흑자, 검버섯과 같은 피부 과색소침착증의 특징 중에 하나는 멜라닌 생성 세포가 본래의 위치를 이탈하여 기저막에서 진피 속으로 이동하는 것인데 멜라닌 생성 세포가 진피 속으로 어떻게 이동하고 진피 속으로 들어갔을 때 멜라닌 생성과 분산에는 어떤 영향이 있는지, 그리고 섬유아세포가 멜라닌 생성 세포에 미치는 영향은 무엇인지에 대한 연구 결과가 없다는 문제가 있었다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 한국등록특허 제10-0840144호
본 발명의 구현 예들은 피부의 미백 및 노화의 개선에 효과적인 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 시스템과 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 구현 예들은 캐드헤린11(Cadherin 11) 및 N-캐드헤린(N-cadherin) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 및 이를 포함하는 피부 개선 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구현 예들은 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명의 구현 예들은 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 피부 개선 조성물은 피부 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌 생성 세포의 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생성효소인 티로시나제, 그 전사인자인 MITF 발현을 억제하고 RAC과 베타-카테닌의 활성을 억제할 수 있다. 이로써 멜라닌의 생성 및 분산을 억제하여 피부 과색소침착증을 개선할 수 있으며, 피부 미백 효과를 제공할 수 있다. 또한 캐드헤린11의 발현을 억제함으로써 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하여, 콜라겐 분해를 방지하고 멜라닌 생성세포의 기저막에서 진피로의 이동을 억제하여, 피부 주름생성을 방지 또는 완화할 수 있으므로, 우수한 항노화 효과를 나타낸다.
본 발명의 피부 개선 물질 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법은 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 2종 이상의 공배양물을 포함함으로써 실제 피부 조직의 유전자 발현 정도 및 신호전달 인자의 인산화 정도와 유사한 조건을 가지므로, 생체외(in vitro)에서도 임상적으로 캐드헤린11, N-캐드헤린의 발현 변화를 효과적으로 측정할 수 있다.
도 1 내지 도 6은 miR-675가 캐드헤린11(CDH11)의 3'UTR을 타겟팅함으로써 캐드헤린11의 발현을 억제함 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 1은 miR-675와 캐드헤린11 mRNA의 3'UTR간의 상보적인 서열을 나타낸 것이고, 도 2는 정상인간 섬유아세포내에 pMIR-CDH11 또는 변이체(mutant)가 miR-675와 함께, 또는 miR-675 없이 트랜스펙션되어 배양된 경우의 루시페라제 활성(luciferase activity)의 상대비를 나타낸 것이다(P<0.05). 이때 도 2의 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균 SD하여 나타낸 것이다. 도 3 및 도 4는 섬유아세포(FB) 및 각질형성세포(KC)에 다양한 농도의 miR-675의 유사체 또는 억제제를 처리하지 않은 경우(도 3)와 처리한 경우(도 4; 왼쪽이 유사체, 오른쪽이 억제제를 처리한 경우)의 각 캐드헤린11(CDH11) 발현정도를 웨스턴블랏 분석(Western blot analysis)하여 나타낸 것이다. 이때, β-액틴(β-actin)은 국제규격인 것을 사용하였다. 도 5는 miR-675이 감소된 다섯명의 기미 환자의 정상 색소 피부 대비 과색소침착된 피부의 캐드헤린11 발현량의 상대비를 RT(Real time) PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 GAPDH는 국제규격의 것을 사용하였다. 도 6은 안티-캐드헤린11 및 안티-K14 항체를 사용한 miR-675가 감소된 4명의 기미환자의 정상 색소 피부(N) 및 과색소침착된 피부(L)를 면역형광염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 14는 섬유아세포내 캐드헤린11의 발현과 멜라닌 형성과의 관련성을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 7은 섬유아세포-멜라닌 생성세포 공배양으로, 왼쪽부터 단분자막 공배양, 챔버 하부의 섬유아세포 및 인서트(insert) 상부의 멜라닌 생성세포의 공배양 및 인서트 외측의 섬유아세포 및 인서트 상부의 멜라닌 생성세포의 공배양을 각각 도시한 것이다. 도 8은 캐드헤린11(CDH11) 유전자 또는 캐드헤린11 siRNA를 트랜스펙션한 후 캐드헤린11 발현정도를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다(그래프 x축의 왼쪽부터 control, CDH11, control siRNA, CDH11 siRNA). 도 9 및 도 10은 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포와 공배양된 멜라닌 생성세포의 LY294002가 처리, 또는 처리되지 않은 경우의 티로시나제(tyrosinase), MITF, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, AKT, p-AKT, Wnt-3A, 및 β-카테닌(β-catenin)의 발현정도를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다. 도 11 및 도 12는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물의 막(membranous) 및 핵 부위의 β-카테닌 발현량을 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다. 도 13은 안티-캐드헤린11 항체를 사용한, 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물내 면역침강(Immunoprecipitation) 결과를 나타낸 것이다. 도 14는 안티-캐드헤린11 및 안티-β-카테닌 항체들을 사용한, 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물의 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛). 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균 SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 15 및 도 16은 섬유아세포내 캐드헤린11 발현과 멜라노좀(melanosome)이동과의 관련성을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 15는 인서트 외측의 섬유아세포(캐드헤린11 과발현 또는 발현감소) 및 인서트 내측의 각질형성세포/멜라닌 생성세포로 된 공배양 시스템에서 세포에 안티-TYRP1 및 안티-K14 항체들을 사용한 FACS 분석결과를 나타낸 것이다. 도 16은 멜라닌 생성 세포의 세포돌기(dendrite) 형성에 관여하는 Rac1, LY294002가 처리 또는 무처리된 p-Rac1 및 PAR2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균 SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 17 내지 도 23은 각질형성세포내 캐드헤린11의 발현과 멜라닌형성 및 멜라노좀 이동의 관련성을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 17은 캐드헤린11 유전자 또는 캐드헤린 siRNA를 트렌스펙션한 후의 캐드헤린11 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 18 및 도 19는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와 공배양된 멜라닌 생성세포내 LY294002가 처리 또는 무처리된 티로시나제, MITF, CREB, p-CREB, AKT, p-AKT, Wnt-3A 및 β-카테닌의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 20은 캐드헤린11이 과발현된 각질형성세포와 공배양된 멜라닌 생성세포의 세포질 및 핵 부분내 β-카테닌의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 21은 안티-캐드헤린11 항체를 이용한 면역 침강 웨스턴 블랏으로 캐드헤린11 억제제가 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 22는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와 멜라닌 생성 세포를 공배양했을 때 멜라노좀을 가지고 있는(TRP1: 멜라노좀 표지 단백질) 각질형성세포의 수(Keratin14: 각질형성세포 표지 단백질)를 FACS 분석으로 나타낸 결과이다. 도 23은 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와의 공배양물들내 Rac1, p-Rac1 및 PAR2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균 SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 24 및 도 25는 섬유아세포내 캐드헤린11의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(matrix metalloproteinase-2) 발현유도 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 24는 케드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포내 콜라겐 분해효소인 MMP-1 및 MMP-2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균 SD하여 나타낸 것이다(P<0.05). 도 25는 안티-타입 IV 콜라겐 및 안티-K14 항체들을 사용한, miR-675가 감소된 네명의 기미 환자들의 과색소침착 및 정상 색소 피부의 면역형광 염색결과를 형광현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛).
도 26 내지 도 34는 섬유아세포내 캐드헤린11의 멜라닌 생성세포내 N-캐드헤린 발현유도 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 26 내지 도 28은 캐드헤린11이 과발현(도 26 및 27) 및 발현감소(도 28)된 섬유아세포-멜라닌 생성세포 공배양물의 N-캐드헤린 및 E-캐드헤린 발현에 대한 차이를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 도이다. 도 29 및 도 30은 캐드헤린11이 과발현(도 29) 및 발현감소(도 30)된 섬유아세포의 단분자막 공배양물에 안티-캐드헤린11 및 안티-N-캐드헤린 항체를 사용하여 면역형광염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 31은 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포의 단분자막 공배양물에 안티-캐드헤린11 항체를 사용하여 면역침각한 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛). 도 32는 멜라닌 생성세포의 유무에 따른 캐드헤린11이 과발현된 섬유아세포내 Twist1 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 33은 N-캐드헤린이 발현감소 또는 발현감소되지 않은 캐드헤린11 과발현 섬유아세포와 공배양된 인서트내 멜라닌 생성세포의 티로시나제 발현을 웨스턴 블랏분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 34는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포의 존재하 멜라닌 생성세포 이동에 대한 보이든 챔버 분석(Boyden chamber assay) 결과를 나타낸 도이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 35 및 도 36은 각질형성세포내 캐드헤린11의 EMT 유도 실험결과를 나타낸 것으로, 구체적으로 멜라닌 생성세포의 유무에 따른 캐드헤린11 과발현 각질형성세포내 N-캐드헤린, E-캐드헤린 및 Twist1 발현을 웨스턴블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 37은 기미 피부에서의 캐드헤린11의 역할을 개략적으로 나타낸 도이다.
본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
이하, 본 발명을 본 명세서에 첨부된 도면을 참조로 하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 구현예들은 캐드헤린11(Cadherin 11(CDH11), ACCESSION: AAD27755, VERSION: AAD27755.1, GI: 4689094) 및 N-캐드헤린(N-cadherin, (ACCESSION: AAB22854, VERSION: AAB22854.1, GI: 253483) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
기미(melasma)와 같은 피부 과색소침착증 환자의 피부에는 마이크로RNA인 miR-675가 감소되어 있다. 상기 miR-675는 H19 유래 마이크로RNA로서 H19 유전자는 기미부위에서 하향조절(downregulation)된다. 상기 miR-675는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)를 타겟으로 하며, 엑소좀(exosome)내의 각질형성세포(kerinocyte)로부터 방출된다. 상기 miR-675는 상기 MITF 이외에 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 유효성분인 캐드헤린11도 타겟으로 한다. 상기 캐드헤린11의 3'UTR(untranslate region)은 miRNA 타겟 추정부위를 포함한다. 구체적으로, miR-675는 캐드헤린11의 3'UTR을 포함하는 세포로 트랜스펙션(transfection)할 수 있지만 캐드헤린11 3'UTR의 변이체는 캐드헤린11의 발현을 감소시키지 않는다(도 1 및 도 2 참조). 이는 캐드헤린11의 3'UTR에 miR-675이 직접결합함을 의미한다. 캐드헤린11의 발현량의 증가 또는 감소는 miR-675, 예를 들면 miR-675의 유사체(mimic) 또는 억제제(inhibitor)의 트랜스펙션에 의해 유도될 수 있다. 이에 따라, 과색소침착증인 경우 miR-675가 그 타겟 유전자인 각질 형성세포와 섬유아세포의 캐드헤린11의 발현을 억제하지 못하기 때문에 과색소침착증 부위에서 그 발현이 증가하게 된다.
본 발명의 구현예들에 따른 상기 캐드헤린11은 Ca2+의존성 막관통 세포 연접 분자인 캐드헤린의 상과(superfamily)로서, 상기 캐드헤린은 타입-1 막관통 단백질로 세포연접에 중요한 역할을 하며 조직내에서 세포들이 밀착연접을 형성한다. 캐드헤린11은 배아 발달, 조직의 형태 형성, 종양의 침윤과 전이, 염증, 및 신호 전달에 기여한다. 본 발명의 구현예들에 따른 상기 캐드헤린 11은 각질형성세포 및 섬유아세포에서 발현한다. 상기 캐드헤린11은 멜라닌 생성세포에서는 발현하지 않지만, 상기 섬유아세포 유래 캐드헤린11은 멜라닌 생성세포를 기저막에서 진피로 이동시킬 수 있다. 섬유아세포 또는 각질형성세포 유래 캐드헤린11은 각각 AKT-β-카테닌(β-catenin)-Wnt와 AKT-Rac1 경로(pathway)를 통한 멜라닌 형성(melanogenesis) 및 멜라노좀(melanosome) 뿐만 아니라, EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 겪는 세포 내에서 N-캐드헤린의 상향조절(upregulation)에 관여한다.
도 37을 참조로 하여 본 발명의 구현예들에 포함되는 상기 캐드헤린11에 대하여 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 섬유아세포 및 각질형성세포내 캐드헤린11의 과발현은 공배양된 멜라닌 생성세포내 N-캐드헤린의 발현을 유도하게 되는데, 이는 표준(canonical) Wnt 및 AKT 활성경로를 통한 멜라닌 형성 및 AKT/Rac1 인산화(phosphorylation)을 통한 멜라노좀의 이동과 연관된다. 즉, 캐드헤린11이 과발현된 섬유아세포 및 각질형성세포는 각질형성세포, 멜라닌 생성세포, 섬유아세포에 존재하는 N-캐드헤린 발현을 증가시킨다. N-캐드헤린 및 Twist1 발현의 증가, 및/또는 E-캐드헤린 발현의 감소에 의해 EMT를 촉진시킨다. 또한 RAC과 β-카테닌을 통하여 멜라닌의 생성 및 분산을 증가시킨다. 한편, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현은 콜라겐 분해효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(matrix metalloproteinase-2) 발현을 증가시켜 기저막과 진피에 있는 콜라겐이 분해되고, 세포 이동을 가능하게 한다. 또한 멜라닌 생성세포 내 N-캐드헤린의 발현 증가는 섬유아세포 및 멜라닌 생성세포 사이의 세포간 접촉을 도와준다. 이로써 멜라닌 생성세포는 기저막에서 위치를 이탈하여 진피 속으로 이동하여 피부 주름을 촉진하게 된다.
이에 본 발명의 구현예들은 캐드헤린 11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함함으로써, 멜라닌 생성 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있다. 따라서 miR-675의 감소로 캐드헤린11의 발현이 증가된 과색소침착증 피부를 개선할 수 있거나, 피부에 미백효과를 제공할 수 있다. 또한, 캐드헤린11의 발현을 억제하거나 N-캐드헤린의 발현을 억제함으로써, MMP-1 및 MMP-2를 예로 들 수 있는 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제할 수 있다. 이로서 피부 주름생성을 방지하고 피부 항노화 효과를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서 상기 조성물은 예를 들어 상기 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 mRNA에 결합하는 siRNA, 및 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면 본 발명은 상기와 같이 본 발명의 명세서에 기재된 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 억제 물질의 피부 개선 용도, 또는 상기 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 포함하는 조성물의 피부 개선 용도를 제공한다.
또한, 다른 일 구현예는 상기와 같이 본 발명의 명세서에 기재된 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로써 대상에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 피부 개선 방법을 제공하며, 이때 상기 발현 억제 물질은 조성물에 포함되어 투여될 수 있다.
나아가, 본 발명의 또다른 일 구현예는 피부 개선에 사용하기 위하여 상기와 같이 본 발명의 명세서에 기재된 상기 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 제공할 수 있으며, 이때 상기 발현 억제 물질을 조성물에 포함하여 사용할 수 있다.
본 발명의 구현예들에 따른 상기 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명의 구현예들은 상기와 같은 조성물을 포함하는 피부 개선 키트를 제공할 수 있으며, 상기 피부 개선 키트는 본 발명의 조성물의 피부 미백, 과색소침착증 개선, 피부 주름생성 완화 또는 방지, 항노화 등의 피부 개선 용도 및 효과를 기재한 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예들은 상기와 같은 캐드헤린 11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제시키는 물질을 스크리닝하기 위한 피부 개선 물질 스크리닝 시스템으로서, 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템을 제공할 수 있다. 일 구현 예로서 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양물 또는 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양물은 섬유아세포와 멜라닌생성세포를 30:1~1:1의 세포 수 비율로 공배양한 것일 수 있다. 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양물은 30:30:1 ~ 1:1:1의 세포 수 비율로 공배양한 것일 수 있다. 상기 비율을 피부 생리학적으로 유의미한 범위를 나타낸 것이며, 흑자, 검버섯, 기미와 같이 과색소침착증이 일어난 피부의 경우 멜라닌 생성세포 수가 증가하게 된다.
본 발명의 일 구현예로서 상기 섬유아세포 및 각질형성세포 중 하나 이상의 세포는 캐드헤린11(Cadherin 11) 과발현(overexpression) 세포를 포함할 수 있으며, 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 N-캐드헤린(N-cadherin) 과발현 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭 및 돼지 중에서 선택된 하나 이상에서 유래한 세포를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예로서, 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 인서트(insert)를 포함하는 챔버를 포함할 수 있으며, 상기 공배양물의 세포 중 하나 이상은 상기 챔버내 인서트의 내부에서 배양된 것일 수 있다. 일 구현예로서 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양시 멜라닌생성세포를 인서트내부에서 배양할 수 있다. 또는 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양시 각질형성세포 및 멜라닌생성세포를 인서트 내부에서 배양할 수 있다.
상기와 같은 시스템은 실제 피부와 유사한 생리적, 화학적 특징을 가지므로, 피부 개선 물질을 생체외(in vitro)에서도 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이로써 피부 미백 또는 과색소침착증을 개선하거나 피부 노화를 방지 또는 개선하는 물질을 선별할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예들은 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 또한, 일 구현예로서 상기 발현 변화를 측정하는 단계 이후, 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 감소시킨 물질을 피부 개선 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 발현 변화를 측정하는 단계의 측정방법은 상기 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정할 수 있는 것이라며 제한되지 않으나, 예를 들면 RT(Real time)-PCR, 웨스턴 블랏(western blot), 면역형광염색(Immunofluorescence staining) 및 면역침강(Immunoprecipitation) 중 하나 이상의 방법을 포함할 수 있다.
이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
이때, 하기 실험들에 사용된 공통적인 실험방법을 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
세포의 배양
하기 실험들에서는 여성의 얼굴 피부에 있는 기미조직이나 제왕절개로부터 얻은 피부 조직 및 남성의 환상절제술(포경수술)로부터 얻은 포피 조직을 세포배양을 위한 시료로 하였다. 상기 피부조직에서 얻은 세포에 제한되지 않으며, 예를 들면 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입한 세포를 사용할 수 있다.
그 다음 상기 시료를 표피를 진피로부터 분리하고, 각 표피세포들의 현탁액을 준비하였다. 구체적으로, 각질형성세포들은 BPE (bovine pituitary extract), BI(bovine insulin), 히드로코르티손(hydrocortisone), 인간상피세포성장인자 및 BT(bovine transferring, #S-001-5; Invitrogen)가 보충된 에피라이프 배지(EpiLife Medium, #M-EPI-500-CA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 넣어 배양하였다. 멜라닌생성세포는 BPE, 소태아혈청(fetal bovine serum), BI, 히드로코르티손, bFGF, BT, 헤파린(heparin) 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, Invitrogen)가 보충된 배지 254(Medium 254, Invitrogen)에서 배양하였다. 섬유아세포는 10% 소태아혈청(Gibco/BRL), 100 m/L 페니실린(Gibco/BRL) 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(Gibco/BRL)이 보충된 DMEM (Gibco/BRL, Grand Island, NY)에 표피 세포를 넣어 배양하였다.
공배양 시스템
공배양 실험에서는 세가지 종류의 스크리닝 시스템을 제조하여 사용하였다. 첫번째 스크리닝 시스템은 섬유아세포 및 멜라닌 생성세포를 DMEM내에서 2:1의 비율로 혼합하여 제조하였다. 두번째 스크리닝 시스템은 섬유아세포를 10%FBS가 보충된 DMEM내 바깥 배양 용기(dish)에 심고, 그 안쪽에 위치한 바이오코트(biocoat) 세포 배양 인서트(collagen type I, 6-well, 0.45㎛, Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)에 멜라닌 생성세포를 심어 제조하였다. 세번째 스크리닝시스템은 인서트를 뒤집어서 섬유아세포를 인서트 멤브레인의 외측에 심어 하루간 둔 다음, 다시 인서트를 뒤집어서 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포, 또는 멜라닌 생성세포만을 인서트 멤브레인의 내측에 심었다. 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포를 모두 사용하는 경우는 각질형성세포 배양배지 및 멜라닌 생성세포 배양배지를 9:1의 비율로 혼합한 혼합물을 제조하여 사용하였다.
마이크로 RNA 유사체/억제제의 트랜스 펙션
대조군 마이크로RNA 유사체(Dhmarcon Research, Lafayette, CO) 또는 인간 miR-675 유사체(Dhmarcon Research, Lafayette, CO)는 세포들에 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus, PanVera, Madison, WI)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스펙션하였다.
캐드헤린11의 과발현 및 발현감소 유도
캐드헤린11의 과발현은 제조자의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 캐드헤린11 유전자를 포함하는 pCMV를 세포에 트랜스펙션하여 유도하였다. 캐드헤린11의 발현감소는 제조자의 프로토콜에 따라 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus)을 사용하여 인간 캐드헤린11의 siRNA 또는 음성대조군(ON-TARGETplus SMARTpool or Non-targeting siRNA; Dharmacon) 100 nM 또는 50 nM를 6-웰 플레이트내 배양된 세포에 트랜스펙션하여 유도하였다.
면역조직화학(immunohistochemistry)
실험결과의 분석방법으로서, 면역형광염색을 위하여는 탈파라핀(deparaffinization) 및 재수화(rehydration) 후 측정부분을 3%소혈청알부민과 함께 전보온(preincubation)하였다. 이중 염색을 위하여는 배양된 세포 또는 측정부분을 항-캐드헤린11 항체 및 1:200 알렉사 플루오르 라벨된 고트 안티-래빗 IgG(Alexa Fluor-labeled goat anti-rabbit IgG, 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)과 반응시킨 후 연속적으로 안티-케라틴14항체 및 알렉사 플루오르 라벨된 고트 안티-마우스 IgG(Alexa Fluor-labeled goat anti-mouse IgG, 594; Molecular Probes)과 반응시켰다. 세포핵은 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich)로 대비염색하였다. 염색된 시료들은 이미지 분석 시스템(CellSense standard 1.7.1; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)으로 측정하였다.
멜라노좀의 이동 분석
멜라노좀의 각질형성세포로의 이동에 대한 정량분석은 유세포분석기(Flowcytometry)를 사용하였다. 구체적으로, 세포들을 2%파라포르말데히드(paraformaldehyde)에 10분간 고정시킨다음 BD PhosFlow Perm/Wash Buffer I (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 포함하는 PBS로 10분간 세척하였다. 그 다음, FITC-콘쥬게이티드 고트(goat) 안티-TYRP-1 (1 g per 1 x 106 cells; Santa Cruz Biotechnology) 및 PE-콘쥬게이티드 마우스(mouse) 안티-사이토케라틴 14 (1:10; BD Biosciences)와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 다시 PBS로 세척하여 유세포분석을 준비하였다. 라벨링된 세포들을 CXP 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 CytomicsTM FC500 유세포 분석기(Beckman Coulter, Hialeah, Fla., USA)로 분석하였으며,멜라노좀 이동 효율값은 사이토케라틴 14-포지티브 세포 및 TYRP-1-포지티브 세포들의 숫자를 사이토케라닌 11-포지티프 세포들의 총 숫자로 나누어 얻었다.
리얼타임 RT-PCR 분석
성숙 miRNA의 발현을 hsa-mir-675에 특정된 택맨(Taqman) 마이크로RNA 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. 택맨 마이크로RNA 분석은 리얼타임 RT-qPCR에 의한 miRNA정량을 위해 사용하였으며, 이때 리얼타임 qPCR은 택맨 유니버설 마스터 믹스(TaqMan universal master mix) 를 사용하여 수행하였고, U18은 정상화를 위한 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 사용하였다(Roche, Mannheim, Germany).
GAPDH에 대한 mRNA의 양은 Light Cycler real-time PCR (Roche, Mannheim, Germany)을 정량 사용하여 리얼타임 PCR에 의해 측정하였으며, 이때 사용한 프라이머는 다음과 같다.
CDH11 5'-GGCAGGCTCAGAACAGAAAG-3'(forward, 서열번호 1)
5'-CTACCAGATCATTGTTCTTC-3'(reverse, 서열번호 2)
GAPDH 5'-TCCACTGGCGTCTTCACC-3'(forward, 서열번호 3)
5'-GGCAGAGATGATGACCCTTT-3'(reverse, 서열번호 4).
웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)
추출된 동량의 단백질(20 mg)을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분해하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 막을 포스포르(phosphor)-ERK, ERK, 포스포(phosphor)-CREB, CREB, 포스포(phosphor)-AKT, AKT, 포스포(phosphor)-Rac1, Rac1, 베타-카테닌(beta-catenin, rabbit polyclonal; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), 티로시나제(tyrosinase), 콜라겐I(goat polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 캐드헤린11, PAR-2, Twist, MMP-1, MMP-2, Integrina2 (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology), WNT3A, E-cadherin(mouse monoclonal; Santa Cruz Biotechnology), N-캐드헤린(Abcam, Cambridge, UK) 대한 항체에 안티-래빗 또는 안티-마우스 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-콘쥬게이트된 항체들(Santa Cruz Biotechnology)과 함께 배양시켰다. 그 다음, 강화된 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution, Thermo, Rockford, IL, USA)으로 처리하였다. 신호들은 이미지 리더(LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 캡쳐하였다. 각 래인(lane)에 로드되는 단백질의 양을 모니터하기 위하여, 멤브레인들을 마우스 단일클론항체 안티 -β-액틴 항체(mouse monoclonal anti-β-actin antibody, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 다시 프로브(probe)하고, 상술된 과정을 다시 처리하였다. 그리고 단백질 밴드를 덴시토메트리(densitometry)에 의해 분석하였다.
루시페라제(Luciferase) 활성 분석
인간 캐드헤린11 3'UTR을 다음의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
forward primer 5'-AAAGCTGCGCACTAGTGAATGCAGAGAGAGGAGAAG-3' (MITF-3UTR-F, 서열번호 5)
reverse primer 5'-ATCCTTTATTAAGCTT TTGGATTTGCAAATGACT-3' (MITF-3UTR-R, 서열번호 6)
증폭된 3'UTR을 pMIR-REPORT 루시페라제 벡터(Ambion, Austin, TX)내 루시페라제 유전자의 다운스트림에 복제하였다. 이는 섬유아세포 및 293T내 트랜스펙션을 위해 사용되었다. 그 다음 제조자의 프로토콜에 따라 QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Lo Jolla, CA)를 사용하여 캐드헤린11 3'UTR의 추측 타겟 사이트에 결실(deletion)을 생성하였다. 세포들을 6-웰 플레이트에서 배영하고, 각 세포들에 레닐라 루시페라제(Renilla luciferase), miR-675 또는 네거티브 컨트롤(Dharmacon, Lafayette, LA) 50 nM를 포함하는 pRL-TK 벡터 (Promega, Madison, WI)와 함께 pMIR-CDH11 또는 pMIR-Mutant를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션에는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하였다. 24시간 후, 반딧불이 및 라닐라 루시페라제 활성을 듀얼-루시페라제 리포터 어세이(Promega)를 사용하여 측정하였다. 트렌스펙션은 3중으로 수행하였으며, 모든 실험들을 세번씩 반복 수행하였다.
통계분석
모든 실험데이터의 통계분석은 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 사용하여 수행하였으며, 그 결과는 평균±SD값으로 표현되었다. 또한, p 값이 0.05 미만인 경우를 의미있는 값으로 고려하였다.
[실험예 1] MiR-675가 캐드헤린11 발현을 억제시키는지 여부의 확인
miRNA-675의 캐드헤린11 발현억제능의 확인
MiR-675 및 캐드헤린11 3'-UTR(3'-untranslated region, 829 base pairs)간의 6개 및 8개의 염기쌍(base paires)으로 구성된 두개의 상보적인 서열을 발현시켰다. 캐드헤린11 이 miR-675의 직접적인 타겟인지여부를 확인하기 위하여, 캐드헤린11 3'-UTR을 miR-675 유사체(miR-675 mimic, Dhmarcon Research, Lafayette, CO) 또는 비타겟 대조군(non-targeting control miRNA)으로 1차 피부 섬유아세포 및 293T 세포 내로 코트랜스펙션(cotransfection)시켰다. 이때 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus, PanVera, Madison, WI)을 사용하여 트랜스펙션하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 비타겟 대조군 유전자와 달리, miR-675는 1차 피부 섬유아세포에서 캐드헤린11 루시페라제(luciferase) 활성을 매우 감소시켰다(P = 0.0002). 또한, miR-675는 변이된 캐드헤린11 3'-UTR의 루시페라제 활성은 감소시키지 않았다. 도 2에는 삽입되지 않았지만 293T 세포에서도 동일한 결과가 나타났다. 이로부터, miR-675는 캐드헤린11 의 3'-UTR을 타겟으로 하여 캐드헤린11 발현을 억제시킴을 확인할 수 있다.
각질형성세포(KC)와 섬유아세포(FB)에서의 캐드헤린11 단백질 발현 확인
배양된 정상 인간 피부 각질형성세포(keratinocytes, KC), 멜라닌 생성세포(melanocytes) 및 섬유아세포(fibroblasts, FB)를 공배양한 후, 캐드헤린11 단백질의 발현여부를 관찰하였다. 이때, 상기 두 세포는 miR-675 유사체 또는 억제제를 트랜스펙션한 것과 하지 않은 것으로 분리하여 실험하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 각질형성세포(KC), 및 섬유아세포(FB)에서 캐드헤린11 단백질 발현이 검출되었다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, miR-675 유사체를 처리한 섬유아세포(도 4의 오른쪽 상부 윗줄) 및 각질형성세포 (도 4의 오른쪽 상부 아랫줄)에서는 miR-675 유사체의 양이 증가함에 따라 캐드헤린11 발현이 감소한데 반해, miR-675 억제제를 트랜스펙션한 경우에는 그 양이 증가함에 따라 섬유아세포 (도 4의 왼쪽 상부 윗줄) 및 각질형성세포 (도 4의 왼쪽 상부 아랫줄)에서의 캐드헤린11 발현은 증가하였다. 이상의 웨스턴 블랏 결과를 정량화하여 도 4 하부에 그래프로 나타내었다. 멜라닌 생성세포에서는 캐드헤린11 이 검출되지 않았다. 도면에 포함하지는 않았으나, miR-675 유사체 또는 억제제를 트랜스펙션한 경우 모두 캐드헤린11 발현량이 변화하지 않았다.
기미 피부에서의 캐드헤린11 RNA 발현 증가여부 확인
miR-675와 캐드헤린11 발현의 역상관관계를 확인하기 위하여 9명의 기미환자의 피부를 분석한 결과, miR-675양이 감소된 것으로 검출되었다. 또한, 리얼타임 PCR로 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 다섯명의 환자 샘플에서 정상 피부와 비교하여 과색소침착 피부(hyperpigmented skin)에서 상대적인 캐드헤린11 mRNA 발현량이 증가하였음을 확인할 수 있다. 도 5의 x축의 3L, 7L, 16L. 19L, 23L이 의미하는 바는 서로 다른 환자를 나타내는 표시이다.
면역형광법(Immunofluorescence)으로서 면역염색 후 형광현미경으로 분석한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 나머지 네 환자들의 경우 과색소침착된 표피 및 진피에서의 캐드헤린11 염색정도가 더 강하게 나타남을 확인할 수 있었다. 기미 부위(L)에 정상 피부(N)보다 캐드헤린11 의 단백질 발현이 증가된 것을 알 수 있었다.
[실험예 2] 섬유아세포에서의 캐드헤린11 발현의 멜라닌 생성 및 멜라노좀의 이동과의 관련성 확인
상기 실험예 1로부터 멜라닌 생성세포와 달리 각질형성세포와 섬유아세포에서는 캐드헤린11 발현이 검출되었고(도 3), 캐드헤린11 이 각질형성세포내 H19 유전자에서 생성되고 엑소좀내 인접세포로 전달되는 miR-675의 직접적인 타겟임을 확인하였다(도 2). 또한, 도 3으로부터 각질형성세포와 비교하여 섬유아세포에서 캐드헤린11 발현이 더 높게 나타남을 확인하였다. 이에, 본 실험에서는 섬유아세포에서의 멜라닌 생성에 대한 캐드헤린11 과발현 및 발현감소효과를 확인하는 실험을 실시하였다.
먼저, 섬유아세포-멜라닌 생성세포의 공배양을 위하여 도 7에 도시한 바와 같이 단분자막으로된 공배양을 사용하였으며, 하부 챔버의 바닥에서 섬유아세포를 공배양하고 인서트(insert)의 상부에서 멜라닌 생성세포를 공배양하였다. 그리고 상기 인서트의 외측에서 섬유아세포, 내측에서 멜라닌 생성세포를 공배양하였다. 상기 두 종류의 세포가 인서트에서 공배양되는 시스템이 생리학적 관련성이 보다 높으므로, 공배양 후 인서트 내측의 멜라닌 생성세포를 채취하여 분석하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 섬유아세포에서 캐드헤린11 이 과발현되고, 캐드헤린11 siRNA을 처리한 경우는 발현이 감소하였다.
나아가, 도 9에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 의 과발현이 멜라닌 생성 효소인 티로시나제(tyrosinase)와 그 전사인자인 MITF(micropthalmia-associated transcription factor)의 발현뿐만 아니라 멜라노 생성세포로부터 cAMP-반응요소 결합 단백질(responsive-element-binding protein, CREB), ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 및 AKT(Protein Kinase B)의 인산화 반응을 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 또한, 상기 섬유아세포에서의 캐드헤린11 의 과발현은 멜라닌 생성 세포내 캐드헤린11 하위 신호 전달인자인 β-카테닌(β-catenin) 및 Wnt3a(Wingless-type MMTV integration site family, member 3a)의 발현을 증가시키고 분해된 섬유아세포에서는 발현을 감소시켰다. 도 10에 확인할 수 있는 바와 같이 PI3K 억제제인 LY294002 처리는 캐드헤린11 가 과발현된 섬유아세포에서의 β-카테닌 발현 증가를 억제하였다. 이때 β-카테닌은 다른 세포 부분에서 다르게 작용하므로, 각 부분에서의 β-카테닌 발현을 단분자층으로된 섬유아세포-멜라닌 생성 세포 공배양을 사용하여 측정하였다.
그 다음으로, 캐드헤린11 가 유도된 β-카테닌 발현을 공배양의 멤브레인 및 핵 부분에서 검출한 결과, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이 β-카테닌의 발현이 캐드헤린11 발현 감소와 함께 감소하였다. 또한, 도 13에 나타난 바와 같이 안티-캐드헤린11 항체로 면역침강(immunoprecipitation) 분석결과 캐드헤린 siRNA에 의해 캐드헤린11 발현이 감소된 세포내의 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합이 감소된 것으로 나타났다. 마지막으로, 도 14에 나타난 바와 같이 안티-캐드헤린11 및 안티-β-카테닌 항체들의 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포와 공배양한 멜라닌 생성 세포내 β-카테닌의 염색이 더 약한 것으로 나타났다. 이는 캐드헤린11 와 β-카테닌, Wnt3a가 결합함을 의미한다.
[실험예 3] 각질형성세포에서의 캐드헤린11 발현과 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동의 관련성 확인 1
인서트의 내부에 멜라닌 생성 세포 단배양 대신 멜라닌 생성세포-각질 형성 세포를 공배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 공배양 시스템을 이용하여, 캐드헤린11 가 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포의 멜라노좀 이동효과를 확인하는 실험을 실시하였다.
FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석결과는 공초점형 현미경(confocal microscopy) 분석 결과와 같으므로, 티로시나제-관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1) 및 사이토테라틴 14(cytokeratin 14, K14) 염색 세포에 FACS 분석만을 수행하였다. 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 가 과발현된 섬유아세포는 TYRP1 및 K14 더블-포지티브(double-positive) 각질형성세포 비율을 매우 증가시킨데 반해(P < 0.05), 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포는 상기 비율을 감소시켰다. 즉, 캐드헤린11 의 발현을 증가시킨 각질 형성세포와 멜라닌 생성세포를 공배양하였을 때 멜라노좀(melanosome)의 이동이 증가하였고, 캐드헤린11 의 발현을 감소시켰을 때는 멜라닌 생성 세포에서 각질형성세포로 멜라노좀 이동이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행한 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 Rac1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)의 인산화 반응(p-RAC)은 캐드헤린11 의 과발현 및 발현감소에 따라 각각 증가 및 감소하였다. 이에 반해, 멜라노좀 이동의 핵심 단백질인 PAR 2(protease activated receptor 2)의 발현은 캐드헤린11 의 과발현 및 발현감소에 따라 변화하지 않았다. 또한, 도 16의 하부에 나타난 바와 같이, LY294002는 Rac1 인산화 반응에서 캐드헤린11 의 유도된 증가를 억제하였다. 즉, 캐드헤린11 의 발현을 증가시켰을 때 멜라닌 생성 세포의 세포 돌기(dendrite) 형성에 관여하는 RAC의 활성(인산화)을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 각질형성세포에서의 캐드헤린11 발현과 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동의 관련성 확인 2
각질형성세포를 단분자층에서 멜라닌 생성세포와 공배양하여, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현 및 발현감소 효과를 다시한번 분석하였다.
상기 실험예 2의 캐드헤린11 이 과발현 또는 발현 감소된 섬유아세포의 결과와 유사하게(도 8-14), 각질형성세포에서도 캐드헤린11 유전자 또는 캐드헤린 siRNA를 트렌스펙션한 후 캐드헤린11의 발현량은 캐드헤린11을 과발현시킨 경우 증가하였고, 발현감소시킨 경우 감소하였다(도 17).
또한, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현은 공배양된 멜라닌 생성 세포 및 각질형성세포로부터 CREB 및 AKT의 인산화 반응뿐만 아니라 멜라닌 생성효소(tyrosinase) 및 MIFT의 발현을 매우 증가시켰다(P < 0.05). 반면, 캐드헤린11 발현 감소는 상기 단백질들을 매우 감소시켰다(도 18). 또한, 도 19에 나타난 바와 같이, β-카테닌 및 Wnt-3A의 발현은 캐드헤린11 과발현에 의해 증가하고 캐드헤린11 발현감소에 의해 감소하였다. 또한, LY249002 처리는 각질형성세포에서의 캐드헤린11 가 유도된 β-카테닌 발현을 억제하였다. 도 20에서는 세포질(cytoplasm) 및 핵(nuclear) 부분에서의 β-카테닌 발현이 전체 세포 용균액(total lysate) 내의 β-카테닌과 유사하게 변화하였음을 확인할 수 있다. 도 21에는 안티-캐드헤린11 항체로 면역 침강한 결과 캐드헤린11 억제제로 캐드헤린11 발현을 감소시켰을 때 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합도 감소하였음을 나타내고 있다.
또한, FACS 분석결과, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현은 TYRP1 and K14 더블-포지티브 세포비율을 매우 증가시켰으며(P < 0.05), 캐드헤린11 발현감소는 이를 감소시킨 것으로 나타났다(도 22). 마지막으로, 웨스턴 블랏 분석결과, 도 23에 나타난 바와 같이 PAR2과 달리 Rac1의 인산화 반응이 캐드헤린11 과발현에 의해 증가하였으며, 캐드헤린11 발현감소에 의하여는 상기 인산화 반응이 감소한 것으로 나타났다.
[실험예 5] 섬유아세포에서 캐드헤린11 의 MMP-1 및 MMP-2 발현 유도 확인
캐드헤린11 은 세포와 세포의 부착 분자이다. 비록 섬유아세포에서의 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소가 공배양된 멜라닌 생성 세포의 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동에 영향을 미치지만(도 7 내지 도 16), 직접 또는 거의 직접적으로 세포와 세포간에 접착된 공배양 시스템은 생리적 조건과 달리 상기 결과에 기여한다. 피부 섬유아세포의 캐드헤린11 가 생체내 상피 멜라닌 생성 세포에 기능을 발휘하기 위하여, 손상된 기저막을 통한 섬유아세포 이동 및 섬유아세포 및 멜라닌 생성 세포간의 직접적인 세포-세포 부착이 필요할 수 있다. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)가 섬유아세포의 이동과 관련이 있고, MMP-2가 기저막을 분해시키므로, MMP-1 및 MMP-2의 발현에 대한 캐드헤린11 의 효과를 분석하는 실험을 실시하였다.
먼저, 웨스트 블랏 분석한 결과 도 24에 나타난 바와 같이 배양된 섬유아세 포내 캐드헤린11 과발현은 MMP-1 및 MMP-2의 발현을 매우 증가시켰고(P<0.05), 캐드헤린11 발현감소는 이를 매우 감소시켰다(P < 0.05). 또한, 과색소침착 피부내 강한 캐드헤린11 발현을 갖는 4명의 환자로부터 면역침강법으로 조직을 분석하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 25에 나타난 바와 같이 과색소침착 피부(L)의 기저막내 콜라겐 IV 발현이 정상부위(N)보다 매우 감소된 것으로 나타났다.
[실험예 6] 섬유아세포내 캐드헤린11 의 멜라닌 생성 세포내 N-캐드헤린 발현 유도 확인
캐드헤린(CDH)은 인접 세포의 동일한 캐드헤린 종들과의 동종친화성 부착(homophilic adhesion)을 조절하나, 멜라닌 생성세포에서는 캐드헤린11 발현이 검출되지 않았다. 이에, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소가 공배양된 멜라닌 생성 세포내 E-캐드헤린 및 N-캐드헤린의 발현에 대하여 갖는 효과를 도 7에 도시된 섬유아세포-멜라닌 생성 세포 공배양 시스템을 사용하여 분석하였다.
먼저, 웨스턴 블랏 분석결과, 도 26 내지 도 28에 각각 나타난 바와 같이, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 및 발현감소는 사용된 공배양 시스템과 상관없이 단배양된 섬유아세포뿐만 아니라 공배양된 멜라닌 생성세포에서도 N-캐드헤린 단백질의 발현을 매우 증가 및 감소시켰다(P < 0.05). 구체적으로, N-캐드헤린 발현에 대한 효과는 단분자막으로 된 공배양에서 가장 높게 나타났으며, 그 다음으로 인서트의 외측내 섬유아세포와 공배양순으로 높게 나타났고, 하부 챔버 바닥의 섬유아세포와의 공배양에서 가장 낮았다. 그리고 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소의 경우 모두 멜라닌 생성세포내 E-캐드헤린 발현은 변화가 없었다.
캐드헤린11 및 안티-N-캐드헤린 항체들을 사용하여 단분자층의 공배양을 이 중 염색한 후 형광현미경으로 관측한 결과, 도 29 및 도 30에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현시킨 경우 멜라닌 생성세포 및 섬유아세포내 강하게 염색된 N-캐드헤린이 증가한 반면, 캐드헤린11 발현감소시에는 강하게 염색된 N-캐드헤린이 감소하였다.
안티-캐드헤린11 항체를 사용하여 단분자층의 공배양으로부터 단백질을 면역침강 분석한 결과, 도 31에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 이 발현 감소된 섬유아세포는 결합한 N-캐드헤린을 감소시켰으며, 캐드헤린11이 공배양된 세포의 E-캐드헤린에 결합하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 도 32에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현은 E-캐드헤린의 전사 억제인자인 Twist1의 발현을 증가시켰으며, 도 33에 나타난 바와 같이 N-캐드헤린의 발현감소는 티로시나제 발현내 캐드헤린11 -유도된 증가를 사라지게 했다.
또한, 보이든 챔버 평가(Boyden chamber assay) 결과, 도 34에 나타난 바와 같이 인서트의 외측내 캐드헤린11 이 과발현된 섬유아세포가 인서트의 내측내 멜라닌 생성세포의 이동을 매우 촉진(p<0.05)하고, 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포는 상기 이동을 억제함을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 각질형성세포내 캐드헤린11 의 EMT에 대한 관련성의 확인
상기 실험예 6의 결과에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 의 변화는 멜라닌 생성세포의 캐드헤린 발현에 영항을 미치므로, 각질형성 세포내 캐드헤린11 과발현의 E-캐드헤린 및 공배양된 멜라닌 생성 세포의 N-캐드헤린 발현에 대한 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 35 및 도 36에 나타난 것과 같이 각질형성세포 단배양(KC) 및 각질형성세포-멜라닌 생성세포의 공배양(KC+MC) 모두에서 N-캐드헤린 발현이 증가하는 동안 E-캐드헤린의 발현이 감소하였다. 또한, 각질형성세포 단배양물 및 공배양물에서 Twist1의 발현이 매우 상향조절되었다(P < 0.05).

Claims (18)

  1. 캐드헤린11(Cadherin 11) 및 N-캐드헤린(N-cadherin) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은
    상기 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 mRNA에 결합하는 siRNA; 및 상기 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 캐드헤린11은 miRNA-675의 타겟 유전자인 피부 개선용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 멜라닌 생성 세포의 멜라닌 생성을 억제하는 피부 개선용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 캐드헤린 11의 발현 억제물질은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)의 발현을 억제하는 물질인 피부 개선용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 과색소 침착증 개선 또는 피부 미백용인 피부 개선용 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 항노화용인 피부 개선용 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 피부 개선 키트.
  9. 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 섬유아세포 및 각질형성세포 중 하나 이상의 세포는 캐드헤린11(Cadherin 11) 과발현(overexpression) 세포를 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 N-캐드헤린(N-cadherin) 과발현 세포를 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 인서트(insert)를 포함하는 챔버를 포함하고, 상기 공배양물의 세포 중 하나 이상은 상기 챔버내 인서트의 내부에서 배양된 것인 미백 물질 스크리닝 시스템.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭 및 돼지 중에서 선택된 하나 이상에서 유래한 세포인 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 피부 개선 물질은 피부 미백 또는 과색소침착증을 개선하는 물질인 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 피부 개선 물질은 피부 노화를 방지 또는 개선하는 물질인 피부 개선 물질 스크리닝 시스템.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 하나의 항에 따른 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 발현 변화를 측정하는 단계 이후, 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 감소시킨 물질을 피부 개선 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 발현 변화를 측정하는 단계는 상기 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 RT(Real time)-PCR, 웨스턴 블랏(western blot), 면역형광염색(Immunofluorescence staining) 및 면역침강(Immunoprecipitation) 중 하나 이상의 방법으로 측정하는 단계를 포함하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
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