JP2016103997A - メラニン制御剤の探索方法 - Google Patents
メラニン制御剤の探索方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016103997A JP2016103997A JP2015201569A JP2015201569A JP2016103997A JP 2016103997 A JP2016103997 A JP 2016103997A JP 2015201569 A JP2015201569 A JP 2015201569A JP 2015201569 A JP2015201569 A JP 2015201569A JP 2016103997 A JP2016103997 A JP 2016103997A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- melanin
- exosome
- cells
- keratinocytes
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 123
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 25
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 93
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 8
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 claims description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 44
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 2
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 abstract 2
- 206010024380 Leukoderma Diseases 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 16
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 15
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 15
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 9
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 9
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 8
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 8
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 8
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 7
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 7
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000013760 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Human genes 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150056978 HMGS gene Proteins 0.000 description 6
- 101100011891 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ERG13 gene Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- -1 serum Substances 0.000 description 6
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 5
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 5
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 5
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108010014402 tyrosinase-related protein-1 Proteins 0.000 description 4
- PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N (e)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazine Chemical compound C1=CC=C2S\C(=N\N)N(C)C2=C1 PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100040881 60S acidic ribosomal protein P0 Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000673456 Homo sapiens 60S acidic ribosomal protein P0 Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700031126 Tetraspanins Proteins 0.000 description 2
- 102000043977 Tetraspanins Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 1
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 101000836492 Dictyostelium discoideum ALG-2 interacting protein X Proteins 0.000 description 1
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000219051 Fagopyrum Species 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001134621 Homo sapiens Programmed cell death 6-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001510071 Pyrrhocoridae Species 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100024550 Sphingomyelin phosphodiesterase 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700030796 Tsg101 Proteins 0.000 description 1
- 101150072717 Tsg101 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000032341 cell morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003037 imidazol-2-yl group Chemical group [H]N1C([*])=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 108040005466 neutral sphingomyelin phosphodiesterase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- AJHJUZXFWYDLMU-UHFFFAOYSA-M potassium cyclodecyloxy-[di(cyclodecyl)-lambda4-sulfanylidene]methanethiolate Chemical compound [K+].[S-]C(OC1CCCCCCCCC1)=S(C1CCCCCCCCC1)C1CCCCCCCCC1 AJHJUZXFWYDLMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000031019 skin pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
【課題】メラノサイトにおけるメラニン量を制御する物質を簡易に探索する方法の提供。【解決手段】以下の工程ａ）〜ｃ）を含むメラニン制御剤の探索方法。ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程、ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程、ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程。【効果】前記方法によれば、メラノサイトのメラニン量を変化させる素材やデンドライト形成を変化させる素材を探索することができ、メラニン産生促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防又は治療剤、白髪予防又は改善剤、デンドライト伸長促進剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、デンドライト伸長抑制剤等を評価又は選択することができる。【選択図】なし
Description
本発明は、メラニン制御剤を探索する方法に関する。
人の皮膚や毛髪の色調は、皮膚及び毛髪に存在する色素メラニンの量によって決定される。メラニンは、皮膚や毛髪の毛球部に存在する色素細胞（メラノサイト）において、酵素チロシナーゼやドーパオキシダーゼによってチロシンから生合成されることから、メラノサイトの活性化又はチロシナーゼの活性化によりメラニン産生が亢進すれば、皮膚は褐色化し、毛髪は黒色化する。
皮膚のシミ、ソバカスは、その原因の一つとして、皮膚の紫外線暴露による刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等によってメラノサイトが活性化され、メラニン産生が亢進することが挙げられる。したがって、従来より、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させたりする美白剤が開発されてきた。また、表皮角化細胞（ケラチノサイト）に存するメラニン顆粒は、メラノサイトで産生されたメラニン顆粒を、メラノサイトがデンドライトを伸長し、ケラチノサイトと接合して該メラニン顆粒をケラチノサイト内に転送することにより、ケラチノサイトに存するようになる。これは、メラニン色素の皮膚組織への沈着にとって重要な過程であるため、デンドライトの伸長を阻害することは美白剤の開発に有用であるのみならず、皮膚の色素異常症の診断や治療にも役立つと考えられる。
一方で、メラニンの産生を亢進して肌を褐色化する需要も多く、日光浴や屋内での紫外線照射により肌を積極的に日焼けさせることや、タンニング剤を利用することが従来から行われている。また、皮膚に於いて、デンドライトの伸長が妨げられてメラニン顆粒の転送に支障を来すと、メラニン産生が妨げられ白斑などを生ずるようになる。したがって、白斑の治療に於いては、メラノサイトのデンドライト伸長を促進することが有効である。
また、白髪は、毛母色素細胞の変化によってメラニンが減少する生理的老化現象の一つであるが、その発生機序の多くは未だ解明されておらず、染毛剤による染毛が中心となっているのが現状である。従って、白色化した髪を黒髪へと変化させる方法の開発が求められている。
斯様に、メラノサイトに直接的若しくは間接的に作用してメラニン量やデンドライトの形成を変化させる成分の探索は、美白、肌の褐色化、白髪の防止又は改善等を図るために極めて有用である。
一方、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は脂質二重膜で囲まれた膜小胞で、従来は不要な細胞内成分を外に放出するために機能していると考えられてきたが、近年、免疫細胞や腫瘍細胞をはじめ、多くの細胞がエクソソームを放出し、これが分泌細胞（エクソソーム放出細胞）とその標的細胞（エクソソーム受容細胞）の間で蛋白質や脂質を交換する重要なメッセンジャーとなっていることが解明されつつある。近年、ケラチノサイト由来のエクソソームも単離され、線維芽細胞に添加することで、ＭＭＰ−１の発現が上昇すること（非特許文献１）、骨髄由来樹状細胞に添加することで、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２の産生が上昇すること（非特許文献２）が報告されている。
しかしながら、ケラチノサイトから放出されるエクソソームがメラノサイトに対して如何なる作用を示すのかは全く知られていない。
しかしながら、ケラチノサイトから放出されるエクソソームがメラノサイトに対して如何なる作用を示すのかは全く知られていない。
Chavez-Munos C et al. (2008) J Cell Biochem., 104: 2165-2173
Kotzerke K et al. (2013) Exp Dermatol., 22: 650-655
本発明は、メラノサイトにおけるメラニン量を制御する物質を簡易に探索する方法を提供することに関する。
本発明者は、メラニン制御に関して種々検討したところ、ケラチノサイトから放出されるエクソソームがメラノサイトに受容され、メラノサイトの細胞増殖及びデンドライト形成を顕著に促進し、メラニン産生を促進することを見出した。すなわち、ケラチノサイト由来のエクソソームは、メラノサイトの細胞増殖能及びメラニン産生能をはじめとした細胞活性を正に制御しており、ケラチノサイトから放出されるエクソソームの分泌レベルを指標とすることにより、メラニン制御剤を評価又は選択できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の工程ａ）〜ｃ）を含むメラニン制御剤の探索方法に係るものである。
ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
本発明によれば、メラノサイトのメラニン量を変化させる素材やデンドライト形成を変化させる素材を探索することができる。すなわち、メラニン産生促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防又は治療剤、白髪予防又は改善剤、デンドライト伸長促進剤、メラニン産生抑制剤、美白剤、デンドライト伸長抑制剤等を評価又は選択することができる。
本発明において、「エクソソーム」とは、ケラチノサイトから恒常的に放出されるエクソソームを意味する。ケラチノサイト由来のエクソソームは、直径が３０〜１００ｎｍで、ｃｕｐ形状を有し、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０（ＨＳＰ７０）、β−Ａｃｔｉｎ、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３）等のタンパク質を含むという特徴を有することが報告されているが、本発明においてはこれに限定されるものではない。
後記実施例に示すように、ケラチノサイト由来のエクソソームは、メラノサイトの細胞活性（ドーパオキシダーゼ活性、細胞呼吸鎖活性）を上昇させ（図３）、メラニン関連タンパク質をコードする遺伝子（Microphthalmia-associated transcription factor（ＭＩＴＦ）、Tyrosinase（ＴＹＲ）、Tyrosinase related protein１（ＴＹＲＰ１）、Dopachrome tautomerase (ＤＣＴ)／Tyrosinase related protein２（ＴＹＲＰ２））の発現を上昇させ（図４）、メラノサイトの細胞増殖及び形態形成を促進させ（細胞数の増加、デンドライトの伸長）（図５）、メラニン関連タンパク質（ＭＩＴＦ、Tyrosinase、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２）の発現を上昇させ（図６）、さらにメラニン産生を促進させる（図７）。また、さらに表皮中のエクソソーム含有量とメラノソームに特異的なタンパク質であるＰｍｅｌ１７の発現量は良好に相関する（図８）。したがって、ケラチノサイト由来のエクソソームは、メラノサイトの細胞活性を正に制御し、皮膚色形成に関与すると考えられる。
故に、ケラチノサイトからのエクソソームの分泌レベルを変化させることによって、メラニンの制御が可能であり、当該エクソソームの分泌レベルの増加はメラニン量を増加させ、逆に当該エクソソームの分泌レベルの低減はメラニン量を低下させると云え、実際に、エクソソームの放出促進剤によりメラニン生成が促進され（図９〜１１）、エクソソームの放出抑制剤によりメラニン生成が抑制される（図１２〜１５）。
したがって、ケラチノサイトにおけるエクソソームの分泌レベルを指標とすることにより、メラニン制御剤を評価又は選択することができる。
故に、ケラチノサイトからのエクソソームの分泌レベルを変化させることによって、メラニンの制御が可能であり、当該エクソソームの分泌レベルの増加はメラニン量を増加させ、逆に当該エクソソームの分泌レベルの低減はメラニン量を低下させると云え、実際に、エクソソームの放出促進剤によりメラニン生成が促進され（図９〜１１）、エクソソームの放出抑制剤によりメラニン生成が抑制される（図１２〜１５）。
したがって、ケラチノサイトにおけるエクソソームの分泌レベルを指標とすることにより、メラニン制御剤を評価又は選択することができる。
本発明において、「メラニン制御」とは、メラノサイトにおけるメラニン量の制御及びデンドライト形成の制御を意味し、具体的にはメラノサイトの細胞増殖活性の上昇又は低下、メラノサイトの細胞数の増加又は減少、メラニン合成の促進又は低下、メラニン合成に関わる因子（メラニン合成のマスター制御因子：Microphthalmia-associated transcription factor (ＭＩＴＦ)、メラニン合成に関わる酵素群：ＴＹＲ，ＴＲＰ１，ＴＲＰ２等）及びその遺伝子の発現量の増加又は減少、デンドライト形成の促進又は低下が包含される。
本発明のメラニン制御剤の探索方法は、ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程、ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程、ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程、を含む。
本発明において用いられる「ケラチノサイト」としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、ヒト、マウス、ラット、ブタ等の哺乳動物由来の細胞を使用することができるが、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。当該ケラチノサイトを用いる場合には、動物よりケラチノサイトを採取し、常法に従って処理して用いることができるが、樹立細胞株として市販されているもの（例えば、ヒト表皮角化細胞株であるHaCaT細胞など）を購入して利用することもできる。ヒトの細胞としては、例えば正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ：Normal Human Epidermal Keratinocytes）が好適に挙げられる。
被験物質の種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。接触の形態は、被験物質に依存して、任意の形態であり得る。
被験物質とケラチノサイトとの接触における、被験物質の濃度は、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上で、１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下であり、また０．００００１〜１質量％、好ましくは０．０００１〜０．１質量％である。当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１２〜１２０時間であり、４８〜７２時間が好ましい。
当該細胞と被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行われる。例えば、増殖用添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）を含むＥｐｉｌｉｆｅ培地（Life Technologies製）、上記、増殖用添加剤のうちｈＥＧＦを含まないＥｐｉｌｉｆｅ培地（Life Technologies製）やCnT-Prime培地（CELLnTEC製）の他、適宜、抗生物質、血清、増殖因子等を添加した培地等の市販の培地中で培養できる。培養は、通常３０℃〜４０℃、１〜１０ｖｏｌ％二酸化炭素存在下で実施すればよく、３７℃、５ｖｏｌ％二酸化炭素存在下で実施するのが好ましい。
また、被験物質と接触させる際のケラチノサイトの細胞数は、例えば６ｗｅｌｌプレートを用いる場合、通常１０４〜１０６個／ｗｅｌｌであればよく、５×１０４〜５×１０５個／ｗｅｌｌが好ましい。
エクソソームの単離は、培養上清を回収した後、超遠心機を用いて、異なる速度で段階的に遠心処理することにより行うことができる(ref. Thery C et al. (2006) Curr Protoc Cell Biol., 3.22.1-3.22.29)。具体的には、培養上清を回収し、300gで10分間、2,000gで20分間、10,000gで30分間と段階的に遠心分離することにより、余分な細胞(破片)を除去した培養上清に対し、100,000gで70分間の遠心分離を行った後で上清を除去し、Phosphate Buffered Saline (PBS)にて一度洗浄し、さらに、100,000gで70分間遠心分離した後に完全に上清を除去することにより行うことができる。また、超遠心機を用いずに、エクソソーム膜に発現するタンパク質（CD9、CD63、そして、CD81など）に対する抗体でコートされたビーズを用いて、エクソソームを直接単離する免疫吸着法（抗体結合法）を用いることもできる(ref. Wubbolts R et al. (2003) J Biol Chem., 278: 10963-10972)。その他、市販のキット試薬（例えばExosome Precipitation Solution, ExoQuick-TC（System Biosciences社、#EXOTC10A-1 or EXOTC50A-1）やmiRCURY Exosome Isolation Kit (EXIQON社、#300102)、Total Exosome Isolation Reagent (invitrogen社、#4478359)等）を用いることでもよい。
エクソソームの分泌レベルの変化は、例えば、被験物質を接触させる細胞群と接触させない群（対照細胞）を用意し、エクソソームの分泌レベルを測定し、両者間で比較することが挙げられる。なお、対照細胞としては、被験物質を接触させない代わりに、対照物質を接触させたものを用いてもよい。
エクソソームの分泌レベルの測定は、例えば、エクソソーム画分の総タンパク質量の測定、エクソソーム中に含まれるマーカー物質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ７０、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、Ｈｒｓ、ＧＭ１ガングリオシドなど）の発現量の測定、エクソソームの粒径の分布と濃度の測定、エクソソーム数の測定、エクソソーム中に含まれるＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）の発現量の測定等によって行うことができる。好適には、４８〜７２時間の間に培養上清中に放出されたエクソソーム画分のタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、単位時間における１細胞あたりのエクソソーム放出量を算出することが挙げられる。
各種測定は、当該分野で通常使用される任意の解析方法を用いればよく、遺伝子発現解析には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等を、タンパク質発現解析には、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等を用いることができる。また、市販のキット（例えばCD63 ExoELISA Kit（System Biosciences社、#EXOEL-CD63A-1）等）やナノ粒子解析装置（NanoSight LM10（NanoSight社））を用いることもできる。
各種測定は、当該分野で通常使用される任意の解析方法を用いればよく、遺伝子発現解析には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等を、タンパク質発現解析には、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等を用いることができる。また、市販のキット（例えばCD63 ExoELISA Kit（System Biosciences社、#EXOEL-CD63A-1）等）やナノ粒子解析装置（NanoSight LM10（NanoSight社））を用いることもできる。
上記のように測定されたケラチノサイトにおけるエクソソームの分泌レベルの変化に基づき、メラニン制御剤を選択することができる。すなわち、被験物質（候補物質）を添加したエクソソームの分泌レベルが被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞でのレベルと比較して、低下又は減少していれば、メラニン産生抑制剤、美白剤又はデンドライト伸長抑制剤として評価又は選択でき、増強又は増加していれば、メラニン産生促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防又は治療剤、白髪予防若しくは改善剤又はデンドライト伸長促進剤として評価又は選択することができる。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞以下の工程ａ）〜ｃ）を含むメラニン制御剤の探索方法。
ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
＜２＞ｂ）工程における分泌レベルの測定が、エクソソーム画分のタンパク質量を測定し、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出する、＜１＞の方法。
＜３＞エクソソームの分泌レベルを増強又は増加させる被験物質を、メラニン産生促進剤、デンドライト伸長促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防若しくは治療剤、又は白髪予防若しくは改善剤として評価及又は選択する＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を、メラニン産生抑制剤、デンドライト伸長抑制剤又は美白剤としてとして評価又は選択する＜１＞又は＜２＞の方法。
＜５＞前記被験物質の濃度は、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上で、１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下であり、また０．００００１〜１質量％、好ましくは０．０００１〜０．１質量％である＜１＞〜＜４＞の方法。
＜６＞前記細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１２〜１２０時間であり、好ましくは４８〜７２時間である＜１＞〜＜５＞の方法。
＜１＞以下の工程ａ）〜ｃ）を含むメラニン制御剤の探索方法。
ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程
＜２＞ｂ）工程における分泌レベルの測定が、エクソソーム画分のタンパク質量を測定し、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出する、＜１＞の方法。
＜３＞エクソソームの分泌レベルを増強又は増加させる被験物質を、メラニン産生促進剤、デンドライト伸長促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防若しくは治療剤、又は白髪予防若しくは改善剤として評価及又は選択する＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を、メラニン産生抑制剤、デンドライト伸長抑制剤又は美白剤としてとして評価又は選択する＜１＞又は＜２＞の方法。
＜５＞前記被験物質の濃度は、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上で、１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下であり、また０．００００１〜１質量％、好ましくは０．０００１〜０．１質量％である＜１＞〜＜４＞の方法。
＜６＞前記細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１２〜１２０時間であり、好ましくは４８〜７２時間である＜１＞〜＜５＞の方法。
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例1：ケラチノサイト由来エクソソームの単離とその特徴付け
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入した。ケラチノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
実施例1：ケラチノサイト由来エクソソームの単離とその特徴付け
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入した。ケラチノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
（２）ケラチノサイト由来エクソソームの単離
ケラチノサイトを2.5×106cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。3日間の培養後、培養上清を回収し、300gで10分間、2,000gで20分間、10,000gで30分間と段階的に遠心分離することにより、余分な細胞(破片)を除去した。この操作を終えた後の培養上清に対し、100,000gで70分間の遠心分離を行った後で上清を除去し、Phosphate Buffered Saline (PBS)にて一度洗浄した。さらに、100,000gで70分間遠心分離した後に完全に上清を除去し、沈殿物をPBSにて懸濁した。100mLの培養上清から遠心分離した場合、最終沈殿物は200μLのPBSにて懸濁し、これを原液として評価に用いた。また、100,000g遠心後の上清はAmicon(R) Ultra Centrifugal Filters Ultra(R)-3K (Millipore)に供し、4,800rpmで45分間遠心処理を行った。遠心処理後にフィルター上部に残留した液を培養上清濃縮物として回収した。また、細胞非培養の培地に対して同様の処理を施した液を培地濃縮物として回収した。
ケラチノサイトを2.5×106cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。3日間の培養後、培養上清を回収し、300gで10分間、2,000gで20分間、10,000gで30分間と段階的に遠心分離することにより、余分な細胞(破片)を除去した。この操作を終えた後の培養上清に対し、100,000gで70分間の遠心分離を行った後で上清を除去し、Phosphate Buffered Saline (PBS)にて一度洗浄した。さらに、100,000gで70分間遠心分離した後に完全に上清を除去し、沈殿物をPBSにて懸濁した。100mLの培養上清から遠心分離した場合、最終沈殿物は200μLのPBSにて懸濁し、これを原液として評価に用いた。また、100,000g遠心後の上清はAmicon(R) Ultra Centrifugal Filters Ultra(R)-3K (Millipore)に供し、4,800rpmで45分間遠心処理を行った。遠心処理後にフィルター上部に残留した液を培養上清濃縮物として回収した。また、細胞非培養の培地に対して同様の処理を施した液を培地濃縮物として回収した。
（３）単離したエクソソーム画分の電子顕微鏡観察
単離したエクソソーム画分をPBSもしくはHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) bufferにて適宜希釈した。その溶液を親水化処理したコロジオン膜貼付メッシュ 400メッシュ(日新EM)に5μL滴下し、5分間静置した。膜上の水分を吸い取った後、2% Sodium Dodecatungsto(VI) phosphate n-Hydrate (wako)もしくはEMステイナー(日新EM)を10μL滴下し、1分間もしくは30分間静置することにより、ネガティブ染色を行った。膜上の水分を除いた後、精製水を10μL滴下した。余分な水分を除いた後、H7650透過型電子顕微鏡(日立)を用いて加速電圧100kVで観察した。その結果、既報と同様に、エクソソームに特徴的なサイズ (直径30-100nm)と形態(cup-shaped) を示す小胞を確認した(図1)。
単離したエクソソーム画分をPBSもしくはHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) bufferにて適宜希釈した。その溶液を親水化処理したコロジオン膜貼付メッシュ 400メッシュ(日新EM)に5μL滴下し、5分間静置した。膜上の水分を吸い取った後、2% Sodium Dodecatungsto(VI) phosphate n-Hydrate (wako)もしくはEMステイナー(日新EM)を10μL滴下し、1分間もしくは30分間静置することにより、ネガティブ染色を行った。膜上の水分を除いた後、精製水を10μL滴下した。余分な水分を除いた後、H7650透過型電子顕微鏡(日立)を用いて加速電圧100kVで観察した。その結果、既報と同様に、エクソソームに特徴的なサイズ (直径30-100nm)と形態(cup-shaped) を示す小胞を確認した(図1)。
（４）単離したエクソソーム画分におけるマーカータンパク質の発現確認
単離したエクソソーム画分をResuspension buffer (ambion)にて溶解し、その溶液についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク質定量を行った後、細胞抽出物、培養上清濃縮物及び培地濃縮物と共に、タンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-CD9 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-CD63 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-Calnexin (Cell Signaling, 1:1000)抗体、anti-HSP70 (Cell Signaling, 1:1000)抗体、あるいはanti-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)抗体を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)あるいはanti-rabbit IgG HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Donkey (GE Healthcare Life Science) を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(富士フィルム)を用いて可視化した。その結果、エクソソームに特徴的に発現するマーカーとされるタンパク質群、すなわち、細胞質に存在するHeat shock protein 70、細胞骨格タンパク質であるActin、また、テトラスパニン(CD9、CD63)の発現がエクソソーム画分に確認され、さらにエクソソームには含有されないとして知られるCalnexinの発現が認められないことも確認された(図2)。それと同時に、ケラチノサイトの培養上清濃縮物(図2; lane2)には、Hsp70を除くエクソソームマーカータンパク質の発現が認められなかったことから、エクソソームがその濃縮過程で除去されていることを確認した。なお、Hsp70の発現が培養上清濃縮物で認められたことは既報（Chavez-Munoz C. et al., 2008, J.Cell. Biochem. 104:2165-2173）と同様の結果である。
単離したエクソソーム画分をResuspension buffer (ambion)にて溶解し、その溶液についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク質定量を行った後、細胞抽出物、培養上清濃縮物及び培地濃縮物と共に、タンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-CD9 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-CD63 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-Calnexin (Cell Signaling, 1:1000)抗体、anti-HSP70 (Cell Signaling, 1:1000)抗体、あるいはanti-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)抗体を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)あるいはanti-rabbit IgG HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Donkey (GE Healthcare Life Science) を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(富士フィルム)を用いて可視化した。その結果、エクソソームに特徴的に発現するマーカーとされるタンパク質群、すなわち、細胞質に存在するHeat shock protein 70、細胞骨格タンパク質であるActin、また、テトラスパニン(CD9、CD63)の発現がエクソソーム画分に確認され、さらにエクソソームには含有されないとして知られるCalnexinの発現が認められないことも確認された(図2)。それと同時に、ケラチノサイトの培養上清濃縮物(図2; lane2)には、Hsp70を除くエクソソームマーカータンパク質の発現が認められなかったことから、エクソソームがその濃縮過程で除去されていることを確認した。なお、Hsp70の発現が培養上清濃縮物で認められたことは既報（Chavez-Munoz C. et al., 2008, J.Cell. Biochem. 104:2165-2173）と同様の結果である。
以上のことより、ケラチノサイトの培養上清より単離した画分がエクソソーム画分と呼ぶに値するものと判断し、これを用いて、以降の評価を行った。
実施例2：ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトに及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologiesより購入した。メラノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologiesより購入した。メラノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
（２）メラノサイトに対するケラチノサイト由来エクソソーム画分の処理
メラノサイトを1.0×104 cells/well (100μL/well)、1.0×105 cells/well (500μL/well)及び1.5×105 cells/well (1.5mL/well)の細胞密度で96-well plate、12-well plate及び6-well plateにそれぞれ播種した。この時の試験用培地としては、Medium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含）を用いた。2日後、PBSにて懸濁したエクソソーム画分を添加した後、さらに、96-well plateにおいては5日間、12-well plateにおいては3日間もしくは4日間培養し、それぞれドーパオキシダーゼ活性の計測及び定量的RT-PCR解析に用いた。6-well plateにおいては5日間培養した後に、細胞数の計測及び形態観察、ウェスタンブロッティング解析、さらに、細胞内メラニン定量に用いた。
メラノサイトを1.0×104 cells/well (100μL/well)、1.0×105 cells/well (500μL/well)及び1.5×105 cells/well (1.5mL/well)の細胞密度で96-well plate、12-well plate及び6-well plateにそれぞれ播種した。この時の試験用培地としては、Medium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含）を用いた。2日後、PBSにて懸濁したエクソソーム画分を添加した後、さらに、96-well plateにおいては5日間、12-well plateにおいては3日間もしくは4日間培養し、それぞれドーパオキシダーゼ活性の計測及び定量的RT-PCR解析に用いた。6-well plateにおいては5日間培養した後に、細胞数の計測及び形態観察、ウェスタンブロッティング解析、さらに、細胞内メラニン定量に用いた。
（３）ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
96-well plateでの培養終了後、培地を全量置換し(100μL/well)、アラマーブルー(Bio-Rad AbD Serotec Limited)試薬を10μL/wellになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度 (Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer (0.1M Tris-HCL (pH:7.2）、1% NP-40、0.01% SDS)を20μL/well、Assay Buffer (4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate-buffered (pH:7.1))を20μL/well添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各wellに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH (3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)溶液を60μL、基質として5mM L-DOPA (L-ジヒドロキシフェニルアラニン)溶液を40μL加え、37℃にて30〜60分間反応させた後、その吸光度を505nmの測定波長で測定した。その結果、PBSのみを添加したコントロールと比較して、同画分添加による両活性の有意な上昇を確認した(図3A、B)。
96-well plateでの培養終了後、培地を全量置換し(100μL/well)、アラマーブルー(Bio-Rad AbD Serotec Limited)試薬を10μL/wellになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度 (Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer (0.1M Tris-HCL (pH:7.2）、1% NP-40、0.01% SDS)を20μL/well、Assay Buffer (4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate-buffered (pH:7.1))を20μL/well添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各wellに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH (3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)溶液を60μL、基質として5mM L-DOPA (L-ジヒドロキシフェニルアラニン)溶液を40μL加え、37℃にて30〜60分間反応させた後、その吸光度を505nmの測定波長で測定した。その結果、PBSのみを添加したコントロールと比較して、同画分添加による両活性の有意な上昇を確認した(図3A、B)。
（４）ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトのメラニン関連遺伝子の発現量に及ぼす影響
12-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄した後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN）を用いて定法に従いtotal RNAを抽出した。その抽出したtotal RNAを鋳型とし、High Capacity RNA to cDNA Kit (Life Technologies)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。反応には、MH Research社製のPeltier Thermal Cyclerを用いた。続いて合成したcDNA及びTaqMan(R)probeを用いて、定量的PCR法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なprobe及びprimerは、Life Technologies社製のTaqMan(R)Gene Expression Assays (P/N 4331182)を使用した。各々の発現量は、内部標準遺伝子であるribosomal protein, large, P0 (RPLP0)の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、アプライドバイオシステムズ社製のシークエンスディテクター(ABI PRISM 7500 Real Time PCR System)を用いて行った。その結果、エクソソーム画分を添加して72時間後にMITFの発現上昇を確認し(図4A)、96時間後にはTYR、TYRP1、Dopachrome tautomerase (DCT) /TYRP2の発現上昇を確認した(図4B)。
12-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄した後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN）を用いて定法に従いtotal RNAを抽出した。その抽出したtotal RNAを鋳型とし、High Capacity RNA to cDNA Kit (Life Technologies)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。反応には、MH Research社製のPeltier Thermal Cyclerを用いた。続いて合成したcDNA及びTaqMan(R)probeを用いて、定量的PCR法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なprobe及びprimerは、Life Technologies社製のTaqMan(R)Gene Expression Assays (P/N 4331182)を使用した。各々の発現量は、内部標準遺伝子であるribosomal protein, large, P0 (RPLP0)の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、アプライドバイオシステムズ社製のシークエンスディテクター(ABI PRISM 7500 Real Time PCR System)を用いて行った。その結果、エクソソーム画分を添加して72時間後にMITFの発現上昇を確認し(図4A)、96時間後にはTYR、TYRP1、Dopachrome tautomerase (DCT) /TYRP2の発現上昇を確認した(図4B)。
（５）ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトの細胞増殖能及び形態形成に及ぼす影響
6-well plateでの培養終了後、顕微鏡観察をおこない、画像を記録した。その後、0.25% Trypsin-EDTA 溶液(Life Technologies)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、細胞数の有意な増加を確認すると共に(図5A)、デンドライトの顕著な伸長を確認した(図5B)。
6-well plateでの培養終了後、顕微鏡観察をおこない、画像を記録した。その後、0.25% Trypsin-EDTA 溶液(Life Technologies)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、細胞数の有意な増加を確認すると共に(図5A)、デンドライトの顕著な伸長を確認した(図5B)。
（６）ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトのメラニン関連タンパク質の発現量に及ぼす影響
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-MITF (Santacruz, 1:200)、anti-Tyrosinase related protein (TRP) 1 (Santacruz, 1:1000)、anti-TRP2 (Santacruz, 1:200)、あるいはanti-Tyrosinase (Zymed, 1:1000)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)、あるいはanti-goat IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。上記タンパク質の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、PBSを添加したコントロールに対して、全てのタンパク質が有意に発現上昇していることを確認した(図6)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-MITF (Santacruz, 1:200)、anti-Tyrosinase related protein (TRP) 1 (Santacruz, 1:1000)、anti-TRP2 (Santacruz, 1:200)、あるいはanti-Tyrosinase (Zymed, 1:1000)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)、あるいはanti-goat IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。上記タンパク質の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、PBSを添加したコントロールに対して、全てのタンパク質が有意に発現上昇していることを確認した(図6)。
（７）ケラチノサイト由来エクソソームがメラノサイトのメラニン産生に及ぼす影響
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、メラニン産生が促進傾向にあることを確認した(図7)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、メラニン産生が促進傾向にあることを確認した(図7)。
以上のことより、ケラチノサイトが恒常的に分泌しているエクソソームがメラノサイトの細胞活性及びメラニン産生能を正に制御していることが示された。
実施例３：異なる人種由来のヒト皮膚組織におけるエクソソーム含有量とメラノソームタンパク量との関連性
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。人種の異なる7名の被験者由来の皮膚組織から外科的に脂肪及び真皮の除去を行った後でタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット解析により、メラノソーム特異的なタンパク質であるPmel17の発現を検出し、それらのバンド強度を画像解析により定量した(図8A)。一方、10mLのhomogenization buffer (20mM Sodium phosphate、 pH6.5、0.15M NaCl、10mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、1mM dithiothreitol (DTT)、Halt protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific))中でガラス製ホモジナイザーを用いて組織破砕を行った。続いて、300gで10分間、2,000gで20分間、遠心分離することにより、余分な組織(破片)を除去した。この破砕液の上清を回収してタンパク質量を定量した後、約6mg分のタンパク質を含む液に調製し、10,000gで30分間、100,000gで70分間の遠心処理を行った。上清を除去し、PBSにて一度洗浄してから、さらに100,000gで70分間遠心処理を行い、完全に上清を除去して沈殿物をPBSに懸濁することで、エクソソーム画分を単離した。そして、そのタンパク質定量を行うことで、表皮組織中のエクソソーム含有量を算出した(図8B)。双方の結果から、Pmel17の発現量と表皮組織中のエクソソーム含有量の間に統計学的に有意な正の相関が見出された(図8C)。
このことより、実際のヒト皮膚組織において、エクソソームの量に応じてメラニン合成が正に制御され、皮膚色に影響を与えている可能性が示された。
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。人種の異なる7名の被験者由来の皮膚組織から外科的に脂肪及び真皮の除去を行った後でタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット解析により、メラノソーム特異的なタンパク質であるPmel17の発現を検出し、それらのバンド強度を画像解析により定量した(図8A)。一方、10mLのhomogenization buffer (20mM Sodium phosphate、 pH6.5、0.15M NaCl、10mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、1mM dithiothreitol (DTT)、Halt protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific))中でガラス製ホモジナイザーを用いて組織破砕を行った。続いて、300gで10分間、2,000gで20分間、遠心分離することにより、余分な組織(破片)を除去した。この破砕液の上清を回収してタンパク質量を定量した後、約6mg分のタンパク質を含む液に調製し、10,000gで30分間、100,000gで70分間の遠心処理を行った。上清を除去し、PBSにて一度洗浄してから、さらに100,000gで70分間遠心処理を行い、完全に上清を除去して沈殿物をPBSに懸濁することで、エクソソーム画分を単離した。そして、そのタンパク質定量を行うことで、表皮組織中のエクソソーム含有量を算出した(図8B)。双方の結果から、Pmel17の発現量と表皮組織中のエクソソーム含有量の間に統計学的に有意な正の相関が見出された(図8C)。
このことより、実際のヒト皮膚組織において、エクソソームの量に応じてメラニン合成が正に制御され、皮膚色に影響を与えている可能性が示された。
実施例4：エクソソーム放出促進剤D609によるメラニン産生の促進
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
（２）エクソソーム放出促進剤D609がケラチノサイトのエクソソーム放出量に及ぼす影響
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出促進剤として報告（国際特許公開第2013/054534号）されているD609 (トリシクロデカン-9-イルキサントゲン酸カリウム；Tocris Bioscience社)を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分のタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、D609の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に増加することが確認された(図9)。
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出促進剤として報告（国際特許公開第2013/054534号）されているD609 (トリシクロデカン-9-イルキサントゲン酸カリウム；Tocris Bioscience社)を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分のタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、D609の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に増加することが確認された(図9)。
（３）エクソソーム放出促進剤D609がケラチノサイト及びメラノサイトからなる共培養系においてメラニン産生に及ぼす影響
ケラチノサイトを6-well plateに1×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105 cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、D609を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、有意にメラニン産生が促進していることが確認され、また、細胞の黒化は視覚的にも認められた(図10)。
ケラチノサイトを6-well plateに1×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105 cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、D609を終濃度で5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、有意にメラニン産生が促進していることが確認され、また、細胞の黒化は視覚的にも認められた(図10)。
（４）エクソソーム放出促進剤D609がメラノサイトの単独培養系においてメラニン産生に及ぼす影響
メラノサイトを2×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、D609を終濃度で1、5、10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含））を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、D609を5μM添加した際にはメラニン産生量の有意な増加は確認されなかった(図11)。
以上のことより、D609はケラチノサイトに作用して、エクソソームの放出を促し、放出されたエクソソームがメラノサイトを活性化させることによって、メラニン産生を促進したものと考えられる。
メラノサイトを2×105 cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、D609を終濃度で1、5、10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含））を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、D609を5μM添加した際にはメラニン産生量の有意な増加は確認されなかった(図11)。
以上のことより、D609はケラチノサイトに作用して、エクソソームの放出を促し、放出されたエクソソームがメラノサイトを活性化させることによって、メラニン産生を促進したものと考えられる。
実施例5：エクソソーム放出抑制剤GW4869によるメラニン産生の抑制
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5%CO2の環境下で培養した。
（２）エクソソーム放出抑制剤GW4869がケラチノサイトのエクソソーム放出量に及ぼす影響
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出抑制剤として報告（国際特許公開第2013/054534号）されているNeutral Sphingomyelinaseの阻害剤GW4869 (Ｎ，Ｎ’−ビス［４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニル］−３，３’−ｐ−フェニレン−ビス−アクリルアミド ２塩酸塩、Sigma Aldrich)を終濃度で20μM（溶媒はDMSO）になるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、GW4869の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に減少することが確認された(図12)。
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出抑制剤として報告（国際特許公開第2013/054534号）されているNeutral Sphingomyelinaseの阻害剤GW4869 (Ｎ，Ｎ’−ビス［４−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニル］−３，３’−ｐ−フェニレン−ビス−アクリルアミド ２塩酸塩、Sigma Aldrich)を終濃度で20μM（溶媒はDMSO）になるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、GW4869の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に減少することが確認された(図12)。
（３）エクソソーム放出抑制剤GW4869がケラチノサイト及びメラノサイトからなる共培養系においてメラニン産生に及ぼす影響
ケラチノサイトを6-well plateに1×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてhEGF以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti-Pmel17 (Dako, 1:250)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。Pmel17の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を20μM処理した際に、それが有意に発現低下していることを確認した(図13)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、GW4869処理によりメラニン量が減少したものと考えられる。
ケラチノサイトを6-well plateに1×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105cells/well (1mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてhEGF以外のHumedia-KG増殖添加剤（インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB）を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA（ビシンコニン酸）法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti-Pmel17 (Dako, 1:250)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。Pmel17の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を20μM処理した際に、それが有意に発現低下していることを確認した(図13)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、GW4869処理によりメラニン量が減少したものと考えられる。
（４）エクソソーム放出抑制剤GW4869がメラノサイトの単独培養系においてメラニン産生に及ぼす影響
メラノサイトを2×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含）を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を添加した際にメラニン産生量に対する影響は確認されなかった(図14)。
メラノサイトを2×105cells/well (2mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (増殖添加剤（HMGS）のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含）を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてマイクロチューブに細胞を回収した。各マイクロチューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を添加した際にメラニン産生量に対する影響は確認されなかった(図14)。
（５）エクソソーム放出抑制剤GW4869が表皮メラニン量に及ぼす影響
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1 cm×1 cmの大きさに小片化し、6-well plateを使用して37℃ 5Vol%CO2の環境下にて培養した。培養には、Fetal Bovine Serum (FBS)を10% (v/v)含むAdvanced DMEM培地 (いずれもLife Technologies)を使用した。ヒト皮膚組織を6-well plateに静置し、GW4869を終濃度で20μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から7日間経過後に皮膚組織を回収、定法に従って凍結組織切片を作成後にフォンタナマッソン染色を実施し(図15A)、その染色像に関して、Image Jソフトウェアを用いて二値化を行うことにより、画像解析を行った。表皮と真皮の境界における単位長あたりの表皮メラニン量を算出した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を処理した皮膚では、有意にメラニン量が低下していることが確認された(図15B)。
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1 cm×1 cmの大きさに小片化し、6-well plateを使用して37℃ 5Vol%CO2の環境下にて培養した。培養には、Fetal Bovine Serum (FBS)を10% (v/v)含むAdvanced DMEM培地 (いずれもLife Technologies)を使用した。ヒト皮膚組織を6-well plateに静置し、GW4869を終濃度で20μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から7日間経過後に皮膚組織を回収、定法に従って凍結組織切片を作成後にフォンタナマッソン染色を実施し(図15A)、その染色像に関して、Image Jソフトウェアを用いて二値化を行うことにより、画像解析を行った。表皮と真皮の境界における単位長あたりの表皮メラニン量を算出した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を処理した皮膚では、有意にメラニン量が低下していることが確認された(図15B)。
以上のことより、GW4869はケラチノサイトに作用して、エクソソームの放出を抑制し、エクソソームによるメラノサイトの活性化を抑制させることで、メラニン産生を抑制したものと考えられる。
実施例４及び５の結果から、ケラチノサイトのエクソソーム放出量を指標に、メラニン制御剤のスクリーニングを行うことが可能である。
Claims (4)
- 以下の工程ａ）〜ｃ）を含むメラニン制御剤の探索方法。
ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
ｂ）培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
ｃ）エクソソームの分泌レベルを変化させる被験物質をメラニン制御剤として選択する工程 - ｂ）工程における分泌レベルの測定が、エクソソーム画分のタンパク質量を測定し、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出する、請求項１記載の方法。
- エクソソームの分泌レベルを増強又は増加させる被験物質を、メラニン産生促進剤、デンドライト伸長促進剤、皮膚褐色化剤、白斑予防若しくは治療剤、又は白髪予防若しくは改善剤として評価又は選択する請求項１又は２記載の方法。
- エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を、メラニン産生抑制剤、デンドライト伸長抑制剤、又は美白剤としてとして評価又は選択する請求項１又は２記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014237995 | 2014-11-25 | ||
| JP2014237995 | 2014-11-25 | ||
| US201562235714P | 2015-10-01 | 2015-10-01 | |
| US62/235,714 | 2015-10-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016103997A true JP2016103997A (ja) | 2016-06-09 |
| JP6650240B2 JP6650240B2 (ja) | 2020-02-19 |
Family
ID=56101891
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015201569A Active JP6650240B2 (ja) | 2014-11-25 | 2015-10-09 | メラニン制御剤の探索方法 |
| JP2015229880A Active JP6688051B2 (ja) | 2014-11-25 | 2015-11-25 | メラニン産生抑制剤 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015229880A Active JP6688051B2 (ja) | 2014-11-25 | 2015-11-25 | メラニン産生抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP6650240B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170003000A (ko) * | 2015-06-30 | 2017-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
| WO2018214694A1 (zh) * | 2017-05-23 | 2018-11-29 | 北京希诺赛尔健康科技推广有限公司 | 外泌体在皮肤美白制剂中的应用 |
| WO2019146612A1 (ja) * | 2018-01-23 | 2019-08-01 | ノバセラ株式会社 | 皮膚疾患治療用組成物 |
| CN111110699A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-05-08 | 北京岳昊科技发展有限公司 | 多肽偶联物与表皮干细胞外泌体的组合在药品和化妆品中的应用 |
| JP2022097507A (ja) * | 2016-07-08 | 2022-06-30 | 花王株式会社 | 核酸試料の調製方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013054534A1 (ja) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | 国立大学法人北海道大学 | アミロイドβ関連の疾患用医薬及びそのスクリーニング |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192326A (ja) * | 1997-09-22 | 1999-04-06 | Shiseido Co Ltd | 皮膚外用剤 |
| JP4452203B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2010-04-21 | 株式会社ナリス化粧品 | 美白化粧料 |
| JP2010189368A (ja) * | 2009-02-18 | 2010-09-02 | Hiroyuki Iwasaki | 液状皮膚外用剤 |
-
2015
- 2015-10-09 JP JP2015201569A patent/JP6650240B2/ja active Active
- 2015-11-25 JP JP2015229880A patent/JP6688051B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013054534A1 (ja) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | 国立大学法人北海道大学 | アミロイドβ関連の疾患用医薬及びそのスクリーニング |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HIROBE T: "How are proliferation and differentiation of melanocytes regulated?", PIGMENT CELL MELANOMA RES., vol. 24(3), JPN6019028471, 2011, pages 462 - 78, ISSN: 0004100421 * |
| HIROBE T: "Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of", PIGMENT CELL RES., vol. 2005 Feb;18(1), JPN6019028469, 2005, pages 2 - 12, ISSN: 0004100419 * |
| JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 134, no. 4, JPN6019032218, April 2014 (2014-04-01), pages 1075 - 1082, ISSN: 0004100417 * |
| MIROSLAWA CICHOREK, MAGORZATA WACHULSKA, ANETA STASIEWICZ, AND AGATA TYMINSKA: "Skin melanocytes: biology and development", POSTEPY DERMATOL ALERGOL., vol. 30(1), JPN6019028470, 2013, pages 30 - 41, ISSN: 0004100420 * |
| NATURE COMMUNICATIONS, vol. Vol.6, 7506, JPN6019032219, 24 June 2015 (2015-06-24), ISSN: 0004100418 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170003000A (ko) * | 2015-06-30 | 2017-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
| KR102394636B1 (ko) | 2015-06-30 | 2022-05-09 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법 |
| JP2022097507A (ja) * | 2016-07-08 | 2022-06-30 | 花王株式会社 | 核酸試料の調製方法 |
| JP7323671B2 (ja) | 2016-07-08 | 2023-08-08 | 花王株式会社 | 核酸試料の調製方法 |
| US11913061B2 (en) | 2016-07-08 | 2024-02-27 | Kao Corporation | Method for preparing nucleic acid sample |
| WO2018214694A1 (zh) * | 2017-05-23 | 2018-11-29 | 北京希诺赛尔健康科技推广有限公司 | 外泌体在皮肤美白制剂中的应用 |
| WO2019146612A1 (ja) * | 2018-01-23 | 2019-08-01 | ノバセラ株式会社 | 皮膚疾患治療用組成物 |
| CN111110699A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-05-08 | 北京岳昊科技发展有限公司 | 多肽偶联物与表皮干细胞外泌体的组合在药品和化妆品中的应用 |
| CN111110699B (zh) * | 2020-04-01 | 2020-07-17 | 广州市新纪元化妆品有限公司 | 多肽偶联物与表皮干细胞外泌体的组合在药品和化妆品中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6688051B2 (ja) | 2020-04-28 |
| JP2016104735A (ja) | 2016-06-09 |
| JP6650240B2 (ja) | 2020-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6650240B2 (ja) | メラニン制御剤の探索方法 | |
| Terlecki-Zaniewicz et al. | Extracellular vesicles in human skin: cross-talk from senescent fibroblasts to keratinocytes by miRNAs | |
| KR101318521B1 (ko) | 피부 노화 마커와 그의 이용기술 | |
| Dame et al. | Human colonic crypts in culture: segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived | |
| Yamada et al. | Melanocyte stem cells express receptors for canonical Wnt-signaling pathway on their surface | |
| Leir et al. | Characterization of primary cultures of adult human epididymis epithelial cells | |
| Devos et al. | Elevated ΔNp63α levels facilitate epidermal and biliary oncogenic transformation | |
| Rani et al. | Melanocyte abnormalities and senescence in the pathogenesis of idiopathic guttate hypomelanosis | |
| EP2904095A1 (en) | Sebocyte cell culturing and methods of use | |
| WO2017136892A1 (en) | Method of diagnosis | |
| JP6462437B2 (ja) | 皮膚の乾燥状態の評価方法 | |
| KR102212623B1 (ko) | 캐드헤린11 또는 n-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법 | |
| CA2360762C (en) | Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof | |
| JP6663690B2 (ja) | メラニン産生促進剤 | |
| Shi et al. | Biological characteristics of mouse skin melanocytes | |
| JP2014112073A (ja) | 幹細胞を標的とした薬効及び毒性の評価法 | |
| US20110112019A1 (en) | Method for promoting hair growth or hair regeneration by maintaining or increasing expression of cell-adhesion factor | |
| CN116251126A (zh) | 牙周膜干细胞来源的外泌体在缓解细胞衰老和牙周炎治疗中的应用 | |
| Sasahara et al. | Human keratinocytes derived from the bulge region of hair follicles are refractory to differentiation | |
| Sobiepanek et al. | Soszy nska | |
| KR102109976B1 (ko) | 아르기나제 2 억제제를 유효성분으로 함유하는 색소형성 억제용 조성물 | |
| KR20190006253A (ko) | Rab5A 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소형성 억제용 조성물 | |
| Wang et al. | ASH2L Mediates Epidermal Differentiation and Hair Follicle Morphogenesis through H3K4me3 Modification | |
| Fan et al. | Melanocytes derived from mouse hair follicles: A novel study model to assess pigmentation disorders | |
| JP2022184021A (ja) | 皮膚モデルおよびその製造方法、ならびに皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180918 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190827 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191024 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200114 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200120 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6650240 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |