WO2015155799A1 - 表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法 - Google Patents

表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法 Download PDF

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幸登 中村
高敏 彼谷
剛典 永江
昭俊 野▲崎▼
史生 長井
亮太 石川
晃志 生田目
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コニカミノルタ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and a surface plasmon enhanced fluorescence measuring method for detecting the presence or amount of a substance to be detected contained in a specimen using surface plasmon resonance.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPR surface plasmon resonance
  • a capture body for example, a primary antibody
  • a capture body that can specifically bind to the substance to be detected is immobilized on the metal film to form a reaction field for specifically capturing the substance to be detected.
  • the target substance bound to the reaction field is labeled with the fluorescent substance.
  • the fluorescent substance that labels the substance to be detected is excited by the electric field enhanced by SPR and emits fluorescence. Therefore, the presence or amount of the substance to be detected can be detected by detecting fluorescence.
  • SPFS a fluorescent substance is excited by an electric field enhanced by SPR, so that a substance to be detected can be detected with high sensitivity.
  • PC-SPFS is roughly classified into prism coupling (PC) -SPFS and lattice coupling (GC) -SPFS by means of coupling (coupling) excitation light and surface plasmons.
  • PC-SPFS utilizes a prism having a metal film formed on one surface. In this method, the excitation light is totally reflected at the interface between the prism and the metal film, thereby coupling the excitation light and the surface plasmon.
  • PC-SPFS is the mainstream method at present, but because of the use of prisms and the large incident angle of excitation light on the metal film, PC-SPFS is problematic in terms of miniaturization of the measuring device. have.
  • GC-SPFS couples excitation light and surface plasmon using a diffraction grating (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Since the GC-SPFS does not use a prism and the incident angle of the excitation light with respect to the diffraction grating is small, the measuring apparatus can be made smaller than the PC-SPFS.
  • GC-SPFS has the advantage that the measuring device can be made smaller than PC-SPFS, but research on GC-SPFS has not progressed compared to research on PC-SPFS. Therefore, there is room for improvement in detection sensitivity in the measurement apparatus and measurement method using GC-SPFS.
  • An object of the present invention is to provide a measuring apparatus and a measuring method using GC-SPFS, which can detect a substance to be detected with higher sensitivity.
  • a surface plasmon enhanced fluorescence measurement device includes a metal film on which a diffraction grating is formed, a capturing body fixed to the diffraction grating, and a capturing body.
  • a surface plasmon-enhanced fluorescence measuring apparatus that detects the presence or amount of a substance to be detected by attaching a chip having a substance to be detected that is bound with a fluorescent substance and irradiating the diffraction grating with excitation light.
  • a light source that irradiates the diffraction grating with the excitation light, and linearly polarized light is extracted from the fluorescence emitted from the fluorescent material.
  • a polarizer, and a light detection unit that detects the light of the linearly polarized light extracted by the polarizer.
  • the surface plasmon enhanced fluorescence measurement method uses a fluorescent material that labels a target substance to emit fluorescence that is excited by an electric field based on surface plasmon resonance.
  • a surface plasmon enhanced fluorescence measurement method for detecting the presence or amount of a substance to be detected by detecting a metal film having a diffraction grating formed thereon, a capture body immobilized on the diffraction grating, and the capture body And a second step of irradiating the diffraction grating with excitation light so that surface plasmon resonance occurs in the diffraction grating.
  • a substance to be detected can be detected with higher sensitivity in a measuring apparatus and a measuring method using GC-SPFS.
  • a substance to be detected can be detected in real time.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus (hereinafter referred to as “SPFS apparatus”) according to Embodiments 1 and 2.
  • SPFS apparatus surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus
  • FIG. 3A is a diagram schematically illustrating a first aspect of the chip according to the first and second embodiments
  • FIG. 3B schematically illustrates a second aspect of the chip according to the first and second embodiments.
  • FIG. FIG. 4 is a flowchart showing the operation of the SPFS apparatus according to the first embodiment.
  • 5A and 5B are schematic views showing a procedure for measuring the fluorescence intensity.
  • FIG. 6 is a graph for explaining the difference value (signal value).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus (hereinafter referred to as “SPFS apparatus”) according to Embodiments 1 and 2.
  • FIG. 3A is a diagram schematically illustrating a first aspect of the
  • FIG. 7 is a flowchart showing the operation of the SPFS apparatus according to the second embodiment.
  • 8A and 8B are graphs showing examples of results when the fluorescence intensity is measured in real time.
  • FIG. 9 is a schematic diagram illustrating a configuration of another example of the SPFS apparatus according to the first and second embodiments.
  • 10A and 10B are schematic diagrams showing the procedure of the reference experiment.
  • FIG. 11 is a graph showing the measurement results of the reference experiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus (SPFS apparatus) 100 according to Embodiment 1 of the present invention.
  • SPFS apparatus surface plasmon enhanced fluorescence measurement apparatus
  • the SPFS apparatus 100 includes an excitation light irradiation unit 110, a fluorescence detection unit 120, and a control unit 130.
  • the SPFS device 100 is used in a state where the chip 200 is mounted on a chip holder (not shown). Therefore, the chip 200 will be described first, and then the SPFS device 100 will be described.
  • the chip 200 includes a substrate 210 and a metal film 220 formed on the substrate 210.
  • a diffraction grating 230 is formed on the metal film 220.
  • a capture body (for example, a primary antibody) is immobilized on the diffraction grating 230, and the surface of the diffraction grating 230 also functions as a reaction field for binding the capture body and the substance to be detected. In FIG. 1, the capturing body and the substance to be detected are omitted.
  • the substrate 210 is a support member for the metal film 220.
  • the material of the substrate 210 is not particularly limited as long as it has mechanical strength capable of supporting the metal film 220.
  • Examples of the material of the substrate 210 include inorganic materials such as glass, quartz, and silicon, and resins such as polymethyl methacrylate, polycarbonate, polystyrene, and polyolefin.
  • the metal film 220 is disposed on the substrate 210. As described above, the diffraction grating 230 is formed on the metal film 220. When the metal film 220 is irradiated with light, surface plasmons generated in the metal film 220 and evanescent waves generated by the diffraction grating 230 are combined to generate surface plasmon resonance.
  • the material of the metal film 220 is not particularly limited as long as it is a metal that generates surface plasmons. Examples of the material of the metal film 220 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • a method for forming the metal film 220 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 220 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 220 is not particularly limited. The thickness of the metal film 220 is, for example, 30 to 500 nm, and preferably 100 to 300 nm.
  • the diffraction grating 230 generates an evanescent wave when the metal film 220 is irradiated with light.
  • the shape of the diffraction grating 230 is not particularly limited as long as an evanescent wave can be generated.
  • the diffraction grating 230 may be a one-dimensional diffraction grating as shown in FIG. 2A or a two-dimensional diffraction grating as shown in FIG. 2B.
  • a plurality of ridges parallel to each other are formed on the surface of the metal film 220 at a predetermined interval.
  • convex portions having a predetermined shape are periodically arranged on the surface of the metal film 220.
  • Examples of the arrangement of the convex portions include a square lattice, a triangular (hexagonal) lattice, and the like.
  • Examples of the cross-sectional shape of the diffraction grating 230 include a rectangular wave shape, a sine wave shape, a sawtooth shape, and the like.
  • the optical axis of the excitation light ⁇ described later is parallel to the xz plane.
  • the formation method of the diffraction grating 230 is not particularly limited.
  • the metal film 220 may be provided with an uneven shape.
  • the metal film 220 may be formed over the substrate 210 that has been previously provided with an uneven shape.
  • the metal film 220 including the diffraction grating 230 can be formed.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected is immobilized.
  • the capturing body specifically binds to the substance to be detected.
  • the capturing body is fixed substantially uniformly on the surface of the diffraction grating 230.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody (primary antibody) or a fragment thereof specific to the substance to be detected, an enzyme that can specifically bind to the substance to be detected, or the like.
  • the method for immobilizing the capturing body is not particularly limited.
  • a self-assembled monomolecular film hereinafter referred to as “SAM”
  • a polymer film to which a capturing body is bonded may be formed on the diffraction grating 230.
  • SAMs include films formed with substituted aliphatic thiols such as HOOC— (CH 2 ) 11 —SH.
  • the material constituting the polymer film include polyethylene glycol and MPC polymer.
  • a polymer having a reactive group that can be bound to the capturing body may be fixed to the diffraction grating 230, and the capturing body may be bound to the polymer.
  • the excitation light ⁇ is applied to the metal film 220 (diffraction grating 230) at a predetermined incident angle ⁇ 1 .
  • the surface plasmon generated in the metal film 220 and the evanescent wave generated by the diffraction grating 230 are combined to generate SPR.
  • the fluorescent substance is excited by the enhanced electric field formed by SPR, and fluorescent ⁇ is emitted.
  • fluorescence ⁇ is emitted with directivity in a specific direction. For example, the emission angle ⁇ 2 of the fluorescence ⁇ is approximated by 2 ⁇ 1 . Note that almost no reflected light ⁇ of the excitation light ⁇ is generated.
  • the diffraction grating 230 comes into contact with a liquid such as a buffer solution for operations such as reaction and washing. Therefore, normally, the diffraction grating 230 is arrange
  • the diffraction grating 230 may be disposed on the inner surface (e.g., the bottom surface) of a well containing liquid as shown in FIG. 3A or continuously supplied with liquid as shown in FIG. 3B. It may be disposed on the inner surface (for example, the bottom surface) of the flow path (flow cell).
  • the chip 200 shown in FIG. 3B includes, for example, in addition to a general measurement of a target substance (non-real time measurement), another molecule (a target to be detected) with respect to a molecule (captured body) immobilized on the surface of the metal film 220. It is also suitable for analysis of reaction constants of substances) (real-time measurement; see Embodiment Mode 2).
  • the excitation light irradiation unit 110 irradiates the metal film 220 (diffraction grating 230) of the chip 200 with excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount. At this time, the excitation light irradiation unit 110 emits p-polarized light with respect to the surface of the metal film 220 so that diffracted light that can be combined with the surface plasmons in the metal film 220 is generated in the metal film 220 (diffraction grating 230). Irradiate.
  • the optical axis of the excitation light ⁇ is along the arrangement direction of the periodic structure in the diffraction grating 230 (the x-axis direction in FIGS. 2A and 2B).
  • the optical axis of the excitation light ⁇ is xz. It is parallel to the plane (see FIG. 1). Since the excitation light ⁇ is p-polarized light with respect to the surface of the metal film 220, the vibration direction of the electric field of the excitation light ⁇ is in the xz plane including the optical axis of the excitation light ⁇ and the normal to the surface of the metal film 220. Parallel.
  • the excitation light irradiation unit 110 has at least a light source 112.
  • the excitation light irradiation unit 110 may further include a collimating lens, an excitation light filter, and the like.
  • the light source 112 emits excitation light ⁇ toward the diffraction grating 230 of the chip 200.
  • the light source 112 is a laser diode.
  • the type of the light source 112 is not particularly limited, and may not be a laser diode. Examples of the light source 112 include a light emitting diode, a mercury lamp, and other laser light sources.
  • a collimating lens (not shown) is disposed between the light source 112 and the chip 200 and collimates the excitation light ⁇ emitted from the light source 112.
  • the excitation light ⁇ emitted from the laser diode (light source 112) has a flat outline shape even when collimated. Therefore, the laser diode is held in a predetermined posture so that the shape of the irradiation spot on the surface of the metal film 220 is substantially circular.
  • the size of the irradiation spot is preferably about 1 mm ⁇ , for example.
  • the excitation light filter (not shown) is arranged between the light source 112 and the chip 200 and tunes the excitation light ⁇ emitted from the light source 112.
  • Excitation light filters include, for example, bandpass filters and linear polarizing filters. Since the excitation light ⁇ from the laser diode (light source 112) has a slight wavelength distribution width, the bandpass filter turns the excitation light ⁇ from the laser diode into narrowband light having only the center wavelength. In addition, since the excitation light ⁇ from the laser diode (light source 112) is not completely linearly polarized light, the linear polarization filter converts the excitation light ⁇ from the laser diode into completely linearly polarized light.
  • the excitation light filter may include a half-wave plate that adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that p-polarized light is incident on the metal film 220.
  • the incident angle ⁇ 1 (see FIG. 1) of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 220 is such that the intensity of the enhanced electric field formed by the SPR is the strongest, and as a result, the angle at which the intensity of the fluorescent ⁇ from the fluorescent material is the strongest.
  • the incident angle ⁇ 1 of the excitation light ⁇ is appropriately selected according to the pitch of the diffraction grating 230, the wavelength of the excitation light ⁇ , the type of metal constituting the metal film 220, and the like.
  • the pitch of the diffraction grating is preferably about 400 nm, for example.
  • the SPFS apparatus 100 adjusts the incident angle ⁇ 1 by relatively rotating the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip 200. It is preferable to have a first angle adjustment unit (not shown).
  • the first angle adjustment unit may rotate the excitation light irradiation unit 110 or the chip 200 around the intersection between the optical axis of the excitation light ⁇ and the metal film 220.
  • the fluorescence detection unit 120 is arranged with respect to the excitation light irradiation unit 110 so as to sandwich a straight line passing through the intersection of the optical axis of the excitation light ⁇ and the metal film 220 and perpendicular to the surface of the metal film 220. Yes.
  • the fluorescence detection unit 120 detects fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material on the diffraction grating 230 (reaction field).
  • the fluorescence detection unit 120 includes at least a polarizer 122 and a light detection unit 124.
  • the fluorescence detection unit 120 may further include a condenser lens group, an aperture stop, a fluorescence filter, and the like.
  • the polarizer 122 is disposed between the chip 200 and the light detection unit 124 and extracts linearly polarized light from the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material.
  • the polarizer 122 is a polarizing plate.
  • the polarizer 122 is held so as to be able to rotate in a plane perpendicular to the traveling direction of the fluorescence ⁇ from the metal film 220 toward the light detection unit 124.
  • the polarizer 122 is the first in the range where the angle of the oscillation direction of the electric field from the fluorescence ⁇ to the plane (xz plane) including the normal to the surface of the metal film 220 and the optical axis of the excitation light ⁇ is 0 ⁇ 30 °. And second light within the range of 90 ⁇ 30 ° in the direction of vibration of the electric field with respect to the plane (xz plane) are taken out simultaneously or at different times.
  • the polarizer 122 extracts, from the fluorescence ⁇ , p-polarized light whose angle of vibration direction of the electric field with respect to the plane (xz plane) is 0 ° as the first light, and the electric field of the electric field with respect to the plane (xz plane).
  • the s-polarized light having an oscillation direction angle of 90 ° is taken out as the second light simultaneously or at different times.
  • the first light for example, p-polarized light
  • the second light for example, s-polarized light
  • the first light is light including a signal component to be detected and a noise component
  • the second light is light mainly composed of a noise component.
  • the type of the polarizer 122 is not particularly limited as long as linearly polarized light having a predetermined polarization direction can be extracted, and may not be a polarizing plate.
  • Examples of the polarizer 122 include a polarizing prism, a liquid crystal filter, and other polarizing filters.
  • the light detection unit 124 detects the linearly polarized light extracted by the polarizer 122 and detects a fluorescent image on the metal film 220.
  • the light detection unit 124 detects the first light and the second light, respectively.
  • the light detection unit 124 is a photomultiplier tube having high sensitivity and a high SN ratio.
  • the light detection unit 124 may be an avalanche photodiode (APD), a photodiode (PD), a CCD image sensor, or the like.
  • the condensing lens group (not shown) is disposed between the chip 200 and the light detection unit 124 and constitutes a conjugate optical system that is not easily affected by stray light.
  • the condenser lens group forms a fluorescent image on the metal film 220 on the light receiving surface of the light detection unit 124.
  • Fluorescent filter (not shown) is disposed between the chip 200 and the light detection unit 124.
  • the fluorescence filter includes, for example, a cut filter and a neutral density (ND) filter, and removes noise components other than the fluorescence ⁇ (for example, excitation light ⁇ and external light) from the light reaching the light detection unit 124, The amount of light reaching the detection unit 124 is adjusted.
  • ND neutral density
  • the fluorescence ⁇ is emitted from the diffraction grating 230 (reaction field) with directivity in a specific direction. Therefore, the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 120 with respect to the normal of the surface of the metal film 220 is preferably an angle (fluorescence peak angle) at which the intensity of the fluorescence ⁇ is maximized. Therefore, the SPFS device 100 has a second angle adjustment unit (not shown) that adjusts the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 120 by relatively rotating the optical axis of the fluorescence detection unit 120 and the chip 200. Is preferred. For example, the second angle adjustment unit may rotate the fluorescence detection unit 120 or the chip 200 around the intersection between the optical axis of the fluorescence detection unit 120 and the metal film 220.
  • the control unit 130 includes an excitation light irradiation unit 110 (light source 112), a fluorescence detection unit 120 (polarizer 122 and a light detection unit 124), an angle adjustment unit (first angle adjustment unit) of the excitation light irradiation unit 110 and the fluorescence detection unit 120. And the operation of the second angle adjusting unit).
  • the control unit 130 also functions as a processing unit that processes an output signal (detection result) from the light detection unit 124.
  • the control unit 130 is, for example, a computer that executes software.
  • FIG. 4 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 100.
  • a primary antibody is immobilized on the metal film 220 as a capturing body.
  • a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is used as a capturing body used for fluorescent labeling.
  • step S10 preparation for measurement is performed (step S10). Specifically, the chip 200 is prepared, and the chip 200 is installed at a predetermined position of the SPFS device 100. Further, when a humectant is present on the metal film 220 of the chip 200, the humectant is removed by washing the metal film 220 so that the primary antibody can appropriately capture the substance to be detected.
  • the detection target substance in the specimen is reacted with the primary antibody (primary reaction, step S20).
  • a specimen is provided on the metal film 220, and the specimen and the primary antibody are brought into contact with each other.
  • the metal film 220 is washed with a buffer solution or the like to remove substances that have not bound to the primary antibody.
  • the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof.
  • substances to be detected include nucleic acids (such as DNA and RNA), proteins (such as polypeptides and oligopeptides), amino acids, carbohydrates, lipids, and modified molecules thereof.
  • the detection target substance bound to the primary antibody is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S30).
  • a fluorescent labeling solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is provided on the metal film 220, and the detection target substance bound to the primary antibody is brought into contact with the fluorescent labeling liquid.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance.
  • the SPFS device 100 can detect the detection target substance without removing the free secondary antibody.
  • the order of the primary reaction and the secondary reaction is not limited to this.
  • a liquid containing these complexes may be provided on the metal film 220 after the substance to be detected is bound to the secondary antibody.
  • the specimen and the fluorescent labeling solution may be provided on the metal film 220 at the same time.
  • the excitation light ⁇ is irradiated onto the metal film 220, and the intensity of the first light (for example, p-polarized light) contained in the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material is measured (step S40).
  • the control unit 130 causes the light source 112 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control unit 130 causes the light detection unit 124 to detect the intensity of the fluorescence ⁇ from the metal film 220.
  • the control unit 130 adjusts the rotation angle of the polarizer 122 so that only the first light (p-polarized light in the drawing) included in the fluorescence ⁇ can be transmitted.
  • the light detection unit 124 outputs the measurement result (output Op) to the control unit (processing unit) 130.
  • the fluorescence ⁇ (signal component) emitted from the fluorescent substance that labels the detection target substance has p-polarized light or a polarization angle with respect to the surface of the metal film 220.
  • the light is close to the p-polarized light. Therefore, the signal component passes through the polarizer 122 and reaches the light detection unit 124.
  • the fluorescence ⁇ (noise component) emitted from the fluorescent material floating on the metal film 220 is randomly polarized light. Therefore, part of the noise component (light having the same polarization angle as the signal component) also passes through the polarizer 122 and reaches the light detection unit 124.
  • the measurement result (output Op) of this step includes a signal component and a noise component.
  • the excitation light ⁇ is irradiated onto the metal film 220, and the intensity of the second light (for example, s-polarized light) contained in the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material is measured (step S50).
  • the control unit 130 causes the light source 112 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control unit 130 causes the light detection unit 124 to detect the intensity of the fluorescence ⁇ from the metal film 220.
  • the control unit 130 adjusts the rotation angle of the polarizer 122 so that only the second light (s-polarized light in the drawing) included in the fluorescence ⁇ can be transmitted.
  • the light detection unit 124 outputs the measurement result (output Os) to the control unit (processing unit) 130.
  • the fluorescence ⁇ (noise component) emitted from the fluorescent substance floating on the metal film 220 is randomly polarized light. Accordingly, part of the noise component passes through the polarizer 122 and reaches the light detection unit 124 also in this step. As a result, the measurement result (output Os) of this step mainly consists of noise components.
  • the order of the first light measurement (step S40) and the second light measurement (step S50) is not limited to this.
  • the intensity of the first light may be measured.
  • control unit (processing unit) 130 analyzes the output signals (outputs Op and Os) from the light detection unit 124, and analyzes the presence of the detected substance or the amount of the detected substance (step S60). Specifically, as illustrated in FIG. 6, the control unit (processing unit) 130 calculates a difference value between the output Op and the output Os to obtain a signal value.
  • the output Op is mainly composed of a signal component and a noise component
  • the output Os is mainly composed of a noise component. Therefore, a signal value from which the noise component has been removed can be obtained by calculating a difference value between them. it can.
  • the presence of the substance to be detected or the amount of the substance to be detected in the sample can be detected.
  • the SPFS device 100 can detect only the signal component by utilizing the difference in polarization characteristics of the signal component and the noise component, and thus has higher sensitivity than the conventional SPFS device. It is possible to detect the substance to be detected.
  • the SPFS device 100 can remove the noise component contained in the fluorescence ⁇ , it is not necessary to remove the free secondary antibody after the secondary reaction (step S30). Detection of a detection substance can be performed.
  • the chip 200 is irradiated with the excitation light ⁇ from the metal film 220 side
  • the chip 200 may be irradiated with the excitation light ⁇ from the substrate 210 side.
  • the SPFS device 100 ′ according to the second embodiment has the same configuration as the SPFS device 100 according to the first embodiment, and differs from the SPFS device 100 according to the first embodiment in that real-time measurement is performed. Therefore, the description of the configuration of the SPFS apparatus is omitted, and only the operation procedure is described.
  • the SPFS device 100 ′ continuously irradiates the diffraction grating 230 with the excitation light ⁇ , continuously extracts linearly polarized light from the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material, and the linearly polarized light. Detect light continuously.
  • continuous includes not only continuous operation but also intermittent operation. Therefore, “continuously irradiating the excitation light” means irradiating the excitation light ⁇ at an appropriate time and frequency capable of detecting a change with time of the substance to be detected.
  • Continuous extracting linearly-polarized light means that linearly-polarized light is continuously extracted from the fluorescence ⁇ at an appropriate time and frequency at which a change in the substance to be detected over time can be detected.
  • Continuous detecting linearly polarized light means detecting linearly polarized light from the fluorescence ⁇ at an appropriate time and frequency at which a change in the substance to be detected over time can be detected.
  • the continuous irradiation with the excitation light ⁇ may be continuous irradiation with the excitation light ⁇ , or may be intermittent irradiation with the excitation light ⁇ .
  • the continuous irradiation of the excitation light ⁇ is an intermittent irradiation of the excitation light ⁇ .
  • the irradiation interval of the excitation light ⁇ may be constant or indefinite (arbitrary). Further, the irradiation interval of the excitation light ⁇ may be automatically determined based on a certain condition such as automatic calculation by a program, may be determined empirically by a preliminary experiment, etc. It may be arbitrarily determined by.
  • the irradiation interval of the excitation light may be determined according to the detection result of the fluorescence intensity. For example, when the fluorescence intensity detection value is small, the excitation light irradiation interval may be shortened, and when the fluorescence intensity detection value is large, the excitation light irradiation interval may be lengthened. In addition, when the change in the fluorescence intensity detection value with time is large, the excitation light irradiation interval is shortened, and when the change in the fluorescence intensity detection value with time is small, the excitation light irradiation interval. May be longer.
  • Such adjustment of the excitation light irradiation interval can be performed, for example, by appropriately setting a threshold value related to the fluorescence intensity detection value and performing feedback control based on the fluorescence intensity detection value.
  • Such adjustment of the excitation light irradiation interval is preferable from the viewpoint of more precisely observing a change with time of the substance to be detected.
  • FIG. 7 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 100 ′ according to the second embodiment.
  • a primary antibody is immobilized on the metal film 220 as a capturing body.
  • a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is used as a capturing body used for fluorescent labeling.
  • step S110 preparation for measurement is performed (step S110). Specifically, the chip 200 is prepared, and the chip 200 is installed at a predetermined position of the SPFS device 100 ′. Similar to the first embodiment, the metal film 220 is cleaned as necessary.
  • the detection target substance in the specimen is reacted with the primary antibody (primary reaction, step S120). Specifically, a specimen is provided on the metal film 220, and the specimen and the primary antibody are brought into contact with each other. When a substance to be detected exists in the sample, at least a part of the substance to be detected binds to the primary antibody. Thereafter, the metal film 220 is washed with a buffer solution or the like to remove substances that have not bound to the primary antibody.
  • the target substance bound to the primary antibody is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S130).
  • a fluorescent labeling solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is provided on the metal film 220, and the detection target substance bound to the primary antibody is brought into contact with the fluorescent labeling liquid.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing a secondary antibody labeled with a fluorescent substance.
  • the SPFS device 100 ′ can measure the substance to be detected without removing the free secondary antibody.
  • the order of the primary reaction and the secondary reaction is not limited to this.
  • a liquid containing these complexes may be provided on the metal film 220 after the substance to be detected is bound to the secondary antibody.
  • the specimen and the fluorescent labeling solution may be provided on the metal film 220 at the same time.
  • the intensity of the first light (for example, p-polarized light) included in the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material is measured while irradiating the excitation light ⁇ on the metal film 220 (step S140), While irradiating the metal film 220, the intensity of the second light (for example, s-polarized light) contained in the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material is measured (step S150), and the intensity of the first light is measured. And the measurement of the intensity of the second light are repeated a predetermined number of times (step S160). Thereby, the measurement of the intensity of the first light and the measurement of the intensity of the second light are alternately repeated a plurality of times, and the measurement value of the first light intensity and the measurement value of the second light intensity are Each is obtained continuously (intermittently).
  • the intensity of the first light for example, p-polarized light
  • the intensity of the second light for example, s-polarized light
  • step S140 the control unit 130 causes the light source 112 to emit the excitation light ⁇ continuously or intermittently (that is, “continuously”) at a predetermined interval.
  • the “predetermined interval” is, for example, an interval for changing (adjusting) the rotation angle of the polarizer 122 described later.
  • the control unit 130 causes the light detection unit 124 to continuously detect the intensity of the fluorescence ⁇ from the metal film 220.
  • the timing of continuous detection of the intensity of the fluorescence ⁇ may be synchronized with the timing of irradiation of the excitation light ⁇ with time, or may be different. At this time, as shown in FIG.
  • control unit 130 adjusts the rotation angle of the polarizer 122 so that only the first light (p-polarized light in the drawing) included in the fluorescence ⁇ can be transmitted.
  • the light detection unit 124 outputs the measurement result (output Op) to the control unit (processing unit) 130.
  • the fluorescence ⁇ (signal component) emitted from the fluorescent substance that labels the detection target substance passes through the polarizer 122 and reaches the light detection unit 124.
  • part of the fluorescence ⁇ (noise component) emitted from the fluorescent substance floating on the metal film 220 also passes through the polarizer 122 and is detected by the light detection unit 124.
  • the measurement result (output Op) of this step includes a signal component and a noise component.
  • step S150 the control unit 130 causes the light source 112 to continue to emit the excitation light ⁇ .
  • the control unit 130 causes the light detection unit 124 to continuously detect the intensity of the fluorescence ⁇ from the metal film 220.
  • the control unit 130 adjusts the rotation angle of the polarizer 122 so that only the second light (s-polarized light in the drawing) included in the fluorescence ⁇ can be transmitted.
  • the light detection unit 124 outputs the measurement result (output Os) to the control unit (processing unit) 130.
  • step S50 of the first embodiment a part of the fluorescence ⁇ (noise component) emitted from the fluorescent material floating on the metal film 220 is transmitted through the polarizer 122 also in this step. It reaches the light detection unit 124.
  • the measurement result (output Os) of this step mainly consists of noise components.
  • the order of the first light measurement (step S140) and the second light measurement (step S150) is not limited to this.
  • the intensity of the first light may be measured.
  • step S160 for example, the control unit 130 counts the number of times the second light is measured (s-polarized light measurement number Cs). If Cs has not reached a set value (for example, N times), the rotation of the polarizer 122 is performed. The angle is adjusted again to the angle for detecting the first light, and the process returns to step S140 to measure the intensity of the first light.
  • Cs s-polarized light measurement number
  • control unit 130 analyzes the output signals (outputs Op and Os) from the light detection unit 124 to determine the presence of the detected substance or the amount of the detected substance. Analyze (step S170).
  • the control unit (processing unit) 130 determines the intensity of the first light measured in step S140 and the intensity of the second light measured in step S150 immediately after that. For each set, a difference value between the output Op and the output Os is calculated to obtain a signal value. Therefore, when the intensity of the first light and the intensity of the second light are continuously measured, a signal value is calculated for each set of the detected value of the first light intensity and the detected value of the second light intensity. Is done. That is, a signal value that changes with time is calculated. Also, by performing steps S140 to S160 and step S170 in parallel, it is possible to calculate a signal value that changes over time in real time.
  • FIG. 8A shows that the fluorescence intensity of the signal component and the fluorescence intensity of the signal component over time when a fluorescent labeling solution containing a fluorescent substance is provided on the metal film 220 at a general concentration (for example, several hundred pM to 1 ⁇ M). It is a graph which shows a change.
  • FIG. 8B shows changes over time in the fluorescence intensity of the signal component and the fluorescence intensity of the signal component when a fluorescent labeling solution containing a fluorescent substance at a low concentration (for example, 100 fM to several hundred pM) is provided on the metal film 220. It is a graph to show.
  • the intensities of the first light and the second light are measured in a state where a fluorescent labeling solution (free secondary antibody) is present on the metal film 220.
  • a black circle ( ⁇ ) represents the fluorescence intensity (output Os) of the noise component
  • a black triangle ( ⁇ ) represents the fluorescence intensity of the signal component (difference value between the output Op and output Os).
  • the presence of the substance to be detected in the sample or the amount of the substance to be detected can be measured in real time.
  • the SPFS device 100 ′ can detect only the signal component in real time using the difference in polarization characteristics of the signal component and the noise component, and thus is equivalent to the conventional SPFS device.
  • the substance to be detected can be measured in real time with high sensitivity.
  • the SPFS device 100 ′ can remove the noise component contained in the fluorescence ⁇ , it is not necessary to remove the free secondary antibody after the secondary reaction (step S130).
  • the substance to be detected can be measured.
  • the measurement method according to the present embodiment can detect substances such as lectins that have a weak affinity and are difficult to detect by a normal sandwich assay. Further, even when using a specimen with a lot of contaminants such as serum, it is possible to distinguish the intensity of the fluorescence derived from the detected substance captured on the diffraction grating 230 from the intensity of the fluorescence derived from the contaminant. Therefore, a measurement result that does not substantially reflect the influence of noise due to impurities can be obtained while the measurement is highly accurate.
  • a detected substance in an unpurified sample such as a crude product obtained by biosynthesis of a new biological substance or an original sample collected in a clinical test can be obtained with high accuracy. It is possible to measure easily over time.
  • the SPFS device 300 shown in FIG. 9 may be used instead of the SPFS device 100 (100 ′) shown in FIG.
  • the SPFS apparatus 300 is configured in the same manner as the SPFS apparatus 100 except that the SPFS apparatus 300 further includes a half mirror 321, a polarizer 322, and a light detection unit 324.
  • the half mirror 321 is disposed on the optical path of the fluorescence ⁇ between the diffraction grating 230 and the polarizer 122.
  • the photodetector 324 is disposed on the optical path (reflected optical path) of the fluorescence ⁇ reflected by the half mirror 321, and the polarizer 322 is disposed on the reflected optical path between the half mirror 321 and the photodetector 324.
  • the rotation angle of the polarizer 122 is adjusted (or fixed) so as to pass the first light (for example, p-polarized light), and the rotation angle of the polarizer 322 is the second light (for example, s-polarized light). ) Is adjusted (or fixed) to pass.
  • a polarization beam splitter may be used.
  • Both the photodetectors 124 and 324 continuously detect the intensity of the first light and the intensity of the second light. Therefore, when the light source 112 continuously emits the excitation light ⁇ , the photodetectors 124 and 324 continuously detect the intensity of the first light and the intensity of the second light, respectively. From the viewpoint of preventing excessive fading of the fluorescence ⁇ , when the light source 112 intermittently irradiates the excitation light ⁇ at a predetermined interval, the photodetector 124 intermittently detects the intensity of the first light and detects the light. The device 324 intermittently detects the intensity of the second light. That is, the intensity of the first light and the intensity of the second light are simultaneously detected at the same interval as the irradiation interval of the excitation light ⁇ .
  • the SPFS device 100 (100 ′) has only one polarizer 122 and one photodetector 124, it is advantageous for downsizing of the device.
  • the SPFS device 300 has the first light and the second light. It is advantageous for real-time SPFS measurement with higher temporal resolution.
  • a first fluorescent substance (allophycocyanin, absorption wavelength: 650 nm, fluorescence wavelength 661 nm) indicated by a white star in the figure was immobilized on a diffraction grating 230 of a metal film.
  • the first fluorescent substance simulates a fluorescent substance that labels a substance to be detected in GC-SPFS.
  • excitation light ⁇ (wavelength 640 nm) was irradiated to the diffraction grating 230 at a predetermined incident angle, and the intensity of the fluorescence ⁇ was measured by the light detection unit 124 while rotating the polarizer (polarizing plate) 122.
  • the buffer solution present on the diffraction grating 230 is omitted.
  • a buffer solution containing the second fluorescent material (AlexaFluor 647, absorption wavelength: 647 nm, fluorescence wavelength 665 nm) indicated by a black star in the figure is formed on the diffraction grating 230 of the metal film.
  • the second fluorescent material simulates a fluorescent material floating on the metal film, which is a noise source in GC-SPFS.
  • the diffraction grating 230 was irradiated with excitation light ⁇ (wavelength 640 nm) at the same incident angle as the previous time, and the intensity of the fluorescence ⁇ was measured by the light detection unit 124 while rotating the polarizer (polarizing plate) 122.
  • the buffer solution existing on the diffraction grating 230 is omitted except for the second fluorescent material.
  • the actual particle size of the fluorescent material is generally about several nm.
  • FIG. 11 is a graph showing the measurement results of fluorescence intensity.
  • the alternate long and short dash line is a curve showing the relationship between the rotation angle of the polarizer and the fluorescence intensity when only the first fluorescent material is present (see FIG. 10A).
  • the broken line is a curve showing the relationship between the rotation angle of the polarizer and the fluorescence intensity when the second fluorescent material is present in addition to the first fluorescent material (see FIG. 10B).
  • the solid line is a curve showing the relationship between the rotation angle of the polarizer and the difference value between these two measured values.
  • the rotation angle of the polarizer is an angle with respect to a plane including the normal to the surface of the metal film 220 and the optical axis of the excitation light ⁇ . For example, when the rotation angle of the polarizer is 0 °, p-polarized light is detected, and when the rotation angle of the polarizer is ⁇ 90 °, s-polarized light is detected.
  • the fluorescence (signal component) derived from the first fluorescent material is mainly p-polarized light.
  • the fluorescence intensity increases uniformly regardless of the rotation angle of the polarizer. This is considered to be due to the addition of fluorescence (noise component) derived from the second fluorescent material. Therefore, when looking at the solid line indicating these difference values, it can be seen that the fluorescence (noise component) derived from the second fluorescent material is randomly polarized.
  • the noise component is almost included by subtracting the detection result of the s-polarized component from the detection result of the p-polarized component.
  • the value of no signal component can be calculated.
  • the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and the surface plasmon enhanced fluorescence measuring method according to the present invention can measure a substance to be detected with high reliability, and are useful for clinical examinations, for example.
  • the surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus and the surface plasmon enhanced fluorescence measuring method according to the present invention can measure a substance to be detected with high reliability in real time without cleaning the metal film surface after providing a fluorescent labeling solution or the like. You can also Therefore, not only the measurement time can be shortened, but also it is expected to contribute to the development, spread and development of a very simple quantitative immunoassay system.
  • SPFS device Surface plasmon enhanced fluorescence measuring device
  • Excitation light irradiation unit 112
  • Light source 120
  • Fluorescence detection unit 122,322 Polarizer 124,324
  • Photodetection part 130
  • Control part (processing part) 200 chip 210 substrate 220 metal film 230 diffraction grating 321 half mirror ⁇ excitation light ⁇ fluorescence ⁇ reflected light

Abstract

　本発明は、被検出物質を高感度に検出することができる、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する表面プラズモン増強蛍光分析装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光をチップの回折格子に照射する光源と、回折格子上の蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。

Description

表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。
　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。
　ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ－ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ－ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、ＰＣ－ＳＰＦＳは、測定装置の小型化の点で課題を有している。
　これに対し、ＧＣ－ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（特許文献１および非特許文献１参照）。ＧＣ－ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ－ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化することができる。
特開２０１１－１５８３６９号公報
Keiko Tawa, Hironobu Hori, Kenji Kintaka, Kazuyuki Kiyosue, Yoshiro Tatsu, and Junji Nishii, "Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance", Optics Express, Vol. 16, pp. 9781-9790.
　上記のように、ＧＣ－ＳＰＦＳは、ＰＣ－ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化できるという利点を有するが、ＧＣ－ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ－ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法には、検出感度に改善の余地がある。
　本発明の目的は、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法であって、被検出物質をより高感度に検出することができる測定装置および測定方法を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置は、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。
　また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する第１の工程と、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する第２の工程と、前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す第３の工程と、前記直線偏光の光を検出する第４の工程と、を含む。
　本発明によれば、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、被検出物質をより高感度に検出することができる。また、本発明によれば、被検出物質をリアルタイムで検出することもできる。
図１は、実施の形態１，２に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）の構成を示す模式図である。 図２Ａ，Ｂは、回折格子の斜視図である。 図３Ａは、実施の形態１，２に係るチップの第１の態様を模式的に示す図であり、図３Ｂは、実施の形態１，２に係るチップの第２の態様を模式的に示す図である。 図４は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。 図５Ａ，Ｂは、蛍光強度の測定手順を示す模式図である。 図６は、差分値（シグナル値）を説明するためのグラフである。 図７は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。 図８Ａ，Ｂは、蛍光強度をリアルタイムで測定したときの結果の例を示すグラフである。 図９は、実施の形態１，２に係るＳＰＦＳ装置の他の例の構成を示す模式図である。 図１０Ａ，Ｂは、参考実験の手順を示す模式図である。 図１１は、参考実験の測定結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　［実施の形態１］
　図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。
　図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０および制御部１３０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（不図示）にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。
　チップ２００は、基板２１０と、基板２１０の上に形成された金属膜２２０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。
　基板２１０は、金属膜２２０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
　金属膜２２０は、基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。金属膜２２０の厚みは、例えば３０～５００ｎｍであり、好ましくは１００～３００ｎｍである。
　回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。図２Ａ，Ｂに示される例では、後述する励起光αの光軸は、ｘｚ平面に平行である。
　回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。
　回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
　捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。
　図１に示されるように、励起光αは、所定の入射角θ１で金属膜２２０（回折格子２３０）に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＧＣ－ＳＰＦＳでは、ＰＣ－ＳＰＦＳと異なり、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。たとえば、蛍光βの出射角θ２は、２θ１で近似される。なお、励起光αの反射光γは、ほとんど生じない。
　回折格子２３０は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常は、回折格子２３０は、液体を収容可能な空間に配置される。たとえば、回折格子２３０は、図３Ａに示されるように、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。図３Ａに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、バルクと金属膜２２０表面との間の物質移動解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）や、増強電場空間スケール（ｚ軸方向）の測定などにも好適である。図３Ｂに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、金属膜２２０表面に固定化された分子（捕捉体）に対する、別の分子（被検出物質）の反応定数解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）などにも好適である。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　励起光照射ユニット１１０は、波長および光量が一定の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。このとき、励起光照射ユニット１１０は、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光を金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。励起光αの光軸は、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ，Ｂにおけるｘ軸方向）に沿う。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に平行な軸をｙ軸とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸をｚ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｚ平面に平行である（図１参照）。励起光αは、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光であることから、励起光αの電界の振動方向は、励起光αの光軸および金属膜２２０の表面に対する法線を含むｘｚ平面に平行である。
　励起光照射ユニット１１０は、少なくとも光源１１２を有する。励起光照射ユニット１１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。
　光源１１２は、チップ２００の回折格子２３０に向けて励起光αを出射する。本実施の形態では、光源１１２は、レーザーダイオードである。なお、光源１１２の種類は、特に限定されず、レーザーダイオードでなくてもよい。光源１１２の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
　コリメートレンズ（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αをコリメートする。レーザーダイオード（光源１１２）から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、レーザーダイオードは所定の姿勢で保持される。照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。
　励起光フィルター（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αを整波する。励起光フィルターは、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含む。レーザーダイオード（光源１１２）からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、レーザーダイオード（光源１１２）からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルターは、金属膜２２０にｐ偏光の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
　金属膜２２０に対する励起光αの入射角θ１（図１参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角θ１は、回折格子２３０のピッチや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。なお、回折格子のピッチとしては、例えば４００ｎｍ程度であることが好ましい。励起光αの最適な入射角θ１は、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角θ１を調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、励起光照射ユニット１１０またはチップ２００を回転させればよい。
　蛍光検出ユニット１２０は、励起光照射ユニット１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニット１２０は、回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。
　蛍光検出ユニット１２０は、少なくとも偏光子１２２および光検出部１２４を有する。蛍光検出ユニット１２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。
　偏光子１２２は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置され、蛍光物質から放出された蛍光βから直線偏光の光を取り出す。本実施の形態では、偏光子１２２は、偏光板である。偏光子１２２は、金属膜２２０から光検出部１２４に向かう蛍光βの進行方向に垂直な平面内で回転できるように保持されている。
　偏光子１２２は、蛍光βから、金属膜２２０の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光、および前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出す。好ましくは、偏光子１２２は、蛍光βから、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０°のｐ偏光の光を第１の光として取り出し、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が９０°のｓ偏光の光を第２の光として同時または異時に取り出す。本実施の形態では、偏光子（偏光板）１２２を回転させることで、第１の光（例えばｐ偏光の光）と第２の光（例えばｓ偏光の光）とを異時に取り出す。この後説明するように、第１の光は、検出対象のシグナル成分およびノイズ成分を含む光であり、第２の光は、主としてノイズ成分からなる光である。
　なお、偏光子１２２の種類は、所定の偏光方向の直線偏光の光を取り出すことができれば特に限定されず、偏光板でなくてもよい。偏光子１２２の例には、偏光プリズム、液晶フィルター、その他の偏光フィルターが含まれる。
　光検出部１２４は、偏光子１２２により取り出された直線偏光の光を検出して、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。偏光子１２２が、蛍光βから第１の光および第２の光を同時または異時に取り出した場合は、光検出部１２４は、第１の光および第２の光をそれぞれ検出する。たとえば、光検出部１２４は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１２４は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。
　集光レンズ群（図示省略）は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜２２０上の蛍光像を光検出部１２４の受光面上に結像させる。
　蛍光フィルター（図示省略）は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１２４に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１２４に到達する光の光量を調整したりする。
　前述のとおり、ＧＣ－ＳＰＦＳでは、蛍光βは、回折格子２３０（反応場）から特定の方向に指向性を持って出射される。したがって、金属膜２２０表面の法線に対する蛍光検出ユニット１２０の光軸の角度は、蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニット１２０の光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニット１２０の光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニット１２０の光軸と金属膜２２０との交点を中心として、蛍光検出ユニット１２０またはチップ２００を回転させればよい。
　制御部１３０は、励起光照射ユニット１１０（光源１１２）、蛍光検出ユニット１２０（偏光子１２２および光検出部１２４）、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１２０の角度調整部（第１角度調整部および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１３０は、光検出部１２４からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。制御部１３０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、チップ２００を準備して、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
　次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜２２０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。この後説明するように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。しかしながら、蛍光物質で標識した後は、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。
　なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜２２０上に提供してもよい。また、金属膜２２０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
　次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えばｐ偏光の光）の強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、図５Ａに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第１の光（図ではｐ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
　この後の参考実験で示すように、ＧＣ－ＳＰＦＳでは、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光または、偏光角度が前記ｐ偏光の光に近い光である。したがって、シグナル成分は、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。一方で、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）は、ランダム偏光の光である。したがって、ノイズ成分の一部（シグナル成分と偏光角度が同じ光）も、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｐ）は、シグナル成分およびノイズ成分を含む。
　次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えばｓ偏光の光）の強度を測定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第２の光（図ではｓ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
　前の工程で説明したように、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）は、ランダム偏光の光である。したがって、ノイズ成分の一部は、この工程においても偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｓ）は、主としてノイズ成分からなる。
　なお、第１の光の測定（工程Ｓ４０）と第２の光の測定（工程Ｓ５０）の順番は、これに限定されない。たとえば、第２の光の強度を測定した後に、第１の光の強度を測定してもよい。
　最後に、制御部（処理部）１３０は、光検出部１２４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ６０）。具体的には、図６に示されるように、制御部（処理部）１３０は、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。前述のとおり、出力Ｏｐは、主としてシグナル成分およびノイズ成分からなり、出力Ｏｓは、主としてノイズ成分からなることから、これらの差分値を算出することで、ノイズ成分を除去したシグナル値を得ることができる。
　以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
　以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、シグナル成分とノイズ成分の偏光特性の違いを利用してシグナル成分のみを検出することができるため、従来のＳＰＦＳ装置に比べてより高感度に被検出物質を検出することができる。
　また、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。
　なお、上記実施の形態では、金属膜２２０側から励起光αをチップ２００に照射する例について説明したが、基板２１０側から励起光αをチップ２００に照射してもよい。
　［実施の形態２］
　実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置１００’は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同じ構成であり、リアルタイム測定を行う点で実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、ＳＰＦＳ装置の構成については説明を省略し、動作手順についてのみ説明する。
　本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００’は、回折格子２３０に励起光αを継続して照射し、蛍光物質から放出された蛍光βから直線偏光の光を継続して取り出し、かつ前記直線偏光の光を継続して検出する。ここで「継続」とは、連続して動作を行うことだけでなく、断続的に動作を行うことも含む。したがって、「励起光を継続して照射する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で励起光αを照射することを意味する。「直線偏光の光を継続して取り出す」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で蛍光βから直線偏光の光を継続して取り出すことを意味する。「直線偏光の光を継続して検出する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で蛍光βから直線偏光の光を検出することを意味する。
　たとえば、励起光αの継続的な照射は、励起光αを連続して照射することであってもよいし、励起光αを断続的に照射することであってもよい。蛍光物質の退色を防ぐ観点からは、励起光αの継続的な照射は、励起光αの断続的な照射であることが好ましい。この場合、励起光αの照射間隔は、一定であってもよいし、不定（任意）であってもよい。また、励起光αの照射間隔は、例えばプログラムによる自動算出のような、一定の条件に基づいて自動的に決められてもよいし、予備実験などによって経験的に決められてもよいし、ユーザによって任意に決められてもよい。
　励起光の照射間隔は、蛍光強度の検出結果に応じて決められてもよい。たとえば、蛍光強度の検出値が小さい場合には、励起光の照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値が大きい場合には、励起光の照射間隔をより長くしてもよい。また、蛍光強度の検出値の経時的な変化が大きい場合には、励起光の照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値の経時的な変化が小さい場合には、励起光の照射の間隔をより長くしてもよい。このような励起光の照射間隔の調整は、例えば、蛍光強度の検出値に係る閾値を適宜に設定し、蛍光強度の検出値に基づくフィードバック制御によって行うことが可能である。このような励起光の照射間隔の調整は、被検出物質に係る経時的な変化をより精密に観測する観点から好ましい。
　直線偏光の光の継続的な取り出しのタイミング、および直線偏光の光の継続的な検出のタイミングについても同様である。
　図７は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置１００’の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、チップ２００を準備して、ＳＰＦＳ装置１００’の所定の位置にチップ２００を設置する。実施の形態１と同様に、必要に応じて金属膜２２０上を洗浄する。
　次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。
　次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜２２０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。実施の形態１と同様に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００’では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質を測定することができる。
　なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜２２０上に提供してもよい。また、金属膜２２０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
　次いで、励起光αを金属膜２２０に照射しつつ、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えばｐ偏光の光）の強度を測定し（工程Ｓ１４０）、励起光αを金属膜２２０に照射しつつ、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えばｓ偏光の光）の強度を測定し（工程Ｓ１５０）、そして、第１の光の強度の測定と第２の光の強度の測定とを所定の回数だけ繰り返す（工程Ｓ１６０）。これにより、第１の光の強度の測定と第２の光の強度の測定が交互に複数回繰り返され、第１の光の強度の測定値と第２の光の強度の測定値とが、それぞれ継続して（断続的に）得られる。
　具体的には、工程Ｓ１４０では、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを連続して、または所定の間隔で断続的に（すなわち「継続して」）出射させる。「所定の間隔」とは、例えば、後述する偏光子１２２の回転角度の変更（調整）の間隔である。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を継続して検出させる。蛍光βの強度の継続的な検出のタイミングは、励起光αの経時的な照射のタイミングと同期していてもよいし、異なっていてもよい。このとき、図５Ａに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第１の光（図ではｐ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
　実施の形態１の工程Ｓ４０で説明したように、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。一方で、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）の一部（シグナル成分と偏光角度が同じ光）も、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｐ）は、シグナル成分およびノイズ成分を含む。
　工程Ｓ１５０では、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを依然として継続して出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を継続して検出させる。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第２の光（図ではｓ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
　実施の形態１の工程Ｓ５０で説明したように、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）の一部は、この工程においても偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｓ）は、主としてノイズ成分からなる。
　なお、第１の光の測定（工程Ｓ１４０）と第２の光の測定（工程Ｓ１５０）の順番は、これに限定されない。たとえば、第２の光の強度を測定した後に、第１の光の強度を測定してもよい。
　工程Ｓ１６０では、例えば、制御部１３０は、第２の光の測定回数（ｓ偏光測定回数Ｃｓ）を数え、Ｃｓが設定値（例えばＮ回）に達していない場合には、偏光子１２２の回転角度を第１の光を検出するための角度に再び調整し、工程Ｓ１４０に戻って第１の光の強度を測定する。
　前記ＣｓがＮ回に達した場合、制御部（処理部）１３０は、光検出部１２４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ１７０）。
　具体的には、図６に示されるように、制御部（処理部）１３０は、工程Ｓ１４０で測定された第１の光の強度およびその直後の工程Ｓ１５０で測定された第２の光の強度の各セットについて、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。したがって、第１の光の強度および第２の光の強度を継続して測定すると、第１の光の強度の検出値と第２の光の強度の検出値とのセットごとにシグナル値が算出される。すなわち、経時的に変化するシグナル値が算出される。また、工程Ｓ１４０～Ｓ１６０と工程Ｓ１７０とを並行して行うことで、経時的に変化するシグナル値をリアルタイムで算出することも可能である。
　図８Ａは、一般的な濃度（例えば数１００ｐＭ～１μＭ）で蛍光物質を含む蛍光標識液が金属膜２２０上に提供されたときの、シグナル成分の蛍光強度とシグナル成分の蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。図８Ｂは、低濃度（例えば１００ｆＭ～数１００ｐＭ）で蛍光物質を含む蛍光標識液が金属膜２２０上に提供されたときの、シグナル成分の蛍光強度とシグナル成分の蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。これらの実験では、蛍光標識液（遊離の２次抗体）が金属膜２２０上に存在する状態で、第１の光および第２の光の強度を測定している。これらのグラフにおいて、黒丸（●）は、ノイズ成分の蛍光強度（出力Ｏｓ）を表し、黒三角（▲）は、シグナル成分の蛍光強度（出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値）を表す。
　これらのグラフから、蛍光標識のために供給される蛍光物質の濃度の高低に関わらず、シグナル成分の蛍光強度の経時的変化を測定できることがわかる。これらの測定値は、カイネティクス解析によって即座に経時的変化の挙動を示す曲線として表示されうる。
　以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量をリアルタイムで測定することができる。
　以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００’は、シグナル成分とノイズ成分の偏光特性の違いを利用してシグナル成分のみをリアルタイムで検出することができるため、従来のＳＰＦＳ装置と同等の高感度で被検出物質をリアルタイムで測定することができる。
　また、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００’は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ１３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の測定を行うことができる。
　したがって、本実施の形態に係る測定方法では、レクチンなどの、アフィニティーが弱く、通常のサンドイッチアッセイでは検出が難しい物質も検出することができる。また、血清などの夾雑物が多い検体を用いる場合でも、回折格子２３０上に捕捉された被検出物質に由来する蛍光の強度を、夾雑物に由来する蛍光の強度から区別することが可能であるので、高精度の測定でありながら、夾雑物によるノイズの影響が実質的には反映されない測定結果が得られる。
　したがって、本実施の形態に係る測定方法によれば、新規の生体物質の生合成による粗生成物や、臨床検査で採取された原サンプルなどの未精製のサンプル中の被検出物質を高い精度で経時的に、そして簡易に測定することが可能である。
　なお、図１に示されるＳＰＦＳ装置１００（１００’）の代わりに、図９に示されるＳＰＦＳ装置３００を用いてもよい。図９に示されるように、ＳＰＦＳ装置３００は、ハーフミラー３２１、偏光子３２２および光検出部３２４をさらに有する点を除き、ＳＰＦＳ装置１００と同様に構成されている。
　ハーフミラー３２１は、回折格子２３０と偏光子１２２との間において蛍光βの光路上に配置されている。光検出器３２４は、ハーフミラー３２１で反射した蛍光βの光路（反射光路）上に配置されており、偏光子３２２は、ハーフミラー３２１と光検出器３２４との間において反射光路上に配置されている。偏光子１２２の回転角度は、第１の光（例えばｐ偏光の光）を通すように調整（あるいは固定）されており、偏光子３２２の回転角度は、第２の光（例えばｓ偏光の光）を通すように調整（あるいは固定）されている。なお、ハーフミラー３２１、偏光子１２２および偏光子３２２の代わりに、偏光ビームスプリッターを使用してもよい。
　光検出器１２４，３２４は、いずれも、第１の光の強度および第２の光の強度を連続して検出する。したがって、光源１１２が励起光αを連続して照射した場合、光検出器１２４，３２４は、それぞれ第１の光の強度および第２の光の強度を連続して検出する。蛍光βの過度の退色を予防する観点から、光源１１２が所定の間隔で断続的に励起光αを照射した場合、光検出器１２４は第１の光の強度を断続的に検出し、光検出器３２４は第２の光の強度を断続的に検出する。すなわち、第１の光の強度および第２の光の強度は、いずれも励起光αの照射間隔と同じ間隔で同時に検出される。
　光検出器１２４からの出力Ｏｐおよび光検出器３２４からの出力Ｏｓから、図８Ａおよび図８Ｂと同様のグラフが作成されうる。
　ＳＰＦＳ装置１００（１００’）は、偏光子１２２および光検出器１２４をそれぞれ一つずつしか有さないので、装置の小型化に有利であるが、ＳＰＦＳ装置３００は、第１の光と第２の光の両方を同時に測定可能であるので、より高い時間分解能でのリアルタイムのＳＰＦＳ測定に有利である。
　［参考実験］
　本実験では、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、金属膜上で励起された蛍光物質から放出された蛍光（被検出物質の存在または量を示すシグナル成分）と、液体中に浮遊している蛍光物質から放出された蛍光（ノイズ成分）の偏光特性を調べた結果を示す。
　まず、図１０Ａに示されるように、金属膜の回折格子２３０上に、図中白色の星で示される第１の蛍光物質（アロフィコシアニン、吸収波長：６５０ｎｍ、蛍光波長６６１ｎｍ）を固定化した。第１の蛍光物質は、ＧＣ－ＳＰＦＳにおける被検出物質を標識する蛍光物質を模擬している。この状態で、回折格子２３０に励起光α（波長６４０ｎｍ）を所定の入射角で照射し、偏光子（偏光板）１２２を回転させながら、光検出部１２４で蛍光βの強度を測定した。なお、図１０Ａでは、回折格子２３０上に存在する緩衝液を省略している。
　次いで、図１０Ｂに示されるように、金属膜の回折格子２３０上に、図中黒色の星で示される第２の蛍光物質（AlexaFluor 647、吸収波長：６４７ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍ）を含む緩衝液を提供した。第２の蛍光物質は、ＧＣ－ＳＰＦＳにおいてノイズ源となる、金属膜上に浮遊している蛍光物質を模擬している。この状態で、回折格子２３０に励起光α（波長６４０ｎｍ）を前回と同一の入射角で照射し、偏光子（偏光板）１２２を回転させながら、光検出部１２４で蛍光βの強度を測定した。なお、図１０Ｂでも、第２の蛍光物質を除き、回折格子２３０上に存在する緩衝液を省略している。また、蛍光物質の実際の粒子サイズとしては、一般的には数ｎｍ程度である。
　図１１は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。一点鎖線は、第１の蛍光物質のみが存在する場合（図１０Ａ参照）における、偏光子の回転角度と蛍光強度との関係を示す曲線である。破線は、第１の蛍光物質に加えて第２の蛍光物質も存在する場合（図１０Ｂ参照）における、偏光子の回転角度と蛍光強度との関係を示す曲線である。実線は、偏光子の回転角度とこれら２つの測定値の差分値との関係を示す曲線である。なお、偏光子の回転角度は、金属膜２２０の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面に対する角度である。たとえば、偏光子の回転角度が０°の場合は、ｐ偏光の光が検出されており、偏光子の回転角度が±９０°の場合は、ｓ偏光の光が検出されている。
　まず、一点鎖線について見てみると、第１の蛍光物質に由来する蛍光（シグナル成分）は、主としてｐ偏光であることがわかる。次に、破線について見てみると、第２の蛍光物質が浮遊している場合は、偏光子の回転角度に関係なく蛍光強度が一律に上昇していることがわかる。これは、第２の蛍光物質に由来する蛍光（ノイズ成分）が加わったためと考えられる。そこで、これらの差分値を示す実線について見てみると、第２の蛍光物質に由来する蛍光（ノイズ成分）は、ランダム偏光であることがわかる。
　したがって、シグナル成分以外のノイズ成分が蛍光に含まれる場合であっても、図１１に示されるように、ｐ偏光成分の検出結果からｓ偏光成分の検出結果を引くことで、ノイズ成分をほとんど含まないシグナル成分の値を算出することができる。
　本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
　また、本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、蛍光標識液などを提供した後に金属膜表面を洗浄しなくても、被検出物質を高い信頼性でリアルタイムに測定することもできる。よって、測定時間の短縮化が図られるだけでなく、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
　１００，１００’，３００　表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
　１１０　励起光照射ユニット
　１１２　光源
　１２０　蛍光検出ユニット
　１２２，３２２　偏光子
　１２４，３２４　光検出部
　１３０　制御部（処理部）
　２００　チップ
　２１０　基板
　２２０　金属膜
　２３０　回折格子
　３２１　ハーフミラー
　α　励起光
　β　蛍光
　γ　反射光

Claims (8)

  1. 　回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
    　増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、
    　前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、
    　前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、
    　を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
  2. 　前記光検出部による検出値を処理する処理部をさらに有し、
    　前記偏光子は、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出し、
    　前記光検出部は、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
    　前記処理部は、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
    　請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
  3. 　前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
    　前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
    　請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
  4. 　被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
    　回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する第１の工程と、
    　前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する第２の工程と、
    　前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す第３の工程と、
    　前記直線偏光の光を検出する第４の工程と、
    　を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
  5. 　前記第４の工程で得られた検出値を処理する第５の工程をさらに含み、
    　前記第３の工程では、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出し、
    　前記第４の工程では、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
    　前記第５の工程では、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
    　請求項４に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
  6. 　前記第２の工程では、前記回折格子に励起光を継続して照射し、
    　前記第３の工程では、前記直線偏光の光を継続して取り出し、
    　前記第４の工程では、前記直線偏光の光を継続して検出する、
    　請求項４に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
  7. 　前記第４の工程で得られた検出値を処理する第５の工程をさらに含み、
    　前記第３の工程では、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を継続して同時または異時に取り出し、
    　前記第４の工程では、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ継続して検出し、
    　前記第５の工程では、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
    　請求項６に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
  8. 　前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
    　前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
    　請求項５または請求項７に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
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