JP2011209097A - 光学的測定装置および光学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微小な流路を備える測定チップを用い、表面プラズモンによる電場増強効果を利用する測定において、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除して、Ｓ／Ｎ比の高い測定を可能とする。
【解決手段】表面プラズモンを利用して試料中の被検物質Ａの有無および／または量を測定する光学的測定装置において、流路３３に接するように形成されたプリズム部３０上の金属膜３４ａを含む検出部を備える測定チップＣ１と、プリズム部３０と金属膜３４ａとの界面における測定光Ｌｅの偏光方向を変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御する偏光制御機構（１１、２１および２２）と、検出部から生じる信号光を検出する光検出器２３と、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出する信号処理部２４とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、表面プラズモンを利用して試料中の被検物質の有無および／または量を測定する光学的測定装置および光学的測定方法に関するものである。

従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのときの蛍光を検出することによって被検物質の存在を確認する方法である。また、被検物質が蛍光体ではない場合、例えば、蛍光色素等で標識されて被検物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検物質の存在を確認することも広くなされている。

また、このような蛍光法において、感度を向上させるため、表面プラズモンによる電場増強効果を利用する表面プラズモン増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ:Surface Plasmon field enhanced Fluorescence Spectroscopy）が特許文献１等に開示されている。これは、表面プラズモンを生じさせるため、プリズム上の所定領域に金属膜を設けた測定チップを備え、プリズムと金属膜との界面に対してプリズム側から、全反射角以上の所定の角度で上記界面に励起光を入射し、この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンを生じせしめ、その電場増強効果によって蛍光を増強させることによりＳ／Ｎ比を向上させるものである。

一方、ＳＰＦＳ法は、上記のように金属膜をプリズム上に備えることにより、プリズム内の不純物による散乱光（これは検出対象とする信号光に対してノイズ光となる）をこの金属膜によって遮断することができるという利点も有する（特許文献１、００５５段落）。これにより、加工が容易であり安価な樹脂製のプリズムを用いて、低コストに測定を行うことができる。

特開２００８−１０２１１７号公報

しかしながら、微小な流路を備える測定チップを用いて上記のようなＳＰＦＳ法を行う場合には、プリズム内の不純物に起因する散乱光が検出光に混ざり込むため、Ｓ／Ｎ比が低下するという問題が生じる可能性がある。図６に示すように、上記のような測定チップＣ５を用いた場合には、その流路５３に合わせて金属膜５４ａが形成される領域も狭くなり、測定光Ｌｅの広い範囲（領域）から生じる散乱光Ｌｓを遮断することができないためである。また、上記のような散乱光Ｌｓは流路５３内の金属膜５４ａ（信号光Ｌｆが生じる領域）に比して広い範囲（領域）で発生し、フィルタで遮断しようとしても、散乱光Ｌｓが斜めに入射するため有効に遮断することは難しい。さらに、微小な流路を備える測定チップを用いて測定を行う場合には、操作簡便性や生体試料による感染防止の観点から、通常測定チップを使い捨てにする場合が多く、測定チップの材料として安価なプラスチック材料が使用されることが多い。この場合、プラスチック材料は光学ガラス材料に比べて、安価ではあるものの不純物や異物を含み、散乱光が多く発生しやすいため、上記の問題は顕著に表れる。一方、このような問題は、蛍光法に限らず、被検物質および／または標識物質の散乱光に基づいて測定を行うような場合にも当てはまる。

したがって、微小な流路を備える測定チップを用い、上記のような表面プラズモンによる電場増強効果を利用する測定を行う場合にも、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除して、Ｓ／Ｎ比の高い測定を可能とする手法が望まれている。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、微小な流路を備える測定チップを用い、表面プラズモンによる電場増強効果を利用する測定において、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除して、Ｓ／Ｎ比の高い測定を可能とする光学的測定装置および光学的測定方法を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するために、本発明に係る光学的測定装置は、
表面プラズモンを利用して試料中の被検物質の有無および／または量を測定する光学的測定装置において、
測定光を出射する光源と、
流路を形成する流路基材と、流路の壁面の一部を構成するプリズム部と、流路に接するように形成されたプリズム部上の金属膜を含む検出部とを備える測定チップと、
プリズム部と金属膜との界面で測定光が全反射条件を満たすように、プリズム部を通して一方の側からこの界面に測定光を導光する導光部材と、
測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御する偏光制御機構と、
上記界面に関して他方の側に配置された、検出部から生じる信号光を検出する光検出器と、
偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出する信号処理部とを備えることを特徴とするものである。

本明細書において、「被検物質の有無および／または量を測定する」とは、被検物質の存在の有無を定性的に判定すること、被検物質の存在の量を定量的に測定すること、または被検物質の活性の程度を測定することを意味する。

「偏光方向」とは、直線偏光におけるその直線方向、または楕円偏光におけるその楕円の長軸方向を意味する。

「検出部から生じる信号光」とは、検出部に存在する被検物質の量に相関性のある強度を有する検出対象の光（検出部に存在する被検物質から生じる光および／またはこの被検物質を標識する標識物質から生じる光）を含む光を意味し、結果として被検物質の量に相関性のない強度を有するノイズ光が含まれていてもよい。

さらに、本発明に係る光学的測定装置において、上記界面における測定光の反射光を検出する第２の光検出器を備え、偏光制御機構は、第２の光検出器に検出された、上記偏光方向の変調に同期して変調する反射光の強度に基づいて、反射光の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように偏光状態を制御するものであることが好ましい。

さらに、本発明に係る光学的測定装置において、情報コードが表示する情報を読み取る情報読取部を備え、測定チップは、測定光がプリズム部に入射してから上記界面に到達するまでに測定光に生じる複屈折の位相差に関する位相差情報を表示する情報コードを備えたものであり、偏光制御機構は、情報読取部により読み取られた測定チップの情報コードが表示する位相差情報に基づいて、測定光に上記位相差と逆の位相差が生じるように偏光状態を制御するものであることが好ましい。

本発明に係る光学的測定方法は、表面プラズモンを利用して試料中の被検物質の存在および／または量を測定する光学的測定方法において、
流路を形成する流路基材と、流路の壁面の一部を構成するプリズム部と、流路に接するように形成されたプリズム部上の金属膜を含む検出部とを備える測定チップを用い、
プリズム部と金属膜との界面で測定光が全反射条件を満たすように、プリズム部を通して一方の側からこの界面に測定光を導光せしめ、
測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、
検出部から生じる信号光を上記界面に関して他方の側から検出し、
偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出し、
分離検出された信号成分により、被検物質の存在および／または量を測定することを特徴とするものである。

さらに、本発明に係る光学的測定方法において、測定光がプリズム部に入射してから上記界面に到達するまでに測定光に生じる複屈折の位相差と逆の位相差を与えるように、偏光状態を制御することが好ましい。この場合、上記界面における測定光の反射光であって、上記偏光方向の変調に同期して変調する反射光の強度に基づいて、逆の位相差を与えるように偏光状態を制御することが好ましく、または、測定チップに備えられた、上記位相差に関する位相差情報を表示する情報コードに基づいて、逆の位相差を与えるように偏光状態を制御することが好ましい。

さらに、本発明に係る光学的測定方法において、検出部から生じる信号光として、被検物質を標識する標識物質から生じる光を検出することができる。この場合、標識物質は、測定光に励起されて蛍光を発する蛍光標識であることが好ましい。

本発明に係る光学的測定装置は、特に偏光制御機構と信号処理部とを備えることにより、測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、この偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができる。これは、表面プラズモンの誘起に有効に寄与するのがｐ偏光成分であり、ｓ偏光成分は寄与しないことを利用している。つまり、検出部から生じる信号光のうち検出対象としている光（検出対象信号成分）は、上記界面における測定光のｐ偏光成分に起因して生じるため、その強度は測定光の上記偏光方向の変調に同期して変動するが、プリズム内の不純物に起因する散乱光（ノイズ信号成分）はその偏光方向に依存しないため、その強度は変動しない。したがって、検出対象信号成分とノイズ信号成分を分離検出することにより、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができる。この結果、微小な流路を備える測定チップを用い、表面プラズモンによる電場増強効果を利用する測定において、Ｓ／Ｎ比の高い測定が可能となる。

さらに、本発明に係る光学的測定方法は、特に測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができ、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

本発明の光学的測定装置の第１の実施形態を示す概略断面図である。 本発明の光学的測定装置の測定チップを示す概略斜視図である。 本発明の光学的測定装置の測定チップを示す概略断面図である。 本発明の光学的測定方法を用いたイムノアッセイ測定の工程を示す概略断面図である。 本発明の光学的測定装置の第２の実施形態を示す概略断面図である。 本発明の光学的測定装置の第３の実施形態を示す概略断面図である。 従来の方法で流路のある測定チップを用いた場合の問題点を示す概略断面図である。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。なお、視認しやすくするため、図面中の各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。

「光学的測定装置および方法の第１の実施形態」
本実施形態の光学的測定装置１は、図１、図２Ａ、図２Ｂおよび図３に示すように、流路３３を形成する流路基材３０、流路３３の上流側に乾燥配置された蛍光標識結合物質ＢＦ、および流路３３内の所定領域に形成された金属膜３４ａを含む検出部３８を備える測定チップＣ１と、測定光Ｌｅを出射する光源１０と、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材３０を通して一方の側からこの界面に測定光Ｌｅを導光する導光部材１４と、測定光Ｌｅの上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御する偏光変調素子１１と、偏光方向の変調の周期の基となる電圧の周期クロックを生成するファンクションジェネレータ（ＦＧ）２１と、このＦＧ２１に生成された電圧の周期クロックに応じて偏光変調素子１１を駆動する偏光変調素子ドライバ２２と、上記界面に関して他方の側に配置された、検出部３８から生じる信号光を検出する光検出器２３と、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出する信号処理部２４と，装置全体をコントロールする制御部２０とを備えるものである。ここで、上記金属膜３４ａの表面には、試料中の被検物質Ａと特異的に結合する物質Ｂ１（特異的結合物質）が固定されている。

測定チップＣ１は、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、所定領域に金属膜３４ａ・３４ｂを有する上方が開放した流路３３を備える流路基材３０と、この流路基材３０上に流路３３の上面を形成するように装着される蓋部材３２とを備えている。ここで、図２Ａは、本実施形態に係るチップＣ１の全体構成を示す概略斜視図であり、図２Ｂは、図２Ａ中チップＣ１の金属膜３４ａを通るｚ−ｘ平面における概略断面図である。

流路基材３０は、被検物質Ａを含む試料等を流すための流路３３、測定光Ｌｅを流路基材３０内部へ透過させるための透過面３０ｂ、およびこの透過面３０ｂをキズや汚れから保護する保護部３０ａが形成されたものである。本実施形態では、流路基材３０がプリズム部としての機能も果たしている（つまり、流路基材３０全体がプリズム部を兼ねており、プリズム部の明確な境界はない）。流路基材３０の材料は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。流路基材３０は、樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）、ポリスチレン、およびゼオネックス（登録商標）等の樹脂を用いることがより望ましい。

流路３３は、流路基材３０上に形成されたコ文字型の溝に蓋をするように、蓋部材３２が流路基材３０に装着されることにより形成される。本明細書において、流路の幅および高さ（いずれも試料の進行方向と垂直な方向の長さ）は、特に限定されない。しかしながら、流路の幅および高さは、プリズム内の不純物等による散乱光の影響が現れる範囲が幅１０ｍｍ以下および高さ２ｍｍ以下であり、特に顕著に現れる範囲が幅３ｍｍ以下および高さ１００μｍであることから、幅１０μｍ〜１０ｍｍおよび高さ１μｍ〜２ｍｍであることが好ましく、幅１００μｍ〜３ｍｍおよび高さ１０μｍ〜１００μｍであることが特に好ましい。これらの幅および高さの範囲にある流路の場合には、本発明は特に効果的である。さらに、流路３３の両端には液下用或いは廃液用の液溜めが形成されている。また、流路３３の所定領域には、検出部３８・３９をそれぞれ構成する金属膜３４ａ・３４ｂが形成されている。本実施形態では、測定用として金属膜３４ａを、リファレンス用として金属膜３４ｂを設けている。ただし、検出部は、測定用の検出部３８が１つあればよく、上記のようなリファレンス用の検出部３９は必ずしも必要ではない。金属膜３４ａ・３４ｂの材料としては、特に制限されるものではなく、例えばプラズモンを効率よく誘起する観点から、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。金属膜３４ａ・３４ｂの厚みは、金属膜３４ａ・３４ｂの材料と、測定光Ｌｅの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、測定光Ｌｅとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜３４ａ・３４ｂとしてＡｕ膜を用いる場合、金属膜３４ａ・３４ｂの厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。

蓋部材３２は、流路基材３０に装着することにより流路３３の上面を形成するためのものである。また、蓋部材３２は、液下用の液溜めに接続する試料等を流下するための注入口３５ａ、および廃液用の液溜めに接続する空気等を抜くための空気孔３５ｂを有している。蓋部材３２の材料としては、前述した流路基材３０と同様の材料を用いることができる。蓋部材３２は、上記金属膜が形成されたあとに、超音波融着等により装着される。

光源１０は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源１０は、前述のように、測定チップＣ１の流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で、測定光Ｌｅが全反射すると共に金属膜３４ａで表面プラズモン共鳴する共鳴角で入射するように配置されている。なお、測定光Ｌｅは、一般的には表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させることが好ましい。

導光部材１４は、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、測定光Ｌｅをこの界面に導光するものであれば特に制限されるものではなく、レンズやミラー等を使用することができる。

偏光変調素子１１、ファンクションジェネレータ（ＦＧ）２１、および偏光変調素子ドライバ２２は、これら全体で本発明における偏光制御機構として機能している。この偏光制御機構によって、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面における測定光Ｌｅの偏光方向が変調される。本実施形態の偏光変調素子１１は、電圧制御によって測定光Ｌｅの偏光状態を制御するための素子であり、このようなものとして電気光学効果を用いたポッケルスセルが挙げられる。しかし、偏光変調素子１１は、これに限定されず、λ／２波長板やλ／４波長板、偏光版、バビネソレイユ板、および特開２００６−３３０１０５に示されているような近接場を利用した偏光変調素子等でもよい。偏光方向の変調波形（より具体的には、ｐ偏光成分（もしくはｓ偏光成分）の変調波形）は、矩形波状であっても正弦波状であってもよい。例えば、ポッケルスセルを矩形波状の電圧で制御する場合には前者となり、波長板を回転させる場合には後者となる。ＦＧ２１は、制御部２０からトリガーを受信し、制御部２０に指定された波形に従って、偏光方向の変調波形の基となる電圧の周期クロック（電圧の変調波形）を生成するものであり、特に限定されるものではなく、他の波形発生器等でもよい。ＦＧ２１により生成される電圧の変調波形は、矩形波状、正弦波状等適宜設定することができる。偏光変調素子ドライバ２２は、ＦＧ２１に接続されており、ＦＧ２１が発する信号の波形に従って偏光変調素子１１を駆動するものである。ただし、偏光方向の変調は必ずしも周期的である必要はない。

光検出器２３は、試料中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器２３は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。

信号処理部２４は、制御部２０からトリガーおよび電圧の変調波形の情報を受信し、光検出器２３が検出した信号光から、偏光方向の変調の周期（ＦＧ２１が出力する変調の周期）に同期した信号成分を取り出し、偏光方向の変調に同期して変動する信号成分（検出対象信号成分）と変動しない信号成分（ノイズ信号成分）を分離検出するものである。例えば、ロックインアンプ等を用いることができる。

制御部２０は、本装置上の各構成の動作内容を制御すると共に各動作のタイミング制御を行っている。また、この制御部２０によって、ＦＧ２１の波形発生と信号処理部２４の信号受信のタイミングを制御することにより、制御部２０は、ＦＧ２１と信号処理部２４との同期をとる同期制御手段としての役割も成す。

一方、本実施形態の光学的測定方法は、上記測定装置１を用い、被検物質Ａを含有する試料を測定チップＣ１に滴下し、試料を乾燥配置された蛍光標識結合物質ＢＦと接触せしめながら検出部３８まで流下せしめ、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材３０を通して一方の側からこの界面に測定光Ｌｅを導光せしめ、測定光Ｌｅの上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御し、検出部３８から生じる信号光を上記界面に関して他方の側から検出し、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出し、分離検出された信号成分により、被検物質Ａの存在および／または量を測定することを特徴とするものである。

以下、例えば、被検物質として抗原Ａを含む試料Ｓｏから、抗原Ａを検出する本実施形態における蛍光法について詳細に説明する。本実施形態の蛍光法は、後述するサンドイッチ法によるアッセイを行うことによって、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜３４ａ上に蛍光標識Ｆを固定し、次に光源１０より発せられる測定光Ｌｅを測定チップＣ１の流路基材３０と金属膜３４ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射して、エバネッセント波を励起し、このエバネッセント波と金属膜３４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜３４ａ中に表面プラズモンを発生させ、この表面プラズモンによる増強電場Ｅｗで蛍光標識Ｆを励起して蛍光Ｌｆを生じせしめ、この蛍光Ｌｆを光検出器２３で検出して、その蛍光量を信号処理部２４で処理するものである。

ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、この蛍光標識Ｆは抗原Ａがなければ金属膜３４ａ上に固定されないものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。

１次抗体Ｂ１は、本実施形態における特異的結合物質であり、特に制限なく、検出条件（特に被検物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、既存の技術を用いて金属膜３４ａ上に固定することができる。

蛍光標識結合物質ＢＦは、蛍光標識Ｆおよびこれに修飾化された２次抗体Ｂ２からなる。蛍光標識Ｆは、測定光Ｌｅによって励起されて所定波長の蛍光Ｌｆを発するものであり、特に制限なく、測定条件（被検物質や励起光の波長）に応じて適宜選択することができる。例えば、測定光Ｌｅの波長が６５０ｎｍ程度の場合、Ｃｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）等を用いることができる。また、蛍光色素以外にも、蛍光色素を包含する蛍光微粒子や量子ドット等の蛍光標識でもよい。

増強電場Ｅｗは、金属膜３４ａ中に発生する表面プラズモンによって形成される電場であって、金属膜３４ａ上の局所的な領域に発生する、通常のエバネッセント波よりも増強された電場である。この増強電場Ｅｗによって、標識から発せられる蛍光等の信号の強度を増幅することができる。表面プラズモンは、エバネッセント波と金属膜３４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜３４ａ中に発生せしめられる。

蛍光標識Ｆを金属膜３４ａに固定するためのサンドイッチ法によるアッセイは、例えば以下に示す手順により行われる。血液（全血）中に被検物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合について図３を参照して説明する。また、以下の手順において、標識２次抗体ＢＦ（２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとの蛍光標識結合物質）が流路３３の検出部上流側に乾燥状態で配置された測定チップＣ１を用いている。
ｓｔｅｐ１：注入口３５ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図３において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルタ３６により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルタ３６で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路３３に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図３において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：流路３３に染み出した血漿Ｓと、流路３３の検出部上流側に乾燥状態で配置された標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ４：血漿Ｓは流路３３に沿って空気孔３５ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、測定用の検出部３８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチ構造が形成される。
ｓｔｅｐ５：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は、リファレンス用の検出部３９上に固定されている抗体であって、上記２次抗体Ｂ２と特異的結合性のある１次抗体Ｂ０と結合する。さらに、１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、検出部上に浮遊している標識２次抗体ＢＦを洗い流す。

このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、前述したように上記の装置１において、測定用の検出部３８からの信号光を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を高感度に検出することができる。その後、リファレンス用の検出部３９からの信号光を検出できるように測定チップＣ１を移動させ、同様に、リファレンス用の検出部３９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定しているリファレンス用の検出部３９からの信号光は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した信号光であると考えられる。したがって、この信号光をリファレンスとして、測定用の検出部３８からの信号光を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、リファレンス用の検出部３９に既知量の標識物質（蛍光標識、金属微粒子等）をあらかじめ固定しておき、リファレンス用の検出部３９からの信号光をリファレンスとして測定用の検出部３８からの信号光を補正してもよい。

以下、本実施形態の光学的測定装置および方法の作用を詳細に説明する。
本実施形態において、例えばポッケルスセルへ周波数ｆの印加電圧を加えて偏光変調素子１１を制御した場合について説明する。偏光変調素子１１によって偏光状態が制御された測定光Ｌｅは、流路基材３０（プリズム部）を透過し、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面に照射される。このとき、偏光方向の変調の周期の中で、上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態がｐ偏光になったとき、測定光Ｌｅは表面プラズモンとカップリングして、金属膜３４ａ上に増強電場Ｅｗが発生する。一方、上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態がs偏光になったとき、測定光Ｌｅは表面プラズモンとカップリングしないので、増強電場は発生しない。そして、表面プラズモンの増強電場Ｅｗによって励起された、検出対象信号成分である蛍光標識Ｆからの蛍光Ｌｆは、周波数ｆで変動するが、ノイズ信号成分である散乱光Ｌｓは、ｐ偏光、ｓ偏光に関わらず発生するため、周波数変動をしない。これは前述したように、表面プラズモンの誘起に有効に寄与するのがｐ偏光成分であり、ｓ偏光成分は寄与しないためである。このため、信号処理部２４によって、検出した信号光のうち周波数ｆに同期する成分を検出する測定を行うと、検出対象信号成分が測定され、ノイズ信号成分は除去される。これによりノイズによらない高感度測定を行うことが可能になる。

本発明は偏光方向の変調を蛍光法と組み合わせているが、散乱光検出法に比して著しい相乗効果を持つ。蛍光法では一般的に、検出蛍光量に比べて照射光量が桁違いに大きい。これは、蛍光物質によって放出される蛍光強度は、光の吸収効率（吸光係数）と蛍光への変換効率（量子収率）の積で表され、理論的な効率が小さいためであり、また、蛍光で物質量を定量する場合、蛍光物質が過剰量あると被検物質との関係で直線性が成り立たなくなるので、蛍光物質の量は比較的少なくするためである。このため、測定光の散乱光は検出したい蛍光強度に比べて桁違いに大きく、前述のように検出部から離れた領域からの散乱光はフィルタを斜めに透過してしまうために、蛍光法ではこの散乱光の影響を低減することが、高感度化に直結するため非常に重要である。また、ＳＰＦＳ法の光学系は、光学系の特徴から、検出部から離れた領域における散乱光が発生しやすく、これがノイズの主要因となりうるので、偏光方向の変調を用いたノイズ信号成分の低減はＳＰＦＳ法の光学系において著しく効果が高い。

以上のように、本実施形態に係る光学的測定装置は、特に偏光制御機構と信号処理部とを備えることにより、測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができる。この結果、微小な流路を備える測定チップを用い、表面プラズモンによる電場増強効果を利用する測定において、Ｓ／Ｎ比の高い測定が可能となる。

さらに、本発明に係る光学的測定方法は、特に測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができ、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

（第１の実施形態の設計変更）
上記実施形態においては、抗原Ａの標識として蛍光標識物質を用いたが、標識としてはその他の光応答性標識（例えば、燐光、散乱光などの標識）を用いてもよい。

偏光変調素子の前後に、λ／２波長板、λ／４波長板、偏光版、バビネソレイユ板などの偏光状態を調整するための素子を加えてもよい。

金属膜に照射される測定光がさまざまな角度成分を含むように、測定光に集光レンズを通過させることが、金属膜の被検物質の吸着量が変動しても表面プラズモンを励起できるために好ましい。しかし、集光レンズがあることは本発明の本質的な部分ではないため、必ずしも必要ではない。また、必要に応じて複数の集光レンズを用いて、測定光の状態を調整してもよい。

上記実施形態においては、免疫反応を利用したサンドイッチ法を例に説明したが、これに限られず、アビジン−ビオチン反応やＤＮＡ反応等を利用したもの、または競合法等を利用したものでも本発明を適用することが可能である。

「光学的測定装置および方法の第２の実施形態」
次に、第２の実施形態の光学的測定装置および方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置２および方法は、偏光変調素子１１と導光部材１４の間に備えられた波長板１２および１３と、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面における測定光Ｌｅの反射光を検出する第２の光検出器４０と、第２の信号処理部４１と、上記波長板を回転制御する波長板制御部４２とを備え、上記反射光をモニタリングすることにより、上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態を調整する点で、第１の実施形態の光学的測定装置１および方法と異なる。したがって、その他の第１の実施形態の光学的測定装置１および方法と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。

本実施形態の光学的測定装置２は、図４に示すように、流路３３を形成する流路基材３０、流路３３の上流側に乾燥配置された蛍光標識結合物質、および流路３３内の所定領域に形成された金属膜３４ａを含む検出部を備える測定チップＣ２と、測定光Ｌｅを出射する光源１０と、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材３０を通して一方の側からこの界面に測定光Ｌｅを導光する導光部材１４と、測定光Ｌｅの上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御する偏光変調素子１１と、偏光方向の変調の周期の基となる電圧の周期クロックを生成するＦＧ２１と、このＦＧ２１に生成された電圧の周期クロックに応じて偏光変調素子１１を駆動する偏光変調素子ドライバ２２と、上記界面に関して他方の側に配置された、検出部から生じる信号光を検出する光検出器２３と、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出する信号処理部２４と，装置全体をコントロールする制御部２０と、上記偏光変調素子１１と上記導光部材１４の間に備えられた波長板１２・１３と、上記界面における測定光Ｌｅの反射光Ｌｒを検出する第２の光検出器４０と、第２の信号処理部４１と、上記波長板を回転制御する波長板制御部４２とを備えるものである。

測定チップＣ２は、第１の実施形態と同様の構成であるが、図４に示すように、上記界面における測定光Ｌｅの反射光Ｌｒが適切に検出することが可能となるように、反射光Ｌｒが流路基材３０外へ透過するための透過面３０ｄとこれをキズや汚れから保護するための保護部３０ｃとをさらに備えるように形成されたものである。

第２の光検出器４０は、上記反射光Ｌｒを検出するように配置された、検出した反射光Ｌｒの信号を第２の信号処理部４１に送信するものであり、第１の実施形態と同様のものを使用することができる。

波長板１２・１３、第２の信号処理部４１、および波長板制御部４２は、偏光制御機構としてさらに設けられたものであり、これらによって、第２の光検出器４０によって検出された反射光強度に基づいて、測定光Ｌｅの偏光状態の調整を行う機能を果たす。例えば波長板１２・１３において、波長板１２がλ／２波長板であり、波長板１３がλ／４波長板である。第２の信号処理部４１は、例えばロックインアンプ等であり、検出した反射信号光のうち測定光の偏光方向の変調に同期した反射信号成分を分離検出し、この信号成分の強度の最大値に対する最小値の比が最小化する（周期的に変調している間の、最大値と最小値の振幅の変化の差が最大となる）ように、波長板１２・１３を制御するよう波長板制御部４２に指示を与えるものである。また、波長板制御部４２は、第２の信号処理部４１の指示に従い波長板１２・１３を回転制御するものである。

一方、本実施形態の光学的測定方法は、上記測定装置２を用い、被検物質Ａを含有する試料を測定チップＣ２に滴下し、試料を乾燥配置された蛍光標識結合物質と接触せしめながら検出部まで流下せしめ、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材を通して一方の側からこの界面に測定光を導光せしめ、測定光の上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、検出部から生じる信号光を上記界面に関して他方の側から検出し、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出し、分離検出された信号成分により、被検物質の存在および／または量を測定するものであって、上記信号光を検出する際に、上記界面における測定光Ｌｅの反射光Ｌｒを含む反射信号光を検出し、この反射信号光のうち偏光方向の変調に同期した反射信号成分を分離検出し、この信号成分の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御することを特徴とするものである。

以下、本実施形態の光学的測定装置および方法の作用を詳細に説明する。
流路基材３０（プリズム）内に複屈折が存在するとき、偏光変調素子１１で流路基材３０へ透過する前にｐ偏光およびｓ偏光を周期的に切り替える変調を行っても、流路基材３０内を伝播する間に例えば楕円偏光となってしまい、増強電場が効率よく生じず、分離検出した信号のＳ／Ｎ比が悪化してしまうという問題が生じる。実際に、安価なプラスチック材料を使ったプリズム（ゼオネックス（登録商標）、ポリスチレン、ＰＭＭＡなど）を用いた場合、この複屈折は無視することができない。そこで、実際にはこの流路基材３０を伝播する間に生じる複屈折の位相差を加味して測定光Ｌｅの偏光状態を制御する必要がある。

流路基材３０と金属膜３４ａとの界面における測定光Ｌｅの反射光Ｌｒを第２の光検出器４０で検出した場合、本実施形態では反射光Ｌｒの強度が、上記界面における測定光Ｌｅの偏光方向の変調に対応して変調することになる。これは、上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態がｐ偏光になったとき、測定光Ｌｅは表面プラズモンとカップリングして、測定光Ｌｅのエネルギーが表面プラズモンに変換されて、反射光Ｌｒが最小になり、一方上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態がs偏光になったとき、測定光Ｌｅは表面プラズモンとカップリングしないので、反射光Ｌｒが最大となることに起因する。そこで、本実施形態では、反射信号光のうち測定光Ｌｅの偏光方向の変調に同期した反射信号成分をモニタリングし、この信号成分の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように波長板１２・１３を調整することにより、上記複屈折の位相差を加味し、この位相差と逆の位相差を与えるように測定光Ｌｅの偏光状態を制御することができる。

以上のように、本実施形態に係る光学的測定装置は、特に偏光制御機構と信号処理部とを備えることにより、測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、第１の実施形態と同様の効果を奏する。

さらに、本実施形態に係る光学的測定装置は、特に上記界面における反射光Ｌｒを検出する第２の光検出器と、この第２の光検出器に検出された反射光Ｌｒに基づいて偏光状態を制御する偏光制御機構とを備え、反射信号光のうち測定光の変調に同期した反射信号成分をモニタリングし、この信号成分の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように、上記複屈折の位相差を加味して測定光の偏光状態を制御しているから、複屈折を有する材料からなるプリズム部を備えた測定チップを用いても、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことが可能となる。

また、本実施形態に係る光学的測定方法は、特に測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができ、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

さらに、本実施形態に係る光学的測定方法は、反射信号光のうち測定光の偏光方向の変調に同期した反射信号成分をモニタリングし、この信号成分の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように、上記複屈折の位相差を加味して測定光の偏光状態を制御しているから、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

（第２の実施形態の設計変更）
上記第２の実施形態では、波長板制御部によって波長板を回転制御し、測定光の流路基材内の伝播中に生じる複屈折の位相差を調整したが、下記第３の実施形態にあるように、波長板ではなく直接偏光変調素子を制御するようにしてもよい。

「光学的測定装置および方法の第３の実施形態」
次に、第３の実施形態の光学的測定装置３および方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置３および方法は、測定チップＣ３が、測定光Ｌｅがプリズム部に入射してから上記界面に到達するまでに測定光Ｌｅに生じる複屈折の位相差に関する位相差情報を表示する情報コード４４を備える点、およびこの情報コードを読み取るための情報読取部４３と、測定光Ｌｅの伝播中に生じる上記複屈折の位相差を制御する位相差制御部４５とを備え、上記情報コードが有する位相差情報に基づいて、上記界面における測定光Ｌｅの偏光状態を調整する点で、第１の実施形態の光学的測定装置１および方法と異なる。したがって、その他の第１の実施形態の光学的測定装置１および方法と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。

本実施形態の光学的測定装置３は、図５に示すように、流路３３を形成する流路基材３０、流路３３の上流側に乾燥配置された蛍光標識結合物質、流路３３内の所定領域に形成された金属膜３４ａを含む検出部、および情報コード４４を備える測定チップＣ３と、測定光Ｌｅを出射する光源１０と、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材３０を通して一方の側からこの界面に測定光Ｌｅを導光する導光部材１４と、測定光Ｌｅの上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御する偏光変調素子１１と、偏光方向の変調の周期の基となる電圧の周期クロックを生成するＦＧ２１と、このＦＧ２１に生成された電圧の周期クロックに応じて偏光変調素子１１を駆動する偏光変調素子ドライバ２２と、上記界面に関して他方の側に配置された、検出部から生じる信号光を検出する光検出器２３と、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出する信号処理部２４と，装置全体をコントロールする制御部２０と、上記情報コードを読み取る情報読取部４３と、情報処理部により読み取られた情報に基づいて、測定光の伝播中に生じる上記複屈折の位相差を制御する位相差制御部４５とを備えるものである。

情報コード４４は、測定チップＣ３の出荷時に予め求められた流路基材３０内の複屈折の位相差に関する位相差情報が、例えばバーコードや２次元コードの形式で記録されたものであり、その測定チップＣ３に添付されたものである。

情報読取部４３は、例えばＣＣＤや公知のバーコードリーダであり、読み取った情報を位相差制御部４５に送信するものである。

位相差制御部４５は、情報読取部４３によって読み取られた情報を受信し、この情報に基づいて、測定光Ｌｅの流路基材３０内の伝播中に生じる複屈折の位相差と逆の位相差を測定光Ｌｅに付与するようにＦＧ２１に指示を与えるものである。これにより、ＦＧ２１は、上記逆の位相差を反映させた電圧の変調波形を生成する。

一方、本実施形態の光学的測定方法は、上記測定装置３を用い、被検物質Ａを含有する試料を測定チップＣ３に滴下し、試料を乾燥配置された蛍光標識結合物質と接触せしめながら検出部まで流下せしめ、流路基材３０と金属膜３４ａとの界面で測定光Ｌｅが全反射条件を満たすように、流路基材３０を通して一方の側からこの界面に測定光Ｌｅを導光せしめ、測定光Ｌｅの上記界面における偏光方向を周期的に変調せしめるように、測定光Ｌｅの偏光状態を制御し、検出部から生じる信号光を上記界面に関して他方の側から検出し、偏光方向の変調の周期に同期した信号成分を信号光から分離検出し、分離検出された信号成分により、被検物質の存在および／または量を測定するものであって、上記測定光Ｌｅの偏光方向を変調する際に、測定チップＣ３に添付された情報コード４４から測定光Ｌｅの流路基材３０内の伝播中に生じる複屈折の位相差に関する位相差情報を取得し、この位相差情報に基づいて、測定光Ｌｅの偏光状態を制御することを特徴とするものである。

以下、本実施形態の光学的測定装置および方法の作用を詳細に説明する。
測定光Ｌｅが流路基材３０を伝播する間に生じる複屈折の位相差を加味して測定光Ｌｅの偏光状態を制御する必要があるのは、前述した通りである。そこで、本実施形態では、出荷時に予め求められた位相差情報を測定チップＣ３に添付しておき、さらにその情報を測定時に読み取り、この読み取った情報をＦＧ２１が生成する変調波形に反映させて偏光状態を調整することにより、上記複屈折の位相差を加味し、この位相差と逆の位相差を与えるように測定光の偏光状態を制御することができる。

以上のように、本実施形態に係る光学的測定装置は、特に偏光制御機構と信号処理部とを備えることにより、測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、第１の実施形態と同様の効果を奏する。

さらに、本実施形態に係る光学的測定装置は、特に情報コード４４が添付された測定チップＣ３、情報読取部４３と、および位相差制御部４５とを備え、出荷時に予め求められた位相差情報を測定チップに添付しておき、さらにその情報を測定時に読み取り、この読み取った情報をＦＧ２１が生成する変調波形に反映させることで、上記複屈折の位相差を加味して測定光の偏光状態を制御しているから、複屈折を有する材料からなるプリズム部を備えた測定チップを用いても、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことが可能となる。

また、本実施形態に係る光学的測定方法は、特に測定光の上記界面における偏光方向を変調せしめるように、測定光の偏光状態を制御し、偏光方向の変調に同期した信号成分を信号光から分離検出しているから、プリズム内の不純物に起因する散乱光の影響を排除することができ、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

さらに、本実施形態に係る光学的測定方法は、出荷時に予め求められた位相差情報を測定チップに添付しておき、さらにその情報を測定時に読み取り、この読み取った情報をＦＧ２１が生成する変調波形に反映させることで、上記複屈折の位相差を加味して測定光の偏光状態を制御しているから、上記光学的測定装置と同様の効果を奏する。

（第３の実施形態の設計変更）
上記第３の実施形態では、波長板ではなく情報コードに基づいて直接偏光変調素子を制御し、測定光の流路基材内の伝播中に生じる複屈折の位相差を調整したが、前述した第２の実施形態にあるように、波長板制御部によって波長板を回転制御するようにしてもよい。

１、２、３ 光学的測定装置
１０ 光源
１１ 偏光変調素子（偏光制御機構）
１２、１３ 波長板
１４ 導光部材
２０ 制御部
２１ ファンクションジェネレータ（ＦＧ）（偏光制御機構）
２２ 偏光変調素子ドライバ（偏光制御機構）
２３ 光検出器
２４ 信号処理部
３０ 流路基材（プリズム部）
３２ 蓋部材
３３ 流路
３４ａ・３４ｂ 金属膜
４０ 第２の光検出器
４１ 第２の信号処理部
４２ 波長板制御部
４３ 情報読取部
４４ 情報コード
４５ 位相差制御部
Ａ 被検物質
ＢＦ 蛍光標識結合物質
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ 測定チップ
Ｅｗ 増強電場
Ｌｅ 測定光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｒ 反射光
Ｌｓ 散乱光

Claims (9)

1. 表面プラズモンを利用して試料中の被検物質の有無および／または量を測定する光学的測定装置において、
   測定光を出射する光源と、
   流路を形成する流路基材と、該流路の壁面の一部を構成するプリズム部と、前記流路に接するように形成された該プリズム部上の金属膜を含む検出部とを備える測定チップと、
   前記プリズム部と前記金属膜との界面で前記測定光が全反射条件を満たすように、該プリズム部を通して一方の側から該界面に前記測定光を導光する導光部材と、
   前記測定光の前記界面における偏光方向を変調せしめるように、該測定光の偏光状態を制御する偏光制御機構と、
   前記界面に関して他方の側に配置された、前記検出部から生じる信号光を検出する光検出器と、
   前記偏光方向の変調に同期した信号成分を前記信号光から分離検出する信号処理部とを備えることを特徴とする光学的測定装置。
2. 前記界面における前記測定光の反射光を検出する第２の光検出器を備え、
   前記偏光制御機構が、該第２の光検出器に検出された、前記偏光方向の変調に同期して変調する前記反射光の強度に基づいて、該反射光の強度の最大値に対する最小値の比が最小化するように前記偏光状態を制御するものであることを特徴とする請求項１に記載の光学的測定装置。
3. 情報コードが表示する情報を読み取る情報読取部を備え、
   前記測定チップが、前記測定光が前記プリズム部に入射してから前記界面に到達するまでに該測定光に生じる複屈折の位相差に関する位相差情報を表示する情報コードを備えたものであり、
   前記偏光制御機構が、前記情報読取部により読み取られた前記測定チップの前記情報コードが表示する前記位相差情報に基づいて、前記測定光に前記位相差と逆の位相差が生じるように前記偏光状態を制御するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の光学的測定装置。
4. 表面プラズモンを利用して試料中の被検物質の存在および／または量を測定する光学的測定方法において、
   流路を形成する流路基材と、該流路の壁面の一部を構成するプリズム部と、前記流路に接するように形成された該プリズム部上の金属膜を含む検出部とを備える測定チップを用い、
   前記プリズム部と前記金属膜との界面で測定光が全反射条件を満たすように、該プリズム部を通して一方の側から該界面に前記測定光を導光せしめ、
   前記測定光の前記界面における偏光方向を変調せしめるように、該測定光の偏光状態を制御し、
   前記検出部から生じる信号光を前記界面に関して他方の側から検出し、
   前記偏光方向の変調に同期した信号成分を前記信号光から分離検出し、
   該分離検出された信号成分により、前記被検物質の存在および／または量を測定することを特徴とする光学的測定方法。
5. 前記測定光が前記プリズム部に入射してから前記界面に到達するまでに該測定光に生じる複屈折の位相差と逆の位相差を与えるように、前記偏光状態を制御することを特徴とする請求項４に記載の光学的測定方法。
6. 前記界面における前記測定光の反射光であって、前記偏光方向の変調に同期して変調する前記反射光の強度に基づいて、前記逆の位相差を与えるように前記偏光状態を制御することを特徴とする請求項５に記載の光学的測定方法。
7. 前記測定チップに備えられた、該位相差に関する位相差情報を表示する情報コードに基づいて、前記逆の位相差を与えるように前記偏光状態を制御することを特徴とする請求項５または６に記載の光学的測定方法。
8. 前記検出部から生じる前記信号光として、前記被検物質を標識する標識物質から生じる光を検出することを特徴とする請求項４から７いずれかに記載の光学的測定方法。
9. 前記標識物質が、前記測定光に励起されて蛍光を発する蛍光標識であることを特徴とする請求項８に記載の光学的測定方法。

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