WO2015146437A1 - 高機能性ＩｇＧ２型二重特異性抗体 - Google Patents

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竜太郎 浅野
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    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a humanized highly functional IgG2-type bispecific antibody that is excellent in stability and can be used for cancer-specific immunotherapy, a single-chain polypeptide constituting the same, and a polypeptide encoding the polypeptide
  • the present invention relates to a nucleic acid to be produced, a method for producing the antibody, and a use thereof as a medicine.
  • immunotherapy has been used as a safe treatment for cancer (malignant tumors) and rheumatism.
  • an antibody that specifically shows cytotoxic activity against cancer is used.
  • Antibody drugs composed of such antibodies are recognized as safe and secure with high side effects, low side effects, and high therapeutic effects. On the other hand, it is necessary to produce them using established animal cells. .
  • bispecific antibody which is one of such recombinant antibodies, can specifically bind to two different antigens.
  • a diabody (Dabody) is the smallest unit of such a bispecific antibody.
  • Each heavy chain (H chain) variable region (V region) (represented as “VH”) derived from the same parent antibody.
  • VH and the light chain (L chain) variable region (V region) (represented as "VL") VL was devised by utilizing the property of forming a heterodimer by non-covalent bonds with each other ( Non-patent document 1).
  • the preparation of bispecific antibodies other than diabody-type bispecific antibodies is described in, for example, Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3.
  • the present inventors have so far developed a diabody-type bispecific antibody (Ex3) prepared using an anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 and an anti-CD3 antibody OKT3, and the antibody as a human. It has been found that a typed diabody-type bispecific antibody (hExh3) has an extremely strong antitumor effect (Patent Document 1). Furthermore, highly functional bispecific antibodies having various structures have been developed based on this humanized diabody-type bispecific antibody and the like (Patent Document 2).
  • each polypeptide constituting a humanized diabody-type bispecific antibody is an “LH type” in which the L chain variable region is on the N-terminal side.
  • LH type bispecific antibody A highly functional bispecific antibody including a specific antibody and the LH type bispecific antibody was developed (Patent Document 3).
  • these antibodies having various amino acid mutations and substitutions in the H chain or L chain of the Her1 antibody 528 have also been developed.
  • the high-functional bispecific antibodies described in the above Patent Documents 2 to 5 are added to the variable regions containing the L chain and H chain of anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528 and anti-CD3 antibody OKT3, respectively.
  • the humanized highly functional bispecific antibody having such a structure has a markedly improved cytotoxic activity compared to Ex3 and can bind to each antigen bivalently.
  • Bispecific antibodies with minimal additional sequences are easily prepared and can be easily purified by protein A. Furthermore, a function for inducing effector effects such as induction of antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity and complement-dependent cytotoxicity (CDC) action is newly added.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the bispecific antibody containing the Fc region has very excellent characteristics, but fragmentation occurs near the hinge region at the fusion site between the variable region and the Fc region during storage after purification, etc. This was a problem (Fig. 1). Furthermore, such a highly functional bispecific antibody excessively induces an effector effect via the Fc region, and there are concerns about side effects caused thereby.
  • the LH type highly functional bispecific antibody (Ex3-scDb-Fc LH type) described in Patent Document 3 shows superior activity in i n vitro compared to its HL type, but tumortumestablish model No significant difference was observed in in vivo. Accordingly, there is a demand for further improvement of the functions of such LH type bispecific antibodies.
  • the problem of the present invention is that the bispecific antibody having such a structure retains the function of cytotoxic activity such as an excellent antitumor effect, and the above problems are improved. It is to provide bispecific antibodies.
  • an Fc region derived from an IgG1 subclass is usually used for the purpose of efficiently inducing an effector effect (Non-patent Document 4).
  • Non-patent Document 4 an Fc region derived from an IgG1 subclass is usually used for the purpose of efficiently inducing an effector effect.
  • the present inventor noted that, among the subclasses of the Fc region, IgG2 has a low ability to induce an effector effect, and instead of IgG1, which has been conventionally used as an Fc region, Fc derived from IgG2 has been used. Attempts were made to produce the above-mentioned highly functional bispecific antibody using the region, and as a result, the present invention was completed and the above-mentioned problems were successfully solved.
  • the present invention relates to each aspect shown below.
  • [Aspect 11] Culturing the host cell according to aspect 9 to express the nucleic acid in the host cell, recovering and purifying the single-chain polypeptide according to aspect 4, and associating the obtained single-chain polypeptide; The method for producing an antibody according to any one of embodiments 1 to 4, wherein the formed antibody is separated and recovered.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of embodiments 1 to 4 as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition according to aspect 12 characterized in that it is for eliminating, killing, injuring and / or reducing tumor cells.
  • the antibody of the present invention showed no difference in antigen-binding property and a decrease in the ability to proliferate against PBMC, compared with the conventional antibody of the same type having an Fc region derived from IgG1.
  • the cytotoxic activity when T-LAK was used as an effector cell, the same level of activity was observed, but when PBMC was used, what was expected from the decrease in proliferation ability against PBMC?
  • the antibody of the present invention showed higher cytotoxic activity.
  • the activation ability against T cells an unexpected result was obtained that the antibody of the present invention was lower for T-LAK but higher for PBMC as compared to conventional antibodies of the same type. It was.
  • the antibody of the present invention showed a higher tumor growth inhibitory effect than the conventional antibody of the same type.
  • PBMC also contains Fc receptor (FcR) -positive NK cells that play a role in effector effects.
  • FcR Fc receptor
  • the ability to bind to FcR In the conventional antibody of the same type having, the action of lymphocytes is inhibited by steric hindrance due to binding with NK cells.
  • the same reason can be considered in the in vivo test because the mouse used has NK cells that cross-react with the human Fc region.
  • the antibody of the present invention showed excellent stability as compared with a conventional antibody of the same type having an Fc region derived from IgG1.
  • the results of the evaluation of cytokine secretion induction ability are shown.
  • the amino acid sequence in the hinge region of IgG1 and IgG2 is shown.
  • the result of Proliferation assay using T-LAK is shown.
  • the result of T cell activation inducing ability evaluation by FCM is shown.
  • the result of stability evaluation of Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 is shown.
  • the result of the in vivo test of Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 is shown.
  • the antibody of the present invention comprises, as basic components, an L-chain humanized variable region (5L: SEQ ID NO: 2) and an H-chain humanized variable region (anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528).
  • 5H: SEQ ID NO: 4 variable region including anti-CD3 antibody OKT3 human chain variable region (OL: SEQ ID NO: 6) and human chain variable region of heavy chain (OH: SEQ ID NO: 8), hinge region
  • OL anti-CD3 antibody OKT3 human chain variable region
  • OH human chain variable region of heavy chain
  • the “Fc region” means a region including two domains (CH2 and CH3) on the C-terminal side of the H chain constituting the constant region (C region) and a hinge part.
  • the antibody of the present invention has a human Fc region, it can be easily purified by protein A, and induces antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity and complement-dependent cytotoxicity (CDC) action. I can do it.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • bispecific antibody of the present invention containing such components
  • various types of antibodies can be prepared.
  • a high-functional bispecific antibody that is a normal IgG type antibody molecule described as the second type (Ex3-Fc) and the third type (Ex3 scDb-Fc).
  • Specific antibodies can be mentioned.
  • the L chain constant region (CL) and H chain constant region (CH1) contained in the fourth type bispecific antibody of the present invention are not particularly limited as long as they are derived from human antibodies.
  • CL may be derived from either ⁇ or ⁇ chain.
  • CH1 those usually derived from the ⁇ chain of IgG are used.
  • CH1 and CL include those having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 33 disclosed in Patent Document 2, respectively.
  • the second type (Ex3-Fc) is a humanized diabody-type bispecific antibody (Ex3) composed of two kinds of OH5L and 5HOL polypeptides.
  • Ex3 a humanized diabody-type bispecific antibody
  • Ex3 composed of two kinds of OH5L and 5HOL polypeptides.
  • Ex3 is bound to two Fc regions of a human antibody via a hinge region. That is, specifically, one of two polypeptides constituting Ex3 bound to the Fc region of a human antibody via a hinge region (for example, (5HOL) -hinge region-Fc region), And it is comprised from 2 types of polypeptide of another polypeptide (for example, (OH5L)) which comprises Ex3.
  • the antibody can be produced by co-expressing these two types of single-chain polypeptides and then associating them.
  • either the 5HOL or OH5L polypeptide can be bound to the Fc region of a human antibody via the hinge region, and the H chain variable region or L Any of the chain variable regions may be bound to the hinge region.
  • Ex3 scDb that is, OH5L and 5HOL, which are two types of polypeptide chains constituting Ex3, are further used as peptide linkers instead of Ex3 in the second type.
  • a single polypeptide chain represented by (OH5H)-(peptide linker)-(5LOL), or a single polypeptide chain represented by (OH5H)-(peptide linker)-(5LOL), or (OH5L)-(peptide linker)-(5HOL) 5L5H)-(peptide linker)-(OHOL) has a structure in which a tandem single polypeptide chain is bound to the Fc region of a human antibody via a hinge region.
  • any of the two types of H chain variable regions or L chain variable regions contained in the above single chain polypeptide may be bound to the hinge region.
  • the number of domains constituting the second type and the third type is the same as that of an IgG type immunoglobulin molecule, and these antibodies are considered to have a three-dimensional structure close to the immunoglobulin molecule. It is done. Further, in the second type (ii) and third type (iii) of these BsAbs of the present invention, these BsAbs are digested with protease by interposing a protease cleavage site between Ex3 or Ex3 scDb and the hinge region. Thereafter, Ex3 or Ex3 scDb can be easily produced by appropriately performing various purification operations described later. Further, Ex3 or Ex3 scDb obtained by such protease digestion shows higher cytotoxic activity than that produced by the conventional method.
  • the VH and VL of the antibody are respectively converted into the humanized variable regions of the H chain and L chain of the anti-human epidermal growth factor receptor antibody 528, respectively.
  • the antibody is composed of two types of single-chain polypeptides of polypeptides formed by binding the other scFv to the N-terminal side of the constant region CL. Note that either the H chain variable region or the L chain variable region contained in the scFv may be bound to these regions. Accordingly, the antibody can be produced by co-expressing these two (single chain) polypeptides and then associating them.
  • the L chain variable region as described in Non-Patent Document 3 is on the N-terminal side of the H chain variable region (LH type).
  • LH type H chain variable region
  • Various antibodies characterized by the above are also included in the present invention. That is, for example, as an example of such LH type in the third type (Ex3 scDb-Fc), it is represented by (OL5H)-(peptide linker)-(5LOH), which is described in the examples of this specification.
  • a structure in which a single polypeptide chain having a structure is bound to the Fc region of a human antibody via a hinge region.
  • the single-chain polypeptide constituting the antibody of the present invention can include, for example, amino acid sequences such as a PreScission sequence, a peptide linker, and a signal peptide disclosed in FIGS. 3-3 and 3-4 of Patent Document 2.
  • the PreSission sequence is a sequence containing a protease cleavage site.
  • protease there are no particular limitations on the type of protease to be used.
  • enzymes known to those skilled in the art such as Thrombin and FactorFXa can be used, and an amino acid sequence including a protease cleavage site can be appropriately selected accordingly. .
  • a protease cleavage site such as a PreSission sequence is not included.
  • Anti-EGFR antibody (528 antibody) -producing mouse B cell hybridoma 528 has been deposited with the Medical Cell Resource Center attached to the Research Institute for Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0555). Further, the hybridoma producing the 528 antibody is stored as ATCC No. HB-8509 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • a hybridoma producing the anti-CD3 antibody OKT3 has been deposited with the Medical Cell Resource Center attached to the Institute of Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0235).
  • the hybridoma producing the OKT3 antibody is stored as ATCC No. CRL-8001 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • cDNA can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted using ISOGEN (Nippon Gene), cDNA is prepared by First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences), and reference paper (Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)) PCR was performed using the cloning primers synthesized to determine the sequence of the variable regions of these antibodies. can do.
  • “Humanization” of the variable region contained in the single-chain polypeptide constituting the bispecific antibody of the present invention means the complementarity-determining region in the humanized variable region of human immunoglobulin (recipient antibody) ( complementarity-determining (region) (CDR) is a non-human animal (donor antibody) such as a mouse, rat, or rabbit and has the desired specificity, affinity, and ability at least in part An antibody that is substituted by a residue.
  • human immunoglobulin Fv framework (FR) residues may be replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may comprise residues that are not found in either the recipient antibody and the introduced CDR sequences or framework sequences. These modifications are made to further improve or optimize the antibody performance.
  • ⁇ ⁇ Humanization of such antibody humanized variable regions can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • humanized antibodies are prepared by analyzing various conceptual humanized products using a three-dimensional immunoglobulin model of recipient and donor antibodies. Three-dimensional immunoglobulin models are well known to those skilled in the art.
  • WO92 / 22653 and the like can be referred to.
  • humanized humanized variable regions include antibodies in which the complementarity determining region (CDR) in the humanized variable region is derived from a mouse antibody and the other part is derived from a human antibody. it can.
  • CDR complementarity determining region
  • an appropriate site in the single-chain polypeptide for example, a framework (FR) that may affect the CDR structure.
  • the function of the humanized antibody can be improved by causing site-specific mutations in the middle part, for example, canonical or vernier sequences.
  • humanization of the 528 humanized variable region was performed by the CDR-grafting method.
  • VH and VL homology searches are performed, and the human antibody sequence having the highest homology FR (frame work) is selected in consideration of the length of each CDR (complementarity determining region). It is preferable to design the amino acid sequence by replacing the CDR of the selected human antibody with the CDR of 528, and for the corresponding codon, it is preferable to use the optimal codon of the host cell used for expression as before, and the gene by the overlap PCR method The total synthesis of can be performed.
  • humanized OKT3 humanized variable regions have already been reported and have been confirmed to retain sufficient activity compared to mouse OKT3 (Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994)).
  • total synthesis of the gene was performed by the overlap PCR method. In this case, it is preferable to use an optimal codon in the host cell, and an increase in the expression level in the host cell by using a total synthetic gene substituted with the optimal codon has already been reported.
  • each L-chain variable region fragment and H-chain variable region fragment are preferably connected by an appropriate peptide linker.
  • the peptide linker makes it difficult for single-chain antibodies to interact with each other in the molecule, and allows the formation of multimers by a plurality of single-chain antibodies, and as a result, VHs derived from different single-chain antibodies.
  • VL are appropriately associated, so that the function of the original protein (the polypeptide is derived from the original protein or derived from the original protein), for example, part of biological activity or It is not particularly limited as long as it can take a structure that simulates or promotes all of them, and for example, it is selected from those widely known in the art or modified from the known linker. Is possible.
  • the peptide linker is preferably 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 2 to 10 amino acids in length.
  • each single-chain polypeptide may not include the peptide linker described above, and two variable region fragments may be directly linked.
  • one of the C-terminals of the variable region fragment on the N-terminal side in each single-chain polypeptide in order to increase the three-dimensional degree of freedom of each single-chain antibody and promote multimerization, one of the C-terminals of the variable region fragment on the N-terminal side in each single-chain polypeptide. It is preferable that one to several amino acids or one to several amino acids at the N-terminal of the variable region fragment on the C-terminal side have been removed.
  • amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs one or several (for example, 2 to 5) amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and the original amino acid sequence
  • amino acid sequence substantially retaining the function and activity of the polypeptide consisting of, for example, the antigen specificity of the variable region fragment can also be used as the polypeptide of the single chain antibody constituting the antibody of the present invention.
  • amino acids that are deleted, substituted, inserted or added are preferably substituted for homologous amino acids (polar / nonpolar amino acids, hydrophobic / hydrophilic amino acids, positive / negative charged amino acids, aromatic amino acids, etc.), Alternatively, it is preferable that amino acid deletion or addition does not cause a significant change in the three-dimensional structure and / or local charge state of the protein or that they are not substantially affected.
  • Polypeptides having such deleted, substituted or added amino acids include, for example, site-directed mutagenesis methods (such as point mutagenesis and cassette mutagenesis), gene homologous recombination methods, primer extension methods, and It can be easily prepared by appropriately combining methods known to those skilled in the art such as PCR.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, with respect to the total length of the original amino acid sequence. It can also be said to show sequence homology (identity).
  • a typical example of a nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding each region contained in a single-chain polypeptide contained in each antibody of the present invention has the base sequence shown in each of the above SEQ ID NOs.
  • a nucleic acid molecule comprising such a base sequence that exhibits a sequence homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more with the entire length of the base sequence described in each SEQ ID NO.
  • these nucleic acid molecules are also included in the above-described nucleic acids of the present invention because they are considered to encode polypeptides having substantially the same activity or function as the sequences.
  • Such a nucleic acid molecule contains a base sequence encoding at least one of two kinds of single-chain polypeptides constituting the bispecific antibody of the present invention. It is preferable that both types of base sequences are included in the two types encoding the present polypeptide.
  • sequence homology between two amino acid sequences or base sequences are pre-processed in an optimal state for comparison. For example, by making a gap in one sequence, the alignment with the other sequence is optimized. Thereafter, the amino acid residues or bases at each site are compared. When the same amino acid residue or base as the corresponding site in the second sequence is present at a site in the first sequence, the sequences are identical at that site. Sequence homology between the two sequences is expressed as a percentage of the total number of sites (all amino acids or all bases) of the number of sites that are identical between the sequences.
  • homology means each amino acid residue constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). Means the number (number) of things that can be determined to be the same in the matching relationship between comrades or bases, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences Is. Homology can be easily calculated. Many methods are known for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term “homology” is well known to those skilled in the art (eg, Lesk, A. M.
  • Preferred methods for measuring homology include those designed to obtain the largest match between the two sequences being tested. An example of such a method is one assembled as a computer program.
  • Preferred computer programming methods for measuring the homology between two sequences include GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)), etc., but are not limited thereto, and methods known in the art are used. be able to.
  • each nucleic acid molecule described above hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. It includes DNA encoding a polypeptide having substantially the same function and activity as the polypeptide.
  • hybridization can be carried out according to a method known in the art or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • stringent conditions in DNA hybridization are defined by an appropriate combination of salt concentration, organic solvent (for example, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is reduced, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • “stringent conditions” means that the degree of homology between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. It means that the hybrid is specifically formed only between base sequences having high homology.
  • the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C.
  • hybridization is performed under conditions of 5 SSC (750 mM NaCl, 75 mM ⁇ trisodium citrate), 1% SDS, 5 x Denhardt solution 50% formaldehyde, and 42 ° C. Washing is carried out under the conditions of 0.1 x SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate), 0.1% SDS, and 55 ° C.
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding a variable region fragment in each single-chain polypeptide is prepared, it can be totally synthesized by an overlap PCR method based on a previously designed amino acid sequence.
  • nucleic acid is a molecule that encodes a single-chain polypeptide, its chemical structure and acquisition route are not particularly limited, and include, for example, gDNA, cDNA, chemically synthesized DNA, mRNA, and the like. is there.
  • telomere can be isolated from a cDNA library by hybridization based on the sequence described in the literature, or by the polymerase chain reaction (PCR) technique.
  • the DNA is placed in an expression vector, which is then placed in an E. coli (C. coli) cell, COS cell, Chinese hamster ovary cell (CHO cell), or myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • E. coli C. coli
  • COS cell COS cell
  • CHO cell Chinese hamster ovary cell
  • myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • a host cell can be transfected and a monoclonal antibody synthesized in the recombinant host cell.
  • the PCR reaction can be carried out by a method known in the art or a method or modification method substantially similar thereto, for example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can also be performed according to a protocol clarified by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • nucleic acid encoding the single-chain polypeptide constituting the antibody of the present invention or each region contained in the antibody thus obtained may appropriately encode a desired peptide or amino acid according to the purpose by means known to those skilled in the art.
  • modification of a nucleic acid means insertion, deletion or substitution of a base in at least one codon encoding an amino acid residue in the obtained original nucleic acid.
  • altering the amino acid sequence itself constituting a single-chain polypeptide by replacing a codon encoding an original amino acid residue with a codon encoding another amino acid residue.
  • a nucleic acid encoding a single-chain polypeptide can be modified so that a codon (optimum codon) suitable for a host cell such as a CHO cell is used without changing the amino acid itself.
  • a codon optimum codon
  • a host cell such as a CHO cell
  • the antibody of the present invention can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, various means such as genetic engineering techniques or chemical synthesis.
  • genetic engineering techniques for example, a replicable cloning vector or expression vector containing a nucleic acid encoding the polypeptide of each single-chain antibody constituting the bispecific antibody is prepared, and this vector is used as a host.
  • replicable expression vector and “expression vector” refer to a piece of DNA (usually double-stranded), in which the DNA contains Can be inserted with foreign DNA fragments.
  • Foreign DNA is defined as heterologous DNA, which is a DNA that is not found naturally in the subject host cell.
  • Vectors are used to carry foreign or heterologous DNA strands into appropriate host cells. Once in the host cell, the vector can replicate independently of the host chromosomal DNA cage, and several copies of the vector and its inserted (foreign) DNA cage can be generated.
  • the vector contains the elements essential to allow translation of the foreign DNA into a polypeptide. Thus, many molecules of polypeptides encoded by foreign DNA can be synthesized rapidly.
  • Such vectors are operably linked to an appropriate control sequence so that the DNA sequence is expressed in an appropriate host (ie, to allow expression of foreign DNA). It means a “DNA construct” containing the determined DNA sequence.
  • control sequences include a promoter for transcription transcription, any operator sequence to control such transcription, sequences encoding appropriate mRNA ribosome binding sites, enhancers, reardenylation sequences, and transcription and translation. (translation) An array for controlling the end of the cage can be mentioned.
  • the vector can appropriately contain various sequences known to those skilled in the art, for example, restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences, and the like as necessary.
  • sequences or elements can be appropriately selected and used by those skilled in the art depending on conditions such as the type of foreign DNA, the host cell used, the culture medium, and the like. Further, for the purpose of facilitating the detection and purification of the produced single-chain polypeptide, a sequence encoding various peptide tags known to those skilled in the art (for example, c-myc tag and His-tag) is added. It can be included at the end of the sequence corresponding to this polypeptide.
  • the vector can be in any form such as a plasmid, a phage particle, or simply a genomic insert. Once introduced into a suitable host by transformation, the vector can replicate or function independently of the resident genome. Alternatively, the vector may be one that is integrated into the genome.
  • any cell known to those skilled in the art can be used.
  • typical host cells include prokaryotic cells such as E. coli and Chinese hamster ovary cells (CHO cells).
  • Mammalian cells such as rabbits and human-derived cells, and eukaryotic cells such as yeast and insect cells.
  • the transformed bacteria can be cultured under any mortgage conditions and methods known to those skilled in the art.
  • a single-chain polypeptide obtained by such expression in a host cell is generally recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, but if it is produced directly without a secretion signal, the host It can be recovered from cell lysates. If the single-chain polypeptide is membrane-bound, it can be released from the membrane using a suitable detergent (eg, Triton-X100).
  • a suitable detergent eg, Triton-X100
  • the purification operation can be performed by appropriately combining methods known to those skilled in the art. For example, after performing chemical modification such as PEGylation as necessary, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, cross flow concentration, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, fractionation on an ion exchange column, ethanol precipitation, Suitable for purification by reverse phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin sepharose, anion or cation resin chromatography (such as polyaspartic acid columns), chromatofocusing, SDS-PAGE, and affinity chromatography .
  • Affinity chromatography is one of the preferred purification techniques with high efficiency utilizing the affinity with a peptide tag of a single-chain polypeptide.
  • the purification operation is preferably performed after the single-chain polypeptide is solubilized and denatured.
  • This solubilization treatment can be performed using any agent known to those skilled in the art as a dissociator such as alcohols such as ethanol, various reagents, guanidine hydrochloride, urea and the like.
  • the antibodies of the present invention can be produced by associating (unwinding) the same or two kinds of single-chain polypeptides purified in this way and separating and recovering the formed antibodies.
  • the association treatment means that a single single-chain polypeptide is returned to a state having a desired biological activity by returning it to an appropriate spatial arrangement. Therefore, the association treatment also has the meaning of returning the polypeptides or domains to the associated state, so it can also be referred to as “reassociation”, and in the sense of having the desired biological activity. It can also be called reconstruction, or it can be called refolding.
  • the association treatment can be performed by any method known to those skilled in the art. For example, the concentration of the denaturing agent (for example, guanidine hydrochloride) in the buffer solution containing the single-chain polypeptide is decreased stepwise by, for example, dialysis. The method is preferred.
  • the antibody of the present invention can be prepared from, for example, a culture medium supernatant of a cultured host cell, a periplasma fraction, a intracellular soluble fraction, or a bacterial insoluble fraction.
  • a vector of the present invention by using a co-expression vector containing both nucleic acid molecules corresponding to the single-chain polypeptide constituting the antibody of the present invention, or a nucleic acid molecule encoding each of the single-chain polypeptides
  • the same host cell is transformed with the expression vector, and each single-chain polypeptide is expressed in the transformed bacterium, and then an antibody molecule is formed, which is prepared from the culture medium supernatant or soluble fraction of the cultured host cell. Is possible. Therefore, in such a case, the above-described association (rewinding) process becomes unnecessary, and high productivity can be obtained at low cost.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by containing as an active ingredient a substance selected from the group consisting of the antibody of the present invention, a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell.
  • a substance selected from the group consisting of the antibody of the present invention a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell.
  • such an active ingredient has an action of significantly eliminating, killing, or damaging (positive) tumor cells expressing the epidermal growth factor receptor in vitro and in vivo. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antitumor agent against such tumor cells.
  • the effective amount of the active ingredient of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the type of tumor, the site and size of the subject to be administered, various conditions of the patient, the administration route, and the like.
  • a typical single dose or daily dose will depend on the above conditions and, if possible, first in vitro and then, for example, using assays known in the art for tumor cell survival or growth.
  • appropriate dose ranges can be determined with appropriate animal models that can extrapolate dose ranges for human patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically acceptable pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method / purpose, and pathological condition of the administration target.
  • Components eg, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (liposome, microemulsion, etc.), macroemulsion, etc., depending on the above various conditions.
  • colloidal distribution system liposome, microemulsion, etc.
  • macroemulsion etc.
  • administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, in particular intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations. It is done.
  • the active substances according to the invention can be administered continuously by infusion or by bulk injection.
  • Sustained release formulations are generally of a form from which the active substance of the present invention can be released for a period of time, and suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymers containing proteins.
  • a semipermeable carrier is included, which is in the form of a molded product, such as a film or microcapsule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by methods known to those skilled in the art, for example, the Japanese Pharmacopoeia Manual Editorial Committee, 13th revision, Japanese Pharmacopoeia Manual, issued on July 10, 1996, Yodogawa Shoten Co., Ltd. In view of the description, it can be appropriately selected and manufactured from among them.
  • Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 was constructed by modifying the structure of Ex3-scDb-Fc LH type hinge and Fc region from conventional IgG1 to IgG2, which has low binding ability to FcR and complement. Thus, the effect of the binding ability to FcR and complement on the cytotoxicity was verified.
  • mRNA was extracted from PBMC using a method known to those skilled in the art, and cDNA was synthesized. Using this cDNA, gene amplification by PCR was performed with a primer covering the Fc region from the hinge region of the human IgG2 sequence, and inserted into the pRA vector to obtain pRA IgG2 hinge-Fc. As a result of confirmation of the sequence, a gene completely identical to the human IgG2 gene sequence (BX640623.1) of GenBank, a gene data bank, was obtained. The base sequence containing the hinge region and Fc region (CH2 and CH3) of the human IgG2 sequence obtained in this way is shown in SEQ ID NO: 9.
  • PCR was performed twice using the obtained pRA IgG2 hinge-Fc and pcDNA Ex3-scDb-Fc LH types (prepared according to Example 2 of Patent Document 3) as a template, and digested with BamHI and XhoI.
  • pcDNA3-Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 was prepared (Fig. 2). The primers and conditions used are shown below.
  • pRA IgG2 hinge-Fc (Template: mRNA extract, annealing temperature: 55 ° C, extension time: 60 sec) back primer: NcoI-IgG2 hinge Sequence number 10: 5'-NNNCCATGGTGTTGTGTCGAGTGCCCACC -3 ' forward primer: IgG2 Fc-SacII Sequence number 11: 5'-NNN CCGCGG TCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3 '
  • PreScDNA Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 1st PCR (Template: pRA IgG2 hinge-Fc, annealing temperature: 55 ° C, extension time: 60 sec) back primer: PreScission-IgG2 hinge SEQ ID NO: 12 : 5'- CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC TGTTGTGTCGAGTGCCCACC -3 ' forward primer : CH3-XhoI Sequence number 13: 5'-NNNCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3 '
  • cloning was performed by limiting dilution, and ELISA was performed using the supernatant (FIG. 4).
  • clones 52, 59, 104, 111, 171, 198, 341, 343, 366, 468, 470, 476 which had a particularly high value and formed only colonies derived from one cell, were selected. Selected and expanded using 12-well plates. A solution obtained by diluting the culture supernatant 10 to 100 times was prepared, and ELISA was performed again to select clones 366 and 470 having high values in the stock solution and 10-fold dilution (FIG. 5). ELISA was performed using a Human IgG ELISA Quantitation Kit (BETHYL).
  • Clone 366 and 470 obtained by preparation of Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 were cultured using a triple flask, respectively, and protein A was purified from the medium supernatant.
  • protein A was purified from the medium supernatant.
  • a band was obtained in the elution fraction, so the purification was confirmed (FIG. 6). Since the yield after purification was 0.6 mg / L for clone 366 and 0.9 mg / L for clone 470, clone 470 was used in the purification confirmation and subsequent assays.
  • the HL-type Ex3-scDb-Fc and LH-type Ex3-scDb-Fc used as comparative controls in the examples in the present specification are the antibodies described in Patent Document 2 and Patent Document 3, respectively. It is an antibody containing an IgG1-derived polypeptide as the Fc region.
  • Ex3-scDb-Fc LH-type IgG2 has a decreased activation ability against T-LAK, which also affects the ability to induce proliferation against T-LAK.
  • Proliferation assay was performed by the above method using T-LAK (FIG. 13). As a result, a decrease in proliferation ability was confirmed as compared with Ex3-scDb-Fc LH type.
  • Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 was added to PBMC was evaluated by the above FCM (FIG. 14).
  • LH type IgG2 showed higher expression of CD69.
  • Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 has the ability to activate Ex3-scDb-Fc LH type due to hinge problems as described above when T cells alone exist like T-LAK.
  • the Fc region of the antibody of the present invention is derived from IgG2, which has low binding to FcR. It is thought that it bound only to T cells without receiving and promoted higher activation.
  • Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 Ex3-scDb-Fc has a problem of fragmentation that is cleaved near the hinge. Therefore, with respect to LH-type Ex3-scDb-Fc IgG1 (the antibody described in Patent Document 3) and Ex3-scDb-Fc LH-type IgG2, which is the antibody of the present invention, samples after purification by gel filtration chromatography are passed for a certain period of time. Then, the presence or absence of fragmentation was confirmed by performing gel filtration chromatography again, and the stability of each antibody was evaluated. In order to eliminate the influence of factors (proteases and the like) produced from microorganisms, the purified sample was subjected to filter sterilization treatment and subjected to experiments. The result is shown in FIG.
  • the LH type Ex3-scDb-Fc IgG1 shows considerable fragmentation after 6 months
  • the Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 which is the antibody of the present invention, has passed after such a long period of time.
  • Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 in vivo test Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 in vivo test using tumor-bearing mice (Protein Eng Des Sel. 2013 May; 26 (5 ): 359-67) (FIG. 13).
  • TFK-1 5 ⁇ 10 6
  • T-LAK 1 ⁇ 10 7
  • Ex3-scDb-Fc showed stronger tumor growth inhibitory activity than the commercially available anti-EGFR antibody drug Cetuximab, and Ex3-scDb-Fc LH type IgG2 showed a significantly stronger effect than IgG1. .
  • the present invention uses a polypeptide derived from IgG2 for the FC region, thereby suppressing side effects due to reduced effector function and avoiding steric hindrance.
  • the development of the next-generation antibody drug will be accelerated and greatly contributed by improving and further providing a technology for stably maintaining its function over a long period of time.

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Abstract

【課題】　優れた抗腫瘍効果等の細胞傷害活性の機能を保持しつつ、更に、機能が向上した高機能性二重特異性抗体、特に、ＬＨ型二重特異性抗体を提供することである。 【解決手段】　抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ：配列番号２）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ：配列番号４）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ：配列番号６）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ：配列番号８）を含む可変領域、ヒンジ領域、並びに、Ｆｃ領域を含む、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１及びＣＤ３に対する二重特異性抗体であって、該Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ２サブクラスに由来することを特徴とする、前記抗体等。

Description

高機能性ＩｇＧ２型二重特異性抗体
　本発明は、安定性に優れ、がん特異的免疫療法に使用することのできるヒト型化高機能性IgG2型二重特異性抗体、それを構成する一本鎖ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該抗体の製造方法、及び、それらの医薬として用途等に関する。
　がん（悪性腫瘍）及びリウマチ等に対する安全な治療法として、近年、免疫療法が用いられている。がんに対する免疫療法では、がんに対して特異的に細胞傷害活性を示す抗体が使用される。このような抗体から成る抗体医薬は、副作用の少ない、安心安全で治療効果の高いことが認められる一方、確立された動物細胞を用いて製造する必要があるためにコスト高が問題となっている。
　このため、投与量を大幅に軽減して低コスト化を計る手段として、極めて強力な活性を有する組換え抗体の作製が試みられてきた。
　例えば、このような組換え抗体のうちの一つである二重特異性抗体(Bispecific Antibody:BsAb)は２つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生かして特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての利用法が可能であるとして、その研究が盛んに行われている。ダイアボディ（diabody:Db）とはこのような二重特異性抗体の最小単位であり、それぞれ同じ親抗体由来の重鎖（H鎖）の可変領域（V領域）（「VH」と表わされる）VHと軽鎖（L鎖）の可変領域（V領域）（「VL」と表わされる）VLとが互いに非共有結合によりヘテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたものである（非特許文献１）。又、ダイアボディ型二重特異性抗体以外の二重特異性抗体の調製等は、例えば、非特許文献２及び非特許文献３記載されている。
　本発明者等は、これまでに、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を用いて作製したダイアボディ型二重特異性抗体(Ex3)及び該抗体をヒト型化したダイアボディ型二重特異性抗体(hExh3)が極めて強力な抗腫瘍効果を有していることを見出している（特許文献１）。更に、このヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体等に基づき多様な構造を有する高機能性二重特異性抗体を開発している（特許文献２）。
更に、本発明者は、ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体を構成する各ポリペプチドにおいてＬ鎖可変領域がＮ末側にある「ＬＨ型」であることを特徴とするＬＨ型二重特異性抗体及び該ＬＨ型二重特異性抗体を含む高機能性二重特異性抗体を開発した（特許文献３）。又、Ｈｅｒ１抗体５２８のＨ鎖又はＬ鎖に各種のアミノ酸変異・置換を有するこれらの抗体（特許文献４及び特許文献５）も開発した。
　上記特許文献２～５に記載された高機能性二重特異性抗体は、夫々、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖及びＨ鎖を含む可変領域に加えてＦｃ領域を含む、二重特異性抗体である。このような構造を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体は、Ex3に比べて細胞傷害活性が格段に向上し、各抗原に対して二価で結合可能であり、プロテアーゼ消化によりTag等の付加配列を最小限にした二重特異性抗体が容易に調製され、プロテインAによる簡易精製が可能となる。更に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）作用の誘導等のエフェクター効果を誘導する機能が新たに付与される。
特許第３８０３７９０号明細書 国際公開第WO2007/108152号パンフレット 国際公開第WO2010/109924号パンフレット 国際公開第WO2011/062112号パンフレット 国際公開第WO2012/020622号パンフレット
Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 Alt M, et. al. Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma1 Fc or  CH3 region. FEBS Lett., 454, 90-4. (1999) Lu D, et. al. A fully human recombinant IgG-like bispecific antibody to both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor for enhanced antitumor activity. J Biol Chem., 280, 19665-72. (2005) J Biol Chem. 2005:280 (20)19665-72
上記のように、Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体は非常に優れた特性を有するが、精製後の保存中等に可変領域とＦｃ領域等との融合部位にあるヒンジ領域近傍で断片化が生じることが問題となっていた（図１）。更に、このような高機能性二重特異性抗体はＦｃ領域を介してエフェクター効果を過剰に誘導し、それによる副作用が懸念されている。
　特に、特許文献３に記載された、ＬＨ型高機能性二重特異性抗体（Ex3-scDb-Fc　LH型）はi n vitroにおいてそのＨＬ型に比べて優れた活性を示すが、tumor establishモデル等のin vivoにおいては有意な差は見られていない。従って、このようなＬＨ型二重特異性抗体に関して、更なる機能の向上が求められている。
　本発明の課題は、このような構造を有する二重特異性抗体において、優れた抗腫瘍効果等の細胞傷害活性の機能を保持しつつ、上記の問題点が改善された、臨床上、より優れた二重特異性抗体を提供することである。
　当該技術分野において、Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体を作製する場合には、エフェクター効果を効率的に誘導する目的で、通常、ＩｇＧ１サブクラスに由来するＦｃ領域が用いられる（非特許文献４）。しかしながら、本発明者は、Ｆｃ領域のサブクラスの中で、ＩｇＧ２はエフェクター効果の誘導能が低いことに着目して、従来からＦｃ領域として通常使用されてきたＩｇＧ１に代えて、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域を使用して上記の高機能性二重特異性抗体の作製することを試み、その結果、本願発明を完成させて上記課題を解決することに成功した。
　即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
[請求項１]
抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ：配列番号２）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ：配列番号４）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ：配列番号６）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ：配列番号８）を含む可変領域、ヒンジ領域、並びに、Ｆｃ領域を含む、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１及びＣＤ３に対する二重特異性抗体であって、該Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ２サブクラスに由来することを特徴とする、前記抗体。
[態様２]
各ポリペプチドにおいて、Ｌ鎖可変領域がＨ鎖可変領域のＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とする、態様１記載の抗体。
[態様３]
ＩｇＧ型タイプの免疫グロブリン分子と同じドメイン数を有する、態様１又は２に記載の抗体。
[態様４]
（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）で示される構造を有するシングルポリペプチド鎖がヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合した構造を有している、態様３に記載の抗体。
[態様５]
態様１～４のいずれか一項に記載された抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
[態様６]
態様５記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
[態様７]
態様６記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
[態様８]
プラスミドベクターである、態様７記載のベクター。
[態様９]
態様７又は８記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[態様１０]
哺乳動物細胞である態様９記載の宿主細胞。
[態様１１]
態様９記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、態様４に記載の一本鎖ポリペプチドを回収し、精製し、得られた該一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体を分離・回収することを特徴とする、態様１～４のいずれか一項に記載の抗体の製造方法。
[態様１２]
態様１～４のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
[態様１３]
腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする態様１２記載の医薬組成物。
　本発明の抗体は、ＩｇＧ１に由来するＦｃ領域を有する従来の同型の抗体と比較して、抗原への結合性には違いが見られず、ＰＢＭＣに対する増殖能には低下が見られた。
　しかしながら、細胞傷害活性に関して、エフェクター細胞としてT-LAKを使用した場合には同程度の活性が見られたものの、ＰＢＭＣを使用した場合には、ＰＢＭＣに対する増殖能の低下から予想される結果とは異なり、驚くべきことに、本発明抗体の方がより高い細胞傷害活性を示した。
　又、Ｔ細胞に対する活性化能についても、従来の同型の抗体と比較して、T-LAKに対しては本発明抗体の方が低いがＰＢＭＣに対しては高い、という予想外の結果が得られた。
　さらにin vivo試験においても、従来の同型の抗体と比較して、本発明抗体の方がより高い腫瘍の成長抑制効果を示した。
　この理由の一つとして、PBMCにはエフェクター効果の担い手となるFcレセプター(FcR)陽性のＮＫ細胞も含まれており、PBMC中におけるリンパ球とＮＫ細胞との共存下では、ＦｃＲへの結合能を有する従来の同型の抗体では、ＮＫ細胞との結合による立体障害によりリンパ球の作用が阻害されていることが挙げられる。in vivo試験においても、用いたマウスはヒトのFc領域との交差反応があるNK細胞を有しているため、同様の理由が考えられる。
　更に、本発明の抗体は、ＩｇＧ１に由来するＦｃ領域を有する従来の同型の抗体と比較して、優れた安定性を示した。
LH型 Ex3-scDb-Fcの断片化の一例を示す。 Ex3-scDb-Fc LH型IgG2発現ベクターの構築を示す。 FCMによる発現確認の結果を示す。 ELISAによるクローニング (480クローン)の結果を示す。 ELISAによるクローニング (12クローン) の結果を示す。 プロテインA精製の結果を示す。 ゲルろ過クロマトグラフィー精製の結果を示す。 PBMCを用いたProliferation assayの結果を示す。 MTS assayによる細胞傷害性評価の結果を示す。 サイトカイン分泌誘導能評価 (がん細胞＋T-LAKのみ) の結果を示す。 サイトカイン分泌誘導能評価 (T-LAKのみ) の結果を示す。 IgG1とIgG2のヒンジ領域におけるアミノ酸配列を示す。 T-LAKを用いたProliferation assayの結果を示す。 FCMによるT細胞活性化誘導能評価の結果を示す。 Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の安定性評価の結果を示す。 Ex3-scDb-Fc LH型IgG2のin vivo試験の結果を示す。
　本発明の抗体は、基本的な構成要素として、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ：配列番号２）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ：配列番号４）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ：配列番号６）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ：配列番号８）を含む可変領域、ヒンジ領域、並びに、ヒトＩｇＧ２サブクラスに由来するＦｃ領域を含む。その結果、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１及びＣＤ３に対する二重特異性を有する。尚、「Ｆｃ領域」とは、定常領域（Ｃ領域）を構成するＨ鎖のＣ末端側の２個のドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）及びヒンジ部を含む領域を意味する。
　本発明の抗体は、ヒトＦｃ領域を有しているために、プロテインＡによる精製が容易であり、又、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）作用を誘導することが出来る。
　更に、Ｆｃ領域としてヒトＩｇＧ２サブクラスに由来するポリペプチドを使用することによって、Ｆｃ領域としてヒトＩｇＧ１サブクラスに由来するポリペプチドを使用した同じ型の二重特異性抗体に比べて、より優れた安定性と、より高い細胞傷害性を有する。
　このような構成要素を含む本発明の二重特異性抗体の具体的な例として、様々な型の抗体を作製することが出来る。この例として、例えば、特許文献２において、第二の型（Ex3-Fc）及び第三の型（Ex3 scDb-Fc）として記載されている通常のＩｇＧ型抗体分子である高機能性二重特異性抗体、並びに、上記の構成要素に加えて更にＬ鎖定常領域（ＣＬ）及びＨ鎖定常領域（ＣＨ１）を含む第四の型（Ex3 scFv-Fc）として記載されている高機能性二重特異性抗体を挙げることが出来る。
　本発明の第四の型二重特異性抗体に含まれるＬ鎖定常領域（ＣＬ）及びＨ鎖定常領域（ＣＨ１）はヒト抗体に由来するものである限り特に制限はない。例えば、ＣＬはκまたはλ鎖の何れに由来するものでも良い。ＣＨ１としては、通常、ＩｇＧのγ鎖に由来するものが使用される。ＣＨ１及びＣＬの一例として、夫々、特許文献２に開示された配列番号２９及び配列番号３３に示したアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
　より具体的には、上記の第ニの型（Ex3-Fc）は、ＯＨ５Ｌ及び５ＨＯＬの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体（Ex3）がいずれか一方のポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合しているものである。即ち、具体的には、ヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域と結合したEx3を構成する２種類のポリペプチドの何れか一方のポリペプチド（例えば、（５ＨＯＬ）－ヒンジ領域－Ｆｃ領域）、及び、Ex3を構成するもう一方のポリペプチド（例えば、（ＯＨ５Ｌ））の２種類のポリペプチドから構成されるものである。該抗体はこれら２種類の一本鎖ポリペプチドを共発現させた後に会合せしめることによって製造することが出来る。
　この型の抗体において、５ＨＯＬ又はＯＨ５Ｌの何れかのポリペプチドをヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合させることができ、更に、各一本鎖ポリペプチドに含まれるＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合していても良い。
　上記の第三の型（Ex3 scDb-Fc）は、上記の第二の型におけるEx3の代わりに、Ex3 scDb、即ち、Ex3を構成する２種類のポリペプチド鎖であるＯＨ５Ｌ及び５ＨＯＬが更にペプチドリンカーにより結合された（ＯＨ５Ｌ）－（ペプチドリンカー）－（５ＨＯＬ）で示される構造を有するシングルポリペプチド鎖、（ＯＨ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＬ）で示されるシングルポリペプチド鎖、又は、（５Ｌ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＨＯＬ）で示されるタンデム型のシングルポリペプチド鎖がヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合した構造を有している。尚、以上の一本鎖ポリペプチドに含まれる２種類のＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合していても良い。
　上記の第二の型及び第三の型を構成するドメインの数はＩｇＧタイプの免疫グロブリン分子と同じであり、これらの抗体は該免疫グロブリン分子に近い立体的構造を有しているものと考えられる。更に、これら本発明BsAbの第ニの型（ii）及び第三の型（iii）において、Ex3又はEx3 scDbとヒンジ領域の間にプロテアーゼ切断部位を介在させることにより、これらのBsAbをプロテアーゼ消化し、その後、後述する各種精製操作を適宜行うことによって、Ex3又はEx3 scDbを容易に製造することが可能となる。又、こうしたプロテアーゼ消化によって得られたEx3又はEx3 scDbは、従来の方法で作製したものと比較してより高い細胞傷害活性を示す。
　上記の第四の型（Ex3 scFv-Fc）は、抗体（免疫グロブリン分子）のＶＨ及びＶＬを、夫々、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８のＨ鎖及びＬ鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（５ＨＬ）又は抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖及びＬ鎖のヒト型化可変領域を含む一本鎖Ｆｖ（ＯＨＬ）で置換して成る抗体である。即ち、該抗体は、IgGタイプの免疫グロブリン分子においてＨ鎖の定常領域を構成するＣＨ１ドメインのＮ末端側にｓｃＦｖであるＯＨＬ又は５ＨＬのいずれか一方が結合してなるポリペプチド、及びＬ鎖の定常領域ＣＬのＮ末端側にもう一方のｓｃＦｖが結合してなるポリペプチドの２種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるものである。尚、ｓｃＦｖに含まれるＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域の何れがこれら領域と結合していても良い。従って、該抗体はこれら２種類の（一本鎖）ポリペプチドを共発現させた後に会合せしめることによって製造することが出来る。
　又、本発明の二重特異性抗体等を構成する各ポリペプチドにおいて、非特許文献３に記載されているようなＬ鎖可変領域がＨ鎖可変領域のＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とする各種の抗体も本発明に含まれる。即ち、例えば、第三の型（Ex3 scDb-Fc）におけるこのようなＬＨ型の例として、本明細書の実施例に記載されている、（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）で示される構造を有するシングルポリペプチド鎖がヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合した構造を挙げることができる。
　更に、本発明の二重特異性抗体等を構成する各ポリペプチドにおいて、特許文献４及び特許文献５に記載されているように、Ｈｅｒ１抗体５２８のＨ鎖又はＬ鎖に各種のアミノ酸変異・置換を導入することもできる。
　本発明抗体を構成する一本鎖ポリペプチドは、例えば、特許文献２の図３－３及び図３－４に開示された、PreScission配列、ペプチドリンカー、シグナルペプチド等のアミノ酸配列を含むことができる。尚、PreSission配列はプロテアーゼ切断部位を含む配列である。使用するプロテアーゼの種類に特に制限はなく、例えば、Thrombin及びFactor Xa等の当業者に公知の酵素を使用することが出来、それに応じて、プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を適宜選択することが出来る。
　発明抗体の断片化をより効果的に抑制するためには、PreSission配列等のプロテアーゼ切断部位は含まれていないことが好ましい。
　抗EGFR抗体（５２８抗体）産生マウスB細胞ハイブリドーマ528は、東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０５５５）。更に、５２８抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.HB-8509 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
　一方、抗CD3抗体OKT3を産生するハイブリドーマは東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０２３５）。又、OKT3抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.CRL-8001 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
　これらを用いて、当業者に公知の方法によってcDNAを調製することが出来る。例えば、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いmRNAを抽出、First-Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences社)によりcDNAを調製し、参考論文（Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)）に基づき合成したクローニングプライマーを用いPCRを行いこれら各抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域の配列を決定することができる。
　本発明の二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる可変領域の「ヒト型化」とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のヒト型化可変領域における相補性決定領域 (complementarity-determining region; CDR)の残基の少なくとも一部において、マウス、ラット、またはウサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体）であり且つ所望の特異性、親和性、および能力を有するCDR に由来する残基によって置換されている抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗体は、レシピエント抗体および導入されたCDR またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れたものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988);EP-B-239400; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992); およびEP-B-451216 を参照することができる。
  このような抗体のヒト型化可変領域のヒト型化は当業者に公知の方法に従って実施することが出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の３次元イムノグロブリンモデルを使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製される。３次元イムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細については、WO92/22653等を参照することができる。
　従って、ヒト型化されたヒト型化可変領域の例として、ヒト型化可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げることができる。
　本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合があるので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）中の部位、例えば、canonical 配列又はvernier 配列において部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をすることが出来る。
　具体的には、528ヒト型化可変領域のヒト型化はCDR grafting法により行った。まずVH、VLそれぞれ相同性検索を行い、各CDR(complementarity determining region)の長さ等を考慮した上でもっとも相同性の高いFR(frame work)をもつヒト抗体配列を選択する。選択したヒト抗体のCDRを528のCDRと入れ換えたアミノ酸配列を設計し、対応するコドンについては先と同様に発現に使用する宿主細胞の至適コドンを用いることが好ましく、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行うことが出来る。
　又、ヒト型化OKT3ヒト型化可変領域はすでに報告されており、マウスOKT3に比べて十分に活性を保持していることも確かめられている(Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994))。この文献に記載されているヒト型化OKT3ヒト型化可変領域のアミノ酸配列を基に、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行った。この際にコドンは宿主細胞における至適コドンを用いることが好ましく、至適コドンに置換した全合成遺伝子を用いることでの宿主細胞における発現量の増加はすでに報告されている。
　各一本鎖ポリペプチドの構造において示されるペプチドリンカーに加えて、各Ｌ鎖可変領域断片及びＨ鎖可変領域断片は適当なペプチドリンカーで連結されていることが好ましい。該ペプチドリンカーは、一本鎖抗体の分子内での相互作用を困難にし、複数の一本鎖抗体による多量体の形成を可能ならしめ、その結果、互いに別の一本鎖抗体に由来するＶＨとＶＬが適切に会合することによって、オリジナルのタンパク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリジナルのタンパク質から誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部あるいはその全てを模擬又は促進する構造をとることができるようなものであれば特に限定されず、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。例えば、ペプチドリンカーは１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは２～１０個のアミノ酸の長さであることが好ましい。
　更に、各一本鎖ポリペプチドは上記のペプチドリンカーを含まずに、二つの可変領域断片が直接結合していても良い。このような場合には、各一本鎖抗体の三次元的自由度を高めて多量体化を促進させるために、各一本鎖ポリペプチドにおいてＮ末端側にある可変領域断片のC末端の１ないし数個のアミノ酸、又は、C末端側にある可変領域断片のＮ末端の１ないし数個のアミノ酸が除去されていることが好ましい。
　更に、上記の各配列番号で示される各アミノ酸配列において、一個又は数個（例えば、２～５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって、元のアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能・活性、例えば、可変領域断片の抗原特異性と実質的に保持しているアミノ酸配列も本発明の抗体を構成する一本鎖抗体のポリペプチドとして使用することが出来る。欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸は、好ましくは、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士が置換されるか、又は、アミノ酸の欠失若しくは付加によって、蛋白質の三次元構造及び／又は局所的電荷状態に大きな変化が生じない、又は、実質的にそれらが影響を受けないようなものが好ましい。このような欠失、置換又は付加されるアミノ酸を有するポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法（点突然変異導入及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能である。尚、これらの一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列は、元のアミノ酸配列全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性（同一性）を示すものということもできる。
　本発明の各抗体に含まれる一本鎖ポリペプチドに含まれる各領域をコードする核酸分子（ポリヌクレオチド）の代表例は、上記の各配列番号に示された塩基配列を有するものである。その他に、各配列番号に記載の塩基配列の全長と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性を示すような塩基配列から成る核酸分子は、上記の各領域又は配列と実質的に同等の活性又は機能を有するポリペプチドをコードしていると考えられるので、これらの核酸分子も上記の本発明の核酸に含まれる。このような核酸分子には本発明の二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのポリペプチドをコードする塩基配列が含まれているが、２種類の一本鎖ポリペプチドを夫々コードする２種類に塩基配列が共に含まれていることが好ましい。
　２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
　ここで、「相同性（同一性）」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同士の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
　更に、上記の各核酸分子は、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記配列番号で示された各ポリペプチドの機能・活性と実質的に同じものを有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むものである。
　ここで、ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　本明細書において、ＤＮＡのハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。
　従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度150～900mM、好ましくは600～900mM、pH 6～8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
　更に、各一本鎖ポリペプチドにおける可変領域断片をコードする核酸を作製する場合には、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップPCR法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものものである。
　具体的には、cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 技術により単離されうる。一旦単離されれば、DNA は発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（E. coli ）細胞、COS 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., “PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
　DNA など核酸の配列決定は、例えばSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)などを参考にすることができる。また一般的な組換えDNA 技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (ed.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D. M. Glover et al. (ed.), “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) などを参考にできる。
　こうして取得された本発明の抗体を構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にDNA を遺伝子的に改変又は修飾する技術は、Mutagenesis: a Practical Approach, M.J．Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK(1991) における総説において示されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 変異生成法を挙げることができる。
　ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。
　又は、アミノ酸自体は変更せずに、ＣＨＯ細胞等の宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
　本発明の抗体は、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、該二重特異性抗体を構成する夫々の一本鎖抗体のポリペプチドをコードする核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、それらの一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体分子を分離・回収することによって製造することが出来る。
　ここで、「複製可能な発現ベクター(replicable expression vector)」および「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA（通常は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該DNAは、その中に外来のDNAの断片を挿入せしめることができる。外来のDNAは、異種DNA (heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないDNA である。ベクターは、外来DNAまたは異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）DNA のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
  このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(control sequence)とそれが機能するように(operably)（即ち、外来DNAが発現できるように）連結せしめられたDNA配列を含有する DNA構築物(DNA construct) を意味している。そうした制御配列としては、転写(transcription) させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳(translation) の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来DNAの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ－ｍｙｃタグ及びＨｉｓ－ｔａｇ）をコードする配列を一本鎖ポリペプチドに対応する配列の末端等に含ませることが出来る。
　該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
　本発明の抗体を構成する一本鎖ポリペプチドを製造する為に使用する各種の発現ベクターは、当業者であれば、当該技術分野における公知技術を用いて容易に作製することが出来る。その一例として、特許文献１、特に、実施例１、２、１１及び１２の記載及び特許文献２における各実施例を挙げることが出来る。
　宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli) 等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。形質転換菌は当業者に公知の任意の抵当な条件・方法で培養することができる。宿主として、例えば、BL21 star(DE3)株、培地として2xYT培地、培養温度28℃前後、0.5 mM 程度のIPTGで発現を誘導することによって、培養上清又は可溶性画分における本発明の抗体の収量を大幅に向上させることができ、製造効率を高めることが可能となる。
　このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン-X100) を使用して膜から遊離せしめることができる。
　精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、必用に応じてＰＥＧ化等の化学修飾を行った後、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、クロスフロー濃縮、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
　回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれている場合には、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、各種試薬類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。更に、こうして精製された同一種類又は２種類の一本鎖ポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成された抗体を分離して回収することによって、本発明の抗体を製造することが出来る。
　会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すことによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング (refolding)とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成された多量体化低分子抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
　以上に示したように、本発明の抗体は、例えば、培養宿主細胞の培養培地上清、ペリプラズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から調製することが可能である。
　本発明のベクターとして、本発明の抗体を構成する一本鎖ポリペプチドに対応する核酸分子を共に含む共発現ベクターを用いることによって、又は、一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする核酸分子を含む発現ベクターを同一の宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換菌内で夫々の一本鎖ポリペプチドが発現した後に抗体分子が形成され、それを培養宿主細胞の培養培地上清又は可溶性画分から調製することが可能である。従って、このような場合には、上記の会合（巻き戻し）処理は不要となり、低コストで高生産性が得られる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗体、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする。かかる有効成分は、以下の実施例に示されているように、インビトロ及びインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、本発明の医薬組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤として使用することが出来る。
　本発明の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
　本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
　本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
　投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食作用又は細胞傷害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与前に本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体のような有効成分と上記細胞とを混合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい。
  持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正　日本薬局方解説書、平成８年７月10日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
　尚、本明細書及び図面において、用語はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
　以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
  全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。尚、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, “Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)  及び D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,“DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)   及び M. A. Innis et al. ed.,“PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
　実施例において、Ex3-scDb-Fc LH型のヒンジとFc領域を従来のIgG1からFcRや補体への結合能が低いとされるIgG2へと構造改変したEx3-scDb-Fc LH型IgG2を作製することで、FcRや補体への結合能が細胞傷害性に与える影響を検証した。
Ex3-scDb-Fc LH型IgG2発現ベクターの作製
　まず、当業者に公知の方法を用いてPBMCからmRNAを抽出し、cDNAの合成を行った。そのcDNAを用いてヒトIgG2配列のヒンジ領域からFc領域をカバーするプライマーでPCRによる遺伝子増幅を行い、pRAベクターに挿入しpRA IgG2 hinge-Fcを得た。その配列を確認したところ、遺伝子データバンクであるGenBankのhuman IgG2 遺伝子配列(BX640623. 1)と完全に一致する遺伝子が得られた。
　こうして得られたヒトIgG2配列のヒンジ領域及びFc領域（ＣＨ２及びＣＨ３）を含む塩基配列を配列番号９で示す。
　続いて、得られたpRA IgG2 hinge-FcおよびpcDNA Ex3-scDb-Fc LH型（特許文献３の実施例２に準じて作製）を鋳型として2度のPCRを行い、BamHIとXhoIで消化した後のライゲーションによりpcDNA Ex3-scDb-Fc LH型IgG2を作製した（図２）。以下に使用したプライマー、条件を示す。
pRA IgG2 hinge-Fc
(鋳型：mRNA抽出産物、annealing温度：55℃、伸長時間：60 sec )
back primer：NcoI-IgG2 hinge
配列番号１０：5’-NNNCCATGGTGTTGTGTCGAGTGCCCACC -3’
forward primer：IgG2 Fc-SacII 
配列番号１１：5’-NNN CCGCGG TCATTTACCCGGAGACAGGGAG -3’
pcDNA Ex3-scDb-Fc LH型IgG2
1st PCR(PreScission site-IgG2 Fc-XhoI作製)
(鋳型：pRA IgG2 hinge-Fc、annealing温度：55℃、伸長時間：60 sec )
back primer：PreScission-IgG2 hinge
配列番号１２
：5’- CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC TGTTGTGTCGAGTGCCCACC -3’
forward primer：CH3-XhoI 
配列番号１３：5’-NNNCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’
1st PCR(BamHI-5LOH- PreScission site作製)
(鋳型：pcDNA Ex3-scDb-Fc LH型、annealing温度：60℃、伸長時間：60 sec )
back primer：BamHI-h5L
配列番号１４：5’-NNNGGATCC GATATTGTGATGACCCAGAGCCC-3’
forward primer：hOH-PreScission
配列番号１５：5’-GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAG GGAGCTAACGGTCACCGG-3’
2nd PCR
( 鋳型：1st PCR産物、annealing温度：60℃、伸長時間：60 sec )
back primer：BamHI-h5L
配列番号１４
forward primer：CH3-XhoI
配列番号１３
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
CHO細胞への遺伝子導入とクローニング
　発現ベクターpcDNA Ex3-scDb-Fc LH型IgG2を予めNruIで制限酵素消化し、直鎖状にした。続いて、CHO細胞を宿主細胞として用い、Lipofectamine2000を使用したリポソーム法による遺伝子導入を行った。そして、G418を含む選択抗生培地によりスクリーニングを行い、その培地上清を用いて、当業者に公知の方法（例えば、特許文献５の実施例２に記載の方法）に準じた方法を用いたフローサイトメトリー（FCM）によりヒト扁平上皮がん細胞株であるA431細胞（ATCC No.CRL-1555）(EGFR+)及び細胞傷害性Ｔ細胞であるT-LAK(CD3+)に対する結合活性評価を行うことで、本発明抗体の一種であるEx3-scDb-Fc LH型IgG2の発現を確認した（図３）。A431、T-LAKそれぞれに対する結合活性が見られたため、遺伝子導入に成功したことが確認できた。
　その後、限界希釈法によるクローニングを行い、その上清を用いてELISAを行った（図４）。続いて、その中から特に値が高く、かつ1つの細胞から派生したコロニーだけを形成していたclone 52、59、104、111、171、198、341、343、366、468、470、476を選択し、12穴プレートを用いて拡大培養した。その培養上清を10、100倍に希釈した溶液を調製し、再びELISAを行い、原液および10倍希釈において値の高かったclone 366、470を選択した（図５）。
　尚、ELISAはHuman IgG ELISA Quantitation Kit(BETHYL社)を用いて行った。
Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の調製
　取得したclone 366、470を、それぞれトリプルフラスコを用いて培養し、その培地上清からプロテインAによる精製を行った。その確認をSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより行った結果、溶出画分にバンドが得られたことから、その精製を確認した（図６）。精製後における収量はclone 366で0.6 mg/L、clone 470で0.9 mg/Lであったことから、精製確認および以後のアッセイにおいてはclone 470を用いた。
　次に、プロテインA精製での溶出画分を用いてゲルろ過クロマトグラフィーによる最終精製を行った。結果、Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の分子量(158 kDa)と思われる溶出位置にピークが見られたため（図７）、この画分を取得し、以下のアッセイに用いた。
Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の機能評価
（１）Proliferation assayによるPBMC増殖誘導能評価
　当業者に公知の方法（例えば、特許文献２の実施例４に記載の方法）により末梢血リンパ球（PBMC）を用いたProliferation assayによりEx3-scDb-Fc LH型IgG2のFcR結合能を評価した。結果、IgG1のFc領域を持つEx3-scDb-Fc HL型、LH型と比較して著しく低い増殖能を示し、FcR結合能が低下していることが示された（図８）。尚、本明細書中の実施例で比較対照として使用されるＨＬ型 Ex3-scDb-Fc及びＬＨ型 Ex3-scDb-Fcは、夫々、特許文献２及び特許文献３に記載の抗体であって、Ｆｃ領域としてIgG1由来のポリペプチドを含む抗体である。
（２）SPRを用いたEGFRに対する結合速度論的解析
　ヒンジやFc領域への構造改変が抗原に対する結合能に与える影響を検討するため、EGFR(固定化量3690 RU)を用いたSPR（J Biol Chem. 2010 Jul 2:285(27):20844-9）による結合速度論的解析を行ったところ、Ex3-scDb-Fc LH型とEx3-scDb-Fc LH型IgG2のKDは同等であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）MTS assayによる細胞傷害性評価
　構造改変が細胞傷害性に与える影響を検討するため、業者に公知の方法（例えば、特許文献２の実施例５に記載の方法）に準じて、エフェクター細胞としてT-LAKまたはPBMCを用い、ヒト胆管がん細胞株であるTFK-1（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター ID：TKG036）に対する細胞傷害性試験MTS assayを行った。その結果、T-LAKを用いた場合においてはEx3-scDb-Fc LH型とEx3-scDb-Fc LH型IgG2は同等の傷害性を示した。一方で、予想外なことに、PBMCを用いた場合においてはEx3-scDb-Fc LH型IgG2の方がより高い活性を示した（図９）。
（４）サイトカインの分泌誘導能評価
　Ex3-scDb-Fc LH型IgG2のがん細胞とT-LAKの存在下、およびT-LAKのみの存在下におけるIL-2とIFN-γの分泌誘導能の経時変化を当業者に公知の方法（J Biol Chem. 2011 Jan 21;286(3):1812-8）で評価した（図１０、図１１）。
　その結果、がん細胞とT-LAKが存在する場合においてはEx3-scDb-Fc LH型と同等の値を示すが、T-LAKのみにおいてはLH型と比べて低く、HL型と同等の値であった。LH型IgG2のヒンジには4つのシステインが存在し、図１２に示すように、PreScission Protease認識配列の直後にジスルフィド結合の形成部位が存在する。そのためPreScission Protease認識配列とシステインの間に5つの残基を含むEx3-scDb-Fc LH型と比較してヒンジのフレキシビリティーが低下し、OKT3とCD3の結合に影響が生じてT-LAKの活性化能を低下させたと考えられる。しかしながら、上記の実験で示されるように傷害性には影響を及ぼしていないため、T-LAK単独に対する活性化能は傷害性に大きな影響は与えないものと考えられる。
（５）T細胞に対する活性化能評価
　Ex3-scDb-Fc LH型IgG2のT-LAKに対する活性化能の低下が見られたことから、T-LAKに対する増殖誘導能にも影響が生じていると考え、T-LAKを用いて上記の方法でProliferation assayを行った（図１３）。その結果、Ex3-scDb-Fc LH型と比較して増殖能の低下が確認された。
　続いて、PBMCにEx3-scDb-Fc LH型IgG2を添加した場合におけるCD69の発現を上記のFCMによって評価した（図１４）。結果、Ex3-scDb-Fc LH型と比較して、LH型IgG2が高いCD69の発現を示した。これらの結果から、Ex3-scDb-Fc LH型IgG2はT-LAKのようにT細胞が単独で存在する場合においては、前述したようなヒンジの問題により活性化能はEx3-scDb-Fc LH型を下回るが、FcR陽性のＮＫ細胞等のエフェクター細胞が含まれるPBMCにおいては、本発明の抗体のＦｃ領域はＦｃＲとの結合性が低いIgG2由来であるので、ＮＫ細胞等との結合による阻害を受けることなくT細胞のみと結合し、より高い活性化を促したとが考えられる。
Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の安定性評価
　Ex3-scDb-Fcはヒンジ近傍で切断される断片化が問題となっている。そこで、LH型 Ex3-scDb-Fc IgG1（特許文献３に記載の抗体）及び本発明抗体であるEx3-scDb-Fc LH型IgG2に関して、夫々のゲルろ過クロマトグラフィーによる精製後のサンプルを一定時間経過後、再度ゲルろ過クロマトグラフィーを行うことで断片化の有無を確認し、各抗体の安定性の評価を行った。尚、微生物から産出される因子（プロテアーゼ等）による影響を排除するために、精製後のサンプルをフィルター滅菌処理して実験に供した。その結果を図１５に示す。
　その結果、LH型 Ex3-scDb-Fc IgG1は6ヶ月後にはかなりの断片化がみられるのに対し、本発明抗体であるEx3-scDb-Fc LH型IgG2はこのような長期間が経過した後でも殆ど断片化しておらず、断片化が有意に抑制されたことが確認された。
Ex3-scDb-Fc LH型IgG2のin vivo試験
　Ex3-scDb-Fc LH型IgG2の担がんマウスを用いたin vivo試験を当業者に公知の方法（Protein Eng Des Sel. 2013 May;26(5):359-67）で評価した（図１３）。TFK-1(5 x 106)とT-LAK(1 x 107)を混合後、皮下移植し、その1時間後に各サンプルを投与した。
　その結果、Ex3-scDb-Fcは市販されている抗EGFR抗体医薬Cetuximabよりも強い腫瘍の成長阻害活性を示し、さらにEx3-scDb-Fc LH型IgG2はIgG1に比べ、優位に強い効果を示した。
　本発明は、Ｆｃ領域を含む各種の二重特異性抗体において、ＦＣ領域をＩｇＧ２由来ポリペプチドを使用することによって、エフェクター機能の低減による副作用を抑制しつつ、立体障害を回避することにより薬効を向上させ、更に、その機能を長期間に亘って安定的に保持する技術を提供することによって、次世代の抗体医薬の開発を加速させ、大いに貢献するものである。

Claims (13)

  1. 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ：配列番号２）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ：配列番号４）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ：配列番号６）及びＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ：配列番号８）を含む可変領域、ヒンジ領域、並びに、Ｆｃ領域を含む、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１及びＣＤ３に対する二重特異性抗体であって、該Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ２サブクラスに由来することを特徴とする、前記抗体。
  2. 各ポリペプチドにおいて、Ｌ鎖可変領域がＨ鎖可変領域のＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とする、請求項１記載の抗体。
  3. ＩｇＧ型タイプの免疫グロブリン分子と同じドメイン数を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. （ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）で示される構造を有するシングルポリペプチド鎖がヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合した構造を有している、請求項３に記載の抗体。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載された抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
  6. 請求項５記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  7. 請求項６記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
  8. プラスミドベクターである、請求項７記載のベクター。
  9. 請求項７又は８記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  10. 哺乳動物細胞である請求項９記載の宿主細胞。
  11. 請求項９記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、請求項４に記載の一本鎖ポリペプチドを回収し、精製し、得られた該一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された抗体を分離・回収することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体の製造方法。
  12. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
  13. 腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする請求項１２記載の医薬組成物。
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