WO2015144900A1 - Diagnoseverfahren zur krebsfrüherkennung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Diagnoseverfahren zur Früherkennung von Krebs, wobei einer zu testenden Person ein Alkaloidpräparat verabreicht wird, welches wenigstens ein wasserlösliches Isochinolin-Alkaloid mit quartärem Stickstoffatom enthält, worauf innerhalb eines vorbestimmten Zeitintervalls nach Verabreichung des Alkaloid-Präparats mindestens einer der folgenden Parameter ex vivo analytisch bestimmt und ausgewertet wird: - eine signifikante Veränderung des Körpergeruchs; - eine signifikante Veränderung des Geruchs einer Urinprobe der Person; - die Anwesenheit eines durch die Verabreichung des Alkaloid-Präparats induzierten Krebsmarkers in einer Blut- oder Urinprobe der Person; - eine Veränderung einer Blut- oder Urinprobe der Person in Bezug auf das Alkaloidprofil, d.h. in Bezug auf den Gehalt und/oder die Zusammensetzung der verabreichten Alkaloide, im Vergleich zu korrespondierenden Werten einer gesunden Kontrollperson, wobei die positive Feststellung einer Veränderung des Körpergeruchs und/oder des Geruchs einer Urinprobe und/oder die positive Bestimmung der Anwesenheit eines induzierten Krebsmarkers und/oder eines veränderten Alkaloidprofils auf das Vorhandensein von Krebszellen im Körper der Person hinweist.

Description

DIAGNOSEVERFAHREN ZUR KREBSFRÜHERKENNUNG

TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Verfahren zur Früherkennung von Krebs.

STAND DER TECHNIK

In WO2004/082698 wird ein Verfahren zur Herstellung von alkylierten Alka- loidderivaten beschrieben, wobei aus einem ursprünglich tertiären Stickstoffatom durch Alkylierung ein quartäres Stickstoffatom gebildet wird . Bevorzugte Alkaloide sind jene, die im gemeinen Schöllkraut (Chelidonium majus L.) vorkommen . Ein wasserlösliches Gemisch mehrerer derartiger Alkaloidderi- vate, die durch chemische Reaktion eines Extrakts aus Schöllkraut mit dem bekannten alkylierenden Krebsmittel Thiotepa (Ν,Ν,Ν-Triethylenthiophos- phorsäuretriamid) nach dem Herstellungsverfahren von WO2004/082698 erhalten werden, ist im Stand der Technik unter dem Namen UKRAIN be- kannt.

Aus Untersuchungen zum Wirkmechanismus der quartären Alkaloidderivate von UKRAIN ist bekannt, dass sich diese offenbar bevorzugt in Krebszellen anreichern und letztere direkt oder indirekt durch Apoptose-Induktion in einen frühen Zelltod treiben, während normale, gesunde Zellen nicht angegriffen werden .

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Es wurde ausserdem festgestellt, dass Krebspatienten, die mit dem Präparat UKRAIN behandelt wurden, schon kurz nach Einnahme des Präparats über eine signifikant und charakteristisch veränderte Körperausdünstung verfügen, während dieses Phänomen bei gesunden Personen nicht beobachtet werden konnte. Ebenso wurde bemerkt, dass sich der Geruch des Urins bei Krebspa- tienten nach UKRAIN-Verabreichung signifikant verändert. Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, auf der Basis dieser Erkenntnisse ein medizinisch-diagnostisches Verfahren zur Früherkennung von Krebserkrankungen bereitzustellen, wie dies im unabhängigen Anspruch definiert wird . Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen beschrieben .

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im Zuge der erstmaligen Behandlung von Krebspatienten mit dem Präparat UKRAIN, einer alkoholfreien Lösung eines Gemisches aus natürlichen tertiären und quartären Isochinolin-Alkaloiden des Schöllkrauts und davon durch Alkylierung abgeleiteten Alkaloidderivaten mit quartärem Stickstoff in der chemischen Struktur, konnte festgestellt werden, dass die meisten der behandelten Personen bereits kurze Zeit nach oraler oder intravenöser Verab- reichung einer Dosiereinheit von 1 x5ml oder 5x1 ml des Alkaloid-Präparats einen geänderten Körpergeruch aufweisen . Noch stärker ausgeprägt ist die Veränderung des Geruchs des Urins solcher Personen, wobei der veränderte Geruch eher unangenehm ist und an Pferdestall-Geruch erinnert. Auch verändert sich die Farbe des Urins solcher von Krebs betroffenen Personen.

Typischerweise verspüren krebskranke Personen kurz nach der Einnahme des Präparats ausserdem ein Kribbeln im Körper, häufig verbunden mit einem Gefühl von leichter Wärmeentwicklung . Diese Symptome Messen und lassen sich mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von 90% mit dem Vorhandensein einer Krebserkrankung - unabhängig von der Art des Krebses - in Verbindung bringen, selbst wenn die Krebserkrankung sich noch in einem frühen Stadium befindet.

Bei gesunden Kontrollpersonen, die das Präparat ebenfalls erhielten, konnten diese Effekte nicht festgestellt werden .

Bei etwa 1 0% der getesteten Krebspatienten scheint das Präparat die gewünschte krebshemmende Wirkung bedauerlicherweise nicht erbringen zu können und kann auch eine Veränderung des Körpergeruchs und des Urin- geruchs nach Verabreichung des Präparats nicht festgestellt werden. Es kann also daraus abgeleitet werden, dass eine mit der Nase subjektiv wahrnehmbare, olfaktorisch feststellbare Veränderung der Körperausdünstung oder des Uringeruchs einer Person nach Verabreichung einer UKRAIN- Dosis das Vorhandensein von Krebszellen oder einer Krebserkrankung in der betreffenden Person mit hoher Verlässlichkeit anzeigt. Der Umkehrschluss ist hingegen nur bedingt zulässig, d . h . die Abwesenheit dieser Symptome kann zwar ebenfalls in rund 90% der Fälle das Freisein von Krebsgeschehen korrekt anzeigen, kann in rund 1 0% der Fälle aber einen falschen Eindruck der Abwesenheit von Krebsgeschehen in den getesteten Personen erwecken .

Es ist bekannt, dass das Präparat Ukrain in vitro eine Vielzahl unterschiedlicher Krebszellen durch I nduktion von Apoptose erfolgreich in den Zelltod treiben kann . Dabei spielen zumeist mitochondriale Vorgänge eine wesentliche Rolle, insbesondere die Depolarisation des Membranpotenzials der inneren Mitochondrienmembran und die Aktivierung von Caspasen (siehe z. B. Habermehl et al . , BMC Cancer 2006, 6: 1 4)

Es ist ausserdem davon auszugehen, dass in vivo mindestens ein in dem Präparat Ukrain vorhandenes, natürliches Alkaloid oder chemisch modifiziertes Alkaloidderivat mit allfällig vorhandenen Krebszellen in einer betroffenen Person reagiert, insbesondere von diesen adsorbiert oder absorbiert wird . Dabei kann insbesondere ein Alkaloid oder Alkaloidderivat mit quartärem Stickstoff-Atom eine chemische Verbindung mit einer zelleigenen Substanz eingehen und zu einer neuen chemischen Verbindung umgewandelt oder abgebaut werden, die entweder selbst über den Urin ausgeschieden wird oder aber die Ausscheidung wenigstens einer anderen, für die Anwesenheit von Krebszellen indikativen, chemischen Verbindung über den Urin bewirkt. Diese mindestens eine, über den Urin ausgeschiedene chemische Verbindung kann als Krebsmarker für analytische Zwecke, insbesondere für die medizini- sehe Diagnostik zur Krebsfrüherkennung, herangezogen werden .

Zur Erhärtung der einfachen und raschen, subjektiv-olfaktorischen Diagnose eines veränderten Urin- oder Körpergeruchs der jeweiligen Testperson kann auch die Heranziehung einer standardisierten olfaktometrischen Differential- analyse hilfreich sein . Im Bedarfsfall kann zusätzlich eine gaschromatografi- sche Bestimmung der flüchtigen Komponenten des Urins vorgenommen und das Auftreten eines oder mehrerer zusätzlicher Peaks in den experimentellen Proben im Vergleich zu den Kontrollproben als Krebsindikation herangezogen werden .

Weiters kann auch eine Methode zur gelchromatografischen Bestimmung der wesentlichen Inhaltsstoffe des Urins zur Erhärtung der Diagnosestellung herangezogen werden. Auch hier ist aus dem Vergleich der Chromatogramme der experimentellen Proben mit denjenigen der Kontrollproben gesunder Menschen vor und nach Alkaloidgabe sowie mit denjenigen der Testpersonen vor der Alkaloidgabe, eine eindeutige und mit hoher Verlässlichkeit zutreffende Schlussfolgerung bzw. Diagnosestellung möglich . Dem Fachmann sind geeignete gaschromatografische und gelchromatografische Verfahren zur Durchführung derartiger qualitativer und quantitativer Analysen bekannt.

Besonders schnell, einfach und kostengünstig lässt sich allerdings eine Fluo- reszenzmessung mit UV-Lichtbestrahlung für die vergleichende Analyse der Urinproben heranziehen, z.B. mit einem Multi-Mode Mikroplattenfotometer (z.B. " Synergie 2 " , BioTek, USA), mit dessen Hilfe man Verdünnungsreihen aus den Urinproben ansetzen und in einem Schwung fotometrisch vermessen kann . Aus der vergleichenden Betrachtung der dabei ermittelten Absorptions- Spektren lassen sich ebenfalls wiederholbare und mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von mindestens 90% zutreffende Rückschlüsse auf das Vorhandensein von Krebszellen im Körper der Testperson ziehen . Grundsätzlich lassen sich mit dem erwähnten Verfahren auch Blutproben, insbesondere nach Abtrennung der festen Bestandteile, differentialdiagnostisch analysie- ren, wobei allerdings die Auswertung der alkaloidbezogenen Absorptionsspektren aufgrund eines erhöhten Hintergrundrauschens - im Vergleich zu Urinproben - etwas erschwert wird .

Den hierin zuvor erwähnten nass-chemischen oder optischen Analysemetho- den liegt als erste Annahme zugrunde, dass bei krebskranken Personen die Gabe der erwähnten Alkaloide, speziell der Alkaloide mit quartärem Stickstoffatom, dazu führt, dass zumindest ein Teil der Alkaloide von den Krebszellen absorbiert wird und daher in nachfolgend entnommenen Blut- und/oder Urinproben fehlt und als Abnahme des Gehalts an Alkaloiden, im Vergleich zu den korrespondierenden Werten gleichermassen behandelter, gesunder Kontrollpersonen, analytisch bestimmbar ist. Es wird also ein Alkaloidprofil aus den Urin- und/oder Blutproben der Testpersonen ermittelt und mit dem ent- sprechenden Alkaloidprofil aus Blut- und/oder Urinproben gesunder

Kontrollpersonen verglichen . Dabei kann sich gegebenenfalls ein für die jeweilige Krebsart typisches differentielles Alkaloidprofil im Vergleich zum Alkaloidprofil der Kontrollpersonen ergeben.

Als zweite Annahme liegt diesen Methoden zugrunde, dass bei krebskranken Personen die spezifische Absorption der erwähnten, insbesondere quartären, Alkaloide, durch Krebszellen dazu führt, dass zumindest ein Teil der absorbierten Alkaloide metabolisiert wird und in Form von analytisch bestimmba- ren Reaktionsprodukten in den Blut- und/oder Urinproben, quasi als Krebsindikatoren oder Krebsmarker aufscheint und mindestens qualifizierbar, vorzugsweise auf quantifizierbar ist. Dabei kann die physiologisch-chemische Reaktion der absorbierten Alkaloide mit den Krebszellen unter anderem zur Induktion von speziellen Enzymen, z.B. Caspasen, und/oder von Signal- oder Botenstoffen, insbesondere aus der Gruppe der Interleukine und Gewebefaktoren wie z.B. TNF, welche im Zusammenhang mit der Apoptose von Zellen stehen, führen . In diesem Fall kann man die solcherart induzierten chemischen Verbindungen als Indikatoren für vorhandenes Krebsgeschehen differentialdiagnostische nutzen und mit den erfindungsgemässen Verfahren bestimmen .

Die hierin beschrieben Diagnosemethoden sind von ihrem Wesen her vor allem Differenzialdiagnosen und als solche in erster Linie zur Früherkennung von Krebserkrankungen in Menschen mit erhöhtem Krebsrisiko gedacht.

Insbesondere kann der behandelnde Arzt Personen mit erhöhtem Krebsrisiko, also Personen mit entsprechender familiärer bzw. genetischer Disposition, oder Raucher, Chemiearbeiter, Lackierer, Personen mit wiederholten Sonnenbränden, und andere in regelmässigen oder unregelmässigen Intervallen und jedenfalls noch vor dem Auftreten klinisch relevanter Krankheitssymptome mit den Isochinolin-Alkaloiden auf einfache und schmerzlose Art auf das mögliche Vorhandensein einer Krebserkrankung testen. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass sich derartige Personen mit dem Präparat UKRAIN oder einem vergleichbaren Präparat auf Isochinolin-Alkaloid-Basis selbst regelmässig testen, da bislang keinerlei negative Reaktionen auf die Verabreichung einzelner Dosen solcher Präparate in zeitlichen Abständen von mehreren

Wochen oder Monaten festgestellt wurden . Die Methode ist ausserdem unabhängig von der Art der Krebserkrankung generell einsetzbar. Geeignete Isochinolin-Alkaloide, wie z.B. die Alkaloide aus dem Schöllkraut Chelidonium majus L, gehören zu einer Gruppe gut bekannter, antibakteriell, antiviral und/oder anti-tumoral wirkender Stoffe. Typische Vertreter der für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Alkaloide oder Alkaloidderivate sind beispielsweise Chelidonin, Protopin, Stylopin, Allocryptopin, Homochelidonin, Chelamidin, Chelamin, L- Spartein, und Oxychelidonin, jeweils in ihrer quaternierten Form, d.h . mit qartärem Stickstoffatom, sowie Chelerythrin, Sanguinarin und Berberin, die von Natur aus bereits in qartärer Form vorliegen . Auch eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Alkaloide oder und/oder davon abgeleiteter Derivate, gegebenenfalls auch in Kombination mit tertiären Alkaloiden aus dieser Gruppe, soweit sie in einer wässrigen Lösung löslich sind, kann für die Diagnosemethode der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise enthält das im Stand der Technik bekannte und nach WO2004/082698 oder WO03/041 721 herstellbare Präparat UKRAIN eine Mischung solcher Alkaloide oder Alkaloidderivate. Die Auswahl der erfindungsgemäss einsetzbaren Isochinolin-Alkaloide und davon abgeleiteter Derivate ist jedoch nicht auf die hierin explizit angeführten Verbindungen beschränkt, sondern umfasst gene- rell alle bekannten antibakteriell, antiviral, antifungal und/oder anticarcinogen wirksamen Vertreter dieser Substanzklasse wie z.B. auch Papaverin, wobei insbesondere Alkaloide oder chemisch modifizierte Alkaloidderivate mit quartären Stickstoffatomen bevorzugt werden, da sie besser bzw. selektiver mit Krebszellen zu interagieren scheinen, als Alkaloide mit lediglich tertiären Stickstoffatomen .

Das Zeitintervall, innerhalb dessen die Änderung des Körpergeruchs und des Geruchs des Urins und/oder die Anwesenheit einer Krebsmarker-Substanz im Urin frühestens festgestellt werden kann, beträgt rund 1 0 bis 60 Minuten nach Verabreichung des Alkaloidpräparates. Der Gesamt-Alkaloidgehalt im einzusetzenden Alkaloid-Präparat liegt typischerweise in einem Bereich von 0.1 - 1 mg/ml und der pH-Wert einer zur oralen Applikation geeigneten Lösung kann vorzugsweise in einem leicht saueren Bereich von pH 3.0 - 6 liegen . Beispiel: Krebsfrühdiagnose nach Alkaloidgabe

Eine Patientengruppe bestehend aus 20 freiwilligen Personen unterschiedlichen Geschlechts und Alters, wird mit dem erfindungsgemässen Verfahren auf das Vorhandensein von Krebs getestet. Davon wissen 9 Personen, dass sie an Krebs erkrankt sind, die übrigen 1 1 gehören verschiedenen Risikogruppen mit erhöhtem Krebsrisiko an und möchten daher freiwillig am Frühdiagnoseversuch teilnehmen . Jede Testperson erhält eine Ampulle mit 5ml eines gemäss WO2004/082698 hergestellten, chemisch modifizierten Gemisches aus wasserlöslichen tertiären und quartären Alkaloiden eines Schöllkrautextrakts, mit einer Alkaloid- gesamtkonzentration von 5mg/ml, zur peroralen, vorzugsweise sublingualen Einnahme. Als Verabreichungsschema für diesen Test wurde ein fraktionier- tes Zuführen von 1 ml pro 5 min vereinbart, sodass die gesamte Menge von 5ml nach 20 min von jeder Testperson oral aufgenommen wurde. Der Test funktioniert aber auch bei einmaliger, vorzugsweise sublingualer, Verabreichung der gesamten Präparatmenge von 5ml . Vor der Einnahme des Alkaloid- präparates wird von jeder Person eine Urinprobe als Kontrolle abgegeben.

Bereits 5 - 1 0 Minuten nach Einnahme der ersten Fraktion des Alkaloidprä- parates berichten 1 0 Personen von einem leichten Wärmegefühl, darunter alle jene, die bereits von ihrer Krebserkrankung wissen . 30 Minuten nach Verabreichung der letzten Dosiereinheit werden die Personen abermals um eine Urinprobe gebeten und ebenso nach 60 Minuten . Die Proben werden in verschliessbaren Behältern bis zur Geruchskontrolle aufbewahrt.

Der testführende Arzt sowie zwei Arztassistentinnen nehmen nacheinander die jeweils 3 Proben je Testperson zur Geruchsbestimmung auf, indem der Arzt die 3 Probefläschchen öffnet, erst an der Kontrollprobe und dann hintereinander an den beiden experimentellen Proben riecht und dann seine subjektive olfaktorische Wahrnehmung notiert. Anschliessend reicht er die 3 Proben an die Assistentinnen weiter, die nach demselben Schema vorgehen. Im Sinne einer Blindstudie sind die Probefläschchen ohne Namensnennung fortlaufend nummeriert. Die Zuordnung der Namen erfolgt vor oder nach der Geruchsbestimmung durch eine Aufsichtsperson . Ergebnis:

Die subjektive Wahrnehmung des Arztes und der Assistentinnen deckten sich in allen Fällen . Von den 20 Testpersonen wurde in 1 0 Fällen ein signifikanter Geruchsunterschied in den experimentellen Proben festgestellt, wobei in den 30-Minuten-Proben der Unterschied deutlicher wahrnehmbar war als in den 60-Minuten-Proben . Die Zuordnung der olfaktorischen Bestimmung, die ohne ein Hilfsgerät, z.B. ein Olfaktometer, durchgeführt wurde, ergab, dass diejenigen Personen, die zuvor schon das Entstehen eines Wärmegefühls berichtet haben, dieselben waren, die auch eine Geruchsveränderung im Urin zeigten. Darunter jene 9 Personen, die bereits von ihrem Krebsgeschehen wussten, sowie 1 weitere Person, welche darauf hin ersucht wurde, eine Bestätigung durch eine im Stand der Technik etablierte Methode der Krebsdiagnose einzuholen . Die erbetene Rückmeldung dieser Person bestätigte später den Verdacht auf eine Krebserkrankung gemäss der erfindungsgemässen Früh- diagnose.

Zu den übrigen, negativ gestesteten Testpersonen liegen zum Zeitpunkt des Einreichens der Patentanmeldung keine Rückmeldungen und daher keine weiteren Erkenntnisse vor.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Diagnoseverfahren zur Früherkennung von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass einer zu testenden Person ein Alkaloidpräparat verabreicht wird, welches wenigstens ein wasserlösliches Isochinolin-Alkaloid mit quartärem Stickstoffatom enthält, worauf innerhalb eines vorbestimmten Zeitintervalls nach Verabreichung des Alkaloid-Präparats mindestens einer der folgenden Parameter ex vivo analytisch bestimmt und ausgewertet wird:

- eine signifikante Veränderung des Körpergeruchs;

- eine signifikante Veränderung des Geruchs einer Urinprobe der Person;

- die Anwesenheit eines durch die Verabreichung des Alkaloid-Präparats induzierten Krebsmarkers in einer Blut- oder Urinprobe der Person;

- eine Veränderung einer Blut- oder Urinprobe der Person in Bezug auf das Alkaloidprofil, d.h . in Bezug auf den Gehalt und/oder die

Zusammensetzung der verabreichten Alkaloide, im Vergleich zu

korrespondierenden Werten einer gesunden Kontrollperson,

wobei die positive Feststellung einer Veränderung des Körpergeruchs und/oder des Geruchs einer Urinprobe der behandelten Person im Vergleich zur selben Person vor der Alkaloidgabe, und/oder die positive Bestimmung der Anwesenheit eines induzierten Krebsmarkers und/oder eines veränderten Alkaloidprofils in der Blut- oder Urinprobe der behandelten Person, jeweils im Vergleich zu korrespondierenden Werten einer gesunden Kontrollperson, auf das Vorhandensein von Krebszellen im Körper der Person hinweist.

2. Diagnoseverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der induzierte Krebsmarker ein Umwandlungs- oder Abbauprodukt eines verabreichten Isochinolin-Alkaloids ist.

3. Diagnoseverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der induzierte Krebsmarker ein durch die Einwirkung eines Isochinolin-Alkaloids mit quartärem Stickstoffatom unmittelbar oder mittelbar hervorgerufenes, nicht-alkaloidisches Stoffwechselprodukt ist.

4. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge- kennzeichnet, dass eine Veränderung des Alkaloidprofils eine Abnahme des

Alkaloidgehalts in Bezug auf mindestens eines der verabreichten Alkaloide mit quartärem Stickstoffatom umfasst.

5. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine subjektiv oder mittels Olfaktometrie festgestellte Geruchsveränderung durch Gaschromatografie bestätigt wird .

6. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein induzierter Krebsmarker mittels Gelchromatografie oder UV-Absorptionsspektroskopie bestimmt wird .

7. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Isochinolin-Alkaloid mit quartärem Stickstoffatom ausgewählt ist aus der Gruppe Chelerythrin, Sanguinarin und Berberin, sowie Chelidonin, Protopin, Stylopin, Allocryptopin,

Homochelidonin, Chelamidin, Chelamin, L-Spartein, und Oxychelidonin, jeweils in quaternierter Form .

8. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkaloidpräparat eine wässrige Lösung ist und einen Isochinolin-Alkaloidgehalt von insgesamt 0.1 - 1 0mg/ml aufweist.

9. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkaloidpräparat eine Mischung aus zwei oder mehr Isochinolin-Alkaloiden mit quartärem Stickstoffatom enthält.

1 0. Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das vorbestimmte Zeitintervall 1 0 bis 60 Minuten beträgt.

1 1 . Diagnoseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Alkaloidpräparat oral, insbesondere sublingual, verabreicht wird .