WO2015137441A1 - 抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクター - Google Patents

抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクター Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof, a myristoylated protein detection kit, a medicine, a gene, and a vector.
  • Non-Patent Document 1 Since it was discovered that myristic acid was bound to the N-terminus during primary sequencing of cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit (see Non-Patent Document 1), more than 100 ⁇ myristoylated proteins have been found so far. It has been reported that several percent of the total protein has undergone myristoylation from the genomic sequence (see Non-Patent Document 2).
  • Myristoylation is a type of post-translational modification in which myristic acid, a saturated fatty acid having 14 carbon atoms, is added to the N-terminus of protein.
  • This modification is N-myristoyl that is universally present in all eukaryotes It is performed simultaneously with translation by a transferase (NMT: N-myristoytransferase, see Non-Patent Document 3).
  • Myristoylation occurs when NMT adds myristic acid via an amide bond to the ⁇ -amino group of glycine exposed by the removal of methionine at the N-terminus by methionine aminopeptidase with the peptide chain bound to ribosome during translation ( (Refer nonpatent literature 4.).
  • Non-Patent Document 5 There is no consensus sequence for myristoylation, but it is essential that the first from the N-terminus is glycine, the second is an uncharged amino acid (except for proline and aromatic amines), and the fifth is a charge. There is a tendency that amino acids having no amino acid, particularly serine, are present, and the sixth is an amino acid other than proline (see Non-Patent Document 5).
  • Nef which is an HIV gene product
  • Src kinase which is an oncogene product
  • myristoylation is involved in the functional expression of proteins (see Non-Patent Documents 6 and 7).
  • N-terminal glycine is mutated so that it cannot be myristoylated cannot bind to the cell membrane, and as a result, cancer metastasis activity may be lost.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof, a myristoylated protein detection kit, a medicine, a gene, and a vector that can be recognized only by interaction.
  • the present inventors have used an antibody library technology capable of cloning an antibody only by an intermolecular interaction between the antibody and the antigen, to thereby obtain an anti-myristoylated protein antibody or an antigen thereof.
  • the binding fragment was found and the present invention was completed.
  • the present invention provides an anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof, myristoylated protein detection kit, drug, gene, and vector having the following characteristics.
  • (a1) CDR-L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (B1) CDR-L2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (C1) CDR-L3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • a light chain variable domain comprising: and / or (D1) CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in which one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (E1) CDR-H2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, wherein 1
  • (a2) CDR-L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (B2) CDR-L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, wherein 1 to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (C2) CDR-L3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • a light chain variable domain comprising: and / or (D2) CDR-H1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added
  • (E2) CDR-H2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in which one
  • CDR-L1 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • CDR-L2 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • CDR-L3 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • Light chain variable domain, and / or A heavy chain variable comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDR-H2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and CDR-H3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to (5) having a domain.
  • CDR-L1 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, CDR-L2 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and CDR-L3 including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17
  • the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to (9) having a domain.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and the amino acid shown in SEQ ID NO: 26
  • the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to (13) or (14) above which has the sequence and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 in this order.
  • a myristoylated protein detection kit comprising the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (16).
  • a medicament comprising the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (16) as an active ingredient.
  • a gene comprising a DNA encoding the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (16).
  • (21) (g2) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, (H2) DNA encoding a protein consisting of a base sequence in which 1 to several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 and having the ability to recognize myristoylated protein, (I2) DNA encoding a protein consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 and having the ability to recognize myristoylated protein, or (J2) A protein comprising a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, and having a myristoylated protein recognition ability A gene characterized by comprising a DNA encoding.
  • (22) (g3) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 24, (H3) a DNA encoding a protein consisting of a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 24, and having a myristoylated protein recognition ability; (I3) DNA encoding a protein consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 and having the ability to recognize myristoylated protein, or (J3) a protein comprising a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 24, and having a myristoylated protein recognition ability A gene characterized by comprising a DNA encoding.
  • an anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof that can be recognized only by interaction can be provided.
  • the anti-myristoylated protein antibody of the present embodiment or an antigen-binding fragment thereof (hereinafter also referred to as the antibody of the present embodiment) (A1) CDR-L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added; (B1) CDR-L2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one to several amino acids are deleted, substituted or added; (C1) CDR-L3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added; A light chain variable domain comprising: and / or (D1) CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence shown in S
  • the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment specifically recognizes the myristoyl group of the myristoylated protein. Therefore, as long as it retains the myristoyl group-specific recognition ability, one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 of (a1) to (f1). It may be.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2.
  • the anti-myristoylated protein antibody of the present embodiment or the antigen-binding fragment thereof flexibly combines the heavy chain variable domain and the light chain variable domain, which are the minimum units necessary for recognizing the antigen. It is preferably a single variable domain fragment linked by a simple peptide linker. That is, it is preferably an scFv antibody.
  • the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • It preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in this order, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. Is more preferable.
  • the method for producing the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment is not particularly limited, and a commonly used animal immunization method or a method for producing an antibody using a hybridoma may be used.
  • the growth rate of animal cells is slow and time consuming, antigens that are harmful to animals (lethal) cannot be used, only epitopes (antigen binding sites of antibodies) and specific antibodies with limited binding power can be obtained. Since there are problems such as difficulty in obtaining an antibody gene, it is preferable to use a method for producing a monoclonal antibody using a phage antibody library that can clone an antibody gene only by the intermolecular interaction between the antibody and the antigen.
  • An antibody library is obtained by cloning all antibody genes from a single solid animal or a plurality of solid animals, and converting all the variable domains thereof into recombinant forms (scFv antibodies), each with one filamentous phage (for example, This is a technique for producing a set of phages that display all antibodies without omission by fusion expression with the outer protein of M13) (see FIG. 1).
  • the target anti-myristoylated protein antibody is selected by panning with a set of antibodies displayed on phage using such an antibody library. By repeating the panning cycle several times, an anti-myristoylated protein antibody having a high affinity for the myristoyl group as an antigen can be obtained from the antibody library.
  • myristoylated protein that is a target protein (antigen) is immobilized on a plate, reacted with a phage antibody, unbound phage is washed, and the bound phage antibody is eluted to infect Escherichia coli (for example, DH12S). And repeat the operation. Thereby, it is possible to select an antibody only by whether the antibody expressed to the antigen molecule binds or not. Further, as shown in the Examples, myristoylated protein may be immobilized on beads. From the two viewpoints of (1) increase in the absolute number of antigen molecules to be presented and (2) exposure of appropriate antigen sites, bead screening using beads is preferred.
  • Non-immune libraries and immune libraries are prepared by cloning all antibody genes prepared in vivo by the animal from which they are derived. At this time, an animal that has not been immunized is used in the non-immunized library, and an animal that has been immunized with the target antigen is used in the immune library. In the former, any antigen can be used, and various antibodies with different epitopes and binding powers can be obtained. In the latter case, antibodies with high specificity and strong binding force are often obtained.
  • a synthetic library is a library in which CDR region genes having diversity among antibody variable regions are substituted with random amino acids.
  • An antibody library does not necessarily require immunity, and all antibodies possessed by animals are candidates, so that they may exist in large amounts in vivo, such as toxic substances and antibodies of the present invention, and cause an immune reaction. Antibodies against difficult molecules can also be obtained.
  • affinity maturation antibody affinity maturation
  • affinity maturation that produces antibodies with higher affinity by repeated stimulation with antigen is performed, but by introducing mutations and panning repeatedly, This phenomenon can be reproduced in vitro.
  • antibody genes can be obtained together with antibody molecules, one of the merits is that continuous antibody production is possible and antibody molecules can be modified.
  • an antibody expression vector for phage display is the vector shown in FIG. 3 (provided by Fujita Health University, Kurosawa Laboratory).
  • the antibody is first expressed as a single chain antibody (scFv) in a form fused with cp3, which is a part of the phage outer membrane.
  • scFv single chain antibody
  • this vector is recovered from the phage bound to the antigen via the antibody, and the cp3 gene is removed by SalI treatment to obtain an scFv antibody fused with proteinA. Therefore, the obtained scFv antibody can be easily purified on a column on which IgG to which protein A binds is immobilized.
  • the antibody of this embodiment is (A2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or CDR-L1 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, (B2) CDR-L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, wherein 1 to several amino acids are deleted, substituted or added; (C2) CDR-L3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added; A light chain variable domain comprising: and / or (D2) CDR-H1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added; (E2) CDR-H2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or
  • a light chain variable domain comprising -L3, and / or A heavy chain variable comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, CDR-H2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and CDR-H3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • it includes a domain.
  • one to several amino acids may be deleted, substituted or added in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 8 to 13 of (a2) to (f2).
  • the antibody of the present embodiment is preferably an scFv antibody.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 8 It is more preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in this order, and it is particularly preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. .
  • the antibody of this embodiment is (A3) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, or CDR-L1 comprising an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, (B3) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or CDR-L2 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, (C3) CDR-L3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 in which one to several amino acids are deleted, substituted or added; A light chain variable domain comprising: and / or (D3) CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in which one to several amino acids are deleted, substituted or added; (E3) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 or CDR-H2 comprising
  • a light chain variable domain comprising -L3, and / or A heavy chain variable comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, CDR-H2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and CDR-H3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • it includes a domain.
  • one to several amino acids may be deleted, substituted, or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 15 to 20 in the above (a3) to (f3).
  • the antibody of this embodiment is preferably an scFv antibody, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 15 It is more preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 in this order, and it is particularly preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 .
  • the antibody of this embodiment is (A4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, or CDR-L1 comprising an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25; (B4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, or CDR-L2 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26; (C4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, or CDR-L3 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27; A light chain variable domain comprising: and / or (D4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, or CDR-H1 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28; (E4) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25
  • a light chain variable domain comprising -L3, and / or A heavy chain variable comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, CDR-H2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and CDR-H3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • it includes a domain.
  • one to several amino acids may be deleted, substituted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 25 to 30 in the above (a4) to (f4).
  • the antibody of the present embodiment is preferably an scFv antibody.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 25 It is more preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 in this order, and it is particularly preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31. .
  • the gene of the present invention comprises DNA encoding the above-described anti-myristoylated protein antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the gene is not particularly limited as long as it includes DNA encoding the heavy chain variable domain and the light chain variable domain of the antibody of the present invention, and the gene including DNA encoding the heavy chain variable domain, and the light chain It may be composed of two genes including a gene encoding a variable domain. From the viewpoint of easy handling, a base sequence having high homology (base sequence identity) with the base sequence of the DNA encoding the scFv antibody described above is preferable.
  • the gene of this embodiment is composed of the DNA encoding the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the first embodiment described above, specifically, any one of the following bases (g1) to (j1): DNA consisting of sequences.
  • the number of bases that may be deleted, substituted or added is preferably from 1 to 30, more preferably from 1 to 15, particularly preferably from 1 to 10, and most preferably from 1 to 5 .
  • stringent conditions includes, for example, a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL 2nd EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). For example, 5 ⁇ SSC (composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0), 0.1 wt% N-lauroyl sarcosine, 0.02 wt% SDS, 2 wt% The hybridization can be performed by incubation for several hours to overnight at 55 to 70 ° C. in a hybridization buffer consisting of a blocking reagent for nucleic acid hybridization and 50% formamide.
  • the washing buffer used for washing after incubation is preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS, more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS.
  • the gene of this embodiment consists of DNA encoding the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the second embodiment described above, and specifically, any one of the following bases (g2) to (j2): DNA consisting of sequences.
  • the gene of this embodiment consists of DNA encoding the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the third embodiment described above, specifically, any one of the following bases (g3) to (j3): DNA consisting of sequences.
  • the gene of this embodiment is composed of the DNA encoding the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof of the fourth embodiment described above, specifically, any one of the following bases (g4) to (j4): DNA consisting of sequences.
  • (G4) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32
  • (H4) a DNA encoding a protein consisting of a base sequence in which 1 to several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 32, and having a myristoylated protein recognition ability
  • (I4) DNA encoding a protein consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and having the ability to recognize myristoylated protein
  • (J4) a protein comprising a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 and having the ability to recognize myristoylated proteins
  • the recombinant vector of the present invention is obtained by inserting the above-described gene of the present invention into an expression vector. Specifically, a DNA encoding an anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof is added to the expression vector. , Inserted through a restriction enzyme site.
  • the DNA inserted into the recombinant vector of the present invention includes DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23, DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24, Or the DNA which consists of a base sequence shown by sequence number 32 is preferable.
  • the expression vector used in the present invention includes a cell-based vector that allows a host cell to express an anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof; a protein translation system comprising a component having the ability to synthesize proteins extracted from a suitable cell.
  • a cell-free vector that expresses myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof can be mentioned.
  • the cell system vector a known expression vector suitable for the host cell is used.
  • Escherichia coli examples include ColE-type plasmids typified by pBR322 derivatives, pACYC-type plasmids having a p15A origin, pSC-type plasmids, and Bac-type F factor-derived mini-F plasmids.
  • Other examples include expression vectors having tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, arabinose-inducible promoter, cold shock promoter, tetracycline-inducible promoter, and the like.
  • Introduction of a recombinant vector into which a gene is incorporated into a host can be performed using a conventionally known method.
  • a competent cell method using microbial cells treated with calcium, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • a phage vector may be used to infect and introduce into a microbial cell.
  • the cell-free vector examples include an expression vector having a T7 promoter and an expression vector having a T3 promoter mentioned in the cell-based vector; a vector for wheat cell-free protein synthesis such as a pEU-based plasmid having an SP6 promoter or a T7 promoter. It is done.
  • RNA synthesis using a cell-free vector In protein synthesis using a cell-free vector, first, using a transcription system, the DNA of an anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof is transcribed to synthesize mRNA.
  • transcription systems include conventionally known ones that are transcribed with RNA polymerase.
  • the RNA polymerase include T7 RNA polymerase.
  • a cell-free protein synthesis system which is a translation system, mRNA is translated and a protein is synthesized. This system contains elements necessary for translation, such as ribosomes, translation initiation factors, translation elongation factors, dissociation factors, and aminoacyl-tRNA synthetases.
  • Examples of such protein translation systems include Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, and wheat germ extract. Furthermore, there is a reconstituted cell-free protein synthesis system in which the elements necessary for the translation are composed solely of independently purified factors.
  • An anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof can be purified from a protein synthesized using a cell-based vector or a cell-free vector. Examples of the purification method include salting out methods and methods using various chromatographies. If the expression vector is designed to express a tag sequence such as a histidine tag at the N-terminus or C-terminus of the target protein, use an affinity column that uses a substance having an affinity for this tag, such as nickel or cobalt. A purification method is mentioned. In addition, the purity of the purified anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof can be increased by purifying it in combination as appropriate, such as ion exchange chromatography or gel filtration chromatography.
  • the myristoylated protein detection kit of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-described anti-myristoylated protein antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the myristoylated protein detection kit of the present invention includes an ELISA kit for colorimetric determination by the sandwich method. Specifically, a 96-well plate coated with the anti-myristoylated protein antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, a secondary antibody labeled with an enzyme such as HRP (Horseadish peroxidase), and a chromogenic substrate of the enzyme And including.
  • HRP Hexeadish peroxidase
  • the medicament of the present invention contains an anti-myristoylated protein antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • protein myristoylation has been reported in proteins involved in intracellular signal transduction systems such as oncogene product Src kinase and HIV gene products such as Nef.
  • the anti-myristoylated protein antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof functions as a neutralizing antibody
  • the medicament of the present invention containing this as an active ingredient is expected to have a therapeutic effect on various diseases.
  • target diseases for which the therapeutic effect of the medicament of the present invention is expected include human solid cancer.
  • human solid cancer examples include brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, small cell cancer, non-small cell cancer, breast cancer, stomach cancer, gallbladder / bile duct cancer, and liver.
  • Cancer pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer, ovarian cancer, choriocarcinoma cancer, endometrial cancer, cervical cancer, renal pelvis / ureter cancer, bladder cancer, prostate cancer, penis Cancer, testicular cancer, fetal cancer, Wilms cancer, skin cancer, malignant melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, Ewing's tumor, soft tissue sarcoma, etc.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease; diabetes and the like.
  • Examples of formulation in the medicament of the present invention include those used orally as tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as necessary. Or what is used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension. Furthermore, a pharmacologically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative And those formulated by mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice, in appropriate combination with agents, binders and the like.
  • Additives that can be mixed into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling such as corn starch, gelatin and alginic acid Agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red mono oil or cherry.
  • the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or oral administration to patients are performed by methods known to those skilled in the art. sell.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the medicament of the present invention varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, generally for an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to It is believed that 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method. For example, in the form of an injection, it is usually 1 for an adult (with a body weight of 60 kg). It may be convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection.
  • One aspect of the present invention also provides the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof for therapy.
  • One aspect of the invention also provides a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • One aspect of the present invention also provides use of the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof for the manufacture of a therapeutic agent.
  • One aspect of the present invention also provides a therapeutic method comprising administering an effective amount of the anti-myristoylated protein antibody or antigen-binding fragment thereof to a patient in need of treatment.
  • NAP22 neural axial membrane protein 22 kDa: myristoylated protein specifically expressed in the brain
  • E. coli BL21 (DE3) strain having a plasmid (pET14b_NAP22) in which the rat-derived NAP22 gene is inserted into pET14b vector is used.
  • the BL21 (DE3) strain transformed with pET14b_NAP22 was cultured overnight at 37 ° C. on an LB plate (hereinafter referred to as “Amp.”) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin (hereinafter referred to as “Amp.”).
  • LBA medium LB medium
  • plasmid extraction 5 mL of LB medium (hereinafter referred to as LBA medium) containing 100 ⁇ g / mL Amp.
  • glycerol stock preparation 5 mL of LB medium (hereinafter referred to as LBA medium) containing 100 ⁇ g / mL Amp.
  • LBA medium LB medium
  • the collected cells before and after induction were suspended in 60 ⁇ L cell lytic B (SIGMA), and the culture supernatant was collected at 12,000 rpm, 10 min, 4 ° C. Subsequently, the supernatant was boiled at 95 ° C. for 15 min, and the resulting precipitate was removed by centrifugation at 12,000 rpm, 15 min, 4 ° C. This was again used as a sample before and after induction, and the expression level was confirmed by SDS-PAGE using 12.5% acrylamide gel. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, the most highly expressed clone2 was used as an expression strain of NAP22, and mass expression was performed.
  • SIGMA cell lytic B
  • NAP22 Hydrophobic chromatography was used for the purification of NAP22. According to the above procedure, NAP22 was expressed in 200 mL LBA medium, and the cells were collected at 10,000 rpm, 15 min, 4 ° C. After induction of 200 mL of this culture solution, the cells were suspended in 12 mL of TEG solution (10 mM Tris-HCl, 0.2 mM EGTA, pH 7.5). Using BRANSON SONIFIER 250, Duty Cycle: 50%, Output control: power 4, 5 min sonication ⁇ 2.5 min interval was repeated 3 times on ice to disrupt the cells. The supernatant was collected by centrifugation at 12,000 rpm, 30 min, 4 ° C.
  • This soluble fraction was used as a sample before purification, and subjected to FPLC using AKTAPlime (GE Healthcare).
  • AKTAPlime GE Healthcare
  • a HiPrep Phenyl FF (high sub) 16/10 column GE healthcare
  • 5 mL of pre-purification sample was injected into this column equilibrated beforehand with 40% saturated ammonium sulfate TEG solution, and 40% saturated ammonium sulfate TEG solution was allowed to flow at a flow rate of 1 mL / min for 10 minutes for washing.
  • a 0% saturated ammonium sulfate TEG solution was prepared as an elution buffer, and the protein was eluted by gradually decreasing the ammonium sulfate ratio from 40% to 0% at a flow rate of 1 ml / min and 30 min.
  • SDS-PAGE was performed on a 12.5% acrylamide gel for the fraction considered to contain protein from the absorbance value. The results are shown in FIG. In FIG. 5, the band indicated by the arrow indicates NAP22.
  • the fraction of fractions 110 to 120 in which a single band was confirmed was considered to be usable as a protein solution, and the fraction in this section was recovered as purified NAP22.
  • myrNAP22 was constructed by constructing a co-expression strain of NAP22 and N-myristoy transferase (hereinafter abbreviated as NMT). 3) The pBB131 vector in which the yeast N-myristoy transferase cDNA was incorporated was introduced into the NAP22 expression strain that was determined to have the highest expression level by the above expression confirmation.
  • NMT N-myristoy transferase
  • the NAP22 expression strain which was determined to have the highest expression level by confirming the expression, was made competent cells.
  • a glycerol stock of a NAP22 expression strain was generated and cultured overnight at 37 ° C. on an LBA plate.
  • the cells were suspended in 20 mL of an ice-cooled transformation buffer, incubated for 10 min on ice, and then centrifuged at 4 ° C., 3,000 rpm, 10 min, and the supernatant was removed.
  • the cells were suspended again with 5 mL transformation buffer, DMSO with a final concentration of 7% was added, and the mixture was allowed to stand for 10 min on ice. Thereafter, 100 ⁇ L each was dispensed, snap-frozen with liquid nitrogen, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • the transformation buffer was prepared by adjusting the composition of Table 2 to pH 6.7 to 6.8 with KOH, adding 5.45 g of MnCl 2 .4H 2 O, making up to 500 mL with milliQ, and sterilizing by filter.
  • a pBB131 vector (pBB131_yNMT) in which yeast N-myristol transfer cDNA was incorporated was introduced into this competent cell by the heat shock method.
  • 1 ⁇ L of pBB131_yNMT and 20 ⁇ L of NAP22 expression strain competent cell were mixed. The mixture was allowed to stand for 30 min on ice, then incubated at 42 ° C. for 45 sec, and immediately left for 2 min on ice. Four times the amount of LB medium was added and mixed, followed by shaking culture at 37 ° C. for 1 hour.
  • LBAK plate LBA plate containing 50 ⁇ g / mL kanamycin
  • 20 ⁇ L of non-transformed NAP22-expressing strain competent cells were diluted with 80 ⁇ L of LB medium, then each 50 ⁇ L was plated on LBAK and LBA plates, and cultured at 37 ° C. overnight.
  • Five grown colonies were picked up and cultured overnight at 37 ° C. in 2 mL of LBA medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (hereinafter referred to as “LBAK medium”). From each preculture, 1) plasmid extraction, 2) glycerol stock preparation, and 3) expression confirmation were performed.
  • BRANSON SONIFIER 250 Duty Cycle: 50%, Output control: power3, 30 min sonication ⁇ 1 min interval was repeated twice. This was centrifuged at 12,000 rpm, 10 min, 4 ° C., and the culture supernatant was collected. This was used as a sample after induction. Pre-induction cells were collected from 2 mL of the pre-induction culture by centrifugation at 12,000 rpm, 5 min, 4 ° C. After adding 240 ⁇ L cell lytic B and disrupting the cells by pipetting, the culture supernatant was collected at 2,000 rpm, 5 min, 4 ° C. to obtain a sample before induction.
  • myrNAP22 was expressed in large quantities on a 200 mL scale.
  • a glycerol stock of myrNAP22 expression strain was raised, inoculated into 3 mL of LBAK medium, and cultured at 37 ° C. overnight. This preculture was added to 200 mL of LBAK and cultured at 30 ° C. for 4 hours. Expression was induced with a final concentration of 1 mM IPTG, and then the culture was continued for 8 hours. After centrifuging at 12,000 rpm for 15 min at 4 ° C.
  • RNA extraction preparation of a rabbit immune library [Total RNA extraction] Since the myristoyl group has a low molecular weight and is contained in the living body, even if the myristoyl group is immunized as it is, it does not exhibit antigenicity. Therefore, a myristoyl group was conjugated to KLH (Keyhole limpet hemocyanin, 450 kDa-13000 kDa). The myristoyl group does not bind unless the N-terminal of the protein to be bound is glycine, and KLH does not bind unless the molecule to be bound is a peptide or protein. Combined. The linker peptide was designed to have a sequence that does not exist naturally among myristoylated proteins.
  • myristol-GKRKC-KLH (abbreviated as myrKLH)
  • RNAlater RNA Stabilization Reagent QIAGEN
  • concentration of total RNA extracted by absorbance was estimated.
  • a solution having the composition shown in Table 5 was mixed and incubated at 65 ° C. for 5 minutes and on ice for 2 minutes.
  • the solution having the composition shown in Table 4 was further mixed with the solution having the composition shown in Table 5 and incubated at 42 ° C. for 2 minutes.
  • 6 ⁇ L of reverse transcriptase was further mixed with this solution, and incubated at 42 ° C. for 50 minutes, 70 ° C. for 15 minutes, and on ice for 5 minutes.
  • Ribonuclease H (manufactured by Invitrogen) was added to this solution and incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
  • the synthesized cDNA solution was purified using QIAquick purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • each antibody gene was amplified by PCR using primers specific to each antibody gene. At that time, the optimum number of cycles was estimated.
  • Each specific primer is a mixture of sequences common to the V gene group (V primer) and the J gene group (J primer) at both ends of the variable region.
  • the number of cycles in amplification of each gene was distributed from 24 cycles to 36 cycles, PCR reaction was performed, and amplification products were confirmed by agarose electrophoresis.
  • the composition of the reaction solution in the PCR reaction is shown in Table 6, and the reaction conditions for the PCR reaction are shown in Table 7.
  • Each PCR reaction solution was treated with phenol / chloroform and precipitated with ethanol, and then purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN). Each reaction solution was mixed with 1/5 equivalent of 6 ⁇ Loading Dye (TaKaRa) and electrophoresed on a 2% agarose gel to confirm that the target band was present.
  • the purified antibody gene light chain (k chain, ⁇ chain) and the antibody display vector for phage display shown in FIG. 3 were treated with restriction enzymes with NcoI and AscI. 10 ⁇ L of 10 ⁇ buffer, 1.2 ⁇ L each of NcoI and AscI were added to 4 ⁇ g of each antibody gene, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. 18 ⁇ L of 10 ⁇ buffer and 9 ⁇ L each of NcoI and AscI were added to 30 ⁇ g of vector, and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the antibody gene after the restriction enzyme treatment is purified using QIA PCR purification Kit (manufactured by QIAGEN), and the vector after the restriction enzyme treatment is purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) and agarose electrophoresis is performed. Confirmed cutting.
  • the restriction enzyme-treated sample was ligated at 15 ° C. for 3 hours with the following reaction composition.
  • the k chain and ⁇ chain ligation products were confirmed by agarose electrophoresis, and ethanol precipitation was performed.
  • 5 ⁇ L of each sample and 100 ⁇ L of DH12S were mixed, transformed by electroporation (25 ⁇ F, 2.5 kV, 200 ⁇ ), cultured in 2 ⁇ YT medium 10 mL at 37 ° C. for 1 hour, and a part (100 ⁇ L, 10 ⁇ L). 1 ⁇ L) was plated on LBGA plates and incubated overnight at 37 ° C. Further, 190 mL of 2 ⁇ YTGA was added to the 10 mL culture solution and cultured overnight at 30 ° C. The composition of the medium used is shown below.
  • 2 ⁇ YT triptone 16 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g (1 L) 2 ⁇ YTGA: 2 ⁇ YT + Amp final 20 ⁇ g / mL, Glucose final 1%
  • LB plate triptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, agar 15g (1L) LBGA plate: LB plate + Amp final 20 ⁇ g / mL, Glucose final 1%
  • Plasmids were extracted from 200 mL of each culture solution using Maxi prep (manufactured by QIAGEN), and the target bands were confirmed by agarose electrophoresis, which were designated as rabbit immune k chain and ⁇ chain library plasmids, respectively.
  • the repertoire was estimated from the number of colonies on the plate, 10 colonies were picked up, and the base sequence of plasmid DNA extracted from the selected colonies was analyzed.
  • the composition of the solution used in the sequence reaction is shown in Table 11, and the conditions for the sequence reaction are shown in Table 12.
  • the purified heavy chain gene (H chain) and light chain (k chain, ⁇ chain) library was treated with SfiI at 50 ° C. for 2 hours. Specifically, 10 ⁇ L of 10 ⁇ buffer and 6 ⁇ L of SfiI were added to 4 ⁇ g heavy chain gene, incubated at 50 ° C. for 2 hours, and cleavage was confirmed by agarose electrophoresis. In addition, 20 ⁇ L of 10 ⁇ buffer and 10 ⁇ L of SfiI were added to 5 ⁇ g of a light chain library in which the light chain k chain gene and the light chain ⁇ chain gene were mixed at 9: 1, and incubated at 50 ° C.
  • the heavy chain ligation product was confirmed by electrophoresis and ethanol precipitation was performed.
  • 19 ⁇ L of the sample and 100 ⁇ L of DH12S were mixed, transformed by electroporation, added to 1000 mL of 2 ⁇ YT medium, cultured at 37 ° C. for 1 hour, and a part (100 ⁇ L, 10 ⁇ L, 1 ⁇ L) was plated on an LBGA plate. Incubated overnight at 37 ° C. Further, Glucosecofinal 1% and Ampicileine final 20 ⁇ g / ml were added to the culture solution, followed by incubation at 30 ° C. overnight.
  • the number of repertoires was estimated from the number of colonies on the plate, 10 colonies were picked up, and the base sequence of plasmid DNA extracted from the selected colonies was analyzed.
  • the composition of the solution used for the sequence reaction is the same as in Table 11, and the sequence reaction conditions are the same as in Table 12.
  • LBAK plate overnight at 1/10 ⁇ L, 1/100 ⁇ L, and 1/1000 ⁇ L, respectively.
  • the bacterial cells were removed from the 200 mL liquid medium by centrifugation at 10,000 rpm, 4 ° C., and 10 min, and the culture supernatant containing the phage antibody was recovered.
  • 4 mL of 20% polyethylene glycol (hereinafter abbreviated as “PEG”) was added, vigorously mixed by vortexing, and then allowed to stand for 10 min for Room Temperature (hereinafter abbreviated as “RT”).
  • PEG polyethylene glycol
  • 50 ⁇ L of each post-infection bacterial solution was plated on an LBA plate and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the composition of the medium and reagents used is shown below.
  • a glycerol stock was prepared using 140 ⁇ L of the above preculture. The manufacturing method was the same as described above.
  • Antigen beads using myrNAP22 prepared for screening were prepared. MyrNAP22 was biotinylated for immobilization on beads via streptavidin.
  • Biotinylation of myrNAP22 Biotinylation was performed using Biotin Labeling kit-NH 2 (DOJINDO). Based on the result of SDS-PAGE, the concentration of myrNAP22 was estimated, and a sample solution containing about 50 ⁇ g of myrNAP22 was mixed with 200 ⁇ L of 1/10 ⁇ WS buffer diluted with PBS. Using Amicon Ultra4, 10,000 MWCO previously moistened with pure water, centrifugation was performed at 5,000 g, RT, 15 min to remove and concentrate impurities. After discarding the filtrate and washing again in the same manner, about 20 ⁇ L of the sample was collected and transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube.
  • DOJINDO Biotin Labeling kit-NH 2
  • Bio-myrNAP22 Biotinylated myrNAP22
  • phage antibody 500 ⁇ L of the above culture solution was transferred to 5 mL 2 ⁇ YT medium, and 50 ⁇ L of M13KO7 helper phage was added thereto and infected at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 2 ⁇ YTA was added to a total volume of 40 mL, and a final concentration of 50 ⁇ M kanamycin was added, followed by shaking culture at 30 ° C. overnight. After completion of the cultivation, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm, 4 ° C., and 15 minutes. 5 mL of 20% PEG was added and mixed vigorously with vortex.
  • Monoclonal antibodies were prepared from the plate culture at each screening. The colonies grown in the plate culture at each screening stage were picked up, and the expression of each cp3 form monoclonal antibody and the determination of the amino acid sequence of a part of the antibody genes were attempted.
  • [Cp3 form expression] A portion of the phage-infected E. coli was plated. Colonies were picked up from each plate, and each was cultured in 2 mL of 2 ⁇ YTA medium at 37 ° C. overnight. 50 ⁇ L of each preculture was subcultured to 1 mL of 2 ⁇ YTA medium (hereinafter abbreviated as 2 ⁇ YTAI) containing IPTG having a final concentration of 1 mM, and further cultured at 30 ° C. overnight. In addition, 70 ⁇ L of each preculture solution was mixed with 30 ⁇ L of 50% glycerol to obtain each monoclonal antibody glycerol stock.
  • 2 ⁇ YTAI 2 ⁇ YTA medium
  • the supernatant was collected by centrifugation at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min, and used as each cp3 form monoclonal antibody solution. Subsequently, concentration by ammonium sulfate precipitation was performed. An equal amount of saturated ammonium sulfate was added to the sample, vigorously mixed using vortex, and then incubated at RT for 5 min. Centrifugation was performed at 12,000 rpm, 4 ° C., 7 min, and the resulting precipitate was suspended in 0.05% NaN 3 in PBS of 1/10 volume of the sample. The mixture was centrifuged again at 12,000 rpm, 4 ° C., 7 min to remove insoluble matters, and this was used as the final cp3 form monoclonal antibody solution.
  • the plate was washed 3 times with PBS, and 100 ⁇ L of 1/2000 ⁇ ⁇ -cp3 antibody in PBST0.05 was added as a primary antibody. After reacting for 1 hour with shaking at RT, the antibody solution was discarded and washed 3 times with PBS. Subsequently, 100 ⁇ L of 1/4000 ⁇ ⁇ -IgG (H + L chain) (Rabbit) pAb-HRP (MBL) in PBST0.05 was added as a secondary antibody and allowed to react for 1 hour with shaking at RT. It was. After discarding the antibody solution and washing with PBS three times, a substrate solution using an OPD tablet was prepared for detection, and 200 ⁇ L was added to each well.
  • the concentration of the plasmid was estimated based on the results of agarose electrophoresis.
  • a PCR reaction solution was prepared with the composition shown in Table 16, and PCR was performed under the reaction conditions shown in Table 17 to amplify the antibody gene. After the reaction, 5 ⁇ L of 125 mM EDTA and 60 ⁇ L of 100% EtOH were added and tapped. The mixture was incubated at -20 ° C for 20 min and centrifuged at 12,000 rpm for 20 min at 4 ° C to remove the supernatant. 60 ⁇ L of 70% EtOH was added, centrifuged at 12,000 rpm, 10 min, 4 ° C., and the supernatant was removed again. The lid of the Eppendorf tube was opened and dried at room temperature for 5 minutes, and 20 ⁇ L of formamide was added and pipetted. Heating block was performed at 95 ° C. for 3 min and analyzed.
  • the SPR method was used to quantify the binding force of the antibody to the antigen.
  • BIAcore-X GE Healthcare
  • NAP22 and myrNAP22 purified as described above were used as ligands.
  • the concentration was calculated using SDS-PAGE and ultraviolet absorption method for NAP22, and using bradford method for myrNAP22 in addition to SDS-PAGE.
  • the unpurified cp3 form monoclonal antibody of the above three clones having a high color intensity ratio (myrNAP / NAP) was used.
  • the concentration of cp3 form was estimated from the results of SYPRO Ruby staining by SDS-PAGE using 12.5% acrylamide gel.
  • a protein was expressed in E. coli transformed with a vector (pTZ19R_original) before cloning of the antibody gene, and the lysate was used.
  • CM5 to be bound by the amino coupling method was used as a sensor chip for binding the ligand.
  • HBS 10 mM HEPES 150 mM NaCl pH 7.5
  • the optimum pH of the ligand dilution buffer was examined. 10 mM sodium acetate pH 4.0, 4.5, 5.0
  • the ligand solution was diluted with each immobilization buffer and flowed at 10 ⁇ L / min. The buffer with the largest amount of immobilization was set to the optimum pH.
  • TBS-T0.05 0.05% Tween20 in TBS
  • Skim-milk in TBS-T 1 hour at room temperature.
  • the above three clones diluted 5-fold with 5% skim milk in TBS-T0.05 were reacted as primary antibodies.
  • 1/2000 ⁇ ⁇ -cp3 antibody in TBS-T0.05 capable of recognizing cp3 of a monoclonal antibody was used.
  • this secondary antibody is a rabbit-derived IgG type, it can be detected by using 1/4000 ⁇ ⁇ -IgG (H + L chain) (Rabbit) pAb-HRP (MBL) in TBS-T0.05 as the tertiary antibody. Met.
  • Western blotting using 1/100 ⁇ ⁇ -NAP22 (M-65): sc-66995 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) in TBS-T0.05 was also performed.
  • 1/4000 ⁇ ⁇ -IgG (H + L chain) (Rabbit) pAb-HRP (MBL) in TBS-T0.05 was used as the secondary antibody.
  • the clone 119 was noted as a clone having a high color intensity ratio (myrNAP / NAP).
  • the results of ELISA for clone 119 are shown in Table 21.
  • the supernatant was recovered, and the precipitate obtained by ammonium sulfate precipitation was dissolved in 40 mL of PBS to obtain an antibody solution.
  • 50 ⁇ L of IgG Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) was filled in the column, and the antibody solution (40 mL) obtained previously was allowed to react through the column to obtain antibody beads.
  • the antibody beads were eluted with SDS elution buffer (2% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glycerol, 0.5 mM EDTA, 100 mM DTT, BPB) to check the expression of bound clone 119 and to the beads.
  • lane 1 shows a clone 119 bound to the beads
  • lane 2 shows a control clone (an antibody clone randomly cloned from the library) bound to the beads used as a control.
  • a band was confirmed at a position of 40 kDa, and the bands of the two types of antibodies had the same intensity, so it was confirmed that equal amounts of clone 119 and control clone could be bound to each bead.
  • the signal intensity of lane 1 was 61% of the signal intensity of lane 3.
  • the signal intensity of Lane 2 was 90% of the signal intensity of Lane 3. That is, it was confirmed that about 30% to 40% of myrNAP22 antigen can be immunoprecipitated using clone 119.
  • the reason why a variety of antibodies with high specificity were obtained in this example is that (1) increase in the absolute number of antigen molecules to be presented by using bead screening (2) exposure of appropriate antigen sites There are two points.
  • the beads used in this example can bind to 1,000 pmol of molecule per mg. Considering that the amount of protein that can be immobilized on one well in a plate screening is about 10 pmol, the number of antigen molecules to be presented has a difference of several tens of times or more.
  • plate screening has a major problem that a portion where the antibody cannot react at all is formed due to adsorption to the plate.
  • the myristoyl group used as an antigen in this example is so hydrophobic that it can anchor the protein to the membrane.
  • Anti-myristoylated protein antibodies or antigen-binding fragments thereof, myristoylated protein detection kits, drugs, genes, and vectors that can be recognized only by interaction can be provided.

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Abstract

配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。

Description

抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクター
　本発明は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターに関する。　本願は、２０１４年３月１４日に、日本に出願された特願２０１４－０５２５３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットの一次配列決定の際にＮ末端にミリスチン酸が結合していることが発見されてから（非特許文献１参照。）、現在までに１００ 以上のミリストイル化タンパク質が報告され、全タンパク質の数パーセントがミリストイル化を受けているとゲノム配列から推定されている（非特許文献２参照。）。
　ミリストイル化とは、タンパク質のＮ末端に炭素数１４個の飽和脂肪酸であるミリスチン酸が付加される翻訳後修飾の一種であり、この修飾はすべての真核生物に普遍的に存在するＮ－ミリストイル転移酵素（ＮＭＴ：Ｎ－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、非特許文献３参照。）によって翻訳と同時に行われる。
ミリストイル化は、翻訳時にペプチド鎖がリボソームに結合した状態で、メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端のメチオニンの除去により露出したグリシンのαアミノ基に、ＮＭＴがミリスチン酸をアミド結合で付加することで生じる（非特許文献４参照。）。ミリストイル化にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｎ末端から１番目がグリシンであることは必須であり、２番目は電荷を持たないアミノ酸（但し、プロリン、芳香族アミンを除く）、５番目は電荷を持たないアミノ酸、特にセリンが存在する場合が多く、６番目はプロリン以外のアミノ酸である、という傾向がある（非特許文献５参照。）。
細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質に多く見られるミリストイル化は、タンパク質と細胞膜との可逆的な相互作用のために機能している。例えば、ＨＩＶ遺伝子産物であるＮｅｆや、癌遺伝子産物であるＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅはミリストイル化がタンパク質の機能発現に関与していることが報告されている（非特許文献６，７参照。）。また、Ｎ末端グリシンに変異をいれミリストイル化できないようにしたタンパク質では細胞膜に結合できず、その結果、がんの転移活性がなくなる場合もあることも示唆されている。
タンパク質－膜間、あるいはタンパク質－タンパク質間の特異的相互作用を介して、タンパク質の細胞内局在や活性の制御を行うことにより細胞内情報伝達に深く関与しているミリストイル化タンパク質の検出は、それぞれの細胞の動作メカニズムを理解するための重要な知見を与える（非特許文献８，９参照。）。
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しかしながら、未知のミリストイル化タンパク質の存在が推定されているものの、化学的に安定で反応性の低いミリストイル基を簡便に検出する方法はこれまで存在しなかった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、抗体と抗原の分子間相互作用だけで抗体をクローニングすることが出来る抗体ライブラリー技術を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の特徴を有する抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供するものである。
（１）（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を有する重鎖可変ドメインを含む前記（１）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１）又は（２）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（５）（ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（６）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（５）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（７）配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（５）又は（６）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（８）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する前記（５）～（７）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（９）（ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１０）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（９）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（９）又は（１０）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１２）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する前記（９）～（１１）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１３）（ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（１３）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１５）配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１３）又は（１４）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１６）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する前記（１３）～（１５）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１７）前記（１）～（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
（１８）前記（１）～（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（１９）前記（１）～（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
（２０）（ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２１）（ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２２）（ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２３）（ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。（２４）前記（１９）～（２３）のいずれか一つに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
　本発明によれば、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することができる。
抗体ライブラリーに用いられるファージの構造を示す図である。 抗体ライブラリーのスクリーニング方法（パニング）の概要を示す図である。 ファージディスプレイ用の抗体発現ベクターを示す図である。 実施例におけるＮＡＰ２２の発現検討結果である。 実施例におけるＮＡＰ２２の精製検討結果である。 実施例におけるｍｙｒＮＡＰ２２の発現検討結果である。 実施例におけるｍｙｒＮＡＰ２２の質量分析結果である。 実施例における抗体ライブラリーのスクリーニング方法の概要を示す図である。 実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。 実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。 実施例におけるビアコアを用いた相互作用解析結果である。 実施例におけるモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。 実施例におけるモノクローナル抗体の発現チェックの結果、及びビーズへの結合量のチェック結果である。 実施例におけるモノクローナル抗体を用いた免疫沈降の検討結果である。
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント＞
［第一実施形態］
本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、本実施形態の抗体ともいう。）は、
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
　更に、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、本実施形態の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
　尚、本発明において、ＣＤＲはｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎを意味する。
　本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ミリストイル化されたタンパク質のミリストイル基を特異的に認識するものである。従って、ミリストイル基特異的認識能を保持していれば、前記（ａ１）～（ｆ１）の配列番号１～６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ ～５個が好ましく、１ ～ ２個がより好ましい。
　更に、発現精製が容易であることから、本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
　具体的には、本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましく、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
　本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法としては、特に限定されず、通常用いられる動物免疫法やハイブリドーマによる抗体作製法を用いてもよい。
　しかしながら、動物細胞の増殖速度が遅く時間がかかる、動物に有害（致死性）な抗原は使用出来ない、エピトープ（抗体の抗原結合部位）や結合力が限られた特定の抗体しか得られない、抗体遺伝子を得るのが困難、等の問題があることから、抗体と抗原の分子間相互作用のみで抗体遺伝子をクローニングできる、ファージ抗体ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の作製方法を用いることが好ましい。
抗体ライブラリーは、１固体の動物、あるいは、複数の固体の動物から全ての抗体遺伝子をクローニングし、その全ての可変ドメインを組み換え体の形（ｓｃＦｖ抗体）でそれぞれひとつの繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）の外郭タンパク質に融合して発現させることで、全ての抗体を漏れなく提示したファージのセットを作製する技術である（図１参照。）。図２に示すように、かかる抗体ライブラリーを用いてファージ上に提示された抗体のセットを用いてパニングを行うことによって、目的の抗ミリストイル化タンパク質抗体が選択される。パニングのサイクルを数回繰り返すことによって抗体ライブラリーの中から、抗原であるミリストイル基との親和性の高い抗ミリストイル化タンパク質抗体を取得することができる。
パニングでは、標的タンパク質（抗原）であるミリストイル化タンパク質をプレートに固定化し、ファージ抗体を反応させ、結合しなかったファージは洗浄し、結合したファージ抗体を溶出し大腸菌（例えば、ＤＨ１２Ｓ）に感染させて増殖させる、という操作を繰り返す。これにより、抗原分子に発現した抗体が結合するかしないかだけで抗体を選択することが可能である。
また、実施例において示すように、ミリストイル化タンパク質をビーズに固定化してもよい。（１）提示される抗原分子の絶対数の増加、（２）適切な抗原部位の露出の２つの観点から、ビーズを用いたビーズスクリーニングが好ましい。
抗体ライブラリーとしては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリー、合成ライブラリー等が挙げられる。非免疫ライブラリー及び免疫ライブラリーは、由来となる動物が体内で作製した抗体遺伝子を全てクローニングすることで作製する。このとき、非免疫ライブラリーでは免疫していない動物を、免疫ライブラリーでは目的の抗原で免疫した動物を使用する。前者ではどのような抗原も使用可能で、エピトープや結合力が異なる様々な抗体が得られる。後者では特異性が高く結合力が強い抗体が得られることが多い。合成ライブラリーは抗体の可変領域の中でも特に多様性を持つＣＤＲ領域の遺伝子をランダムなアミノ酸で置換をしたライブラリーである。この場合は多様性が得られるが、実際の生体内では機能する抗体だけが生み出されるのとは異なり、そこには不具合のある抗体が多数含まれている可能性があることが問題となる。
本実施形態においては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリーを用いることが好ましく、免疫ライブラリーを用いることがより好ましい。
　抗体ライブラリーは必ずしも免疫が必要ではなく、動物がもつ全ての抗体が候補となることから、毒物や本発明の抗体のような本来は生体内に大量に存在して免疫反応を惹起することが難しい分子に対する抗体も取得することが可能である。
また生体内では抗原による刺激が繰り返されることでより親和性の高い抗体を産出していくアフィニティーマチュレーション（抗体親和性成熟）がなされているが、遺伝子に変異を入れることやパニングを繰り返すことでこの現象をｉｎ　ｖｉｔｒｏ で再現できる。
また抗体分子とともに抗体の遺伝子も得ることができるため、継続的な抗体の生産が可能となることや、抗体分子の改変も出来ることもメリットのひとつである。
　ファージディスプレイ用の抗体発現ベクターとしては、例えば図３に示すベクターが挙げられる（藤田保健衛生大学、黒澤研究室より供与）。図３に示すベクターにおいて、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、最初はファージ外膜の一部であるｃｐ３と融合した形で発現される。次に、抗体を介して抗原に結合したファージからこのベクターを回収し、ＳａｌＩ処理を行うことでｃｐ３遺伝子を除去すると、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が融合したｓｃＦｖ抗体が得られる。そのため、得られたｓｃＦｖ抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が結合するＩｇＧを固相化したカラムで簡便に精製され得る。
［第二実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
　更に、本実施形態の抗体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
　本実施形態の抗体は、前記（ａ２）～（ｆ２）の配列番号８～１３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
　更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
［第三実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
　更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
　本実施形態の抗体は、前記（ａ３）～（ｆ３）の配列番号１５～２０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
　更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
［第四実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
　更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
　本実施形態の抗体は、前記（ａ４）～（ｆ４）の配列番号２５～３０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
　更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
＜遺伝子＞
　本発明の遺伝子は、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる。該遺伝子は、本発明の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含むものであれば、特に限定されず、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び、軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子の二つの遺伝子からなるものであってもよい。
　ハンドリングしやすさの観点からは、上述したｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
［第一実施形態］
　本実施形態の遺伝子は、上述した第一実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ１）～（ｊ１）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ ～３０個が好ましく、１ ～１５個がより好ましく、１ ～１０個が特に好ましく、１ ～ ５個が最も好ましい。
　本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム,０．３Ｍ クエン酸溶液,ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
［第二実施形態］
　本実施形態の遺伝子は、上述した第二実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ２）～（ｊ２）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［第三実施形態］
　本実施形態の遺伝子は、上述した第三実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ３）～（ｊ３）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［第四実施形態］
　本実施形態の遺伝子は、上述した第四実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ４）～（ｊ４）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、上述した本発明の遺伝子を発現ベクターに挿入してなるものであり、具体的には、発現ベクターに、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを、制限酵素部位を介して挿入してなるものである。
本発明の組換えベクターに挿入されるＤＮＡとしては、配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。
　本発明に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞系ベクター；適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。
　細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
　遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
　無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントのＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
　細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、精製抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの純度を高めることができる。
＜ミリストイル化タンパク質検出キット＞
　本発明のミリストイル化タンパク質検出キットは、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有するものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のミリストイル化タンパク質検出キットとして、サンドイッチ法により比色定量するＥＬＩＳＡキットが挙げられる。具体的には、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントでコートされた９６ウェルプレートと、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素で標識した２次抗体と、該酵素の色原性基質と、を含む。
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットによれば、ウエスタンブロット等を行わなくとも簡便にかつ短時間で試料中のミリストイル化タンパク質の検出をすることができる。
＜医薬＞
　本発明の医薬は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。上述したように、タンパク質のミリストイル化は、癌遺伝子産物であるＳｒｃ　ｋｉｎａｓｅ等細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質や、Ｎｅｆ等のＨＩＶ遺伝子産物において報告されている。本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントが中和抗体として機能する場合には、これを有効成分として含有する本発明の医薬は、種々の疾患に対する治療効果が期待される。
　本発明の医薬の治療効果が期待される対象疾患としては、例えばヒトの固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
　また、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患；糖尿病等も挙げられる。
　本発明の医薬における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
　錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明の医薬の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
　非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
また、本発明の一側面は、治療のための前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
　また、本発明の一側面は、治療的に有効量の前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
　また、本発明の一側面は、治療剤を製造するための前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
　また、本発明の一側面は、前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供する。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（抗原作製）
［発現株の決定］
　ＮＡＰ２２（ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｘｏｎａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２２ｋＤａ:脳に特異的に発現しているミリストイル化蛋白質）の発現には、ｐＥＴ１４ｂ ｖｅｃｔｏｒにラット由来ＮＡＰ２２遺伝子の挿入されたプラスミド(ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２)を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（以下「Ａｍｐ.」と記す。）を含むＬＢプレート（以下、ＬＢＡプレートと記す。）で３７℃、一晩培養した。
　生育したコロニーのうち、５つをｐｉｃｋ ｕｐし、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐ.を含むＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と記す。）５ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
１）プラスミド抽出
Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、上述した前培養液２ｍＬ分のプラスミドを抽出した。、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い５つのコロニーすべてからプラスミドが抽出されていることを確認した。
２）グリセロールストック作製
あらかじめ１５分間のＵＶ照射により滅菌したグリセロールを終濃度１５％になるように各前培養液と混和し、２０μＬ×１０本で分注し－８０℃保存した。
３）発現確認
５つのクローンの各前培養液１００μＬをそれぞれＬＢＡ培地５ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ．Ｄ６００＝０．８４で、誘導前培養液１ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるよう加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃で回収した。先に取り分けた誘導前培養液１ｍＬについても同様の方法で誘導前菌体を回収した。
　回収した誘導前・後菌体それぞれを６０μＬｃｅｌｌ　ｌｙｔｉｃ　Ｂ（ＳＩＧＭＡ社）で懸濁し、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収した。続いて、９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。これを改めて誘導前・後サンプルとし、発現量を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
結果を図４に示す。図４より、最も多く発現しているｃｌｏｎｅ２をＮＡＰ２２の発現株とし、大量発現を行った。
［ＮＡＰ２２の大量発現］
　発現株となるクローンのグリセロールストック１０μＬをＬＢＡ培地３ｍＬに加えた。３７℃、一晩培養した後、この前培養液２ｍＬをＬＢＡ培地２００ｍＬに加え、３０℃で本培養を行った。４時間後、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加え、さらに８時間、３０℃で培養を続けた。その後、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収し誘導後菌体とした。
［ＮＡＰ２２の精製］
ＮＡＰ２２の精製には疎水性クロマトグラフィーを利用した。上記の手順に従い、２００ｍＬ　ＬＢＡ培地でＮＡＰ２２を発現させ、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収した。この培養液２００ｍＬ分の誘導後菌体を１２ｍＬのＴＥＧ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．２ｍＭ　ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）で懸濁した。ＢＲＡＮＳＯＮ　ＳＯＮＩＦＩＥＲ　２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ : ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ４、５ｍｉｎ　ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→２．５ｍｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌを氷上にて３回繰り返すことで、菌体を破砕した。１２，０００ｒｐｍ、３０　ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。
続いて、終濃度２．５％で過塩素酸を添加し、氷上で１０ｍｉｎ　ｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、３０ ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清に８０％飽和硫酸アンモニウム溶液となるように、硫酸アンモニウムを加えた。４℃で一晩撹拌しながら硫安沈殿を行い、１０，０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎで遠心した。沈殿を回収し、４０％飽和の硫酸アンモニウムを加えた４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で可溶化した。この可溶画分を精製前サンプルとし、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＦＰＬＣにかけた。
精製にはＨｉＰｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌ　ＦＦ(ｈｉｇｈ　ｓｕｂ)１６／１０カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。あらかじめ４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で平衡化した本カラムに５ｍＬの精製前サンプルをインジェクトし、４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を流速１ｍＬ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ流し、洗浄した。Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとして０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を調製し、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、３０ ｍｉｎで硫酸アンモニウムの割合を４０％から０％へと段階的に減少させることで、タンパク質を溶出した。ＦＰＬＣ後、吸光度の値からタンパク質を含むと考えられるｆｒａｃｔｉｏｎに関して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
結果を図５に示す。図５中、矢印で示したバンドがＮＡＰ２２を示す。シングルバンドが確認されたｆｒａｃｔｉｏｎ１１０～１２０ の画分がタンパク溶液として使用可能であると考え、この区間の画分を精製ＮＡＰ２２として回収した。
精製が確認されたｆｒａｃｔｉｏｎを回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社)を用いて８，０００ｒｐｍ、４℃でＴｒｉｓ緩衝液からＰＢＳ緩衝液へのｂｕｆｆｅｒ置換と濃縮を行った。濃縮後、ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ(ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社)を用いて、ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質の濃度を定量した。
［ｍｙｒＮＡＰ２２の作製］
ｍｙｒＮＡＰ２２はＮＡＰ２２とＮ－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(以下ＮＭＴと略す。)の共発現株を構築し、作製した。
上記３）発現確認により最も発現量の多いとされたＮＡＰ２２発現株にｙｅａｓｔ Ｎ－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクターを導入した。　
上記３）発現確認により最も発現量の多いとされたＮＡＰ２２発現株をコンピテントセル化した。
ＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。プレート上で生育した直径２～３ｍｍのコロニーを一つｐｉｃｋ ｕｐし、５０　ｍＬのＳＯＢ培地（組成は表１参照。）で１８℃、２００ｒｐｍで培養した。４０時間後、Ｏ.Ｄ６００＝０．６０で培養を止め、氷上で１０ｍｉｎ冷やした。４℃、３，０００ ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。続いて、氷冷したＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ２０ｍＬで菌体を懸濁、ｏｎ　ｉｃｅで１０ｍｉｎ　ｉｎｃｕｂａｔｅした後、４℃、３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、上清を除去した。再び５ｍＬのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにて菌体を懸濁し、終濃度７％のＤＭＳＯを加えた後、ｏｎ　ｉｃｅにて１０ ｍｉｎ静置した。その後、１００ μＬずつに分注し、液体窒素にて瞬間冷凍させ、－８０℃で保存した。
尚、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは表２の組成をＫＯＨでｐＨ６．７～６．８に調整し、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　５．４５ｇ添加し、ｍｉｌｌｉＱで５００ｍＬにメスアップし、フィルター滅菌して調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［発現株の構築］
このコンピテントセルにｙｅａｓｔ　Ｎ－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクター（ｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴ）をヒートショック法にて導入した。　
１μＬのｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴと２０μＬのＮＡＰ２２発現株コンピテントセルを混和した。３０ ｍｉｎ、ｏｎ　ｉｃｅにて静置した後、４２℃、４５ ｓｅｃでインキュベートし、ただちに２ ｍｉｎ、ｏｎ　ｉｃｅに静置した。４倍量のＬＢ培地を加えて混合し、３７℃、１時間で振盪培養した。培養後、５０μＬを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＡプレート（以下、「ＬＢＡＫプレート」と記す。）、残り５０μＬをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。コントロールとして、形質転換していないＮＡＰ２２発現株コンピテントセル２０μＬを、ＬＢ培地８０μＬで希釈した後、ＬＢＡＫ 、ＬＢＡプレートに各５０μＬずつまき、同様に３７℃、一晩培養した。
生育したコロニーを５つｐｉｃｋ ｕｐし、５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢＡ培地（以下、「ＬＢＡＫ培地」と記す。）２ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
１）プラスミド抽出
　前培養液１ｍＬを用い、上記と同様の方法で抽出、アガロース電気泳動を行い確認した。
２）グリセロールストック作製
　各前培養液１４０μＬを用い、上記と同様の方法で行った。
３）発現確認
　５つのクローンの各前培養液４００μＬをそれぞれＬＢＡＫ培地２０ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ.Ｄ６００＝０．８９で、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるように加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１８ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で回収した。
　回収した誘導後菌体を表３で示したＩｎｉｔｉａｌ　ｂｕｆｆｅｒ１．２ｍＬで懸濁した後、懸濁液を６００μＬずつエッペンドルフチューブに分注した。ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ: ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ３、３０ｍｉｎ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→１ｍｉｎ　ｉｎｔｅｒｖａｌを２回繰り返した。これを１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、培養上清を回収した。これを誘導後サンプルとした。
　誘導前培養液２ｍＬからは１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃の遠心処理により、誘導前菌体を回収した。２４０μＬ　ｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ Ｂを加え、ピペッティングにより菌体を破砕した後、２，０００ｒｐｍ、５ ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収し誘導前サンプルとした。
　５つのクローンに関して、上記のサンプルを調製し、ｍｙｒＮＡＰの発現を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。結果を図６に示す。コントロールのバンドを基準にｍｙｒＮＡＰ２２と考えられるバンドは矢印で示したものである。誘導をかけたことによる発現量がもっとも高いと考えられるのはｃｌｏｎｅ２であった。このｃｌｏｎｅ２をｍｙｒＮＡＰ２２発現株の候補とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［ミリストイル化の確認］
　この候補株で発現したタンパク質がミリストイル化されているかを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる質量分析で確認した。図７中、Ａは、ＮＡＰ２２の結果を示し、Ｂは、ｍｙｒＮＡＰ２２の結果を示す。ＮＡＰ２２で確認されたピークからの２１３．５Ｄａ（ミリストイル基の分子量に相当する）のずれを考慮すると、Ｂのピークはミリストイル化されたＮＡＰ２２と考えるのが妥当である。
［ｍｙｒＮＡＰ２２の大量発現］
上記でタンパク質の発現とそのミリストイル化が確認された株を用いて、２００ｍＬスケールでｍｙｒＮＡＰ２２を大量発現させた。ｍｙｒＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡＫ培地３ｍＬに植菌し、３７℃、一晩培養した。この前培養液をＬＢＡＫ ２００ｍＬに加え、３０℃、４時間培養した。終濃度１ ｍＭ ＩＰＴＧで発現誘導をかけ、その後８時間培養を続けた。
１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、菌体を回収した後、１２ｍＬのｉｎｉｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒを加え、上記と同様の方法でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを行った。 回収した可溶画分を９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。さらに、終濃度１０ｍＭとなるようＣａＣｌ２を加え、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により、上清をタンパク質溶液として回収した。そのうち６ｍＬ分のタンパク質溶液に関して、透析によりｂｕｆｆｅｒをＰＢＳ緩衝液へと置換した。その後、この６ｍＬ誘導後サンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて８，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で１ｍＬに濃縮した。これをＰＢＳ系誘導後サンプルとした。一方、透析を行わなかった６ｍＬタンパク質溶液に関してもＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いた濃縮を同様に行い、Ｔｒｉｓ系誘導後サンプル１ｍＬを回収した。
大量培養によるｍｙｒＮＡＰ２２の発現とそのミリストイル化の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと質量分析を用いて行った。
（ラビット免疫ライブラリーの作製）
［ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出］
　ミリストイル基は、分子量が小さく、かつ生体内に含まれるものであるため、ミリストイル基をそのまま免疫しても、抗原性を示さない。そこでＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、４５０ｋＤａ－１３０００ｋＤａ）にミリストイル基をコンジュゲートさせた。ミリストイル基は結合するタンパク質のＮ末端がグリシンでないと結合しない、またＫＬＨも被結合分子がペプチド又はタンパク質でないと結合しないことから、条件を満たすようにリンカー用のペプチドを挟んで両者をマレイミド法で結合させた。リンカーペプチドにはミリストイル化タンパク質の中で天然には存在しない配列を設計した。具体的には、ミリストイル化タンパク質のＮ末端の配列傾向、ＫＬＨ結合用にＣ末端はシステインにする必要があることを踏まえて下記のように設計した。
ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ＧＫＲＫＣ－ＫＬＨ（ｍｙｒＫＬＨと略す。）
ｍｙｒＫＬＨによる免疫を７回行ったラビット（ＳＰＦ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）から脾臓を抽出し、すぐにＲＮＡｌａｔｅｒ　ＲＮＡ　Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により安定化した後、ハサミを用いて細かくした。抽出した脾臓の一部（５０ｍｇ）からＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。吸光度にて抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を見積もった。
［ｃＤＮＡの合成］
　抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　３０μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表５に示す組成の溶液を混合し、６５℃５分、氷上２分インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４に示す組成の溶液に、表５に示す組成の溶液をさらに混合し、４２℃２分インキュベートした。次いで、この溶液に逆転写酵素６μＬをさらに混合し、４２℃５０分、７０℃１５分、氷上５分インキュベートした。次いで、ＲＮＡを分解するために、この溶液にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、３７℃２０分インキュベートした。次いで、合成したｃＤＮＡ溶液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて精製した。
［ＰＣＲ法の最適サイクル数の検討］
　合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、各抗体遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法にて、各抗体遺伝子を増幅した。その際に最適なサイクル数を見積もった。各特異的プライマーはそれぞれ可変領域の両端にあるＶ遺伝子群（Ｖ　ｐｒｉｍｅｒ）、Ｊ遺伝子群（Ｊ　ｐｒｉｍｅｒ）に共通する配列をミックスしたものである。
　各遺伝子の増幅におけるサイクル数を２４サイクルから３６サイクルに振り分けてＰＣＲ反応を行い、増幅産物をそれぞれアガロース電気泳動で確認した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表６に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［コントロールによるレパートリーチェック］
　逆転写したｃＤＮＡが十分なレパートリーを保有しているかを予測するためにレパートリーチェックを行った。各鎖に特異的なプライマーを用いて、最適サイクル数でそれぞれ抗体遺伝子を増幅した。
各ＰＣＲ反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、コントロールとＤＮＡ量を比較することでレパートリーを見積もった。
［ＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅］
　十分なレパートリーを含んでいることを確認した上で検討した最適サイクル数により抗体遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表８に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　各ＰＣＲ反応液をフェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿をした後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。各反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドがあることを確認した。
［軽鎖ライブラリーの作製］
精製した抗体遺伝子の軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）、及び図３に記載のファージディスプレイ用の抗体発現ベクターをＮｃｏＩ、ＡｓｃＩで制限酵素処理をした。各抗体遺伝子４μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各１．２μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。ｖｅｃｔｏｒ３０μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１８μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各９μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。
制限酵素処理後の抗体遺伝子をＱＩＡ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素処理後のベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アガロース電気泳動にて切断を確認した。
制限酵素処理済みのサンプルを、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
ｋ鎖、λ鎖のライゲーション産物をアガロース電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル各５μＬとＤＨ１２Ｓ　１００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて（２５μＦ、２．５ｋＶ、２００Ω）形質転換し、２×ＹＴ培地１０ｍＬで３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また、１０ｍＬ培養液に２×ＹＴＧＡ１９０ｍＬを加え３０℃一晩培養した。
用いた培地の組成を以下に示す。
２×ＹＴ：ｔｒｉｐｔｏｎｅ　１６ｇ，ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ（１Ｌ)
２×ＹＴＧＡ：２×ＹＴ＋Ａｍｐ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｆｉｎａｌ　１％
ＬＢプレート：ｔｒｉｐｔｏｎｅ　１０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ，ＮａＣｌ　１０ｇ，ａｇａｒ　１５ｇ（１Ｌ)
ＬＢＧＡプレート：ＬＢプレート＋Ａｍｐ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｆｉｎａｌ　１％
各培養液２００ｍＬからＭａｘｉ　ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、アガロース電気泳動で目的のバンドを確認し、これをそれぞれラビット免疫ｋ鎖、λ鎖ライブラリープラスミドとした。プレートのコロニー数からレパートリーを見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成を表１１に示し、シークエンス反応の条件を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］
　精製した重鎖遺伝子（Ｈ 鎖）と軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）ライブラリーをＳｆｉＩで５０℃、２時間制限酵素処理をした。具体的には、４μｇ重鎖遺伝子に、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＳｆｉＩを６μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。また、軽鎖ｋ鎖遺伝子と軽鎖λ鎖遺伝子を９：１に混合した軽鎖ライブラリー５μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ、ＳｆｉＩを１０μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。
さらに重鎖遺伝子、軽鎖ライブラリーにＸｈｏＩを５μＬ加え３７℃２時間インキュベートし、アガロース電気泳動にて切断を確認した。軽鎖ライブラリーについては、制限酵素処理後、エタノール沈殿をし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。軽鎖ライブラリーに重鎖遺伝子を組み込むために、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
重鎖のライゲーション産物を電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル１９μＬとＤＨ１２Ｓ　１００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて形質転換し、２×ＹＴ培地１０００ｍＬに加え、３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また培養液にＧｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ　１％、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍｌになるように加え、３０℃一晩培養した。プレートのコロニー数からレパートリー数を見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成は、表１１と同様であり、シークエンス反応の条件は、表１２と同様である。
[プラスミド抽出]
　上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、３０℃一晩培養した培養液２００ｍＬから、Ｍａｘｉ　ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを１本使用してプラスミドを抽出し、これをラビット抗体ライブラリープラスミドとした。
[グリセロールストックの作製１]
　上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］の培養液のうち４０ｍＬを８０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し菌体を回収した。上清を捨て４０％グリセロールを５００μＬ加えて懸濁し－８０℃で保存した。同じものを計４本作り、これをラビット抗体ライブラリーグリセロールストックとした。
[ｃｐ３　ｆｏｒｍの作製１]
　上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液０．５ｍＬを２×ＹＴＡＩ　１０ｍＬに加え３０℃一晩培養した。この培養液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収し、飽和硫安を同量加え、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を完全に捨てきり硫安沈殿を行った。沈殿をＮａＮ３（ｆｉｎａｌ０．０５％）入りＰＢＳ　１ｍＬで懸濁、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収した。これをラビット抗体ライブラリーｃｐ３　ｆｏｒｍ溶液とした。
　用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＩ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）ｆｉｎａｌ　０．５ｍＭ
試薬組成
ＰＢＳ：ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ　１３７ｍＭ），ＫＣｌ（ｆｉｎａｌ ２．７ｍＭ)， ＮａＨＰＯ４ （ｆｉｎａｌ　１０ｍＭ) ，ＫＨ２ＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １．７６ｍＭ)ｐＨ ７．４
[ファージ抗体の作製１]
　上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液１ｍｌを２×ＹＴＡ培地２０ｍＬに加えＯＤ＝０．５６になるまで３７℃にて振盪培養し、Ｍ１３ヘルパーファージＫＯ７を１ｍＬ加え１．５時間感染させた。その後、終濃度５０μｇ ／ｍＬ カナマイシンを加え、感染効率の確認のため１０μＬの培養液を取り分けた後、３０℃、一晩培養した。取り分けた培養液は希釈系列を作製し、１／１０μＬ分、１／１００μＬ分、１／１０００μＬ分でそれぞれ一晩、３７℃ＬＢＡＫプレートにて培養した。
　２００ｍＬ液体培地から１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎの遠心により菌体を除去し、ファージ抗体を含む培養上清を回収した。２０％ポリエチレングリコ―ル（以下「ＰＥＧ」と略す。）を４ｍＬ加え、ボルテックスにより激しく混和した後、１０ｍｉｎ、Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（以下「Ｒ.Ｔ.」と略す。）で静置した。続いて、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ ｍｉｎの遠心により上清を除去した後、再度１０，０００　ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎで上清を完全に取り除いた。残った沈殿を０．０５％ ＮａＮ３／ ＰＢＳにて４００μＬで懸濁し、溶解しなかった不純物を１２，０００　ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心で除去した。回収した上清を０．４５μｍのフィルターで滅菌し、これをファージ抗体溶液とした。
この溶液中に含まれるファージ抗体のタイターを確認した。まず、菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。続いて、１０６、１０７、１０８、１０９倍希釈したファージ抗体溶液１０μＬを、ＤＨ１２Ｓ（Ｏ.Ｄ６００＝０．５）の菌液１ｍＬにそれぞれ加え、ファージを大腸菌に感染させた。１．５ 時間後、各感染後菌液５０μＬずつをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
　培地組成
２×ＹＴＡＫ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　５０μｇ／ｍＬ
ＬＢＡＫ：ＬＢ培地＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ　ｆｉｎａｌ　５０μｇ／ｍＬ
試薬組成
ＰＥＧ：ＰＥＧ６０００　２０％，ＮａＣｌ　２．５Ｍ
［グリセロールストックの作製］
上記の前培養液１４０μＬを用いてグリセロールストックを作製した。作製方法は前記と同様であった。
［抗原ビーズの作製］
スクリーニングを行うために作製したｍｙｒＮＡＰ２２を用いた抗原ビーズを作製した。ストレプトアビジンを介したビーズへの固定化のために、ｍｙｒＮＡＰ２２をビオチン化した。
［ｍｙｒＮＡＰ２２のビオチン化］
ビオチン化はＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ－ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いて行った。上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果をもとに、ｍｙｒＮＡＰ２２の濃度を見積もり、約５０μｇのｍｙｒＮＡＰ２２を含むサンプル溶液を、ＰＢＳで希釈した１／１０×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ２００ μＬと混和した。あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて、５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心し、不純物除去・濃縮を行った。ろ液を捨て、再度同様の方法で洗浄した後、サンプル約２０μＬを回収し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
ＤＭＳＯ １０μＬで付属のＮＨ２－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎを懸濁し、１００ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと共に１０μＬ全量をサンプルに添加した。３７℃、１２ ｍｉｎ、ｉｎｃｕｂａｔｅした後、１×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬでピペッティングし、あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心した。ろ液を破棄し、サンプルを回収し、再度同様の方法で洗浄した後、約２０ μＬのサンプルを回収し、ＷＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて２００ μＬまでメスアップした。これをビオチン化ｍｙｒＮＡＰ２２（以下、「Ｂｉｏ－ｍｙｒＮＡＰ２２」と記す。）とした。
［ビーズへの固定化］
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ (１０ｍｇ／ｍＬ) ２５０μＬを用意した。マグネットトラッパーを用いて上清を破棄した後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＴＢＳ (以下「ＴＢＳ－Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬを用いて懸濁、上清を破棄した。これを２回繰り返しビーズを洗浄した後、ＴＢＳ－Ｔ０．０５ ４００μＬで懸濁し、上記で作製したＢｉｏ－ｍｙｒＮＡＰ２２溶液１０μＬ（＝約３．５μｇに相当）と混和した。４℃で一晩回転攪拌した後、フリーのストレプトアビジンをマスクするために、ビオチンが付加された１ ｍＭ ＧＡＰ４３－ｐｅｐ（Ｂｉｏｔｉｎ－ＨＨＨＨＨＨ－ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ）を６μＬ加えた。１時間、４℃、回転攪拌した後、マグネットトラッパーを用いて、未反応物を除去した。これを素通り画分とし、続いて、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ(以下「ＰＢＳ－Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬで懸濁、マグネットトラッパーを用いて洗浄という操作を２回繰り返した。各ろ液を画分ｗａｓｈ１・ｗａｓｈ２として回収した。最終的にビーズを２％ ＢＳＡ　ｉｎ ＰＢＳ　４００μＬ で懸濁し、これをｍｙｒＮＡＰ２２の抗原ビーズとした。
［スクリーニング］
スクリーニング前のｐｒｅｓｏａｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを表１４のように調製し、１時間、Ｒ.Ｔ.、回転攪拌にて反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
１時間の反応の後、作製したｍｙｒＮＡＰ２２抗原ビーズを４００μＬ加え、１時間、Ｒ.Ｔ.、回転攪拌でファージ抗体ライブラリーと反応させた（図８参照）。終了後、マグネットトラッパーを用いてろ液を捨て、続いて１％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００ ｉｎ ＰＢＳ(以下「ＰＢＳ－ＴＸ１」と略す。)７００μＬで懸濁し、ろ液を捨てた。この操作を５回繰り返し洗浄した後、７００μＬのＰＢＳで懸濁した。
平行して菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。この培養液１ｍＬを、ライブラリーと反応したｍｙｒＮＡＰ２２抗原ビーズ７００μＬと試験管内で混和させ、１時間、３７℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。１時間後、１００ｍｌ ２×ＹＴＡ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ培地( 以下ＹＴＧＡと略す。) に移し、一部をプレート培養用に取り分けた後、一晩、１３０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養した。プレート培養は１００ｍＬ培地から５０μＬ、５μＬ、１μＬで取り分け、それぞれをＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。
培養終了後、１００ｍＬを次の３つの用途にそれぞれ取り分けた。すなわち、１）グリセロールストック、２）ファージ抗体調整、３）抗体タンパク質発現である。
１）グリセロールストック作製
上記の培養液６０ｍＬを取り分け、２本のグリセロールストックを作製した。３０ｍＬ×２本分の培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。回収した菌体を５０％グリセロール５００μＬで激しく懸濁し、これを１ｓｔスクリーニングライブラリグリセロールストックとして、－８０℃で保存した。
２）ファージ抗体調整
上記の培養液５００μＬを５ｍＬ ２×ＹＴ培地に移し、そこにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ５０μＬを加え１時間、３７℃で感染させた。その後、全量４０ｍＬとなるように２×ＹＴＡを加え、さらに終濃度５０μＭカナマイシンを添加し、３０℃、一晩震盪培養した。
培養終了後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。２０％ ＰＥＧを５ｍＬ添加し、ｖｏｒｔｅｘにて激しく混和した。５ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.にてｉｎｃｕｂａｔｅした後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ遠心し、上清を除去した。再度、８，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎで遠心し、上清を完全に除去した。生じた沈殿物を０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ １　ｍＬで懸濁し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。これを１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルターを通して滅菌し、これを１ｓｔスクリーニングファージ抗体とした。
この一連のスクリーニング操作を３回繰り返し、それぞれを１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄスクリーニングとした。各スクリーニング段階でそれぞれの培養液を用いて、１）グリセロールストック作製、２）ファージ抗体調製を行った。
［モノクローナル抗体作製］
各スクリーニングでのプレート培養からモノクローナル抗体の作製を行った。各スクリーニング段階のプレート培養にて生育したコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の発現とその一部の抗体遺伝子のアミノ酸配列の決定を試みた。
［ｃｐ３ ｆｏｒｍ発現］
ファージの感染した大腸菌の一部をプレート培養した。各プレートからコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、それぞれを２×ＹＴＡ培地 ２ｍＬで、３７℃、一晩培養した。各前培養液５０μＬを終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴＡ培地（以下２×ＹＴＡＩと略す。）１　ｍＬに継代し、さらに３０℃、一晩培養した。また、各前培養液７０μＬを５０％グリセロール３０μＬと混和し、各モノクローナル抗体グリセロールストックとした。
１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心により上清を回収し、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。続いて、硫安沈殿による濃縮を行った。サンプルと等量の飽和硫安を加え、ｖｏｒｔｅｘを用いて激しく混和した後、５ ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.でｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、生じた沈殿をサンプルの１／１０量の０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳで懸濁した。再び１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、不溶物を除去し、これを最終的なｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。
［ＥＬＩＳＡを用いた発現確認］
発現させたｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液、各５０μＬをそれぞれＰＢＳ ５０μＬと混和し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／２０００×α－ｃｐ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００×α－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ）(Ｒａｂｂｉｔ)ｐＡｂ－ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のために　　ＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４　７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
　１ｓｔスクリーニングから５３個、２ｎｄスクリーニングから４７個、３ｒｄスクリーニングから８個、計１０８個をモノクローナル化した。
［ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた発現確認］
発現量を見積もるために、発現したｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） 染色を行った。泳動の終わったゲルを取り出し、表１２に示す固定液に浸し３０ｍｉｎ、２回ゲルを振とうした。ｍｉｌｌｉＱ で１０ｍｉｎ、振とうしながらゲルをゆすいだ後、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙに浸し、遮光下で一晩振とうした。ゲルを１０ｍｉｎ、ｍｉｌｌｉＱ でゆすぎ、遮光下で表１５に示す脱色液に浸しながら３０ｍｉｎ振とうした。遮光下でｍｉｌｌｉＱ に浸し１０ｍｉｎ洗浄し、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によりゲルを撮影した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［プラスミド抽出］
作製したグリセロールストックを起こし、２×ＹＴＡ  ５ｍＬで３７℃、一晩振盪培養した。終了後、培養液２ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎの遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミドの抽出はアガロース電気泳動で確認した。
［アミノ酸配列決定］
アガロース電気泳動の結果をもとにプラスミドの濃度を見積もった。表１６の組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、表１７の反応条件でＰＣＲを行うことで、抗体遺伝子を増幅させた。反応後、１２５ ｍＭ ＥＤＴＡ ５μＬ、１００％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加しタッピングした。２０ ｍｉｎ、－２０℃でインキュベートし、１２，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して上清を取り除いた。７０％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加し、１２，０００ｒｐｍ、１０ ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して再び上清を取り除いた。エッペンドルフチューブのフタを開けて、５ｍｉｎ室温で乾燥させ、ホルムアミド ２０μＬを添加、ピペッティングした。９５℃、３ ｍｉｎでヒーティングブロックして、解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
［モノクローナル抗体の性能評価］
各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の特異性を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。
上記で発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれの抗原吸着量を確認した。発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２について、それぞれ１０μｇ、５μｇ、２．５μｇ、１．２５μｇ、０．６７５μｇ、０．３３７５μｇのタンパク質を含む１００μＬ ＰＢＳを調製し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐの各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗原溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／１００×α－ＮＡＰ２２ (Ｍ－６５) : ｓｃ－６６９９５ (ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社) ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００ × α－ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ－ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のためにＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４　７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
１ｓｔ～３ｒｄスクリーニングにおいて、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かったクローンのＥＬＩＳＡの結果を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 [ＳＰＲ法を用いた結合力評価]
抗体の抗原との結合力を定量するために、ＳＰＲ法を用いた。解析にはＢＩＡｃｏｒｅ－Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。リガンドには上記で精製したＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２を用いた。濃度はＮＡＰ２２についてはＳＤＳ－ＰＡＧＥと紫外吸収法、ｍｙｒＮＡＰ２２についてはＳＤＳ－ＰＡＧＥに加えｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて算出した。アナライトには、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かった上記３つのクローンの未精製ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を用いた。ｃｐ３ ｆｏｒｍの濃度は、１２．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色の結果から見積もった。アナライトのコントロールとして、抗体遺伝子をクローニングする前のベクター（ｐＴＺ１９Ｒ＿ｏｒｉｇｉｎａｌ）で形質転換された大腸菌でタンパク質を発現させ、そのｌｙｓａｔｅを用いた。
 [ＢＩＡｃｏｒｅ測定]
リガンドを結合させるセンサーチップは、アミノカップリング法で結合させるＣＭ５を用いた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）を用いてシステムを置換した後、リガンド希釈用緩衝液の最適ｐＨを検討した。１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ４．０、４．５、５．０ 各固定化緩衝液でリガンド溶液を希釈し、１０μＬ ／ ｍｉｎで流した。最も固定化量の多い緩衝液を最適ｐＨとした。１００ ｍＭ ＮＨＳ : ４００ ｍＭ ＥＤＣ ＝ １ ： １混合液を５μＬ ／ ｍｉｎで１４分 ７０μＬ 流し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化させたのち、２つの流路のうち一方に最適ｐＨの固定化緩衝液で希釈したリガンド溶液を５μＬ ／ｍｉｎ、７分、３５μＬ流し結合させた。リガンドが結合していることを確認した後、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ (ｐＨ ８．５)を５μＬ ／ ｍｉｎ、７ 分、３５μＬ流し、ブロッキングをした。残るもう一つの流路はカルボキシル基の活性化の後、ただちにブロッキングを行いコントロール流路とした。
続いて上述したアナライトを２０μＬ ／ ｍｉｎ、３ ｍｉｎ、６０μＬで流し、リガンドとの相互作用を測定した。３ ｍｉｎ後からは解離もモニタリングした。反応終了後はＮａＯＨを３０μＬ ／ ｍｉｎ、１ ｍｉｎ、３０μＬ流すことでセンサーチップを再生した。
　結果を図９～図１１に示す。また、各抗体のＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれに対するＫＤ値を表１９に示す。このように、ｍｙｒＮＡＰ２２に対して特異性の高い抗体が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 [ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ]
上述したｃｌｏｎｅ２１，１６１，１８７を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
未精製ＮＡＰ２２、精製ｍｙｒＮＡＰ２２の３段階希釈系列を調製して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの間に、ＰＶＤＦメンブレンをメタノールに６０秒ほど浸したのち、ｍｉｌｌｉＱでゆすぎ、表２０に示す組成のＳｅｍｉ－Ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに一時間以上浸し、振盪した。泳動が終わったゲルを、ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙とメンブレンで空気が入り込まないよう挟み、２５ Ｖ、１００ ｍＡ ／ メンブレンの条件で９０分間転写した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　転写の終わったメンブレンを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（以下「ＴＢＳ－Ｔ０．０５」と略す。）で５分間ゆすぎ、５ ％ Ｓｋｉｍ－ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔで室温、１時間ブロッキングした。続いて５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ０．０５で５倍希釈した上記３つのクローンを一次抗体として用いて反応させた。二次抗体にはモノクロ―ナル抗体のｃｐ３を認識できる１／２０００×α－ｃｐ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ０．０５を用いた。この二次抗体はｒａｂｂｉｔ由来ＩｇＧ型であるので、三次抗体に１／４０００×α－ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ－ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ　ＴＢＳ－Ｔ０．０５を用いることで、検出可能であった。また、ＮＡＰ２２, ｍｙｒＮＡＰ２２の存在を確認するために、１／１００×α－ＮＡＰ２２ （Ｍ－６５ ） : ｓｃ－６６９９５ （ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社） ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ０．０５を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇも行った。この場合二次抗体には１／４０００×α－ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ－ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ０．０５を用いた。抗体反応の後はその都度ＴＢＳ－Ｔ０．０５で10 min × ３回洗浄を行った。二次（三次）抗体反応後に、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて化学発光させ、ｉｍａｇｅ ｓｃａｎｎｅｒ ＡＴＴＯを用いて発光を検出した。
　結果を図１２に示す。図１２Ａに示すように、コントロールとして行ったα－ＮＡＰ２２ ａｎｔｉｂｏｄｙ によるＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇではＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２ どちらのレーンにも抗体が反応したバンドが検出された。
図１２Ｂ～図１２Ｄに示すように、本発明に係るモノクローナル抗体、特にｃｌｏｎｅ２１や１６７ではミリストイル化を受けていないＮＡＰ２２ のレーンにはほとんどバンドが検出されず、ｍｙｒＮＡＰ２２に対する特異性が確認された。
　また、上記３つのクローンについて全て遺伝子配列を確認したところ、４種類のクローンが得られたことが確認された。ＣＤＲ 領域の決定はＩｇＧ　ＢＬＡＳＴを参考にした。
　クローン２１のアミノ酸配列は配列番号７で表され、クローン１６１のアミノ酸配列は配列番号１４で表され、クローン１８７のアミノ酸配列は配列番号２１で表される。
上記１ｓｔ～３ｒｄスクリーニングにおいて、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かったクローンとして、クローン１１９に注目した。クローン１１９のＥＬＩＳＡの結果を表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［抗体ビーズの調製］
　図３に示した抗体発現ベクターには、３’末端にＰｒｏｔｅｉｎＡをコードする配列が挿入されている（図３中、ＰＡの部分）。そのため、この発現ベクターを用いて作製した抗体には、Ｆｃ部分のＣ末端側にＰｒｏｔｅｉｎＡがついている。このＰｒｏｔｅｉｎＡを介してＩｇＧセファロースビーズにクローン１１９を結合させた。
　詳細に説明すると、クローン１１９の発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌（ＪＭ－１０９）を前培養後、１Ｌの０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含む２×ＹＴ培地で３０℃、１２ｈ培養した。培養液を遠心後、上清を回収し、硫安沈殿で得られた沈殿をＰＢＳ、４０ｍＬに溶かして抗体溶液を得た。
　次いで、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製) ５０μＬをカラムに充填し、先に得られた抗体溶液（４０ ｍＬ）を、全量、そのカラムに通して反応させて抗体ビーズを得た。
抗体ビーズを、ＳＤＳ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２％ ＳＤＳ, １００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５, １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ, １００ｍＭ ＤＴＴ, ＢＰＢ）で溶出して、結合したクローン１１９の発現チェックとビーズへの結合量のチェックをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて行った。クマシー染色した結果を図１３に示す。
　図１３中、レーン１は、ビーズに結合していたクローン１１９を示し、レーン２は、コントロールとして用いたビーズに結合していたコントロールクローン（ライブラリーからランダムにクローニングした抗体クローン）を示す。４０ｋＤａの位置にバンドが確認でき、２種類の抗体のバンドが同じ濃さであることから、等量のクローン１１９及びコントロールクローンをそれぞれのビーズに結合できたことが確認された。
［免疫沈降］
　得られた抗体ビーズが、抗原を免疫沈降できるかどうかの確認を行った。抗体ビーズ８０μＬ（クローン１１９　４μｇ）を［ｍｙｒＮＡＰ２２の大量発現］で調製したリコンビナントｍｙｒＮＡＰ２２と４℃一晩反応させた後、遠心分離し、上清を用いて１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。クマシー染色した結果を図１４に示す。
　図１４中、レーン１は、クローン１１９を用いたものの上清を示し、レーン２は、コントロールクローンを用いたものの上清を示し、レーン３は、インプットに用いたリコンビナントｍｙｒＮＡＰを示す。レーン３とレーン１を比較すると、レーン１のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の６１％であった。一方、レーン２とレーン３を比較すると、レーン２のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の９０％であった。即ち、クローン１１９を用いてインプットの約３０％～４０％のｍｙｒＮＡＰ２２抗原を免疫沈降できることが確認された。
本実施例においてこのように特異性の高い抗体が多種類得られた理由として、ビーズスクリーニングを用いたことによる（１）提示される抗原分子の絶対数の増加（２）適切な抗原部位の露出、の２点が挙げられる。本実施例で用いたビーズは１ｍｇあたり１，０００ ｐｍｏｌの分子と結合できる。
プレートスクリーニングで１つのｗｅｌｌあたりに固相化できるタンパク量が約１０ ｐｍｏｌであることを考えると、提示される抗原分子の数には数十倍以上の差があることになる。加えて、プレートスクリーニングには、プレートに吸着していることで部分的にまったく抗体が反応できない箇所ができてしまう、という大きな問題点がある。
本実施例で抗原として用いたミリストイル基は、タンパク質を膜へアンカーできるほど疎水性に富んでいる。そのため、疎水性相互作用を利用したプレート吸着方法では、この脂肪酸部分がプレートと面する形になってしまい、抗体との反応が妨げられている可能性も十分考えられる。
一方、ビーズスクリーニングでは、ビーズの表面に抗原が提示されることで、脂肪酸部分も含む一つの抗原分子の様々な面に対し抗体集団が相互作用することが可能になったと推測される。このように抗原の絶対量、そして提示の仕方に変化があったことで、特異性の高い多種類のモノクローナル抗体を得ることが可能になったと考察される。
相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供できる。

Claims (24)

  1. （ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    （ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    （ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    （ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    （ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    （ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 　配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項１又は２に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 　配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. （ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    （ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    （ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    （ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    （ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    （ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項５に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 　配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項５又は６に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 　配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する請求項５～７のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. （ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    （ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    （ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    （ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    （ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    （ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. 配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項９に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. 　配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項９又は１０に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 　配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する請求項９～１１のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. （ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    （ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    （ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    （ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    （ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    （ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  14. 配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
    配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１３に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  15. 　配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項１３又は１４に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  16. 　配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
  17. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
  18. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
  19. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
  20. （ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
    （ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
  21. （ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
    （ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
  22. （ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
    （ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
  23. （ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
    （ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
  24. 　請求項１９～２３のいずれか一項に記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
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