WO2015129646A1 - Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法 - Google Patents

Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015129646A1
WO2015129646A1 PCT/JP2015/055106 JP2015055106W WO2015129646A1 WO 2015129646 A1 WO2015129646 A1 WO 2015129646A1 JP 2015055106 W JP2015055106 W JP 2015055106W WO 2015129646 A1 WO2015129646 A1 WO 2015129646A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liver
dna
cyp3a4
methylation analysis
methylation
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/055106
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一郎 家入
豪 廣田
Original Assignee
国立大学法人 九州大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 九州大学 filed Critical 国立大学法人 九州大学
Priority to JP2016505212A priority Critical patent/JP6482087B2/ja
Publication of WO2015129646A1 publication Critical patent/WO2015129646A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA methylation analysis method and a CYP3A4 expression level estimation method.
  • liver-derived normal cells were isolated using human blood as a sample, DNA was extracted from these liver-derived normal cells, and DNA methyl in a part of CpG island 5 Mbp away from the CYP3A4 gene.
  • the present invention relates to a method for estimating CYP3A4 expression levels in the human body based on the analysis results.
  • Cytochrome® P450 is a metabolic enzyme that is widely responsible for the metabolism of in-vivo substances and foreign substances from the outside world. CYP plays a pivotal role in drug metabolism and is known to be involved in the metabolism of 80-90% of pharmaceuticals. CYP has multiple molecular species with different substrate specificities. Among them, CYP3A4 is expressed most frequently among CYPs in the liver, which is the main metabolic organ (Non-patent Document 1).
  • CYP3A4 is distributed mainly in the liver and small intestine, and uses more than half of the drugs used in clinical practice as a substrate. Therefore, CYP3A4 is one of the important metabolic enzymes in individual optimization in pharmacotherapy (Non-patent Document 2). However, it has been reported that CYP3A4 in human liver has individual differences of about 50 times the expression level and about 10 to 20 times the enzyme activity (Non-patent Document 3). There is a report that 60-90% of individual differences in CYP3A4 activity are due to genetic factors (Non-patent Document 4).
  • DNA methylation is known as one of epigenetic control mechanisms. Mammalian DNA is methylated in 60-90% of all sequences. In general, in DNA methylation, the C5 carbon atom of the CG sequence on a gene is methylated. In the region called CpG island where CG sequences appear frequently, most of the CG sequences are not methylated. In addition, it is known that gene expression is suppressed by methylation of a gene promoter region and a transcription initiation site (Non-Patent Documents 5 and 6).
  • the inventors found that DNA methylation frequency varies among individuals in a part of CpG island (DMR) 5Cbp away from CYP3A4 gene by DNA methylation analysis of human liver tissue. It has been clarified that there is a strong correlation between the frequency of DNA methylation in DMR and the expression level of CYP3A4.
  • the present invention has an object to develop a methylation analysis method in DMR and a method for estimating the expression level of CYP3A4 in human individuals, which can lead to providing appropriate medical treatment according to the drug metabolic ability of human individuals and
  • the inventors have come up with the idea of isolating hepatocytes detached from the liver, which may be present in the blood, and performing DNA extraction and DNA methylation analysis of the hepatocytes.
  • the inventors confirmed that normal hepatocytes were successfully isolated from the blood. In addition, it was confirmed that DNA extraction and DNA methylation analysis were possible using the isolated normal cells derived from the liver.
  • the invention of a method for methylation analysis in DMR and a method for estimating the expression level of CYP3A4 in a human individual by isolating normal cells derived from liver using human blood as a sample and using the DNA of normal cells derived from liver Completed.
  • a first configuration of the present invention includes a liver-derived cell separation step for separating normal liver-derived cells from human blood, a DNA extraction step for extracting the DNA of the separated liver-derived cells, and the DNA of the liver-derived cells. And a methylation analysis step for analyzing the degree of methylation of a gene region 5 Mbp away from the CYP3A4 gene.
  • the second configuration of the present invention is that the liver-derived cell DNA in the analysis step is obtained after an extraction step and an amplification step in which a DNA in a gene region 5 Mbp away from the CYP3A4 gene is amplified by a PCR method.
  • the DNA methylation analysis method according to the first configuration which is characterized.
  • a third configuration of the present invention is the DNA methylation analysis method according to the second configuration, characterized in that the primer sequences used in the amplification step are the primers shown in SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 13.
  • the liver-derived cell separation step is performed by targeting a cell pellet separation step through a cell pellet from human blood, and an antigen or receptor specifically expressed in the liver in the cell pellet as a target.
  • the DNA methylation analysis method according to any one of the first to third configurations, which comprises a selective separation step of selectively separating a derived cell.
  • a fifth configuration of the present invention is the DNA methylation analysis method according to the fourth configuration, wherein the cell pellet separation step is performed using a density gradient centrifugation method.
  • a sixth configuration of the present invention is the DNA methylation analysis method according to the fourth or fifth configuration, wherein the target in the selective separation step is an asialoglycoprotein receptor.
  • the degree of methylation of CYP3A4 in human liver is evaluated by evaluating the methylation degree of a gene region 5 Mbp away from the CYP3A4 gene by the DNA methylation analysis method described in the first to sixth configurations. Is an in vitro CYP3A4 expression level estimation method.
  • the present invention makes it possible to provide a method for analyzing methylation in DMR and a method for estimating the expression level of CYP3A4 in human individuals. As a result, it is expected to provide appropriate medical care according to the drug metabolic ability of human individuals.
  • FIG. 1 Figure showing the results of methylation analysis of the GSTP1 promoter region in liver-derived normal cells Diagram showing the results of RNA detection in pre-magnetic separation cells Diagram showing RNA detection results in cells after magnetic separation Diagram showing the effect of DNA methylation in DMR on transcriptional activity of CYP3A4 gene Figure showing the results of the luciferase assay Comparison of CYP3A4 mRNA expression in each sample Figure showing CpG islands subjected to methylation analysis The figure which showed the result of analyzing methylation frequency in each CpGpislands Figure showing the results of analysis of the correlation between methylation frequency and AER in DMR Figure showing the results of an analysis of the correlation between methylation frequency in DMR and mRNA expression level of CYP3A4 Diagram showing the results of methylation analysis using cloning-sequence method and COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) method using human peripheral blood cell pellet
  • the liver-derived cell separation step is a step of separating normal cells derived from the liver from human blood.
  • the liver-derived cell separation step is not particularly limited as long as the liver-derived normal cells can be separated, and various techniques can be used alone or in combination.
  • liver-derived cell separation step there is a technique combining density gradient centrifugation and separation using magnetic beads.
  • a method for obtaining a cell pellet by density gradient centrifugation will be described.
  • a reagent for density gradient centrifugation such as Ficoll or Percoll into a sterilized tube, leave a human blood sample on it, and centrifuge.
  • a human blood sample may be used directly, or a blood sample subjected to hemolysis with a buffer or the like may be used.
  • the centrifugation conditions may be adjusted as appropriate depending on the blood sample used and the reagent for density gradient centrifugation.
  • the cell pellet obtained by density gradient centrifugation contains other cells such as leukocytes in addition to normal cells derived from the liver. Therefore, it is necessary to selectively extract liver-derived normal cells from this cell pellet.
  • density gradient centrifugation in the liver-derived cell separation step. Thereby, a cell pellet containing liver-derived normal cells can be easily obtained, and the working efficiency of the DNA methylation analysis method of the present invention is improved.
  • liver-derived normal cells from the obtained cell pellet by separation with magnetic beads.
  • the resulting cell pellet is reacted with a protein that binds to an antigen or receptor expressed specifically in the liver.
  • antigens or receptors include asialoglycoprotein receptors.
  • the protein to be reacted is previously bound with a label molecule such as biotin for subsequent reaction with magnetic beads.
  • the protein-bound cell pellet obtained by the reaction is reacted with magnetic beads.
  • the magnetic beads used are bound with antibodies or the like that bind to the label molecules. By this reaction, magnetic beads are bound to liver-derived normal cells via label molecules.
  • liver-derived cell separation step it is preferable to selectively separate liver-derived cells by targeting an antigen or receptor specifically expressed in the liver. This makes it possible to efficiently extract liver-derived normal cells, and has the effect of improving the working efficiency of the DNA methylation analysis method of the present invention.
  • the DNA extraction step is a step of extracting DNA from liver-derived normal cells obtained by the liver-derived cell separation step.
  • the DNA extraction step is not particularly limited as long as this DNA extraction is possible, and various techniques can be used. For example, after degrading a cell tissue-derived protein with a proteolytic enzyme, etc., nucleic acid extraction or purification is performed using phenol and chloroform, or nucleic acid obtained is extracted using a commercially available extraction kit. Etc.
  • nucleic acid amplification methods such as PCR method.
  • This has the effect of improving the accuracy of DNA methylation analysis in the present invention.
  • PCR method as an example of the nucleic acid amplification method, using the primers shown in SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 13 as primers, adding a substrate such as heat-resistant DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate to the reaction solution, heat denaturation, annealing
  • the nucleic acid amplification may be performed by performing an extension reaction and repeating these cycles.
  • the methylation analysis step is a step of analyzing the degree of methylation in DMR.
  • the methylation analysis step is not particularly limited as long as the methylation analysis in DMR is possible, and various methylation analysis methods can be used. Examples of such methylation analysis methods include bisulfite sequencing, bisulfite cloning sequencing, methylation specific PCR, combined bisulfite restriction analysis (COBRA), and methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP).
  • methylation analysis methods include bisulfite sequencing, bisulfite cloning sequencing, methylation specific PCR, combined bisulfite restriction analysis (COBRA), and methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP).
  • COBRA combined bisulfite restriction analysis
  • MeDIP methylated DNA immunoprecipitation
  • CYP3A4 expression level estimation method Through the DNA methylation analysis method described above, it becomes possible to obtain information on the degree of methylation in DMR. Based on information on the degree of methylation, CYP3A4 expression level in human liver is estimated. The lower the methylation frequency in DMR, the higher the amount of CYP3A4 mRNA, so the expression level of CYP3A4 may be lower.
  • ⁇ Experiment outline> 1 0.2 mg asialofetuin was dissolved in 100 ⁇ L WS buffer, placed in a Filtration Tube, pipetted, and then centrifuged at 8000 ⁇ g for 10 minutes for washing. 2. 10 ⁇ L DMSO was added to NH 2 -Reactive Biotin and dissolved. After adding 100 ⁇ L reaction buffer and the total amount of NH 2 -Reaction Biotin dissolved in DMSO in the order of 3.1 Filtration tube, the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes to carry out asialofetin biotination reaction.
  • a washing operation was performed by adding 100 ⁇ L WS buffer to the solution of 4.3, centrifuging at 8000 ⁇ g for 10 minutes, and removing the supernatant. The same washing operation was performed once more. After removing the supernatant of the solution obtained in 5.4, 200 ⁇ L WS buffer was added, and pipetting 10 times or more was obtained as a biotinylated asialofetuin solution. This solution was stored at 4 ° C and used in subsequent experiments.
  • ⁇ Experiment outline> 1 After suspending the cell pellet with WS Buffer, it was mixed with 20 ⁇ L of biotinylated asialofetuin solution and incubated at 37 ° C. for 45 minutes to react the normal hepatocyte asialofetin receptor with biotinylated asialofetuin. The reaction solution obtained in 2.1 was centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes, the supernatant was removed, 1 mL Buffer was added, and the mixture was further centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes for washing. The buffer prepared as follows was used.
  • ⁇ Experiment outline> 1 Using the SmartFlare TM RNA detection probe, we performed fluorescent staining of miR-122, a microRNA that is expressed specifically in hepatocytes. At the same time, GAPDH mRNA expressed in most cells as a positive control, miRNA Scramble that does not recognize any intracellular sequence as a negative control, and miR-137 expressed in blood cells that are not expressed in hepatocytes were also stained. . 2. The results are shown in FIGS. In cells before magnetic separation, GAPDH mRNA and miR-137 fluorescence were observed, confirming the presence of blood cells (Fig. 2). 3.
  • HepG2 cells which are cells derived from human liver cancer.
  • HepG2 cells were cultured in DMEM medium containing 5-aza-dC, a DNA demethylating agent, at various concentrations for 3 days.
  • the cells cultured in DMEM medium containing 0.025% DMSO solution used to dissolve 5-aza-dC were used for comparison.
  • RNA extraction was performed using about one third of the total amount. 4).
  • the amount of CYP3A4 mRNA was measured by the quantitative real-time PCR method.
  • the amount of GAPDH mRNA was also measured for comparison.
  • the CYP3A4 gene showed a concentration-dependent increase in mRNA levels of 2.1, 2.7, and 3.4 by treatment with 0.5, 1, and 2 ⁇ M of 5-aza-dC, respectively. . 6). From these results, it was found that the amount of CYP3A4 mRNA increased as the environment was more susceptible to demethylation.
  • a reporter vector was constructed by inserting a CYP3A4 transcription start sequence approximately 2 kbp, which has been correlated with histone acetylation and CYP3A4 expression, and the following three sequences, respectively, and luciferase reporter assay was performed.
  • Sequence 1 was DMR
  • sequences 2 and 3 were sequences near DMR, respectively, and were selected as comparison targets for hypomethylated and hypermethylated states, respectively.
  • Sequence 5 (DMR): 5'-CACAGTCTGCGCTCCTGGTACACGCGCTTCAACTTCGGTTGGTGTG-3 ' (82563-82608 [GenBank accession number: AC069292])
  • Sequence 6 5'-CAGCGTGGCCACCGCCCCCACCCCCATCCCCCATCCCCGCACCCCC-3 ' (82447-82492 [GenBank accession number: AC069292])
  • Sequence 7 5'-CGAGCCTGGCGAAAGGTCCGCTGAGCGGGCTGTCGTCCGGAGCCAC-3 ' (82659-82704 [GenBank accession number: AC069292]) 2.
  • the inserted CpG island sequence was unmethylated.
  • the cells were treated with TSA, an acetylation promoter. 3.
  • TSA an acetylation promoter. 3
  • the reporter vector containing the DMR region showed about 34.8 times the transcriptional activity in the presence of TSA. This was a significant increase in transcriptional activity compared to the control without TSA treatment (p ⁇ 0.01). 4). In both reporter vectors into which sequence 2 and sequence 3 were inserted, no significant increase in transcriptional activity was observed compared to the control. 5.
  • FIG. 7 shows CpG islands to be analyzed in each specimen. (1) Three CpG islands between the SGCE-PEG10 genes, including DMR, were analyzed. (2) In addition, four CpG islands near the CYP3A family gene were also analyzed.
  • Bisulfite PCR primer Forward 5'-GTTAGTTTGGTTAGTTTAGTATTAGTA-3 '(sequence 8) Reverse: 5'-Bio-AAAACCCAATCAAATTTCTTC-3 '(sequence 9)
  • Bisulfite sequence primer I 5'-TTAGTTTGGTTAGTTTAGTATTAG-3 '(sequence 10)
  • II 5′-TTAGAGGAGGGTTATTGTAG-3 ′ (sequence 11)
  • III 5'-GAGGAGTAAGTTGGGAT-3 '(sequence 12)
  • IV 5'-TTTTTAGGTGTAATTTATATAAGG-3 '(sequence 13) 5.
  • the result of methylation analysis is shown in FIG.
  • ⁇ Experiment outline> 1 A crude cell fraction was obtained from 20 mL of human peripheral blood using Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). 2. To the obtained crude cell fraction, 3 mL of TrypLE (manufactured by Life Technology Japan) was added, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, inactivated by adding 3 mL of DMEM, and centrifuged at 1500 rpm for 1 minute. 3. After removing the supernatant, the precipitated cell pellet was collected and purified and washed. Then, methylation analysis was performed by the method according to Experimental Examples 2 to 8 using a cell solution suspended in PBS as a sample. 4). FIG.
  • FIG. 11 shows the results of analyzing the obtained sample by a cloning-sequence method and a COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) method, which are representative methods for methylation analysis.
  • the left figure shows the results of the presence or absence of methylation at each CpG site by sequencing a total of 9 clones isolated by subcloning the DNA obtained in 5. above. Of the 9 clones examined, 3 clones were methylated in any of the DMR regions of CpG site number 14 to 17, so this sample was about 30% in CpG site number 14 to 17 It was shown that the DNA methylation frequency was.
  • the right figure shows an example of the result of measuring the DNA methylation frequency at CpG site number 15 by the COBRA method for the DNA obtained in 5.
  • CpG site number 15 had a DNA methylation frequency of about 20%. 5. It was demonstrated that the method established this time can be used to quantitatively measure the isolation of human hepatocytes from peripheral blood and the frequency of DNA methylation in isolated hepatocytes. The obtained DNA methylation frequency reflects the DNA methylation frequency in liver tissue, and it is considered possible to noninvasively evaluate the DNA methylation frequency in liver tissue.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

【課題】 ヒト個体の薬物代謝能に応じた適切な医療を提供することにつながりうる，DMRにおけるメチル化解析方法，ならびにヒト個体におけるCYP3A4の発現量推定方法の開発 【解決手段】 ヒト血液中から正常な肝臓由来細胞を分離する肝臓由来細胞分離工程と，分離された肝臓由来細胞のDNAを抽出するDNA抽出工程と，肝臓由来細胞のDNAにおいて，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化の度合いを解析するメチル化解析工程とを含むことを特徴とするDNAメチル化解析方法。および，DNAメチル化解析方法により，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化度合いの評価を行い，ヒト肝臓のCYP3A4の発現量を推定することを特徴とするインビトロCYP3A4発現量推定方法。

Description

ＤＮＡメチル化解析方法ならびにＣＹＰ３Ａ４発現量推定方法
　本発明は，DNAメチル化解析方法ならびにCYP3A4発現量推定方法に関する。より詳しくは，ヒトの血液をサンプルとして用いて肝臓由来正常細胞を分離し，この肝臓由来正常細胞からDNAの抽出を行い，さらに，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れたCpG islandの一部の領域のDNAメチル化解析を行い，その結果をもとに人体におけるCYP3A4発現量を推定する方法に関するものである。
　Cytochrome P450（CYP）は，生体内物質や外界からの異物などの代謝を幅広く担っている代謝酵素である。CYPは，薬物代謝において極めて重要な役割を果たしており，医薬品の80～90%の代謝に関わっていることが知られている。CYPには基質特異性の異なる複数の分子種が存在する。中でもCYP3A4は，主要代謝臓器である肝臓において，CYPの中で最も多く発現している（非特許文献１）。
　CYP3A4は，主に肝臓および小腸に分布しており，現在の臨床現場で用いられている薬物の半数以上を基質とする。このことからCYP3A4は，薬物治療における個別適正化において重要な代謝酵素の1つである（非特許文献２）。しかし，ヒト肝臓においてCYP3A4は，発現量が約50倍，酵素活性が約10～20倍の個人差があることが報告されている（非特許文献３）。
　CYP3A4活性の個人差は60～90%が遺伝的要因によるものだという報告がある（非特許文献４）。この報告をはじめとして，これまでCYP3A4遺伝子のexon領域，intron領域，5’上流，3’下流非翻訳領域について遺伝子多型解析が行われてきた。しかしながら，個人差に重要となるSNPsは見つかっておらず，個人差の要因は不明であった。このような事情もあって，近年，個人差要因を説明する機構として，遺伝子配列の変化を伴わない遺伝子発現制御機構であるエピジェネティクス機構について研究が行われてきている。
　エピジェネティックな制御機構の1つとして，DNAメチル化が知られている。哺乳類のDNAは，全配列の60～90%がメチル化されている。一般的に，DNAメチル化では遺伝子上のCG配列のC5位炭素原子がメチル化される。CG配列が高頻度に出現するCpG islandと呼ばれる領域では，CG配列の多くはメチル化されていない。また，遺伝子プロモーター領域や転写開始部位がメチル化されることで，遺伝子発現が抑制されることが知られている（非特許文献５，６）。
　DNAメチル化と疾患の関連性について様々な検討が行われており，疾患によってはDNAメチル化状態が変化し遺伝子発現量が変化することが知られている。このことから，DNAメチル化との関連性が高い疾患である癌において，バイオマーカーや治療効果の判定を行う際にDNAメチル化解析を利用する試みが行われている。
 
Evans WE, Relling MV. (1999) Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics. Science, 286:487-91. Vincent J. Wacher, Chi-Yuan Wu, and Leslie Z Benet. (1995) Overlapping substrate specificities and tissue distribution of cytochrome P450 3A and P-glycoprotein: Implications for drug delivery and activity in cancer chemotherapy. Moleular Carcinogenesis, 13:129-134. Shimada T, Yamazaki H, Himura M, Inui Y, Guengerich FP. (1994) Interindividual variations in human liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drug, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes od 30 Japanese and 30 Caucasians. J Pharmacol Exp Ther, 270(1):414-23. Lown KS, Thummel KE, Benedict PE, Shen DD, Turgeon DK, Berent S, Watkins PB. (1995) The erythromycin breath test predicts the clearance of midazolam. Clin Phermacol Ther, 57(1):16-24. Ng HH and Bird A. (1999) DNA methylation and chromatin modification. Current Opinion Genetics＆Development 9:158-163. Nakao M. (2001) Epigenetics: interaction of DNA methylation and chromatin. GENE 278:25-31. Koch I, Weil R, Wolbold R, Brockmoller J, Hustert E, Burk O, Nuessler A, Neuhaus P, Eichelbaum M, Zander U, Wojnowski L. (2002) Interindividual variability and tissue-specificity in the expression of cytochrome P450 3A mRNA. Drug Metabolism and Disposition
　発明者らは，ヒト肝臓組織のDNAメチル化解析により，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れたCpG islandの一部の領域（Differentially methylated region，DMR）において，個人間でDNAメチル化頻度にばらつきが見られ，DMRにおけるDNAメチル化頻度とCYP3A4発現量との間に強い相関が認められることを明らかにしている。
　このCYP3A4遺伝子から5Mbpも離れた遺伝子領域のメチル化が，CYP3A4の発現に影響を及ぼしているという知見は，遺伝学の常識からは考えられないものであり，極めて貴重な知見である。
　さらにこの知見は，DMRにおけるDNAメチル化がCYP3A4発現の個人差において一定の役割を果たしており，DNAメチル化を解析することでCYP3A4発現量を推測できる可能性があることを示すものである。しかしながら，ヒト肝組織を採取することは臨床的に難しく，ヒト肝組織におけるCYP3A4発現量予測を可能とするバイオマーカーは未だ確立されていない。
　上記事情を背景として本発明では，ヒト個体の薬物代謝能に応じた適切な医療を提供することにつながりうる，DMRにおけるメチル化解析方法，ならびにヒト個体におけるCYP3A4の発現量推定方法の開発を課題とする。
　発明者らは，鋭意研究の結果，血液中に存在するかもしれない，肝臓から剥離した肝細胞を分離すること，および，その肝細胞のDNA抽出およびDNAメチル化解析を行うことに着想した。
　発明者らが確認を行ったところ，血液中から正常な肝細胞の分離に成功した。加えて，この分離した肝臓由来正常細胞を用いて，DNAの抽出およびDNAメチル化解析が可能であることを確認した。
　これらにより，ヒトの血液をサンプルとして用いて肝臓由来正常細胞を分離し，この肝臓由来正常細胞のDNAを用いることにより，DMRにおけるメチル化解析方法およびヒト個体におけるCYP3A4発現量推定する方法の発明を完成させた。
　本発明は，以下の構成からなる。
　本発明の第一の構成は，ヒト血液中から正常な肝臓由来細胞を分離する肝臓由来細胞分離工程と，分離された肝臓由来細胞のDNAを抽出するDNA抽出工程と，肝臓由来細胞のDNAにおいて，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化の度合いを解析するメチル化解析工程とを含むことを特徴とするDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第二の構成は，解析工程における肝臓由来細胞DNAが，抽出工程を経た後，さらにCYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のDNAをPCR法にて増幅する増幅工程を経て得られることを特徴とする第一の構成に記載のDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第三の構成は，増幅工程に用いるプライマー配列が，配列番号１２ないし配列番号１３に示すプライマーであることを特徴とする第二の構成に記載のDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第四の構成は，肝臓由来細胞分離工程が，ヒト血液中から細胞ペレットを経る細胞ペレット分離工程と，細胞ペレットに，肝臓に特異的に発現する抗原ないしレセプター等をターゲットとして，肝臓由来細胞を選択的に分離する選択的分離工程とからなることを特徴とする第一ないし第三の構成に記載のDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第五の構成は，細胞ペレット分離工程が，密度勾配遠心分離法を用いてなされることを特徴とする第四の構成に記載のDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第六の構成は，選択的分離工程におけるターゲットが，アシアロ糖タンパク質受容体であることを特徴とする第四又は第五の構成に記載のDNAメチル化解析方法である。
　本発明の第七の構成は，第一ないし第六の構成に記載のDNAメチル化解析方法により，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化度合いの評価を行い，ヒト肝臓のCYP3A4の発現量を推定することを特徴とするインビトロCYP3A4発現量推定方法である。
 
　本発明により，DMRにおけるメチル化解析方法，ならびにヒト個体におけるCYP3A4の発現量推定方法の提供が可能となった。これにより，ヒト個体の薬物代謝能に応じた適切な医療を提供することが期待できる。
 
肝臓由来正常細胞におけるGSTP1プロモーター領域のメチル化解析結果を示した図 磁気分離前細胞におけるRNA検出結果を示した図 磁気分離後細胞におけるRNA検出結果を示した図 DMRにおけるDNAメチル化度合いが，CYP3A4遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示した図 ルシフェーラゼアッセイの結果を示した図 各検体におけるCYP3A4のmRNA発現を比較した図 メチル化解析を行ったCpG islandsを示した図 各CpG islandsにおけるメチル化頻度を解析した結果を示した図 DMRにおけるメチル化頻度と，AERの相関について解析を行った結果を示した図 DMRにおけるメチル化頻度と，CYP3A4のmRNA発現量の相関について解析を行った結果を示した図 ヒト末梢血細胞ペレットを用いたクローニング-シークエンス法ならびにCOBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)法によるメチル化解析結果を示した図
　以下では，本発明のDNAメチル化解析方法ならびにCYP3A4発現量推定方法について説明を行う。
＜＜DNAメチル化解析方法の概要＞＞
　本発明のDNAメチル化解析方法では，まず，ヒトの血液を用いて，その血液から正常な肝臓由来細胞を分離する（肝臓由来細胞分離工程）。そして分離された肝臓由来細胞からDNAの抽出を行う（DNA抽出工程）。この抽出されたDNAについて，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域（82563-82608 [GenBank accession number : AC069292]，以下，「DMR」）のメチル化の度合いを解析する（メチル化解析工程）。
　よって，本発明のDNAメチル化解析方法では，肝臓由来細胞分離工程，DNA抽出工程，メチル化解析工程，これら３つの工程を必須の構成とする。以下では，これらの工程について説明を行う。
［肝臓由来細胞分離工程］
　肝臓由来細胞分離工程は，ヒト血液中から，肝臓由来の正常細胞を分離する工程である。肝臓由来細胞分離工程は，この肝臓由来正常細胞の分離が可能な限り特に限定する必要はなく，種々の手法を単独，もしくは組み合わせて用いることができる。
　肝臓由来細胞分離工程の一例として，密度勾配遠心分離法と磁気ビーズによる分離を組み合わせた手法が挙げられる。
　まず，密度勾配遠心分離法により細胞ペレットを得る方法について説明する。
　フィコールやパーコール等の密度勾配遠心用の試薬を滅菌チューブに入れ，その上にヒト血液サンプルを静置し，遠心分離を行う。ヒト血液サンプルについては直接用いてもよいが，バッファー等により溶血作業を行ったものを用いてもよい。また，遠心分離の条件については，用いる血液サンプルや密度勾配遠心用試薬によって適宜調整すれよい。
　密度勾配遠心分離法により得られた細胞ペレットは，肝臓由来正常細胞以外に，白血球などの他の細胞を含んでいる。よって，この細胞ペレットから，肝由来正常細胞を選択的に抽出する必要がある。
　このように，肝臓由来細胞分離工程においては，密度勾配遠心分離法を用いることが好ましい。これにより，簡便に肝臓由来正常細胞を含む細胞ペレットを得ることができ，本発明のDNAメチル化解析方法の作業効率を向上させる効果を有する。
　続いて磁気ビーズによる分離により，得られた細胞ペレットから肝臓由来正常細胞を抽出する方法について説明する。
　得られた細胞ペレットと，肝臓特異的に発現している抗原ないし受容体と結合するタンパク等を反応させる。このような抗原ないし受容体として，アシアロ糖タンパク質受容体などが挙げられる。また，反応させるタンパク等は，その後の磁気ビーズとの反応のため，ビオチンなどのラベル分子を予め結合させておく。
　次に，反応により得られたタンパク結合細胞ペレットと，磁気ビーズとを反応させる。この際に用いる磁気ビーズは，ラベル分子に結合する抗体等を結合させておく。この反応により，磁気ビーズがラベル分子を介して肝臓由来正常細胞に結合する。これを，カラムなどにより精製することにより，細胞ペレットから肝臓由来正常細胞を選択的に分離することができる。
　このように，肝臓由来細胞分離工程において，肝臓に特異的に発現する抗原ないしレセプター等をターゲットとして，肝臓由来細胞を選択的に分離することが好ましい。これにより，肝臓由来正常細胞を効率的に抽出することが可能なり，本発明のDNAメチル化解析方法の作業効率を向上させる効果を有する。
［DNA抽出工程］
　DNA抽出工程は，肝臓由来細胞分離工程により得られた肝臓由来正常細胞からDNAを抽出する工程である。DNA抽出工程は，このDNA抽出が可能な限り特に限定する必要はなく，種々の手法を用いることができる。
　一例をあげると，タンパク質分解酵素等により細胞組織由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キットを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
　得られたDNAについて，DMRのDNAを，PCR法などの核酸増幅方法により，増幅することが好ましい。これにより，本発明におけるDNAメチル化解析の精度を向上させる効果を有する。
　核酸増幅法としてPCR法を例にあげると，プライマーとして配列番号１２ないし配列番号１３に示すプライマーを用い，耐熱性DNAポリメラーゼ，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を反応溶液に加え，熱変性，アニーリング，伸長反応を行い，これらのサイクルを繰り返すことにより核酸増幅を行えばよい。
［メチル化解析工程］
　メチル化解析工程は，DMRにおけるメチル化の度合いを解析する工程である。メチル化解析工程は，DMRにおけるメチル化解析が可能限り特に限定する必要はなく，種々のメチル化解析手法を用いることができる。このようなメチル化解析手法として，バイサルファイトシークエンス法，バイサルファイトクローニングシークエンス法，Methylation Specific PCR法，COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)法，Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP)法などが挙げられる。
　一例として，バイサルファイトシークエンス法を用いたDNAメチル化解析を挙げると，得られたDNAにバイサルファイト処理を行ない，非メチル化シトシンをウラシルに変換する。そして，バイサルファイト処理前後で生じるシトシンとチミン(ウラシル)の差異を配列データとして得，これをメチル化の度合いとして評価すればよい。
＜＜CYP3A4発現量推定方法の概要＞＞
　上述したDNAメチル化解析方法を経て，DMRにおけるメチル化度合いに関する情報を得ることが可能となる。このメチル化度合いの情報をもとに，ヒト肝臓におけるCYP3A4発現量の推定を行う。DMRにおけるメチル化頻度が低いほど，CYP3A4のmRNA量が多いことから，CYP3A4の発現量についても低いことが考えられる。
 
＜＜実験例１．末梢血からの細胞ペレットの分離＞＞
　ヒトの末梢血から，肝臓由来の正常細胞が分離できるかについて検討を行うに際し，肝臓由来正常細胞と推定される細胞ペレットの分離を行うことを目的として行った。
＜実験概容＞
１．チューブに，18～20℃に調整したヒト末梢血サンプル14mLと等量のbalanced solutionを入れ転倒混和した。なお，balanced solutionについては，下記，solution Aとsolution Bを１対９の比で混合したものを用いた。
　［Solution A］
　　D-glucose（20mg），CaCl2（0.148mg），MgCl2（3.984mg），KCl（8.052mg），Tris
　　（349.13mg）を超純水にて溶解し，pH7.6に調整後，20mLにメスアップしたもの
　［Solution B］
　　NaCl（368.55mg/45mL）
２．50mLチューブにFicoll-Paque mediaを20mL分取し，その上に血液とbalanced salt solutionの混合溶液を加え，1750rpmで40分間遠心した。
３．上清を除去後，中間層を新しいチューブに入れ，3倍量のbalanced salt solutionを加えて1750rpmで15分間遠心した。
４．上清を除去後，7mLのbalanced salt solutionを加え，1750rpmで10分間遠心し，上清を除去し細胞ペレットを得た。
＜＜実験例２．asialofetuinのbiotin化＞＞
　細胞ペレットを間接的にMicrobeadsに結合させるためのターゲット抗原としてbiotinを用いることから，asialofetuinのbiotin化を目的として行った。
＜実験概容＞
１．0.2mg asialofetuinを100μLのWS bufferで溶かし，Filtration Tube に入れ，ピペッティングした後，8000×gで10分間遠心し，洗浄を行った。
２．NH2-Reactive Biotinに10μL DMSOを加え溶解させた。
３．１のFiltration tubeに，100μL Reaction buffer，DMSOで溶解したNH2-Reaction Biotin全量の順に加えた後，37℃で10分間インキュベートし，asialofetuinのbiotin化反応を行った。
４．３の溶液に，100μL WS bufferを加え，8000×gで10分間遠心し，上清を除去することにより，洗浄作業を行った。同様の洗浄作業をさらに１回行った。
５．４で得られた溶液の上清を除去後，200μL WS buffer を加え，10回以上ピペッティングしたものをbiotinylated asialofetuin溶液として得た。この溶液は，4℃で保存し，後の実験に用いた。
＜＜実験例３，Asialofetuin，microbeadsによる標識と磁気分離＞＞
　細胞ペレット中に存在するであろう肝臓由来正常細胞を分離するために行った。
＜実験概容＞
１．WS Bufferで細胞ペレットを懸濁した後，biotinylated asialofetuin溶液20μLと混合し，37℃で45分間インキュベートを行い，正常肝細胞のasialofetuin受容体とbiotinylated asialofetuinを反応させた。
２．１で得られた反応溶液を400×gで5分間遠心後，上清を除去し，1mL Bufferを加えさらに300×gで10分間遠心し，洗浄作業を行った。なお，Bufferとしては下記のとおり調製したものを用いた。
　［Buffer］
　　dH2O 16mL，10×PBS 2mL，0.5 M EDTA 80μLを混合し，pH 7.6に調整し
　　19mLにメスアップした後，1mL 10% BSA を加えたもの
３．２で遠心分離したものの上清を除去し，残渣を80μLのBufferで溶出した。これに，20μL Anti-Biotin MicroBeadsを加えて十分に混合した後，4℃で15分間インキュベートした。これにより，正常肝細胞にasialofetuin受容体を介して結合しているbiotinと，microbeads上のAnti-biotinを反応させた。
４．３の反応液を300×gで遠心後，上清を除去し500μL Bufferを加え300×gで遠心して洗浄作業を行った。残渣を500μL Bufferで溶出し細胞懸濁液として，その後の分離に用いた。
５．MACS separatorにカラムを設置し，500μL Bufferでカラムをリンスした。
６．４で得られた細胞懸濁液中の凝集塊を取り除くために，プレセパレーションフィルターを設置した。
７．細胞懸濁液をフィルターにapplyし，溶液が落ち切った後に500 μL Bufferで3回洗浄した。
８．MACS separator からカラムを外し，安定な場所へ設置して1mL Bufferを加えてプランジャーで押し出し，磁気分離細胞を得，その後の実験に用いた。
＜＜実験例４．GSTP1プロモーター領域のメチル化解析＞＞
　実験例３で得られた磁気分離細胞が肝臓由来正常細胞であること，および，肝臓由来正常細胞のDNAメチル化解析が可能かどうかを確認するために行った。
　DNAメチル化解析として，プロモーター領域が肝細胞特異的にメチル化されていることが報告されているGlutathione S-transferase P1（GSTP1）のDNAメチル化解析を行い，肝臓由来正常細胞と肝正常細胞のDNAメチル化状態の比較を行うことにより，磁気分離細胞が肝臓由来正常細胞であるかどうかの確認を行った。
＜実験概容＞
１．バイサルファイトシークエンス法を用いて，磁気分離細胞におけるGSTP1のDNAメチル化解析を行った。比較対象として，ヒト正常肝細胞，および磁気分離作業前の細胞ペレットのDNAメチル化解析を合わせて行った。
２．DNAメチル化解析については，文献報告によればGSTP1 遺伝子の転写開始点から数えて-7～+4までのCpG sitesについてメチル化の報告があることから，GSTP1遺伝子の転写開始点から数えて-7～+4までのCpG sitesについてメチル化解析を行い，解析についてはそれぞれ10個のクローンを解析した。
３．図１に結果を示す。DNAメチル化解析の結果，ヒト肝組織（A）では，GSTP1のDNAはメチル化状態であることが確認された。
４．磁気分離前の末梢血由来細胞（B）は非メチル化状態であったのに対し，磁気分離後の細胞（C）はメチル化状態であった。加えて，磁気分離後の細胞のメチル化状態は，ヒト肝組織のメチル化状態と類似していた。
５．これらの結果から，実験例３で行った一連の分離作業により，磁気分離細胞に肝細胞が含まれている可能性が強く示唆された。加えて，末梢血由来細胞から，肝臓由来正常細胞と推定される細胞のDNAメチル化解析が可能であることが確認された。
＜＜実験５．SmartFlareTM RNA検出プローブによる確認＞＞
　実験例３で得られた磁気分離細胞が，肝臓由来正常細胞であることを確認するために行った。
　SmartFlareTM RNA 検出プローブを用いて肝細胞特異的に発現する microRNA である miR-122 の蛍光染色を行った。
＜実験概容＞
１．SmartFlareTM RNA検出プローブを用いて，肝細胞特異的に発現するmicroRNAであるmiR-122の蛍光染色を行った。同時に，ポジティブコントロールとしてほとんどの細胞に発現する GAPDH mRNA，ネガティブコントロールとして細胞内のいずれの配列も認識しないmiRNA Scramble，さらに肝細胞に発現せず血球細胞に発現するmiR-137の蛍光染色を行った。
２．図２および図３に結果を示す。磁気分離前の細胞においては，GAPDH mRNAとmiR-137の蛍光が観察され，血球細胞の存在が確認された（図２）。
３．磁気分離細胞において，GAPDH mRNAとmiR-122の蛍光が観察され，血球に発現するmiR-137は観察されなかった（図３）。
４．miR-122は肝細胞に特異的に発現することから，磁気分離により，末梢血細胞から肝細胞が分離された可能性が示唆された。
＜＜実験例６．HepG2細胞におけるDNAメチル化のCYP3A4遺伝子発現への影響評価＞＞
　DMRにおけるDNAメチル化がCYP3A4遺伝子の転写活性に影響を与えるか否かを調べるため行った。
＜実験概容＞
１．サンプルとして，ヒト肝がん由来細胞であるHepG2 細胞を用いて解析を行った。
２．HepG2細胞を，DNA脱メチル化剤である5-aza-dCを各濃度で含んだDMEM培地で3日間培養を行った。なお，5-aza-dCを溶解する際に用いたDMSO溶液を0.025％含むDMEM培地で培養したものを比較対象とした。
３．培養後，HepG2細胞を回収し，全量の約3分の1を用いて，RNA抽出を行った。
４．抽出したRNAについて，quantitative real-time PCR法によりCYP3A4のmRNA量を測定した。合わせて，比較対象として，GAPDHのmRNA量の測定も行った。なお，これらを増幅するプライマーについては，下記のものを用いた。
 
　［CYP3A4］
　　Forward : 5’- CCCTCGAGTTCTACTCCGGTAAAC -3’（配列１）
　　Reverse : 5’- CCCTCGAGCACTACTTTCCTTACTTATCTCTCT -3’（配列２）
　［GAPDH］
　　Forward : 5’- CCTCCCGCTTCGCTCTCTGCT -3’（配列３）
　　Reverse : 5’- GAGCGATGTGGCTCGGCTGG -3’（配列４）
 
５．結果を図４に示す。コントロール（DMSOのみ）のmRNAを1としたとき，CYP3A4遺伝子は0.5，1，2μMの5-aza-dC処理によりそれぞれ2.1倍，2.7倍，3.4倍と濃度依存的なmRNA量の増加を示した。
６．この結果から，脱メチル化が起きやすい環境にあるほど，CYP3A4 mRNA量が増加していることが分かった。
＜＜実験７．CpG islandのCYP3A4 転写活性への影響評価＞＞
　DMRがCYP3A4転写活性に与える影響について評価を行った。
＜実験概容＞
１．ヒストンアセチル化とCYP3A4発現に相関の得られているCYP3A4転写開始点近傍約2kbpの配列，および，それぞれ下記３つの配列を挿入したレポーターベクターを作製し，luciferase reporter assayを行った。配列１はDMRであり，配列２，配列３は，それぞれDMR近傍の配列であって，それぞれ低メチル化状態，高メチル化状態の比較対象として選択した。
　配列５（DMR）：
　　5’-CACAGTCTGCGCTCCTGGTACACGCGCTTCAACTTCGGTTGGTGTG-3’
　　（82563-82608 [GenBank accession number : AC069292]）
　配列６：
　　5’-CAGCGTGGCCACCGCCCCCACCCCCATCCCCCATCCCCGCACCCCC-3’
　　（82447-82492 [GenBank accession number : AC069292]）
　配列７：
　　5’-CGAGCCTGGCGAAAGGTCCGCTGAGCGGGCTGTCGTCCGGAGCCAC-3’
　　（82659-82704 [GenBank accession number : AC069292]）
２．挿入したCpG islandの配列は非メチル化状態とした。ヒストンアセチル化状態での影響を評価するため，細胞にアセチル化促進剤であるTSA処理を行った。
３．Luciferase reporter assayの結果，DMR 領域を含んだレポーターベクターはTSA存在下で約34.8倍の転写活性を示した。これはTSA処理を行っていないコントロールに比べて有意な転写活性の上昇であった（p < 0.01）。
４．配列２および配列３を挿入したレポーターベクターはどちらにおいてもコントロールに比べて有意な転写活性の上昇は認められなかった。
５．これらの結果から，DMR領域がCYP3A4の転写活性に重要な役割を果たしていることを示すことが分かった。
＜＜実験８．CYP3A4遺伝子発現に関与するCpG islandのメチル化解析＞＞
　DMRにおけるメチル化頻度が，ヒトCYP3A4発現にどのような影響を与えているかを調べるために行った。
＜実験概容＞
１．CYP3A4遺伝子が座位するヒト7番染色体に存在するCpG islandsにおいて，ヒト肝臓より抽出したgenome DNAを用い，DNAメチル化解析を行った。
２．対象検体は，CYP3A4 mRNA発現量が低い検体（HHL No. 12, 16, 20, 36）と高い検体（HHL No. 6, 7, 14, 15）を4検体ずつ，合計８つのヒト肝臓由来の検体を用いた（図６）。
３．各検体において，解析対象としたCpG islandsを図７に示す。
(1)　DMRが含まれる，SGCE-PEG10遺伝子間に存在する3ヵ所のCpG islandsを解析対象とした。
(2)　合わせて，CYP3Aファミリー遺伝子近傍に存在する4か所のCpG islandsも解析対象とした。
(3)　なお，各CpG islandsにおいて，実験手技的に解析が困難なCG sitesが存在したことから，それらについては解析を行わず，その場合は，いくつかのCG sitesに限局してメチル化解析を行った。
４．DNAメチル化解析は，バイサルファイトパイロシークエンス法により行った。プライマーとしては，下記のプライマーを用いた。
　バイサルファイトPCRプライマー
　　Forward：5’- GTTAGTTTGGTTAGTTTAGTATTAGTA -3’（配列８）
　　Reverse：5’- Bio-AAAACCCAATCAAATTTCTTC -3’（配列９）
　バイサルファイトシークエンスプライマー
　　I：5’- TTAGTTTGGTTAGTTTAGTATTAG -3’（配列１０）
　　II：5’- TTAGAGGAGGGTTATTGTAG -3’（配列１１）
　　III：5’- GAGGAGTAAGTTGGGAT -3’（配列１２）
　　IV：5’- TTTTTAGGTGTAATTTATATAAGG -3’（配列１３）
５．メチル化解析の結果を図８に示す。
(1)　メチル化頻度の比率は，各CG sitesによって異なっていた。
(2)　CpG islandsごとにみると，8検体一様にメチル化頻度の比率は同じような傾向を示しており，個人差と考えられるメチル化頻度の差は認められなかった。
(2)　しかしながら，DMRを含む領域である，SGCE-PEG10遺伝子間CpG island 82363-82893の中で，14，15，16，17番目のCG siteにおいてメチル化頻度に個人差が認められた（図８，(b)）。
６．DNAメチル化解析の結果をもとに，図８(b)に示す４か所のCG sitesにおけるメチル化頻度について，AERとの相関を解析した。結果を図９に示す。
(1)　メチル化頻度に個人差が見られる14番目のCG siteにおいて，メチル化頻度とAERについて，逆相関の傾向が得られた (rs = -0.655 , p = 0.079) 。
(2)　この解析結果は，メチル化頻度が高くなるにつれて，2本の染色体間でアリル発現に大きな偏りが生じていることを示すものである。
７．さらに，DNAのメチル化が直接CYP3A4遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。結果を図１０に示す。
(1)　図８(b)に示す4か所のCG sitesにおけるメチル化頻度とCYP3A4 mRNA発現量の間には，14，16番目のCG sitesにおいて有意な相関が得られた (rs = -0.822, p = 0.009，rs = -0.751, p = 0.029, Fig. 9) 。
(2)　特に14番目のCG siteでは強い相関関係が認められた。
(3)　すなわち，これらのCG siteにおいては，メチル化頻度が高くなるにつれてAERと同様，CYP3A4 mRNA発現量も低下することを示すものである。
＜＜実験例９．末梢血からの細胞ペレットの分離＞＞
　ヒト末梢血から分離したヒト肝細胞ペレットを用いて一連のメチル化解析操作を行い，メチル化解析が可能かどうかを確認する目的で実験を行った。
＜実験概容＞
１．Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)を用いて，ヒト末梢血20mLより細胞粗画分を得た。
２．得られた細胞粗画分に対して，TrypLE（ライフテクノロジージャパン株式会社製） 3mLを加え，37℃で 5 分間インキュベートした後，DMEM 3mLを加えて失活させ，1500rpmで1分遠心した。
３．上清を除去後，沈殿した細胞ペレットを回収し，精製・洗浄作業を行った。その後，PBSにて懸濁した細胞溶液をサンプルとして，実験例２から８に準じる方法にて，メチル化解析を行った。
４．得られたサンプルについてメチル化解析の代表的な手法であるクローニング-シークエンス法とCOBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)法により解析した結果を図１１に示す。
(1)　左図は，上記5.により得られたDNAについてサブクローニングにて分離した計９つクローンについてシークエンスを行い，各CpG siteのメチル化有無の結果を示している。検討を行った9つのクローンのうち，3つのクローンについては，CpG site number 14から17いずれのDMR領域においてもメチル化されていたことから，当該検体についてはCpG site number 14から17において約30％のDNAメチル化頻度であることが示された。
(2)　右図は，上記5.により得られたDNAついてCOBRA法によりCpG site number 15におけるDNAメチル化頻度を測定した結果の例を示す。電気泳動の結果，CpG site number 15は，約20%のDNAメチル化頻度であった。
５．今回確立した方法により末梢血からヒト肝細胞の分離と分離した肝細胞におけるDNAメチル化頻度が定量的に測定可能であることが示された。得られたDNAメチル化頻度は，肝組織におけるDNAメチル化頻度を反映しており肝組織のDNAメチル化頻度を非侵襲的に評価することが可能であると思われる。

Claims (7)

  1. ヒト血液中から正常な肝臓由来細胞を分離する肝臓由来細胞分離工程と，
    分離された肝臓由来細胞のDNAを抽出するDNA抽出工程と，
    肝臓由来細胞のDNAにおいて，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化の度合いを解析するメチル化解析工程とを含むことを特徴とするDNAメチル化解析方法
     
  2. 解析工程における肝臓由来細胞DNAが，抽出工程を経た後，さらにCYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のDNAをPCR法にて増幅する増幅工程を経て得られることを特徴とする請求項１に記載のDNAメチル化解析方法
     
  3. 増幅工程に用いるプライマー配列が，配列番号１２ないし配列番号１３に示すプライマーであることを特徴とする請求項２に記載のDNAメチル化解析方法
     
  4. 肝臓由来細胞分離工程が，
    ヒト血液中から細胞ペレットを経る細胞ペレット分離工程と，
    細胞ペレットに，肝臓に特異的に発現する抗原ないしレセプター等をターゲットとして，肝臓由来細胞を選択的に分離する選択的分離工程とからなることを特徴とする請求項１ないし３に記載のDNAメチル化解析方法
     
  5. 細胞ペレット分離工程が，密度勾配遠心分離法を用いてなされることを特徴とする請求項４に記載のDNAメチル化解析方法
     
  6. 選択的分離工程におけるターゲットが，アシアロ糖タンパク質受容体であることを特徴とする請求項４又は５に記載のDNAメチル化解析方法
     
  7. 請求項１ないし６に記載のDNAメチル化解析方法により，CYP3A4遺伝子から5Mbp離れた遺伝子領域のメチル化度合いの評価を行い，ヒト肝臓のCYP3A4の発現量を推定することを特徴とするインビトロCYP3A4発現量推定方法
     
     
     
     
     
     
     
PCT/JP2015/055106 2014-02-25 2015-02-24 Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法 WO2015129646A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016505212A JP6482087B2 (ja) 2014-02-25 2015-02-24 Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-034688 2014-02-25
JP2014034688 2014-02-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015129646A1 true WO2015129646A1 (ja) 2015-09-03

Family

ID=54008964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/055106 WO2015129646A1 (ja) 2014-02-25 2015-02-24 Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6482087B2 (ja)
WO (1) WO2015129646A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018157812A (ja) * 2017-03-23 2018-10-11 東ソー株式会社 試料中に含まれる細胞の検出方法
JP2022551633A (ja) * 2019-10-08 2022-12-12 レピジン カンパニー，リミテッド 生物学的試料が肝組織由来であるか否かを判別する方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102344958B (zh) * 2010-08-04 2014-12-17 上海人类基因组研究中心 一种推断cyp3a4基因表达量的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102344958B (zh) * 2010-08-04 2014-12-17 上海人类基因组研究中心 一种推断cyp3a4基因表达量的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HABANO W. ET AL.: "METHYLATION OF PXR, VDR AND PRMT1 GENES AND THEIR ROLES IN THE REGULATION OF CYP3A4 EXPRESSION IN COLON CANCER CELLS.", 24TH JSSX ANNUAL MEETING KOEN YOSHISHU, vol. 11, no. 1, 2009, pages 269, XP021087294 *
HAYASHI T. ET AL.: "Regulation of CYP3A4 Expression Level in Japanese Liver.", 27TH ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN PROGRAM KOEN YOSHISHU, 2004, pages 444 *
JIRO FUJIMOTO: "Autotransfusion In Hepatectomy For Hepatocellular Carcinoma", JOURNAL OF JAPAN SURGICAL SOCIETY, vol. 92, no. 7, 1991, pages 825 - 830 *
KACEVSKA M. ET AL.: "DNA methylation dynamics in the hepatic CYP3A4 gene promoter.", BIOCHIMIE, vol. 94, no. 11, 2012, pages 2338 - 2344, XP055220773, ISSN: 0300-9084 *
SHUNSUKE EGUCHI ET AL.: "CYP3A4 Idenshi Hatsugen no Kojinsa Kaimei o Shiko shita Epigenetic Kaiseki", DAI 28 KAI THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN , KYUSHU BRANCH, TAIKAI KOEN YOSHISHU, 2011, pages 24 *
XU W. ET AL.: "Isolation of circulating tumor cells in patients with hepatocellular carcinoma using a novel cell separation strategy.", CLIN CANCER RES., vol. 17, no. 11, 2011, pages 3783 - 3793 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018157812A (ja) * 2017-03-23 2018-10-11 東ソー株式会社 試料中に含まれる細胞の検出方法
JP2022551633A (ja) * 2019-10-08 2022-12-12 レピジン カンパニー，リミテッド 生物学的試料が肝組織由来であるか否かを判別する方法
JP7412549B2 (ja) 2019-10-08 2024-01-12 レピジン カンパニー，リミテッド 生物学的試料が肝組織由来であるか否かを判別する方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6482087B2 (ja) 2019-03-13
JPWO2015129646A1 (ja) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6966508B2 (ja) 尿バイオマーカーコホート、遺伝子発現特性、およびその使用の方法
EP3274476B1 (en) Digital analysis of circulating tumor cells in blood samples
EP3529374B1 (en) Sequencing and analysis of exosome associated nucleic acids
KR20210107618A (ko) 뉴클레아제 기반 rna 고갈
US20210147935A1 (en) Methods and probes for identifying gene alleles
EP2596006B1 (en) Methods and systems for analysis of single cells
JP2004511236A (ja) 核酸差異を含有するポリヌクレオチドを同定かつ単離する方法
EP3607064A1 (en) Method and kit for targeted enrichment of nucleic acids
CN106957906B (zh) 一种应用于高通量测序检测t细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒
US10815528B2 (en) MiRNAs as non-invasive biomarkers for inflammatory bowel disease
JP6449147B2 (ja) Ｔ細胞リンパ腫の検出方法
JP6482087B2 (ja) Ｄｎａメチル化解析方法ならびにｃｙｐ３ａ４発現量推定方法
US20230032847A1 (en) Method for performing multiple analyses on same nucleic acid sample
US20210115503A1 (en) Nucleic acid capture method
US20180291436A1 (en) Nucleic acid capture method and kit
WO2018186947A1 (en) Method and kit for targeted enrichment of nucleic acids
KR101767644B1 (ko) 차등 발현 유전자를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법
US20240180981A1 (en) Methods to analyze host-microbiome interactions at single-cell and associated gene signatures in cancer
KR20220012896A (ko) 배설물 시료 내 희귀 dna 서열의 검출 방법
US20230348985A1 (en) Methods for non-invasively monitoring organ health in cross-species transplantation
WO2005098021A1 (en) Detecting targets using nucleic acids having both a variable region and a conserved region
Beier et al. Microfluidic primer extension assay
JP2024149636A (ja) ヌクレアーゼを利用したｒｎａ枯渇
JP2000201685A (ja) Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15755401

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016505212

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15755401

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1