WO2015111252A1 - ポリペプチド及び抗腫瘍剤 - Google Patents

ポリペプチド及び抗腫瘍剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2015111252A1
WO2015111252A1 PCT/JP2014/076945 JP2014076945W WO2015111252A1 WO 2015111252 A1 WO2015111252 A1 WO 2015111252A1 JP 2014076945 W JP2014076945 W JP 2014076945W WO 2015111252 A1 WO2015111252 A1 WO 2015111252A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
domain
egf
crm197
mbp
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/076945
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英輔 目加田
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to US15/112,756 priority Critical patent/US20170029474A1/en
Publication of WO2015111252A1 publication Critical patent/WO2015111252A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag

Definitions

  • HB-EGF is a heparin-binding growth factor.
  • EGF family growth factors include EGF, transforming growth factor (TGF- ⁇ ), amphiregulin (AR), epiregulin, etc., and these molecules are classified into EGF receptors and their family (ErbB family) molecules. Binds to promote receptor phosphorylation. Specifically, HB-EGF binds to EGF receptors ErbB1 and ErbB4. HB-EGF is expressed in various tissues, and high mRNA expression is observed in lung, skeletal muscle, and heart. Furthermore, high expression in various cancer tissues and inflammatory sites has also been reported.
  • HB-EGF has been reported to well promote the proliferation of fibroblasts, smooth muscle cells or keratinocytes. In addition, HB-EGF has been reported not only to play an important role in morphogenesis and regeneration of the living body, but also closely related to cancer cell proliferation and invasion, metastasis, and anticancer drug resistance.
  • HB-EGF is synthesized on the cell membrane as a membrane-bound molecule (proHB-EGF) and cleaved by a cell surface protease to produce secreted HB-EGF (sHB-EGF). Although this sHB-EGF mainly acts as a growth factor, there have been reports of cases where proHB-EGF acts as a growth factor in a membrane-bound form. (Non-Patent Document 1-3).
  • Diphtheria toxin (DT) produced by diphtheria is a protein with 535 amino acids and a molecular weight of about 58.4 kDa.
  • DT is composed of fragment A and fragment B.
  • C domain catalytic domain
  • T domain transmembrane domain
  • R domain receptor binding domain
  • Fragment A corresponds to the C domain
  • fragment B is composed of a T domain and an R domain (FIG. 1).
  • DT binds to proHB-EGF at its R domain, then enters the cell and reaches acidic vesicles.
  • Non-Patent Document 4 ADP-ribosylating the peptide elongation factor (EF2), resulting in inhibition of cellular protein synthesis.
  • CRM197 Cross reaction material
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide and an antitumor agent that more strongly inhibit the binding between HB-EGF and the EGF receptor.
  • the present inventor examined the creation of a molecule that suppresses the growth factor action of HB-EGF more strongly against HB-EGF than CRM197, and by substituting an amino acid at a specific position in the R domain of CRM197, -We found that the binding between EGF and EGF receptor can be more strongly inhibited.
  • the present invention provides the following polypeptides and antitumor agents.
  • Item 1 A polypeptide comprising the R domain of CRM197, wherein the R domain is at least one amino acid selected from the group consisting of 391, 460, 466, 467, 468, 472, 507 and 520 Is a substituted polypeptide.
  • Item 2. Item 2. The polypeptide according to Item 1, wherein at least one amino acid selected from the group consisting of positions 391, 460, 466, 467, 468, and 472 of the R domain is substituted.
  • Item 3. Item 3.
  • the polypeptide according to Item 1 or 2 comprising, in the R domain of CRM197, at least one selected from the group consisting of H391K, R460H, G466D, D467A, V468T, R472K, D507N, and H520K.
  • Item 4. The polypeptide according to any one of Items 1 to 3, wherein the polypeptide is a CRM197 variant containing the C domain, the T domain, and the R domain of CRM197.
  • An antitumor agent comprising the polypeptide according to any one of Items 1 to 4.
  • the antitumor agent according to Item 5 wherein the antitumor agent is bound to the polypeptide according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 5 A pharmaceutical composition comprising an effective amount of the polypeptide according to any one of Items 1 to 4 and a pharmaceutical carrier.
  • Item 8. A method for treating a tumor, comprising administering an effective amount of the polypeptide according to any one of items 1 to 4 to a subject.
  • Item 9. Item 5. Use of the polypeptide according to any one of Items 1 to 4 for the manufacture of a tumor agent.
  • CRM197 Primary structure of CRM197.
  • CRM197 consists of fragment A and fragment B, which is structurally divided into a T (transmembrane) domain and an R (receptor binding) domain.
  • T transmembrane
  • R receptor binding
  • DER cells were cultured for 40 hours in the presence of 10 ng / ml HB-EGF and various concentrations of CRM197 or recombinant R domain protein, and the number of cells was counted.
  • A Comparison between CRM197 and MBP-R (WT).
  • B Comparison of MBP-R (WT) and R (WT). Inhibition of HB-EGF-dependent proliferation of DER cells by MBP-R mutant.
  • MBP-R (466-468) in the figure represents MBP-R (G466D / D467A / V468T). Inhibition of HB-EGF-dependent proliferation of DER cells by MBP-R mutant.
  • A V468T mutant
  • B D507N mutant
  • C H520K mutant. Effect of CRM197 or MBP-R mutant on TGF- ⁇ -dependent proliferation of DER cells.
  • DER cells were cultured in the presence of 3 ng / ml TGF- ⁇ and various concentrations of CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R mutant.
  • MBP-R (466-468) in the figure represents MBP-R (G466D / D467A / V468T). Inhibitory effect of R-domain mutants on the growth of BRL cells (A-C) and BRLH cells (D, E) in three-dimensional (3D) culture.
  • A-C Effect of MBP-R mutant on BRL cells stimulated with recombinant HB-EGF.
  • CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R mutant (5 ⁇ M each) and recombinant HB-EGF (30 ng / ml) were added to the culture medium and cultured under 3D conditions.
  • D, E Effect of MBP-R mutant on BRLH cell proliferation.
  • BRLH cells were cultured in the presence of CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R mutant (5 ⁇ M each). 466-468 in the figure represents G466D / D467A / V468T. N.S indicates not significant. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.0005. Suppression of HB-EGF-dependent proliferation of DER cells by CRM197 mutant. DER cells were cultured for 40 hours in the presence of 10 ng / ml HB-EGF and various concentrations of CRM197 or CRM197 (R460H), and the number of cells was counted.
  • the three domains of CRM197 consist of the following amino acids: C domain: 1-193 T domain: 194-379 R domain: 380-535
  • polypeptide of the present invention at least one amino acid selected from the group consisting of 391, 460, 466, 467, 468, 472, 507 and 520 of the R domain of CRM197 is substituted.
  • Preferred substitution positions are positions 391, 460, 466, 467, 468 and 472.
  • the most preferred substitutions are H391K, R460H, G466D / D467A / V468T, R472K, D507N, H520K.
  • the amino acid sequence of CRM197 is represented by SEQ ID NO: 1, and the DNA sequence encoding CRM197 is represented by SEQ ID NO: 2. Mutagenesis such as polypeptide substitution can be performed using the DNA sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid substitution mutagenesis position described above is a position having a stronger activity of inhibiting the binding between HB-EGF and the EGF receptor than the wild type (WT) R domain into which no mutation has been introduced.
  • Such mutants in which amino acids at positions that have little or no influence on the inhibitory activity are further substituted or deleted are also included in the polypeptide of the present invention as long as they have an inhibitory activity superior to that of the wild-type R domain.
  • the polypeptide of the present invention includes an R domain (modified R domain) substituted with an amino acid at the above specific position, may consist of only the R domain, and is further linked to CRM197 T domain, C domain, etc. May be. Accordingly, the polypeptide of the present invention may be a modified CRM197 containing a modified R domain. As shown in the Examples, MBP-R in which maltose binding protein (MBP) and a modified R domain are linked has inhibitory activity similar to that of the R domain. In this way, since the inhibitory activity does not change even when other proteins are bound to the R domain, polypeptides in which other amino acids, peptides, and polypeptides are bound to the N-terminal or C-terminal of the modified R domain are widely used. Included in the polypeptide of the invention. Such a polypeptide can be produced biotechnologically by a well-known method in the art using DNA encoding the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention may be chemically conjugated with a known antitumor agent.
  • known antitumor agents to be bound to the polypeptides of the present invention include taxol, taxotere, docetaxel, irinotecan, topotecan, doxorubicin, etoposide, CPT-11, camptostar, epothilone, tamoxifen, methoxytrexate, 5FU, temozolomide, Cyclophosphamide, SCH66336, R115777, L778,123, BMS214466, Iressa, Tarceva, antibody to EGF receptor (EGFR), Gleevec, Intron, Ara-C, Adriamycin, Cytoxan, Gemcitabine), Uracil mustard, Chloromethine, Ifosfamide , Melphalan, chlorambucil, pipbloman, triethylenemelamine, triethylenethiophosphoramine, busulfan, carmustine, lomustine, P
  • the antitumor agent of the present invention is effective for treating ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, stomach cancer, lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer and the like.
  • the anticancer agent of the present invention is particularly effective for the treatment of cancers in which the expression of HB-EGF is enhanced among the growth factors of the EGF family.
  • the antitumor agent or anticancer agent of the present invention can be formulated with the above active ingredient as it is or in combination with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier.
  • the pharmaceutical carrier refers to a pharmaceutically acceptable solid or liquid pharmacologically inert known carrier useful for formulation for administration of a pharmaceutically active ingredient.
  • the therapeutic agent may be administered orally or parenterally (for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, airway administration, etc.). it can.
  • parenterally for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, airway administration, etc.
  • Examples of the pharmaceutical composition suitable for oral administration include tablets, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, syrups, etc.
  • Examples of the pharmaceutical composition suitable for parenteral administration include , Injections, infusions, suppositories, transdermal absorption agents, and the like, but the dosage form is not limited thereto.
  • the type of formulation additive used for the production of the therapeutic agent is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, bases, solubilizers or solubilizers, dispersants, suspending agents, emulsifiers, buffers, antioxidants, antiseptics Agents, isotonic agents, pH adjusters, solubilizers, stabilizers, and the like can be used, and the individual specific components used for these purposes are well known to those skilled in the art.
  • Examples of pharmaceutical additives that can be used in the preparation of pharmaceutical preparations for oral administration include excipients such as glucose, lactose, D-mannitol, starch, or crystalline cellulose; carboxymethylcellulose, starch, carboxymethylcellulose calcium, etc.
  • Disintegrating agents or disintegrating aids include binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, or gelatin; lubricants such as magnesium stearate or talc; coatings such as hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, polyethylene glycol, or titanium oxide
  • Bases such as petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or hard fat can be used.
  • Pharmaceutical additives that can be used for the preparation of pharmaceutical preparations for injection or infusion include aqueous solutions such as distilled water for injection, physiological saline, and propylene glycol, or solubilizers or solubilizers that can constitute dissolution-type injections for use.
  • Agents; pharmaceutical additives such as glucose, sodium chloride, D-mannitol, glycerin and other isotonic agents; inorganic acid, organic acid, inorganic base, organic base and other pH adjusters.
  • the amount of the active ingredient contained in the therapeutic agent of the present invention varies depending on the preparation form or administration route of the therapeutic agent and cannot be generally defined, but is usually about 0.0001% to 70% in the final formulation. It can be determined by appropriately selecting from the range.
  • the therapeutic agent of the present invention can be administered to mammals including humans, particularly humans, as subjects.
  • the dose of the therapeutic agent of the present invention should be appropriately increased or decreased according to the conditions such as the patient's age, sex, weight, symptom, and administration route, but the amount of active ingredient per day for an adult is 1 ⁇ g. To about 100 mg, more preferably about 10 ⁇ g to about 10 mg, and still more preferably about 100 ⁇ g to about 5 mg.
  • the above-mentioned dose of medicine may be administered once a day or may be divided into several times. It may also be administered once a week for 6-8 weeks, every other day for 2-3 weeks, or daily for 10 to 14 days.
  • the present invention includes a method of treating a tumor comprising administering to a subject an effective amount of a polypeptide of the present invention.
  • the invention also includes the use of an inventive polypeptide for the manufacture of a tumor agent.
  • Example 1 Materials and Methods Reagents Recombinant HB-EGF and TGF- ⁇ were obtained from R & D Systems (MN, USA). C-terminal His-tagged HB-EGF lacking the heparin binding domain is described in the literature (Takazaki, R., et al., J Biol Chem, 2004. 279 (45): p. 47335-43) To be purified.
  • Glutathione-S-transferase (GST) fusion R domain The cDNA of the entire R domain (residues 380-535) amplified by PCR was inserted into the BamHI-EcoRI site of the pGEX-3 vector (GE Healthcare), and E. coli JM109 was inserted. Transformed. Single colonies were inoculated into 40 ml LB medium (LB-amp) containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and grown overnight at 37 ° C. The preculture medium was inoculated into 500 ml of fresh LB-amp and grown at 37 ° C. until reaching the logarithmic growth phase of the bacteria.
  • LB-amp LB medium
  • the preculture medium was inoculated into 500 ml of fresh LB-amp and grown at 37 ° C. until reaching the logarithmic growth phase of the bacteria.
  • Thioredoxin (TRX) -fusion R domain R domain cDNA was cloned into the XhoI-EcoRI site of the pThioHis vector (Invitrogen, CA, USA) and transformed into E. coli JM109.
  • the ThioHis-fusion protein was purified using the His-Patch ThioFusion TM expression system (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • Maltose binding protein (MBP) -fusion R domain R domain cDNA was cloned into the BamHI-PstI site of pMAL-p2 vector (New England BioLabs Inc. MA, USA) and transformed into E. coli JM109.
  • the primers used for PCR are as follows (restriction sites for cloning are underlined): Fw, 5'-GCA GGATCC CCCGCGTATTCTCCGGGG-3 '(SEQ ID NO: 3), Rv, 5'-CG CTGCAG TCAGCTTTTGATTTCTAG-3 '(SEQ ID NO: 4).
  • an oligonucleotide encoding a PreSicission Protease (GE Healthcare) recognition sequence was inserted into the BamHI site of the pMAL-p2 vector.
  • Single colonies were inoculated into 40 ml LB-amp and grown overnight at 37 ° C.
  • the preculture was inoculated into 500 ⁇ l of fresh LB-amp, cultured at 37 ° C. until reaching the logarithmic growth phase, and further added with 1 mM IPTG and cultured at 37 ° C. for 3 hours.
  • Bacteria were collected by centrifugation and washed with buffer B (20 mM mM HEPES, pH 7.3, 150 mM NaCl). Bacteria were collected again by centrifugation, resuspended in buffer B and sonicated.
  • the bacterial lysate was clarified by centrifugation and the supernatant was mixed with amylose resin (New (England BioLabs) overnight at 4 ° C. The resin was washed with buffer B and the bound protein was eluted with buffer B containing 100 ⁇ mM maltose. Release of the R domain from the fusion protein was performed by incubation with PreSicission Protease. The released MBP and PreSicission proteinase were removed by incubation with amylose resin and glutathione-sepharose 4B.
  • MBP-R domain mutants were constructed by site-directed mutagenesis using PCR.
  • the oligonucleotides used are listed in Table 1.
  • a plasmid encoding the MBP-R domain mutant was introduced into E. coli JM109 and transformed.
  • the MBP-R domain mutant was purified by the method described above.
  • DER cells (1 ⁇ 10 4 cells) were cultured in 10% fetal bovine serum (FBS), recombinant HB-EGF (10 ng) in the presence or absence of various concentrations of MBP-R domain protein for 40 hours. / ml), heparin (10 ⁇ g / ml), penicillin G (100 U / ml), and streptomycin (100 ⁇ g / ml) were cultured in RPMI1640 / 10% FCS medium. The concentrations of MBP-R domain protein were 0.22, 0.67, 2, 6.1, 18.5, 55.5 and 167 ⁇ M. Culturing was performed using 96-well plates (100 ⁇ l medium / well). The number of DER cells was measured using a cell count reagent SF (Nacalai Tesque, Japan) according to the manufacturer's manual. All experiments were performed in triplicate and data are shown as mean ⁇ sd.
  • FBS fetal bovine serum
  • HB-EGF 10 ng
  • Collagen gel culture Ice-cold bovine type I collagen (Nitta Gelatin; 3 mg / ml), reconstitution buffer containing 2.2% (w / v) NaHCO 3 , 0.2 M HEPES and 50 mM NaOH, 10X DMEM-F12 (1: 1 )
  • 10X DMEM-F12 (1: 1 )
  • serum-free DMEM 5 ⁇ 10 6 cells / ml
  • DMEM serum-free DMEM
  • the collagen gel was covered with 1 ml DMEM-FBS containing either CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R (mutant) and cultured for 1 week.
  • DMEM-FBS containing either CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R (mutant)
  • To count the number of cells 0.5 mg at 37 ° C in HBS (+) (10 mM HEPES, pH 7.2, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2 and 1 mM MgCl 2 ) until the collagen gel was dissolved.
  • HBS (+) 10 mM HEPES, pH 7.2, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2 and 1 mM MgCl 2
  • Biacore T200 and sensor chip NTA were used for this analysis. Coupling constants of HB-EGF and R domain variants were measured according to the manufacturer's instructions. Ni 2+ was captured on the sensor chip for 60 seconds at a flow rate of 10 ⁇ l / ml, followed by C-terminal His-tagged recombinant HB-EGF ( ⁇ ⁇ ⁇ -EGF-His) lacking the heparin binding domain. Captured for 180 seconds. Various concentrations of CRM197, MBP-R (WT) or MBP-R (mutant) were allowed to act on this sensor chip at a flow rate of 30 ⁇ l / ml for 600 seconds to perform a binding reaction. Dissociation was then monitored for 600 seconds at a flow rate of 30 ⁇ l / ml. KD and KA values were calculated using Biacore Software (GE Healthcare).
  • C. diphtheriae expressing CRM197 mutant by three parental conjugation method CRM197 gene and its promoter were transferred to C. diphtheriae C7hm723 ( ⁇ 197) strain (Kanei, C., T. Uchida, and M. Yoneda, Infect Immun, 1977. 18 (1): p. 203-9.).
  • the primers used are shown below (restriction enzyme sites for cloning are underlined): Fw, 5'-GCG AGATCT TTAGGATAGCTTTACCTAATTATTTTATG-3 '(SEQ ID NO: 5), Rv, 5'-CGCCAT GCGGCCGC TCAGCTTTTGATTTCAAAAAATAGCG-3 '(SEQ ID NO: 6).
  • PK-PIM vector (Oram, M., Woolston, JE, Jacobson, AD, Holmes, RK & Oram, DM Bacteriophage-based vectors for site-specific insertion of DNA in the chromosome of Corynebacteria.Gene 391, 53 -62, (2007).)
  • CRM197 (R460H) mutant was constructed by site-directed mutagenesis using pK-PIM / CRM197.
  • DH10B / pK-PIM, HB101 / prk2013 and C. diphtheriae were each precultured overnight at 37 ° C., and then mixed at a ratio of DH10B: HB101: C.
  • Diphtheriae C7 ( ⁇ ) 1: 1: 8.
  • a pellet of the bacterial mixture was added to a Brain Heart Infusion (BHI) agar plate and incubated at 30 ° C.
  • the bacterial mixture was diluted in BHI medium and incubated for 16 hours at 30 ° C. on complex BHI agar plates containing nalidixic acid (20 ⁇ g / ml) and kanamycin (5 ⁇ g / ml). Further, the separated colonies were cultured in a BHI medium supplemented with 20 ⁇ g / ml nalidixic acid and 5 ⁇ g / ml kanamycin to obtain diphtheria that had incorporated pK-PIM.
  • CRM197 and CRM197 variants were prepared and purified as previously reported (Uchida, T., AM Pappenheimer, Jr., and R. Greany, J Biol Chem, 1973. 248 (11) : p. 3838-3844). Statistical processing Data were expressed as mean ⁇ standard deviation unless otherwise stated. Statistical significance was evaluated by Student's t-test. A value of p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • CRM197 recombinant R domain and HB-EGF-inhibitory activity The CRM197 R domain fused with three expression-purification tags (GST, TRX and MBP) was constructed and expressed in E. coli. These fusion proteins, named GST-R (WT), TRX-R (WT) and MBP-R (WT) were prepared and purified according to standard procedures or manufacturer's instructions. Since the MBP-fusion protein was the best in purity and stability among the constructed fusion proteins, the MBP-R domain was used for further studies.
  • MBP-R suppresses HB-EGF-dependent cell proliferation using a DER cell proliferation assay system.
  • DER cells are derived from IL-3-dependent 32D cells, stably express human EGF receptor (EGFR), and can grow in a medium containing EGFR ligand. In the absence of IL-3, DER cells exhibit EGFR-ligand dependence-cell proliferation.
  • the DER cell proliferation assay in the presence of HB-EGF allows detection of the HB-EGF-inhibitory activity of the test sample in an HB-EGF-specific manner.
  • MBP-R (WT) suppressed DER cell proliferation in a dose-dependent manner (FIG. 2A). However, its inhibitory activity was lower than CRM197.
  • MBP-R (WT) has a lower inhibitory activity than CRM197 is that the MBP tag may suppress the interaction between HB-EGF and the R domain due to steric hindrance. I understood.
  • the MBP tag was removed from MBP-R (WT) by PreSicission Protease (GE Healthcare), and R (WT) was purified.
  • R (WT) and MBP-R (WT) showed similar inhibitory activity (FIG. 2B), indicating that the MBP tag does not interfere with the inhibitory activity of the R domain.
  • R domain mutant inhibitory activity and characterization of R domain mutants with increased inhibitory activity To assess the inhibitory activity of R domain mutants on HB-EGF cell proliferation activity, DER cells were treated with a certain amount of HB-EGF. And cultured in the presence of various concentrations of R domain mutant protein. Representative data are shown in FIGS. The ID 50 values for MBP-R mutants are listed in Table 2.
  • MBP-R Six R domain mutant proteins showed higher inhibitory activity than MBP-R (WT).
  • the ID 50 values for each variant compared to CRM197 are as follows: CRM197, 1.2 nM; MBP-R (R460H), 2.5 nM; MBP-R (H391K), 3.1 nM; MBP-R (R472K), 3.2 nM; MBP-R (D507N), 4.5 nM; MBP-R (H520K ), 6.0 nM; MBP-R (V468T), 6.2 nM; MBP-R (WT), 7.9 nM.
  • MBP-R mutant having multiple mutations
  • FIGS. The ID 50 value of the MBP-R (G466D / D467A / V468T) mutant was 2.6 nM, and the inhibitory activity was significantly increased by multiple mutations.
  • MBP-R H391K
  • MBP-R G466D / D467A / V468T
  • MBP-R R460H
  • MBP-R R472K
  • Affinity constants of R domain mutants for HB-EGF were determined using Biacore according to the manufacturer's instructions. The binding of the MBP-R domain protein to the recombinant HB-EGF captured on the sensor chip was measured, and the affinity constant KA was calculated from the association rate constant and dissociation rate constant.
  • Protein affinity constants are shown below: CRM197, 9.22 ⁇ 10 8 M -1 ; MBP-R (R460H), 6.09 ⁇ 10 8 M -1 ; MBP-R (G466D / D467A / V468T), 4.44 ⁇ 10 8 M -1 ; MBP-R (R472K), 4.42 ⁇ 10 8 M -1 ; MBP-R (H391K), 3.17 ⁇ 10 8 M -1 ; MBP-R (WT), 2.99 ⁇ 10 8 M -1 ( Table 4). Affinity constant values are roughly correlated with ID 50 values. These results indicate that the increased affinity for HB-EGF is responsible for the inhibitory activity of the four variants.
  • CRM197 mutant against HB-EGF MBP-R showed lower cell growth inhibitory activity than full-length CRM197, suggesting that the entire molecular structure is necessary for full inhibition. Therefore, the present inventors reconstituted and prepared full length CRM197 having the R460H mutation in the C. diphtheriae strain as described above and compared with the inhibitory activity of CRM197.
  • CRM197 (R460H) inhibited HB-EGF-dependent proliferation of DER cells more effectively than wild type CRM197 (FIG. 7).
  • the ID 50 values for CRM197 and CRM197 (R460H) were 1.02 nM and 0.72 nM, respectively (Table 5).
  • affinity constants KA of CRM197 and CRM197 were compared using Biacore.
  • the affinity constants KA of CRM197 and CRM197 (R460H) were 9.80 ⁇ 10 8 M ⁇ 1 and 1.63 ⁇ 10 9 M ⁇ 1 , respectively (Table 5).
  • the complementary oligonucleotide of the used Fw primer was used as a reverse primer.
  • * HB-EGF inhibition indicates the number of cells when 5 ⁇ M CRM197 or MBP mutant is added, expressed as%, where the number of cells without CRM197 or MBP mutant is 100%.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換又は欠失されたポリペプチドが提供される。

Description

ポリペプチド及び抗腫瘍剤
（関連分野の相互参照）
　本願は、2014年1月21日に出願した特願2014-008675号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
(技術分野)
　本発明は、ポリペプチド及び抗腫瘍剤に関する。
　HB-EGFは、ヘパリン結合性の増殖因子である。EGFファミリーの増殖因子には、HB-EGFの他にEGF、transforming growth factor(TGF-α)、amphiregulin(AR)、epiregulin等があり、これらの分子はEGFリセプター及びそのファミリー(ErbBファミリー)分子に結合して、リセプターのリン酸化を促す。具体的にはHB-EGFは、EGFリセプターErbB1及びErbB4に結合する。HB-EGFは種々の組織で発現しているが、肺、骨格筋、心臓でmRNAの高い発現が認められている。さらに種々の癌組織や炎症部位に高発現することも報告されている。HB-EGFは、繊維芽細胞、平滑筋細胞あるいはケラチノサイトの増殖をよく促進することが報告されている。また、HB-EGFは生体の形態形成や再生に重要な役割を果たすだけでなく、がん細胞の増殖や浸潤、転移、抗癌剤耐性にも密接に関わることが報告されている。HB-EGFは細胞膜上で膜結合型分子（proHB-EGF）として合成され、細胞表面のプロテアーゼによって切断されて分泌型のHB-EGF(sHB-EGF)を作り出す。このsHB-EGFが主として増殖因子として働くが、proHB-EGFが膜結合型で増殖因子として働く例も報告されている。(非特許文献1－３)。
　ジフテリア菌が産生するジフテリア毒素(DT)は、アミノ酸535個、分子量が約58.4kDaのタンパク質である。DTは、フラグメントＡとフラグメントＢから構成される。一方、立体構造的に見ると、DTは触媒ドメイン（Cドメイン）、膜貫通ドメイン（Tドメイン）、受容体結合ドメイン（Rドメイン）から成っている。また、フラグメントＡはCドメインに相当し、フラグメントＢはTドメインとRドメインから構成されている(図1)。DTは、そのRドメインでproHB-EGFに結合後、細胞内に侵入し、酸性小胞に到達する。この時Tドメインが酸性小胞の膜に挿入され、Cドメインの小胞膜通過を促進させる。最終的に、そのCドメインが細胞質に到達し、ペプチド伸長因子(EF2)をADP-リボシル化することでEF2を不活化し、結果的に細胞のタンパク質合成を阻害する。（非特許文献４）
　CRM197(Cross reaction material)は、DTにおいてG52Eの変異を有するものであり、この変異によりADPリボシル化活性が不活化されているため、DTとしての毒性は失われているが、そのRドメインはDTと同じであるので、DTと同様にproHB-EGFに結合する。DT及びCRM197のRドメインはproHB-EGFのEGF様ドメインに結合する。したがってDT及びCRM197はsHB-EGFにも結合する。DTやCRM197がsHB-EGFに結合すると、そのsHB-EGFはEGFリセプターに結合できなくなり、結果的にsHB-EGFの細胞増殖作用を抑制する。したがってCRM197はHB-EGF阻害剤として用いることができる。（非特許文献５、特許文献１，２）
　CRM197のHB-EGF阻害作用を利用してCRM197を抗がん剤として開発する研究が進められている。これまでの非臨床試験ではCRM197はヌードマウスに接種されたヒト癌細胞の腫瘍形成を強く抑制することが報告されており、さらにCRM197を有効成分とする抗がん剤の臨床試験が実施されている。(非特許文献６、７)。
特開2006-232761 特開2004-155776
Raab, G. and M. Klagsbrun, Heparin-binding EGF-like growth factor. Biochim Biophys Acta, 1997. 1333(3): p. F179-99. Iwamoto, R., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(6): p. 3221-6. Higashiyama, S., et al., The membrane protein CD9/DRAP 27 potentiates the juxtacrine growth factor activity of the membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor. J Cell Biol, 1995. 128(5): p. 929-38. Collier, R.J., Understanding the mode of action of diphtheria toxin: a perspective on progress during the 20th century. Toxicon, 2001. 39(11): p. 1793-803. Mitamura, T., et al., Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J Biol Chem, 1995. 270(3): p. 1015-9. Miyamoto, S., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor is a promising target for ovarian cancer therapy. Cancer Res, 2004. 64(16): p. 5720-7. Miyamoto, S., et al., Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor as a novel targeting molecule for cancer therapy. Cancer Sci, 2006. 97(5): p. 341-7
　本発明は、HB-EGFとEGFレセプターとの結合をさらに強力に阻害するポリペプチド及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
　本発明者は、CRM197よりもHB-EGFに対してより強くHB-EGFの増殖因子作用を抑制する分子の作製を検討し、CRM197のRドメインの特定の位置のアミノ酸を置換させることで、HB-EGFとEGFレセプターとの結合をより強く阻害できることを見出した。
　本発明は、以下のポリペプチド及び抗腫瘍剤を提供するものである。
項１．　CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換されたポリペプチド。
項２．　前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位及び472位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換された、項１に記載のポリペプチド。
項３．　CRM197のRドメインにおいて、H391K、R460H、G466D、D467A、V468T、R472K、D507N、H520Kからなる群から選ばれる少なくとも1種を含む項１又は２に記載のポリペプチド。項４．　前記ポリペプチドがCRM197のCドメイン、Tドメイン及びRドメインを含むCRM197改変体である、項1～3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
項５．　項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む抗腫瘍剤。
項６．　項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドに抗腫瘍剤が結合されている、項５に記載の抗腫瘍剤。
　項７．項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量と医薬用担体とを含有する医薬組成物。
　項８．被験体に、項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を投与することを含む腫瘍の治療方法。
　項９．腫瘍剤の製造のための、項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
CRM197の一次構造。CRM197はフラグメントＡ及びフラグメントＢからなり、フラグメントＢは、構造的にＴ（膜貫通）ドメインとＲ(受容体結合)ドメインに分けられる。 CRM197又は組換えRドメインタンパク質によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。DER細胞を10 ng/mlのHB-EGFと種々の濃度のCRM197又は組換えRドメインタンパク質の存在下に40時間培養して細胞数をカウントした。(A)CRM197とMBP-R(WT)の比較。(B)MBP-R(WT)とR(WT)の比較。 MBP-R変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。増大した抑制作用を有する変異体の比較。図中のMBP-R(466-468)はMBP-R(G466D/D467A/V468T)を表す。 MBP-R変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。(A)V468T変異体、(B)D507N変異体、(C)H520K変異体。 DER細胞のTGF-α-依存性増殖に対するCRM197又はMBP-R変異体の効果。 DER細胞を3ng/mlのTGF-αと種々の濃度のCRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R変異体の存在下に培養した。図中のMBP-R(466-468)はMBP-R(G466D/D467A/V468T)を表す。 BRL細胞(A-C)及びBRLH細胞(D, E)の3次元(3D)培養での増殖に対するR-ドメイン変異体の抑制作用。(A-C)組換えHB-EGFで刺激されたBRL細胞に対するMBP-R変異体の効果。CRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R変異体(各5μM)及び組換えHB-EGF(30ng/ml)を培養培地に加え、3D条件下に培養した。(D, E)MBP-R変異体のBRLH細胞増殖に対する効果。BRLH細胞をCRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R変異体(各5μM)の存在下に培養した。図中の466-468はG466D/D467A/V468Tを表す。N.Sは有意でないことを示す。*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005。 CRM197変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。DER細胞を10 ng/mlのHB-EGFと種々の濃度のCRM197又はCRM197(R460H)の存在下で40時間培養し、細胞数をカウントした。
　本明細書において、単数形（a, an, the）は、本明細書で別途明示がある場合又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。

　本明細書において、CRM197の番号は、配列番号１のアミノ酸配列においてシグナル配列（1～25）を除いた26位のアミノ酸（Gly)を1番として番号付けしている。
　配列番号１において、CRM197の3つのドメインは、以下のアミノ酸からなる：
Cドメイン：1-193
Tドメイン：194-379
Rドメイン：380-535
　本発明のポリペプチドは、CRM197のRドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換されている。好ましい置換の位置は、391位、460位、466位、467位、468位及び472位である。最も好ましい置換は、H391K、R460H、G466D/D467A/V468T、R472K、D507N、H520Kである。
　CRM197のRドメインを含むポリペプチドにおける特定位置のアミノ酸の置換の導入は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに対しSite-Directed Mutagenesis System Mutan（登録商標）-Super Express Kmキット(TAKARA BIO Inc.)等を用いて行なう部位特異的変異、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）、ＳＯＥ（splicing by overlap extension）－ＰＣＲ法（Gene,77,61,1989）等により遺伝子に対して特定の塩基を別の塩基に置換することで行うことができる。
　CRM197のアミノ酸配列は配列番号１で示され、CRM197をコードするDNA配列は、配列番号２で示される。ポリペプチドの置換などの変異導入は、配列番号２のＤＮＡ配列を利用して行うことができる。
　上記のアミノ酸置換の変異導入の位置は、変異を導入していない野生型(WT)RドメインよりもHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性の強い位置であるが、上記以外にこのような阻害活性にほとんど或いは全く影響しない位置のアミノ酸をさらに置換又は欠失させた変異体も、野生型Rドメインよりも優れた阻害活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。
　本発明のポリペプチドは、上記の特定位置のアミノ酸が置換したRドメイン(改変型Rドメイン)を含み、Rドメインのみからなっていてもよく、さらにCRM197のTドメイン、Cドメインなどが連結されていてもよい。従って、本発明のポリペプチドは、改変型Rドメインを含む改変型CRM197であってもよい。実施例に示されるように、マルトース結合タンパク質(MBP)と改変型Rドメインとが連結されたMBP-RはRドメインと同様な阻害活性を有する。このように、Rドメインに他のタンパク質を結合させても阻害活性は変わらないので、他のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドを改変型RドメインのN末端又はC末端に結合させたポリペプチドは広く本発明のポリペプチドに包含される。このようなポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて当該技術分野の周知の方法により生物工学的に製造することができる。
　また、本発明のポリペプチドは公知の抗腫瘍剤を化学的に結合させてもよい。本発明のポリペプチドに結合される公知の抗腫瘍剤としては、タキソール、タキソテール、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、エトポシド、ＣＰＴ－１１、カンプトスター、エポシロン、タモキシフェン、メトキシトレキサート、５ＦＵ、テモゾロミド、シクロホスファミド、ＳＣＨ６６３３６、Ｒ１１５７７７、Ｌ７７８，１２３、ＢＭＳ２１４６６２、イレッサ、タルセバ、ＥＧＦ受容体(EGFR)に対する抗体、グリーベック、イントロン、アラ－Ｃ、アドリアマイシン、シトキサン、ゲムシタビン）、ウラシルマスタード、クロロメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃなどが挙げられる。
　本発明の抗腫瘍剤は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌などの癌治療に有効である。
　本発明の抗癌剤は、EGFファミリーの増殖因子の中でもとりわけHB-EGFの発現が亢進している癌の治療に有効である。
　本発明の抗腫瘍剤又は抗癌剤は、上記有効成分をそのまま、又は、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。なお、医薬用担体は、薬学的に活性な成分の投与のための製剤化に有用な、薬学的に許容できる固体又は液体の薬理学的に不活性な公知の担体を指す。
　前記治療薬は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。
　経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。
　前記治療薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
　経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
　注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
　前記本発明の治療薬に含まれる有効成分の量は、治療薬の製剤形態又は投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。
　本発明の治療薬は、被験体として、ヒトを含む哺乳動物、特にヒトに投与することができる。
　本発明の治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、１μgから１００ｍｇ程度、より好ましくは１０μgから１０ｍｇ程度、さらに好ましくは１００μｇから５ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、１週間に１度ずつ６－８週にわたって投与してもよいし、又は一日おきに２－３週間にわたって投与してもよいし、又は１０日から１４日間毎日投与してもよい。
　本発明は、被験体に本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む腫瘍の治療方法を含む。また本発明は、腫瘍剤の製造のための、発明のポリペプチドの使用を含む。
　以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例１
材料と方法
試薬
　組換えHB-EGF及びTGF-αはR&D Systems (MN, U.S.A.)から入手した。ヘパリン結合ドメインを欠失したC-末端His-タグ化HB-EGFを文献（Takazaki, R., et al., J Biol Chem, 2004. 279(45): p. 47335-43）に記載のように精製した。
細胞及び培養
　DER細胞は外因性ヒトEGFR cDNAを骨髄由来リンパ芽球性32D細胞に導入することにより既報のように確立し、維持した（Iwamoto, R., K. Handa, and E. Mekada, J Biol Chem, 1999. 274(36): p. 25906-12.）。Buffaloラット肝(BRL)細胞及び外因性ヒトHB-EGFを発現するBRL細胞(BRLH)を既報のように確立し、維持した（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86）。
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合Rドメイン
　PCRにより増幅した全Rドメイン(残基380-535)のcDNAをpGEX-3ベクター(GE Healthcare)のBamHI-EcoRI部位に挿入し、E.coli JM109を形質転換した。単一コロニーを50μg/mlアンピシリンを含有する40 mlのLB培地(LB-amp)に接種し、37℃で終夜増殖した。プレ培養培地を500 mlの新鮮なLB-ampに接種し、37℃で細菌の対数増殖期に到達するまで増殖した。これに0.4 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて37℃で２時間培養し、培養液を遠心分離し、大腸菌を集めた。0.2 mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)を含有する溶液A(20 mM Tris-HCl, pH8.0, 30 mM NaCl, 10mM EDTA)で洗浄した大腸菌を再び遠心分離により集め、リゾチーム(40 μg/ml)を含有する溶液Aで氷上１時間溶解した。細菌溶解物にTriton-X100(0.53%)及びNaCl(100 mM)を加えて１５分間氷上でインキュベートし、さらに0.2 mM PMSFの存在下で20秒間(氷上で２回)超音波処理した。遠心分離により、上清をグルタチオン-セファロース4Bゲル(GE Healthcare)と4℃で終夜インキュベートした。ゲルを溶液Aで洗浄し、結合したタンパク質を溶離バッファー(100 mM Tris-HCl, pH8.0, 6 mMグルタチオン)で溶離した。
チオレドキシン(TRX)-融合Rドメイン
　RドメインのcDNAをpThioHisベクター(Invitrogen, CA, U.S.A.)のXhoI-EcoRI部位にクローニングし、E.coli JM109を形質転換した。ThioHis-融合タンパク質を製造元の指示書に従いHis-Patch ThioFusionTM発現システム(Invitrogen)を用いて精製した。
マルトース結合タンパク質(MBP)-融合Rドメイン
　RドメインcDNAをpMAL-p2ベクター(New England BioLabs Inc.MA, U.S.A)のBamHI-PstI部位にクローニングし、E.coli JM109を形質転換した。PCRに使用したプライマーは以下のものである(クローニング用の制限酵素部位は下線で示す)：
Fw,　5'-GCAGGATCCCCCGCGTATTCTCCGGGG-3' (配列番号３),
Rv,　5'-CGCTGCAGTCAGCTTTTGATTTCTAG-3'(配列番号４).
　さらにRドメインをMBPから分離するために、PreSicission Protease(GE Healthcare)認識配列(LEVLFQ/GP)をコードするオリゴヌクレオチドをpMAL-p2ベクターのBamHI部位に挿入した。
　単一コロニーを40 mlのLB-ampに接種し、37℃で終夜増殖した。プレ培養物を500 mlの新鮮なLB-ampに接種し、対数増殖期に到達するまで37℃で培養し、さらに1mM IPTGを加えて37℃で３時間培養した。細菌を遠心分離により集め、バッファーB(20 mM HEPES, pH7.3, 150 mM NaCl)で洗浄した。細菌を遠心分離により再度集め、バッファーBに再懸濁し、超音波破砕した。細菌溶解物を遠心分離により清澄にし、上清をアミロース樹脂(New England BioLabs)と終夜4℃で混合した。樹脂をバッファーBで洗浄し、結合したタンパク質を100 mMマルトースを含有するバッファーBで溶離した。融合タンパク質からRドメインの遊離は、PreSicission Proteaseとインキュベートして行った。遊離されたMBP及びPreSicission Proteaseはアミロース樹脂及びグルタチオン-セファロース4Bとインキュベートすることにより除去した。
MBP-Rドメイン変異体
　MBP-Rドメイン変異体をPCRを用いた部位特異的突然変異により構築した。使用したオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。MBP-Rドメイン変異体をコードするプラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換した。MBP-Rドメイン変異体は上記の方法で精製した。
増殖抑制アッセイ
　DER細胞(1×104細胞)を、種々の濃度のMBP-Rドメインタンパク質の存在下又は非存在下に４０時間10%牛胎児血清(FBS)、組換えHB-EGF(10 ng/ml)、ヘパリン(10 μg/ml), ペニシリンG(100U/ml), 及びストレプトマイシン(100 μg/ml)を含有するRPMI1640/10% FCS培地で培養した。MBP-Rドメインタンパク質の濃度は0.22, 0.67, 2, 6.1, 18.5, 55.5及び167μMであった。培養は96-ウェルプレート(100 μl培地/ウェル)を用いて行った。DER細胞数を細胞カウント試薬SF(Nacalai Tesque, Japan)を用い製造元のマニュアルに従い測定した。全ての実験は３回行い、データは平均±s.dで示す。
コラーゲンゲル培養
　氷冷ウシI型コラーゲン(Nitta Gelatin; 3 mg/ml)、2.2%(w/v)NaHCO3, 0.2 M HEPES及び50 mM NaOHを含む再構成バッファー、10X DMEM-F12(1:1)培地、及び細胞を懸濁した血清フリーDMEM(5×106 細胞/ml)を8:1:1:0.1比で混合し、24-ウェルディッシュ(0.5 ml/ウェル)に既報のように注いだ（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86）。37℃で30分のインキュベート後、コラーゲンゲルをCRM197, MBP-R(WT)、MBP-R(変異体)のいずれかを含有する1 ml DMEM-FBSで覆い、１週間培養した。細胞数をカウントするために、コラーゲンゲルを溶解するまでHBS(+)(10 mM HEPES, pH7.2, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2及び1 mM MgCl2)中37℃で0.5 mlの0.5%(w/v)細菌コラゲナーゼ(Invitrogen, CA, U.S.A.)とインキュベートし、細胞を遠心分離により集めた。細胞を固定し、クリスタルバイオレット溶液(0.1%クリスタルバイオレット, 0.1 Mクエン酸)で染色し、核の数をボルテックス後に顕微鏡下でカウントした。全ての実験は３回行い、データは平均±s.dで示す。
表面プラズモン共鳴
　Biacore T200及びセンサーチップNTA(GE Healthcare)をこの分析に使用した。HB-EGF及びRドメイン変異体のカップリング定数を製造元の指示書に従い測定した。Ni2+を10μl/mlの流量で60秒間センサーチップ上で捕捉し、続いてヘパリン結合ドメインを欠失したC-末端His-タグ化組換えHB-EGF(Δ・・-EGF-His)を１８０秒間捕捉した。このセンサーチップに種々の濃度のCRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R(変異体)を30μl/mlの流量で600秒間作用させ結合反応を行った。次に解離を30μl/mlの流量で600秒間モニターした。KD及びKA値をBiacore Software(GE Healthcare)を用いて計算した。
　三親接合法によるCRM197変異体を発現するC. diphtheriaeの確立 CRM197遺伝子及びそのプロモーターをC. diphtheriae C7hm723(β197)株（Kanei, C., T. Uchida, and M. Yoneda, Infect Immun, 1977. 18(1): p. 203-9.）のゲノムDNAからPCRにより得た。使用したプライマーを以下に示す(クローニング用の制限酵素部位は下線で示す)：
Fw, 5'-GCGAGATCTTTAGGATAGCTTTACCTAATTATTTTATG-3'　(配列番号５),　
Rv, 5'-CGCCATGCGGCCGCTCAGCTTTTGATTTCAAAAAATAGCG-3'　(配列番号６).
　増幅したDNAをpK-PIMベクター(Oram, M., Woolston, J. E., Jacobson, A. D., Holmes, R. K. & Oram, D. M. Bacteriophage-based vectors for site-specific insertion of DNA in the chromosome of Corynebacteria. Gene 391, 53-62, (2007).)のBglII-NotI部位に挿入した。CRM197(R460H)変異体をpK-PIM/CRM197を用いた部位特異的突然変異により構築した。DH10B/pK-PIM, HB101/prk2013及びC. diphtheriaeをそれぞれ37℃で終夜プレ培養し、次にDH10B:HB101:C. diphtheriaeC7(-)=1:1:8の比で混合した。細菌混合物のペレットをBrain Heart Infusion (BHI)寒天プレートに加え、30℃でインキュベートした。細菌混合物をBHI培地で希釈し、ナリジクス酸(20 μg/ml)及びカナマイシン(5 μg/ml)を含有する複合BHI寒天プレートで30℃で16時間インキュベートした。さらに分離したコロニーを20 μg/mlナリジクス酸及び5μg/mlカナマイシンを加えたBHI培地で培養し、pK-PIMを組み込まれたジフテリア菌を得た。
CRM197及びCRM197変異体の調製と精製
　CRM197及びCRM197変異体は既報のように調製及び精製した（Uchida, T., A.M. Pappenheimer, Jr., and R. Greany, J Biol Chem, 1973. 248(11): p. 3838-3844）。
統計処理
　データは別途記載がない限り平均値±標準偏差として表した。統計学的有意差はスチューデントt-検定で評価した。ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。
結果
CRM197の組換えRドメインの調製及びHB-EGF-阻害活性
　３種類の発現-精製タグ(GST, TRX及びMBP)と融合したCRM197のRドメインを構築し、大腸菌で発現した。GST-R(WT), TRX-R(WT)及びMBP-R(WT)と名付けられたこれらの融合タンパク質は標準的手順又は製造元の指示書に従い調製及び精製した。MBP-融合タンパク質は、構築された融合タンパク質の中で純度及び安定性が最もよかったので、MBP-Rドメインをさらなる検討に使用した。
　最初に、DER細胞増殖アッセイ系を用いて、MBP-R(WT)がHB-EGF-依存性細胞増殖を抑制するかをどうかを検討した。DER細胞はIL-3-依存性32D細胞に由来し、ヒトEGF受容体（EGFR）を安定発現し、EGFRリガンドを含有する培地で増殖し得る。IL-3がないと、DER細胞はEGFR-リガンド依存性-細胞増殖を示す。従って、HB-EGF存在下でのDER細胞増殖アッセイはHB-EGF-特異的様式で試験サンプルのHB-EGF-阻害活性の検出を可能にする。MBP-R(WT)は用量依存性様式でDER細胞の増殖を抑制した(図2A)。しかしながら、その阻害活性はCRM197よりも低かった。細胞数が50%減少する濃度であるID50値は, CRM197及びMBP-R(WT)について各々1.2及び7.9 nMであった。MBP-R(WT)がCRM197よりも低い阻害活性を示す理由として、HB-EGFとRドメインとの相互作用をMBPタグが立体障害により抑制する可能性が考えられたが、これは正しくないことがわかった。MBPタグをMBP-R(WT)からPreSicission Protease(GE Healthcare)により除去し、R(WT)を精製した。R(WT)及びMBP-R(WT)は類似した阻害活性を示し(図2B)、これよりMBPタグはRドメインの阻害活性を妨げないことが示された。
　Rドメイン変異体の阻害活性及び増大した阻害活性を有するRドメイン変異体の特徴付け  HB-EGF細胞増殖活性に対するRドメイン変異体の阻害活性を評価するために、DER細胞を一定量のHB-EGFと種々の濃度のRドメイン変異体タンパク質存在下に培養した。代表的データを図3及び図4に示す。MBP-R変異体のID50値を表2に列挙する。
　６つのRドメイン変異体タンパク質がMBP-R(WT)より高い阻害活性を示した。CRM197と比較した各変異体のID50値は以下の通りである。CRM197、1.2 nM; MBP-R(R460H), 2.5 nM; MBP-R(H391K), 3.1 nM; MBP-R(R472K), 3.2 nM; MBP-R(D507N), 4.5 nM; MBP-R(H520K), 6.0 nM; MBP-R(V468T), 6.2 nM; MBP-R(WT), 7.9 nM。
　次に多重変異を有する変異体（MBP-R(G466D/D467A/V468T)）を作製しその阻害活性についても検討した。結果を図3、4及び表3に示す。MBP-R(G466D/D467A/V468T)変異体のID50値は2.6 nMであり、多重変異によって顕著に阻害活性の上昇が認められた。
　これらのRドメイン変異体の阻害活性がHB-EGFに特異的であるかを調べるために、DER細胞をTGF-α及びRドメイン変異体の存在下で培養した。これらの変異体のいずれもDER細胞の増殖に影響せず(図5)、これらのRドメイン変異体タンパク質は細胞毒性なしにHB-EGFを特異的に抑制することが示された。
　3次元(3D)培養におけるHB-EGF-依存性細胞増殖に対する4つのRドメイン変異体の効果
HB-EGFによる細胞増殖作用は3D培養条件で特に顕著に表れる（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86.）。そこで、本発明者はコラーゲンゲルを用いた3D培養条件下でBRL細胞を培養し、BRL細胞のHB-EGF-依存性増殖に対する4つのRドメイン変異体の阻害活性を調べた。4つのRドメイン変異体であるMBP-R(H391K)、MBP-R(G466D/D467A/V468T), MBP-R(R460H)及びMBP-R(R472K)は、MBP-R(WT)よりも効果的に組換えHB-EGFにより誘導されるBRL細胞増殖を抑制した(図6A-C, 表2)。さらに、これらの変異体はMBP-R(WT)と比較して外因性proHB-EGFを過剰発現するBRLH細胞の増殖をより強く抑制した(図6D, E, 表4)。これらの結果は、MBP-R(WT)と比較した4つのRドメイン変異体のより高い阻害活性は、特定の細胞型又は培養条件に特異的ではないことを示す。
HB-EGFに対するRドメイン変異体の親和性定数
　4つのRドメイン変異体が野生型Rドメインと比較してHB-EGFに対する増大した親和性を得ているかを調べるために、該変異体の親和性定数を製造元の指示書に従いBiacoreを用いて求めた。センサーチップ上に捕捉される組換えHB-EGFに対するMBP-Rドメインタンパク質の結合を測定し、結合速度定数及び解離速度定数から親和性定数KAを計算した。タンパク質の親和性定数値を以下に示す:CRM197, 9.22×108 M-1; MBP-R(R460H), 6.09×108 M-1; MBP-R(G466D/D467A/V468T), 4.44×108M-1; MBP-R(R472K), 4.42×108 M-1; MBP-R(H391K), 3.17×108 M-1; MBP-R(WT), 2.99×108 M-1 (表 4)。親和性定数値はID50値とほぼ相関する。これらの結果は、HB-EGFに対する増大した親和性が4つの変異体の阻害活性の原因であることを示す。
HB-EGFに対するCRM197変異体の阻害活性
　MBP-R(WT)は全長CRM197より低い細胞増殖阻害活性を示し、これは全分子構造が完全な阻害作用を示すのに必要であることを示唆する。従って、本発明者はC. diphtheriae株においてR460H変異を有する全長CRM197を上記のように再構成及び調製し、CRM197の阻害活性と比較した。CRM197(R460H)はDER細胞のHB-EGF-依存性増殖を野生型CRM197より効果的に阻害した(図7)。CRM197及びCRM197(R460H)のID50値は各々1.02 nM及び0.72 nMであった(表5)。
　MBP-Rドメイン変異体で観察されたように、CRM197の親和性定数がR460H変異により向上するかを調べるために、Biacoreを用いてCRM197とCRM197(R460H)の親和性定数KAを比較した。CRM197及びCRM197(R460H)の親和性定数KAは、各々9.80×108 M-1及び1.63×109 M-1であった(表5)。これらの結果はHB-EGFに対するCRM197の阻害活性は、変異により増大することを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　使用したFwプライマーの相補的なオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 * HB-EGF 阻害は、CRM197又はMBP変異体を加えない場合の細胞数を１００％としたときの、5 μM のCRM197又はMBP変異体を加えたときの細胞数を％として示す。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (9)

  1. 　CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸が置換されたポリペプチド。
  2. 　前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位及び472位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換された、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　CRM197のRドメインにおいて、H391K、R460H、G466D、D467A、V468T、R472K、D507N、H520Kからなる群から選ばれる少なくとも1種を含む請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 　前記ポリペプチドがCRM197のCドメイン、Tドメイン及びRドメインを含むCRM197改変体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む抗腫瘍剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドに抗腫瘍剤が結合されている、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量と医薬用担体とを含有する医薬組成物。
  8. 　被験体に、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を投与することを含む腫瘍の治療方法。
  9. 　腫瘍剤の製造のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。　
     
PCT/JP2014/076945 2014-01-21 2014-10-08 ポリペプチド及び抗腫瘍剤 WO2015111252A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/112,756 US20170029474A1 (en) 2014-01-21 2014-10-08 Polypeptide and anti-tumor agent

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-008675 2014-01-21
JP2014008675A JP6422652B2 (ja) 2014-01-21 2014-01-21 ポリペプチド及び抗腫瘍剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015111252A1 true WO2015111252A1 (ja) 2015-07-30

Family

ID=53681075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/076945 WO2015111252A1 (ja) 2014-01-21 2014-10-08 ポリペプチド及び抗腫瘍剤

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20170029474A1 (ja)
JP (1) JP6422652B2 (ja)
WO (1) WO2015111252A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115651781B (zh) * 2022-11-25 2023-12-12 广州洁生日化有限公司 一体式组合物洗涤片及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009013141A (ja) * 2007-07-09 2009-01-22 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 連続投与されたｃｒｍ１９７による抗腫瘍効果

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009013141A (ja) * 2007-07-09 2009-01-22 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 連続投与されたｃｒｍ１９７による抗腫瘍効果

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROSHI YAGI ET AL.: "CRM197 o Mochiita Ransogan Bunshi Hyoteki Chiryo", OBSTETRICS & GYNECOLOGY, vol. 73, no. 5, 1 May 2006 (2006-05-01), pages 623 - 629 *
LOUIE,G.V. ET AL.: "Crystal structure of the complex of diphtheria toxin with an extracellular fragment of its receptor", MOL. CELL, vol. 1, no. 1, December 1997 (1997-12-01), pages 67 - 78, XP002687267 *
SHEN,W.H. ET AL.: "Participation of lysine 516 and phenylalanine 530 of diphtheria toxin in receptor recognition", J.BIOL.CHEM., vol. 269, no. 46, 18 November 1994 (1994-11-18), pages 29077 - 84, XP055214415 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170029474A1 (en) 2017-02-02
JP6422652B2 (ja) 2018-11-14
JP2015137247A (ja) 2015-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11827681B2 (en) Muteins of human lipocalin 2 (Lcn2, hNGAL) with affinity for a given target
EP3341396B1 (en) Improved cell-permeable (icp)-socs3 recombinant protein and uses thereof
RU2756318C2 (ru) Мутеины липокалина 2 человека с аффинностью в отношении глипикана-3 (gpc3)
CA3017701C (en) Use of pten-long leader sequence for transmembrane delivery of molecules
US10889619B2 (en) Methods for treating cancer
KR20180026565A (ko) 향상된 세포 투과성(icp) 파킨 재조합 단백질 및 이의 용도
US20160068582A1 (en) Conjugate comprising p21 protein for the treatment of cancer
KR20160142372A (ko) 항-ｎｍｅ 항체
CN117730143A (zh) 通过缀合的n-末端甘氨酸修饰的细胞及其用途
US9624277B2 (en) Anticancer agent
JP6422652B2 (ja) ポリペプチド及び抗腫瘍剤
JP6695276B2 (ja) ガンを処置するための方法及び医薬組成物
JP6932506B2 (ja) 細胞透過組成物およびそれを用いる方法
CN111050784B (zh) 截短的豚鼠l-天冬酰胺酶变体及其使用方法
JP6466852B2 (ja) アンジオポエチン−２特異的ｔｉｅ２受容体
US8440788B2 (en) N-terminal VDAC variants and uses thereof
JP2006232761A (ja) 制癌剤
JP2012511309A (ja) Ｅｃ−ｓｏｄのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合蛋白質
EP3969000B1 (en) Bcl-2 inhibitors for use in the treatment of a bcl-2 mediated cancer carrying the gly101val mutation
US10131701B2 (en) Human leucine zipper/trail recombinant polypeptides
Tao et al. Molecular cloning, recombinant expression and characterization of GMCSF from the rhesus monkey, Macaca mulatta
JP5769510B2 (ja) 制癌剤
JPWO2020158691A1 (ja) 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
JP2021164430A (ja) 機能性ポリペプチド及びその使用
JP2022514939A (ja) ヒトＬｅｆｔｙ Ａタンパク質変異体を含む融合タンパク質及びその用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14880139

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15112756

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14880139

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1